JP6785516B2

JP6785516B2 - ヒト臍帯由来間葉系幹細胞から骨芽細胞の製造を目的としたアクチン重合阻害剤による分化誘導技術

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Publication number: JP6785516B2
Application number: JP2020509397A
Authority: JP
Inventors: 吉慶住田; 真弓岩竹; 泉朝比奈; 壽文小守
Original assignee: Nagasaki University
Current assignee: Nagasaki University
Priority date: 2018-03-30
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2020-11-18
Anticipated expiration: 2039-03-29
Also published as: JPWO2019189947A1; WO2019189947A1

Description

本発明は、アクチン重合阻害物質を含む、骨芽細胞分化促進剤、骨芽細胞分化能を有する幹細胞を、骨分化誘導因子及びアクチン重合阻害物質と共に培養することを含む、骨芽細胞分化誘導方法等に関する。

骨の再生治療は、自然回復よりも格段に早期の治癒をもたらすこと等から、大変注目されている。骨及び関節を対象とした再生医療市場の規模は、２０１８年には世界的総市場規模で３９億米ドル（ＢＣＣＲｅｓｅａｒｃｈ）に到達することが予測されている。

例えば歯周病は、日本において高い罹患率を有しており、歯肉に何らかの症状がみられる患者数は約９，４００万人（厚生労働省医政局歯科保健課平成２３年歯科疾患実態調査）と言われている。歯周病が進行すると歯茎に炎症が生じ、歯槽骨の吸収が起こる。歯周病によって惹起された骨吸収の治療として、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）等のタンパク質製剤の局所塗布が適用されているものの、効果発現の長期的な維持は困難であり、骨吸収が広範に及ぶ場合の効果は限定的である。

歯周病に対する再生治療も行われているが、現在の骨再生では自家骨移植（患者数年間約１万件、平成２５年社会医療診療行為別調査）を併用した侵襲性の大きい手術が必要であり患者への負担が大きい。そこで、低侵襲且つ有効性の高い新規骨再生法の開発が望まれている。

近年、比較的低侵襲且つ有効性の高い新規骨再生法として間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を用いる方法が提案されているが克服すべき課題が多い。ＭＳＣは、間葉系組織から抽出可能な、自己増殖能及び多分化能を特徴とする細胞集団である。ＭＳＣは、骨髄、臍帯、脂肪に由来するものがあるが、由来する組織によって異なった分化能や増殖能特性を有しており、最も一般的な供給源である骨髄由来幹細胞（骨髄ＭＳＣ）は骨分化誘導可能で免疫抑制作用も有する。しかし、骨髄採取はそれでも侵襲性が大きいことや移植の際に必要な細胞数の確保のために培養が必要な上に、培養細胞の増殖・分化能に個体差が大きく培養操作が困難であるといった問題がある。

臍帯ＭＳＣはＨＬＡＩＩ発現がなく同種異系（アロ）で移植可能であり、バンキングが進められているため細胞の安定供給が可能であり、高い有用性がある。更に臍帯ＭＳＣは採取が非侵襲的に可能で、高い増殖活性と骨組織への分化能を有することが報告されている。しかしながら、他の組織から単離されたＭＳＣよりも骨芽細胞への分化誘導に時間を要し、分化を誘導してもＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＬＰ）活性は相対的に低く（図１）、その分化機構について不明な点が多い。

脂肪由来のＭＳＣは、骨分化能が特に高いわけではなく、夾雑物が多く、品質性が低い。侵襲性も大きい。ＭＵＳＥ細胞、ｉＰＳ／ＥＳ細胞も骨芽細胞分化能を有する幹細胞であるが、前者は細胞数が少なくて増殖性が低く、後者は均質的なものが安定的に得られず、増殖・分化が遅い。

更に、骨芽細胞分化能を有する幹細胞に骨芽細胞への分化を誘導する際に、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を用いるが、ＢＭＰは高価な上に副作用が強いため、使用する量を抑制することが求められる。ＢＭＰをコートゲルに含ませると、少量でも強い誘導が観察されるが、人体内でコートゲルは使用できず、治療に用いることはできない。以上のように、低侵襲且つ有効性の高い新規骨再生法に用いるための骨芽細胞を、幹細胞から高い効率で分化させることは困難であった。

一方、細胞骨格は、細胞分化に際して、重合・脱重合によるダイナミックな構造変化を示す場合や（非特許文献１）、機械的シグナル伝達に関与する場合（非特許文献２）があるが、特にアクチン重合阻害物質が、骨芽細胞分化を顕著に促進することは、これまで全く知られておらず、予想もされていなかった。

ＮｏｂｕｓｕｅＨ，ＯｎｉｓｈｉＮ，ＳｈｉｍｉｚｕＴ，ｅｔａｌ．ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＭＫＬ１ｖｉａａｃｔｉｎｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎｄｙｎａｍｉｃｓｄｒｉｖｅｓａｄｉｐｏｃｙｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１４；５：３３６８．Ｊ．Ｇａｏ，ｅｔａｌ．Ｃｙｃｌｉｃｓｔｒｅｔｃｈｐｒｏｍｏｔｅｓｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅｃｅｌｌｓｔｈｒｏｕｇｈａｃｏｆｉｌｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍｅｃｈａｎｉｓｍ，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｒｅｐ．１４，２１８−２２４（２０１６）．

本発明の課題は、骨芽細胞分化能を有する幹細胞から、骨芽細胞を、高い効率で分化させることである。例えば、臍帯ＭＳＣを骨髄ＭＳＣと同程度まで分化誘導効率を亢進する処理条件を確立できれば、大量に骨芽細胞を生産できるため、安価で安全な細胞治療を実現できる。

本発明者らは、高い骨芽細胞分化能を有する臍帯由来間葉系幹細胞の製造を可能とする培養方法を開発する取り組みを進めた。その結果、アクチン重合阻害物質を応用した新規培養技術により、骨芽細胞分化能を有する幹細胞から、骨再生のための移植用細胞として、骨芽細胞を大量生産することを可能とし、本発明を完成させた。

即ち、本発明は以下のとおりである。
［１］アクチン重合阻害物質を含む、骨芽細胞分化促准剤。
［２］骨芽細胞分化が、骨芽細胞分化能を有する幹細胞からの骨芽細胞分化である、［１］に記載の剤。
［３］骨芽細胞分化能を有する幹細胞が、間葉系幹細胞である、［２］に記載の剤。
［４］間葉系幹細胞が、臍帯由来間葉系幹細胞である、［３］に記載の剤。
［５］アクチン重合阻害物質が、ラトランクリンＡ及び／又はスウィンホリドＡである、［１］〜［４］のいずれかに記載の剤。
［６］骨芽細胞分化能を有する幹細胞を、骨分化誘導因子及びアクチン重合阻害物質と共に培養することを含む、骨芽細胞分化誘導方法。
［７］骨芽細胞分化能を有する幹細胞が、間葉系幹細胞である、［６］に記載の方法。
［８］間葉系幹細胞が、臍帯由来間葉系幹細胞である、［７］に記載の方法。
［９］骨分化誘導因子が、骨形成タンパク質である、［６］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］骨形成タンパク質がＢＭＰ−２である、［９］に記載の方法。
［１１］アクチン重合阻害物質が、ラトランクリンＡ及び／又はスウィンホリドＡである、［６］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］骨分化マーカー遺伝子発現又は骨分化マーカー酵素の活性を測定して骨芽細胞分化能を有する幹細胞の分化状況を確認することを更に含む、［６］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］骨分化マーカー遺伝子がＡＬＰ遺伝子であり、骨分化マーカー酵素がＡＬＰである、［１２］に記載の方法。
［１４］培養が、５日間以上行われる、［６］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］培養開始と同時（０日）、培養開始後１日、２日、３日、４日又は５日に、培地中に骨分化誘導因子を含有させる、［６］〜［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］培養開始と同時（０日）、培養開始後１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日又は１５日に、培地中にアクチン重合阻害物質を含有させる、［６］〜［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］骨治療材を製造するための方法である、［６］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］［１］〜［５］のいずれかに記載の骨芽細胞分化促進剤及び
骨芽細胞分化能を有する幹細胞
を含む、骨治療用キット。

本発明により、これまで困難であった、幹細胞からの効率の高い骨芽細胞分化誘導が可能となる。特に、幹細胞として臍帯由来間葉系幹細胞を用いる場合、無侵襲で採取できること、該幹細胞にＨＬＡＩＩ発現がないため他家移植できることから、治療対象患者の負担を軽減することが可能となる。

図１は、臍帯（ＵＣ）由来及び骨髄（ＢＭ）由来のヒト間葉系幹細胞に骨芽細胞分化を誘導した際と非誘導コントロールの、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性を示すグラフである。図２は、臍帯（ＵＣ）由来及び骨髄（ＢＭ）由来のヒト間葉系幹細胞に骨芽細胞分化を誘導した際と非誘導コントロールの、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）ｍＲＮＡの発現を示すグラフである。臍帯（ＵＣ）由来ヒト間葉系幹細胞は、コラーゲンゲル上で培養したもの（ｇｅｌ）と、そうでないもの（ｎｏｎ−ｃｏａｔ）を両方用いた。図３は、コーティングなし、コラーゲンゲル上、コラーゲンコーティング上の培養で分化誘導した間葉系幹細胞と、非誘導コントロールの細胞の、遊走の様子を記録した図である。図４は、図３のデータに基づき、遊走距離を定量化したグラフである。図５は、コラーゲンゲル上又はコーティングなしでの培養の際の、臍帯（ＵＣ）由来及び骨髄（ＢＭ）由来のヒト間葉系幹細胞の細胞骨格（アクチン）の変化を示す図である。図６は、ＢＭＰ−２−ＢＭＰ受容体ＩＩ（ＢＭＰＲＩＩ）−コフィリン伝達経路の模式図である。図７は、臍帯（ＵＣ）由来のヒト間葉系幹細胞に骨芽細胞分化を誘導した際と非誘導コントロールの、ＢＭＰＲＩＩｍＲＮＡの発現を示すグラフである。臍帯（ＵＣ）由来ヒト間葉系幹細胞は、コラーゲンゲル上で培養したもの（ｇｅｌ）と、そうでないもの（ｎｏｎ−ｃｏａｔｉｎｇ）を両方用いた。図８は、臍帯（ＵＣ）由来のヒト間葉系幹細胞に骨芽細胞分化を誘導した際と非誘導コントロールの、コフィリンｍＲＮＡの発現を示すグラフである。臍帯（ＵＣ）由来ヒト間葉系幹細胞は、コラーゲンゲル上で培養したもの（ｇｅｌ）と、そうでないもの（ｎｏｎ−ｃｏａｔｉｎｇ）を両方用いた。図９は、表示された条件での培養におけるアクチンの細胞内局在の観察結果を示す図である。図１０は、骨芽細胞分化誘導後３日目にアクチン阻害剤のラトランクリンＡ（ＬａｔｒｕｎｃｕｌｉｎＡ）、スウィンホリドＡ（ＳｗｉｎｈｏｌｉｄｅＡ）で処理した細胞、並びに分化非誘導及び阻害剤なしの細胞のＡＬＰｍＲＮＡ発現を示す図である。図１１は、骨芽細胞分化誘導後３日目にアクチン阻害剤のラトランクリンＡ（ＬａｔｒｕｎｃｕｌｉｎＡ）、スウィンホリドＡ（ＳｗｉｎｈｏｌｉｄｅＡ）で処理した細胞、及びコントロールの細胞のアクチンの動態変化を示す図である。図１２は、骨芽細胞分化誘導後にアクチン阻害剤のラトランクリンＡ（ＬａｔｒｕｎｃｕｌｉｎＡ）、スウィンホリドＡ（ＳｗｉｎｈｏｌｉｄｅＡ）で処理した細胞、並びに分化非誘導、阻害剤なし及びコラーゲンゲル培養の細胞のアクチンの動態変化を示す図である。図１３は、コラーゲンゲル上で培養した臍帯由来ヒト間葉系幹細胞もの（ｇｅｌ）と、そうでない臍帯由来ヒト間葉系幹細胞（ｎｏｎ−ｃｏａｔｉｎｇ）の、未分化マーカー（Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ）の発現を示す図である。図１４は、臍帯ＭＳＣを阻害剤処理した骨芽細胞をβ−ＴＣＰとともに頭頂部に移植したヌードマウス、及び対照の切片標本のＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）染色像である（移植４週間後）。

以下、本発明を詳細に説明する。

１．骨芽細胞分化促進剤
本発明は、アクチン重合阻害物質を含む、骨芽細胞分化促進剤を提供する。

球状アクチン（Ｇアクチン）は分子量約４２ｋＤの球形タンパク質であり、これが螺旋状に重合して線維状アクチン（Ｆアクチン）を形成する。本明細書中、アクチン重合阻害物質は、この重合を阻害する物質を指す。

アクチン重合阻害物質としては、ラトランクリンＡ、ラトランクリンＢ、ラトランクリンＣ、ラトランクリンＤ等のラトランクリン類、スウィンホリドＡ、スウィンホリドＢ、スウィンホリドＣ、スウィンホリドＤ、スウィンホリドＥ、スウィンホリドＦ、スウィンホリドＧ、スウィンホリドＨ、スウィンホリドＩ、スウィンホリドＪ、スウィンホリドＫ等のスウィンホリド類、サイトカラシンＡ、サイトカラシンＢ、サイトカラシンＣ、サイトカラシンＤ、サイトカラシンＥ、サイトカラシンＦ、サイトカラシンＨ、サイトカラシンＪ等のサイトカラシン類等の低分子量化合物、コフィリン、プロフィリン、ビリン、フラグミン、アクトリンキン、ゲルゾリン、デパクチン等のアクチン結合タンパク質、及びアクチン結合タンパク質の活性を制御するタンパク質（例、コフィリンの活性を制御するＬＩＭキナーゼ（ＬＩＭＫ）等）が挙げられ、好ましくは、ラトランクリンＡ、スウィンホリドＡが挙げられる。

ラトランクリン類は、Ｇアクチン（モノマー）と１：１の複合体を形成してアクチン重合を阻害する。洗浄によって複合体からラトランクリンを除去することにより、アクチンの重合能は回復する。スウィンホリド類は、Ｇアクチンと１：１で結合してアクチン重合を阻害する他、Ｆアクチンの切断活性を有し、線維状アクチンを速やかに崩壊させる。

一態様において、本発明は、アクチン重合阻害物質をコードするベクターを含む、骨芽細胞分化促進剤を提供する。

前記ベクターがコードするアクチン重合阻害物質としては、コフィリン、プロフィリン、ビリン、フラグミン、アクトリンキン、ゲルゾリン、デパクチン等のアクチン結合タンパク質、及びアクチン結合タンパク質の活性を制御するタンパク質（例、コフィリンの活性を制御するＬＩＭキナーゼ（ＬＩＭＫ）等）が挙げられる。

アクチン重合阻害物質は、低分子量化合物の場合、例えば培養中に培地に添加することによって、細胞内に浸透（透過）させることによって導入し、骨細胞内のアクチンに接触させて作用させてもよい。培地中のアクチン重合阻害物質の濃度は、本発明の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。該物質は、通常、１ｎＭ〜１０μＭ、好ましくは１０ｎＭ〜８００ｎＭ、更に好ましくは１０ｎＭ〜５００ｎＭの濃度で使用される。

上記アクチン重合阻害物質は、単独で本発明の分化促進剤として用いることができるが、溶解促進剤、安定化剤、保存剤、抗酸化剤等の成分を更に含み得る。溶解促進剤としては、ジメチルスルホキシド、エタノール、メタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等が挙げられる。

なお、アクチン重合阻害物質は、低分子量化合物又はタンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶ由来のＴＡＴ及びポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクション等の手法を用いた培養によって細胞内に導入し、細胞内のアクチンに作用させてもよい。

一方、ＤＮＡの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体等のベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション等の手法によって細胞内に導入し、細胞内のアクチンに作用させることができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−６７６，２００６；Ｃｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１−８７２，２００７；Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８，ｐｐ．１９１７−１９２０，２００７）、アデノウイルスベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２，９４５−９４９，２００８）、アデノ随伴ウイルスベクター等が例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）等が含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用し得る（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２：９４９−９５３，２００８）。ベクターには、アクチン重合阻害物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイト等の制御配列を含むことができるし、更に、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばピューロマイシン耐性遺伝子等）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子等の選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧ等のレポーター遺伝子配列等を含むことができる。

また、ＲＮＡの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクション等の手法によって細胞に作用させても良く、分解を抑制するため、５−メチルシチジン及びｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ（ＴｒｉＬｉｎｋＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を取り込ませたＲＮＡを用いても良い（ＷａｒｒｅｎＬ，（２０１０）ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ．７：６１８−６３０）。

本発明の骨芽細胞分化促進剤は、骨芽細胞分化能を有する幹細胞から骨芽細胞への分化を促進することができる。

骨芽細胞は、骨組織の表面に存在し、骨細胞に分化して新しい骨をつくる働きを有する細胞をいう。なお、本発明の骨芽細胞分化促進剤を骨芽細胞分化能を有する幹細胞に用いた場合、その分化細胞（分化誘導させた細胞）は骨芽細胞のみならず、骨芽細胞分化能を有する幹細胞から骨への分化において観察される任意の細胞を意味し、例えば、骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅ）、前骨芽細胞（ｐｒｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、骨前駆細胞（ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌ）、又は間葉系幹細胞からやや分化が進行した間葉系前駆細胞等（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｐｒｅｃｕｒｓｏｒｃｅｌｌ）も挙げることができる。

本発明の骨芽細胞分化促進剤によって骨芽細胞への分化が促進される骨芽細胞分化能を有する幹細胞は、脊椎動物由来の細胞であることが好ましい。該脊椎動物としては、例えば、哺乳動物、鳥が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類等を挙げることが出来る。鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、オーストリッチ、エミュ、ダチョウ、ホロホロ鳥、ハト等を挙げることができる。脊椎動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはげっ歯類（マウス等）又は霊長類（ヒト等）である。

骨芽細胞分化能を有する幹細胞としては、例えば、間葉系幹（ＭＳ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）等が挙げられる。

間葉系幹細胞は、間葉に由来する体性幹細胞であり、骨系細胞、脂肪細胞及び筋肉細胞等の間葉系に属する細胞への分化能を持つ。また、外胚葉由来細胞、内胚葉由来細胞等、中胚葉性でない組織にまで分化できる可塑性を持っていることが示されている。間葉系幹細胞には、例えば、臍帯由来幹細胞、骨髄間葉系細胞及び脂肪由来幹細胞が含まれる。間葉系幹細胞は間葉系組織のある全ての組織（例、臍帯血、骨髄、脂肪組織、子宮内膜、真皮、骨格筋、骨膜、歯根膜、歯髄及び歯胚等）に存在すると考えられている。臍帯血とは、胎児と母体を繋ぐ胎児側の組織であるへその緒（臍帯）の中に含まれる血液をいう。臍帯血の中には、臍帯血由来幹細胞（造血幹細胞）が多量に含まれていることが知られていたが、臍帯や臍帯血には、造血幹細胞以外の体性幹細胞である間葉系幹細胞（臍帯（血）由来の間葉系幹細胞）が存在することが明らかとなっている。一方、骨髄間葉系幹細胞は骨髄間質細胞の中に含まれており、骨髄間質細胞は骨髄の中で主体となる造血細胞を支える細胞の一種である。骨髄間葉系幹細胞は、骨髄穿刺で容易に採取でき、培養技術も確立されている。脂肪組織由来の間葉系幹細胞は、比較的増殖が速く、細胞活性も高い。

生体においては、間葉系幹細胞は、例えば骨髄、末梢血、臍帯（血）、脂肪組織中に低頻度で存在する。間葉系幹細胞は、これらの組織から公知の方法で単離又は精製することが出来る。「単離又は精製」とは、天然に存在する状態とは異なる状態に人為的に置かれること、例えば、天然に存在する状態から、目的とする成分以外の成分を除去する操作が施されていることを意味する。

例えばヒトの臍帯から間葉系幹細胞を単離するには、ＲｏｍａｎｏｖＹ．Ａ．ら（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ．２００３；２１：１０５−１０．）によって報告された方法に準じて間葉系幹細胞を単離することができる。また、例えばヒトの骨髄からは、ＨａｙｎｅｓｗｏｒｔｈＳ．Ｅ．ら（Ｂｏｎｅ．１９９２；１３：８１−８．）によって報告された方法に準じて、骨髄細胞液を採取しながら行うことができる。得られた骨髄細胞液からは、ＰｉｔｔｅｎｇｅｒＭ．Ｆ．ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９；２８４：１４３−７．）によって報告された方法を用いて骨髄細胞液中に混在する他の細胞を除去し、間葉系幹細胞を単離することができる。また、例えばヒトの脂肪組織から間葉系幹細胞を単離する場合は、ＺｕｋＰ．Ａ．ら（ＴｉｓｓｕｅＥｎｇ．２００１Ａｐｒ；７：２１１−２８．，ＭｏｌＢｉｏｌＣｅｌｌ．２００２Ｄｅｃ；１３（１２）：４２７９−９５．）によって報告された方法を用いることができる。以上のようにして間葉系幹細胞を採取することができるが、その方法は上記の内容に限定されるものではない。

間葉系幹細胞は不死化された細胞であり得る。不死化とは、無限自律増殖能を獲得したことを意味する。間葉系細胞の不死化は、種々の不死化遺伝子の導入により行うことが出来る。例えば、Ｂｍｉ１遺伝子及びＴＥＲＴ遺伝子を導入したり（ＢＢＲＣ，ｖｏｌ．３５３，ｐ．６０−６６（２００７））、ＴＥＲＴ遺伝子及びヒトパピローマウイルスのＥ６及びＥ７遺伝子を導入すること（ＢＢＲＣ，ｖｏｌ．２９５，ｐ．３５４−３６１（２００２））により、間葉系幹細胞を不死化することが出来る。

胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。いずれもマウス胚性幹細胞である、ＥＢ５細胞は国立研究開発法人理化学研究所より、Ｄ３株はＡＴＣＣより、入手可能である。ＥＳ細胞の一つである核移植ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）は、細胞株を取り除いた卵子に体細胞の細胞核を移植して作ったクローン胚から樹立することができる。ＥＧ細胞は、始原生殖細胞をｍＳＣＦ、ＬＩＦ及びｂＦＧＦを含む培地中で培養することにより製造することが出来る（Ｃｅｌｌ，７０：８４１−８４７，１９９２）。

人工多能性幹細胞は、体細胞を、公知の方法等により初期化（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）することにより、多能性を誘導した細胞である。具体的には、線維芽細胞や末梢血単核球等分化した体細胞をＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ（ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ）、Ｇｌｉｓ１、Ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、ｌｉｎ２８、Ｅｓｒｒｂ等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の組み合わせのいずれかの発現により初期化して多分化能を誘導した細胞が挙げられる。好ましい初期化因子の組み合わせとしては、（１）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＭｙｃ（ｃ−Ｍｙｃ又はＬ−Ｍｙｃ）、（２）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８及びＬ−Ｍｙｃ（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，２０１３；３１：４５８−４６６）を挙げることが出来る。

Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄液や真皮結合組織等の皮膚組織から得ることができ、各臓器の結合組織にも散在する。また、この細胞は、多能性幹細胞と間葉系幹細胞の両方の性質を有する細胞であり、例えば、それぞれの細胞表面マーカーである「ＳＳＥＡ−３（Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ−３）」と「ＣＤ１０５」のダブル陽性として同定される。従って、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、これらの抗原マーカーを指標として生体組織から分離することができる。Ｍｕｓｅ細胞の分離法、同定法、及び特徴等の詳細は、国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号に開示されている。また、Ｗａｋａｏ，Ｓ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１０８，ｐ．９８７５−９８８０（２０１１）によって報告されているように、骨髄、皮膚等の間葉系細胞を培養して得たものをＭｕｓｅ細胞の母集団として用いる場合、ＳＳＥＡ−３陽性細胞の全てがＣＤ１０５陽性細胞であることが分かっている。従って、本発明においては、生体の間葉系組織又は培養間葉系幹細胞からＭｕｓｅ細胞を分離する場合は、単にＳＳＥＡ−３を抗原マーカーとしてＭｕｓｅ細胞を精製し、使用することができる。

骨芽細胞分化能を有する幹細胞は、本発明の骨芽細胞分化促進剤を用いられる前に、適切な培地中で接着培養されていてもよい。具体的には、例えば、適切な細胞外マトリックス上に、好ましくは担体表面に固相化された細胞外マトリックス上に、幹細胞の懸濁液を乗せて培養することにより幹細胞を分化させずに増殖させることができる。幹細胞を懸濁する溶液としては、特に限定されないが、幹細胞の培地（培養液）を好適に用いることができる。かかる幹細胞の培地は、使用する幹細胞の種類に応じて培養に適した自体公知の培地を用いることができる。用いられる基礎培地としては、特に限定されないが、例えばＭＥＭ培地、α−ＭＥＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＥａｇｌｅＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、ＧｌａｓｇｏｗＭＥＭ培地、ＩｍｐｒｏｖｅｄＭＥＭＺｉｎｃＯｐｔｉｏｎ培地、ハム培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地及びこれらの混合培地等が挙げられる。これらの培地は、血清（例えばウシ胎児血清、ヒト血清等）を含んでいてもよい。或いは、血清の代替添加物（例えばＫｎｏｃｋｏｕｔＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等）を用いてもよい。血清の濃度は特に限定されないが、通常５〜２０（ｖ／ｖ）％の範囲である。

更に上記培地には、自体公知の添加物を含有させることもできる。添加物としては、特に限定されないが、例えば成長因子（例えばインスリン等）、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清タンパク質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばＬ−グルタミン等）、還元剤（例えば２−メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、ｄ−ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ等）等が挙げられる。また、幹細胞を増殖させる場合には、通常、幹細胞の分化抑制剤（例えばＬＩＦ、Ｗｎｔ、ＴＧＦ−β、ｂＦＧＦ等）が用いられる。これらの添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含有させることができる。

また、本発明の骨芽細胞分化促進剤で骨芽細胞分化能を有する幹細胞の骨芽細胞への分化の誘導を促進する場合には、通常、予め又は本発明の骨芽細胞分化促進剤と同時に骨分化誘導因子が培地に添加される。かかる骨分化誘導因子は、使用する幹細胞に応じて適宜決定することができる。例えば幹細胞として間葉系幹細胞を用いて、これを骨芽細胞に分化誘導させる場合には、デキサメタゾン、タクロリムス及びシクロスポリン等の免疫抑制剤；ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７及びＢＭＰ−９等の骨形成タンパク質；ＴＧＦ−β等の骨形成液性因子；ヒドロコルチゾン、アスコルビン酸、β−グリセロリン酸等を用いることができるが、好ましくは、骨形成タンパク質が用いられ、更に好ましくは、ＢＭＰ−２が用いられる。これらの骨分化誘導因子は単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。また、添加される骨分化誘導因子の濃度は特に限定されず、それぞれ自体公知の濃度範囲内とすることができる。例えば、骨分化誘導因子は、通常、約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約３００μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ〜約３００ｎｇ／ｍｌの濃度となるように培地に添加することができる。

播種する骨芽細胞分化能を有する幹細胞の数（密度）は、用いる幹細胞の種類、培養方法、培養条件及び幹細胞の分化を誘導する対象等に応じて適宜設定することができる。細胞増殖を行う場合、その細胞数は、通常１０，０００〜５００，０００個／ｍｌ、好ましくは１０，０００〜１００，０００個／ｍｌ、より好ましくは１０，０００〜５０，０００個／ｍｌである。また、細胞の分化誘導を行う場合、その細胞数は、通常１００，０００〜１，０００，０００個／ｍｌ、好ましくは１００，０００〜５００，０００個／ｍｌ、より好ましくは１００，０００〜２５０，０００個／ｍｌである。

骨芽細胞分化能を有する幹細胞の培養条件は、細胞培養技術において通常用いられる条件であれば特に限定されず、例えば、培養温度は通常３０〜４０℃の範囲であり、好ましくは約３７℃が例示される。ＣＯ_２濃度は通常１〜１０％の範囲であり、好ましくは約５％が例示される。湿度は通常７０〜１００％の範囲であり、好ましくは８５〜９５％が例示される。

２．骨芽細胞分化誘導方法
本発明は、骨芽細胞分化能を有する幹細胞を、骨分化誘導因子及びアクチン重合阻害物質と共に培養することを含む、骨芽細胞分化誘導方法を提供する。

本発明の骨芽細胞分化誘導方法においては、「骨芽細胞分化能を有する幹細胞」、「骨分化誘導因子」、「アクチン重合阻害物質」に関しては、上記の１．骨芽細胞分化促進剤に記載したものを用いることができる。

上記方法における骨芽細胞分化能を有する幹細胞の培養は、浮遊培養若しくは接着培養又はそれらの組合せであり得る。本発明における「浮遊培養」は、細胞（又は細胞の凝集体）が培養液に浮遊して存在する状態を維持しつつ培養することを言う。「接着培養」は、細胞（又は細胞の凝集体）を培養器材等に接着させる条件で行う培養をいう。この場合、細胞が接着するとは、細胞又は細胞の凝集体と培養器材の間に、強固な細胞−基質間結合（ｃｅｌｌ−ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍｊｕｎｃｔｉｏｎ）ができることをいう。より詳細には、浮遊培養とは、細胞又は細胞の凝集体と培養器材等との間に強固な細胞−基質間結合を作らせない条件での培養をいい、接着培養とは、細胞又は細胞の凝集体と培養器材等との間に強固な細胞−基質間結合を作らせる条件での培養をいう。

浮遊培養を行う際に用いられる培養器は、浮遊培養することが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、培養皿（ディッシュ）、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、三角フラスコ、スピナーフラスコ又はローラーボトルが挙げられる。これらの培養器は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を低下させる目的で人工的に処理（例えば、ＭＰＣポリマー等の超親水性処理、タンパク低吸着処理等）されたもの等を使用できる。スピナーフラスコやローラーボトル等を用いて回転培養してもよい。培養器の培養面は、平底でもよいし、凹凸があってもよい。

接着培養を行う際に用いられる培養器は、接着培養することが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜培養のスケール、培養条件及び培養期間に応じた培養器を選択することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、培養皿（ディッシュ）、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、マイクロキャリア、ビーズ、スタックプレート、スピナーフラスコ又はローラーボトルが挙げられる。これらの培養器は、接着培養を可能とするために、細胞接着性であることが好ましい。細胞接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理された培養器が挙げられ、具体的には表面加工された培養器、又は、内部がコーティング剤で被覆された培養器が挙げられる。表面加工された培養器としては、正電荷処理等の表面加工された培養容器が挙げられる。コーティング剤としては、例えば、ラミニン［ラミニンα５β１γ１（以下、ラミニン５１１）、ラミニンα１β１γ１（以下、ラミニン１１１）等及びラミニン断片（ラミニン５１１Ｅ８等）を含む］、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン、ビトロネクチン（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）、シンセマックス（コーニング社）、マトリゲル等の細胞外マトリクス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等が挙げられる。

本発明の骨芽細胞分化誘導方法において細胞の培養に用いられる培地は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、ＧｌａｓｇｏｗＭＥＭ（ＧＭＥＭ）培地、ＩｍｐｒｏｖｅｄＭＥＭＺｉｎｃＯｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、ＥａｇｌｅＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、Ｆ−１２培地、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、又はこれらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。これらの培地は、無血清培地であってもよいし、血清（例えばウシ胎児血清、ヒト血清等）培地であってもよいが、無血清培地であることが好ましい。

無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本発明では、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に含まれる。

無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、或いはこれらの均等物等を適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製；現ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ：以下、ＫＳＲと記すこともある。）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄＬｉｐｉｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＧｌｕｔａｍａｘＴＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ｂ２７（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ｎ２サプリメント（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）が挙げられる。

調製の煩雑さを回避するために、かかる無血清培地として、市販のＫＳＲ（ライフテクノロジー（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製）を適量（例えば、約０．５％から約３０％、好ましくは約１％から約２０％）添加した無血清培地（例えば、Ｆ−１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％ＫＳＲ、１ｘＣｈｅｍｉｃａｌｌｙＤｅｆｉｎｅｄＬｉｐｉｄＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（ＣＤＬＣ）及び４５０μＭ１−モノチオグリセロールを添加した培地）を使用してもよい。また、ＫＳＲ同等品として特表２００１−５０８３０２に開示された培地が挙げられる。

本発明の骨芽細胞分化誘導方法における培養は、好ましくはゼノフリー条件で行われる。「ゼノフリー」とは、培養対象の細胞の生物種とは異なる生物種由来の成分が排除された条件を意味する。

播種する骨芽細胞分化能を有する幹細胞の濃度は、例えば、約１×１０^３〜約１×１０^８細胞／ｍｌ、好ましくは約３×１０^３〜約５×１０^７細胞／ｍｌ、より好ましくは約４×１０^３〜約２×１０^６細胞／ｍｌ、更に好ましくは、約４×１０^３〜約１×１０^６細胞／ｍｌ、より更に好ましくは約１×１０^４〜約１×１０^６細胞／ｍｌとすることができる。

培養温度、ＣＯ_２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃から約４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ_２濃度は、例えば約１％から約１０％、好ましくは約５％である。

本発明の骨芽細胞分化誘導方法における培養日数は、本発明の効果が得られる限り特に限定されないが、例えば、５日間以上、６日間以上、７日間以上、８日間以上、９日間以上、１０日間以上又は１５日間以上であり、２０日間以下である。上記培養日数は、好ましくは、１０日間以上又は１５日間以上であり、２０日間以下である。

本発明の骨芽細胞分化誘導方法において、骨分化誘導因子は、骨芽細胞分化能を有する幹細胞が骨芽細胞に分化する限り特に限定されないが、通常、約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約３００μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ〜約３００ｎｇ／ｍｌの濃度となるように培地に添加することができる。

また、骨分化誘導因子を培地に添加するタイミングは、骨芽細胞分化能を有する幹細胞が骨芽細胞に分化する限り特に限定されないが、例えば、培養開始と同時（０日）、培養開始後１日、２日、３日、４日又は５日であり得、好ましくは、培養開始と同時（０日）、培養開始後１日、２日又は３日であり得、より好ましくは、培養開始と同時（０日）である。また、添加する回数は、当業者が適宜決定することができるが、通常、１回以上である。尚、本発明の方法においては、必要に応じて、骨分化誘導因子を培地に添加した時点を培養０日目とすることができる。骨芽細胞分化能を有する幹細胞は、当該時点まで、適切な培地中で培養（前培養）され得る。前培養の期間は、例えば、６時間〜３日、好ましくは１２時間〜２日、より好ましくは２４時間である。

骨分化誘導因子を培地に含有させる時間は、骨芽細胞分化能を有する幹細胞が骨芽細胞に分化する限り特に限定されないが、例えば、３日間以上、５日間以上、６日間以上、７日間以上、８日間以上、９日間以上、１０日間以上又は１５日間以上であり、２０日間以下である。上記日数は、好ましくは、１０日間以上又は１５日間以上であり、２０日間以下である。骨分化誘導因子は、培養の間常に細胞に作用させてもよい。

本発明の骨芽細胞分化誘導方法において、アクチン重合阻害物質は、骨芽細胞分化能を有する幹細胞の骨芽細胞への分化を促進する限り特に限定されないが、通常、１ｎＭ〜１０μＭ、好ましくは１０ｎＭ〜８００ｎＭ、更に好ましくは１０ｎＭ〜５００ｎＭの濃度で使用される。

アクチン重合阻害物質を、培地に添加するタイミングは、骨芽細胞分化能を有する幹細胞の骨芽細胞への分化を促進する限り特に限定されないが、例えば、培養開始と同時（０日）、培養開始後１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日又は１５日であり得、好ましくは、培養開始後３日及び７日である。また、添加する回数は、当業者が適宜決定することができるが、通常、１又は２回以上である。

アクチン重合阻害物質を、培地に含有させる時間は、骨芽細胞分化能を有する幹細胞の骨芽細胞への分化を促進する限り特に限定されないが、例えば、１時間〜２０時間、２時間〜１５時間、３時間〜１０時間、４時間〜８時間、５時間〜７時間であり得る

アクチン重合阻害物質と骨芽細胞分化能を有する幹細胞との培養は、全培養過程を通して１回のみとすることもできるし、複数回に分けて行うこともできる。

培養中に、骨芽細胞分化能を有する幹細胞と骨分化誘導因子及び／又はアクチン重合阻害物質との培養を終了する場合、例えば、該骨分化誘導因子及び／又はアクチン重合阻害物質が培地中から除去される。当該除去は、例えば、元の骨分化誘導因子及びアクチン重合阻害物質を含む培地を、骨分化誘導因子及び／又はアクチン重合阻害物質を含まない培地と交換することにより行われる。培地交換操作を行う場合、例えば、元ある培地を捨てずに新しい培地を加える操作（培地添加操作）、元ある培地を半量程度（元ある培地の体積量の３０〜９０％程度、例えば４０〜６０％程度）捨てて新しい培地を半量程度（元ある培地の体積量の３０〜９０％程度、例えば４０〜６０％程度）加える操作（半量培地交換操作）、元ある培地を全量程度（元ある培地の体積量の９０％以上）捨てて新しい培地を全量程度（元ある培地の体積量の９０％以上）加える操作（全量培地交換操作）が挙げられる。

ある時点で特定の成分（例えば、骨分化誘導因子、アクチン重合阻害物質）を添加する場合、例えば、終濃度を計算した上で、元ある培地を半量程度捨てて、特定の成分を終濃度よりも高い濃度（具体的には終濃度の１．５〜３．０倍、例えば終濃度の約２倍の濃度）で含む新しい培地を半量程度加える操作（半量培地交換操作）を行ってもよい。

ある時点で、元の培地に含まれる特定の成分の濃度を維持する場合、例えば元ある培地を半量程度捨てて、元の培地に含まれる濃度と同じ濃度の特定の成分を含む新しい培地を半量程度加える操作を行ってもよい。

ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、例えば、培地交換操作を、１日に複数回、好ましくは１時間以内に複数回（例えば２〜３回）行ってもよい。また、ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、細胞又は凝集体を別の培養容器に移してもよい。

培地交換操作に用いる道具は特に限定されないが、例えば、ピペッター、マイクロピペット（ピペットマン）、マルチチャンネルマイクロピペット（マルチチャンネルピペットマン）、連続分注器、等が挙げられる。例えば、培養容器として９６ウェルプレートを用いる場合、マルチチャンネルマイクロピペット（マルチチャンネルピペットマン）を使ってもよい。

以上のように、本発明の骨芽細胞分化誘導方法を用いることにより骨芽細胞分化能を有する幹細胞から骨芽細胞への分化を誘導することができる。本発明の骨芽細胞分化誘導方法により骨芽細胞が得られていることの確認は、骨分化マーカー遺伝子発現又は骨分化マーカー酵素の活性を測定して骨芽細胞分化能を有する幹細胞の分化状況を確認することによって実施することができる。従って、本発明の骨芽細胞分化誘導方法は、骨分化マーカー遺伝子発現又は骨分化マーカー酵素の活性を測定して骨芽細胞分化能を有する幹細胞の分化状況を確認することを更に含んでよい。骨分化マーカー遺伝子としては、ＡＬＰ（アルカリフォスファターゼ）、オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ、ＯＣ）、オステオポンチン（Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）、Ｒｕｎｘ２などが挙げられ、好ましくは、ＡＬＰが挙げられる。

Ｒｕｎｘ２は骨形成において必須の転写因子である。Ｒｕｎｘ２は、生体での間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化において必要不可欠な役割を果たしている。間葉系幹細胞へのＲｕｎｘ２の強制発現は、ＯＣ（オステオカルシン）、ＢＳＰ（Ｂｏｎｅｓｉａｌｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＡＬＰ（アルカリフォスファターゼ）、ＣＯＬ１Ａ１等の骨芽細胞特異的遺伝子を増大させる。

ＡＬＰ（アルカリフォスファターゼ）は、骨芽細胞の早期から中期分化マーカーである。骨芽細胞の膜表面と骨芽細胞より分泌される基質小胞に多く含まれ、石灰化基質産生の開始に関与する。

オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ、ＯＣ）は骨芽細胞特異的に発現し、骨形成の促進に寄与すると考えられている。

更に、骨分化細胞が産生した石灰化成分を検出する方法を用いることもできる。当該検出方法としては、特に限定されないが、例えばフォンコッサ（ＶｏｎＫｏｓｓａ）染色及びアリザリンレッド染色等が挙げられる。

フォンコッサ染色は、硝酸銀を用いて石灰化成分であるリン酸カルシウムを検出する方法である。具体的には、パラフィン等で固定した細胞に１〜５重量％の硝酸銀水溶液を反応させる。反応後、光を当てることによってリン酸カルシウムが存在する部分が黒く呈色されることになる。この呈色部分の面積を計測する等によって骨分化を評価することができる。

アリザリンレッド染色は、アリザリンレッドＳがカルシウムイオンに対して特異的に結合し、カルシウムイオンの沈着部分を染色することを利用した方法である。具体的には、パラフィン等で固定した細胞に０．０１〜５重量％のアリザリンレッドＳ溶液を反応させると、赤紫〜橙赤色の呈色反応が見られる。この呈色部分の面積を計測する等によって骨分化を評価することができる。

３．骨治療材
本発明は、本発明の骨芽細胞分化誘導方法により製造された骨芽細胞を含む、骨治療材を提供する。また、本発明の骨芽細胞分化誘導方法は、骨治療材を製造するための方法であり得る。

骨治療材とは、骨組織の修復、再生のために生体内に導入する、骨芽細胞を含有する移植材料をいう。移植材料は、インビトロで部分的若しくは完全に骨組織を再生させて、同一又は別の個体に移植する材料を包含する。本発明で得られた骨芽細胞は、移植材料の作製に使用することができる。骨芽細胞自体も移植材料になる。従って、骨芽細胞を細胞製剤として患者に移植することもできるし、β−ＴＣＰ（β−リン酸三カルシウム）、ヒドロキシアパタイト、生体吸収性セラミック等の人工材料からなる基材（スキャホールド）とともに修復や再生が必要な骨組織に移植したり、スキャホールドとともに培養してから移植することができる。これらの場合、スキャホールドは移植目的に応じて様々な３次元的な形状を作らせることができる。また、当該細胞は、投与対象にとって自家移植又は他家移植のいずれであってもよく、他家移植の場合、同種同系、同種異系又は異種細胞のいずれであっても良い。特に、本発明の骨治療材に臍帯由来の間葉系幹細胞から分化した骨芽細胞を用いる場合、臍帯由来の間葉系幹細胞はＨＬＡＩＩ発現がないため、同種異系の移植が可能である。

本発明により得られる骨芽細胞（骨治療材）を用いて治療する対象となる疾患としては、歯周病、歯槽骨吸収、骨腫瘍、外傷や骨髄炎等にともなう骨欠損、また骨腫瘍等の掻爬後の骨欠損、骨折、骨粗しょう症、口腔関連の難治性創傷、顎骨破損、関節リウマチ、突発性大腿骨頭壊死、変形性関節症、腰椎変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、椎間板ヘルニア、脊髄損傷、脊椎分離症、脊椎分離すべり症、脊椎側弯症、頸椎症性脊髄症、後縦靭帯骨化症、変形性股関節症、変形性膝関節症、大腿骨頭すべり症、骨軟化症、下顎再建術等の複雑骨折により破壊された骨折部位の再建術、手術後の骨の修復（心臓手術後の胸骨の修復等）、人工足関節手術に伴う欠損部の修復、骨髄炎、骨壊死等が挙げられる。また、骨芽細胞を移植すれば、骨移植、人工骨移植、人工関節やインプラントと併用し治療効果を高められる可能性がある。また骨芽細胞を３次元的なスキャホールド等を用いて培養して種々な形態の骨組織を体外で作成し、その骨組織を移植することによって、上記の疾患の治療を行うこともできる。それ以外にも骨芽細胞の欠損、不足若しくは機能低下に関係するさまざまな疾患が対象となる。

本発明で得られる骨芽細胞はまた、疾患の治療に限らず、美容目的で用いることもできる。例えば事故や手術等により欠損した部位に骨芽細胞若しくはそれにより作製された骨組織を移植することで、骨基質を産生させて欠損部位を修復し、目立たなくすることができる。

本発明の骨治療材は、上記骨芽細胞に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体、安定剤や緩衝液成分、他の治療薬やサプリメント等を含み得る。医薬上許容され得る担体としては、例えば、水、生理食塩水等の希釈剤等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。

本発明の骨治療材の投与量、投与回数、投与期間等、及び本発明の骨治療材における骨芽細胞の濃度は特に制限されず、投与対象の体調、病状、体重、年齢、性別等によって適宜調整することができ、他の手術や投薬治療を併用することもできる。

本発明の骨治療材は、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等への移植用として用いることができる。本発の骨治療材は、好ましくは霊長類又はげっ歯類への移植用であり、より好ましくはヒトへの移植用である。

本発明の治療材は、医療従事者により、ガイドラインに沿った適切な移植方法に従って移植される。例えば、粘膜骨膜を切開して、移植予定部位の顎骨を露出させ該部位に本発明の治療材を投与することにより、移植することができる。

治療上有効量の本発明の治療材を、骨組織修復を必要とする部位に移植すると、移植した細胞が骨細胞へと分化し、該骨細胞が欠損部位を補うことにより、骨組織が修復され治療効果が達成される。その結果、本発明の治療材により骨組織を再生することが可能となる。

なお、本明細書中、「有効量」とは、所望の効果を生み出す活性成分（例、骨芽細胞）の量を意味する。本明細書中で使用される場合、「治療上有効量」とは、被験体に投与される場合、所望の治療効果（例、骨を再生する等）をもたらす活性成分の量を意味する。治療上有効量は、一度に投与（移植）されてもよく、複数回に分けて投与（移植）されてもよい。移植の適用回数は疾患に応じて医療従事者、ガイドラインに従って決定される。また複数回移植を行う場合、インターバルは特に限定されないが、数日〜数週間の期間を置いても良い。

４．骨再生治療方法
本発明は、骨芽細胞分化能を有する幹細胞を、骨分化誘導因子及びアクチン重合阻害物質と共に培養し、得られた骨芽細胞を骨欠損部位に移植することを含む、骨再生治療方法も提供する。

上記方法は、培養された細胞から骨芽細胞を単離することを含み得る。骨芽細胞が「単離」されているとは、目的とする骨芽細胞以外の細胞を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。従って、最も好ましくは、「単離された骨芽細胞」には、培養対象の細胞や組織から産生され細胞や組織及び培地中に含まれている骨芽細胞以外の細胞は、包含されない。「単離された骨芽細胞」の純度（総細胞数に占める骨芽細胞数の百分率）は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９９％以上、更に好ましくは１００％である。本発明においては、「単離された骨芽細胞」の純度が１００％未満の場合、「単離された骨芽細胞」中に存在する骨芽細胞以外の細胞は、骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅ）、前骨芽細胞（ｐｒｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、骨前駆細胞（ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌ）、間葉系幹細胞からやや分化が進行した間葉系前駆細胞、又はこれらの組合せであることが好ましい。

５．骨治療用キット
本発明は、
上記本発明の骨芽細胞分化促進剤及び
骨芽細胞分化能を有する幹細胞
を含む、骨治療用キットを提供する。

上記骨治療用キットは、例えば、上記本発明の骨芽細胞分化促進剤を、上記本発明の骨芽細胞分化誘導方法に記載されたように、骨芽細胞分化能を有する幹細胞に対して使用して、骨芽細胞を製造し、更に該骨芽細胞を含む骨治療材を製造して、上記疾患を有する被験体に移植することによって、疾患の治療を行うことができる。

本発明のキットは、上記本発明の骨芽細胞分化促進剤及び骨芽細胞分化能を有する幹細胞を別々の容器に含む。骨芽細胞分化能を有する幹細胞は、複数回にわたって増殖及び分化誘導を行うことを可能にするために、凍結保存された形態で提供されることが好ましい。凍結保存は、例えば、５〜２０％のジメチルスルホキシド、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコールなどの凍害防御剤を含む培養液などの生理的溶液に細胞を懸濁しクライオチューブに詰めて冷却し、最終的に−８０℃若しくは−１９６℃で凍結することによって行われる。或いは、ＪＰ５６３０９７９Ｂ２に記載の方法に従って凍結保存を行ってもよい。

更に本発明のキットは、本発明の骨芽細胞分化促進剤及び骨芽細胞分化能を有する幹細胞を、骨治療に使用することができる、又は使用すべきであることを記載した説明書を含んでいてもよい。

上記骨治療用キットは、骨分化マーカー遺伝子の発現を検出し得る物質を更に含むことが好ましい。骨分化マーカーは、間葉系幹細胞の骨分化を確認し得るマーカーであれば特に限定されず、例えば上記の分化誘導方法で示したマーカーを用いることができる。好ましくは、ＢＭＰ２、ＡＬＰ及びＯＣＮの骨分化マーカーが用いられる。

上記骨治療用キットは、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体、安定剤や緩衝液成分、他の治療薬やサプリメント等を含み得る。医薬上許容され得る担体としては、例えば、水、生理食塩水等の希釈剤等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。

［実施例１］
（実験条件）
ゲル上培養における実験条件は以下の通りである。３．０ｍｇ／ｍｌ，ｐＨ３．０に調整された豚腱由来ＴｙｐｅＩコラーゲン溶液ＣｅｌｌｍａｔｒｉｘＴｙｐｅＩ−Ａ４ｍｌに濃縮培地を０．５ｍｌ加え撹拌し、重炭酸ナトリウム及びＨＥＰＥＳを含む０．０５Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加えて更に撹拌したものをコラーゲン混合溶液とし、６０ｍｍディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に薄く広げて、３７℃で２０分静置した。そこへ５ｘ１０^４ｃｅｌｌ／ｍｌのＤ−ＭＥＭ（Ｌｏｗ−ｇｌｕｃｏｓｅ，１０％ＦＢＳ，ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（１００Ｕ／ｍｌ），ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００μｇ／ｍｌ）添加）細胞懸濁液を５ｍｌ／ディッシュで播種し、２４時間インキュベートした。
また阻害剤実験については、５ｘ１０^４ｃｅｌｌ／ｍｌのＤ−ＭＥＭ（Ｌｏｗ−ｇｌｕｃｏｓｅ，１０％ＦＢＳ，ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（１００Ｕ／ｍＬ），ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００μｇ／ｍＬ）添加）細胞懸濁液を、５ｍｌ／ディッシュで播種し２４時間インキュベートした。その後、ＢＭＰ−２を最終濃度３００ｎｇ／ｍｌとなるように添加し（この日を培養０日目とする）、培養３日目及び７日目に無血清培地中にスウィンホリドＡを１００ｎＭ、ラトランクリンＡを４００ｎＭとなるように添加し、６時間作用させた。処理後、再びＢＭＰ−２を含む培地に戻し、培養後１０日目に細胞を回収しＡＬＰ遺伝子の発現解析をＲＴ−ＰＣＲで行った。

これまでの細胞外環境設計による幹細胞の操作技術は、ＢＭＰ−２等の液性因子添加による外因性シグナル誘発による分化誘導調節が主体であった。しかしながら、浮腫発現等の副作用や必要な部位への局所投与が必要である等の面から臨床応用への問題点や課題があった。そこで本発明では新規な分化制御手法として細胞挙動を介した内因性シグナリング誘発に基づく培養手法を考察した。

臍帯ＭＳＣは、他の細胞種と同様、細胞周囲を細胞外マトリックス（ＥＣＭ；ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ）に囲まれている。ＥＣＭは、単に細胞接着のための足場を提供するだけでなく、細胞膜表面に存在する受容体を介し、細胞の増殖、分化、遊走等多くの生理活性に寄与することが報告されている。コラーゲンは細胞の接着に関与する細胞接着分子と結合し、細胞内シグナルを活性化することが可能であり、細胞外マトリックスを構成する代表的な分子である。このコラーゲン基質を用いて臍帯ＭＳＣを培養すると未分化／骨芽細胞ともにＡＬＰ活性及び上昇が見られ、特にコラーゲンゲル上培養では顕著なＡＬＰ遺伝子発現上昇が観察され、骨髄ＭＳＣと同レベルまで上昇した（図２）。我々はコラーゲン比較実験においてコラーゲンゲル上培養が有効であるという知見を得た（図３〜５）。

これらの制御機構について「ＢＭＰ−２−ＢＭＰｒｅｃｅｐｔｏｒＩＩ（ＢＭＰＲＩＩ）−ｃｏｆｉｌｉｎ」伝達経路（図６）を解析したところ、ＢＭＰＲＩＩとｃｏｆｉｌｉｎともにｍＲＮＡ発現上昇が見られた（図７、８）。ｃｏｆｉｌｉｎはアクチンフィラメント（Ｆ−ａｃｔｉｎ）の脱重合・切断因子であるため、ｃｏｆｉｌｉｎが活性化するとＦ−ａｃｔｉｎはＧ−ａｃｔｉｎへ移行することが知られている。

細胞製品を製造・供給するシステムを実現するためには可及的に特別な処理をすることなく移植細胞を用意でき、細胞の取扱も容易でなければならない。ゲル上培養では細胞採取のためコラゲナーゼ処理を要する等手間がかかり、実用化には適していない。そのため、通常の培養で細胞数を確保しつつ、分化促進を誘導する臍帯ＭＳＣの新規培養法の設計と最適化が重要となる。

ゲル上培養におけるアクチンの細胞内局在の観察結果から、分化前に発現が見られないＧ−ａｃｔｉｎは培養期間を経て細胞内での顕著な発現亢進を確認することができた（図９）。得られた知見から臍帯ＭＳＣは、ゲル上培養することにより骨芽細胞分化を促進するがその作用機序にはＦ−ａｃｔｉｎの脱重合が大きく関与していることが示唆された。そこで、アクチン重合阻害物質を用いて臍帯ＭＳＣを処理すれば骨芽細胞分化誘導できるのではないかと考えた。

そこで、我々は２種類のアクチン重合阻害物質を用いて骨分化促進の検討を行った。ＢＭＰ−２で骨芽細胞分化誘導後３日目にアクチン阻害剤のラトランクリンＡ（ＬａｔｒｕｎｃｕｌｉｎＡ）、スウィンホリドＡ（ＳｗｉｎｈｏｌｉｄｅＡ）で処理した場合、どちらの添加群においてもＡＬＰｍＲＮＡの発現上昇が見られた（図１０）。アクチンの動態変化については、阻害剤で処理した細胞はゲル上培養で観察される形態（図９）と同様の細胞内局在変化を確認した。即ち、アクチンの動態変化については、阻害剤で処理した細胞はＦ−ａｃｔｉｎが崩壊するが、その後培養を重ねるとＦ−ａｃｔｉｎは再構成し、Ｇ−ａｃｔｉｎの発現も多く見られ（図１１、１２）、ゲル上培養での形態（図９）と同様の細胞内局在変化を示した。本実験の結果から、アクチン重合阻害物質で臍帯ＭＳＣを処理すれば、骨芽細胞分化を促進することが示唆された。

一方で、幹細胞から多様な細胞が分化誘導される過程では均質な分化細胞群を安定して得ることが難しいことも課題としてある。その主な原因は細胞不均質性や多方向且つ段階的に進行する分化誘導過程において細胞間コミュニケーションや誘導等の細胞挙動を伴っているからと考えられる。臍帯ＭＳＣは分化誘導後もＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ等の未分化マーカーの高発現が維持されるが、コラーゲンゲル培養では長期間の培養後、未分化マーカーの発現は顕著に減少する（図１３）。

［実施例２］
（実験方法）
臍帯ＭＳＣを１０％ＦＢＳ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（１００Ｕ／ｍＬ）、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００μｇ／ｍＬ）を含むＤ−ＭＥＭ（Ｌｏｗ−ｇｌｕｃｏｓｅ）とともに１００ｍｍディッシュに播種し２４時間インキュベートした。その後、ＢＭＰ−２を最終濃度３００ｎｇ／ｍｌとなるように添加し４００ｎＭラトランクリンＡを作用させ骨芽細胞を作製した（この日を培養０日目とする）。培養１０日目に０．０２５％トリプシン溶液を用いて剥離し、３ｘ１０^６ｃｅｌｌｓの細胞とβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）の複合体を形成し、１０週齢の雄性ヌードマウス頭蓋骨に移植した。

（実験結果）
臍帯ＭＳＣを阻害剤処理した骨芽細胞をβ−ＴＣＰとともにヌードマウスへ全身麻酔下、頭頂部に移植した。対照群にはＢＭＰ−２で分化誘導した骨芽細胞とβ−ＴＣＰの複合物を移植した。

移植４週間後、切片標本を作成しＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）染色による評価を行ったところ、阻害剤処理した臍帯ＭＳＣ移植群では複合体の吸収が進み、新生骨形成が確認された（図１４）。

臍帯ＭＳＣは無侵襲で採取でき、通常は医療廃棄物として取り扱われるためバンキングしやすく安定供給が可能であることから、他の成体組織由来ＭＳＣを用いた骨再生よりも利点が多い。

本分化誘導法は、アクチン重合阻害物質を応用した新規培養技術により、遺伝子操作なしにヒト臍帯ＭＳＣから骨再生のために移植用細胞製剤として骨芽細胞を大量生産することを可能とする。

本発明により、骨再生のための移植用細胞製剤として骨芽細胞を大量生産することが可能となる。特に、臍帯由来間葉系幹細胞を用いる場合、該細胞は無侵襲で採取でき、通常は医療廃棄物として取り扱われるためバンキングしやすく、安定供給が可能であるといった利点を更に有する。

本出願は、２０１８年３月３０日出願の日本国特許出願、特願２０１８−０６９６９５を基礎としており、その内容は全て本明細書に包含される。

Claims

臍帯由来間葉系幹細胞を、骨分化誘導因子及びアクチン重合阻害物質と共に培養することを含む、骨芽細胞分化誘導方法。
コーティングなしの培養器での骨芽細胞分化促進のための、請求項１に記載の方法。
培養器が正電荷処理の表面加工をされた培養器である、請求項２に記載の方法。
骨分化誘導因子が、骨形成タンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
骨形成タンパク質がBMP-2である、請求項４に記載の方法。
アクチン重合阻害物質が、ラトランクリンＡ及び/又はスウィンホリドＡである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
アクチン重合阻害物質が、ラトランクリンＡである、請求項６に記載の方法。
骨分化マーカー遺伝子発現又は骨分化マーカー酵素の活性を測定して骨芽細胞分化能を有する幹細胞の分化状況を確認することを更に含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
骨分化マーカー遺伝子がALP遺伝子であり、骨分化マーカー酵素がALPである、請求項８に記載の方法。
培養が、5日間以上行われる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
培養開始と同時（0日）、培養開始後1日、2日、3日、4日又は5日に、培地中に骨分化誘導因子を含有させる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
培養開始と同時（0日）、培養開始後1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日又は15日に、培地中にアクチン重合阻害物質を含有させる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
骨治療材を製造するための方法である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
アクチン重合阻害物質を含む、臍帯由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞分化促進剤及び
臍帯由来間葉系幹細胞
を含む、骨治療用キット。