JP5905187B2

JP5905187B2 - 甘味受容体発現コンストラクト、これを発現させた細胞体、及びその利用

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Publication number: JP5905187B2
Application number: JP2009274976A
Authority: JP
Inventors: 啓子阿部; 巧三坂; 隆将今田; 藤原　聡; 聡藤原
Original assignee: T Hasegawa Co Ltd; University of Tokyo NUC
Current assignee: T Hasegawa Co Ltd; University of Tokyo NUC
Priority date: 2009-12-02
Filing date: 2009-12-02
Publication date: 2016-04-20
Anticipated expiration: 2029-12-02
Also published as: JP2011115088A; EP2520647A1; US20120315652A1; EP2520647A4; EP2520647B1; WO2011067970A1; US8658383B2; CA2781655C; CA2781655A1

Description

本発明は、甘味受容体発現コンストラクト、これを発現させた細胞体、及びその利用に関し、詳しくは、甘味受容体（Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３）とＧタンパク質を共に機能的に安定に発現させて、所望する甘味受容体発現細胞を生産させるのに有用な甘味受容体発現コンストラクト、これを発現させた細胞体、及びその利用に関する。

味覚は、物質を口にした時に、特に舌の表面に存在する特異的な受容体と物質が結合することによって生じる感覚である。哺乳類の味覚は、５つの基本味、すなわち、塩味、酸味、甘味、うま味、苦味で構成されており、これらの基本味が統合することによって形成されると考えられている。現在のところ、塩味、酸味は、舌の表面の味蕾に存在する味細胞の近位側の細胞膜上に発現するいくつかのイオンチャネル型受容体を介して感知されると言われており、特に酸味については、ＴＲＰチャネルファミリーであるＰＫＤ２Ｌ１＋ＰＫＤ１Ｌ３からなるイオンチャネル型受容体が機能していると考えられている。

一方、甘味、うま味、苦味については、味細胞に存在する膜タンパク質であるＧタンパク質共役受容体（Ｇｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧＰＣＲ））と、それに共役するＧタンパク質を介したシグナル伝達によって感知されると考えられており、具体的には、甘味はＴ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３のヘテロダイマー（甘味受容体）、うま味はＴ１Ｒ１＋Ｔ１Ｒ３のヘテロダイマー（うま味受容体）で受容され、苦味はＴ２Ｒファミリーと命名された約３０種類の分子（苦味受容体）で受容されることが明らかにされている。

上記Ｇタンパク質は、α、β、γの３つのサブユニットで構成されている。α、β、γのサブユニットが結合した状態は不活性型であり、味物質がＧタンパク質共役受容体に結合すると、αサブユニットに結合していたＧＤＰ（グアノシン５’二リン酸）がＧＴＰに置換されて、ＧＴＰ-αサブユニットとβ-γサブユニットの結合体に解離した活性型になる。

味覚情報の伝達機構のしくみについては、完全に解明されたわけではないが、一般には以下のように理解されている。すなわち、まず、味物質が味細胞の受容体に結合すると、細胞内のセカンドメッセンジャー（ＩＰ₃、ＤＡＧ）などを介する情報伝達過程を経て、細胞内のカルシウム濃度が上昇し、次いで、細胞内に供給されたカルシウムイオンは、神経伝達物質をシナプスに放出させて神経細胞に活動電位を発生させ、その結果、受容体を起点とした味覚シグナルが味神経から脳に伝達されて味覚情報が識別、判断される、というのが通説である。また、最近、カルシウムイオンがＴＲＰＭ５という新規な陽イオンチャネルを開口させ、一価陽イオンが細胞内に流入することで脱分極するという説も認められつつある。

上述した、塩味、酸味、甘味、うま味、苦味からなる５つの基本味のうち、特に甘味は、血液中の糖分が減少したときに、非常に美味しく感じる味であり、また、糖を含むエネルギー源としてのイメージをヒトに与え、さらには、他の基本味に比べて強い満足感、幸福感を引き起こし、ヒトの情動と深く関係していることから、飲食品などの嗜好性を決定する上で中心となる味である。

しかしながら、甘味は、他の基本味に比べて最小感度（閾値）が高く、少量では感知しにくいという特性がある。他方、甘味が強すぎると、ハイカロリー、肥満などの健康的でないイメージを誘起することになる。そのため、甘味を付与した飲食品などを製造する場合、ヒトが感知できる甘味であって、かつ、好ましく受け入れられる甘味になるように、甘味の強度を調節することが重要である。

ヒトが飲食品などを口中に含んだ時に感知する甘味の強度は、従来、主として、ヒトの官能評価によって検証されている。しかし、官能評価では、味覚と嗅覚から感知される情報を統合的に評価することになるため、物質が味覚に対してどの程度作用しているのかを検証することは困難である。特に、閾値以下の甘味を有する物質については、閾値以下のレベルの甘味をヒトは感知できないことから、甘味の程度を検証することは非常に困難である。さらに、物質間における甘味強度の違いを客観的に評価することも非常に困難である。また、官能評価あるいは官能検査では、良く訓練された評価者（パネル又はパネラーと呼ばれる）間の評価のバラツキも無視することはできない。

そこで、ヒトによる官能評価に代えて、舌の表面の味蕾に存在する味細胞を単離し、これを用いて甘味強度を評価することも考えられる。しかし、舌の表面の味蕾に存在する味細胞を単離したものは、培養プレートへの接着が非常に弱く、すぐに死んでしまうため、時間を要する評価には使用することができない。

前述したように、甘味は、飲食品などの嗜好性を決定する上で中心となる味であることから、例えば、甘味受容体に作用して甘味を増強する物質を同定することができれば、同定された該物質を使用して、飲食品、医薬品などの味の改善、甘味料の使用量の削減、摂取カロリーの低下などの有益な効果を達成することができる。そのため、飲食品、フレーバーなどの産業界からは、そのような甘味増強物質に対して多大な関心が寄せられている。

そこで、官能評価に代わる新たな甘味強度の評価方法として、甘味受容体を実際に発現させた細胞系を用いて、物質の甘味強度を客観的に測定、評価する方法が報告されている。
具体的には、例えば、特許文献１の実施例１１において、Ｇα１５発現細胞株（ＡｕｒｏｒａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＨＥＫ-２９３細胞株）に、ｈＴ１Ｒ２の発現コンストラクト（プラスミドＳＡＶ２４８６）を含む線状化したｐＥＡＫ１０由来（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ベクターと、ｈＴ１Ｒ３の発現コンストラクト（プラスミドＳＸＶ５５０）を含むｐＣＤＮＡ３．１／ＺＥＯ由来（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターとを、トランスフェクトすることにより、ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３を共発現させて生成した細胞株が報告されている。

また、特許文献２の実施例６には、ｈＴ１Ｒ２のｃＤＮＡを含むベクター、ｈＴ１Ｒ３のｃＤＮＡを含むベクター、キメラＧαタンパク質をコードする遺伝子を含むベクター、及びトランスフェクション効率のマーカーｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１（タカラバイオ社）を、ＤＮＡ導入比率が重量比（４：４：１：０．２）、導入量４．６〜５．５μｇとなるようにして、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ-２９３Ｔ細胞に導入して、ｈＴ１Ｒ２−ｈＴ１Ｒ３、及びキメラＧαタンパク質をＨＥＫ-２９３Ｔ細胞に共発現させたシグナリング系が開示されている。

また、特許文献３の実施例７には、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを含む線状ｐＩＲＥＳ２-Ｐｕｒｏベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、Ｇα１６ｇｕｓｔ４４を発現する細胞にトランスフェクトし、次いで、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡ含む線状ｐｃＤＮＡ４-ＴＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をトランスフェクトすることにより、ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３を共発現させて生成した細胞株が記載されている。

特開２００８−１３５７０号公報特開２００８−２２８６９０号公報ＷＯ２００７−１２１６０４号公報

従来の甘味受容体を発現させた細胞系は、いずれも所定のＧタンパク質を発現する細胞を事前に作製あるいは入手しておき、これにＴ１Ｒ２をコードする遺伝子を含むベクター、及びＴ１Ｒ３をコードする遺伝子を含むベクターをそれぞれトランスフェクトすることによって作製されている。

しかしながら、そのような方法によって細胞系を作製すると、各ベクターの細胞への導入効率が同一ではなく、いずれかが優位に導入されることがあり、また、導入した目的遺伝子が細胞のゲノム中にランダムに挿入され、極端な場合には、導入した目的遺伝子がゲノム中の転写されない不活性部分に挿入されることがある。
そのため、得られた細胞系には、以下の問題点があった。
（１）従来の細胞系の中には、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３のいずれか一方又は両方が発現されておらず、中には、細胞内の一連のシグナル伝達機構を実質的に備えていないものがあった。すなわち、従来の細胞系は、甘味の受容・伝達機構を備えた機能的に優れたモデルであるとは言えなかった。
（２）Ｇタンパク質は細胞間で一定量が発現されるものの、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３の発現量及び発現比率が細胞間で異なり、バラツキが大きかった。そのため、甘味に関する評価結果について、細胞間での直接比較、特に各種点変異体コンストラクトを用いて発現させた細胞間での直接比較は困難であった。
(３)細胞の継代に伴い、導入されたＴ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３をコードする遺伝子が排除されることが高頻度で起こり、したがって、連続して継代的に甘味受容体を安定的に発現できる細胞系ではなかった。
（４）細胞系のＧタンパク質を変更する場合には、所望するＧタンパク質を発現する細胞を新たに作製、入手しておく必要があった。
（５）スクロース等の閾値が高い甘味物質に対しては、細胞の応答性が実用上必ずしも十分とは言えなかった。

そこで、本発明は、上記問題点を解決することができる発現コンストラクト、及び該発
現コンストラクトを発現させた安定発現細胞体を提供することにある。

本発明者らは、上記問題点を解決するために検討を重ねた結果、Ｆｌｐリコンビナーゼの特異的認識部位であるＦＲＴ部位を含み、かつ、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、Ｇタンパク質をコードする各遺伝子を同一のプラスミドに挿入した発現コンストラクトを作製し、これを所定の細胞に導入してＴ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、Ｇタンパク質を発現させることによって、甘味受容体（Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３）とＧタンパク質αサブユニットを共に高い発現効率で機能的に安定して発現させることができることを見出し、かかる知見に基づいて、本発明を完成するに至った。

かくして、本発明は、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各遺伝子を同一のプラスミドに挿入してなる甘味受容体発現コンストラクトを提供するものである。

また、本発明は、ゲノム中にＦＲＴ（ＦｌｉｐｐａｓｅＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎＴａｒｇｅｔ）配列を１か所組み込まれた２９３細胞に、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の甘味受容体発現コンストラクトを遺伝子導入して甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットを同時に発現させた細胞株を提供するものである。

また、本発明は、甘味物質に対する生理的応答を測定するための上記細胞株の使用である。

また、本発明は、上記細胞株を使用した、甘味物質に対する生理的応答の測定により同定された、特定の甘味物質に対する甘味増強物質を、該甘味物質の生理的応答を測定する際に添加することにより、該甘味物質の甘味の閾値以下の濃度で該甘味物質の生理的応答を測定する方法である。

本発明によって、以下に示す効果が得られる。
（１）本発明の甘味受容体発現コンストラクトは、甘味受容体刺激による細胞内シグナル伝達が生じるように、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、及びそれらに共役するＧタンパク質を機能的に発現することができる。したがって、上記コンストラクトを発現させた細胞株は、実際の甘味受容によって生じる甘味の知覚を、ｉｎｖｉｖｏで客観的に評価することができる最適なモデルとなり、また、甘味物質、甘味調節物質などを同定、選択する味覚センサーとして使用することができ、特に高スループットスクリーニングアッセイにおいて極めて有用である。なお、甘味調節物質とは、甘味受容体（Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３）に作用することによって、甘味物質単独で得られる甘味受容体からの生理的応答、すなわち、甘味の強度を改変させる物質を意味する。
（２）本発明の甘味受容体発現コンストラクトは、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、及びそれらに共役するＧタンパク質を同等の比率で機能的に発現することができる。したがって、本発明の細胞株によれば、異なる点変異体を導入した甘味受容体、あるいは種々のＧタンパク質を発現させた複数の安定発現株について、直接比較による比較実験を行うことができる。
（３）本発明の細胞株は、長期にわたってＴ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、及びそれらに共役するＧタンパク質を発現することができ、安定性が高い。継代数にかかわらず、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、及びそれらに共役するＧタンパク質の発現量の変化が小さいため、長期間継代して利用することができる。
（４）本発明の細胞株を作製する場合、従来のように、所望するＧタンパク質を発現する細胞を作製、入手しておく必要がない。
（５）本発明の細胞株は、甘味物質に対して高い応答性を示すため、甘味の強度が閾値以下にある物質であっても、甘味の強度を評価することができる。

ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の構造を示す図である。本発明の甘味受容体発現コンストラクトにおいて、第一の好適な具体的態様である甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）、第二の好適な具体的態様である甘味受容体発現コンストラクト（Ｂ）、第三の好適な具体的態様である甘味受容体発現コンストラクト（Ｃ）の構造の一部を示す図である。甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）の作製工程（ａ）で得られる生成物を示す図である。甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）の作製工程（ｂ）で得られる生成物を示す図である。甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）の作製工程（ｃ）で得られる生成物を示す図である。甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）の作製工程（ｄ）で得られる生成物を示す図である。甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）の作製工程（ｅ）で得られる生成物を示す図である。甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）の作製工程（ｆ）で得られる生成物を示す図である。甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）の作製工程（ｇ）で得られる生成物を示す図である。実施例５において、比較として使用した発現コンストラクトの構造の一部を示す図である。アスパルテーム刺激に対する応答細胞数の結果を示す図である。培養細胞株（Ａ）にアスパルテームを投与した際の蛍光イメージ画像を示す図である。培養細胞株（Ａ）にスクロースを投与した際の蛍光イメージ画像を示す図である。培養細胞株（Ａ）にスクロースとラクチゾールを投与した際の蛍光イメージ画像を示す図である。培養細胞株（Ａ）にスクロースを投与した際のスクロース濃度-応答曲線である。培養細胞株（Ａ）にD-フェニルアラニンを投与した際のD-フェニルアラニン濃度-応答曲線である。培養細胞株（Ａ）にアスパルテームを投与した際のアスパルテーム濃度-応答曲線である。培養細胞株（Ａ）にサッカリンを投与した際のサッカリン濃度-応答曲線である。培養細胞株（Ａ）にステビアを投与した際のステビア濃度-応答曲線である。培養細胞株（Ａ）にネオヘスペリジンジヒドロカルコン（NHDC）を投与した際のネオヘスペリジンジヒドロカルコン（NHDC）濃度-応答曲線である。培養細胞株（Ａ）にシクラメートを投与した際のシクラメート濃度-応答曲線である。

以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明において、発現コンストラクトとは、所望のコード配列及び該コード配列を発現させるために必要なプロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子、ＦＲＴ部位をコードする遺伝子などの適切な核酸配列を連結したＤＮＡ断片を細胞に移動させる核酸分子の意味であり、発現ベクターと同様の意味である。

転写開始シグナルとして機能するプロモーターは、細胞に導入する遺伝子を発現する機能を有するものであれば限定されず、例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＥＦ−１α、ＳＲα、ＣＡＧなどが例示される。

転写を終結させる核酸配列であるターミネーターとしては、ＳＶ４０ｐＡが例示される。ＳＶ４０ｐＡは、２３７ｂｐのＢａｍＨＩ／ＢｃＩＩ制限酵素断片上に含まれ、終結及びポリアデニル化の両方をもたらし、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）由来するものが多く利用されている。

目的とする遺伝子が導入されたことを確認するための目印として導入される遺伝子であるマーカー遺伝子としては、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが例示される。

ＦＲＴ部位をコードする遺伝子は、ｐＦＲＴβＧＡＬ（ＳＴＲＡＴＡＧＥ、ｐｒｏｔｏｃｏｌ、ＳＥＱＵＥＮＣＥＡＮＤＳＩＴＥＳ、Ｃａｔａｌｏｇ＃２１８４０３、Ｍａｙ２８、１９９１）に開示される２０８７−２１４７の塩基配列が該当する。

甘味受容体とは、前述したように、Ｔ１Ｒ２とＴ１Ｒ３の２つのサブユニットを組み合わせることによって構成されるヘテロオリゴマー受容体である。本発明において、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３には、ヒトの甘味受容体サブユニット（ｈＴ１Ｒ２、ｈＴ１Ｒ３）だけでなく、ラット、マウス、ブタ、イヌなど、他の動物種（哺乳類、魚類、爬虫類、両生類、鳥類など）の甘味受容体サブユニットも含まれる。
また、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３には、各サブユニットの全ての部分、すなわち、７つの膜貫通領域及び対応する細胞質及び細胞外のループからなる膜貫通ドメイン、ビーナス・フライ・トラップドメイン、高システインドメイン及びＣ末端ドメインの全ての領域が含まれる。
また、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３には、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３の点変異体、キメラも含む。

Ｇタンパク質αサブユニットは、ヒト、ラット、マウスなど、各種動物（哺乳類、魚類、爬虫類、両生類、鳥類など）のＧタンパク質αサブユニットを含み、具体的には、Ｇ１５、ｈＧ１６、あるいはそれらの配列の一部を改変した変異体（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４、ｈＧ１６ｇｕｓｔ２５、Ｇ１５Ｇｉ３）などが挙げられる。Ｇタンパク質αサブユニットは、選択された甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３の種類などに応じて適宜決定すればよいが、ヒト甘味受容体を発現させる場合には、細胞内のエフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）との間の情報伝達を効率的に担うことができる点から、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４が好ましい。なお、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４は、ｈＧα１６のＣ末端部分４４アミノ酸残基をＧｇｕｓｔに入れ替えたキメラＧタンパク質である。

Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各ｃＤＮＡは、いかなる方法で入手されるものでもよく、例えば、該タンパク質をコードするｍＲＮＡからｃＤＮＡをクローン化する方法、既知の塩基配列情報に基づく化学合成、ゲノムＤＮＡを単離してスプライシングする方法など、公知の方法で入手することができる。各種ＤＮＡの塩基配列情報は、ＮＣＢＩなどのデータベースを利用して取得できる。本発明で用いられる他の各種遺伝子も同様にして得られる。なお、ｃＤＮＡは、相補的ＤＮＡを意味し、ｍＲＮＡ転写産物の逆転写反応産物である。
ところで、本発明においては、特に断りがない限り、核酸の塩基配列には、本明細書に記載される特定の配列に加えて、適宜置換、欠失、挿入又は付加変異を導入したものも含み、例えば、縮重コドンを有する相同的配列なども含む。

上記のｃＤＮＡを挿入する同一のプラスミドとしては、特に制限されず、具体的には、ｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏ、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＳＨ１５、ｐＳＨ１９、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４などが例示される。ゲノムＤＮＡ中にＦＲＴ部位が１か所組み込まれた２９３細胞内で、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットを発現することができるプラスミドであれば、効率良く甘味受容体発現細胞を得ることができる点で好ましい。したがって、本発明では、上記の各ｃＤＮＡを挿入する同一のプラスミドとして、市販されているｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるのが好適である。
Ｆlｐ-Ｉｎシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、安定的にＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットを発現する培養細胞株を迅速かつ効果的に得ることができる。図１に、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の構造を示す。

本発明の甘味受容体発現コンストラクトの特徴は、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする全ての遺伝子を同一のプラスミドに挿入してなるという点にある。前述したように、従来の甘味受容体を発現させた細胞系は、いずれも所定のＧタンパク質を発現する細胞を事前に作製あるいは入手しておき、Ｔ１Ｒ２をコードする遺伝子を含むベクター、及びＴ１Ｒ３をコードする遺伝子を含むベクターをそれぞれ別個に上記細胞にトランスフェクションすることによって作製されていた。その結果、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３の発現量及び発現比率が細胞株間で大きく異なるなどの問題点があった。
それに対し、本発明の甘味受容体発現コンストラクトは、上記特徴を有することにより、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各遺伝子を迅速かつ同時に発現することができる。これら３つの遺伝子は、1つもしくは２つのｍＲＮＡに転写された後、３つのタンパク質、すなわち、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットに翻訳されて、各遺伝子を同時に発現させるため、上記のような問題点は生じない。

本発明の甘味受容体発現コンストラクトは、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットの発現効率を高めるため、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各遺伝子を転写方向が同じ向きになるように、同一のプラスミドに挿入してなるものが好ましい。

また、本発明の甘味受容体発現コンストラクトには、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットのすべて、あるいはそれらのうち２者をコードする各遺伝子を、ＩＲＥＳ配列を介して連結してなる遺伝子断片を含み、かつ、上記各遺伝子を転写方向が同じ向きになるように、同一のプラスミドに挿入してなるものが含まれる。

また、本発明の甘味受容体発現コンストラクトには、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２をコードする遺伝子の直後に、ＩＲＥＳ配列を介して、Ｇタンパク質αサブユニットをコードする遺伝子を連結し、さらに、その下流に存在する甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ３をコードする遺伝子の直後に、ＩＲＥＳ配列を介して、Ｇタンパク質αサブユニットをコードする遺伝子を連結してなるものが含まれる。上記各遺伝子は転写方向が同じ向きになるように配向させるのが好ましい。

また、本発明の甘味受容体発現コンストラクトには、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２をコードする遺伝子の下流に、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ３をコードする遺伝子を連結し、その直後にさらに、ＩＲＥＳ配列を介して、Ｇタンパク質αサブユニットをコードする遺伝子を連結してなるものが含まれる。上記各遺伝子は転写方向が同じ向きになるように配向させるのが好ましい。

また、本発明の甘味受容体発現コンストラクトには、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ３をコードする遺伝子の直後に、ＩＲＥＳ配列を介して、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２をコードする遺伝子を連結し、その直後にさらに、ＩＲＥＳ配列を介して、Ｇタンパク質αサブユニットをコードする遺伝子を連結してなるものが含まれる。上記各遺伝子は転写方向が同じ向きになるように配向させるのが好ましい。

本発明の甘味受容体発現コンストラクトにおいて、第一の好適な具体的態様としては、ＥＦ-１αプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有し、かつ、この配列の下流にあるＣＭＶプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有する発現コンストラクトを挙げることができる。上記各遺伝子は転写方向が同じ向きになるように配向させるのが好ましい。図２（Ａ）にその構造の一部を示す。

本発明の甘味受容体発現コンストラクトにおいて、第二の好適な具体的態様としては、ＥＦ-１αプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの配列を有し、かつ、この配列の下流にあるＣＭＶプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有する甘味受容体発現コンストラクトを挙げることができる。上記各遺伝子は転写方向が同じ向きになるように配向させるのが好ましい。図２（Ｂ）にその構造の一部を示す。

本発明の甘味受容体発現コンストラクトにおいて、第三の好適な具体的態様としては、ＣＭＶプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡとｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結してなり、かつ、該ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有する甘味受容体発現コンストラクトを挙げることができる。上記各遺伝子は転写方向が同じ向きになるように配向させるのが好ましい。図２（Ｃ）にその構造の一部を示す。

上述した第一の好適な具体的態様の甘味受容体発現コンストラクト（図２（Ａ）参照）は、例えば、以下の工程（ａ）〜（ｇ）に従って作製することができる。
（ａ）ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニングサイト（塩基番号８９５−１０１０）以外の場所に６塩基の置換を行い、制限酵素ＥｃｏＲＶの認識配列（５’-GATATC-３’）を新たに作製する（図３参照）。
この工程（ａ）の好適な態様の１つとして、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の制限酵素ＢｇｌＩＩの認識配列（塩基番号１２―１７）の直下（塩基番号１８―２３）にＥｃｏＲＶの認識配列を導入する態様が挙げられる。この態様は、例えば、以下のサブ工程（ａ１）〜（ａ５）に従うことにより、実施することができる。
（ａ１）５’末端にＢｇｌＩＩの認識配列（５’-AGATCT-３’）、その直下にＥｃｏＲＶの認識配列を持つセンスプライマーを設計、作製する。一方、ＢＧＨｐＡ配列中の配列を持つアンチセンスプライマーを設計、作製する。
（ａ２）（ａ１）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＶの各認識配列が連結した配列を含むＤＮＡ断片を増幅する。なお、ＰＣＲとは、センスプライマー及びアンチセンスプライマーの間のＤＮＡ配列を増幅する技術であり、増幅とは、遺伝子配列のコピー数を増加させることをいう。
ＰＣＲについては、適宜最適化された条件で行えばよいが、具体例として、９８℃で３０秒間×１サイクル、（９８℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で５５秒間）×３０サイクル、７２℃で１０分間×１サイクル、その後、４℃に冷却する条件が例示される。
（ａ３）（ａ２）で増幅したＤＮＡ断片を、ＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩで消化する。
（ａ４）ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩで消化する。
（ａ５）（ａ３）で得られたＤＮＡ断片と、（ａ４）で得られたｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを、ライゲーション反応によって結合させることにより、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢｇｌＩＩの認識配列の直下にＥｃｏＲＶの認識配列を持つベクターを作製する。
ライゲーション反応は、通常のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて行えばよいが、迅速かつ簡便に処理を行うために、１液タイプのＤＮＡライゲーション試薬であるＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いることが好ましい。

（ｂ）工程（ａ）で作製したベクターのマルチクローニングサイト（塩基番号８９５−１０１０）に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入する（図４参照）。
この工程（ｂ）は、例えば、以下のサブ工程（ｂ１）〜（ｂ８）に従うことにより、実施することができる。
（ｂ１）ｈＴ１Ｒ３のコード領域の直前及び直後に、それぞれＡｓｃＩの認識配列（５’-GGCGCGCC-３’）及びＮｏｔＩの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー、アンチセンスプライマーを設計、作製する。
（ｂ２）（ｂ１）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを増幅する。
（ｂ３）（ｂ２）で得られたｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ断片を、制限酵素ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩで消化する。
（ｂ４）ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、制限酵素ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩで消化する。
（ｂ５）（ｂ３）で得られたｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ断片と、（ｂ４）で得られたｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを、ＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入する。
（ｂ６）（ｂ５）で得られたｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、アガロース電気泳動により、ＤＮＡ断片を分離して、ｈＴ１Ｒ３のｃＤＮＡ断片を精製する。
（ｂ７）（ａ５）で作製したベクターを、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで消化する。
（ｂ８）（ｂ６）で得られたｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ断片と、（ｂ７）で得られたベクターとを、ＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させることにより、（ａ５）で作製したベクターのマルチクローニングサイトに、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入する。

（ｃ）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）に、ＩＲＥＳ配列と、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡとを挿入し、これらが連結された配列（ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列）を有するベクター（ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-））を作製する（図５参照）。ＩＲＥＳ配列とは、内部リボソーム侵入部位(ｉｎｔｅｒｎａｌｒｉｂｏｓｏｍｅｅｎｔｒｙｓｉｔｅ)をコードする配列を意味する。
この工程（ｃ）は、例えば、以下のサブ工程（ｃ１）〜（ｃ１１）に従うことにより、実施することができる。
（ｃ１）ＩＲＥＳ配列の直前にＥｃｏ５２Ｉの認識配列（５’-CGGCCG-３’）を持つようなセンスプライマーを設計、作製する。一方、ＩＲＥＳ配列の終了する部分に相当するアンチセンスプライマーを設計、作製する。
（ｃ２）（ｃ１）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｐＩＲＥＳ２-ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＩＲＥＳ配列を増幅する。なお、ＥＧＦＰは、ＥｎｈａｎｓｅｄＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰｒｏｔｅｉｎの略である。
（ｃ３）ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４のコード領域の直前及び直後に、ＮｏｔＩの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー、アンチセンスプライマーを設計、作製し、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを増幅する。増幅断片を、ＮｏｔＩで消化する。
（ｃ４）ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＮｏｔＩで消化する。
（ｃ５）（ｃ３）で得られたｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡ断片と、（ｃ４）で得られたｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを、ＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを挿入したベクター（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＥＡＫ１０）を作製する。
（ｃ６）ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４の開始コドンを含む１８塩基のセンスプライマーを設計、作製する。一方、ｈＧＨｐＡ配列中の配列を持つアンチセンスプライマーを設計、作製する。なお、ｐＡ配列（ポリアデニル化配列）は、組換え転写産物を安定化するために、ＲＮＡ転写産物の終結及びポリアデニル化を指示するＤＮＡ配列である。ｐＡ配列以外にも、種々の終結配列が公知であり、本発明の甘味受容体発現コンストラクトに使用しうる。ｐＡ配列は、プラスミドに存在する内在性のものでもよい。通常使用されるｐＡ配列は、ＳＶ４０のポリＡ配列であり、このポリＡ配列は２３７ｂｐの制限酵素ＢａｍＨＩ／ＢｃＩＩ断片に含まれる。また、通常使用されるｐＡ配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ：ＢｏｖｉｎｅＧｒｏｗｔｈＨｏｒｍｏｎｅ）遺伝子に由来する。
（ｃ７）（ｃ５）で得られたｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＥＡＫ１０をテンプレートとして、（ｃ６）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを増幅する。
（ｃ８）（ｃ２）で得られたＩＲＥＳ配列を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化する。
（ｃ９）（ｃ７）で得られたｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＮｏｔＩで消化する。
（ｃ１０）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）を、ＮｏｔＩで消化する。
（ｃ１１）（ｃ８）で得られたＩＲＥＳ配列と、（ｃ９）で得られたｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡ断片と、（ｃ１０）で得られたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）とを、ＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）を作製する。

（ｄ）工程（ｂ）で作製したベクターのｈＴ１Ｒ３をコードするＤＮＡ配列の直後に、ＩＲＥＳ配列とｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを連結した配列（ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列）を挿入する（図６参照）。
この工程（ｄ）は、例えば、以下のサブ工程（ｄ１）〜（ｄ３）に従うことにより、実施することができる。
（ｄ１）（ｃ１１）で作製したＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ｃＤＮＡ断片を分離して、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を精製する。
（ｄ２）（ｂ８）で作製したベクターのｈＴ１Ｒ３をコードするＤＮＡ配列の直後に存在する部位をＮｏｔＩで消化する。
（ｄ３）（ｄ１）で得られたＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列と、（ｄ２）で得られたベクターとを、ＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、（ｂ８）で作製したベクターのｈＴ１Ｒ３をコードするＤＮＡ配列の直後に、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入する。この結果、ｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴが得られる。

（ｅ）ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを挿入する（図７参照）。
この工程は、例えば、以下のサブ工程（ｅ１）〜（ｅ５）に従うことにより、実施することができる。
（ｅ１）ｈＴ１Ｒ２のコード領域の直前及び直後に、それぞれＡｓｃＩの認識配列（５’-GGCGCGCC-３’）及びＮｏｔＩの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー、アンチセンスプライマーを設計、作製する。
（ｅ２）（ｅ１）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＴ１Ｒ２をコードするＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを増幅する。
（ｅ３）（ｅ２）で得られたｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを、ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩで消化する。
（ｅ４）ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩで消化する。
（ｅ５）（ｅ３）で得られたｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡ断片と、（ｅ４）で得られたｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを、ＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを挿入する。

（ｆ）工程（ｅ）で作製したベクターのｈＴ１Ｒ２をコードするＤＮＡ配列の直後に、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入する（図８参照）。
この工程は、例えば、以下のサブ工程（ｆ１）〜（ｆ３）に従うことにより、実施することができる。
（ｆ１）（ｃ１１）で作製したＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ｃＤＮＡ断片を分離して、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を精製する。
（ｆ２）（ｅ５）で得られたベクターのｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの直後に存在する部位をＮｏｔＩで消化する。
（ｆ３）（ｆ１）で得られたＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列と、（ｆ２）で得られたベクターとを、ＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、（ｅ５）で得られたベクターのｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの直後に、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入する。この結果、ｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を含むｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が得られる。

（ｇ）工程（ｄ）で得られたベクターを、ＥｃｏＲＶで切断し、ｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列の上流に、工程（ｆ）で得られたｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入して、前述した第一の好適な具体的態様の発現コンストラクトを得る（図９参照）。
この工程（ｇ）は、例えば、以下のサブ工程（ｇ１）〜（ｇ３）に従うことにより、実施することができる。
（ｇ１）Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ反応を行うためのプライマーを設計、作製し、これを用いて、（ｆ３）で作製したベクターをテンプレートとして、ＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４-ｈＧＨｐＡの領域をＰＣＲによって増幅する。上記プライマーは、（ｄ３）で得られたベクターを制限酵素で線状化したものの末端と相同な約１５塩基を、上記領域のＤＮＡ断片に付加するようにして設計する。
（ｇ２）（ｄ３）で得られたベクターを、ＥｃｏＲＶで消化する。
（ｇ３）（ｇ１）で得られたＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４-ｈＧＨｐＡ配列断片と、（ｇ２）で得られたベクターとを、Ｉｎ-ＦｕｓｉｏｎＡｄｖａｎｔａｇｅＰＣＲＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて結合させて、（ｄ３）で得られたベクターのｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列の上流に、（ｆ３）で作製したベクターのｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入した第一の具体的な態様の甘味受容体発現コンストラクトを作製する。Ｉｎ-ＦｕｓｉｏｎＡｄｖａｎｔａｇｅＰＣＲＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）による結合は、（ｇ１）で得られたＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４-ｈＧＨｐＡ配列断片と、（ｇ２）で得られたベクターを混合し、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ酵素と所定のバッファーを加えて、通常、３７℃で１５分、次いで、５０℃で１５分反応を行う。Ｉｎ-ＦｕｓｉｏｎＡｄｖａｎｔａｇｅＰＣＲＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によれば、制限酵素サイトの制約を受けることなく、また、長鎖ＤＮＡ断片でも、目的ＤＮＡ断片のクローニングが可能である。

次に、上述した第二の好適な態様である甘味受容体発現コンストラクト（図２（Ｂ）参照）の作製について述べる。
まず、第一の好適な具体的態様の発現コンストラクトの作製で述べた工程（ａ）〜（ｅ）を同様にして行う。その後、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ反応を行うためのプライマーを設計、作製し、これを用いて、工程（ｅ）で作製したベクターをテンプレートとして、ＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ｈＧＨｐＡの領域をＰＣＲによって増幅する。そして、得られたＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ｈＧＨｐＡ配列断片と、ＥｃｏＲＶで消化した工程（ｄ）で得られたベクターとを、Ｉｎ-ＦｕｓｉｏｎＡｄｖａｎｔａｇｅＰＣＲＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて結合させることにより、工程（ｄ）で得られたベクターのｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列の上流に、上記ＰＣＲ産物であるＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ｈＧＨｐＡの配列を挿入して、上述した第二の好適な具体的態様の甘味受容体発現コンストラクトを作製する。

次に、上述した第三の好適な具体的態様である甘味受容体発現コンストラクト（図２（ｃ）参照）は、例えば、以下の工程（ａ’）〜（ｇ’）に従って作製することができる。
（ａ’）ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニングサイト（塩基番号８９５−１０１０）に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入する。
この工程（ａ’）は、例えば、以下のサブ工程（ａ’１）〜（ａ’８）に従うことにより、実施することができる。
（ａ’１）ｈＴ１Ｒ３のコード領域の直前及び直後に、それぞれＡｓｃＩの認識配列（５’-GGCGCGCC-３’）及びＮｏｔＩの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー、アンチセンスプライマーを設計、作製する。
（ａ’２）（ａ’１）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを増幅する。
（ａ’３）（ａ’２）で得られたｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ断片を、制限酵素ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩで消化する。
（ａ’４）ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、制限酵素ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩで消化する。
（ａ’５）（ａ’３）で得られたｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ断片と、（ａ’４）で得られたｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ
ｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入する。
（ａ’６）（ａ’５）で得られたｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、アガロース電気泳動により、ＤＮＡ断片を分離して、ｈＴ１Ｒ３のｃＤＮＡ断片を精製する。
（ａ’７）ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで消化する。
（ａ’８）（ａ’６）で得られたｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ断片と、（ａ’７）で得られたベクターとを、ＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させることにより、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニングサイトに、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入する。

（ｂ’）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）に、ＩＲＥＳ配列と、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡとを挿入し、これらが連結された配列（ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２配列）を有するベクター（ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-））を作製する。
この工程（ｂ’）は、例えば、以下のサブ工程（ｂ’１）〜（ｂ’１６）に従うことにより、実施することができる。
（ｂ’１）ＩＲＥＳ配列の直前にＥｃｏ５２Ｉの認識配列（５’-CGGCCG-３’）を持つようなセンスプライマーを設計、作製する。一方、ＩＲＥＳ配列の終了する部分に相当するアンチセンスプライマーを設計、作製する。
（ｂ’２）（ｂ’１）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｐＩＲＥＳ２-ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＩＲＥＳ配列を増幅する。
（ｂ’３）ｈＴ１Ｒ２のコード領域の直前及び直後に、それぞれＡｓｃＩの認識配列（５’-GGCGCGCC-３’）及びＮｏｔＩの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー、アンチセンスプライマーを設計、作製する。
（ｂ’４）これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＴ１Ｒ２をコードするＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを増幅する。
（ｂ’５）（ｂ’４）で得られたｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを、ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩで消化する。
（ｂ’６）ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩで消化する。
（ｂ’７）（ｂ’５）で得られたｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡ断片と、（ｂ’６）で得られたｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ
ｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを挿入する。
（ｂ’８）ｈＴ１Ｒ２の開始コドンを含む１８塩基のセンスプライマーを設計、作製する。一方、ｈＧＨｐＡ配列中の配列を持つアンチセンスプライマーを設計、作製する。（ｂ’９）（ｂ’７）で得られたｈＴ１Ｒ２／ｐＥＡＫ１０をテンプレートとして、（ｂ’８）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを増幅する。
（ｂ’１０）（ｂ’２）で得られたＩＲＥＳ配列を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化する。
（ｂ’１１）（ｂ’９）で得られたｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを、ＮｏｔＩで消化する。
（ｂ’１２）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）を、ＮｏｔＩで消化する。
（ｂ’１３）（ｂ’１０）で得られたＩＲＥＳ配列と、（ｂ’１１）で得られたｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡ断片と、（ｂ’１２）で得られたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）とを、ＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）を作製する。

（ｃ’）工程（ａ’）で作製したベクターのｈＴ１Ｒ３をコードするＤＮＡ配列の直後に、ＩＲＥＳ配列とｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを連結した配列（ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２配列）を挿入する。
この工程（ｃ’）は、例えば、以下のサブ工程（ｃ’１）〜（ｃ’３）に従うことにより、実施することができる。
（ｃ’１）（ｂ’１３）で作製したＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ｃＤＮＡ断片を分離して、ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２配列を精製する。
（ｃ’２）（ａ’８）で作製したベクターのｈＴ１Ｒ３をコードするＤＮＡ配列の直後に存在する部位をＮｏｔＩで消化する。
（ｃ’３）（ｃ’１）で得られたＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２配列と、（ｃ’２）で得られたベクターとを、ＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、（ａ’８）で作製したベクターのｈＴ１Ｒ３をコードするＤＮＡ配列の直後に、ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２配列を挿入する。この結果、ｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２配列を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴが得られる。

（ｄ’）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）に、ＩＲＥＳ配列と、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡとを挿入し、これらが連結された配列（ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列）を有するベクター（ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-））を作製する
この工程（ｄ’）は、例えば、以下のサブ工程（ｄ’１）〜（ｄ’１１）に従うことにより、実施することができる。
（ｄ’１）ＩＲＥＳ配列の直前にＥｃｏ５２Ｉの認識配列（５’-CGGCCG-３’）を持つようなセンスプライマーを設計、作製する。一方、ＩＲＥＳ配列の終了する部分に相当するアンチセンスプライマーを設計、作製する。
（ｄ’２）（ｄ’１）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｐＩＲＥＳ２-ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＩＲＥＳ配列を増幅する。
（ｄ’３）ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４のコード領域の直前及び直後に、ＮｏｔＩの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー、アンチセンスプライマーを設計、作製し、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを増幅する。増幅断片を、ＮｏｔＩで消化する。
（ｄ’４）ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＮｏｔＩで消化する。
（ｄ’５）（ｄ’３）で得られたｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡ断片と、（ｄ’４）で得られたｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを、ＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを挿入したベクター（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＥＡＫ１０）を作製する。
（ｄ’６）ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４の開始コドンを含む１８塩基のセンスプライマーを設計、作製する。一方、ｈＧＨｐＡ配列中の配列を持つアンチセンスプライマーを設計、作製する。
（ｄ’７）（ｄ’５）で得られたｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＥＡＫ１０をテンプレートとして、（ｄ’６）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを増幅する。
（ｄ’８）（ｄ’２）で得られたＩＲＥＳ配列を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化する。
（ｄ’９）（ｄ’７）で得られたｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＮｏｔＩで消化する。
（ｄ’１０）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）を、ＮｏｔＩで消化する。
（ｄ’１１）（ｄ’８）で得られたＩＲＥＳ配列と、（ｄ’９）で得られたｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡ断片と、（ｄ’１０）で得られたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）とを、ＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）を作製する。

（ｅ’）工程（ｃ’）で作製したベクターのｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２をコードするＤＮＡ配列の直後に、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入する。
この工程は、例えば、以下のサブ工程（ｅ’１）〜（ｅ’３）に従うことにより、実施することができる。
（ｅ’１）（ｄ’１１）で作製したＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ｃＤＮＡ断片を分離して、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を精製する。
（ｅ’２）（ｃ’３）で得られたベクターのｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの直後に存在する部位をＮｏｔＩで消化する。
（ｅ’３）（ｅ’１）で得られたＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列と、（ｅ’２）で得られたベクターとを、ＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、（ｃ’３）で得られたベクターのｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの直後に、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入する。これにより、上述した第三の好適な具体的態様の甘味受容体発現コンストラクトが得られる。

得られた本発明の甘味受容体発現コンストラクトは、宿主細胞にトランスフェクションするために使用されるが、その宿主細胞としては、２９３細胞、ＣＨＯ細胞、３２Ｄ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞などの真核細胞が挙げられる。本発明の細胞株を作製する場合、ゲノム中にＦＲＴ（ＦｌｉｐｐａｓｅＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎＴａｒｇｅｔ）配列を１か所組み込まれた２９３細胞が好適である。この細胞株の作製方法について説明する。
該培養細胞株の作製は、Ｆlｐ-Ｉｎシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ゲノムＤＮＡ中にＦＲＴ部位が１か所組み込まれた２９３細胞に、上記甘味受容体発現コンストラクトと、Ｆｌｐリコンビナーゼ発現ベクターであるｐＯＧ４４をコトランスフェクションすることによって行われる。Ｆlｐ-Ｉｎシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によれば、トランジエントに発現したＦｌｐリコンビナーゼにより、２９３細胞のゲノムＤＮＡ中に保持されたＦＲＴ部位が開裂して、その部分に外来遺伝子が導入され、該遺伝子が発現する。すなわち、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各遺伝子は、サッカロマイセス・セレビシエ(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)由来のＦｌｐリコンビナーゼと、Ｆｌｐリコンビナーゼの標的部位であるＦＲＴ部位を利用した部位特異的組換えにより、２９３細胞の染色体のＦＲＴ部位に挿入され、その結果、安定的にＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットを発現する培養細胞株が迅速かつ効果的に得られる。この培養細胞株は、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各遺伝子は、１つあるいは２つのｍＲＮＡに転写された後、３つのタンパク質、すなわち、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットに翻訳される。このように、本発明の甘味受容体発現コンストラクトを宿主細胞にトランスフェクションする場合、部位特異的にＤＮＡを切断かつ再結合する酵素を使用することが好ましく、Ｆｌｐリコンビナーゼのほか、λインテグラーゼ、Ｋｗリコンビナーゼなどが挙げられる。

ゲノムＤＮＡ中にＦＲＴ部位が１か所組み込まれた２９３細胞は、例えば、以下のようにして作製することができる。
まず、宿主細胞である２９３細胞に、ＦＲＴ部位を導入するためのベクターであるｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏを遺伝子導入し、導入された細胞をゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ、登録商標）で選択する。ｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏは、ｌａｃＺとゼオシン耐性遺伝子の融合遺伝子を持つため、ｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏがゲノムに導入された細胞は、β-ガラクトシダーゼを発現し、ゼオシン耐性となる。ゼオシン感受性の程度をβ-ガラクトシダーゼアッセイにより確認することができる。
次いで、ｌａｃＺ遺伝子に対してのサザンブロット法を行う。これにより、ゲノム中の転写されうる位置の１か所だけにＦＲＴ部位が組み込まれていることが確認される。ゲノムＤＮＡ中にＦＲＴ部位が１か所組み込まれた２９３細胞として、市販されているＦｌｐ-Ｉｎ-２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるのが簡便である。

本発明の培養細胞株の作製は、ＦＲＴ部位が１か所組み込まれた２９３細胞に、上記発現コンストラクト及びＦｌｐリコンビナーゼの発現ベクターであるｐＯＧ４４をコトランスフェクションし、ハイグロマイシンＢを含む選択培地にて、ハイグロマイシンＢ耐性の細胞株を選択することによって行うことができる。

Ｆｌｐリコンビナーゼ（Ｆｌｉｐｐａｓｅ）は、部位特異的な組換え反応を行う酵素の一種であり、該酵素の発現ベクターであるｐＯＧ４４が公知である。上記発現コンストラクト及びｐＯＧ４４をコトランスフェクションすると、発現したＦｌｐリコンビナーゼにより、上記発現コンストラクトは上記２９３細胞のＦＲＴ部位に挿入されて、２９３細胞はハイグロマイシンＢ耐性、ゼオシン感受性に変化するので、これらの薬剤耐性を指標とすることによって目的の遺伝子が挿入されたか否かを容易に判定することができる。

コトランスフェクションする方法としては、公知の方法、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム-ＤＮＡ沈殿法、塩化カルシウム法、塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥ-デキストラン法、マイクロインジェクション法など、適宜選択することができる。

こうして、ゲノム中の同じ位置に甘味受容体発現コンストラクトが入り、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットが同時に発現された培養細胞株を得ることができる。Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットの発現は、培養細胞株からタンパク質を抽出し、Ｔ１Ｒ２抗体、Ｔ１Ｒ３抗体、及びＧタンパク質αサブユニットを認識可能な抗体を用いたウェスタンブロット法により確認することができる。

上記安定発現細胞は、栄養培地で培養することにより、増殖及び／又は維持される。該安定発現細胞の増殖及び／又は維持の具体的方法に関しては適宜決定すればよいが、グルコースによる脱感作を最小限にするため、例えば、L-グルタミンを４ｍＭになるよう補足された低グルコース（１，０００ｍｇ／ｍｌ）ダルベッコ改変イーグル(ＤＭＥＭ)培地（Vｉｒｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．８、ｐ．３９６、１９５９）に、１０％ＨＩ-ＦＢＳ（ＨｅａｔＩｎａｃｔｉｖａｔｅｄＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ）及び１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を加えたものを用いて、３７℃で増殖及び／又は維持を行うことが好ましい。

本発明の培養細胞株は、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットが機能的に発現されているため、実際の甘味受容によって生じる甘味の知覚を、ｉｎｖｉｖｏで客観的に評価することができる最適なモデルとなり、甘味物質を選択する味覚センサーとして使用することができる。すなわち、本発明の培養細胞株を用いて、例えば、ある特定の甘味物質を該培養細胞株に接触させて、それによって発生した生理的応答を測定することにより、該甘味物質の甘味を評価することができる。

本発明の培養細胞株を用いて生理的応答を測定する対象となる甘味物質は、ヒトが感知できる甘味を呈することができる物質であれば特に限定されず、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラフィノース、キシロース、スクロース、マルトース、乳糖、水飴、異性化糖、イソマルトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、乳果オリゴ糖、大豆オリゴ糖、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、イソマルトール、還元水飴、還元パラチノース、和三盆、黒糖、三温糖、蜂蜜、糖蜜、甘草抽出物及びメープルシロップなどの糖質系甘味料、及び、アスパルテーム、サッカリン、ズルチン、ステビオシド、ステビア抽出物、グリチルリチン、アセスルファム−Ｋ、スクラロース（登録商標；三栄源エフ・エフ・アイ）、シクラメート、アリテーム、ネオテーム、ペリラルチン、モネリン、クルクリン（登録商標；ＡＤＥＫＡ）などの非糖質系甘味料が広く含まれる。

本発明の培養細胞株を用いてある特定の甘味物質の甘味を評価するには、例えば、以下のようにして行う。
まず、前述したように、上記甘味受容体発現コンストラクトを発現させた培養細胞株を取得し、次いで、該培養細胞の所定の数を多数のウェル（２４穴、４８穴、９６穴、３８４穴など）を有するマイクロプレートの各ウェルに撒き（例えば、１万〜５０万個／ウェル）、所定の培地（例えば、ＤＭＥＭ培地）中で培養する。
その後、特定の甘味物質を添加した場合において、上記安定培養細胞株に発生した生理的応答を測定し、その測定結果に基づいて甘味物質の甘味を評価する。

培養細胞株に発生した生理的応答を測定する場合、生理的応答としては、甘味受容体の活性化に伴って変化する事象が適宜選択される。甘味受容体が活性化されると、その後、細胞内で種々の現象が開始される。味物質が受容体に結合すると、細胞内のセカンドメッセンジャー（ＩＰ₃（イノシトール三リン酸）、ＤＡＧ）などを介する情報伝達過程を経て、細胞内のカルシウム濃度が上昇する。したがって、測定対象とする生理的応答としては、甘味受容体の活性化に伴って変化する細胞内のセカンドメッセンジャーの変化、細胞内のカルシウム濃度の変化などが挙げられる。

本発明においては、甘味物質に対する生理的応答の測定は、甘味刺激によって惹起される細胞内のカルシウム濃度の変化を、蛍光カルシウム指示薬を用いることにより細胞外から観察するカルシウムイメージング法で行うのが好適である。これにより、従来の官能評価とは異なり、受容体レベルでの甘味の客観的な評価が可能となる。また、甘味の程度を数値化することにより、各種物質の甘味の強度を相互に比較することができる。

蛍光カルシウム指示薬には、生理的に変化し得るカルシウム濃度において蛍光特性が変化すること、及びそのときの変化がカルシウム特異的に誘導されること、が要求されるため、現在、錯形成部位と蛍光発色団が結合した構造を有する化合物が蛍光指示薬として汎用されている。本発明では、そのような蛍光カルシウム指示薬であるＦｌｕｏ-４ＡＭ、Ｆｕｒａ-２ＡＭを使用することが好適である。

甘味物質に対する生理的応答を測定する場合、カルシウムイメージング法を用いて、甘味物質に対する生理的応答を数値化及び可視化することが好ましい。例えば、マルチプレートリーダーによる同時アッセイにより、細胞応答の数値化を行い、さらに、顕微鏡を用いたイメージングにより、細胞内のカルシウム濃度の変化を画像化して、各細胞が応答しているかを観察する。マルチプレートリーダーによる同時アッセイに使用した蛍光指示薬とは異なる蛍光指示薬を使用した顕微鏡観察を行うことにより、細胞応答がアーティファクトによるものでないことを確認できる。

マルチプレートリーダーによる同時アッセイは、公知の方法に従って適宜行えばよいが、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて、自動化蛍光カルシウムイメージングを行うのが簡便かつ迅速であり、ハイスループットアッセイが可能となる。ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５ｅ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）の性能と、８チャンネルピペッターを融合させたマルチプレートリーダーである。

ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いた自動化蛍光イメージングは、例えば、以下の手順に従って行うことができる。
まず、ハイグロマイシンＢを除いた低グルコース（１，０００ｍｇ／ｍｌ）ＤＭＥＭ培地で細胞を懸濁し、９６ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣｅｌｌＢＩＮＤＳｕｒｆａｃｅ)の各ウェル上に、７〜８万個ずつ撒く。

次いで、３７℃で２４時間培養した後、培地を除去し、適当量のＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸）バッファーで置換し、蛍光カルシウム指示薬(ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、ＦＬＩＰＲＣａ４ＡｓｓａｙＫｉｔに付属のＦｌｕｏ-４ＡＭ)を含むＨＥＰＥＳバッファーをさらに添加する。蛍光指示薬Ｆｌｕｏ-４（励起波長：４９５ｎｍ、蛍光波長：５１８ｎｍ）は、細胞内への移行を容易にするため、脂溶性のアセトキシメチル基が導入されており、培地中に添加されると容易に細胞内に取り込まれ、細胞内のエステラーゼにより加水分解される。加水分解されたＦｌｕｏ-４は、細胞膜を透過しにくくなり、細胞内に拡散してカルシウムと錯形成し、強い蛍光を発する。蛍光観察用の９６ウェルプレートには、プラスチック底とフィルム底があり、プラスチック底のプレートは細胞の接着性及び成長が良いので、ウェル全体を観察するマルチプレートリーダーを用いた同時アッセイ時に使用されるが、このプラスチック底のプレートは、ＵＶ波長の透過性が悪く、Ｆｕｒａ-２の励起光の透過を阻害するため、Ｆｌｕｏ-４を用いる。

次いで、２７〜３７℃で３０〜６０分間インキュベートした後、これに特定濃度の甘味物質又は甘味物質と試験する物質の溶液を添加することにより、２７〜３７℃で味刺激を行う。
甘味物質又は甘味物質と試験する物質の添加直後から６０〜１２０秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を測定することにより、甘味刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を定量することができる。

蛍光顕微鏡を用いた蛍光カルシウムイメージングは、以下の手順に従って行うことができる。
まず、ハイグロマイシンＢを除いた低グルコース（１，０００ｍｇ／ｍｌ）ＤＭＥＭ培地で細胞を懸濁し、９６ウェルプレート(Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｌｕｍｏｘ)の各ウェル上に４〜８万個ずつ撒く。

次いで、３７℃で２４〜４８時間培養した後、培地を除去し、適当量のＨＥＰＥＳバッファーで置換し、蛍光カルシウム指示薬(Ｆｕｒａ-２ＡＭ)を含むＨＥＰＥＳバッファーをさらに添加する。

次いで、２７〜３７℃で３０〜６０分間インキュベートした後、細胞外の蛍光指示薬を除去し、最終的に適当量のＨＥＰＥＳバッファーで置換し、１０〜２０分間室温にて静置する。これに特定濃度の甘味物質又は甘味物質と試験する物質の溶液を適当量添加することにより室温で味刺激を行う。蛍光指示薬Ｆｕｒａ-２（励起波長：３４０ｎｍ／３８０ｎｍ、蛍光波長：５１０ｎｍ）は、カルシウムイオン濃度が高くなると３４０ｎｍ励起の蛍光強度が上昇し、３８０ｎｍ励起の蛍光強度が低下する。

次いで、甘味物質又は甘味物質と試験する物質の溶液の添加直後から６０〜３００秒後にかけて、顕微鏡視野中の蛍光像（３４０ｎｍ，３８０ｎｍ励起で５１０ｎｍ蛍光）を取り込み、２波長励起蛍光の比率を擬似カラーで表示することにより、甘味刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を観察することができる。
以上のようにして、本発明では、生理的応答を測定する際に、カルシウムイメージング法において、蛍光特性の異なる２種類の上記蛍光指示薬を併用することにより、観察系によらない普遍的な現象を観察することができる。

以上のように、本発明の細胞株を使用して、甘味物質に対する生理的応答を測定することができる。また、本発明の細胞株を使用した、甘味物質に対する生理的応答の測定を用いて同定された、特定の甘味物質に対する甘味増強物質を、該甘味物質の生理的応答を測定する際に添加することにより、該甘味物質の甘味の閾値以下の濃度で生理的応答を測定することもできる。

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。

（実施例１）
甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）の作製
ＥＦ-１αプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有し、かつ、この配列の下流にあるＣＭＶプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有する甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）（図２（Ａ）参照）を、以下の手順に従って作製した。

５’末端にＢｇｌＩＩの認識配列（５’-AGATCT-３’）、その直下にＥｃｏＲＶの認識配列を持つセンスプライマー（配列番号１：TATAGATCTGATATCCCCCTATGGTGCACTCTC）及びＢＧＨｐＡ配列中の配列を持つアンチセンスプライマー（配列番号２：TAGAAGGCACAG
TCGAGG）を設計、作製した。
そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＶの各認識配列が連結した配列を含むＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは、後述する実施例も含め、全て、９８℃で３０秒間×１サイクル、（９８℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で５５秒間）×３０サイクル、７２℃で１０分間×１サイクル、その後、４℃に冷却する条件で行った。
次いで、この増幅したＤＮＡ断片を、ＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、また、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩで消化した。これらの制限酵素消化産物をＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させることにより、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢｇｌＩＩの認識配列の直下にＥｃｏＲＶの認識配列を持つベクターを作製した。

次いで、ｈＴ１Ｒ３のコード領域の直前及び直後に、それぞれＡｓｃＩの認識配列（５’-GGCGCGCC-３’）及びＮｏｔＩの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー（配列番号３：GATCGGCGCGCCGCCATGCTGGGCCCTGCTGTC）及びアンチセンスプライマー（配列番号４：TAGAAGGCACAGTCGAGG）を設計、作製した。
そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを増幅した。
増幅したＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ断片を、ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩで消化し、また、ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩで消化した。そして、これらの制限酵素消化産物をＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入した。次いで、これをＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、アガロース電気泳動により、ＤＮＡ断片を分離して、ｈＴ１Ｒ３のｃＤＮＡ断片を精製した。
このｈＴ１Ｒ３のｃＤＮＡ断片と、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで消化した、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢｇｌＩＩの認識配列の直下にＥｃｏＲＶの認識配列を持つベクターとを、ＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させることにより、該ベクターのマルチクローニングサイトに、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入した。

次いで、ＩＲＥＳ配列の直前にＥｃｏ５２Ｉの認識配列（５’-CGGCCG-３’）を持つようなセンスプライマー（配列番号５：GATCCGGCCGGCCCCTCTCCCTCCCCCC）及びＩＲＥＳ配列の終了する部分に相当するアンチセンスプライマー（配列番号６：GGTTGTGGCCATATTATC）を設計、作製した。
そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｐＩＲＥＳ２-ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＩＲＥＳ配列を増幅した。
ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４のコード領域の直前及び直後に、ＮｏｔＩの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー（配列番号７：GATCGCGGCCGCATGGCCCGCTCGCTGACC）、アンチセンスプライマー（配列番号８：GATCGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTTA）を設計、作製した。ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを増幅した。増幅断片をＮｏｔＩで消化し、ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＮｏｔＩで消化して、これらをＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを挿入したベクター（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＥＡＫ１０）を作製した。
次いで、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４の開始コドンを含む１８塩基のセンスプライマー（配列番号９：ATGGCCCGCTCGCTGACC）及びｈＧＨｐＡ配列中の配列を持つアンチセンスプライマー（配列番号１０：CTGGATGCAGGCTACTCTA）を設計、作製した。
そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＥＡＫ１０をテンプレートとして、ＰＣＲを行い、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを増幅した。
次いで、Ｅｃｏ５２Ｉで消化した上記ＩＲＥＳ配列と、ＮｏｔＩで消化した上記ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡと、ＮｏｔＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）とを、ＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）を作製した。

次いで、前述したＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ＤＮＡ断片を分離して、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を精製した。
そして、マルチクローニングサイトにｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入した上記ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＮｏｔＩで消化し、該ベクター中のｈＴ１Ｒ３をコードするＤＮＡ配列の直後に存在する部分を切断した。このベクターと上記のＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列とを、ＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｈＴ１Ｒ３をコードするＤＮＡ配列の直後に、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入してなる、ｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴを得た。

次いで、ｈＴ１Ｒ２のコード領域の直前及び直後に、それぞれＡｓｃＩの認識配列（５’-GGCGCGCC-３’）及びＮｏｔＩの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー（配列番号１１：GATCGGCGCGCCGCCATGGGGCCCAGGGCAAAG）及びアンチセンスプライマー（配列番号１２：GATCGCGGCCGCCTAGTCCCTCCTCATGGT）を設計、作製した。
そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＴ１Ｒ２をコードするＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを増幅した。得られたｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを、ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩで消化し、ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩで消化して、これらをＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを挿入した。

次いで、前述したＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ｃＤＮＡ断片を分離して、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を精製した。
そして、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを挿入したｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＮｏｔＩで消化し、該ベクター中のｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの直後に存在する部分を切断した。このベクターと上記ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列とを、ＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの直後に、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入し、ｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を含むｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を得た。

次いで、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ反応を行うためのプライマー（配列番号１３：ATCGGGAGATCTGATGCATAACTAGTGAGGCTC及び配列番号１４：GCACCATAGGGGGATAGCGGATCCAGACATGAT）を設計、作製し、これを用いて、上記のｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を含むｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をテンプレートとして、ＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４-ｈＧＨｐＡの領域をＰＣＲによって増幅した。
そして、このＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４-ｈＧＨｐＡ配列断片と、ＥｃｏＲＶで消化したｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴとを、Ｉｎ-ＦｕｓｉｏｎＡｄｖａｎｔａｇｅＰＣＲＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて結合させて、甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）を作製した。得られた甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）は、ＤＮＡシーケンシングにより、塩基配列に誤りがないことを確認した。

（実施例２）
甘味受容体発現コンストラクト（Ｂ）の作製
ＥＦ-１αプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの配列を有し、かつ、この配列の下流にあるＣＭＶプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有する甘味受容体発現コンストラクト（Ｂ）（図２（Ｂ）参照）を、以下の手順に従って作製した。
まず、実施例１の甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）の作製で述べた工程に従って、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢｇｌＩＩの認識配列の直下にＥｃｏＲＶの認識配列を持つベクターの作製から、ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを挿入するまでの工程を実施した。
その後、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ反応を行うためのプライマー（配列番号１５：ATCGGGAGATCTGATGCATAACTAGTGAGGCTC及び配列番号１６：GCACCATAGGGGGATAGCGGATCCAGACATGAT）を設計、作製し、これを用いて、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを挿入したｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をテンプレートとして、ＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ｈＧＨｐＡの領域をＰＣＲによって増幅した。そして、得られたＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ｈＧＨｐＡ配列断片と、ＥｃｏＲＶで消化したｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを、Ｉｎ-ＦｕｓｉｏｎＡｄｖａｎｔａｇｅＰＣＲＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて結合させて、甘味受容体発現コンストラクト（Ｂ）を作製した。得られた甘味受容体発現コンストラクト（Ｂ）は、ＤＮＡシーケンシングにより、塩基配列に誤りがないことを確認した。

（実施例３）
甘味受容体発現コンストラクト（Ｃ）の作製
ＣＭＶプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡとｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結してなり、かつ、該ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有する甘味受容体発現コンストラクト（Ｃ）（図２（Ｃ）参照）を、以下の手順に従って作製した。

ｈＴ１Ｒ３のコード領域の直前及び直後に、それぞれＡｓｃＩの認識配列（５’-GGCGCGCC-３’）及びＮｏｔＩの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー（配列番号１７：GATCGGCGCGCCGCCATGCTGGGCCCTGCTGTC）及びアンチセンスプライマー（配列番号１８：GATCGCGGCCGCTCACTCATGTTTCCCCTG）を設計、作製した。
そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを増幅した。
次いで、得られたｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ断片を、制限酵素ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩで消化し、また、ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、制限酵素ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩで消化した。これらの制限酵素消化産物を、ＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを持つｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を得た。
そして、このｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、アガロース電気泳動により、ＤＮＡ断片を分離して、ｈＴ１Ｒ３のｃＤＮＡ断片を精製した。
次いで、このｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ断片と、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで消化したｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを、ＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させることにより、マルチクローニングサイトに、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを持つｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を作製した。

次いで、ＩＲＥＳ配列の直前にＥｃｏ５２Ｉの認識配列（５’-CGGCCG-３’）を持つようなセンスプライマー（配列番号１９：GATCCGGCCGGCCCCTCTCCCTCCCCCC）及びＩＲＥＳ配列の終了する部分に相当するアンチセンスプライマー（配列番号２０：GGTTGTGGCCATATTA
TC）を設計、作製した。
そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｐＩＲＥＳ２-ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＩＲＥＳ配列を増幅した。
次いで、ｈＴ１Ｒ２のコード領域の直前及び直後に、それぞれＡｓｃＩの認識配列（５’-GGCGCGCC-３’）及びＮｏｔＩの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー（配列番号２１：GATCGGCGCGCCGCCATGGGGCCCAGGGCAAAG）及びアンチセンスプライマー（配列番号２２：GATCGCGGCCGCCTAGTCCCTCCTCATGGT）を設計、作製した。
そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＴ１Ｒ２をコードするＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを増幅した。得られたｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを、ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩで消化し、ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩで消化して、これらをＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを挿入した。
次いで、ｈＴ１Ｒ２の開始コドンを含む１８塩基のセンスプライマー（配列番号２３： ATGGGGCCCAGGGCAAAG）及びｈＧＨｐＡ配列中の配列を持つアンチセンスプライマー（配列番号２４：CTGGATGCAGGCTACTCTA）を設計、作製した。
そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＴ１Ｒ２／ｐＥＡＫ１０をテンプレートとして、ＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを増幅した。
次いで、前述したＩＲＥＳ配列を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、また、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを、ＮｏｔＩで消化し、また、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）を、ＮｏｔＩで消化して、これらの制限酵素消化産物をＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）を作製した。

次いで、ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ｃＤＮＡ断片を分離して、ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２配列を精製した。
そして、ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２配列と、ＮｏｔＩで消化したｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを持つｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ
ｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２配列を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴを得た。

次いで、ＩＲＥＳ配列の直前にＥｃｏ５２Ｉの認識配列（５’-CGGCCG-３’）を持つようなセンスプライマー（配列番号２５：GATCCGGCCGGCCCCTCTCCCTCCCCCC）及びＩＲＥＳ配列の終了する部分に相当するアンチセンスプライマー（配列番号２６：GGTTGTGGCCATATTA
TC）を設計、作製した。そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｐＩＲＥＳ２-ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＩＲＥＳ配列を増幅した。
次いで、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４のコード領域の直前及び直後に、ＮｏｔＩの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー（配列番号２７：GATCGCGGCCGCATGGCCCGCTCGCTGACC）、アンチセンスプライマー（配列番号２８：GATCGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTTA）を設計、作製した。ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを増幅した。増幅断片をＮｏｔＩで消化し、ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＮｏｔＩで消化して、これらをＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを挿入したベクター（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＥＡＫ１０）を作製した。
次いで、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４の開始コドンを含む１８塩基のセンスプライマー（配列番号２９：ATGGCCCGCTCGCTGACC）及びｈＧＨｐＡ配列中の配列を持つアンチセンスプライマー（配列番号３０：CTGGATGCAGGCTACTCTA）を設計、作製した。そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、上記ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＥＡＫ１０をテンプレートとして、ＰＣＲを行い、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを増幅した。
次いで、作製したＩＲＥＳ配列を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、また、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＮｏｔＩで消化し、また、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）を、ＮｏｔＩで消化し、これらの制限酵素消化産物を、ＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を有するベクター（ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-））を作製した。

次いで、このＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（-）を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ｃＤＮＡ断片を分離して、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を精製した。
そして、ｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２配列を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴのｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの直後に存在する部位をＮｏｔＩで消化した。この制限酵素消化産物とＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列とを、ＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２配列を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴのｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの直後に、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入することにより、甘味受容体発現コンストラクト（Ｃ）を作製した。得られた甘味受容体発現コンストラクト（Ｃ）は、ＤＮＡシーケンシングにより、塩基配列に誤りがないことを確認した。

（実施例４）
ヒト甘味受容体（ｈＴ１Ｒ２＋ｈＴ１Ｒ３）とｈＧ１６ｇｕｓｔ４４を発現させた培養細胞株（Ａ）〜（Ｃ）の作製
実施例１で作製した甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）０．８μｇと、ｐＯＧ４４７．２μｇとをリポフェクション法で、２００万個のＦｌｐ-Ｉｎ-２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションして４８時間経過後、ハイグロマイシンＢ添加（１００μｇ／ｍｌ）培地でスクリーニングを行い、安定発現株である培養細胞株（Ａ）を取得した。
次いで、ハイグロマイシンＢに対して生存した細胞を増殖させ、その一部をゼオシン添加（１００μｇ／ｍｌ）培地で培養して、ゼオシン（１００μｇ／ｍｌ）によって細胞が死滅していたことから、培養細胞株（Ａ）には、ヒト甘味受容体（ｈＴ１Ｒ２＋ｈＴ１Ｒ３）及びｈＧ１６ｇｕｓｔ４４の遺伝子がＦＲＴ部位に導入されていることを確認した。

また、培養細胞株（Ａ）〜（Ｃ）について、ＲＴ-ＰＣＲを行い、アガロース電気泳動により、ｈＴ１Ｒ２断片、ｈＴ１Ｒ３断片及びｈＧ１６ｇｕｓｔ４４断片のバンドが認められ、ヒト甘味受容体（ｈＴ１Ｒ２＋ｈＴ１Ｒ３）及びｈＧ１６ｇｕｓｔ４４が発現していることを確認した。

同様に、甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）の代わりに、実施例２で作製した甘味受容体発現コンストラクト（Ｂ）、（Ｃ）をそれぞれ用いて、培養細胞株（Ｂ）及び培養細胞株（Ｃ）を作製した。
その後、これらの培養細胞株（Ａ）〜（Ｃ）を１０％ＨＩ-ＦＢＳ（ＨｅａｔＩｎａｃｔｉｖａｔｅｄＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ）、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)、L-グルタミン４ｍＭを含む低グルコース（１，０００ｍｇ／ｍｌ）ダルベッコ改変イーグル(ＤＭＥＭ)培地で、３７℃で増殖、維持した。

（実施例５）
アスパルテーム刺激に対する、実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）〜（Ｃ）の生理的応答の比較
実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）〜（Ｃ）のそれぞれに、蛍光カルシウム指示薬Ｆｕｒａ-２ＡＭを負荷して、細胞に取り込ませた。そして、Ｆｕｒａ-２ＡＭを負荷した細胞を３４０ｎｍと３８０ｎｍで励起し、５１０ｎｍにおいて観察される蛍光画像を蛍光顕微鏡ならびにＣＣＤカメラを用いて取得した。画像取得中に細胞に終濃度１０ｍＭのアスパルテームを投与し、その後、継続して画像の取得を行った。取得した画像の視野中から細胞１００個をランダムに選択し、応答細胞数を計測した。
また、比較として、ＣＭＶプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結してなる配列を有するｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴからなる発現コンストラクト（図１０）を用いて、実施例４と同様に培養細胞株（Ｄ）を作製し、上記と同様に応答細胞数を計測に供した。
上記計測の結果を図１１に示す。この結果からわかるように、培養細胞株（Ａ）については、アスパルテーム投与により、非常に強い細胞応答が観察され、また、培養細胞株（Ｂ）、（Ｃ）については、培養細胞株（Ａ）に比べて、弱い細胞応答が観察されたのに対し、培養細胞株（Ｄ）では、細胞応答が観察されなかった。したがって、培養細胞株（Ａ）〜（Ｃ）は、ヒト甘味受容体が機能的に発現していることが確認された。

（実施例６）
アスパルテーム刺激に対する、培養細胞株（Ａ）の生理的応答
実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）に、蛍光カルシウム指示薬Ｆｕｒａ-２ＡＭを負荷して、細胞に取り込ませた。そして、Ｆｕｒａ-２ＡＭを負荷した細胞を３４０ｎｍと３８０ｎｍで励起し、５１０ｎｍにおいて観察される蛍光画像を蛍光顕微鏡ならびにＣＣＤカメラを用いて取得した。画像取得中に細胞に終濃度０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭの各濃度のアスパルテームを投与し、その後、継続して画像の取得を行った。各濃度において最も強い応答が観察された時点の画像を図１２に示した。結果からわかるように、投与する甘味料としてアスパルテームを用いた場合、０．１ｍＭから５ｍＭの範囲において濃度依存的な甘味応答が観察された。

（実施例７）
スクロース刺激に対する、培養細胞株（Ａ）の生理的応答
実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）に、蛍光カルシウム指示薬Ｆｕｒａ-２ＡＭを負荷して、細胞に取り込ませた。そして、Ｆｕｒａ-２ＡＭを負荷した細胞を３４０ｎｍと３８０ｎｍで励起し、５１０ｎｍにおいて観察される蛍光画像を蛍光顕微鏡ならびにＣＣＤカメラを用いて取得した。画像取得中に細胞に終濃度２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、５００ｍＭ、１Ｍの各濃度のスクロースを投与し、その後、継続して画像の取得を行った。各濃度において最も強い応答が観察された時点の画像を図１３に示した。
結果からわかるように、投与する甘味料としてスクロースを用いた場合、２０ｍＭから１Ｍの範囲において濃度依存的な甘味応答が観察された。

（実施例８）
スクロース刺激に対する、培養細胞株（Ａ）の生理的応答
実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）に、蛍光カルシウム指示薬Ｆｕｒａ-２ＡＭを負荷して、細胞に取り込ませた。そして、Ｆｕｒａ-２ＡＭを負荷した細胞を３４０ｎｍと３８０ｎｍで励起し、５１０ｎｍにおいて観察される蛍光画像を蛍光顕微鏡ならびにＣＣＤカメラを用いて取得した。画像取得中に細胞に終濃度５００ｍＭのスクロースを投与し、その後、継続して画像の取得を行った。最も強い応答が観察された時点の画像を図１４に示した。
また、終濃度が５００ｍＭのスクロースと１．２５ｍＭのラクチゾールを同時に細胞に投与し、上記と同様にして蛍光画像を取得し、最も強い応答が観察された時点の画像を図１４に示した。
結果からわかるように、Ｔ１Ｒ３インヒビターとして知られるラクチゾールの添加により、細胞の応答が抑制されたことが確認できた。この結果より、スクロースに対する細胞応答は、Ｔ１Ｒ３サブユニットを介した応答であると推測された。

（実施例９）
スクロース刺激に対する、培養細胞株（Ａ）の生理的応答
スクロース刺激に対して、培養細胞株（Ａ）の生理的応答を、自動化蛍光イメージングにより解析した。
実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）をトリプシナイズし、該ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞密度を計測し、９６ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣｅｌｌＢＩＮＤＳｕｒｆａｃｅ)の各ウェル上に、約８万個ずつ撒いた。
そして、３７℃で２４時間培養した後、培地を除去し、５０μｌのＨＥＰＥＳバッファーで置換し、蛍光カルシウム指示薬(ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、ＦＬＩＰＲＣａ４ＡｓｓａｙＫｉｔに付属のＦｌｕｏ-４ＡＭ)を含むＨＥＰＥＳバッファーをさらに５０μｌ添加した。次いで、２７℃で４５分間インキュベートして、自動化蛍光イメージングに供する細胞を調製した。
次いで、この細胞に、スクロースの終濃度が表１に記載された濃度となるように、スクロースを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して、２７℃でスクロース刺激を行った。
そして、スクロースを含むＨＥＰＥＳバッファーの添加直後から１００秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、スクロース刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を自動化蛍光イメージングにより定量した。結果を表１及び図１５に示す。図１５の縦軸は、刺激直後と刺激後１００秒後の間における蛍光強度の変化量の最大値（ΔＦ）、すなわち、細胞の応答強度であり、横軸は、対数表示のスクロース濃度（ｍＭ）を示す。
得られた結果から、本発明の培養細胞株（Ａ）を用いて、スクロースの甘味を評価できることが確認できた。スクロースは甘味の程度が弱いため、５０ｍＭ程度の濃度で添加しないと甘味受容体細胞の応答は観察されない。しかし、逆に２００ｍＭを超える濃度のスクロース溶液を添加すると、細胞が浸透圧の影響を受けるため、正常な細胞応答を測定することができなくなる。したがって、通常、細胞を用いた甘味アッセイ系でスクロースの甘味度を数値化できるのは約５０から２００ｍＭという狭い範囲に限定されるが、上記細胞系を利用すれば、この限界値の下限を更に低くすることが可能になる。

（実施例１０）
Ｄ-フェニルアラニン刺激に対する、培養細胞株（Ａ）の生理的応答
Ｄ-フェニルアラニン刺激に対して、培養細胞株（Ａ）の生理的応答を、自動化蛍光イメージングにより解析した。
実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）をトリプシナイズし、該ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞密度を計測し、９６ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣｅｌｌＢＩＮＤＳｕｒｆａｃｅ)の各ウェル上に、約８万個ずつ撒いた。
そして、３７℃で２４時間培養した後、培地を除去し、５０μｌのＨＥＰＥＳバッファーで置換し、蛍光カルシウム指示薬(ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、ＦＬＩＰＲＣａ４ＡｓｓａｙＫｉｔに付属のＦｌｕｏ-４ＡＭ)を含むＨＥＰＥＳバッファーをさらに５０μｌ添加した。次いで、２７℃で４５分間インキュベートして、自動化蛍光イメージングに供する細胞を調製した。
次いで、この細胞に、D-フェニルアラニンの終濃度が表２に記載された濃度となるように、D-フェニルアラニンを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して、２７℃でD-フェニルアラニン刺激を行った。
そして、Ｄ-フェニルアラニンを含むＨＥＰＥＳバッファーの添加直後から１００秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、Ｄ-フェニルアラニン刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を自動化蛍光イメージングにより定量した。結果を表２及び図１６に示す。図１６の縦軸は、刺激直後と刺激後１００秒後の間における蛍光強度の変化量の最大値（ΔＦ）、すなわち、細胞の応答強度であり、横軸は、対数表示のＤ-フェニルアラニン濃度（ｍＭ）を示す。
得られた結果から、本発明の培養細胞株（Ａ）を用いて、Ｄ-フェニルアラニンの甘味を評価できることが確認できた。

（実施例１１）
アスパルテーム刺激に対する、培養細胞株（Ａ）の生理的応答
アスパルテーム刺激に対して、培養細胞株（Ａ）の生理的応答を、自動化蛍光イメージングにより解析した。
実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）をトリプシナイズし、該ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞密度を計測し、９６ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣｅｌｌＢＩＮＤＳｕｒｆａｃｅ)の各ウェル上に、約８万個ずつ撒いた。
そして、３７℃で２４時間培養した後、培地を除去し、５０μｌのＨＥＰＥＳバッファーで置換し、蛍光カルシウム指示薬(ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、ＦＬＩＰＲＣａ４ＡｓｓａｙＫｉｔに付属のＦｌｕｏ-４ＡＭ)を含むＨＥＰＥＳバッファーをさらに５０μｌ添加した。次いで、２７℃で４５分間インキュベートして、自動化蛍光イメージングに供する細胞を調製した。
次いで、この細胞に、アスパルテームの終濃度が表３に記載された濃度となるように、アスパルテームを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して、２７℃でアスパルテーム刺激を行った。
そして、アスパルテームを含むＨＥＰＥＳバッファーの添加直後から１００秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、アスパルテーム刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を自動化蛍光イメージングにより定量した。結果を表３及び図１７に示す。図１７の縦軸は、刺激直後と刺激後１００秒後の間における蛍光強度の変化量の最大値（ΔＦ）、すなわち、細胞の応答強度であり、横軸は、対数表示のアスパルテーム濃度（ｍＭ）を示す。
得られた結果から、本発明の培養細胞株（Ａ）を用いて、アスパルテームの甘味を評価できることが確認できた。

（実施例１２）
サッカリン刺激に対する、培養細胞株（Ａ）の生理的応答
サッカリン刺激に対して、培養細胞株（Ａ）の生理的応答を、自動化蛍光イメージングにより解析した。
実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）をトリプシナイズし、該ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞密度を計測し、９６ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣｅｌｌＢＩＮＤＳｕｒｆａｃｅ)の各ウェル上に、約８万個ずつ撒いた。
そして、３７℃で２４時間培養した後、培地を除去し、５０μｌのＨＥＰＥＳバッファーで置換し、蛍光カルシウム指示薬(ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、ＦＬＩＰＲＣａ４ＡｓｓａｙＫｉｔに付属のＦｌｕｏ-４ＡＭ)を含むＨＥＰＥＳバッファーをさらに５０μｌ添加した。次いで、２７℃で４５分間インキュベートして、自動化蛍光イメージングに供する細胞を調製した。
次いで、この細胞に、サッカリンの終濃度が表４に記載された濃度となるように、サッカリンを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して、２７℃でサッカリン刺激を行った。
そして、サッカリンを含むＨＥＰＥＳバッファーの添加直後から１００秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、サッカリン刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を自動化蛍光イメージングにより定量した。結果を表４及び図１８に示す。図１８の縦軸は、刺激直後と刺激後１００秒後の間における蛍光強度の変化量の最大値（ΔＦ）、すなわち、細胞の応答強度であり、横軸は、対数表示のサッカリン濃度（ｍＭ）を示す。
得られた結果から、本発明の培養細胞株（Ａ）を用いて、サッカリンの甘味を評価できることが確認できた。

（実施例１３）
ステビア刺激に対する、培養細胞株（Ａ）の生理的応答
ステビア刺激に対して、培養細胞株（Ａ）の生理的応答を、自動化蛍光イメージングにより解析した。
実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）をトリプシナイズし、該ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞密度を計測し、９６ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣｅｌｌＢＩＮＤＳｕｒｆａｃｅ)の各ウェル上に、約８万個ずつ撒いた。
そして、３７℃で２４時間培養した後、培地を除去し、５０μｌのＨＥＰＥＳバッファーで置換し、蛍光カルシウム指示薬(ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、ＦＬＩＰＲＣａ４ＡｓｓａｙＫｉｔに付属のＦｌｕｏ-４ＡＭ)を含むＨＥＰＥＳバッファーをさらに５０μｌ添加した。次いで、２７℃で４５分間インキュベートして、自動化蛍光イメージングに供する細胞を調製した。
次いで、この細胞に、ステビアの終濃度が表５に記載された濃度となるように、ステビアを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して、２７℃でステビア刺激を行った。
そして、ステビアを含むＨＥＰＥＳバッファーの添加直後から１００秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、ステビア刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を自動化蛍光イメージングにより定量した。結果を表５及び図１９に示す。図１９の縦軸は、刺激直後と刺激後１００秒後の間における蛍光強度の変化量の最大値（ΔＦ）、すなわち、細胞の応答強度であり、横軸は、対数表示のステビア濃度（ｍｇ／ｍｌ）を示す。
得られた結果から、本発明の培養細胞株（Ａ）を用いて、ステビアの甘味を評価できることが確認できた。

（実施例１４）
ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（NHDC）刺激に対する、培養細胞株（Ａ）の生理的応答
ネオヘスペリジンジヒドロカルコン刺激に対して、培養細胞株（Ａ）の生理的応答を、自動化蛍光イメージングにより解析した。
実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）をトリプシナイズし、該ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞密度を計測し、９６ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣｅｌｌＢＩＮＤＳｕｒｆａｃｅ)の各ウェル上に、約８万個ずつ撒いた。
そして、３７℃で２４時間培養した後、培地を除去し、５０μｌのＨＥＰＥＳバッファーで置換し、蛍光カルシウム指示薬(ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、ＦＬＩＰＲＣａ４ＡｓｓａｙＫｉｔに付属のＦｌｕｏ-４ＡＭ)を含むＨＥＰＥＳバッファーをさらに５０μｌ添加した。次いで、２７℃で４５分間インキュベートして、自動化蛍光イメージングに供する細胞を調製した。
次いで、この細胞に、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンの終濃度が表６に記載された濃度となるように、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して、２７℃でネオヘスペリジンジヒドロカルコン刺激を行った。
そして、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンを含むＨＥＰＥＳバッファーの添加直後から１００秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を自動化蛍光イメージングにより定量した。結果を表６及び図２０に示す。図２０の縦軸は、刺激直後と刺激後１００秒後の間における蛍光強度の変化量の最大値（ΔＦ）、すなわち、細胞の応答強度であり、横軸は、対数表示のネオヘスペリジンジヒドロカルコン濃度（ｍＭ）を示す。
得られた結果から、本発明の培養細胞株（Ａ）を用いて、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンの甘味を評価できることが確認できた。

（実施例１５）
シクラメート刺激に対する、培養細胞株（Ａ）の生理的応答
シクラメート刺激に対して、培養細胞株（Ａ）の生理的応答を、自動化蛍光イメージングにより解析した。
実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）をトリプシナイズし、該ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞密度を計測し、９６ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣｅｌｌＢＩＮＤＳｕｒｆａｃｅ)の各ウェル上に、約８万個ずつ撒いた。
そして、３７℃で２４時間培養した後、培地を除去し、５０μｌのＨＥＰＥＳバッファーで置換し、蛍光カルシウム指示薬(ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、ＦＬＩＰＲＣａ４ＡｓｓａｙＫｉｔに付属のＦｌｕｏ-４ＡＭ)を含むＨＥＰＥＳバッファーをさらに５０μｌ添加した。次いで、２７℃で４５分間インキュベートして、自動化蛍光イメージングに供する細胞を調製した。
次いで、この細胞に、シクラメートの終濃度が表７に記載された濃度となるように、シクラメートを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して、２７℃でシクラメート刺激を行った。
そして、シクラメートを含むＨＥＰＥＳバッファーの添加直後から１００秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、シクラメート刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を自動化蛍光イメージングにより定量した。結果を表７及び図２１に示す。図２１の縦軸は、刺激直後と刺激後１００秒後の間における蛍光強度の変化量の最大値（ΔＦ）、すなわち、細胞の応答強度であり、横軸は、対数表示のシクラメート濃度（ｍＭ）を示す。
得られた結果から、本発明の培養細胞株（Ａ）を用いて、シクラメートの甘味を評価できることが確認できた。

本発明により、甘味受容体の安定な発現細胞を取得することができる。この発現細胞は種々の物質の甘味応答の解析に利用することができる。

Claims

甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各遺伝子を同一のプラスミドに挿入してなる甘味受容体発現コンストラクトであって、
ＥＦ-１αプロモーターの下流に位置する、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２をコードする遺伝子の直後に、ＩＲＥＳ配列を介して、Ｇタンパク質αサブユニットをコードする遺伝子を連結し、さらに、その下流に存在するＣＭＶプロモーターの下流に位置する、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ３をコードする遺伝子の直後に、ＩＲＥＳ配列を介して、Ｇタンパク質αサブユニットをコードする遺伝子を連結してなる、甘味受容体発現コンストラクト。
甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各遺伝子を転写方向が同じ向きになるように、同一のプラスミドに挿入してなる、請求項１に記載の甘味受容体発現コンストラクト。
プラスミドが、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である請求項１又は２に記載の甘味受容体発現コンストラクト。
Ｇタンパク質αサブユニットが、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４である請求項１〜３のいずれか１項に記載の甘味受容体発現コンストラクト。
ＥＦ-１αプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有し、かつ、この配列の下流にあるＣＭＶプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有する甘味受容体発現コンストラクト。
ゲノム中にＦＲＴ（ＦｌｉｐｐａｓｅＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎＴａｒｇｅｔ）配列を１か所組み込まれた２９３細胞に、請求項１〜５のいずれか１項に記載の甘味受容体発現コンストラクトを遺伝子導入して甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットを同時に発現させた細胞株。
甘味物質に対する生理的応答を測定するための請求項６に記載の細胞株の使用。
請求項６に記載の細胞株を使用した、甘味物質に対する生理的応答の測定により同定された、特定の甘味物質に対する甘味増強物質を、該甘味物質の生理的応答を測定する際に添加することにより、該甘味物質の甘味の閾値以下の濃度で該甘味物質の生理的応答を測定する方法。