JP6755640B2 - 甘味受容体キメラタンパク質及びその利用 - Google Patents
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Description
本発明は、甘味受容体キメラタンパク質、キメラＧタンパク質、及びそれらの利用に関する。甘味受容体タンパク質及びＧタンパク質を発現する細胞は、甘味物質や甘味調節物質の検出等に有用である。
味覚受容体の一部は、T1Rファミリーに属する７回膜貫通型のＧタンパク質共役受容体
（GPCR）として同定されている。T1Rファミリーには、T1R1、T1R2、及びT1R3の３種類の
サブユニットが存在し、T1R2及びT1R3からなるヘテロ二量体は甘味受容体として機能することが知られている（マウスでは非特許文献１、ヒトでは特許文献１）。また、T1R1及びT1R3からなるヘテロ二量体はうま味受容体として機能することが知られている（マウスでは非特許文献２、ヒトでは特許文献１）。そして、甘味受容体及びＧタンパク質αサブユニット（Gα）を発現する細胞を用いて、甘味受容体に特異的に結合するリガンド化合物
、すなわち甘味物質又は甘味を調整する物質を検出する方法が提案されている（特許文献１）。
（GPCR）として同定されている。T1Rファミリーには、T1R1、T1R2、及びT1R3の３種類の
サブユニットが存在し、T1R2及びT1R3からなるヘテロ二量体は甘味受容体として機能することが知られている（マウスでは非特許文献１、ヒトでは特許文献１）。また、T1R1及びT1R3からなるヘテロ二量体はうま味受容体として機能することが知られている（マウスでは非特許文献２、ヒトでは特許文献１）。そして、甘味受容体及びＧタンパク質αサブユニット（Gα）を発現する細胞を用いて、甘味受容体に特異的に結合するリガンド化合物
、すなわち甘味物質又は甘味を調整する物質を検出する方法が提案されている（特許文献１）。
また、ヒトT1R2とマウスT1R2とのキメラタンパク質（非特許文献３）、及び、ヒトT1R3とマウスT1R3とのキメラタンパク質（非特許文献３、４）が作製され、甘味受容におけるシステインリッチドメイン（CRD）の必要性について報告されている。しかしながら、特
定の構造を有するキメラT1R2又はキメラT1R3が、天然型T1R2及びT1R3よりも甘味受容体活性化物質の検出に適していることは知られていない。
定の構造を有するキメラT1R2又はキメラT1R3が、天然型T1R2及びT1R3よりも甘味受容体活性化物質の検出に適していることは知られていない。
一方、味覚特異的Ｇタンパク質として、Gqファミリー、ガストデューシン、トランスデューシン等が知られており、ガストデューシンとトランスデューシンは、受容体との作用においては同等の機能であることが知られている（非特許文献５）。
Gαに関しては、Gαqタンパク質変異体のＣ末端がマウストランスデューシンαサブユ
ニットのＣ末端の４４個のアミノ酸で置換されたキメラタンパク質が知られている（特許文献２）。このキメラタンパク質は、プロミスキティ（promiscuity）が上昇したことが
開示されている（特許文献２）。尚、この文献には、置換し得るトランスデューシンαサブユニットのＣ末端のアミノ酸は４４個までと記載されている。
ニットのＣ末端の４４個のアミノ酸で置換されたキメラタンパク質が知られている（特許文献２）。このキメラタンパク質は、プロミスキティ（promiscuity）が上昇したことが
開示されている（特許文献２）。尚、この文献には、置換し得るトランスデューシンαサブユニットのＣ末端のアミノ酸は４４個までと記載されている。
さらに、ラットGα15タンパク質の最終の４４個のアミノ酸が、ガストデューシンαサ
ブユニットの最終の４４個のアミノ酸に置換されている、キメラＧタンパク質が開示されている（特許文献３）。
ブユニットの最終の４４個のアミノ酸に置換されている、キメラＧタンパク質が開示されている（特許文献３）。
Nelson, G. et al., Cell, 106:381-390 (2001)
Nelson, G. et al., Nature, 416:199-202 (2002)
Ohta, K., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 406:435-438 (2011)
Jiang, P. et al., J. Biol. Chem., 279(43):45068-45075 (2004)
Hoon, M.A. et al., Biochem. J., 309:629-636 (1995)
本発明は、甘味物質や甘味調節物質の検出に有用な、キメラT1R2及びキメラT1R3、並びにそれらを利用して甘味物質や甘味調節物質を検出する技術を提供することを課題とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、特定の構造を有するキメラT1R2及びキメラT1R3が、甘味物質や甘味調節物質の検出に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）Ｔ１Ｒ２タンパク質及びＴ１Ｒ３タンパク質を発現する細胞に被検物質を接触させる工程と、Ｔ１Ｒ２タンパク質及び／又はＴ１Ｒ３タンパク質と前記被検物質との相互作用を検出する工程を含む、甘味物質又は甘味調節物質を検出する方法であって、
ａ）Ｔ１Ｒ２タンパク質が、以下のいずれかのキメラＴ１Ｒ２タンパク質から選ばれ、
ａ１）ヒトＴ１Ｒ２タンパク質の１〜４７０位の領域と、マウスＴ１Ｒ２タンパク質の４７５〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ２タンパク質、
ａ２）ヒトＴ１Ｒ２タンパク質の１〜４８０位の領域と、マウスＴ１Ｒ２タンパク質の４８５〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ２タンパク質、
ａ３）ヒトＴ１Ｒ２タンパク質の１〜４８９位の領域と、マウスＴ１Ｒ２タンパク質の４９４〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ２タンパク質、
かつ／又は
ｂ）Ｔ１Ｒ３タンパク質が、以下のいずれかのキメラＴ１Ｒ３タンパク質から選ばれる、前記方法。
ｂ１）ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の１〜６３位の領域と、マウスＴ１Ｒ３タンパク質の６４〜５３９位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ３タンパク質、
ｂ２）マウスＴ１Ｒ３タンパク質の１〜６３位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の６４〜１６２位の領域と、マウスＴ１Ｒ３タンパク質の１６３〜５３９位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ３タンパク質、
ｂ３）マウスＴ１Ｒ３タンパク質の１〜１６２位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の１６３〜２４２位の領域と、マウスＴ１Ｒ３タンパク質の２４３〜５３９位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ３タンパク質。
（２）前記甘味調節物質を検出する方法であって、前記Ｔ１Ｒ２タンパク質及びＴ１Ｒ３タンパク質を発現する細胞に被検物質を接触させる工程において、被検物質と共に甘味物質を前記細胞に接触させる、方法。
（３）少なくともＴ１Ｒ２タンパク質がキメラＴ１Ｒ２タンパク質である、前記方法。
（４）Ｔ１Ｒ２タンパク質及びＴ１Ｒ３タンパク質の両方が、キメラＴ１Ｒ２タンパク質及びキメラＴ１Ｒ３タンパク質である、前記方法。
（５）キメラＴ１Ｒ２タンパク質が、配列番号１８、２２、及び１４から選ばれるアミノ酸配列を有する、前記方法。
（６）キメラＴ１Ｒ３タンパク質が、配列番号３０、３７、及び４１から選ばれるアミノ酸配列を有する、前記方法。
（７）前記細胞がさらにＧタンパク質αサブユニットを発現する、前記方法。
（８）Ｇタンパク質αサブユニットが、ラットＧα15の１〜３２７位の領域と、トランスデューシンαサブユニットの３０７〜３５４位の領域が、この順で融合したキメラＧαタンパク質であって、前記トランスデューシンαサブユニットの３０７〜３５４位の領域のうち、３１２位のメチオニン残基がロイシン残基に、３１６位のバリン残基がアスパラギン酸残基に各々置換されているキメラＧαタンパク質である、前記方法。
（９）前記キメラＧαタンパク質が配列番号５０のアミノ酸配列を有する、前記方法。
（１０）Ｔ１Ｒ２タンパク質及び／又はＴ１Ｒ３タンパク質と被検物質との相互作用を、細胞内遊離カルシウムイオン濃度の変化により検出する、前記方法。
（１１）前記細胞が動物細胞、昆虫細胞又は酵母である、前記方法。
（１２）前記細胞がヒト由来の培養細胞である、前記方法。
（１３）前記細胞がＨＥＫ細胞である、前記方法。
（１４）Ｔ１Ｒ２タンパク質及びＴ１Ｒ３タンパク質を発現する細胞であって、
ａ）Ｔ１Ｒ２タンパク質が、以下のいずれかのキメラＴ１Ｒ２タンパク質から選ばれ、
ａ１）ヒトＴ１Ｒ２タンパク質の１〜４７０位の領域と、マウスＴ１Ｒ２タンパク質の４７５〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ２タンパク質、
ａ２）ヒトＴ１Ｒ２タンパク質の１〜４８０位の領域と、マウスＴ１Ｒ２タンパク質の４８５〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ２タンパク質、
ａ３）ヒトＴ１Ｒ２タンパク質の１〜４８９位の領域と、マウスＴ１Ｒ２タンパク質の４９４〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ２タンパク質、
かつ／又は
ｂ）Ｔ１Ｒ３タンパク質が、以下のいずれかのキメラＴ１Ｒ３タンパク質から選ばれる、前記細胞：
ｂ１）ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の１〜６３位の領域と、マウスＴ１Ｒ３タンパク質の６４〜５３９位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ３タンパク質、
ｂ２）マウスＴ１Ｒ３タンパク質の１〜６３位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の６４〜１６２位の領域と、マウスＴ１Ｒ３タンパク質の１６３〜５３９位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ３タンパク質、
ｂ３）マウスＴ１Ｒ３タンパク質の１〜１６２位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の１６３〜２４２位の領域と、マウスＴ１Ｒ３タンパク質の２４３〜５３９位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ３タンパク質。
（１５）さらにＧタンパク質αサブユニットを発現する、前記細胞。
（１６）以下のａ１）〜ａ３）から選ばれるキメラＴ１Ｒ２タンパク質：
ａ１）ヒトＴ１Ｒ２タンパク質の１〜４７０位の領域と、マウスＴ１Ｒ２タンパク質の４７５〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ２タンパク質、
ａ２）ヒトＴ１Ｒ２タンパク質の１〜４８０位の領域と、マウスＴ１Ｒ２タンパク質の４８５〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ２タンパク質、及び、
ａ３）ヒトＴ１Ｒ２タンパク質の１〜４８９位の領域と、マウスＴ１Ｒ２タンパク質の４９４〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ２タンパク質。
（１７）以下のｂ１）〜ｂ３）から選ばれるキメラＴ１Ｒ３タンパク質：
ｂ１）ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の１〜６３位の領域と、マウスＴ１Ｒ３タンパク質の６４〜５３９位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ３タンパク質、
ｂ２）マウスＴ１Ｒ３タンパク質の１〜６３位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の６４〜１６２位の領域と、マウスＴ１Ｒ３タンパク質の１６３〜５３９位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ３タンパク質、及び
ｂ３）マウスＴ１Ｒ３タンパク質の１〜１６２位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の
１６３〜２４２位の領域と、マウスＴ１Ｒ３タンパク質の２４３〜５３９位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ３タンパク質。
（１８）前記キメラＴ１Ｒ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１９）前記キメラＴ１Ｒ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１）Ｔ１Ｒ２タンパク質及びＴ１Ｒ３タンパク質を発現する細胞に被検物質を接触させる工程と、Ｔ１Ｒ２タンパク質及び／又はＴ１Ｒ３タンパク質と前記被検物質との相互作用を検出する工程を含む、甘味物質又は甘味調節物質を検出する方法であって、
ａ）Ｔ１Ｒ２タンパク質が、以下のいずれかのキメラＴ１Ｒ２タンパク質から選ばれ、
ａ１）ヒトＴ１Ｒ２タンパク質の１〜４７０位の領域と、マウスＴ１Ｒ２タンパク質の４７５〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ２タンパク質、
ａ２）ヒトＴ１Ｒ２タンパク質の１〜４８０位の領域と、マウスＴ１Ｒ２タンパク質の４８５〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ２タンパク質、
ａ３）ヒトＴ１Ｒ２タンパク質の１〜４８９位の領域と、マウスＴ１Ｒ２タンパク質の４９４〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ２タンパク質、
かつ／又は
ｂ）Ｔ１Ｒ３タンパク質が、以下のいずれかのキメラＴ１Ｒ３タンパク質から選ばれる、前記方法。
ｂ１）ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の１〜６３位の領域と、マウスＴ１Ｒ３タンパク質の６４〜５３９位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ３タンパク質、
ｂ２）マウスＴ１Ｒ３タンパク質の１〜６３位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の６４〜１６２位の領域と、マウスＴ１Ｒ３タンパク質の１６３〜５３９位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ３タンパク質、
ｂ３）マウスＴ１Ｒ３タンパク質の１〜１６２位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の１６３〜２４２位の領域と、マウスＴ１Ｒ３タンパク質の２４３〜５３９位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ３タンパク質。
（２）前記甘味調節物質を検出する方法であって、前記Ｔ１Ｒ２タンパク質及びＴ１Ｒ３タンパク質を発現する細胞に被検物質を接触させる工程において、被検物質と共に甘味物質を前記細胞に接触させる、方法。
（３）少なくともＴ１Ｒ２タンパク質がキメラＴ１Ｒ２タンパク質である、前記方法。
（４）Ｔ１Ｒ２タンパク質及びＴ１Ｒ３タンパク質の両方が、キメラＴ１Ｒ２タンパク質及びキメラＴ１Ｒ３タンパク質である、前記方法。
（５）キメラＴ１Ｒ２タンパク質が、配列番号１８、２２、及び１４から選ばれるアミノ酸配列を有する、前記方法。
（６）キメラＴ１Ｒ３タンパク質が、配列番号３０、３７、及び４１から選ばれるアミノ酸配列を有する、前記方法。
（７）前記細胞がさらにＧタンパク質αサブユニットを発現する、前記方法。
（８）Ｇタンパク質αサブユニットが、ラットＧα15の１〜３２７位の領域と、トランスデューシンαサブユニットの３０７〜３５４位の領域が、この順で融合したキメラＧαタンパク質であって、前記トランスデューシンαサブユニットの３０７〜３５４位の領域のうち、３１２位のメチオニン残基がロイシン残基に、３１６位のバリン残基がアスパラギン酸残基に各々置換されているキメラＧαタンパク質である、前記方法。
（９）前記キメラＧαタンパク質が配列番号５０のアミノ酸配列を有する、前記方法。
（１０）Ｔ１Ｒ２タンパク質及び／又はＴ１Ｒ３タンパク質と被検物質との相互作用を、細胞内遊離カルシウムイオン濃度の変化により検出する、前記方法。
（１１）前記細胞が動物細胞、昆虫細胞又は酵母である、前記方法。
（１２）前記細胞がヒト由来の培養細胞である、前記方法。
（１３）前記細胞がＨＥＫ細胞である、前記方法。
（１４）Ｔ１Ｒ２タンパク質及びＴ１Ｒ３タンパク質を発現する細胞であって、
ａ）Ｔ１Ｒ２タンパク質が、以下のいずれかのキメラＴ１Ｒ２タンパク質から選ばれ、
ａ１）ヒトＴ１Ｒ２タンパク質の１〜４７０位の領域と、マウスＴ１Ｒ２タンパク質の４７５〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ２タンパク質、
ａ２）ヒトＴ１Ｒ２タンパク質の１〜４８０位の領域と、マウスＴ１Ｒ２タンパク質の４８５〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ２タンパク質、
ａ３）ヒトＴ１Ｒ２タンパク質の１〜４８９位の領域と、マウスＴ１Ｒ２タンパク質の４９４〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ２タンパク質、
かつ／又は
ｂ）Ｔ１Ｒ３タンパク質が、以下のいずれかのキメラＴ１Ｒ３タンパク質から選ばれる、前記細胞：
ｂ１）ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の１〜６３位の領域と、マウスＴ１Ｒ３タンパク質の６４〜５３９位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ３タンパク質、
ｂ２）マウスＴ１Ｒ３タンパク質の１〜６３位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の６４〜１６２位の領域と、マウスＴ１Ｒ３タンパク質の１６３〜５３９位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ３タンパク質、
ｂ３）マウスＴ１Ｒ３タンパク質の１〜１６２位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の１６３〜２４２位の領域と、マウスＴ１Ｒ３タンパク質の２４３〜５３９位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ３タンパク質。
（１５）さらにＧタンパク質αサブユニットを発現する、前記細胞。
（１６）以下のａ１）〜ａ３）から選ばれるキメラＴ１Ｒ２タンパク質：
ａ１）ヒトＴ１Ｒ２タンパク質の１〜４７０位の領域と、マウスＴ１Ｒ２タンパク質の４７５〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ２タンパク質、
ａ２）ヒトＴ１Ｒ２タンパク質の１〜４８０位の領域と、マウスＴ１Ｒ２タンパク質の４８５〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ２タンパク質、及び、
ａ３）ヒトＴ１Ｒ２タンパク質の１〜４８９位の領域と、マウスＴ１Ｒ２タンパク質の４９４〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ２タンパク質。
（１７）以下のｂ１）〜ｂ３）から選ばれるキメラＴ１Ｒ３タンパク質：
ｂ１）ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の１〜６３位の領域と、マウスＴ１Ｒ３タンパク質の６４〜５３９位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ３タンパク質、
ｂ２）マウスＴ１Ｒ３タンパク質の１〜６３位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の６４〜１６２位の領域と、マウスＴ１Ｒ３タンパク質の１６３〜５３９位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ３タンパク質、及び
ｂ３）マウスＴ１Ｒ３タンパク質の１〜１６２位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の
１６３〜２４２位の領域と、マウスＴ１Ｒ３タンパク質の２４３〜５３９位の領域と、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラＴ１Ｒ３タンパク質。
（１８）前記キメラＴ１Ｒ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１９）前記キメラＴ１Ｒ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
本発明により、甘味物質や甘味調節物質の検出に有用なキメラT1R2タンパク質、キメラT1R3タンパク質、及びキメラＧタンパク質、並びにそれらを発現する細胞が提供される。これらのキメラタンパク質及び細胞は、好適な形態では、天然型T1R2及びT1R3、並びにそれらを発現する細胞よりも、甘味物質や甘味調節物質を高感度で検出することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法は、T1R2タンパク質及びT1R3タンパク質を発現する細胞に被検物質を接触させる工程と、T1R2タンパク質及び／又はT1R3タンパク質と前記被検物質との相互作用を検出する工程を含む、甘味物質又は甘味調節物質を検出する方法である。
本発明の方法は、T1R2タンパク質及びT1R3タンパク質を発現する細胞に被検物質を接触させる工程と、T1R2タンパク質及び／又はT1R3タンパク質と前記被検物質との相互作用を検出する工程を含む、甘味物質又は甘味調節物質を検出する方法である。
本発明の方法においては、前記T1R2タンパク質及びT1R3タンパク質の少なくともいずれかは、特定の構造を有するキメラT1R2タンパク質（以下、「キメラT1R2」と記載することがある。）又はキメラT1R3タンパク質（以下、「キメラT1R3」と記載することがある。）である。T1R2及びT1R3の両方がキメラタンパク質であってもよい。
キメラT1R2は、以下のいずれかのタンパク質である。
ａ１）ヒトT1R2の１〜４７０位の領域と、マウスT1R2の４７５〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラT1R2、
ａ２）ヒトT1R2の１〜４８０位の領域と、マウスT1R2の４８５〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラT1R2、
ａ３）ヒトT1R2の１〜４８９位の領域と、マウスT1R2の４９４〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラT1R2。
ａ１）ヒトT1R2の１〜４７０位の領域と、マウスT1R2の４７５〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラT1R2、
ａ２）ヒトT1R2の１〜４８０位の領域と、マウスT1R2の４８５〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラT1R2、
ａ３）ヒトT1R2の１〜４８９位の領域と、マウスT1R2の４９４〜８４３位の領域が、この順で融合したキメラT1R2。
また、キメラT1R3は、以下のいずれかのタンパク質である。
ｂ１）ヒトT1R3の１〜６３位の領域と、マウスT1R3の６４〜５３９位の領域と、ヒトT1R3の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラT1R3、
ｂ２）マウスT1R3の１〜位６３の領域と、ヒトT1R3の６４〜１６２位の領域と、マウスT1R3の１６３〜５３９位の領域と、ヒトT1R3の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラT1R3、
ｂ３）マウスT1R3の１〜１６２位の領域と、ヒトT1R3の１６３〜２４２位の領域と、マウスT1R3の２４３〜５３９位の領域と、ヒトT1R3の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラT1R3。
ｂ１）ヒトT1R3の１〜６３位の領域と、マウスT1R3の６４〜５３９位の領域と、ヒトT1R3の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラT1R3、
ｂ２）マウスT1R3の１〜位６３の領域と、ヒトT1R3の６４〜１６２位の領域と、マウスT1R3の１６３〜５３９位の領域と、ヒトT1R3の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラT1R3、
ｂ３）マウスT1R3の１〜１６２位の領域と、ヒトT1R3の１６３〜２４２位の領域と、マウスT1R3の２４３〜５３９位の領域と、ヒトT1R3の５３５〜８５２位の領域が、この順で融合したキメラT1R3。
キメラT1R2及びキメラT1R3の構造と、それらが由来するヒトT1R2、マウスT1R2、ヒトT1R3、及び、マウスT1R3の領域を図１に示す。図１中、CRDはシステインリッチドメインを
、TMはトランスメンブレンドメインを各々示す。各キメラタンパク質の上下に記載された文字及び数字は由来とＮ末端からの位置を示す。例えば、T1R2における「h1」は、ヒトT1R2のN末端から１番目のアミノ酸残基を示す。
、TMはトランスメンブレンドメインを各々示す。各キメラタンパク質の上下に記載された文字及び数字は由来とＮ末端からの位置を示す。例えば、T1R2における「h1」は、ヒトT1R2のN末端から１番目のアミノ酸残基を示す。
＜１＞T1R2タンパク質及びT1R3タンパク質
キメラT1R2タンパク質及びキメラT1R3タンパク質が由来するT1R2、及びT1R3について以下に説明する。尚、キメラであると特記しない場合は、「T1R2」及び「T1R3」は、キメラではないT1R2及びT1R3を表す。
ヒトT1R2としては、配列番号52のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ヒトT1R2をコードする塩基配列としては、配列番号51に示す塩基配列が挙げられる。
キメラT1R2タンパク質及びキメラT1R3タンパク質が由来するT1R2、及びT1R3について以下に説明する。尚、キメラであると特記しない場合は、「T1R2」及び「T1R3」は、キメラではないT1R2及びT1R3を表す。
ヒトT1R2としては、配列番号52のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ヒトT1R2をコードする塩基配列としては、配列番号51に示す塩基配列が挙げられる。
マウスT1R2としては、配列番号54のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。マウスT1R2をコードする塩基配列としては、配列番号53に示す塩基配列が挙げられる。
ヒトT1R3としては、配列番号56のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ヒトT1R3をコードする塩基配列としては、配列番号55に示す塩基配列が挙げられる。
ヒトT1R3としては、配列番号56のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ヒトT1R3をコードする塩基配列としては、配列番号55に示す塩基配列が挙げられる。
マウスT1R3としては、配列番号58のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。マウスT1R3をコードする塩基配列としては、配列番号57に示す塩基配列が挙げられる。
各T1R2、T1R3は、甘味受容体を構成し得る限り、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。なお上記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基の種類やタンパク質の立体構造における位置によっても異なるが、具体的には、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜
１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、
置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場
合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミ
ノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入
、付加、または逆位等には、タンパク質が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場
合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミ
ノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入
、付加、または逆位等には、タンパク質が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
また、T1R2及びT1R3は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有するタンパク質であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指すことがある。
また、T1R2及びT1R3は、甘味受容体を構成し得る限り、上記T1R2、又はT1R3をコードする塩基配列から調製され得るプローブ、例えば同塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコードされるタンパク質
であってもよい。そのようなプローブは、例えば、同塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、同塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに
好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイ
ズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザ
ンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1％ SDS、好ましくは60
℃、0.1×SSC、0.1％ SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1％ SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。また、例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼ
ーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1％ SDSが挙げられる。
上記の保存的変異等に関する記載は、後述のＧタンパク質αサブユニットについても同様に適用される。
であってもよい。そのようなプローブは、例えば、同塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、同塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに
好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイ
ズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザ
ンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1％ SDS、好ましくは60
℃、0.1×SSC、0.1％ SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1％ SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。また、例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼ
ーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1％ SDSが挙げられる。
上記の保存的変異等に関する記載は、後述のＧタンパク質αサブユニットについても同様に適用される。
＜２＞甘味受容体キメラタンパク質
キメラT1R2、及びキメラT1R3は、各々前記ａ１〜ａ３、及び前記ｂ１〜ｂ３のいずれかの構造を有する。
キメラT1R2のヒトT1R2及びマウスT1R2に由来する領域又はアミノ酸残基の位置、及び、キメラT1R3のヒトT1R3及びマウスT1R3に由来する領域又はアミノ酸残基の位置は、必ずしも各タンパク質のアミノ酸配列におけるＮ末端からの絶対的な位置を示すものではなく、
配列番号52、54、56、58に記載のアミノ酸配列との相対的な位置を示すものである。例えば、配列番号52に示すアミノ酸配列を有するヒトT1R2において、ｎ位よりもＮ末端側の位置で一アミノ酸残基が欠失した場合、このｎ位はＮ末端からｎ−１番目のアミノ酸残基となる。このような場合であっても、前記アミノ酸酸残基は、ｎ位のアミノ酸残基とみなされる。アミノ酸残基の位置は、対象のT1R2のアミノ酸配列と配列番号52のアミノ酸配列とのアラインメントにより、決定することができる。マウスT1R2、ヒトT1R3、マウスT1R3、及び後述のＧタンパク質αサブユニットについても同様である。
キメラT1R2、及びキメラT1R3は、各々前記ａ１〜ａ３、及び前記ｂ１〜ｂ３のいずれかの構造を有する。
キメラT1R2のヒトT1R2及びマウスT1R2に由来する領域又はアミノ酸残基の位置、及び、キメラT1R3のヒトT1R3及びマウスT1R3に由来する領域又はアミノ酸残基の位置は、必ずしも各タンパク質のアミノ酸配列におけるＮ末端からの絶対的な位置を示すものではなく、
配列番号52、54、56、58に記載のアミノ酸配列との相対的な位置を示すものである。例えば、配列番号52に示すアミノ酸配列を有するヒトT1R2において、ｎ位よりもＮ末端側の位置で一アミノ酸残基が欠失した場合、このｎ位はＮ末端からｎ−１番目のアミノ酸残基となる。このような場合であっても、前記アミノ酸酸残基は、ｎ位のアミノ酸残基とみなされる。アミノ酸残基の位置は、対象のT1R2のアミノ酸配列と配列番号52のアミノ酸配列とのアラインメントにより、決定することができる。マウスT1R2、ヒトT1R3、マウスT1R3、及び後述のＧタンパク質αサブユニットについても同様である。
アラインメントの方法としては、公知の遺伝子解析ソフトウェアが利用可能である。具体的なソフトウェアには、日立ソリューションズ製のDNASISや、ゼネティックス製のGENETYXなどが挙げられる（Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987）。
前記ａ１のキメラT1R2としては、配列番号18のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。また、同キメラT1R2をコードする塩基配列としては、配列番号17に示す塩基配列が挙げられる。
前記ａ２のキメラT1R2としては、配列番号22のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。また、同キメラT1R2をコードする塩基配列としては、配列番号21に示す塩基配列が挙げられる。
前記ａ３のキメラT1R2としては、配列番号14のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。また、同キメラT1R2をコードする塩基配列としては、配列番号13に示す塩基配列が挙げられる。
前記ａ２のキメラT1R2としては、配列番号22のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。また、同キメラT1R2をコードする塩基配列としては、配列番号21に示す塩基配列が挙げられる。
前記ａ３のキメラT1R2としては、配列番号14のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。また、同キメラT1R2をコードする塩基配列としては、配列番号13に示す塩基配列が挙げられる。
前記ｂ１のキメラT1R3としては、配列番号30のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。また、同キメラT1R3をコードする塩基配列としては、配列番号29に示す塩基配列が挙げられる。
前記ｂ２のキメラT1R3としては、配列番号37のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。また、同キメラT1R3をコードする塩基配列としては、配列番号36に示す塩基配列が挙げられる。
前記ｂ３のキメラT1R3としては、配列番号41のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。また、同キメラT1R3をコードする塩基配列としては、配列番号40に示す塩基配列が挙げられる。
前記ｂ２のキメラT1R3としては、配列番号37のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。また、同キメラT1R3をコードする塩基配列としては、配列番号36に示す塩基配列が挙げられる。
前記ｂ３のキメラT1R3としては、配列番号41のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。また、同キメラT1R3をコードする塩基配列としては、配列番号40に示す塩基配列が挙げられる。
キメラT1R2及びキメラT1R3をコードする塩基配列は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、キメラT1R2及びキメラT1R3の各々をコードする塩基配列は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
キメラT1R2をコードするポリヌクレオチドは、ヒトT1R2、及びマウスT1R2を各々コードするポリヌクオレオチドを、上記ａ１〜ａ３のいずれかの構造を有するタンパク質がコードされるように連結することにより調製することができる。また、キメラT1R3をコードするポリヌクレオチドは、ヒトT1R3、及びマウスT1R3を各々コードするポリヌクレオチドを、上記ｂ１〜ｂ３のいずれかの構造を有するタンパク質がコードされるように連結することにより調製することができる。キメラタンパク質をコードするDNAは、例えば、PCRにより調製した各断片を市販のキット（例えばGENEART Seamless cloning and Assembly kit(A13288、Invitrogen、Life Technologies社)を用いて連結することにより、作製することができる。
キメラT1R2をコードするポリヌクレオチドを適当な宿主で発現させると、キメラT1R2が得られる。また、キメラT1R3をコードするポリヌクレオチドを適当な宿主で発現させると
、キメラT1R3が得られる。
キメラT1R2をコードするポリヌクレオチドを適当な宿主で発現させると、キメラT1R2が得られる。また、キメラT1R3をコードするポリヌクレオチドを適当な宿主で発現させると
、キメラT1R3が得られる。
＜２＞キメラT1R2及び／又はキメラT1R3を発現する細胞
キメラT1R2及び／又はキメラT1R3を発現する細胞は、甘味物質又は甘味調節物質の検出に利用することができる。すなわちキメラT1R2及び／又はキメラT1R3キメラタンパク質を発現する細胞は、甘味受容体を構成し得ると考えられる。
前記細胞が発現するT1R2又はT1R3の少なくとも一方がキメラタンパク質であればよいが、両方がキメラタンパク質であることが好ましい。
キメラT1R2及び／又はキメラT1R3を発現する細胞は、甘味物質又は甘味調節物質の検出に利用することができる。すなわちキメラT1R2及び／又はキメラT1R3キメラタンパク質を発現する細胞は、甘味受容体を構成し得ると考えられる。
前記細胞が発現するT1R2又はT1R3の少なくとも一方がキメラタンパク質であればよいが、両方がキメラタンパク質であることが好ましい。
T1R2及びT1R3を発現し、少なくともT1R2及びT1R3の一方が上記キメラT1R2又はキメラT1R3である細胞（単に「キメラタンパク質を発現する細胞」と記載することがある。）は、それらをコードするポリヌクレオチドを発現可能な形態で適当な宿主細胞に導入することによって取得することができる。例えば、キメラタンパク質をコードする直鎖状のDNA、
又は、キメラタンパク質をコードする配列を含むベクターを宿主細胞に導入することによって、キメラタンパク質を発現させることができる。発現可能な形態としては、例えば、DNA情報に基づいてキメラタンパク質が生成し得るように、転写及び翻訳に必要な配列を
、キメラタンパク質をコードする配列の上流に含むことが挙げられる。また、宿主細胞にキメラタンパク質をコードするcRNAを注入することによっても、キメラタンパク質を発現する細胞を取得することができる。この場合は、cRNAの5'末端側に翻訳に必要な配列を含む。転写に必要な配列としては、プロモーター及びエンハンサー等の発現調節配列が挙げられる。また、転写ターミネーター配列を含んでいてもよい。翻訳に必要な配列としては、リボソーム結合部位が挙げられる。さらに、必要に応じて、プロセシング情報部位、例えばＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位等を含んでいてもよい。ブロモーターとしては、免疫グロブリン遺伝子、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス等に由来するプロモーターが挙げられる。キメラではないT1R2又はT1R3も、キメラタンパク質と同様にして発現させることができる。
又は、キメラタンパク質をコードする配列を含むベクターを宿主細胞に導入することによって、キメラタンパク質を発現させることができる。発現可能な形態としては、例えば、DNA情報に基づいてキメラタンパク質が生成し得るように、転写及び翻訳に必要な配列を
、キメラタンパク質をコードする配列の上流に含むことが挙げられる。また、宿主細胞にキメラタンパク質をコードするcRNAを注入することによっても、キメラタンパク質を発現する細胞を取得することができる。この場合は、cRNAの5'末端側に翻訳に必要な配列を含む。転写に必要な配列としては、プロモーター及びエンハンサー等の発現調節配列が挙げられる。また、転写ターミネーター配列を含んでいてもよい。翻訳に必要な配列としては、リボソーム結合部位が挙げられる。さらに、必要に応じて、プロセシング情報部位、例えばＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位等を含んでいてもよい。ブロモーターとしては、免疫グロブリン遺伝子、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス等に由来するプロモーターが挙げられる。キメラではないT1R2又はT1R3も、キメラタンパク質と同様にして発現させることができる。
キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入する細胞としては、ヒト等の哺乳動物、カエル等の両生類のような動物細胞、昆虫細胞又は酵母が好ましく、動物細胞が特に好ましい。例えば、味細胞が濃縮された画分、あるいは単離された味細胞、又は、舌上皮、副腎、松果体、甲状腺、メラノサイト、および、腎臓から選択される組織から単離された組織などを用いても良い。具体的には、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現する組換えベクターを導入し、一時的な機能発現が可能と考えられる細胞として、アフリカツメガエル卵母細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）、human embryonic kidney（HEK）細胞、Sf-9 insect細胞等が挙げられる。本発明は、又、そのよ
うなキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドが発現可能な形態で導入された細胞を提供する。ここで細胞としては卵母細胞又は味細胞が好ましく、特に味細胞が甘味物質又は甘味調節物質の検出（スクリーニングを含む）に用いるのに好適である。
T1R2及びT1R3（少なくとも一方はキメラ）は、各々別個のベクターを用いて細胞に導入しもよく、各々をコードするポリヌクレオチドを含む単一のベクターを用いて細胞に導入してもよい。
うなキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドが発現可能な形態で導入された細胞を提供する。ここで細胞としては卵母細胞又は味細胞が好ましく、特に味細胞が甘味物質又は甘味調節物質の検出（スクリーニングを含む）に用いるのに好適である。
T1R2及びT1R3（少なくとも一方はキメラ）は、各々別個のベクターを用いて細胞に導入しもよく、各々をコードするポリヌクレオチドを含む単一のベクターを用いて細胞に導入してもよい。
宿主細胞にキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入する方法としては、公知の方法を用いることができる。細胞へのポリヌクレオチドの導入等の操作に必要な技術は、Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記
載されている。
載されている。
上記のようなキメラタンパク質を発現する細胞は、さらにＧタンパク質αサブユニットを発現してもよい。T1R2及びT1R3は、GPCR（Ｇタンパク質共役受容体）を構成し、甘味物
質を受容することよって発生するシグナルを、Ｇタンパク質を介して伝達する。したがって、キメラタンパク質を発現する細胞がＧタンパク質も発現すると、Ｇタンパク質を介するシグナリングを検出することにより、甘味物質の受容を検知することができる。
質を受容することよって発生するシグナルを、Ｇタンパク質を介して伝達する。したがって、キメラタンパク質を発現する細胞がＧタンパク質も発現すると、Ｇタンパク質を介するシグナリングを検出することにより、甘味物質の受容を検知することができる。
Ｇタンパク質はGα（αサブユニット）及びGβγサブユニットからなるが、上記目的のためには、これらのうち少なくともGαサブユニットが発現すればよい。また、GαサブユニットとともにGβγサブユニットが発現してもよい。Gαサブユニットとしては、T1R2及びT1R3と共役し得る限り特に制限されないが、Gα15／Gα16（ラットではGα15、ヒトで
はGα16と呼ばれている）が挙げられる。また、Gαサブユニットは、種類の異なるＧタンパク質αサブユニット同士のキメラタンパク質、又はその改変体であってもよい。
はGα16と呼ばれている）が挙げられる。また、Gαサブユニットは、種類の異なるＧタンパク質αサブユニット同士のキメラタンパク質、又はその改変体であってもよい。
前記キメラGαタンパク質として具体的には、ラットGα15とトランスデューシンαサブユニットとのキメラタンパク質が挙げられる。より具体的には、ラットGα15の１〜３２
７位の領域と、トランスデューシンαサブユニットの３０７〜３５４の領域が、この順で融合したキメラGαタンパク質であって、前記トランスデューシンαサブユニットの３０
７〜３５４の領域のうち、３１２位のメチオニン残基がロイシン残基に、３１６位のバリン残基がアスパラギン酸残基に各々置換されているキメラGαタンパク質が挙げられる。
このようなキメラGαタンパク質としては、配列番号50のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質が挙げられる。また、同キメラGαタンパク質をコードする塩基配列としては、配列
番号49に示す塩基配列が挙げられる。
７位の領域と、トランスデューシンαサブユニットの３０７〜３５４の領域が、この順で融合したキメラGαタンパク質であって、前記トランスデューシンαサブユニットの３０
７〜３５４の領域のうち、３１２位のメチオニン残基がロイシン残基に、３１６位のバリン残基がアスパラギン酸残基に各々置換されているキメラGαタンパク質が挙げられる。
このようなキメラGαタンパク質としては、配列番号50のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質が挙げられる。また、同キメラGαタンパク質をコードする塩基配列としては、配列
番号49に示す塩基配列が挙げられる。
ラットGα15をコードする塩基配列を配列番号59に、同塩基配列がコードするアミノ酸
配列を配列番号60に各々示す。また、ラットトランスデューシンαサブユニットをコードする塩基配列を配列番号61に、同塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号62に各々示す。
配列を配列番号60に各々示す。また、ラットトランスデューシンαサブユニットをコードする塩基配列を配列番号61に、同塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号62に各々示す。
ラットGα15、ラットトランスデューシンαサブユニットは、キメラT1R2及びキメラT1R3と共役し得る限り、保存的変異体であってもよい。保存的変異については、前記したT1R2及びT1R3に関する記載が適用される。また、ラットGα15、及びラットトランスデューシンαサブユニットにおける領域又はアミノ酸残基の位置は、キメラT1R2及びキメラT1R3について記載したのと同様に、配列番号60、62に記載のアミノ酸配列との相対的な位置を示すものである。
細胞にGαタンパク質を発現させるには、Gαタンパク質をコードするヌクレオチドを発現可能な形態で宿主細胞に導入すればよい。使用するベクター、プロモーター、遺伝子導入等については、キメラT1R2及びキメラT1R3と同様である。
宿主細胞が元来キメラT1R2及びキメラT1R3と共役し得るＧタンパク質を発現し得る場合は、Gαタンパク質をコードするヌクレオチドを細胞に導入する必要はないが、導入して
もよい。
宿主細胞が元来キメラT1R2及びキメラT1R3と共役し得るＧタンパク質を発現し得る場合は、Gαタンパク質をコードするヌクレオチドを細胞に導入する必要はないが、導入して
もよい。
＜３＞甘味物質又は甘味調節物質の検出
上記のような、T1R2及びT1R3（少なくとも一方はキメラ）を発現する細胞、好ましくはさらにGαタンパク質を発現する細胞に被検物質を接触させ、これらのタンパク質と前記
被検物質との相互作用を検出することにより、甘味物質又は甘味調節物質を検出することができる。この方法によって甘味調節物質を検出する場合は、T1R2及びT1R3を発現する細胞に被検物質を接触させる際に、被検物質と共に甘味物質を前記細胞に接触させる。
上記のような、T1R2及びT1R3（少なくとも一方はキメラ）を発現する細胞、好ましくはさらにGαタンパク質を発現する細胞に被検物質を接触させ、これらのタンパク質と前記
被検物質との相互作用を検出することにより、甘味物質又は甘味調節物質を検出することができる。この方法によって甘味調節物質を検出する場合は、T1R2及びT1R3を発現する細胞に被検物質を接触させる際に、被検物質と共に甘味物質を前記細胞に接触させる。
「T1R2タンパク質及び／又はT1R3タンパク質と被検物質との相互作用を検出する」とは、必ずしもT1R2タンパク質及び／又はT1R3タンパク質と前記被検物質の相互作用を直接検出することのみを意味するものではなく、これらの相互作用を間接的に検出してもよい。
例えば、前記相互作用は、Ｇタンパク質を介したシグナルを測定することにより、検出することができる。同シグナルは、セカンドメッセンジャーの産生により測定することができる。セカンドメッセンジャーとしては、Ｇタンパク質の種類によって、カルシウムイオン、cAMP、cGMP等が挙げられる。例えばＧタンパク質が、G15／G16のようなGqファミリーに属するものである場合は、細胞内カルシウムイオン濃度の変化によって前記シグナルを測定することができる。相互作用が多いと、相互作用が少ない場合に比べて細胞内カルシウム濃度は高くなる。GPCRのシグナル伝達の検出については、Methods Enzymol, vols. 237 and 238 (1994)、Bourne, H.R. et al., Nature, 348:125-132 (1990)等に記載されている。
また、「T1R2タンパク質及び／又はT1R3タンパク質と被検物質との相互作用」は、甘味受容体と被検物質との相互作用と言い換えることもできる。
例えば、前記相互作用は、Ｇタンパク質を介したシグナルを測定することにより、検出することができる。同シグナルは、セカンドメッセンジャーの産生により測定することができる。セカンドメッセンジャーとしては、Ｇタンパク質の種類によって、カルシウムイオン、cAMP、cGMP等が挙げられる。例えばＧタンパク質が、G15／G16のようなGqファミリーに属するものである場合は、細胞内カルシウムイオン濃度の変化によって前記シグナルを測定することができる。相互作用が多いと、相互作用が少ない場合に比べて細胞内カルシウム濃度は高くなる。GPCRのシグナル伝達の検出については、Methods Enzymol, vols. 237 and 238 (1994)、Bourne, H.R. et al., Nature, 348:125-132 (1990)等に記載されている。
また、「T1R2タンパク質及び／又はT1R3タンパク質と被検物質との相互作用」は、甘味受容体と被検物質との相互作用と言い換えることもできる。
T1R2タンパク質及びT1R3タンパク質（少なくとも一方はキメラタンパク質）を発現する細胞に被検物質を接触させたときのこれらのタンパク質と被検物質との相互作用が、被検物質を接触させないときのそれよりも多ければ、被検物質は甘味受容体チャネルを活性化し、被検物質を接触させたときの前記相互作用が、被検物質を接触させないときのそれよりも少なければ、被検物質は甘味受容体チャネルを不活性化すると判断される。甘味受容体チャネルを活性化する物質は、甘味物質であると判断される。さらに、被検物質と共に甘味物質を細胞に接触させたときの前記相互作用が、被検物質を接触させないときのそれよりも多ければ、同被検物質は甘味物質であるか、又は、甘味物質の甘味を増強する物質であると判断される。また、被検物質と共に甘味物質を細胞に接触させたときの前記相互作用が、被検物質を接触させないときのそれよりも少なければ、同被検物質は甘味物質の甘味を低減する物質であると判断される。甘味調節物質とは、このような、甘味物質の甘味を増強又は低減する物質を意味する。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
〔実施例１〕味覚受容体タンパク質発現ベクターの構築
（１）ヒトT1R2タンパク質（hT1R2）発現ベクターの構築
ヒトT1R2タンパク質をコードする全長cDNAの配列は、NCBIのGenBankに登録されており
（accession No. NM_152232）、これを参考にして例えばヒトのmRNAからクローニング可
能であるが、The Mammalian Gene Collection（http://mgc.nci.nih.gov/）中の該当する完全長cDNA（IMAGE:100014762）として、購入可能である（カタログ番号OHS4559-99620754、Open Biosystems社）。このプラスミドを鋳型とし、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（5'末端にEcoRI認識配列が付加してある）をフォワードプライマ
ーとして、配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（5'末端にXbaI認識配列が付加してある）をリバースプライマーとして、PCR反応を行なった。得られたDNA断片を制限酵素EcoRI及びXbaIで消化した後、プラスミドpcDNA3.1(+)（Life Technologies）
の同じ制限サイトにサブクローニングした。得られた組換えベクターをこれ以降「phT1R2」と記載する。なお、前記プラスミドpcDNA3.1(+)は、サイトメガロウイルス由来のプロ
モーター配列を持っており、動物細胞にクローニング断片にコードされるポリペプチドを発現させるために使用することができる。
（１）ヒトT1R2タンパク質（hT1R2）発現ベクターの構築
ヒトT1R2タンパク質をコードする全長cDNAの配列は、NCBIのGenBankに登録されており
（accession No. NM_152232）、これを参考にして例えばヒトのmRNAからクローニング可
能であるが、The Mammalian Gene Collection（http://mgc.nci.nih.gov/）中の該当する完全長cDNA（IMAGE:100014762）として、購入可能である（カタログ番号OHS4559-99620754、Open Biosystems社）。このプラスミドを鋳型とし、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（5'末端にEcoRI認識配列が付加してある）をフォワードプライマ
ーとして、配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（5'末端にXbaI認識配列が付加してある）をリバースプライマーとして、PCR反応を行なった。得られたDNA断片を制限酵素EcoRI及びXbaIで消化した後、プラスミドpcDNA3.1(+)（Life Technologies）
の同じ制限サイトにサブクローニングした。得られた組換えベクターをこれ以降「phT1R2」と記載する。なお、前記プラスミドpcDNA3.1(+)は、サイトメガロウイルス由来のプロ
モーター配列を持っており、動物細胞にクローニング断片にコードされるポリペプチドを発現させるために使用することができる。
（２）マウスT1R2タンパク質（mT1R2）発現ベクターの構築
マウスT1R2タンパク質をコードする全長cDNAの配列は、NCBIのGenBankに登録されてお
り（accession No. NM_031873）、これを参考にして例えばマウスのmRNAからクローニン
グ可能である。マウスmRNAを鋳型とし、配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（5'末端にEcoRI認識配列が付加してある）をフォワードプライマーとして、配列
番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（5'末端にNotI認識配列が付加してあ
る）をリバースプライマーとして、RT-PCR反応を行なった。得られたDNA断片を制限酵素EcoRI及びNotIで消化した後、プラスミドpcDNA3.1(+)の同じ制限サイトにサブクローニン
グした。得られた組換えベクターをこれ以降「pmT1R2」と記載する。
マウスT1R2タンパク質をコードする全長cDNAの配列は、NCBIのGenBankに登録されてお
り（accession No. NM_031873）、これを参考にして例えばマウスのmRNAからクローニン
グ可能である。マウスmRNAを鋳型とし、配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（5'末端にEcoRI認識配列が付加してある）をフォワードプライマーとして、配列
番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（5'末端にNotI認識配列が付加してあ
る）をリバースプライマーとして、RT-PCR反応を行なった。得られたDNA断片を制限酵素EcoRI及びNotIで消化した後、プラスミドpcDNA3.1(+)の同じ制限サイトにサブクローニン
グした。得られた組換えベクターをこれ以降「pmT1R2」と記載する。
（３）ヒトT1R3タンパク質（hT1R3）発現ベクターの構築
ヒトT1R3タンパク質をコードする全長cDNAの配列は、NCBIのGenBankに登録されており
（accession No. NM_152228）、これを参考にして例えばヒトのmRNAからクローニング可
能である。ヒトmRNA配列を鋳型とし、配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、RT-PCR反応を行なった。得られたDNA断片を、プラス
ミドpcDNA3.1(+)のEcoRVサイトにサブクローニングした。得られた組換えベクターのうち、プロモーターに対してhT1R3のコード領域がセンス方向に挿入されたものをこれ以降「phT1R3」と記載する。
ヒトT1R3タンパク質をコードする全長cDNAの配列は、NCBIのGenBankに登録されており
（accession No. NM_152228）、これを参考にして例えばヒトのmRNAからクローニング可
能である。ヒトmRNA配列を鋳型とし、配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、RT-PCR反応を行なった。得られたDNA断片を、プラス
ミドpcDNA3.1(+)のEcoRVサイトにサブクローニングした。得られた組換えベクターのうち、プロモーターに対してhT1R3のコード領域がセンス方向に挿入されたものをこれ以降「phT1R3」と記載する。
（４）マウスT1R3タンパク質（mT1R3）発現ベクターの構築
マウスT1R3タンパク質をコードする全長cDNAの配列は、NCBIのGenBankに登録されてお
り（accession No. NM_031872）、これを参考にして例えばマウスのmRNAからクローニン
グ可能であるが、The Mammalian Gene Collection（http://mgc.nci.nih.gov/）中の該当する完全長cDNA（IMAGE:100016422）として、購入可能である（カタログ番号OMM4760-99847609、Open Biosystems社）。このプラスミドを鋳型とし、配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（5'末端にEcoRI認識配列が付加してある）をフォワードプラ
イマーとして、配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（5'末端にXbaI認識配列が付加してある）をリバースプライマーとして、PCR反応を行なった。得られたDNA断片を制限酵素EcoRI及びXbaIで消化した後、プラスミドpcDNA3.1(+)の同じ制限サイトにサブクローニングした。得られた組換えベクターをこれ以降「pmT1R3」と記載する。
マウスT1R3タンパク質をコードする全長cDNAの配列は、NCBIのGenBankに登録されてお
り（accession No. NM_031872）、これを参考にして例えばマウスのmRNAからクローニン
グ可能であるが、The Mammalian Gene Collection（http://mgc.nci.nih.gov/）中の該当する完全長cDNA（IMAGE:100016422）として、購入可能である（カタログ番号OMM4760-99847609、Open Biosystems社）。このプラスミドを鋳型とし、配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（5'末端にEcoRI認識配列が付加してある）をフォワードプラ
イマーとして、配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（5'末端にXbaI認識配列が付加してある）をリバースプライマーとして、PCR反応を行なった。得られたDNA断片を制限酵素EcoRI及びXbaIで消化した後、プラスミドpcDNA3.1(+)の同じ制限サイトにサブクローニングした。得られた組換えベクターをこれ以降「pmT1R3」と記載する。
ヒトT1R2、マウスT1R2、ヒトT1R3、及びマウスT1R3をコードする塩基配列を、各々配列番号51、53、55、及び57に示す。また、それらがコードするアミノ酸配列を、各々配列番号52、54、56、及び58に示す。
〔実施例２〕ヒトT1R2とマウスT1R2とのキメラタンパク質（h-mT1R2-EX5、h-mT1R2-481、h-mT1R2-471）をコードするキメラ遺伝子の作製と発現ベクターの構築
前記hT1R2、mT1R2発現ベクター（phT1R2、pmT1R2）を鋳型にして、プライマーを用いたPCR法にてパーツとなる断片を各々増幅した後、組み換え手法を用いてキメラタンパク質
をコードする遺伝子をプラスミドpcDNA3.1(+)にクローニングした。キメラタンパク質は
３種類（h-mT1R2-471、h-mT1R2-481、h-mT1R2-EX5）作製した。いずれも、ヒトT1R2のＮ
末端側部分とマウスT1R2のＣ末端側部分とのキメラタンパク質である。キメラタンパク質におけるそれぞれの部分が由来するヒトT1R2（GenBank accession No. NP_689418）又は
マウスT1R2（GenBank accession No. NP_114079）中の位置、及びhT1R2およびmT1R2との
相同性を表１及び図１に示す。例えば、「h(1-470) + m(475-843)」は、hT1R2の１〜470
位の領域と、mT1R2の475〜843位の領域がこの順で融合したタンパク質であることを示す
。
前記hT1R2、mT1R2発現ベクター（phT1R2、pmT1R2）を鋳型にして、プライマーを用いたPCR法にてパーツとなる断片を各々増幅した後、組み換え手法を用いてキメラタンパク質
をコードする遺伝子をプラスミドpcDNA3.1(+)にクローニングした。キメラタンパク質は
３種類（h-mT1R2-471、h-mT1R2-481、h-mT1R2-EX5）作製した。いずれも、ヒトT1R2のＮ
末端側部分とマウスT1R2のＣ末端側部分とのキメラタンパク質である。キメラタンパク質におけるそれぞれの部分が由来するヒトT1R2（GenBank accession No. NP_689418）又は
マウスT1R2（GenBank accession No. NP_114079）中の位置、及びhT1R2およびmT1R2との
相同性を表１及び図１に示す。例えば、「h(1-470) + m(475-843)」は、hT1R2の１〜470
位の領域と、mT1R2の475〜843位の領域がこの順で融合したタンパク質であることを示す
。
（１）h-mT1R2-EX5を発現するベクターは、以下のようにして２つの断片を連結すること
により作製した。phT1R2を鋳型として、配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号10に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行なった。別に、pmT1R2を鋳型として、
配列番号11に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号12に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行なった。それぞれ得られた断片を、GENEART Seamless cloning and Assembly kit(A13288、Invitrogen、Life Technologies社)を用いてプラスミドpcDNA3.1(+)のHindIII-EcoRIサイトにサブクローニングした。得られた組み換えベクターをph-mT1R2-EX5、そ
れがコードするキメラタンパク質をh-mT1R2-EX5とした。h-mT1R2-EX5のコード領域配列を配列番号13に示す。またこの配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号14に示す。
により作製した。phT1R2を鋳型として、配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号10に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行なった。別に、pmT1R2を鋳型として、
配列番号11に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号12に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行なった。それぞれ得られた断片を、GENEART Seamless cloning and Assembly kit(A13288、Invitrogen、Life Technologies社)を用いてプラスミドpcDNA3.1(+)のHindIII-EcoRIサイトにサブクローニングした。得られた組み換えベクターをph-mT1R2-EX5、そ
れがコードするキメラタンパク質をh-mT1R2-EX5とした。h-mT1R2-EX5のコード領域配列を配列番号13に示す。またこの配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号14に示す。
（２）h-mT1R2-471を発現するベクターは、以下のようにして２つの断片を連結すること
により作製した。phT1R2を鋳型として、配列番号9に示す塩基配列からなるオリゴヌクレ
オチドをフォワードプライマーとして、配列番号15に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行なった。別に、pmT1R2を鋳型として、
配列番号16に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号12に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行なった。それぞれ得られた断片を、GENEART Seamless cloning and Assembly kit(A13288、Invitrogen、Life Technologies社)を用いてプラスミドpcDNA3.1(+)のHindIII-EcoRIサイトにサブクローニングした。得られた組み換えベクターをph-mT1R2-471、そ
れがコードするキメラタンパク質をh-mT1R2-471とした。h-mT1R2-471のコード領域配列を配列番号17に示す。またこの配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号18に示す。
により作製した。phT1R2を鋳型として、配列番号9に示す塩基配列からなるオリゴヌクレ
オチドをフォワードプライマーとして、配列番号15に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行なった。別に、pmT1R2を鋳型として、
配列番号16に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号12に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行なった。それぞれ得られた断片を、GENEART Seamless cloning and Assembly kit(A13288、Invitrogen、Life Technologies社)を用いてプラスミドpcDNA3.1(+)のHindIII-EcoRIサイトにサブクローニングした。得られた組み換えベクターをph-mT1R2-471、そ
れがコードするキメラタンパク質をh-mT1R2-471とした。h-mT1R2-471のコード領域配列を配列番号17に示す。またこの配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号18に示す。
（３）h-mT1R2-481を発現するベクターは、以下のようにして２つの断片を連結すること
により作製した。phT1R2を鋳型として、配列番号9に示す塩基配列からなるオリゴヌクレ
オチドをフォワードプライマーとして、配列番号19に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行なった。別に、pmT1R2を鋳型として、
配列番号20に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号12に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行なった。それぞれ得られた断片を、GENEART Seamless cloning and Assembly kit(A13288、Invitrogen、Life Technologies社)を用いてプラスミドpcDNA3.1(+)のHindIII-EcoRIサイトにサブクローニングした。得られた組み換えベクターをph-mT1R2-481、そ
れがコードするキメラタンパク質をh-mT1R2-481とした。h-mT1R2-481のコード領域配列を配列番号21に示す。またこの配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号22に示す。
により作製した。phT1R2を鋳型として、配列番号9に示す塩基配列からなるオリゴヌクレ
オチドをフォワードプライマーとして、配列番号19に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行なった。別に、pmT1R2を鋳型として、
配列番号20に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号12に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行なった。それぞれ得られた断片を、GENEART Seamless cloning and Assembly kit(A13288、Invitrogen、Life Technologies社)を用いてプラスミドpcDNA3.1(+)のHindIII-EcoRIサイトにサブクローニングした。得られた組み換えベクターをph-mT1R2-481、そ
れがコードするキメラタンパク質をh-mT1R2-481とした。h-mT1R2-481のコード領域配列を配列番号21に示す。またこの配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号22に示す。
〔実施例３〕ヒトT1R3とマウスT1R3とのキメラタンパク質（T1R3mosaicA、T1R3mosaicB、T1R3mosaicC）をコードするキメラ遺伝子の作製と発現ベクターの構築
前記hT1R3、mT1R3発現ベクター（phT1R3、pmT1R3）を鋳型にして、プライマーを用いたPCR法にてパーツとなる断片を各々増幅した後、組み換え手法を用いてキメラタンパク質
をコードする遺伝子をプラスミドpcDNA3.1(+)にクローニングした。キメラタンパク質は
３種類（T1R3mosaicA、T1R3mosaicB、T1R3mosaicC）作製した。いずれのキメラタンパク
質も、Ｃ末端側部分はヒトT1R3由来であるが、Ｎ末端部分はヒトT1R3とマウスT1R3の両方に由来する部分を含んでいる。キメラタンパク質におけるそれぞれの部分が由来するヒトT1R3（GenBank accession No.NP_689414）又はマウスT1R3（GenBank accession No. NP_114078）中の位置、及び、hT1R3およびmT1R3との相同性を表２及び図１に示す。例えば、
「h(1-63) + m(64-539) + h(535-852)」は、hT1R3の１〜63位の領域、mT1R3の64〜539位
の領域、及びhT1R3の535〜852の領域がこの順で融合したタンパク質であることを示す。
前記hT1R3、mT1R3発現ベクター（phT1R3、pmT1R3）を鋳型にして、プライマーを用いたPCR法にてパーツとなる断片を各々増幅した後、組み換え手法を用いてキメラタンパク質
をコードする遺伝子をプラスミドpcDNA3.1(+)にクローニングした。キメラタンパク質は
３種類（T1R3mosaicA、T1R3mosaicB、T1R3mosaicC）作製した。いずれのキメラタンパク
質も、Ｃ末端側部分はヒトT1R3由来であるが、Ｎ末端部分はヒトT1R3とマウスT1R3の両方に由来する部分を含んでいる。キメラタンパク質におけるそれぞれの部分が由来するヒトT1R3（GenBank accession No.NP_689414）又はマウスT1R3（GenBank accession No. NP_114078）中の位置、及び、hT1R3およびmT1R3との相同性を表２及び図１に示す。例えば、
「h(1-63) + m(64-539) + h(535-852)」は、hT1R3の１〜63位の領域、mT1R3の64〜539位
の領域、及びhT1R3の535〜852の領域がこの順で融合したタンパク質であることを示す。
（１）T1R3mosaicAを発現するベクターは、以下のようにして３つの断片を連結すること
により作製した。phT1R3を鋳型として、配列番号23に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号24に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとしてPCR反応を行い、第一の断片を増幅した。また、phT1R3を鋳
型として、配列番号25に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号26に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行ない、第二の断片を増幅した。別に、pmT1R3を鋳型として、配列番号27に
示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号28に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行な
い、第三の断片を得た。これら3種類の断片を、GENEART Seamless cloning and Assembly
kit(A13288、Invitrogen、Life Technologies社)を用いてプラスミドpcDNA3.1(+)のHindIII-XbaIサイトにサブクローニングした。得られた組換えベクターをpT1R3mosaicA、それがコードするキメラタンパク質をT1R3mosaicAとした。T1R3mosaicAのコード領域配列を配列番号29に示す。またこの配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号30に示す。
により作製した。phT1R3を鋳型として、配列番号23に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号24に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとしてPCR反応を行い、第一の断片を増幅した。また、phT1R3を鋳
型として、配列番号25に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号26に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行ない、第二の断片を増幅した。別に、pmT1R3を鋳型として、配列番号27に
示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号28に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行な
い、第三の断片を得た。これら3種類の断片を、GENEART Seamless cloning and Assembly
kit(A13288、Invitrogen、Life Technologies社)を用いてプラスミドpcDNA3.1(+)のHindIII-XbaIサイトにサブクローニングした。得られた組換えベクターをpT1R3mosaicA、それがコードするキメラタンパク質をT1R3mosaicAとした。T1R3mosaicAのコード領域配列を配列番号29に示す。またこの配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号30に示す。
（２）T1R3mosaicBを発現するベクターは、以下のようにして３つの断片を連結すること
により作製した。pmT1R3を鋳型として、配列番号31に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号32に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとしてPCR反応を行い、第一の断片を増幅した。また、phT1R3を鋳
型として、配列番号33に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号34に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行ない、第二の断片を増幅した。別に、pT1R3mosaicAを鋳型として、配列番
号35に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号26に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応
を行ない、第三の断片を得た。これら3種類の断片を、GENEART Seamless cloning and Assembly kit(A13288、Invitrogen、Life Technologies社)を用いてプラスミドpcDNA3.1(+)のHindIII-XbaIサイトにサブクローニングした。得られた組換えベクターをpT1R3mosaicB、それがコードするキメラタンパク質をT1R3mosaicBとした。T1R3mosaicBのコード領域配列を配列番号36に示す。またこの配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を
配列番号37に示す。
により作製した。pmT1R3を鋳型として、配列番号31に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号32に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとしてPCR反応を行い、第一の断片を増幅した。また、phT1R3を鋳
型として、配列番号33に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号34に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行ない、第二の断片を増幅した。別に、pT1R3mosaicAを鋳型として、配列番
号35に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号26に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応
を行ない、第三の断片を得た。これら3種類の断片を、GENEART Seamless cloning and Assembly kit(A13288、Invitrogen、Life Technologies社)を用いてプラスミドpcDNA3.1(+)のHindIII-XbaIサイトにサブクローニングした。得られた組換えベクターをpT1R3mosaicB、それがコードするキメラタンパク質をT1R3mosaicBとした。T1R3mosaicBのコード領域配列を配列番号36に示す。またこの配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を
配列番号37に示す。
（３）T1R3mosaicCを発現するベクターは、以下のようにして３つの断片を連結すること
により作製した。pmT1R3を鋳型として、配列番号31に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号34に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとしてPCR反応を行い、第一の断片を増幅した。また、phT1R3を鋳
型として、配列番号35に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号38に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行ない、第二の断片を増幅した。別に、pT1R3mosaicAを鋳型として、配列番
号39に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号26に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応
を行ない、第三の断片を得た。これら3種類の断片を、GENEART Seamless cloning and Assembly kit(A13288、Invitrogen、Life Technologies社)を用いてプラスミドpcDNA3.1(+)のHindIII-XbaIサイトにサブクローニングした。得られた組換えベクターをpT1R3mosaicC、それがコードするキメラタンパク質をT1R3mosaicCとした。T1R3mosaicCのコード領域配列を配列番号40に示す。またこの配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号41に示す。
により作製した。pmT1R3を鋳型として、配列番号31に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号34に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとしてPCR反応を行い、第一の断片を増幅した。また、phT1R3を鋳
型として、配列番号35に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号38に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行ない、第二の断片を増幅した。別に、pT1R3mosaicAを鋳型として、配列番
号39に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号26に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応
を行ない、第三の断片を得た。これら3種類の断片を、GENEART Seamless cloning and Assembly kit(A13288、Invitrogen、Life Technologies社)を用いてプラスミドpcDNA3.1(+)のHindIII-XbaIサイトにサブクローニングした。得られた組換えベクターをpT1R3mosaicC、それがコードするキメラタンパク質をT1R3mosaicCとした。T1R3mosaicCのコード領域配列を配列番号40に示す。またこの配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号41に示す。
〔実施例４〕Gα15遺伝子及びトランスデューシンαサブユニット遺伝子のクローニング
（１）ラットGα15遺伝子のクローニング
ラットGα15タンパク質をコードする全長cDNAの配列は、NCBIのGenBankに登録されており（accession No. NM_053542）、これを参考にしてラットのmRNAからクローニング可能
である。ラット舌上皮から調製したRNAから、SuperScriptIII First-Strand Synthesis System for RT-PCR（18080-051、Invitrogen、Life Technologies社）を用いてcDNAを作製し、これを鋳型として配列番号42に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号43に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行なった。得られた断片を、GENEART Seamless cloning and Assembly kit(A13288、Invitrogen、Life Technologies社)を用いてプラスミドpcDNA3.1(+)のHindIII-XbaIサイトにサブクローニングした。
（１）ラットGα15遺伝子のクローニング
ラットGα15タンパク質をコードする全長cDNAの配列は、NCBIのGenBankに登録されており（accession No. NM_053542）、これを参考にしてラットのmRNAからクローニング可能
である。ラット舌上皮から調製したRNAから、SuperScriptIII First-Strand Synthesis System for RT-PCR（18080-051、Invitrogen、Life Technologies社）を用いてcDNAを作製し、これを鋳型として配列番号42に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号43に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行なった。得られた断片を、GENEART Seamless cloning and Assembly kit(A13288、Invitrogen、Life Technologies社)を用いてプラスミドpcDNA3.1(+)のHindIII-XbaIサイトにサブクローニングした。
（２）ラットトランスデューシンαサブユニット遺伝子のクローニング
ラットトランスデューシンαサブユニットをコードする全長cDNAは、NCBIのGenBankに
登録されており（accession No. NM_001108950）、これを参考にしてラットのmRNAからクローニング可能である。ラット舌上皮から調製したRNAから、SuperScriptIII First-Strand Synthesis System for RT-PCR（18080-051、Invitrogen、Life Technologies社）を用いてcDNAを作製し、これを鋳型として配列番号44に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号45に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行なった。得られた断片を、GENEART Seamless cloning and Assembly kit(A13288、Invitrogen、Life Technologies社)を用いてプ
ラスミドpcDNA3.1(+)のHindIII-XbaIサイトにサブクローニングした。
ラットトランスデューシンαサブユニットをコードする全長cDNAは、NCBIのGenBankに
登録されており（accession No. NM_001108950）、これを参考にしてラットのmRNAからクローニング可能である。ラット舌上皮から調製したRNAから、SuperScriptIII First-Strand Synthesis System for RT-PCR（18080-051、Invitrogen、Life Technologies社）を用いてcDNAを作製し、これを鋳型として配列番号44に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号45に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行なった。得られた断片を、GENEART Seamless cloning and Assembly kit(A13288、Invitrogen、Life Technologies社)を用いてプ
ラスミドpcDNA3.1(+)のHindIII-XbaIサイトにサブクローニングした。
〔実施例５〕Gα15−トランスデューシンαサブユニットキメラタンパク質をコードする
遺伝子の作製と発現ベクターの構築
実施例４で得られたラットGα15、及びトランスデューシンαサブユニットをコードす
るDNA配列を元に、Gα15−トランスデューシンαサブユニットキメラタンパク質をコードする遺伝子を作製した。このキメラタンパク質は、Gα15タンパク質のＣ末端側の４８個
のアミノ酸残基が、トランスデューシンαサブユニットのＣ末端側の４８個のアミノ酸残基に置換されている。尚、上記トランスデューシンαサブユニットのＣ末端側の４８個のアミノ酸残基のうち、Ｃ末端から４３位のメチオニン残基がロイシン残基に、３９位のバリン残基がアスパラギン酸残基に置換されている。
遺伝子の作製と発現ベクターの構築
実施例４で得られたラットGα15、及びトランスデューシンαサブユニットをコードす
るDNA配列を元に、Gα15−トランスデューシンαサブユニットキメラタンパク質をコードする遺伝子を作製した。このキメラタンパク質は、Gα15タンパク質のＣ末端側の４８個
のアミノ酸残基が、トランスデューシンαサブユニットのＣ末端側の４８個のアミノ酸残基に置換されている。尚、上記トランスデューシンαサブユニットのＣ末端側の４８個のアミノ酸残基のうち、Ｃ末端から４３位のメチオニン残基がロイシン残基に、３９位のバリン残基がアスパラギン酸残基に置換されている。
ラットGα15をコードする塩基配列を鋳型にして、配列番号42に示す塩基配列からなる
オリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号46に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行ない、Gα15のＮ末端側のコード領域断片を得た。ラットトランスデューシンαサブユニットをコードする塩基配列を鋳型にして、配列番号47に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号48に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行ない、トランスデューシンαサブユニットのＣ末端側のコード領域断片を得
た。これら２種の断片を、GENEART Seamless cloning and Assembly kit(A13288、Invitrogen、Life Technologies社)を用いてプラスミドpcDNA3.1(+)のHindIII-EcoRIサイトにサブクローニングした。得られた組換えベクターをpGα15-trans48LD、それがコードするキメラタンパク質をGα15-trans48LDとした。Gα15-trans48LDのコード領域配列を配列番号49に示す。またこの配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号50に示す。
オリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号46に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行ない、Gα15のＮ末端側のコード領域断片を得た。ラットトランスデューシンαサブユニットをコードする塩基配列を鋳型にして、配列番号47に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号48に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、PCR反応を行ない、トランスデューシンαサブユニットのＣ末端側のコード領域断片を得
た。これら２種の断片を、GENEART Seamless cloning and Assembly kit(A13288、Invitrogen、Life Technologies社)を用いてプラスミドpcDNA3.1(+)のHindIII-EcoRIサイトにサブクローニングした。得られた組換えベクターをpGα15-trans48LD、それがコードするキメラタンパク質をGα15-trans48LDとした。Gα15-trans48LDのコード領域配列を配列番号49に示す。またこの配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号50に示す。
〔実施例６〕培養細胞への遺伝子導入と甘味受容体の活性・測定感度評価
10% Fetal bovine serum（ニチレイ）、1％ Pen Strep（GIBCO）を含むDMEM/Ham's F-12（ナカライテスク）培地を用いて維持したHEK293E細胞をD-PBS（-）（ナカライテスク）で洗浄後、0.25% Trypsin EDTA(GIBCO)を用いて細胞をフラスコから回収した。遠心分離
（1,200 rpm, 3min）を行って上清を除去し、5% FBS DMEM/Ham's F-12中で0.75×107cell/mlになるように懸濁した。これを150 cm3フラスコ（IWAKI）に10ml播種し、一晩培養（37℃、5% CO2）した。翌日、培地をOpti-MEM(invitrogen、Life Technologies社)30mlに交換して、Opti-MEMとLipofectamin2000（invitrogen、Life Technologies社）を用いて調
製した甘味受容体遺伝子混合物溶液（Gα15-trans48LD遺伝子と、各種のT1R2キメラ遺伝
子と、各種のT1R3キメラ遺伝子の遺伝子、総計63.8μg)を細胞懸濁液にゆっくり添加し、6時間培養（37℃、5% CO2）することで遺伝子を導入した。
10% Fetal bovine serum（ニチレイ）、1％ Pen Strep（GIBCO）を含むDMEM/Ham's F-12（ナカライテスク）培地を用いて維持したHEK293E細胞をD-PBS（-）（ナカライテスク）で洗浄後、0.25% Trypsin EDTA(GIBCO)を用いて細胞をフラスコから回収した。遠心分離
（1,200 rpm, 3min）を行って上清を除去し、5% FBS DMEM/Ham's F-12中で0.75×107cell/mlになるように懸濁した。これを150 cm3フラスコ（IWAKI）に10ml播種し、一晩培養（37℃、5% CO2）した。翌日、培地をOpti-MEM(invitrogen、Life Technologies社)30mlに交換して、Opti-MEMとLipofectamin2000（invitrogen、Life Technologies社）を用いて調
製した甘味受容体遺伝子混合物溶液（Gα15-trans48LD遺伝子と、各種のT1R2キメラ遺伝
子と、各種のT1R3キメラ遺伝子の遺伝子、総計63.8μg)を細胞懸濁液にゆっくり添加し、6時間培養（37℃、5% CO2）することで遺伝子を導入した。
遺伝子導入後に、D-PBS（-）で細胞を洗浄後、0.25% Trypsin EDTA(GIBCO)を用いて細
胞をフラスコから剥がして回収した。細胞数をカウント後、5% FBS DMEM（2.78mMグルコ
ース、GIBCO）培地中に0.5×106cell/mlになるように懸濁した。この細胞懸濁液を、D-Lysine coat 96well plate(BDバイオサイエンス)の各ウェルに7.0×104cellになるように播種し、一晩培養した。
胞をフラスコから剥がして回収した。細胞数をカウント後、5% FBS DMEM（2.78mMグルコ
ース、GIBCO）培地中に0.5×106cell/mlになるように懸濁した。この細胞懸濁液を、D-Lysine coat 96well plate(BDバイオサイエンス)の各ウェルに7.0×104cellになるように播種し、一晩培養した。
培養後、96ウェルの培地をすべてすて、Assay用buffer（20 mM HEPES, 146 mM NaCl, 1
mM MgSO4, 1.39 mMグルコース, 1mM CaCl2, 2.5 mM Probenecid, 0.05% Bovine serum albumin）で80倍に希釈した細胞内カルシウムイオン測定用染色液Calcium assay kit Express（Molecular Device）を200μl加え、37℃で30分、室温にて45分静地し、染色を行っ
た。染色後、FDSSμCELL（浜松ホトニクス）を用いてAssay用bufferで調製した刺激物（
甘味物質）を50μl添加し、刺激後120秒間までの蛍光値を測定した。刺激前後の蛍光値（Ex480:Em540）を測定することで、刺激物の添加により甘味受容体を介して引き起こされ
る細胞内遊離カルシウムイオン濃度の変化を定量的に調べた。蛍光値の測定および解析には、FDSSμCELL付属のソフト（FDSS7000EX）を用いて行い、ΔF/F値は下記の方法により
算出し、それを評価に用いた。
mM MgSO4, 1.39 mMグルコース, 1mM CaCl2, 2.5 mM Probenecid, 0.05% Bovine serum albumin）で80倍に希釈した細胞内カルシウムイオン測定用染色液Calcium assay kit Express（Molecular Device）を200μl加え、37℃で30分、室温にて45分静地し、染色を行っ
た。染色後、FDSSμCELL（浜松ホトニクス）を用いてAssay用bufferで調製した刺激物（
甘味物質）を50μl添加し、刺激後120秒間までの蛍光値を測定した。刺激前後の蛍光値（Ex480:Em540）を測定することで、刺激物の添加により甘味受容体を介して引き起こされ
る細胞内遊離カルシウムイオン濃度の変化を定量的に調べた。蛍光値の測定および解析には、FDSSμCELL付属のソフト（FDSS7000EX）を用いて行い、ΔF/F値は下記の方法により
算出し、それを評価に用いた。
また各甘味物質を添加したときに得られたΔF/F値を用いてS/N比を算出した。具体的に
は各々の物質を種々の濃度で添加したときに得られたΔF/Fの最小値をノイズ（N）値とし、ΔF/Fの最大値をシグナル（S）値として、S/N値を算出し、各受容体の活性測定感度の
指標とした。すなわちS/N値が高いほど甘味受容体と被倹物質の相互作用を検出する感度
が高く、より低濃度領域で甘味物質や甘味調節物質による刺激を容易に見出されることを示すものである。
は各々の物質を種々の濃度で添加したときに得られたΔF/Fの最小値をノイズ（N）値とし、ΔF/Fの最大値をシグナル（S）値として、S/N値を算出し、各受容体の活性測定感度の
指標とした。すなわちS/N値が高いほど甘味受容体と被倹物質の相互作用を検出する感度
が高く、より低濃度領域で甘味物質や甘味調節物質による刺激を容易に見出されることを示すものである。
刺激物質として用いた甘味物質は、アセスルファム（Acesulfame）カリウム(東京化成)、サッカリン（Saccharin） ナトリウム(WAKO)、スクラロース（sucralose）（SIGMA）、スクロース（sucrose）(WAKO)、ネオテーム（Neotame）(SIGMA)、並びに社内で合成した
アスパルテーム（Aspartame）、アドバンテーム(Advantame)、及びSC-45647（[3-[(S)-1-フェニルエチル]-2-(4-シアノフェニル)グアニジノ]酢酸（[3-[(S)-1-Phenylethyl]-2-(4-cyanophenyl)guanidino]acetic acid））を使用した。
アスパルテーム（Aspartame）、アドバンテーム(Advantame)、及びSC-45647（[3-[(S)-1-フェニルエチル]-2-(4-シアノフェニル)グアニジノ]酢酸（[3-[(S)-1-Phenylethyl]-2-(4-cyanophenyl)guanidino]acetic acid））を使用した。
（１）h-mT1R2-481の活性検出と測定感度
HEK293E細胞にGα15-trans48LDとともに、hT1R2又はh-mT1R2-481、及び、hT1R3、mT1R3又はT1R3mosaicAを組み合わせて遺伝子導入し、各甘味物質を添加したときの反応値（ΔF/F）を図２、及び図３に示す。また、S/N比を図４、及び表３に示す。
その結果、全ての甘味物質において、T1R3がmT1R3の場合でも、T1R3mosaicAの場合であっても、hT1R2と比較して、h-mT1R2-481はより高いS/N値を示し、より高い感度で甘味受
容体の活性化物質を検出することが可能であることが示された。
HEK293E細胞にGα15-trans48LDとともに、hT1R2又はh-mT1R2-481、及び、hT1R3、mT1R3又はT1R3mosaicAを組み合わせて遺伝子導入し、各甘味物質を添加したときの反応値（ΔF/F）を図２、及び図３に示す。また、S/N比を図４、及び表３に示す。
その結果、全ての甘味物質において、T1R3がmT1R3の場合でも、T1R3mosaicAの場合であっても、hT1R2と比較して、h-mT1R2-481はより高いS/N値を示し、より高い感度で甘味受
容体の活性化物質を検出することが可能であることが示された。
（２）h-mT1R2-EX5およびh-mT1R2-471の活性検出と測定感度
HEK293E細胞にGα15-trans48LDとともに、hT1R2、h-mT1R2-EX5、h-mT1R2-481又はh-mT1
R2-471を、hT1R3、mT1R3又はT1R3mosaicAと組み合わせて遺伝子導入し、各甘味物質を添
加したときの反応値（ΔF/F）を測定した。得られたΔF/F値を用いて算出したS/N比を図
５、及び表４）に示す。その結果、全ての甘味物質において、T1R3がmT1R3の場合でも、T1R3mosaicAの場合でも、h-mT1R2-EX5とh-mT1R2-471は、hT1R2と比較してより高いS/N値を示した。つまり、h-mT1R2-481に加えて、h-mT1R2-EX5とh-mT1R2-471もhT1R2と比較してより高いS/N値を示し、より高い感度で甘味受容体の活性化物質を検出することが可能であ
ることが示された。
HEK293E細胞にGα15-trans48LDとともに、hT1R2、h-mT1R2-EX5、h-mT1R2-481又はh-mT1
R2-471を、hT1R3、mT1R3又はT1R3mosaicAと組み合わせて遺伝子導入し、各甘味物質を添
加したときの反応値（ΔF/F）を測定した。得られたΔF/F値を用いて算出したS/N比を図
５、及び表４）に示す。その結果、全ての甘味物質において、T1R3がmT1R3の場合でも、T1R3mosaicAの場合でも、h-mT1R2-EX5とh-mT1R2-471は、hT1R2と比較してより高いS/N値を示した。つまり、h-mT1R2-481に加えて、h-mT1R2-EX5とh-mT1R2-471もhT1R2と比較してより高いS/N値を示し、より高い感度で甘味受容体の活性化物質を検出することが可能であ
ることが示された。
（３）T1R3mosaicAの活性検出と測定感度
HEK293E細胞にGα15-trans48LDとともに、hT1R2又はh-mT1R2-481、及び、hT1R3又はT1R
3mosaicAを組み合わせて遺伝子導入し、前記甘味物質、又はネオヘスペリジンジヒドロカルコン（Neohesperidin dihydrochalcone）（NHDC, SIGMA）を添加したときの反応値（ΔF/F）を図６、図７、及び図８に示す。また、S/N比を図９、及び表５に示す。その結果、全ての甘味物質において、T1R2がhT1R2の場合でも、h-mT1R2-481の場合でも、hT1R3と比
較して、T1R3mosaicAはより高いS/N値を示し、より高い感度で甘味受容体の活性化物質を検出することが可能であることが示された。
HEK293E細胞にGα15-trans48LDとともに、hT1R2又はh-mT1R2-481、及び、hT1R3又はT1R
3mosaicAを組み合わせて遺伝子導入し、前記甘味物質、又はネオヘスペリジンジヒドロカルコン（Neohesperidin dihydrochalcone）（NHDC, SIGMA）を添加したときの反応値（ΔF/F）を図６、図７、及び図８に示す。また、S/N比を図９、及び表５に示す。その結果、全ての甘味物質において、T1R2がhT1R2の場合でも、h-mT1R2-481の場合でも、hT1R3と比
較して、T1R3mosaicAはより高いS/N値を示し、より高い感度で甘味受容体の活性化物質を検出することが可能であることが示された。
（４）T1R3mosaicB、およびT1R3mosaicCの活性検出と測定感度
HEK293E細胞にGα15-trans48LDとともに、hT1R2又はh-mT1R2-481、及び、hT1R3、T1R3mosaicA、T1R3mosaicB、又はT1R3mosaicCを組み合わせて遺伝子導入し、各甘味物質を添加したときの反応値（ΔF/F）を測定した。得られたΔF/F値を用いて算出したS/N比を図１
０、及び表６に示す。その結果、全ての甘味物質において、T1R2がhT1R2の場合でも、h-mT1R2-481の場合でも、hT1R3と比較して、T1R3mosaicBおよびT1R3mosaicCはより高いS/N値を示し、より高い感度で甘味受容体の活性化物質を検出することが可能であることが示された。つまり、T1R3mosaicAに加えて、T1R3mosaicBおよびT1R3mosaicCも、hT1R3と比較してより高いS/N値を示し、より高い感度で甘味受容体の活性化物質を検出することが可能
であることが示された。
HEK293E細胞にGα15-trans48LDとともに、hT1R2又はh-mT1R2-481、及び、hT1R3、T1R3mosaicA、T1R3mosaicB、又はT1R3mosaicCを組み合わせて遺伝子導入し、各甘味物質を添加したときの反応値（ΔF/F）を測定した。得られたΔF/F値を用いて算出したS/N比を図１
０、及び表６に示す。その結果、全ての甘味物質において、T1R2がhT1R2の場合でも、h-mT1R2-481の場合でも、hT1R3と比較して、T1R3mosaicBおよびT1R3mosaicCはより高いS/N値を示し、より高い感度で甘味受容体の活性化物質を検出することが可能であることが示された。つまり、T1R3mosaicAに加えて、T1R3mosaicBおよびT1R3mosaicCも、hT1R3と比較してより高いS/N値を示し、より高い感度で甘味受容体の活性化物質を検出することが可能
であることが示された。
〔配列表の説明〕
配列番号１〜12、15〜16、19〜20、23〜28、31〜35、38〜39、42〜48：プライマーの塩基配列
配列番号13：h-mT1R2-EX5をコードする塩基配列
配列番号14：h-mT1R2-EX5のアミノ酸配列
配列番号17：h-mT1R2-471をコードする塩基配列
配列番号18：h-mT1R2-471のアミノ酸配列
配列番号21：h-mT1R2-481をコードする塩基配列
配列番号22：h-mT1R2-481のアミノ酸配列
配列番号29：T1R3mosaicAをコードする塩基配列
配列番号30：T1R3mosaicAのアミノ酸配列
配列番号36：T1R3mosaicBをコードする塩基配列
配列番号37：T1R3mosaicBのアミノ酸配列
配列番号40：T1R3mosaicCをコードする塩基配列
配列番号41：T1R3mosaicCのアミノ酸配列
配列番号49：Gα15-trans48LDをコードする塩基配列
配列番号50：Gα15-trans48LDのアミノ酸配列
配列番号51：ヒトT1R2をコードする塩基配列
配列番号52：ヒトT1R2のアミノ酸配列
配列番号53：マウスT1R2をコードする塩基配列
配列番号54：マウスT1R2のアミノ酸配列
配列番号55：ヒトT1R3をコードする塩基配列
配列番号56：ヒトT1R3のアミノ酸配列
配列番号57：マウスT1R3をコードする塩基配列
配列番号58：マウスT1R3のアミノ酸配列
配列番号59：ラットGα15をコードする塩基配列
配列番号60：ラットGα15のアミノ酸配列
配列番号61：ラットトランスデューシンαサブユニットをコードする塩基配列
配列番号62：ラットトランスデューシンαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１〜12、15〜16、19〜20、23〜28、31〜35、38〜39、42〜48：プライマーの塩基配列
配列番号13：h-mT1R2-EX5をコードする塩基配列
配列番号14：h-mT1R2-EX5のアミノ酸配列
配列番号17：h-mT1R2-471をコードする塩基配列
配列番号18：h-mT1R2-471のアミノ酸配列
配列番号21：h-mT1R2-481をコードする塩基配列
配列番号22：h-mT1R2-481のアミノ酸配列
配列番号29：T1R3mosaicAをコードする塩基配列
配列番号30：T1R3mosaicAのアミノ酸配列
配列番号36：T1R3mosaicBをコードする塩基配列
配列番号37：T1R3mosaicBのアミノ酸配列
配列番号40：T1R3mosaicCをコードする塩基配列
配列番号41：T1R3mosaicCのアミノ酸配列
配列番号49：Gα15-trans48LDをコードする塩基配列
配列番号50：Gα15-trans48LDのアミノ酸配列
配列番号51：ヒトT1R2をコードする塩基配列
配列番号52：ヒトT1R2のアミノ酸配列
配列番号53：マウスT1R2をコードする塩基配列
配列番号54：マウスT1R2のアミノ酸配列
配列番号55：ヒトT1R3をコードする塩基配列
配列番号56：ヒトT1R3のアミノ酸配列
配列番号57：マウスT1R3をコードする塩基配列
配列番号58：マウスT1R3のアミノ酸配列
配列番号59：ラットGα15をコードする塩基配列
配列番号60：ラットGα15のアミノ酸配列
配列番号61：ラットトランスデューシンαサブユニットをコードする塩基配列
配列番号62：ラットトランスデューシンαサブユニットのアミノ酸配列
Claims (15)
- Ｔ１Ｒ２タンパク質及びＴ１Ｒ３タンパク質を発現する細胞に被検物質を接触させる工程と、Ｔ１Ｒ２タンパク質及び／又はＴ１Ｒ３タンパク質と前記被検物質との相互作用を検出する工程を含む、甘味物質又は甘味調節物質を検出する方法であって、
ａ）Ｔ１Ｒ２タンパク質が、配列番号１８、２２、及び１４から選ばれるアミノ酸配列を含むキメラＴ１Ｒ２タンパク質であり、
かつ
ｂ）Ｔ１Ｒ３タンパク質が、配列番号３０、３７、及び４１から選ばれるアミノ酸配列を含むキメラＴ１Ｒ３タンパク質である、前記方法。 - 請求項１に記載の甘味調節物質を検出する方法であって、前記Ｔ１Ｒ２タンパク質及びＴ１Ｒ３タンパク質を発現する細胞に被検物質を接触させる工程において、被検物質と共に甘味物質を前記細胞に接触させる、方法。
- 前記細胞がさらにＧタンパク質αサブユニットを発現し、前記Ｇタンパク質αサブユニットがヒトもしくはラットのＧタンパク質αサブユニット、又は種類の異なるＧタンパク質αサブユニット同士のキメラタンパク質である、請求項１又は２に記載の方法。
- Ｇタンパク質αサブユニットが、ラットＧα15の１〜３２７位の領域と、トランスデューシンαサブユニットの３０７〜３５４位の領域が、この順で融合したキメラＧαタンパク質であって、前記トランスデューシンαサブユニットの３０７〜３５４位の領域のうち、３１２位のメチオニン残基がロイシン残基に、３１６位のバリン残基がアスパラギン酸残基に各々置換されているキメラＧαタンパク質である、請求項３に記載の方法。
- 前記キメラＧαタンパク質が配列番号５０のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の方法。
- Ｔ１Ｒ２タンパク質及び／又はＴ１Ｒ３タンパク質と被検物質との相互作用を、細胞内遊離カルシウムイオン濃度の変化により検出する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の
方法。 - 前記細胞が動物細胞、昆虫細胞又は酵母である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞がヒト由来の培養細胞である、請求項７に記載の方法。
- 前記細胞がＨＥＫ細胞である、請求項８に記載の方法。
- Ｔ１Ｒ２タンパク質及びＴ１Ｒ３タンパク質を発現する細胞であって、
ａ）Ｔ１Ｒ２タンパク質が、配列番号１８、２２、及び１４から選ばれるアミノ酸配列を含むキメラＴ１Ｒ２タンパク質であり、
かつ
ｂ）Ｔ１Ｒ３タンパク質が、配列番号３０、３７、及び４１から選ばれるアミノ酸配列を含むキメラＴ１Ｒ３タンパク質である、前記細胞。 - さらにＧタンパク質αサブユニットを発現し、前記Ｇタンパク質αサブユニットがヒトもしくはラットのＧタンパク質αサブユニット、又は種類の異なるＧタンパク質αサブユニット同士のキメラタンパク質である、請求項１０に記載の細胞。
- 以下のａ１）〜ａ３）から選ばれるキメラＴ１Ｒ２タンパク質：
ａ１）配列番号１８のアミノ酸配列を含むキメラＴ１Ｒ２タンパク質、
ａ２）配列番号２２のアミノ酸配列を含むキメラＴ１Ｒ２タンパク質、及び、
ａ３）配列番号１４のアミノ酸配列を含むキメラＴ１Ｒ２タンパク質。 - 以下のｂ１）〜ｂ３）から選ばれるキメラＴ１Ｒ３タンパク質：
ｂ１）配列番号３０のアミノ酸配列を含むキメラＴ１Ｒ３タンパク質、
ｂ２）配列番号３７のアミノ酸配列を含むキメラＴ１Ｒ３タンパク質、及び
ｂ３）配列番号４１のアミノ酸配列を含むキメラＴ１Ｒ３タンパク質。 - 請求項１２に記載のキメラＴ１Ｒ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項１３に記載のキメラＴ１Ｒ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
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