JP6723319B2 - 出血性障害の治療に対する改変セルピン - Google Patents

Description

本発明は、変更された特異性を有する改変セルピン分子、特に活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）等の抗凝固性プロテアーゼに対する特異性を増すように改変されたセルピン分子に関する。

血友病は出血性障害であり、循環血漿ｆＶＩＩＩ（血友病Ａ、ＨＡ）又はｆＩＸ（血友病Ｂ、ＨＢ）の欠乏によって引き起こされる（非特許文献１で再考される）。これにより、生得的なテナーゼ（Ｘａｓｅ）の活性を減少することで組織傷害が生じた場合に産生されるトロンビンの量が減少する。これにより、傷害後の制御されていない出血、また関節及び軟組織への自然発生的な出血が起こる。

血友病にはおよそ５０００人に１人が罹患する。世界血友病連盟の世界的調査で特定された１７００００人の患者は、健康負荷（the global health burden）の過小評価である（非特許文献２）。治療費は非常に高額で、治療は頻回で生涯に亘る。

血友病の標準的な治療は、組換え又は血漿に由来する因子のいずれかを使用する影響を受けた凝固因子の置き換えを必要とする（非特許文献３及び特許文献４において再考される）。しかしながら、この方法で治療された患者はかなりの割合で補充された凝固因子に対して阻害抗体を発現し、治療を無効にする（非特許文献５において再考される）。治療された血友病の患者の３０％においてインヒビターが発生する（非特許文献６において再考される）が、治療されていないインヒビター患者における高い死亡率、及び第ＶＩＩＩ因子の補充療法を利用することができない多くの国におけるインヒビターの低い普及率のため全体的な推定は低い。従来の治療法の別の欠点は費用であり、また注入された凝固因子の短い半減期のため頻繁な治療を必要とすることである（非特許文献７において再考される）。

患者が阻害抗体を発現する場合、バイパス止血剤（bypassing agent）を出血事象の治
療に対して使用する（非特許文献８において再考される）。バイパス止血剤は、冒された凝固因子を直接供給せずに出血を減少し、すなわちバイパス止血剤はテナーゼ複合体の活性を「バイパス」する。現在のバイパス止血剤の例として、組換えｆＶＩＩａ及びプロトロンビン複合体濃縮物であるＦＥＩＢＡ（Factor Eight Bypassing Activity：第ＶＩＩ
Ｉ因子バイパス止血活性）が挙げられる。これらの補充治療は非常に高額であり（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）、両製品の短い半減期のため従来の治療法よりも更に頻繁に高用量で与えられる必要がある（非特許文献１３において再考される）。さらに、患者の応答は変動的であり、予測不可能であることが示された（非特許文献１４において再考される）。

さらに、因子濃縮物の短い半減期は、血友病の標準的な補充療法を最適以下にする。これは、第ＶＩＩＩ因子が１２時間未満の半減期を有することから、血友病Ａにおいて特に明白である。その結果として、血友病Ａ及びＢの両方に対する治療の利用可能性にもかかわらず、出血率は血友病Ａでより高く、慢性血友病性関節症において更に一般的である。これは、第ＶＩＩＩ因子の短い半減期、その結果として第ＶＩＩＩ因子の止血レベルの維持が困難であることに関連する可能性がある（非特許文献１５）。治療の全国的な報告において、インヒビターを有しない重篤な血友病Ａの患者における年間出血頻度は、血友病Ｂの患者における９に比べて１４であった（非特許文献１６）。筋骨格手術の必要性は、血友病Ａの患者において３倍高かった。Tagarielloらは、血友病Ａの患者は、血友病Ｂの
患者より３倍も頻繁に関節置換を必要とすることを見出した（非特許文献１７）。Loweらは、血友病Ａの患者は血友病Ｂと比較して３倍に及ぶ頻繁な入院が必要であったことを見出した（非特許文献１８）。

したがって、血友病等の出血性障害の現在の治療には様々な欠点がある。

Bolton-Maggs & Pasi, 2003 World Federation of Hemophilia, 2011 Mannucci, 2003 Mannucci, 2008 Brettler, 1996 Teitel & Sholzberg 2013 Lee et al, 2006 Negrier et al, 2006 Bohn et al, 2004 Di Minno et al, 2010 Gringeri et al, 2003 Escobar, 2010 Haya et al, 2007 Berntorp, 2009 Escobar and Sallah 2013 Nagel, et al 2011 Tagariello, et al 2009 Lowe and Ludlam 2008

本発明者らは、反応中心ループ（ＲＣＬ）内の残基の改変によってセルピン分子の特異性を操作することができることを認識し、抗凝固性プロテアーゼに対する特異性が増した改変セルピン分子を同定した。これらの改変セルピン分子は、治療法、例えば出血の治療に有用な可能性がある。

本発明の態様は、改変セルピンであって、その反応中心ループ（ＲＣＬ）の残基Ｐ４、Ｐ２、Ｐ１及びＰ１’のうちの１つ又は複数に変異を有する、改変セルピンを提供する。

本発明の別の態様は、改変セルピンであって、その反応中心ループ（ＲＣＬ）の残基Ｐ１’及び残基Ｐ２うちの一方又は両方と、任意に残基Ｐ４及び／又は残基Ｐ１とに変異を有する、改変セルピンを提供する。

前記変異はトロンビンの阻害に関する活性化プロテインＣの阻害を増大する場合がある。

また、上記変異は、ｆＶＩＩａ、ｆＩＸａ、ｆＸａ及びｆＸＩａ等の他の凝固性プロテアーゼの阻害に関連する活性化プロテインＣの阻害を増大する場合がある。

本発明の他の態様は、出血、例えば、遺伝性出血性障害及び外傷、手術を含む後天性出血を伴う患者並びに抗凝固療法を受ける患者における出血の治療に対する、本明細書に記載される改変セルピンの使用に関する。

凝固カスケード及びこのカスケードにおけるセルピンの調節的役割を示す図である。 ２１残基のＮ末端トランケーション（Ｎ末端残基は、成熟タンパク質の残基１としてプロペプチドの残基１を数えた場合、野生型配列のＡ２２である）を有し、ＲＣＬ内のＰ２位及びＰ１’位にＫ残基を有する（Ａ２２ Ｐ２ＫＰ１’Ｋ ＰＣＩ）、プロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）の組織因子経路（外因系）による凝固に対する効果を判定するためのプロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイの結果を示す図である。３つの別々の血漿に由来するプールされた正常な血漿を、ＰＣＩなし（黒色棒グラフ、−）又は５μＭ Ａ２２野生型（ＷＴ）ＰＣＩ（灰色棒グラフ、ＷＴ）又は５μＭ Ａ２２ Ｐ２ＫＰ１’Ｋ ＰＣＩ（白色棒グラフ、Ｐ２ＫＰ１’Ｋ）のいずれかとインキュベートした。外因系経路による凝固を開始するため凝固をＰＴ試薬の添加によって開始し、凝固塊が形成されるまでの時間を測定した。上記アッセイを３回行い、エラーバーは標準偏差を示す。２倍希釈した血漿を使用して、凝固のインヒビターに対するアッセイの感度を上げた。Ａ２２ Ｐ２ＫＰ１’Ｋ ＰＣＩはこのプロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイにおける凝固に対して何の効果も有しない。この結果は、ＴＦ：ｆＶＩＩａ、トロンビン、及び他の凝固原プロテアーゼのＡ２２ Ｐ２ＫＰ１’Ｋ ＰＣＩによる顕著な阻害がないことを示す。 接触活性化経路（内因系）による凝固に対するＡ２２ Ｐ２ＫＰ１’Ｋ ＰＣＩの効果を判定するための活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイの結果を示す。図３Ａは、ＰＣＩなし（黒色棒グラフ、−）又は５μＭ Ａ２２野生型（ＷＴ）ＰＣＩ（灰色棒グラフ、ＷＴ）又はＡ２２ Ｐ２ＫＰ１’Ｋ ＰＣＩ（白色棒グラフ、Ｐ２ＫＰ１’Ｋ）のいずれかとインキュベートした３つの別々の血漿に由来するプールされた正常な血漿を示す。ａＰＴＴ試薬を添加し、３７℃で５分間試料をインキュベートした。その後、内因系の経路による凝固を開始するためＣａＣｌ_２の添加により凝固を開始し、凝固塊が形成されるまでの時間を測定した。棒グラフは少なくとも３つの測定の平均を示し、エラーバーは標準偏差を示す。上記アッセイを３００秒で停止した。３００秒の実験時間内に凝固しなかった試料を星印で示す。図３Ｂは凝固時間に対するわずかな効果を示すため、Ａ２２ ＷＴ ＰＣＩ試料を含まないＡによるデータを示す。 ＲＣＬ内にＣ２３２Ｓ変異及びＰ３５７Ｋ（Ｐ２）変異及びＳ３５９Ｋ（Ｐ１’Ｋ）変異を更に含む全長（ＦＬ）α_１−アンチトリプシンピッツバーグ（antitrypsin Pittsburgh）（Ｐｉｔｔｓ）変異（Ｍ３５８Ｒ＝Ｐ１Ｒ）（ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋ）の組織因子経路（外因系）による凝固に対する効果を判定する、プロトロンビン時間アッセイ（ＰＴ）の結果を示す図である。３つの別々の血漿に由来するプールした正常な血漿をα_１ＡＴなし（−、黒色棒グラフ）又は５μＭのＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ（Ｐｉｔｔｓ、灰色棒グラフ）又は５μＭのＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋ（Ｐ２ＫＰ１’Ｋ、白色棒グラフ）のいずれかとインキュベートした。凝固をＰＴ試薬の添加によって開始し、凝固塊を形成するまでの時間を測定した。棒グラフは少なくとも３つの測定の平均を示し、エラーバーは標準偏差を示す。２倍希釈した血漿を使用して、凝固のインヒビターに対するアッセイの感度を増した。ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓとは異なり、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’ＫはＰＴを延長しない。これは、ＴＦ−ｆＶＩＩａ、トロンビン、又はｆＸａを含むどの凝固原プロテアーゼに対しても顕著な阻害効果がないことを示す。 接触活性化経路（内因系）による凝固に対するＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋの効果を判定するための活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ（ａＰＴＴ）の結果を示す図である。図５Ａは、α_１ＡＴなし（黒色棒グラフ）又は増大する濃度のＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ（灰色棒グラフ）又はＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋ（白色棒グラフ）のいずれかとインキュベートした３つの別々の血漿に由来するプールされた血漿を示す。ａＰＴＴ試薬を添加し、試料を３７℃で５分間インキュベートした。その後、凝固をＣａＣｌ_２の添加によって開始し、凝固塊を形成するまでの時間を測定した。棒グラフは少なくとも３つの測定の平均を示し、エラーバーは標準偏差を示す。上記アッセイを３００秒で停止した。３００秒の実験時間内に凝固しなかった試料を星印で示す。図５Ｂは、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋによる凝固時間に対するわずかな影響を示すためのＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ試料を含まないＡによるデータを示す。しかしながら、この効果は用量依存的に増大しない。 ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓが正常ヒト血漿（ＮＰ）におけるトロンビン生成を阻害することを示す図である。図６Ａ〜図６Ｃは、（Ａ）トロンボモデュリン（ＴＭ）なし、（Ｂ）１．２５ｎＭのトロンボモデュリン（ＴＭ）、（Ｃ）１０ｎＭのトロンボモデュリン（ＴＭ）の存在下での増大する濃度のＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓを含む反応に対する代表的なトロンビン生成曲線を示す図である。曲線は２回のアッセイの平均を示す。全てのアッセイをGeorge King Biomedical製のプールした正常ヒト血漿（ＮＰ）において行った。外因系経路による凝固を活性化するため、ＣａＣｌ_２、及びＴＦ／リン脂質（Technoclone GmbH製のＲＢ ｌｏｗ ＴＦ及びリン脂質試薬＃５００６２１０）を添加することによって凝固を開始した。蛍光発生基質（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）の開裂により、トロンビン生成を測定した。Ｔｅｃｈｎｏｔｈｒｏｍｂｉｎ較正キット（Technoclone）を使用して、既知濃度のトロンビンに対して蛍光単位を較正することによって蛍光単位をトロンビン濃度に変換した。図６Ｄは、反応の間に生成されたトロンビンの総量を表す平均ＥＴＰ（内因性トロンビン活性）を示す。棒グラフは、２回のアッセイで行われた２つの独立した実験の平均を示す。エラーバーは標準偏差を表す。使用したトロンボモデュリン（ＴＭ）はＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞から組換え産生され、ＴＭの細胞外ドメインからなる。 ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋが正常ヒト血漿（ＮＰ）におけるＴＭの抗凝固性効果を補助する（rescues）ことを示す図である。図７Ａ〜図７Ｃは、（Ａ）ＴＭなし、（Ｂ）１．２５ｎＭのＴＭ、（Ｃ）１０ｎＭのＴＭの存在下での増大する濃度のＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋを含む反応に対する代表的なトロンビン生成曲線を示す図である。曲線は２回のアッセイの平均を示す。全てのアッセイをGeorge King Biomedical製のプールした正常ヒト血漿（ＮＰ）において行った。外因系経路による凝固を活性化するため、ＣａＣｌ_２、及びＴＦ／リン脂質（Technoclone GmbH製のＲＢ ｌｏｗ ＴＦ及びリン脂質試薬＃５００６２１０）を添加することによって凝固を開始した。蛍光発生基質（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）の開裂により、トロンビン生成を測定した。Ｔｅｃｈｎｏｔｈｒｏｍｂｉｎ較正キット（Technoclone GmbH製）を使用して、既知濃度のトロンビンに対して蛍光単位を較正することによって蛍光単位をトロンビン濃度に変換した。図７Ｄは、反応の間に生成されたトロンビンの総量を表す平均ＥＴＰ（内因性トロンビン活性）を示す。棒グラフは、２回のアッセイで行われた３つの独立した実験の平均を示す。エラーバーは標準偏差を表す。 ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓがヒト血友病Ａ血漿（ＨＡ、ｆＶＩＩＩ欠乏）及びヒト血友病Ｂ血漿（ＨＢ、ｆＩＸ欠乏）におけるトロンビン生成を消滅させることを示す図である。グラフは、指定の量で添加されたトロンボモデュリン（ＴＭ）を含む（Ａ）ｆＶＩＩＩ欠乏血漿（ｆＶＩＩＩ活性１％未満）又は（Ｂ）ｆＩＸ欠乏血漿（ｆＩＸ活性１％未満）のいずれかにおける、増大する濃度のＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓによってスパイクされたトロンビン生成実験による平均ＥＴＰを示す。血漿は全てGeorge King Biomedical製であった。外因系経路による凝固を活性化するための１：４０００最終希釈率のＤａｄｅ Ｉｎｎｏｖｉｎ（Siemens）を含むＣａＣｌ_２及びＴＦ／リン脂質（Technoclone GmbH製のＲＢ ｌｏｗ ＴＦ及びリン脂質試薬＃５００６２１０）の添加により反応を開始した。蛍光発生基質（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）の開裂によりトロンビン生成を測定した。Ｔｅｃｈｎｏｔｈｒｏｍｂｉｎ較正キット（Technoclone）を使用して、既知濃度のトロンビンに対して蛍光単位を較正することにより、蛍光単位をトロンビン濃度に変換した。２回のアッセイで行われた少なくとも２つの独立した実験より平均ＥＴＰを示す。エラーバーは標準偏差を示す。 ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’ＫがヒトＨＡ血漿（ｆＶＩＩＩ欠乏血漿）におけるＴＭの効果を補助することを示す図である。図９Ａ〜図９Ｃは、（Ａ）ＴＭなし、（Ｂ）１．２５ｎＭのＴＭ、（Ｃ）５ｎＭのＴＭの存在下での増大する濃度のＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋを含む反応に対する代表的なトロンビン生成曲線を示す図である。曲線は２回のアッセイの平均を示す。全てのアッセイをGeorge King Biomedical製のｆＶＩＩＩ欠乏血漿（ｆＶＩＩＩ活性１％未満）において行った。外因系経路による凝固を活性化するため、ＣａＣｌ_２、及びＴＦ／リン脂質（Technoclone GmbH製のＲＢ ｌｏｗ ＴＦ及びリン脂質試薬＃５００６２１０）を添加することによって凝固を開始した。蛍光発生基質（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）の開裂により、トロンビン生成を測定した。Ｔｅｃｈｎｏｔｈｒｏｍｂｉｎ較正キット（Technoclone）を使用して、既知濃度のトロンビンに対して蛍光単位を較正することによって蛍光単位をトロンビン濃度に変換した。図９Ｄは、反応の間に生成されたトロンビンの総量を表す平均ＥＴＰ（内因性トロンビン活性）を示す。棒グラフは、２回のアッセイで行われた２つの独立した実験の平均を示す。エラーバーは標準偏差を表す。 ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’ＫがヒトＨＢ血漿（ｆＩＸ欠乏血漿）におけるＴＭの効果を補助することを示す図である。図１０Ａ〜図１０Ｃは、（Ａ）ＴＭなし、（Ｂ）１．２５ｎＭのＴＭ、（Ｃ）５ｎＭのＴＭの存在下での増大する濃度のＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋを含む反応に対する代表的なトロンビン生成曲線を示す図である。曲線は２回のアッセイの平均を示す。全てのアッセイをGeorge King Biomedical製のｆＩＸ欠乏血漿（ｆＩＸ活性１％未満）において行った。外因系経路による凝固を活性化するため、ＣａＣｌ_２、及びＴＦ／リン脂質（Technoclone GmbH製のＲＢ ｌｏｗ ＴＦ及びリン脂質試薬＃５００６２１０）、及び１：４０００のＤａｄｅ Ｉｎｎｏｖｉｎ（Siemens）を添加することによって凝固を開始した。蛍光発生基質（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）の開裂により、トロンビン生成を測定した。Ｔｅｃｈｎｏｔｈｒｏｍｂｉｎ較正キット（Technoclone）を使用して、既知濃度のトロンビンに対して蛍光単位を較正することによって蛍光単位をトロンビン濃度に変換した。図１０Ｄは、反応の間に生成されたトロンビンの総量を表す平均ＥＴＰ（内因性トロンビン活性）を示す。棒グラフは、２回のアッセイで行われた少なくとも２つの独立した実験の平均を示す。エラーバーは標準偏差を表す。 ＨＢマウス血漿におけるＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ及びＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋの効果を示す図である。図１１Ａ〜図１１Ｄは、ＴＭなし（Ａ及びＣ）、及び７５０ｎＭの可溶性ヒトＴＭの存在下（Ｂ及びＤ）における、増大する濃度のＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ（Ａ及びＢ）又はＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋ（Ｃ及びＤ）を含む反応に対する代表的なトロンビン生成曲線を示す。クエン酸塩への尾部の出血、赤血球除去のための遠心分離、及び−８０℃での凍結によって採取されたＨＢマウス血漿において全てのアッセイを行った。外因系経路による凝固を活性化するため、ＣａＣｌ_２、ＴＦ／リン脂質（Technoclone製のＲＢ ｌｏｗ ＴＦ及びリン脂質試薬）、及び１：１２０００のＤａｄｅ Ｉｎｎｏｖｉｎ（Siemens）の添加により凝固を開始した。トロンビン生成を蛍光発生基質（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭ）の開裂により測定した。Ｔｅｃｈｎｏｔｈｒｏｍｂｉｎ較正キット（Technoclone）を使用して、既知濃度のトロンビンに対して蛍光単位を較正することにより、蛍光単位をトロンビン濃度に変換した。図１１Ｅは、反応の間に生成されたトロンビンの総量を表す平均ＥＴＰ（内因性トロンビン活性）を示す。棒グラフは、４つの独立した実験の平均を示す。エラーバーは標準偏差を表す。全てのアッセイを３３℃で行った。 ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋがテールクリップアッセイ（tail clip assay）においてＨＢマウスの出血を減少することを示す図である。テールクリップの結果は、野生型マウス又はＨＢマウスに対する直径３ｍｍの尾部切断後の１０分間の採取時間に亘る総失血を示す。２００μｌの総注射容量中、指定の用量のＰＢＳ、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ又はＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋいずれかをマウスに注射した。ＰＢＳを使用してタンパク質溶液を２００μｌにした。失血容量を尾部から１４ｍｌの生理食塩水へ採血により特定した。採取した血液を遠心沈殿し、赤血球を溶解した後、５７５ｎｍでの吸光度を測定した。既知容量の採取した血液を使用して赤血球溶解後の５７５ｎｍでの吸光度を特定することにより、標準曲線を構築した。その後、この基準より実験試料における失血を計算した。示される各点は単一のマウスによるデータを示し、水平線は１群当たりの全ての動物の平均を示す。独立ｔ検定を使用してＰ値を計算した。円はＰＢＳを注射した野生型マウスを示し、四角はＰＢＳを注射したＨＢマウスを示し、三角は７．５ｍｇ／ｋｇのＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓを注射したＨＢマウスを示し、逆三角は７．５ ｍｇ／ｋｇのＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋを注射したＨＢマウスを示し、菱形は１５ｍｇ／ｋｇのＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋを注射したＨＢマウスを示す。 ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋが精巣挙筋細動脈レーザー傷害モデル（cremaster arteriole laser injury model）のＨＢマウスにおいて安定な凝固塊形成を増大することを示す図である。頚静脈カニューレにより血小板を標識化するための蛍光タグ付きα−フィブリン抗体及び蛍光タグ付き抗体をＨＢマウスに注入した。対照は、抗体のみを注入したマウスにおける傷害後の凝固塊形成のベースラインレベルを示す。ｍは各条件に対するマウスの数を示し、ｎはその条件に対して行われた傷害の数を示す。薄い灰色は凝固塊がないことを示し、濃い灰色は血小板のみの凝固塊を示し、黒色は血小板及びフィブリンを含有する凝固塊を表す。 ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋが精巣挙筋細動脈レーザー傷害モデルのＨＢマウスにおける安定な凝固塊形成を増大することを示す図である。図１４は、図１３で示された結果の代表的な生データを示す。各条件について全ての傷害から蛍光を経時的に定量した。グラフは、指定の条件における全ての傷害に由来する中央値を示す。マウスの数及び傷害の総数は以下の通りであった。対照：マウス５匹、傷害８個、７．５ｍｇ／ｋｇのＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ：マウス１匹、傷害７個、７．５ｍｇ／ｋｇのＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋ：マウス４匹、傷害１８個、１５ｍｇ／ｋｇのＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋ：マウス３匹、傷害２０個。 ｆＸａ阻害について再スクリーニングされたトロンビンよりもＡＰＣに特異的なα_１ＡＴの変異体によるトロンビン及びｆＸａの阻害を示す図である。その後、トロンビン又はｆＸａを阻害しなかったＡＰＣ特異的変異体の産生においてスクリーニングが成功したかどうかを判定するため、減少したｆＸａ阻害を有するはずである得られた４つの変異体を、（Ａ）トロンビン及び（Ｂ）ｆＸａの阻害について試験した。１μｍのセルピンを１２．５ｎＭのプロテアーゼと共に種々の時間に亘ってインキュベートした。指定の時間点において、過剰な発色基質（トロンビンに対してＳ２２３８、ｆＸａに対してＳ２２２２）の添加により反応を停止した。残留酵素活性を初期酵素活性で除し、この値の自然対数を時間に対してプロットした。これらのプロットの傾きは、実測速度定数ｋ_ｏｂｓである。二次速度定数ｋ_２の推定を得るため、ｋ_ｏｂｓをセルピン濃度で除した。トロンビン及びｆＸａの最も高い阻害、また実質的にｆＸａを阻害しなかった唯一の変異体（Ｐ２ＲＰ１’Ｑ）に対する値を説明するため、選択した値を図に示す。示される上記変異体は全てＰｉｔｔｓ（Ｍ３５８Ｒ、Ｐ１Ｒ）変異を有する。

詳細な説明
本発明は、他の凝固プロテアーゼと比べてＡＰＣに対する特異性を増大するためのセルピンの改変に関する。ＡＰＣに特異的な改変セルピンバリアントは、例えば凝血促進剤として有用な可能性がある。

改変セルピンバリアントはＡＰＣに対して特異的であることから、本明細書に記載される改変セルピンはわずかなオフターゲット効果を有するか、又はオフターゲット効果を有さず、傷害によって活性化される経路に特異的であると期待される。これは、治療的及び予防的に、また緊急の状況、すなわち外傷において上記改変セルピンを適用することを可能とする。改変セルピンの投薬は、それらが自殺インヒビターであることから予測可能であり、１分子のセルピンは２分子以上のプロテアーゼを阻害することができないことを意味する。さらに、効率的な自然のクリアランス機構はセルピン単独よりもセルピン：プロテアーゼ複合体に特異的であることから、改変セルピンの血漿半減期は現在のバイパス止血剤の血漿半減期を超える可能性が高い。例えば、本明細書に記載される改変セルピンの半減期は約５日の場合がある。

プロテインＣ（遺伝子ＩＤ５６２４）は、トロンビン−トロンボモデュリン複合体によってその活性化形態（活性化プロテインＣ、ＡＰＣ）へと開裂される、ビタミンＫ依存性血漿糖タンパク質である。ヒトプロテインＣは、参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００３０３．１ ＧＩ：４５０６１１５を有し、参照ヌクレオチド配列ＮＭ＿０００３１２．３ ＧＩ：２７０４８３７２０によりコードされ得る。ＡＰＣは、ｆＶａ及びｆＶＩＩＩａをタンパク質分解により開裂する（図１）ことによって、トロンビンの産生を減ずる抗凝固性プロテアーゼである。

本明細書に記載される改変セルピンは、その反応中心ループ（ＲＣＬ）に１又は複数の変異を有してもよい。例えば、改変セルピンは、そのＲＣＬに１個、２個、３個、４個、又は５個以上の変異を有してもよい。Ｐ４、Ｐ２、Ｐ１及びＰ１’の位置の１個、２個、３個、又は４個全てにおける残基が変異されてもよい。例えば、Ｐ１’及びＰ２の位置のうち一方又は両方と、任意にＰ１及び／又はＰ４の位置との残基が変異されてもよい。

本明細書では、ＲＣＬ残基はセリンプロテアーゼの基質及びインヒビターに対するSchechter-Berger命名法（Schechter & Berger, 1967）に従って番号付けされる。この標準的な命名法は、Ｐ１’、Ｐ１、Ｐ２及び／又はＰ４の位置等のＲＣＬの特定の位置の残基を任意のセルピン配列の中で容易に同定することを可能とする。

１又は複数の変異が改変セルピンのＲＣＬにおける唯一の変異であることが好ましい。例えば、ＲＣＬは、Ｐ１’及びＰ２の位置のうち一方又は両方と、任意にＰ１及び／Ｐ４の位置とに変異を有する野生型セルピンのＲＣＬの配列からなってもよい。

改変セルピンのＲＣＬはＰ１’位とＰ２位との変異；Ｐ１’位とＰ２位とＰ１位との変異；Ｐ１’位とＰ２位とＰ４位との変異、若しくはＰ１’位とＰ２位とＰ１位とＰ４位との変異；Ｐ１’位の変異；Ｐ１’位とＰ１位との変異；Ｐ１’位とＰ４位との変異、若しくはＰ１’位とＰ１位とＰ４位との変異；Ｐ２位の変異；Ｐ２位とＰ１との変異；Ｐ２位とＰ４位との変異、Ｐ２位とＰ１位とＰ４位との変異、Ｐ１位の変異、Ｐ４位の変異；又はＰ１位とＰ４位との変異を有してもよい。ＲＣＬの他の位置の残基は変異されていない野生型の残基であってもよい。

ＲＣＬの位置Ｐ１’、位置Ｐ１’とＰ２と、位置Ｐ１’とＰ１とＰ２と、位置Ｐ２とＰ１と、位置Ｐ１とＰ１’と、位置Ｐ１’とＰ２とＰ４と、又は位置Ｐ１’とＰ１とＰ２とＰ４との残基が変異されていることが好ましい。幾つかの好ましい実施形態では、Ｐ１’とＰ１とＰ２との残基が変異される。

セルピンの反応中心ループ（ＲＣＬ）は、典型的には長さ約２０の残基であり、標的プロテアーゼによって開裂される切断しやすいＰ１−Ｐ１’結合を含む。ＲＣＬは、セルピ
ンのベータシートＡの鎖５からベータシートＣの鎖１へと伸びる。残基Ｐ１７のＧｌｕ、残基Ｐ１５のＧｌｙ、及び残基Ｐ１４のＴｈｒはセルピンにおいて保存される。例えば、セルピンのＲＣＬはコンセンサス配列Ｐ１７のＥ、Ｐ１６のＥ／Ｋ／Ｒ、Ｐ１５のＧ、Ｐ１４のＴ／Ｓ、Ｐ１２〜Ｐ９の（Ａ／Ｇ／Ｓ）_４（Hopkins et al. 1993、Irving et al.
2000）を含んでもよい。ＲＣＬは残基Ｐ１７で開始し、通常残基Ｐ３’で終わる。ＲＣ
Ｌは、ＰＣＩ等の一部のセルピンにおいて、Ｐ’側に対する追加の残基により伸長されてもよい。例えば、α_１−抗トリプシンのＲＣＬは残基Ｐ１７〜Ｐ３’からなり、ＰＣＩのＲＣＬは残基Ｐ１７〜Ｐ６’からなる。強調されたＰ１’、Ｐ１、Ｐ２及びＰ４の残基を有するセルピンの例を以下の配列番号１〜配列番号１１に示す。成熟セルピンの配列を構成する残基も示される。

上記セルピンにおけるＲＣＬの他の位置の残基は改変されていなくてもよく、すなわち、それらの残基は、野生型セルピン配列の本来の残基であってもよい。したがって、改変セルピンは、上に記載されるＰ１、Ｐ１’、Ｐ２及び／又はＰ４の位置における変異を含む野生型配列を有するＲＣＬを含んでもよい。

改変セルピンの反応中心ループ（ＲＣＬ）中の１又は複数の変異は、Ｐ１’位における変異を含んでもよく、又はそれからなってもよい。上記変異は置換であることが好ましい。野生型セルピンのＲＣＬ中の本来のＰ１’残基は、改変セルピンにおいて非天然残基で置き換えられてもよい。例えば、α_１ＡＴ又はＰＣＩの野生型配列中のＰ１’位の本来のＳ残基は、改変セルピンにおいてＳ以外の残基で置き換えられてもよい。

野生型セルピンのＲＣＬ中の本来のＰ１’残基は、Ｑ、Ｎ、Ｙ等の大きな極性残基、Ｉ、Ｍ及びＶ等の大きな疎水性残基、Ｒ、Ｈ若しくはＫ等の正電荷を持つ残基、又はＣ、Ａ、Ｓ及びＥ等の別の残基で置き換えられてもよい。

幾つかの好ましい実施形態では、Ｐ１’残基は、Ｑ、Ｎ、Ｙ等の大きな極性残基、Ｖ等の大きな疎水性残基、又はＲ、Ｈ若しくはＫ等の正電荷を持つ残基、より好ましくはＨ、Ｋ、Ｒ若しくはＱ等の正電荷を持つか、又は大きな極性の残基、最も好ましくはＫへと改変されてもよい。

他の実施形態では、Ｐ１’残基は改変セルピンにおいて改変されていなくてもよい。例えば、改変セルピンのＲＣＬ中のＰ１’位の残基は、野生型セルピン配列のＰ１’残基に存在する残基であってもよい。

改変セルピンの反応中心ループ（ＲＣＬ）における１又は複数の変異は、Ｐ２残基における変異を含んでもよく、又はそれからなってもよい。その変異は置換であることが好ましい。例えば、野生型セルピンのＲＣＬ中の本来のＰ２残基は、改変セルピン中の非天然残基で置き換えられてもよい。

野生型セルピンのＲＣＬにおける本来のＰ２残基は、Ｄ、Ｑ、Ｎ、Ｙ等の大きな極性残基、Ｗ、Ｌ、Ｉ、Ｖ及びＦ等の大きな疎水性残基、Ｒ、Ｈ若しくはＫ等の正電荷を持つ残基、又はＣ、Ａ、Ｔ、Ｓ若しくはＰ等の別の残基によって置き換えられてもよい。

幾つかの実施形態では、改変セルピンのＰ２残基はＰ以外であってもよい。

幾つかの好ましい実施形態では、Ｐ２残基は、Ｑ、Ｎ、Ｙ等の大きな極性残基、Ｗ等の大きな疎水性残基、又はＲ、Ｈ若しくはＫ等の正電荷を持つ残基、最も好ましくはＨ、Ｋ若しくはＲ等の正の残基、好ましくはＫへと改変されてもよい。

幾つかの実施形態では、Ｐ２残基は改変セルピンにおいて改変されていなくてもよい。例えば、改変セルピンのＲＣＬ中のＰ２位の残基は、野生型セルピン配列のＰ２残基に存在する残基であってもよい。

改変セルピンのＲＣＬ中の１又は複数の変異は、Ｐ１’残基及び／又はＰ２残基における置換を含んでもよく、又はそれからなってもよく、すなわち、野生型セルピン配列のＲＣＬ中のＰ１’位及び／又はＰ２位に位置する残基が改変セルピンにおいて他の残基に置き換えられてもよい。

好ましい実施形態では、改変セルピンは、ＲＣＬのＰ２位及びＰ１’位の両方に変異を有する。

改変セルピンのＰ２位及びＰ１’位に適した残基は上に記載される。

本明細書に記載される幾つかの改変セルピンでは、Ｐ１’残基及びＰ２残基の少なくとも一方が、Ｒ、Ｈ若しくはＫ等の正電荷を持つ残基、又はＤ、Ｙ、Ｑ若しくはＮ等の大きな極性残基；Ｗ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｍ若しくはＩ等の大きな疎水性残基、又はＬ、Ｃ、Ａ、Ｅ、Ｔ、Ｓ若しくはＰ等の別の残基であってもよい。Ｐ１’残基及びＰ２残基の少なくとも一方は、Ｒ、Ｈ若しくはＫ等の正電荷を持つ残基、Ｙ、Ｑ若しくはＮ等の大きな極性残基、又はＷ、Ｌ、Ｆ、Ｖ若しくはＩ等の大きな疎水性残基であることが好ましい。

本明細書に記載される改変セルピンにおけるＰ２残基及びＰ１’残基の例としてはそれぞれ、ＫＫ、ＦＫ、ＲＫ、ＶＫ、ＬＫ、ＱＫ、ＣＫ、ＰＫ、ＦＲ、ＨＲ、ＩＲ、ＳＲ、ＴＲ、ＶＲ、ＹＲ、ＡＲ、ＰＲ、ＲＳ、ＫＳ、ＱＶ、ＲＶ、ＲＩ、ＲＨ、ＫＨ、ＴＨ、ＲＣ、ＲＡ、ＬＹ、ＱＹ、ＴＹ、ＤＭ、ＴＭ、ＷＮ、ＲＮ、ＨＮ、ＴＮ、ＫＮ、ＮＮ、ＰＥ、ＲＱ、ＫＱ及びＴＱが挙げられる。

幾つかの好ましい実施形態では、Ｐ１’残基及びＰ２残基の両方が、Ｋ、Ｈ又はＲ等の正電荷を持つ残基、最も好ましくはＫに改変されてもよい。

幾つかの実施形態では、Ｐ２残基及びＰ１’残基は、本明細書に記載される改変セルピンにおいてそれぞれ、ＰＮ、ＦＳ、ＱＳ、ＡＳ、ＴＳ、ＨＳ、ＴＡ、ＰＴ、ＣＣ、ＰＳ、ＰＴ、ＰＭ、ＰＨ、ＰＡ又はＰＣ以外であってもよい。例えば、Ｐ２残基及びＰ１’残基は、ＰＣＩスカフォールドにおいてＰＮ、ＦＳ、ＱＳ、ＡＳ、ＴＳ、ＨＳ、ＴＡ、ＰＴ、ＣＣ若しくはＰＣ以外であってもよく、又はα_１ＡＴスカフォールドにおいてＰＳ、ＰＴ、ＰＭ、ＰＨ若しくはＰＡ以外であってもよい。

幾つかの実施形態では、Ｐ１残基は改変セルピンにおいて改変されなくてもよい。例えば、改変セルピンのＲＣＬ中のＰ１位における残基は、野生型セルピン配列中のＰ１残基に存在する残基であってもよい。例えば、改変ＰＣＩ中のＰ１残基はＲ残基であってもよい。

他の実施形態では、Ｐ１残基は改変セルピンにおいて変異されてもよい。例えば、改変セルピンの反応中心ループ（ＲＣＬ）中の１又は複数の変異は、Ｐ１残基における変異を更に含む。上記変異は置換であることが好ましい。野生型セルピンのＲＣＬ中の本来のＰ１残基は、改変セルピン中の非天然残基によって置き換えられてもよい。

幾つかの実施形態では、Ｐ１残基は、Ｈ、Ｋ又はＲ等の正電荷を持つ残基、好ましくはＲに変異又は改変されてもよい。

野生型セルピンのＰ１位において正電荷を有しない本来の残基は、改変セルピンにおいて正電荷を有する残基によって置き換えられてもよい。例えば、野生型α_１ＡＴのＰ１位におけるＭは、改変α_１ＡＴにおいてＲ等の正電荷を持つ残基によって置き換えられてもよい。α_１ＡＴのピッツバーグ（Ｐｉｔｔｓ）バリアントは、Ｐ１位のＭ残基をＲ残基で置き換える残基３５８における変異を有する。

幾つかの実施形態では、Ｐ４残基は改変セルピンにおいて改変されていなくてもよい。例えば、改変セルピンのＲＣＬ中のＰ４位における残基は、野生型セルピン配列中のＰ４残基に存在する残基であってもよい。例えば、ＰＣＩスカフォールドにおけるＰ４残基はＦであってもよく、α_１ＡＴスカフォールドにおけるＰ４残基はＡであってもよい。

他の実施形態では、Ｐ４残基は改変セルピンにおいて変異されてもよい。例えば、改変セルピンの反応中心ループ（ＲＣＬ）中の１又は複数の変異は、Ｐ４残基における変異を更に含む。

上記変異は置換であることが好ましい。野生型セルピンのＲＣＬ中のＰ４残基における残基は、改変セルピンにおいて異なる残基で置き換えられてもよい。例えば、改変ＰＣＩのＰ４残基は、Ｆ以外の残基に変異又は改変されてもよく、改変α_１ＡＴにおけるＰ４残基はＡ以外の残基に変異又は改変されてもよい。

改変セルピンのＲＣＬのＰ４位に適した残基としてＳ、Ｒ、Ｖ、Ｃ、Ｗ、Ｋ、Ｇ、Ｌ、Ｈ、Ｆ、Ｔ、Ｑ及びＡが挙げられる。

本明細書に記載される改変凝固原セルピンの例では、
（１）Ｐ４残基がＱであり、Ｐ２残基がＲであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＮである；
（２）Ｐ４残基がＫであり、Ｐ２残基がＲであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＨである；
（３）Ｐ４残基がＳであり、Ｐ２残基がＬであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＫである；
（４）Ｐ４残基がＨであり、Ｐ２残基がＲであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＶである；
（５）Ｐ４残基がＦであり、Ｐ２残基がＫであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＫである；
（６）Ｐ４残基がＦであり、Ｐ２残基がＲであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＫである；
（７）Ｐ４残基がＦであり、Ｐ２残基がＶであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＫである；
（８）Ｐ４残基がＣであり、Ｐ２残基がＬであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＫである；
（９）Ｐ４残基がＦであり、Ｐ２残基がＦであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＲである；
（１０）Ｐ４残基がＳであり、Ｐ２残基がＨであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＲである；
（１１）Ｐ４残基がＧであり、Ｐ２残基がＩであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＲである；
（１２）Ｐ４残基がＲであり、Ｐ２残基がＱであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＶである；
（１３）Ｐ４残基がＴであり、Ｐ２残基がＲであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＶである；
（１４）Ｐ４残基がＲであり、Ｐ２残基がＲであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＩである；
（１５）Ｐ４残基がＶであり、Ｐ２残基がＲであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＩである；
（１６）Ｐ４残基がＬであり、Ｐ２残基がＲであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＩである；
（１７）Ｐ４残基がＴであり、Ｐ２残基がＬであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＹである；
（１８）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＱであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＹである；
（１９）Ｐ４残基がＫであり、Ｐ２残基がＤであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＭである；
（２０）Ｐ４残基がＷであり、Ｐ２残基がＷであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＮである；
（２１）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＫであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＳである；
（２２）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＲであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＳである；
（２３）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＰであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＥである；
（２４）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＰであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＲである；
（２５）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＰであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＫである；
（２６）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＴであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＭである；
（２７）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＴであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＨである；
（２８）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＴであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＱである；
（２９）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＴであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＮである；
（３０）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＴであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＹである；
（３２）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＴであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＲである；
（３３）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＲであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＡである；
（３４）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＲであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＨである；
（３５）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＲであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＣである；
（３６）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＲであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＮである；
（３７）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＳであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＲである；
（３８）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＫであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＮである；
（３９）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＫであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＨである；
（４０）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＫであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＫである；
（４１）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＶであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＲである；
（４２）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＹであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＲである；
（４３）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＡであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＲである；
（４４）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＣであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＫである；
（４５）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＷであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＮである；
（４６）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＨであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＮである；
（４７）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＱであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＫである；又は、
（４８）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＮであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＮである。
（４９）Ｐ４残基がＦであり、Ｐ２残基がＦであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＫである。
（５０）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＫであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＱである、
（５１）Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＲであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＱである。

幾つかの好ましい改変セルピンにおいて、Ｐ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＫであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＫである。

幾つかの実施形態では、本明細書に記載される改変凝固原セルピンにおけるＰ４位、Ｐ２位及びＰ１’位の残基は、それぞれＨＰＮ、ＤＫＮ、ＨＰＥ、ＦＦＳ、ＬＱＳ、ＨＡＳ、ＹＴＳ、ＡＨＳ、ＡＴＡ、ＬＰＴ、ＡＣＣ、ＡＰＴ、ＡＰＡ、ＡＰＭ、ＡＰＨ、ＡＰＳ及びＶＰＣ以外であってもよい。例えば、改変ＰＣＩはＰ４位、Ｐ２位及びＰ１’位においてＨＰＮ、ＤＫＮ、ＨＰＥ、ＦＦＳ、ＬＱＳ、ＨＡＳ、ＹＴＳ、ＡＨＳ、ＡＴＡ、ＬＰＴ、ＡＣＣ、及びＶＰＣ以外の残基を有してもよく、改変α_１ＡＴはＰ４位、Ｐ２位及びＰ１’位においてＡＰＴ、ＡＰＡ、ＡＰＭ、又はＡＰＨ以外の残基を有してもよい。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される改変凝固原セルピンにおけるＰ４位、Ｐ２位及びＰ１’位の残基の組合せは非天然であってもよく、すなわち、親の野生型（すなわち、改変されていない）セルピン又は他の野生型セルピンには見られないＰ４位、Ｐ２位及びＰ１’位の残基の組合せであってもよい。

本明細書に記載される改変セルピンは、上に記載されるそのＲＣＬにおいて１又は複数の変異、及び任意にＲＣＬの外に１又は複数の追加の変異を有する、野生型（すなわち、改変されていない）セルピン、好ましくは成熟な野生型セルピンの配列を含んでもよい。

野生型セルピンの配列は当該技術分野でよく知られており、本明細書に提示される配列番号１〜配列番号１１を含んでもよい。野生型セルピンの配列は成熟な野生型タンパク質の配列を含んでもよい。

そのプロペプチドを含む成熟プロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）配列は、配列番号１の残基２０〜４０６に対応する。成熟α_１−抗キモトリプシンは、配列番号２の残基２６
〜４２３に対応する。成熟Ｃ１−エステラーゼインヒビター配列は、配列番号３の残基２３〜５００に対応する。成熟α_２−抗プラスミン配列は、配列番号４の残基２８〜４９１に対応する。成熟抗トロンビン（ＡＴＩＩＩ）配列は、配列番号５の残基３３〜４６４に対応する。成熟ヘパリン補因子ＩＩ配列は、配列番号６の残基２０〜４９９に対応する。成熟α_１−抗トリプシン（α_１ＡＴ）配列は、配列番号７の残基２５〜４１８に対応する。成熟カリスタチン配列は、配列番号８の残基２１〜４２７に対応する。成熟プラスミノーゲン活性化因子インヒビター配列は、配列番号９の残基２４〜４０２に対応する。成熟プロテインＺ依存性インヒビター配列は、配列番号１０の残基２２〜４４４に対応する。成熟プロテアーゼネキシン１アイソフォーム配列は、配列番号１１の残基２０〜３９８に対応する。

上に記載されるＲＣＬ中の残基の変異以外に、改変セルピンは、野生型セルピンアミノ酸配列（例えば、配列番号１〜配列番号１１のうちの１個、好ましくは配列番号１又は配列番号７の成熟セルピン配列）と比較して変更された５０以下、好ましくは４５以下、４０以下、３０以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、又は３以下のアミノ酸残基を有してもよい。例えば、改変セルピンは、上に記載されるように変異又は変更されたセルピンのＲＣＬにおける１個、２個、３個、又は４個のアミノ酸残基（すなわち、Ｐ１’及び／又はＰ２、並びに任意にＰ１及び／又はＰ４の位置の残基）に加えて、５０以下、４５以下、４０以下、３０以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下又は３以下の変異又は変更されたアミノ酸残基を有する野生型セルピンの配列を含んでもよい。

野生型アミノ酸配列におけるアミノ酸残基は、挿入、欠失又は置換、好ましくは種々のアミノ酸残基に対する置換によって変更又は変異されてもよい。かかる変更は、コード核酸における１又は複数のヌクレオチドの１又は複数の付加、挿入、欠失、又は置換によって引き起こされてもよい。

例えば、改変セルピンは、５０以下の変異を有し、上記変異がＰ４、Ｐ２、Ｐ１及びＰ１’以外の位置である、配列番号１２の残基２５〜４１８のアミノ酸配列を含んでもよく、すなわち、改変セルピンのＲＣＬ中のＰ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＫであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＫである。

配列番号１２の改変セルピン中のＰ４残基は３７９位（成熟タンパク質の３５５）に位置し、Ｐ２残基は３８１位（成熟タンパク質の３５７）に位置し、Ｐ１残基は３８２位（成熟タンパク質の３５８）に位置し、Ｐ１’残基は３８３位（成熟タンパク質の３５９）に位置する。

改変セルピンは、野生型セルピンの野生型アミノ酸配列、例えば、配列番号１〜配列番号１１のいずれか１個、好ましくは配列番号１又は配列番号７の成熟セルピン配列と少なくとも５０％の配列同一性を共有してもよく、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を共有してもよい。

例えば、改変セルピンは、改変セルピンのＲＣＬ中のＰ４残基がＡであり、Ｐ２残基がＫであり、Ｐ１残基がＲであり、Ｐ１’残基がＫである、配列番号１２の残基２５〜４１８に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。

配列同一性は、一般的にはアルゴリズムＧＡＰ（米国サンディエゴのAccelerys Inc製
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＧＣＧ ｐａｃｋａｇｅ）を参照して規定される。ＧＡＰは、２つの完全配列を整列するため、一致する数を最大化し、ギャップの数を最小化するNeedleman及びWunschのアルゴリズムを使用する。一般的には、ギャップ作製ペナルティ（gap cre
ation penalty）＝１２及びギャップ伸長ペナルティ（gap extension penalty）＝４を有するデフォルトパラメーターを使用する。ＧＡＰの使用が好ましい場合があるが、一般的に採用されるデフォルトパラメーターである他のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴ（Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410の方法を使用する）、ＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448の方法を使用する）、若しくはＳｍ
ｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Smith and Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197）、又は前述のAltschul et al.（1990）のＴＢＬＡＳＴＮプログラムを使用してもよい。特に、ｐｓｉ−Ｂｌａｓｔアルゴリズムが使用され得る（Nucl. Acids Res.
(1997) 25 3389-3402）。また、Ｇｅｎｏｍｅｑｕｅｓｔ（商標）ソフトウェア（米国マサチューセッツ州ウースターのGene-IT）を使用して配列の同一性及び類似性を決定して
もよい。

配列比較は、本明細書に記載される関連のある配列の全長に対して行われることが好ましい。

本明細書に記載される改変凝固原セルピンは、ＲＣＬコンセンサスＰ１７ Ｅ、Ｐ１６
Ｓ／Ｅ／Ｋ／Ｒ、Ｐ１５ Ｇ、Ｐ１４ Ｔ／Ｓ、Ｐ１２−Ｐ９（Ａ／Ｇ／Ｓ）_４を含むことが好ましい。

改変セルピンは、野生型セルピン配列に保存される１又は複数の残基を更に含んでもよい。例えば、変性セルピンは、下記の残基（α１ＡＴにおける位置に従って付番している）:３３Ｆ、４９Ｎ、５３Ｓ、５４Ｐ、５６Ｓ、６１Ｌ、６７Ｇ、７２Ｔ、８０Ｌ、１３
０Ｆ、１４７Ｆ、１５７Ｉ、１５８Ｎ、１６１Ｖ、１６５Ｔ、１６７Ｇ、１６９Ｉ、１８０Ｔ、１８４Ｌ、１８６Ｎ、１９０Ｆ、１９１Ｋ、１９２Ｇ、１９４Ｗ、１９８Ｆ、２０３Ｔ、２０８Ｆ、２１８Ｖ、２２０Ｍ、２２１Ｍ、２７７Ｙ、２５４Ｌ、２５５Ｐ、２８９Ｐ、２９０Ｋ、２９９Ｌ、３０３Ｌ、３０７Ｇ、３１２Ｆ、３１６Ａ、３２７Ｌ、３３４Ｈ、３４２Ｅ、３４４Ｇ、３４７Ａ、３６９Ｐ、３７０Ｆ、３８３Ｌ、３８４Ｆ、３８６Ｇ及び３９１Ｐ（Irving et al 2008）の幾つか又は全てを含み得る。他のセルピン配
列において対応する保存された残基は、通例の配列分析を使用して容易に決定され得る。

改変セルピンのＲＣＬの外での変異又はバリエーションとして、ジスルフィド架橋形成又は他の改変を消滅させるためのα_１ＡＴのＣ２３２（成熟配列によるナンバリング）残基等の改変セルピンにおける１又は複数のＣｙｓ残基の置き換え、例えば発現を促進するための野生型配列のＮ末端における残基の欠失若しくは置換、又は改変セルピンのヘパリン結合活性を変更するための改変セルピンのヘパリン結合部位（すなわち、へリックスＤ又はへリックスＨ）における残基の変異若しくは改変が挙げられ得る。

幾つかの実施形態では、改変セルピンは、野生型セルピンと比較してＮ末端トランケーションを有してもよい。例えば、改変セルピンは、Ｎ末端に１０残基〜３０残基、好ましくは約２０残基のトランケーションを有してもよい。

改変セルピンにおける１又は複数の残基は、非天然アミノ酸、改変アミノ酸又はＤアミノ酸であってもよい。かかるアミノ酸の使用は当業者によく知られている。

本明細書に記載される改変セルピンは野生型セルピンの二次構造を呈してもよく、例えば、改変セルピンは３つのベータシート、８〜９のアルファへリックス及び約２０残基の柔軟なＲＣＬを含む構造を呈してもよい。

幾つかの好ましい実施形態では、改変セルピンは、本明細書に記載されるようにその反応中心ループ（ＲＣＬ）中に１又は複数の変異を有する野生型セルピンのアミノ酸配列か
らなってもよい。

改変セルピンはヒトにおいて非免疫原性であることが好ましい。例えば、野生型セルピンは、ヒトセルピン、好ましくはヒト血漿セルピンであってもよい。

野生型セルピンは、α_１−抗キモトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ３）、α_２−抗プラスミン（ＳＥＲＰＩＮＦ２）、抗トロンビン（ＡＴＩＩＩ）（ＳＥＲＰＩＮＣ１）、ヘパリン補因子ＩＩ（ＨＣＩＩ）（ＳＥＲＰＩＮＤ１）、プロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）（ＳＥＲＰＩＮＡ５）、α_１−抗トリプシン（α_１ＡＴ）（ＳＥＲＰＩＮＡ１）、カリスタチン（ＳＥＲＰＩＮＡ４）、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター−１（ＳＥＲＰＩＮＥ１）、Ｃ１−エステラーゼインヒビター（ＳＥＲＰＩＮＧ１）、プロテアーゼネキシン１（ＳＥＲＰＩＮＥ２）又はプロテインＺ−依存性インヒビター（ＳＥＲＰＩＮＡ１０）であってもよい（Whisstock et al JBC. 285 32 24307-24312、Rau et al Journal of Thrombosis and Hemostasis, 5 (Suppl. 1): 102-115、Huntington, Journal of Thrombosis and Hemostasis, 9 (Suppl. 1): 26-34）。

野生型セルピンは、好ましくはＡＴＩＩＩ、ＨＣＩＩ、ＰＣＩ又はα_１ＡＴであり、最も好ましくはＰＣＩ又はα_１ＡＴである（Huntington et al Cell. Mol. Life Sci. 66 (2009) 113-121、Li et al JBC. 283 51 36039-36045、及びLi et al PNAS 2008 105 4661-4666）。

α_１−抗キモトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ３、遺伝子ＩＤ１２）は、ＮＰ＿００１０７６．２ ＧＩ：５０６５９０８０（配列番号２）の参照アミノ酸配列を有してもよく、またＮＭ＿００１０８５．４ ＧＩ：７３８５８５６２の参照ヌクレオチド配列によってコードされてもよい。

Ｃ１−エステラーゼインヒビター（ＳＥＲＰＩＮＧ１、遺伝子ＩＤ７１０）は、ＮＰ＿００００５３．２ ＧＩ：７３８５８５６８（配列番号３）の参照アミノ酸配列を有してもよく、またＮＭ＿００００６２．２ ＧＩ：７３８５８５６７の参照ヌクレオチド配列によってコードされてもよい。

α_２−抗プラスミン（ＳＥＲＰＩＮＦ２、遺伝子ＩＤ５３４５）は、ＮＰ＿０００９２５．２ ＧＩ：１１５５８３６６３（配列番号４）の参照アミノ酸配列を有してもよく、またＮＭ＿００１１６５９２０．１ ＧＩ：２６００６４０４７の参照ヌクレオチド配列によってコードされてもよい。

抗トロンビン（ＡＴＩＩＩ）（ＳＥＲＰＩＮＣ１、遺伝子ＩＤ４６２）は、ＮＰ＿０００４７９．１ ＧＩ：４５０２２６１（配列番号５）の参照アミノ酸配列を有してもよく、またＮＭ＿０００４８８．３ ＧＩ：２５４５８８０５９の参照ヌクレオチド配列によってコードされてもよい。

ヘパリン補因子ＩＩ（ＨＣＩＩ）（ＳＥＲＰＩＮＤ１、遺伝子ＩＤ３０５３）は、ＮＰ＿０００１７６．２ ＧＩ：７３８５８５６６（配列番号６）の参照アミノ酸配列を有してもよく、またＮＭ＿０００１８５．３ ＧＩ：７３８５８５６５の参照ヌクレオチド配列によってコードされてもよい。

プロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）（ＳＥＲＰＩＮＡ５、遺伝子ＩＤ５１０４）は、ＮＰ＿０００６１５．３ ＧＩ：１９４０１８４７２の参照アミノ酸配列を有してもよく、またＮＭ＿０００６２４．５ ＧＩ：４０１７８２５８１の参照ヌクレオチド配列によってコードされてもよい。幾つかの好ましい実施形態では、プロテインＣインヒビター（
ＰＣＩ）は、ＳＮＰ ｒｓ６１１５における置換によって生じた対立遺伝子バリアントＶＡＲ＿０１３０８１（Ｓ４５Ｎバリアント、プロペプチドを含む成熟タンパク質によるナンバリング）であって、配列番号１に示される配列を有してもよい。配列番号１の残基１〜１９はシグナル配列に対応する。血漿では、ＰＣＩは、配列番号１の残基２０〜２５のプロペプチドを含む全長形態（すなわち、配列番号１の残基２０〜４０６）、又はプロペプチドを欠くＮ末端切断形態（すなわち、配列番号１の残基２６〜４０６）で存在し得る。

α_１−抗トリプシン（α_１ＡＴ）（ＳＥＲＰＩＮＡ１、遺伝子ＩＤ５２６５）は、ＮＰ＿０００２８６．３ ＧＩ：５０３６３２１７（配列番号７）の参照アミノ酸配列を有してもよく、またＮＭ＿０００２９５．４ ＧＩ：１８９１６３５２４の参照ヌクレオチド配列によってコードされてもよい。

カリスタチン（ＳＥＲＰＩＮＡ４、遺伝子ＩＤ５２６７）は、ＮＰ＿００６２０６．２
ＧＩ：２１３６１３０２（配列番号８）の参照アミノ酸配列を有してもよく、またＮＭ＿００６２１５．２ ＧＩ：２１３６１３０１の参照ヌクレオチド配列によってコードされてもよい。

プラスミノーゲン活性化因子インヒビター−１（ＳＥＲＰＩＮＥ１、遺伝子ＩＤ５０５４）は、ＮＰ＿０００５９３．１ ＧＩ：１０８３５１５９（配列番号９）の参照アミノ酸配列を有してもよく、またＮＭ＿０００６０２．４ ＧＩ：３８３２８６７４５の参照ヌクレオチド配列によってコードされてもよい。

プロテインＺ依存性プロテアーゼインヒビター（ＰＺＩ）（ＳｅｒｐｉｎＡ１０、遺伝子ＩＤ５１１５６）は、ＮＰ＿０５７２７０．１ ＧＩ：７７０５８７９（配列番号１０）の参照アミノ酸配列を有してもよく、またＮＭ＿０１６１８６．２ ＧＩ：１５４７５９２８９の参照ヌクレオチド配列によってコードされてもよい。

プロテアーゼネキシン１（ＰＮ１）（ＳｅｒｐｉｎＥ２、遺伝子ＩＤ５２７０）は、ＮＰ＿００１１３００００．１ ＧＩ：２４３０７９０７、ＮＰ＿００１１３０００２．１
ＧＩ：２１１９０４１５２又はＮＰ＿００６２０７．１ ＧＩ：２１１９０４１５６（配列番号１１）の参照アミノ酸配列を有してもよく、ＮＭ＿００１１３６５２８．１ ＧＩ：２１１９０４１５１、ＮＭ＿００１１３６５３０．１ ＧＩ：２１１９０４１５５又はＮＭ＿００６２１６．３ ＧＩ：２１１９０４１５０の参照ヌクレオチド配列によってコードされてもよい。

上に記載されるように変異され得るＰ１’、Ｐ１、Ｐ２及びＰ４の残基を配列番号１〜配列番号１１において太字で強調する。

ＲＣＬ中の１又は複数の変異は、改変されていない野生型セルピンと比較して改変セルピンの特異性を変更する。改変セルピンは、野生型セルピンと比べて凝血原プロテアーゼよりも抗凝固性プロテアーゼに対して増大された選択性を呈する。

ＲＣＬ内の１又は複数の変異は、他の凝固性プロテアーゼ、特にトロンビン、ｆＸａ、ｆＶＩＩａ、ｆＩＸａ及びｆＸＩａのうちの１又は複数の凝血原プロテアーゼの阻害と比較して、改変セルピンによるＡＰＣの阻害を増大することが好ましい。

例えば、改変セルピンのＲＣＬ中の１又は複数の変異は、トロンビンの阻害と比較して改変セルピンによるＡＰＣの阻害を増大し得る。トロンビンと比較してＡＰＣの選択的阻害は、ヘパリンの存在下又は不在下において増大し得る。

さらに、改変セルピンのＲＣＬ中の１又は複数の変異は、凝血原プロテアーゼｆＸａ、ｆＶＩＩａ、ｆＩＸａ及びｆＸＩａのうちの１個、２個、３個又は４個全ての阻害と比較して、改変セルピンによるＡＰＣの阻害を増大し得る。

本明細書で記載されるように改変されたセルピンは、改変されていない野生型セルピンよりも、トロンビン及び他の凝固原プロテアーゼと比較してより大きなＡＰＣの阻害を呈する。

改変セルピンは、トロンビンの阻害よりも大きなＡＰＣの阻害を示し得る。例えば、改変セルピンによるＡＰＣの阻害は、改変セルピンによるトロンビンの阻害よりも少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００、又は少なくとも１０００倍であってもよい。幾つかの実施形態では、改変セルピンは、トロンビンの阻害に対する二次速度定数よりも少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００、又は少なくとも１０００倍の二次速度定数（ｋ_２）によりＡＰＣを阻害してもよい。改変セルピンのＡＰＣに対する阻害の化学量論は１であることが好ましい。

本明細書に記載される改変セルピンは、ＡＰＣに結合して阻害し得るが、トロンビンへの結合若しくは阻害を示さないか、又は実質的にトロンビンへの結合若しくは阻害を示さないことが好ましい。

また、ＲＣＬ中の１又は複数の変異は、ｆＶＩＩａ、ｆＩＸａ、ｆＸａ及びｆＸＩａのうちの１個、２個、３個、又は４個全ての阻害と比べてＡＰＣの阻害を増大し得る。ｆＶＩＩａ、ｆＩＸａ、ｆＸａ及び／又はｆＸＩａと比較したＡＰＣの阻害は、ヘパリンの存在下又は不在下で増大され得る。

例えば、改変セルピンは、野生型セルピンよりもｆＶＩＩａ、ｆＩＸａ、ｆＸａ及びｆＸＩａのうちの１個、２個、３個、又は４個全てと比べてより大きなＡＰＣの阻害を呈し得る。

改変セルピンは、ｆＶＩＩａを阻害するよりもＡＰＣを阻害し得る。例えば、改変セルピンによるＡＰＣの阻害は、改変セルピンによるｆＶＩＩａの阻害よりも少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００、又は少なくとも１０００倍であってもよい。改変セルピンは、ｆＶＩＩａの阻害に対する二次速度定数よりも少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００、又は少なくとも１０００倍の二次速度定数（ｋ_２）でＡＰＣを阻害する。

改変セルピンは、ｆＩＸａを阻害するよりもＡＰＣを阻害し得る。例えば、改変セルピンによるＡＰＣの阻害は、改変セルピンによるｆＩＸａの阻害よりも少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００、又は少なくとも１０００倍であってもよい。改変セルピンは、ｆＩＸａの阻害に対する二次速度定数よりも少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００、又は少なくとも１０００倍の二次速度定数（ｋ_２）でＡＰＣを阻害する。

改変セルピンは、ｆＸａを阻害するよりもＡＰＣを阻害し得る。例えば、改変セルピンによるＡＰＣの阻害は、改変セルピンによるｆＸａの阻害よりも少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００、又は少なくとも１０００倍であってもよい。改変セルピンは、ｆＸａの阻害に対する二次速度定数よりも少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００、又は少なくとも１０００倍の二次速度定数（ｋ_２）でＡＰＣを阻害する。

改変セルピンは、ｆＸＩａを阻害するよりもＡＰＣを阻害し得る。例えば、改変セルピンによるＡＰＣの阻害は、改変セルピンによるｆＸＩａの阻害よりも少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００、又は少なくとも１０００倍であってもよい。改変セルピンは、ｆＸＩａの阻害に対する二次速度定数よりも少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００、又は少なくとも１０００倍の二次速度定数（ｋ_２）でＡＰＣを阻害する。

本明細書に記載される改変セルピンは、改変セルピン配列に加えて１又は複数の異種性アミノ酸配列を含む融合タンパク質の一部であってもよい。例えば、改変セルピンを含む融合タンパク質は、改変セルピンの安定性、薬物動態、ターゲッティング、親和性、精製及び生産の特性を改善する１又は複数の追加のドメインを更に含んでもよい。

好適な更なるドメインとして、免疫グロブリンＦｃドメインが挙げられる。免疫グロブリンＦｃドメインは当該技術分野でよく知られており、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインが挙げられる。ヒト免疫グロブリンＦｃドメインは、改変セルピンのＮ末端又はＣ末端に位置してもよい。

本明細書に記載される改変セルピンは、当該技術分野で標準的な合成又は組換えの技法を使用して提供され得る。

幾つかの実施形態では、改変セルピンは、例えば精製に有用な場合がある親和性タグを更に含む融合タンパク質として産生されてもよい。親和性タグは、特異的結合対の１つのメンバーを形成する異種性のペプチド配列である。タグを含むポリペプチドは、例えばアフィニティカラムにおいて、ポリペプチドに対する特異的結合対の他のメンバーの結合により精製されてもよい。例えば、タグ配列は、抗体分子によって結合されるエピトープを形成する場合がある。

好適な親和性タグとしては、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、（ＧＳＴ）、マルトース結合ドメイン（ＭＢＤ）、ＭＲＧＳ（Ｈ）_６、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（ＦＬＡＧ（商標））、Ｔ７−、Ｓ−（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ）、ポリ−Ａｒｇ（Ｒ_５〜６）、ポリ−Ｈｉｓ（Ｈ_２〜１０）、ポリ−Ｃｙｓ（Ｃ_４）ポリ−Ｐｈｅ（Ｆ_１１）ポリ−Ａｓｐ（Ｄ_５〜１６）、ＳＵＭＯタグ（InvitrogenのＣｈａｍｐｉｏｎ ｐＥＴ ＳＵＭＯ発現システム）、Ｓｔｒｅｐｔ−タグＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）、ｃ−ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、インフルエンザ−ＨＡタグ（Murray, P. J. et al (1995) Anal Biochem 229, 170-9）、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅタグ（Stammers, D. K. et al (1991) FEBS Lett 283, 298-302）、Ｔａｇ．１００（Qiagen、哺乳動物のＭＡＰキナーゼ２から誘
導される１２ａａタグ）、Ｃｒｕｚタグ０９（商標）（ＭＫＡＥＦＲＲＱＥＳＤＲ、Santa Cruz Biotechnology Inc.）及びＣｒｕｚタグ２２（商標）（ＭＲＤＡＬＤＲＬＤＲＬ
Ａ、Santa Cruz Biotechnology Inc.）が挙げられる。既知のタグ配列は、Terpe (2003) Appl. Microbiol. Biotechnol. 60 523-533に概説される。好ましい実施形態では、（Ｈ
）_６、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯタグ（InvitrogenのＣｈａｍｐｉｏｎ ｐＥＴ ＳＵＭＯ発現システム）、又はＭＲＧＳ（Ｈ）_６等のポリ−Ｈｉｓタグを使用することができる。

親和性タグ配列は、例えば部位特異的プロテアーゼを使用して、精製の後に改変セルピンから分離されてもよい。

幾つかの実施形態では、改変セルピンは、細胞から培養培地中への融合ポリペプチドの直接分泌に対する適切なシグナルリーダーペプチドに連結されてもよい。好適なシグナルリーダーペプチドの範囲は当該技術分野で知られている。シグナルリーダーペプチドはセ
ルピンシグナル配列であってもよく、又は改変セルピンに対して異種性、すなわち非セルピンシグナル配列であってもよい。例えば、α−因子分泌シグナル又はＢｉＰシグナル配列が採用されてもよい。シグナルペプチドは、上記ポリペプチドの発現後に翻訳後プロセシングによって除去されることが好ましい。

本明細書に記載される改変セルピンは、改変されていないセルピン及び他のポリペプチド及び／又は血清成分等の汚染物質を含まないという意味で単離され得る。

本明細書に記載される改変セルピンは、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）の１又は複数の活性を阻害し得る。例えば、本明細書に記載される改変セルピンは、ｆＶａ又はｆＶＩＩＩａ等の１又は複数のＡＰＣ基質のタンパク質分解による開裂を阻害し得る。例えば、改変セルピンのＡＰＣへの結合は、ｆＶａ、ｆＶＩＩＩａ及び／又は別のＡＰＣ基質のタンパク質分解による開裂の少なくとも５倍、少なくとも１０倍、又は少なくとも１５倍の減少をもたらす場合がある。幾つかの実施形態では、改変セルピンによるＡＰＣの結合では、ＡＰＣによるｆＶａ又はｆＶＩＩＩａの開裂を検出することができない場合がある。

例えばｉｎ ｖｉｔｒｏでＡＰＣ基質のタンパク質分解による開裂を測定することによるＡＰＣ活性を測定する技法は、当該技術分野で標準的であり、本明細書に記載される。ＡＰＣ活性の判定における使用に適したアッセイとして、例えば速度定数を測定する標準的な反応速度アッセイ、及びトロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）を含む凝固アッセイが挙げられる。

例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発色基質のタンパク質分解による開裂を測定することにより、凝固原プロテアーゼの活性を測定する技法は、当該技術分野で標準的であり、本明細書に記載される。プロテアーゼ活性の判定における使用に適したアッセイとして、例えば速度定数を測定するための標準的な反応速度アッセイ、及びトロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）、プロトロンビン時間アッセイ（ＰＴ）及び活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ（ａＰＴＴ）を含む凝固アッセイが挙げられる。

幾つかの実施形態では、例えばｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加することにより薬学的特性を改善するため、化学修飾によって、例えばＰＥＧ化によって、又はリポソーム中の組込みによって本明細書に記載される改変セルピンを更に改変してもよい。

本明細書に記載される改変セルピンは、改変セルピンのｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加するため１又は複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は他の部分に付着されてもよい（Cantin et al. 2002, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 27; 659-665）。例えば、改変セルピンは、モノペグ化又はポリペグ化（例えば、２〜６のＰＥＧ部分により）されてもよい。好適なペグ化方法は当該技術分野でよく知られている。

改変セルピンの凝固及び出血に対する効果を判定してもよい。好適な技法は当該技術分野で標準的である。例えば、改変セルピンのトロンビン生成に対する効果を、本明細書に記載されるトロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）又は活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ又はプロトロンビン時間アッセイを使用して判定してもよい。好適なｉｎ ｖｉｖｏモデルとして、本明細書に記載される精巣挙筋細動脈レーザー傷害モデル、ＦｅＣｌ_３頸動脈モデル及びテールクリップアッセイが挙げられる。他の好適な凝固モデルは当該技術分野でよく知られている。

本発明の他の態様は、上に記載される改変セルピンをコードする核酸及びかかる核酸を含むベクターを提供する。

好適なベクターは、選択されても構築されてもよく、プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び必要に応じて他の配列を含む、適切な調節配列を含有する。ベクターは、哺乳動物細胞において上記核酸の発現を誘導する適切な調節配列を含むことが好ましい。また、ベクターは、大腸菌（E. coli）等の細菌宿主においてその選択、発現及び複製を可能とする、複製起点、
プロモーター領域、及び選択可能なマーカー等の配列を含んでもよい。

ベクターは、必要に応じてプラスミド、ウイルス、例えばファージ、又はファージミドであってもよい。更なる詳細については、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, Russell et al., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。例えば核酸コンストラクトの作製、変異導入、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入、及び遺伝子発現における核酸の操作に関する多くの既知の技法及びプロトコルがCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds. John Wiley & Sons, 1992に詳細に記載されている。

本明細書に記載される核酸又はベクターは宿主細胞へと導入され得る。

本発明の別の態様は、上に記載される改変セルピンを含む又はそれからなるポリペプチドを発現する核酸又はベクターを含む組換え細胞を提供する。

組換え改変セルピンの産生に適した宿主細胞の範囲は当該技術分野で知られている。好適な宿主細胞として、原核細胞、特に細菌、例えば大腸菌（Escherichia coli）及びラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）の細胞、並びに、哺乳類の細胞、例えばＣＨＯ及びＣＨＯ由来の細胞株（Ｌｅｃ細胞）、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３及びＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞、両生類の細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞、昆虫細胞、例えばイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）の細胞、Ｓｆ９及びＳｆ２１、及び酵母細胞
、例えばピキア・パストリス（Pichia pastoris）の細胞を含む真核細胞を挙げることが
できる。

細胞への核酸の導入に関する技法は当該技術分野でよく確立されており、特定の状況に応じて任意の適した技法が採用され得る。真核細胞について適した技法として、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、電気穿孔法、リポソーム媒介性トランスフェクション、及びレトロウイルス又は他のウイルス、例えばアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス又はワクシニアウイルスを用いた形質導入を挙げることができる。細菌細胞について適した技法として、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔法、及びバクテリオファージを用いたトランスフェクションを挙げることができる。

当該技術分野でよく知られているように、抗生物質に耐性又は感受性の遺伝子等のマーカー遺伝子を目的の核酸を含むクローンの同定に使用してもよい。

導入された核酸は、細胞内の染色体外ベクター上にあってもよく、又は核酸は宿主細胞のゲノム中に統合されてもよい。統合は、標準的な技法に従って、核酸内での配列の包含によって促進されてもよく、又はゲノムとの組換えを促進するベクターによって促進されてもよい。

或る実施形態では、本明細書に記載される改変セルピンをコードする核酸は、個体への投与に適した、例えば遺伝子治療用途のベクターに含まれてもよい。好適なベクターとして、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びＡＡＴベクターが挙げられる。

導入に続き、核酸を発現してコードされる改変セルピンを産生してもよい。幾つかの実施形態では、コードされたセルピンポリペプチドが産生されるように、（実際に形質転換された細胞を含み得るが、どちらかといえばその細胞が形質転換細胞の子孫である可能性が高い）宿主細胞を核酸の発現のための条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏで培養してもよい。誘導性プロモーターを使用する場合、発現は誘導性プロモーターの活性化を必要とする場合がある。

改変セルピンを含む又はそれからなる発現されたポリペプチドを、産生後、単離及び／又は精製してもよい。これは、当該技術分野で知られている任意の簡便な方法を使用して達成され得る。組換えポリペプチドの精製のための技法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、又はアフィニティクロマトグラフィーが挙げられる。幾つかの実施形態では、精製は上に記載されるポリペプチドに対するアフィニティタグを使用して行われてもよい。

本発明の別の態様は、宿主細胞において上に記載される改変セルピンをコードする核酸を発現することと、任意にそのようにして産生された改変セルピンを単離及び／又は精製することとを含む、改変セルピンを産生する方法を提供する。

記載されるように産生された改変セルピンを含む又はそれからなるポリペプチドは更に調査されてもよく、例えば、薬理学的な特性及び／又は活性が特定されてもよい。タンパク質分析の方法及び手段は、当該技術分野でよく知られている。

本明細書に記載される改変セルピン、改変セルピンをコードする核酸又は改変セルピンを発現する組換え細胞は治療法において有用な可能性がある。例えば、本明細書で記載される改変セルピン、改変セルピンをコードする核酸、又は改変セルピンを発現する組換え細胞を、出血の治療のため個体に投与してもよい。

改変セルピンは単独で投与されてもよいが、改変セルピンは通常、改変セルピン、例えば改変セルピンをコードする核酸又は改変セルピンを発現する組換え細胞に加えて少なくとも１つの成分を含んでもよい医薬組成物の形態で投与される。したがって、医薬組成物は、改変セルピン、核酸又は細胞に加えて、当業者によく知られている薬学的に許容可能な賦形剤、担体、バッファー、安定化剤又は他の材料を含んでもよい。本明細書で使用される「薬学的に許容可能な」という用語は、合理的な利点／リスクの比率に見合った、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応又は他の問題若しくは合併症のない被験体（例えば、ヒト）の組織との接触における使用に適した、健全な医学的判断の範囲内の化合物、材料、組成物、及び／又は剤形に関係する。また、各担体、賦形剤等は、上記製剤の他の原料と適合性であるという意味で「許容可能」でなくてはならない。担体又は他の材料の正確な特徴は、以下に考察されるボーラス、注入、注射又は任意の他の好適な経路であってもよい投与経路に依存する。

幾つかの実施形態では、改変セルピン、核酸又は細胞は、投与に先立つ再構成用に凍結乾燥形態で提供されてもよい。例えば、凍結乾燥されたセルピンを、個体への投与に先立って滅菌水中で再構成し、生理食塩水と混合してもよい。

非経口、例えば、注射による皮下又は静脈内の投与に対して、上記改変セルピン、核酸又は細胞を含む医薬組成物は、発熱物質を含まない（pyrogen-free）、好適なｐＨ、等張性、及び安定性を有する、非経口的に許容可能な水溶液の形態であってもよい。当業者であれば、例えば塩化ナトリウム液、リンゲル液、乳酸リンゲル液等の等張ビヒクルを用いて好適な溶液を調製することが十分に可能である。防腐剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤及び／又は他の添加剤を必要に応じて利用することができ、これらには緩衝剤、例えばリ
ン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルアルコール又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルパラベン又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３’−ペンタノール；及びｍ−クレゾール等）；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリシン；グルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む、単糖、二糖及び他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウムイオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。好適な担体、賦形剤等は、標準的な医薬書、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990に見ることができる。

医薬組成物及び製剤は、簡便には単位用量の形態で提示されてもよく、薬学の技術分野でよく知られている任意の方法によって作製されてもよい。かかる方法は、改変セルピンと、１又は複数の副成分を構成する担体と合わせる（association）工程を含む。一般的
には、上記組成物は、液体担体若しくは微粉化された固体担体、又はそれらの両方と活性化合物とを均一に及び密接に合わせた後、必要に応じて製品を成形することによって作製される。

本明細書に記載される改変セルピン、核酸又は細胞は、静脈内又は皮下の投与に対する医薬組成物に製剤化されることが好ましい。

治療される状態に応じて、改変セルピン、核酸又は細胞を含む医薬組成物を、単独で又は他の治療と組み合せて、同時に又は順次のいずれかで投与してもよい。

本明細書に記載される改変セルピン、核酸又は細胞を、治療的及び予防的若しくは防止的な処置（例えば、個体において生じる状態のリスクを減じるため、その発症の遅延のため、又は発症後のその重症度を減じるための個体における状態の発症前の処置）を含むヒト又は動物の身体を治療する方法において使用してもよい。上記治療の方法は、改変セルピンを、それを必要とする個体に投与することを含んでもよい。

上記のような治療に適した個体は、哺乳類、例えば齧歯類（例えばモルモット、ハムスター、ラット、マウス）、ネズミ科動物（例えばマウス）、イヌ科動物（例えばイヌ）、ネコ科動物（例えばネコ）、ウマ科動物（例えばウマ）、霊長類、類人猿（例えばサル又はエイプ）、サル（例えばマーモセット、ヒヒ）、エイプ（例えばゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル）、又はヒトとすることができる。

幾つかの好ましい実施形態では、上記個体はヒトである。他の好ましい実施形態では、非ヒト哺乳動物、特に、ヒトにおける治療的有効性を実証するためのモデルとして従来使用される哺乳動物（例えば、ネズミ科動物、霊長目の動物、ブタ、イヌ科動物、又はウサギ動物）を採用してもよい。ヒト又はネズミ科動物のトロンビンの阻害を伴わない改変セルピンによるヒト及びネズミ科動物のＡＰＣの阻害を以下に示す。

投与は、通常「治療的有効量」又は「予防的有効量」であり、これは患者に対する利益を示すのに十分である。かかる利益は、少なくとも１つの症状の少なくとも改善であってもよい。投与される実際の量、並びに投与の速度及び時間経過は、治療される特徴及び重
症度、治療される特定の哺乳動物、個別の患者の臨床状態、障害の原因、組成物の送達部位、投与方法、投与計画、及び医師に知られている他の要因に依存する。

組成物は、治療される個体の状況に応じて単独又は他の治療と組合せて、同時又は順次のいずれかで投与され得る。

治療の処方、例えば投与量の決定等は、一般医及び他の医師の責任の範囲に含まれ、治療される疾患の症状の重症度及び／又は進行に依存する場合がある。治療用ポリペプチドの適切な用量は当該技術分野でよく知られている（Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664、Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922）。投与される医薬の種類に応じて、本明細書又はPhysician's Desk Reference（2003）に示され得る具体的な投与量を使用してもよい。改
変セルピンの治療的有効量又は好適な用量は、動物モデルにおけるそのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性及びｉｎ ｖｉｖｏ活性を比較することによって特定され得る。マウス及び他の試験動物における有効投薬量をヒトに外挿する方法が知られている。正確な用量は、改変セルピンが予防用であるのか又は治療用であるのか、治療される領域の大きさ及び位置、改変セルピンの正確な特徴、並びに改変セルピンに付着された任意の検出可能な標識又は他の分子の特徴を含む多くの要因に依存する。

典型的な改変セルピンの用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば１ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇの範囲となる。例えば、１００μｇ〜１ｇの範囲の用量を全身適用に対して使用してもよく、１μｇ〜１ｍｇを局所適用に使用してもよい。初期のより高い負荷用量に続いて、１又は複数のより低用量が投与されてもよい。これは、成人患者の１回の治療に対する用量であり、幼児及び乳児に対して比例的に調整されてもよく、また分子量に対する割合で他の改変セルピンの形式に合わせて調整されてもよい。治療は、内科医の裁量で毎日、１週間に２回、毎週又は毎月の間隔で繰り返されてもよい。或る個体に対する治療計画は、改変セルピン組成物の薬物動態学的及び薬力学的な特性、投与経路、並びに治療される状態の特徴に依存する場合がある。

治療は定期的であってもよく、投与の間の期間は、約１週間以上、例えば約２週間以上、約３週間以上、約４週間以上、約１ヶ月に１回以上、約５週間以上、又は約６週間以上であってもよい。例えば、治療は、２週間毎〜４週間毎、又は４週間毎〜８週間毎であってもよい。治療は、手術の前及び／又は後に行われてもよく、及び／又は外傷、外科処置、又は侵襲性処理の解剖学的部位に投与又は直接塗布されてもよい。好適な製剤及び投与経路は上に記載される。

幾つかの実施形態では、本明細書に記載される改変セルピンは、皮下注射として投与されてもよい。皮下注射は、例えば長期の予防／治療のため自動注入装置を使用して投与されてもよい。

幾つかの好ましい実施形態では、改変セルピンの治療的効果は、その用量に依存して数回の半減期に亘って持続する場合がある。

本明細書に記載される改変セルピンは、トロンビン等の凝血促進因子を阻害することなく又は実質的に阻害することなくＡＰＣを阻害し、出血及び出血性障害の治療、特にトロンビン生成の減少又はＡＰＣ抗凝固性経路活性の増大によって引き起こされる障害に有用な可能性がある。

止血は、傷害に対する正常な凝固反応、すなわち、例えば損傷された血管からの出血又は大出血（hemorrhage）の防止である。止血は、身体の血管からの出血又は大出血を阻止
する。改変セルピンは止血を促進する可能性があり、すなわち、改変セルピンは、身体、例えば出血性障害又は外傷を有する個体の血管からの出血及び大出血の阻止を促進又は増大し得る。

本発明の態様は、ヒト又は動物の身体の治療方法における使用に対する本明細書に記載される改変セルピン、出血を治療する又は止血を促進する方法における使用に対する本明細書に記載される改変セルピン、出血の治療又は止血の促進のための医薬の製造における本明細書に記載される改変セルピンの使用、並びに出血を治療する又は止血を促進する方法であって、それを必要とする個体に本明細書に記載される改変セルピンを投与することを含む、方法を提供する。

出血として、身体の血管からの出血又は大出血が挙げられ得る。

本明細書に記載される改変セルピンによる治療に適した個体は、出血性障害を有する場合がある。

出血性障害は、トロンビン生成の減少又はＡＰＣ抗凝固性経路の活性の増大によって引き起こされるか、又はそれらと関連する場合がある。

出血性障害として、トロンビン生成の減少、フィブリン凝固塊形成の減少又は凝固塊安定性の減少がある任意の遺伝性又は後天性の出血性障害が挙げられ得る。例えば、出血性障害として、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩ因子及び第ＸＩＩＩ因子の先天性欠乏、Ｖ及びＶＩＩＩの重複欠乏、プロトロンビン欠乏、フィブリン欠乏、並びに他の凝血因子の珍しい欠乏、血友病Ａ、Ｂ、及びＣ、線溶解亢進と関連する出血の増加、血小板数の減少又は血小板機能の減少に起因する出血の増加、並びにフォンビルブランド病が挙げられ得る。

後天性出血性障害として、大量失血と関連する希釈性凝固障害、外傷及び手術に起因する出血、並びに抗凝固療法の影響が挙げられる。

幾つかの実施形態では、個体は、外因性のｆＶＩＩＩ又はｆＩＸ等の外因性凝固因子に対して抵抗性の場合がある。例えば、外因性のｆＶＩＩＩ又はｆＩＸは個体において免疫応答、例えば抑制性アロ抗体の産生を惹起する場合がある。

本明細書に記載される改変セルピンによる治療に適した個体は、外傷、手術又は抗凝固療法と関連する出血等の後天性出血性障害を有してもよい。例えば、本明細書に記載される改変セルピンによる治療に適した個体は、外傷を受けた場合があるか、又は手術若しくは抗凝固療法を経験した若しくは経験している場合がある。好適な個体は、身体の１又は複数の血管から出血している場合がある、又は出血のリスクにある場合がある。

幾つかの実施形態では、本明細書に記載される改変セルピンは、ｉ）凝固因子アロ抗原を有する患者における出血、ｉｉ）例えば、アロ抗体の発現を回避するためインヒビター発現リスクの高い患者における出血、ｉｉｉ）インヒビター不在下の第ＶＩＩＩ因子欠乏を伴う患者における出血、ｉｖ）先天性出血性障害、例えば、重篤な第ＶＩＩ因子欠乏、第ＸＩ因子欠乏、ＶＩＩＩ及びＶの重複欠乏、第Ｘ因子欠乏及び第Ｖ因子欠乏等の現在組換えの最適な補充療法が存在しない先天性出血性障害を伴う患者における出血、ｖ）血友病の患者、例えば、補充療法が不適切若しくは利用不可能な患者における出血、又はｖｉ）外傷、手術、及び抗凝固療法に関連する出血を含む、後天性出血の予防又は治療において有用な可能性がある。

本発明の他の態様は、本明細書に記載される改変セルピンの凝血促進剤としての使用、出血の治療においてＡＰＣを阻害するための改変セルピンの使用を提供する。

本開示を考慮して、本発明の様々な更なる態様及び実施形態が当業者に明らかとなる。

本発明の他の態様及び実施形態は、「からなる（consisting of）」という用語によっ
て置き換えられる「を含む（comprising）」という用語を伴う上に記載の態様及び実施形態、並びに「から本質的になる（consisting essentially of）」という用語で置き換え
られる「を含む（comprising）」という用語を伴う上に記載の態様及び実施形態を提供する。

本出願は、文脈上別段の要求がない限り、上の態様及び上に記載される実施形態のいずれかと互いとの全ての組合せを開示すると理解される。同様に、本出願は、文脈上別段の要求がない限り、好ましい及び／又は任意の特徴の単独又は他の態様のいずれかとの全ての組合せを開示する。

上の実施形態の変更形態、更なる実施形態及びその変更形態は、本開示を読むことで当業者に明らかとなり、したがってこれらが本発明の範囲に含まれる。

本明細書で言及される全ての文書及び配列データーベース登録は、全ての目的に対してそれら全体において参照により本明細書に援用される。

本明細書で使用される場合「及び／又は」は、２つの明示された特徴又は成分の各々と他方とを含む、又は他方を含まない具体的な開示として理解される。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、各々が本明細書で個別に提示される場合と全く同じように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の具体的な開示として理解される。

ここで、本発明の特定の態様及び実施形態を、例として、また上記の図面及び下記の表を参照して解説する。

表１は、Ａ２２ ＰＣＩ（Ｎ末端トランケーションを有し、Ａｌａ２２で開始するＰＣＩ、ナンバリングはプロペプチドを含む成熟タンパク質配列を使用する）、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ（Ｐ１Ｒピッツバーグ（Ｐｉｔｔｓ）変異を含む全長α_１ＡＴ）、及びそれらのバリアントによるトロンビン及びＡＰＣの阻害に対する二次速度定数を示す。標準誤差を示す。＊ＰＣＩのＰ２ＫＰ１’バリアントによるトロンビンに対する阻害の速度定数は初期阻害の後の推定であり、反応は、潜在的にセルピンが基質経路又は共有結合性のセルピン：プロテアーゼの阻害性複合体の分離を止める（shuttled down）ことに起因し
て、完全な阻害に近づくことはなさそうである。

表２は、ヘパリンの存在下でのＰＣＩ及びバリアントによるトロンビン及びＡＰＣの阻害に対する二次速度定数を示す。標準誤差を示す。＊ＰＣＩのＰ２ＫＰ１’Ｋバリアントによるトロンビンの阻害の速度定数は、残留トロンビン活性対時間のプロットの初期傾きからの推定である。セルピンが基質経路又は共有結合性のセルピン：プロテアーゼの阻害性複合体の分離を止める可能性があるため、完全な阻害は達成されない。

表３は、α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ及びＰＣＩ、並びにそれらのバリアントによるｆＸａの阻害に対する二次速度定数を示す。標準誤差を示す。

表４は、ＰＣＩ及びＰＣＩ Ｐ２ＫＰ１’ＫバリアントによるｆＸＩａの阻害に対する二次速度定数を示す。比較のためＡＰＣ阻害を示す（表１より）。標準誤差を示す。

表５は、標的化ランダム変異導入によって作製されたＰＣＩバリアントによるトロンビン及びＡＰＣの阻害に対する二次速度定数を示す。標準誤差を示す。比較のためＷＴ及びＰ２ＫＰ１’ ＰＣＩに対する定数を示す。＊ＰＣＩのＰ２ＫＰ１’バリアントによるトロンビンに対する阻害の速度定数は初期阻害の後の推定であり、反応は、潜在的にセルピンが基質経路又は共有結合性のセルピン：プロテアーゼの阻害性複合体の分離を止めることに起因して、完全な阻害に近づくことはなさそうである。

表６は、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ及びそのＰ２ＫＰ１’ＫバリアントによるｆＸＩａの阻害に対する二次速度定数を示す。比較のためＡＰＣ阻害を示す（表１より）。標準誤差を示す。

表７は、標的化ランダム変異導入によってトロンビン阻害よりもＡＰＣ阻害に対して特異的であると判定されたＰＣＩバリアントのＲＣＬ配列の画分を示す。示される配列は、８８の変異体を判断した初期の実験に由来する。本実験において変化されたＰ４、Ｐ２及びＰ１’の残基を太字で示す。比較のためＷＴ ＰＣＩ及びＰ２ＫＰ１’Ｋ ＰＣＩの配列を示す。

表８は、標的化ランダム変異導入によってトロンビン阻害よりもＡＰＣ阻害に対して特異的であると判定されたＰＣＩバリアントのＲＣＬ配列の画分を示す。示される配列は、４６０の変異体を判断したより大規模な実験に由来する。本実験において変化されたＰ４、Ｐ２及びＰ１’の残基を太字で示す。比較のためＷＴ ＰＣＩ及びＰ２ＫＰ１’Ｋ ＰＣＩの配列を示す。

表９は、標的化ランダム変異導入によってトロンビン阻害よりもＡＰＣ阻害に対して特異的であると判定されたα_１ＡＴバリアントのＲＣＬ配列の画分を示す。ＷＴ α_１ＡＴ及びα_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓの両方と比較して配列を示す。Ｐ２残基及びＰ１’残基を太字で示し、Ｐ１残基に下線を引く。接頭辞は、Ｐ２バリアントライブラリに由来するＰ２．ｎｒと表示される変異体、Ｐ１’バリアントライブラリに由来するＰ１’．ｎｒ．と表示される変異体、及びＰ２Ｐ１’バリアントライブラリのプレート１〜５に由来する標識化された変異体１−５．ｎｒ．を含む、特定の変異体に対する起源のライブラリを示す。

表１０は、トロンビンに対するよりもＡＰＣに対してより特異的であるように標的化ランダム変異導入によって特定された、α_１ＡＴのバリアントのサブセットによるトロンビン及びＡＰＣの阻害に対する二次速度定数を示す。標準誤差が示される。比較のためＦＬ
α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋ及びＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ
Ｃ２３２Ｓによるトロンビン及びＡＰＣの阻害に対する二次速度定数を示す。

表１１は、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓバックグラウンドに対するランダム変異導入に由来するヒットによる凝血原プロテアーゼの阻害を調べるためのＰＴ及びａＰＴＴアッセイの結果を示す。アッセイに対する感受性を増すため、１／４希釈した血漿を使用してＰＴアッセイを行い、２回行われたＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ
Ｐ２ＲＰ１’Ｃに対して示される反応を除いて、３回行った。示される誤差は標準偏差である。ａＰＴＴアッセイは単独の実験であり、誤差を示していない。ＰＴ及びａＰＴＴの両方に対して、タンパク質に代えてバッファー（ＴＢＳ）を血漿に添加したバッファーのみの対照を対照として使用した。対照に関してＰＴ又はａＰＴＴの増加は、凝血原プロテアーゼの阻害の指標である。ＰＴ及びａＰＴＴアッセイの両方に対して、セルピン変異体を５μＭの濃度で使用した。比較のため、Ｐ２Ｋ変異体及びＰ１’Ｋ変異体を３回のアッセイの平均として示す。表１及び表３の阻害速度定数から示されるように、これらの変異体はトロンビンよりもＡＰＣに対して高い特異性を示すが、ｆＸａを顕著に阻害する。
したがって、これらの変異体は、トロンビン以外の凝血原プロテアーゼの阻害に良好なコンパレーター（comparator）である。ＮＤは特定されていないことを示す。

表１２は、標的化ランダム変異導入に由来するα_１ＡＴバリアントによるｆＸａの阻害に対する二次速度定数を示す。ここで評価された変異体は、トロンビンよりもＡＰＣに対して特異性、すなわち実質的なＡＰＣ阻害を示し、ＰＴの延長は示さなかった。また、大半はわずかなａＰＴＴの延長を示したに過ぎなかった。これらの特徴のため、それらのバリアントを更なる分析に対して選択した。比較のため、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ及びＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’ＫによるｆＸａ阻害も示す（表３より）。

表１３は、合理的及びランダムな変異導入による情報を合わせることによって見出されたα_１ＡＴの２つの更なる変異体の特性の要約を示す。比較のためＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ及びＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋ Ｃ２３２Ｓを示す（表１及び表３、並びに図５によるデータ）。Ｐ２ＲＰ１’Ｑ及びＰ２ＫＰ１’Ｑに対するａＰＴＴは、４つの別々の測定に対する平均であり、示される誤差は標準偏差である。バッファーを用いて血漿について得られた値を括弧で示し、ここでも標準偏差を誤差として示す。Ｐｉｔｔｓ及びＰ２ＫＰ１’Ｋについて示されるａＰＴＴは、少なくとも３つの別々の測定の結果であり、示される誤差は標準偏差である。括弧に示される値は、バッファーを用いて血漿について得られた値であり、誤差としての標準偏差と共に示される。全てのａＰＴＴは最終濃度５μＭのセルピンを使用して得られた。ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓは、この濃度で血漿を凝固することができなくする。示される３００秒の値は該アッセイに対するカットオフである。バリアントによるトロンビン、ＡＰＣ及びｆＸａの阻害に対する二次速度定数を標準誤差と共に示す。

実験
凝固カスケード及びこのカスケードにおけるセルピンの調節的役割を図１に示す。外因系カスケード（すなわち組織因子経路）及び内因系経路（接触活性化経路）の２つの経路が凝固カスケードの活性化をもたらす。活性化の主な生理学的経路は外因系経路であると考えられている。この経路では、組織因子（ＴＦ）が損傷した血管の表面に露出される。その後、ＴＦはｆＶＩＩａ及びｆＶＩＩに結合することができる。ＴＦ：ｆＶＩＩａはｆＶＩＩを活性化し、同様にＴＦ：ｆＶＩＩはＴＦ：ｆＶＩＩａへと自然に活性化する。ＴＦ：ｆＶＩＩａはｆＸをｆＸａへと活性化し、これがプロトロンビンを凝固カスケードの中心的なプロテアーゼであるトロンビン（ｆＩＩａ）へと活性化する。トロンビンはプロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）の開裂によって血小板を活性化し、フィブリノゲンをフィブリンへと開裂する。フィブリンは、それ自体がトロンビンによって活性化されるｆＸＩＩＩａにより架橋されて安定なフィブリン塊を形成する。さらに、トロンビンはそれ自体の形成を増強するポジティブフィードバック機構を活性化する。トロンビンはｆＶＩＩＩをｆＶＩＩＩａへと活性化し、ｆＶをｆＶａへと活性化する。ｆＶＩＩＩａはｆＩＸａに結合して内因系テナーゼ（Ｘａｓｅ）複合体を形成する。内因系ＸａｓｅはｆＸをより活性化する。このｆＸａはｆＶａに結合してプロトロンビナーゼを形成することができる。プロトロンビナーゼはプロトロンビンをトロンビンへと活性化し、凝固の開始後に生成されるトロンビンの大半を担う。トロンビンのポジティブフィードバック機構に加えて、トロンビンはネガティブフィードバック機構によってそれ自体の活性化を停止することもできる。トロンビンがその補因子であるトロンボモデュリン（ＴＭ）に結合すると、トロンビン：ＴＭ複合体がプロテインＣ（ＰＣ）を活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）へと活性化することができる。ＡＰＣは開裂し、ｆＶＩＩＩａ及びｆＶａの両方を不活性化し、トロンビン生成を効果的に停止する。セルピンは凝固カスケードの重要なインヒビターである。セルピンプロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）、抗トロンビン（ＡＴＩＩＩ）、ヘパリ
ン補因子ＩＩ（ＨＣＩＩ）及びα_１−抗トリプシン（α_１ＡＴ）の阻害作用を図１に示す。

以下に本発明者らは、血友病等の出血性障害の治療における凝血促進剤（治療、予防、バイパス又は相乗）としての使用に対する、セルピンのＡＰＣの特異的インヒビターへの変換を説明する。本明細書で記載されるＰＣＩ及びα_１ＡＴの両方に対する修飾は、これらのタンパク質におけるわずかな変化が特異的ＡＰＣインヒビターを作製するため使用することができることを原理の証明として示す。

当初、ＰＣＩはＡＰＣの生理学的インヒビターとして説明されたため、これらの調査に対する開始点としての役割を果たした（Suzuki et al, 1983; 1984）。しかしながら、ＰＣＩは乱雑であり、またトロンビン、トロンビン：ＴＭ、ｆＸＩａ、ｆＸａ及びＴＦ：ｆＶＩＩａも阻害する（Elisen et al, 1998、Mosnier et al, 2001、Suzuki et al, 1984
、Fortenberry et al, 2011、Meijers et al, 1988）。結果として、ＰＣＩは凝血促進剤及び抗凝血剤の両方として機能することができる。ＰＣＩの活性は、ヘパリン及びヘパラン硫酸等のグリコサミノグリカンに結合することによって調節される（Pratt & Church, 1992、Pratt et al, 1992、Li & Huntington, 2008）。凝固カスケードにおけるＰＣＩの役割の概要については図１を参照されたい。

α_１ＡＴは好中球エラスターゼの天然インヒビターである（Kalsheker, 1989）。Ａｒ
ｇ又はＬｅｕのいずれかをＰ１に有する凝固カスケードの他のセルピンと異なり、α_１ＡＴは代わりにＭｅｔを有する。これは、α_１ＡＴを凝固プロテアーゼの非常に乏しいインヒビターとする。それにもかかわらず、血漿中の高濃度のα_１ＡＴのため、α_１ＡＴは生理学的に有意な程度までＡＰＣを阻害すると考えられている（Heeb & Griffin, 1988）。Ｐ１残基の変異導入は、Ｐ１におけるＡｒｇ又はＬｅｕの使用がα_１ＡＴによる凝固プロテアーゼの阻害を大幅に改善することを示した（Heeb et al, 1990）。これは、重篤な出血性障害を引き起こすα_１ＡＴのピッツバーグ（Ｍ３５８Ｒ（Ｐ１Ｒ）、Ｐｉｔｔｓ）バリアントによって説明される（Owen et al, 1983）。

凝血原プロテアーゼよりもＡＰＣの阻害に特異的なセルピンを開発するため、ＰＣＩ及びα_１ＡＴのピッツバーグ（Ｐ１Ｒ、α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ）をテンプレートセルピンスカフォールドとして使用した。この研究で使用したタンパク質は全て、ｐＥＴＳＵＭＯ発現ベクター（Invitrogen）を使用する大腸菌培養物（NovagenのＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ
３）ｐＬｙｓＳ）から発現され、Ｎｉクロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、またＰＣＩの場合はヘパリンアフィニティクロマトグラフィーの組み合せを使用して精製した。ＳＵＭＯプロテアーゼの開裂によって実質的にＳＵＭＯタグを除去し、α_１ＡＴのピッツバーグ（Ｐｉｔｔｓ、Ｐ１Ｒ）に対するタンデムＮｉ−アニオン交換クロマトグラフィー、及びＰＣＩに対するタンデムアニオン交換−ヘパリンクロマトグラフィーによってタグを除去した。ＰＣＩコンストラクトはＮ末端が切断され、Ａｌａ２２で開始する（Ａ２２、プロペプチドから開始する、成熟タンパク質配列に従って番号を付する）。α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ（Ｐ１Ｒ）コンストラクトは全長（ＦＬ）であり、発現及び精製の間の分子間のジスルフィド結合形成及び他の修飾を消滅させるため更なるＣ２３２Ｓ変異を有する（Yamasaki et al, 2011）。使用した発現ベクターに起因して、α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓコンストラクトはその第１の残基としてＧｌｕ（Ｅ）に代えてＳｅｒ（Ｓ）を有する。Ｃ２３２Ｓ変異及びＥ１Ｓ変異は、α_１ＡＴの活性を変更するとは予想されていない。

様々な位置でＰＣＩ及びα_１ＡＴのピッツバーグのＲＣＬへとＬｙｓ残基を導入し、得られた変異体をトロンビン及びＡＰＣの阻害について試験した。この研究の初期段階では、ＡＰＣ阻害を選択して一旦トロンビン阻害が消滅されたという前提に基づき、他の凝固
プロテアーゼのインヒビターによる阻害についてスクリーニングも試験も行わず、他の凝固プロテアーゼに対して顕著な残留阻害活性を有した場合に上記インヒビターを更に改変する可能性があった。セルピンに対するSchechter-Berger命名法に従ってＲＣＬ残基に番号を付した（Schechter & Berger, 1967）。

プロテアーゼよりも過剰のセルピンを使用して擬一次条件下でトロンビン及びＡＰＣの阻害の速度定数を測定した（表１）。セルピン及びプロテアーゼを様々な長さの時間に亘って共にインキュベートし、プロテアーゼに対する過剰な発色基質（トロンビンに対してＳ２２３８、及びＡＰＣに対してＳ２３６６）を添加することによって残留活性を特定した。その後、残留プロテアーゼ活性を４０５ｎｍの吸光度に従って測定した。時間に対する残留プロテアーゼ活性のプロットは、実測速度定数ｋ_ｏｂｓを与えた。二次速度定数ｋ_２は、ｋ_ｏｂｓ対セルピン濃度のプロットの傾きである（線形回帰モデルを使用して適合させた）。傾きの標準誤差を示す。

Ｐ２及びＰ１’に導入されたリジン変異は、表１に示される全てのバリアントについてトロンビンよりもＡＰＣに対するＰＣＩ及びα_１ＡＴの特異性を増すことに非常に有効であった。概してトロンビン阻害は全ての場合で大きく減少した。ＡＰＣ阻害もまた全ての変異体について減少したが、同程度ではなかった。いずれのセルピンも当初はＡＰＣよりもトロンビンを良好に阻害した。これは試験した全ての変異体について逆転した。

α_１ＡＴと異なりＰＣＩはヘパリンに結合し、この結合はトロンビン及びＡＰＣのＰＣＩによる阻害を著しく増大する（Pratt & Church, 1992）。しがたって、本発明者らは、表１に見られる特異性の交換が持続するかどうかを見るため、ヘパリンの存在下においてＰ１’Ｋ変異体及びＰ２ＫＰ１’Ｋ ＰＣＩ変異体によるトロンビン及びＡＰＣの阻害を試験した。プロテアーゼよりも過剰なＰＣＩを使用して擬一次条件下で速度定数を測定した。実験に先立って、ＰＣＩを等モル濃度の未分画ヘパリンと共に３０分間予めインキュベートした。ＰＣＩ：ヘパリン及びプロテアーゼを変動する時間に亘って共にインキュベートし、ポリブレンと混合したプロテアーゼがヘパリンと結合するように過剰な発色基質の添加によって、幾つかの時間点後の残留活性を特定した。時間に対する残留プロテアーゼ活性のプロットは、実測速度定数ｋ_ｏｂｓを与えた。二次速度定数ｋ_２は、ｋ_ｏｂｓ対セルピン濃度のプロットの傾きである（線形回帰モデルを使用して適合させた）。傾きの標準誤差を示す。Ｐ２ＫＰ１’Ｋ ＰＣＩによるトロンビンの阻害について計算された値は、完全な阻害は達成されないことをグラフが示唆するように、残留トロンビン活性対時間のプロットの初期の傾きからの推定であった。これは、基質経路又は複合体の解離に起因する可能性がある。二次速度定数を表２に示す。ヘパリンの不在下での阻害について、ＷＴタンパク質と異なり、ＰＣＩのＰ１’Ｋ変異体及びＰ２ＫＰ１’Ｋ変異体はトロンビンよりもＡＰＣに対して特異的であった（表２）。

これらの実験は、セルピンＲＣＬに唯一又は２つの改変を導入することは、補因子の存在下と不在化のいずれにおいてもトロンビンの阻害を消滅させるか、又は大きく減少するのに十分であったことを示した。ＡＰＣの阻害は減少されたものの、特にヘパリンの存在下におけるα_１ＡＴのバリアント及びＰＣＩバリアントに対してかなりの阻害であった。しかしながら、ＰＣＩ及びα_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓの特異性はトロンビン及びＡＰＣに限定されない。これらのセルピンはいずれも別の凝血原プロテアーゼであるｆＸａも阻害する。また、凝固を阻害しないように、本発明者らのバリアントはｆＸａよりもＡＰＣに対して特異性である必要がある。したがって、本発明者らは、ＰＣＩ及びα_１ＡＴ、並びにそれらのバリアントのｆＸａに対する阻害の速度定数を特定した（表３）。プロテアーゼよりも過剰なセルピンを使用し、擬一次条件下で速度定数を測定した。セルピン及びプロテアーゼを変動する時間に亘って共にインキュベートし、残留活性をプロテアーゼに対して過剰な発色基質（Ｓ２２２２）を添加することによって特定した。時間に対する残留プロ
テアーゼ活性のプロットは、実測速度定数ｋ_ｏｂｓを与えた。二次速度定数ｋ_２は、ｋ_ｏｂｓ対セルピン濃度のプロットの傾きである（線形回帰モデルを使用して適合させた）。傾きの標準誤差を示す（表３）。

トロンビンについて先に見られるように、ＷＴ ＰＣＩはＡＰＣよりも良好にｆＸａを阻害した。α_１ＡＴ ＰｉｔｔｓはｆＸａよりも良好にＡＰＣを阻害したが、ｆＸａの阻害はなおもかなりあった。ｆＸａの阻害は、Ｐ１’Ｋ ＰＣＩ、Ｐ２Ｋ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ及びＰ１’Ｋ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓに対してなおも顕著であった（表３）。α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ及びＰＣＩのＰ２ＫＰ１’Ｋバリアントはいずれも、ｆＸａの阻害がないか、又は無視することができる程度であり、ｆＸａよりもＡＰＣに対して非常に特異的であったため、有力候補とされた。また、ＰＣＩのＰ１’Ｋバリアントも、そのｆＸａの阻害がヘパリンの不在下では非常に遅いことから関心が持たれる。ヘパリンの存在がＡＰＣ阻害の速度を著しく加速し、ＡＰＣに有利な特異性の比率を歪ませる可能性があった。

ＰＣＩの有力化合物を最初に考察した後、α_１ＡＴの有力化合物を考察する。

より複雑な血漿系におけるＡ２２ Ｐ２ＫＰ１’Ｋ ＰＣＩの特性を調べ、凝血原プロテアーゼに対するいかなる悪影響も排除するため、プロトロンビン時間アッセイ（ＰＴ）を行った。このアッセイは、外因系経路により凝固が開始された後に血漿中で凝固塊が形成されるまでの時間を測定する。Ａ２２ ＷＴ ＰＣＩは凝固時間のわずかな増加を示したのに対し、Ｐ２ＫＰ１’Ｋはより少ない増加を示し、凝血原プロテアーゼに対する阻害活性の減少と一致していた（図２）。

さらに、本発明者らは、凝固の接触活性化経路に対するＰＣＩ変異のいかなる影響も排除したかった。そのため、ｆＸＩａの阻害に対する阻害の速度定数を測定し、ａＰＴＴアッセイを行った。このアッセイは、内因系経路によって開始される凝固を測定すること以外はＰＴアッセイに類似する。

プロテアーゼよりも過剰なセルピンを使用する擬一次条件下において、ＰＣＩ及びＰ２ＫＰ１’ＫバリアントによるｆＸＩａの阻害に対する阻害の二次速度定数を測定した。セルピン及びプロテアーゼを変動する時間に亘って共にインキュベートし、プロテアーゼに対して過剰な発色基質（Ｓ２３６６）を添加することによって残留活性を特定した。時間に対する残留プロテアーゼ活性のプロットは実測速度定数ｋ_ｏｂｓを与えた。二次速度定数ｋ_２はｋ_ｏｂｓ対セルピン濃度のプロットの傾きである（線形回帰モデルを使用して適合された）。傾きの標準誤差を示す。潜在的にプロテアーゼによるセルピンの開裂に起因して、Ａ２２ Ｐ２ＫＰ１’Ｋ ＰＣＩによるｆＸＩａ阻害は、一連の実験に亘って完了することはなかった。ＷＴと比較して、Ｐ２ＫＰ１’Ｋ変異体はｆＸＩａに対してより一層減少した阻害、及びｆＸＩａに対するよりもＡＰＣに対してより大きな特異性を示した（表４）。

ａＰＴＴアッセイは、ＷＴ ＰＣＩが接触活性化経路の強力なインヒビターであり、ｆＸＩａ又はｆＸＩＩａの阻害に起因する可能性があることを示した（図３）。Ｐ２ＫＰ１’Ｋ変異体はａＰＴＴにおいてわずかな増加を示した。しかしながら、接触活性化経路が主にｆＩＸａ活性化による凝固を活性化することから、わずかな接触活性化の阻害は、血友病患者が接触活性化の主な標的（ｆＩＸ）又はその補因子（ｆＶＩＩＩ）のいずかを欠乏することから、血友病患者においては顕著ではない可能性が高い。

したがって、本明細書で示される結果は、今のところＡ２２ Ｐ１’Ｋ ＰＣＩ及びＡ２２ Ｐ２ＫＰ１’Ｋ ＰＣＩの両方が血友病の治療用バイパス止血剤への開発に対する有望なＡＰＣ特異的な有力化合物であることを示す。

トロンビンよりもＡＰＣに対して特異性を有する追加のＰＣＩ変異体を作製するため、ＰＣＩスカフォールドに対して標的化ランダム変異導入戦略を用いた。標的化した残基はＰ４、Ｐ２及びＰ１’であった。ランダムなアプローチは、９６ウェルフォーマットにおけるＰＣＩ発現の後に溶菌液の阻害活性を試験することによる、ＡＰＣ阻害に対する及びトロンビン阻害に対する選択に基づく。

上に概略を述べた特異性に対する試験と合せた合理的変異導入により作製された最も特異的なＰＣＩ変異体、すなわちＡ２２ Ｐ２ＫＰ１’Ｋ ＰＣＩを使用して、上記アッセイを較正した。ＷＴ ＰＣＩを追加の対照として使用した。トロンビンの阻害に対する負の選択は、Ａ２２ ＷＴ ＰＣＩが完全な阻害を示すような時間に亘って溶菌液をインキュベートすることによって達成され、より小さな阻害に対する選択もするため該インキュベーション期間をその時間点から延長した。ＷＴ及びＰ２ＫＰ１’Ｋ ＰＣＩの両方がＡＰＣ阻害活性の中間範囲に含まれるようにＡＰＣ阻害に対する正の選択を較正し、これにより本発明者らが阻害の増加及び減少の両方を判定することができた。

初期のアッセイでは、８８のバリアントをトロンビン及びＡＰＣの阻害活性についてスクリーニングした。９６ウェルプレートで培養物を成長させ、誘導し、タンパク質発現を行った。溶解バッファーの添加によって細胞を溶解し、トロンビンについて１時間、ＡＰＣについて３０分間に亘って溶解物をプロテアーゼと共にインキュベートすることにより、トロンビン及びＡＰＣに対する阻害活性について溶解物をアッセイした。その後、プロテアーゼに対する発色基質の添加により残留プロテアーゼアッセイを読んだ。Ａ２２ ＷＴ ＰＣＩ及びＡ２２ Ｐ２ＫＰ１’Ｋ ＰＣＩを対照として使用した。Ｐ２ＫＰ１’Ｋ
ＰＣＩと比較して、より高い又は同等の残留トロンビン活性、及びより低い又は同等の残留ＡＰＣ活性を有する任意の溶解物を有望なＡＰＣ特異的候補とした。これらの配列を表７に示す。Ｐ４位、Ｐ２位及びＰ１’位を太字で示す。

この一組の実験による最も大きなＡＰＣ阻害活性を有する変異体（Ｄ８；Ｐ４ＱＰ２ＲＰ１’Ｎ）を予備的な様式で特性評価し、Ｐ２ＫＰ１’Ｋと異なる変異を利用するが、トロンビンよりもＡＰＣの阻害に対してより特異的であることが示された（表５）。これは、既に記載された変異と同等の効果を有し得るセルピンＲＣＬにおいて、更なる変異を作製することができることを示した。

より大きなデータセットを作製するため、更に４６０の変異体を陽性及び陰性の選択アッセイの両方においてスクリーニングした。５つの９６ウェルプレートにおいて培養物を成長させ、誘導し、タンパク質発現を行った。溶解バッファーの添加により細胞を溶解し、その溶解物をトロンビンについて１時間、ＡＰＣについて３０時間に亘ってプロテアーゼと共にインキュベートすることにより、トロンビン及びＡＰＣに対する阻害活性について該溶解物をアッセイした。その後、プロテアーゼに対する発色基質（トロンビンに対してＳ２２３８、ＡＰＣに対してＳ２３６６）の添加により残留プロテアーゼ活性を読んだ。Ａ２２ ＷＴ ＰＣＩ及びＡ２２ Ｐ２ＫＰ１’Ｋ ＰＣＩを対照として使用した。Ｐ２ＫＰ１’Ｋ ＰＣＩと比較してより高い又は同等の残留トロンビン活性及びより低い又は同等の残留ＡＰＣ活性を有する任意の溶解物を、有望なＡＰＣ特異的候補とした。このデータセットより、Ｐ２ＫＰ１’Ｋよりも良好なＡＰＣの阻害を示し、より不良又は同等のトロンビンの阻害を示したセルピンについてコロニーを選択して配列を決定し、これらのセルピンが実際に真のヒットであり疑陽性ではないことを検証するため、同じアッセイにおいてこれらのセルピンを３回再試験した。この再試験より、初期スクリーンで見出された１７の変異体のうち１５の一連の変異体をＰ２ＫＰ１’ＫよりもＡＰＣの阻害においてより良好であるか又は同等であり、トロンビンの阻害においてより不良であるか又は同等であると決定した（表８）。再試験後に陽性であったバリアントの配列を表８に示す。
興味深いことに、ランダム変異導入は、Ｐ２位及びＰ１’位における正電荷を持つ残基の有利な効果を確認した。しかしながら、代替的なＲＣＬ組成物も見出された。

プロテアーゼよりも過剰のセルピンを使用する擬一次条件下において、ランダム変異導入ＰＣＩバリアントによるトロンビン及びＡＰＣの阻害に対する予備的な二次速度定数を測定した。セルピン及びプロテアーゼを変動する時間に亘って共にインキュベートし、プロテアーゼに対して過剰の発色基質を添加することによって残留活性を特定した。時間に対する残留プロテアーゼ活性のプロットは実測速度定数ｋ_ｏｂｓを与えた。二次速度定数ｋ_２は、ｋ_ｏｂｓ対セルピン濃度のプロットの傾きである（線形回帰モデルを使用して適合された）。比較のためＷＴ及びＰ２ＫＰ１’Ｋを示す。速度定数を表５に示す。示される誤差は傾きの標準誤差である。

ランダム変異導入アッセイから選択された変異体のうちの幾つかの予備的な特性評価は、選択された変異体がＰ２ＫＰ１’Ｋ ＰＣＩに対して少なくとも機能的に同等であり、幾つかはわずかに改善されたＡＰＣ阻害の速度を有したことを示した（表５）。これらの実験は、Ｐ２ＫＰ１’ＫがＡＰＣ特異的セルピンを生成するために利用可能であった唯一の組成物ではないことを強く示唆する。

表１及び表３に示される速度定数によるα_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓに基づく主な有力化合物は、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋであった。この変異体はトロンビンを阻害することは示されておらず、ｆＸａを徐々に阻害するに過ぎなかったが、ＡＰＣ阻害を保持した（表１及び表３）。

より複雑な血漿系におけるこの変異体の特性を調査し、凝血原プロテアーゼに対するいかなる悪影響も排除するため、プロトロンビン時間アッセイ（ＰＴ）を行った。このアッセイは、外因系経路により凝固が開始された後の凝固塊形成までの時間を測定する。予測したように、抗凝固剤α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓは、そのトロンビン及びｆＸａの阻害に起因して、凝固時間の増加を示した（図４）。対照的に、α_１ＡＴ ＰｉｔｔｓのＰ２ＫＰ１’Ｋ変異体は凝固時間の増加を示さず、したがってこのアッセイにおける正常な凝固を干渉しなかった。

上記データは、今のところ、α_１ＡＴ ＰｉｔｔｓのＰ２ＫＰ１’Ｋ変異体が外因系（組織因子）経路又は凝固の一般的経路のいずれにおいても凝血原プロテアーゼを干渉しなかったことを示した。さらに、本発明者らはＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋが内因系（接触活性）経路に影響を及ぼすかどうかを判定したいと考えた。プロテアーゼよりも過剰のセルピンを使用する擬一次条件の下、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ及びＰ２ＫＰ１’ＫのバリアントによるｆＸＩａの阻害の二次速度定数を測定した。セルピン及びプロテアーゼを変動する時間に亘って共にインキュベートし、プロテアーゼに対する過剰な発色基質（Ｓ２３６６）の添加によって残留活性を特定した。時間に対する残留プロテアーゼ活性のプロットは、実測速度定数ｋ_ｏｂｓを与えた。二次速度定数ｋ_２は、ｋ_ｏｂｓ対セルピン濃度のプロットの傾きである（線形回帰モデルを使用して適合された）。傾きの標準誤差を示す。

ｆＸＩは接触活性化経路の間に活性化され、ｆＩＸを活性化することによって凝固の一般的な経路へと入る。さらに、ｆＸＩはトロンビンによって一旦凝固が開始されると活性化される。ｆＸＩａはＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓによってかなりの程度阻害されたが、この阻害はＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋについて大きく減少された（表６）。

α_１ＡＴ ＰｉｔｔｓのＰ２ＫＰ１’Ｋ変異体によるｆＸＩａの阻害がわずかに検出さ
れたことから、ｆＸＩＩａに対するあらゆる可能性のある悪影響を特定するため、本発明者らはａＰＴＴアッセイを更に行った。このアッセイは、凝固の内因系経路によって開始された凝固を測定する以外はＰＴアッセイに類似する。それによりａＰＴＴを使用して、ｆＸＩａ及び凝固の接触活性化経路に対するあらゆる悪影響を検出することができた。このアッセイでは、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓと共にインキュベートした血漿は、０．６７μＭのセルピンを用いた１つの反応以外は上記アッセイの時間内に凝固しなかった（図５Ａ）。ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋは、凝固時間のわずかな増加を示したが、用量依存性の増加はなかった（図５Ｂ）。これは、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’ＫのｆＸＩａ阻害活性は非常に遅い可能性が高いため、接触活性化経路に顕著に影響を及ぼさないことを示す。さらに、接触活性化経路はｆＩＸａの活性化によって凝固カスケードを活性化する。血友病患者はｆＩＸ又はその必須の補因子であるｆＶＩＩＩのいずれかを欠くことから、血友病患者における接触活性化経路のわずかな阻害の役割は最小である可能性が高い。

α_１ＡＴ ＰｉｔｔｓのＰ２ＫＰ１’Ｋ変異体が血漿系においてＡＰＣを阻害することができたかどうかを調べるため、本発明者らは改良したトロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）を使用した。組換え可溶性トロンボモデュリン（ＴＭ）の存在下及び不在下において、ヒトのプールした正常血漿（ＮＰ）中におけるトロンビン生成を測定した。このＴＭはＨＥＫ−ＥＢＮＡ発現系から発現され精製され、可溶性細胞外ドメインを含む。ＴＭは、生理学的には膜貫通タンパク質であることから通常はＴＧＡに存在せず、内皮膜上に存在し、血漿にはほとんど存在しない。したがって、ＰＴアッセイ及びａＰＴＴアッセイ等の通常のＴＧＡ又は血漿を利用する他の凝固アッセイにおけるＰＣ経路の活性化はない。上記アッセイにＴＭを添加することはＰＣ活性化を可能とし、それによってｉｎ ｖｉｖｏにおけるトロンビン生成の更なる現実感を与える可能性がある。図６及び図７に示されるアッセイを、George King Biomedical製のプールした正常なヒト血漿（ＮＰ）において行った。外因系経路による凝固を活性化するため、ＣａＣｌ_２及びＴＦ／リン脂質（Technoclone製のＲＢ ｌｏｗ ＴＦ及びリン脂質試薬）の添加により凝固を開始した。蛍光発生
基質（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）の開裂によりトロンビン生成を測定した。Ｔｅｃｈｎｏｔｈｒｏｍｂｉｎ較正キット（Technoclone）を使用して、既知濃度のトロ
ンビンに対して蛍光単位を較正することにより、蛍光単位をトロンビン濃度に変換した。

プールした正常な血漿へのＴＭの添加は、濃度依存的な方式でトロンビン生成を減少した。この実験より、本発明者らは、中間レベル（１．２５ｎＭのＴＭ最終アッセイ濃度）又は低レベル（１０ｎＭのＴＭ最終アッセイ濃度）のいずれかまでトロンビン生成をノックダウンするため２つのＴＭの濃度を選択した。ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋの血漿においてＡＰＣを阻害する能力を評価するため、後のアッセイにおいてこれらの濃度を使用した。

正常ヒト血漿（ＮＰ）へのＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓの添加は、使用した全ての濃度においてトロンビン生成を減少し、これはトロンビン及びｆＸａの阻害による可能性が高い（図６）。対照的には、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’ＫはＴＭの不在下ではＮＰに対して何らの影響も有しなかった（図７Ａ）。しかしながら、ＴＭの存在下では、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋは用量依存的にトロンビン生成を補助した（図７Ｂ〜図７Ｄ）。この効果は、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’ＫによるＡＰＣの特異的阻害の結果である。

ｆＶＩＩＩ欠乏又はｆＩＸ欠乏の血漿において同じ実験を行うため、ベースライン条件（ＲＢ誘発のみ）では因子欠乏血漿においてトロンビン生成を検出することができないことから、上記アッセイを開始するために使用される組織因子（ＴＦ）の量を増加する必要
があった。トロンビン生成に対するＴＦにおける増加の影響を実証するため、ベースライン条件において上記アッセイを誘発するため使用されるＲＢ試薬に加えてＴＦ試薬の種々の希釈液（Siemens製のＤａｄｅ Ｉｎｎｏｖｉｎ）を用いて反応をスパイクした。Ｉｎ
ｎｏｖｉｎ試薬におけるＴＦの濃度は製造業者によって開示されていないが、以前の測定からおよそ７．３６ｎＭであることが分かっている（Duckers et al, 2010）。ＴＦ誘発
を増大することは遅延時間を短縮し、ヒトＮＰ、ｆＶＩＩＩ欠乏（ＨＡ）及びｆＩＸ欠乏（ＨＢ）の血漿におけるピークトロンビン及び内因性トロンビン活性（ＥＴＰ）の両方を増大した。これらの実験より、本発明者らは、トロンビン生成を開始するため最終反応において１：４０００のＩｎｎｏｖｉｎ希釈率を選択した。上記アッセイにリン脂質を添加する必要があるため、リン脂質及びＴＦの両方を含有するＲＢ試薬を添加した。

因子欠乏血漿の使用はアッセイパラメーターの修正を必要とするため、本発明者らは、１：４０００のＩｎｎｏｖｉｎの添加によるヒトＨＡ血漿におけるヒトの正常なプールされた血漿に対してＴＭ滴定実験を繰り返した。上記アッセイをGeorge King Biomedical製のヒトｆＶＩＩＩ欠乏血漿（ｆＶＩＩＩ活性１％未満）において行った。外因系経路による凝固を活性化するため１：４０００の最終希釈率のＤａｄｅ Ｉｎｎｏｖｉｎ（Siemens）を含むＣａＣｌ_２及び／又はＴＦ／リン脂質（Technoclone製のＲＢ ｌｏｗ ＴＦ及びリン脂質試薬）の添加により凝固を開始した。蛍光発生基質（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）の開裂によりトロンビン生成を測定した。Ｔｅｃｈｎｏｔｈｒｏｍｂｉｎ較正キット（Technoclone）を使用して、既知濃度のトロンビンに対して蛍光単位を較正
することにより、蛍光単位をトロンビン濃度に変換した。トロンボモデュリン（ＴＭ）は、ｆＶＩＩＩ欠乏血漿（ＨＡ）におけるトロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）でトロンビン生成を減少することが分かった。

この実験より、１．２５ｎＭ及び５ｎＭのＴＭを後の実験のため選択した。主に使用した上記アッセイ条件におけるＨＡ血漿中での総トロンビン生成がより低かったため、使用した高いＴＭ濃度はＮＰに対するよりも低かった。

ＨＡ及びＨＢの血漿に対するＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ及びＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋの両方の効果は、プールしたＮＰによる結果に匹敵した。ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓは、ＨＡ血漿（ｆＶＩＩＩ欠乏）及びＨＢ血漿（ｆＩＸ欠乏）の両方におけるＴＭの存在下及び不在下でのトロンビン生成を阻害した（図８）。ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋは、ｆＶＩＩＩ欠乏及びｆＩＸ欠乏の血漿の両方におけるトロンビン生成に対するＴＭの効果を補助することができ、ＴＭの不在下で何らの影響も有しなかった（図９及び図１０）。これは、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’ＫがＡＰＣを阻害することができ、因子欠乏血漿における凝血促進効果を有することを示す。これは、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋが凝固塊形成を促進する可能性があり、血友病患者における出血を軽減し得ることを意味する。この凝血促進効果の大きさは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるトロンビン生成の減少に対するプロテインＣ系の相対的な寄与によって特定される。本明細書に示されるこのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を使用して、この変異体のｉｎ ｖｉｖｏのおおよその有効性を予測することができないが、複雑な血漿系において、ＦＬ
α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’ＫがＡＰＣを阻害することができ、凝血促進経路に干渉しないこと、またこれらの効果がｆＩＸ及びｆＶＩＩＩの存在又は不在と独立していることを確かに示している。

本発明者らは、本発明者らのｉｎ ｖｉｔｒｏデータを検証するため、ｉｎ ｖｉｖｏの血友病のマウスモデルを使用したいと考えた。しかしながら、ヒトα_１ＡＴのマウス血漿に対する効果がヒト血漿において見られる効果に匹敵し得ることを検証するため、本発明者らはマウス血漿において最初にＴＧＡを行った。これを修正したＴＧＡプロトコルを
使用して行った（Bunce et al, 2011; Ivanciu et al, 2011）。標準的な条件下でＴＧＡアッセイを妨げるマウス血漿中の阻害タンパク質の濃度の増加のため、これらの改変が必要であった（Tchaikovski et al, 2007、Bunce et al, 2011、Ivanciu et al, 2011）。
ヒトの系と同様に、アッセイのベースライン条件の下でＨＢマウス血漿におけるトロンビン生成はなかった。したがって、本発明者らは異なる濃度のＩｎｎｏｖｉｎにおける滴定スパイク（titration spiking）を行った。後のアッセイのため１：１２０００のＩｎｎ
ｏｖｉｎの濃度を選択した。

ネズミ科動物のＴＭを入手することができなかったため、本発明者らは、マウスＴＧＡアッセイにおいてＡＰＣ形成を促進するためヒト血漿ＴＧＡにおいて使用した可溶性ヒトＴＭを使用した。ＨＢマウス血漿中のヒトＴＭのあらゆる影響を見るために必要な濃度は、ヒト血漿で見られるよりも約１００倍高かった。これは、ヒトＴＭノックインマウスがネズミ科動物ＰＣを活性化する能力の減少を示すという観察によって説明され得る（Raife et al, 2011）。これは、ヒトＴＭがネズミ科動物ＴＭよりもネズミ科動物ＰＣ活性化
を促進する作用が弱いことを示す。７５０ｎＭの濃度のヒトＴＭを後の実験で使用した。

その後、種々の濃度のＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ及びＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋの両方を、これらの変異体のマウス血漿における効果を先のヒト血漿におけるＴＧＡの結果と比較するため、ＴＭの不在下及び存在下の両方において、マウスＨＢ血漿で規定された条件に対して添加した。

ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓは、ヒト血漿で見られるように、ＴＭの不在下でマウスＨＢ血漿においてトロンビン生成を減少した（図１１Ａ）。しかしながら、ＴＭの存在下では、最も低濃度のα_１ＡＴにおいて、トロンビン生成の部分的な補助があった（図１１Ｂ）。これは、ヒトにおいて見られる速度と比較して、生成されたＡＰＣがトロンビン阻害に先立って阻害されるように、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓによるネズミ科動物トロンビン及びネズミ科動物ＡＰＣに対する阻害の相対的速度の差に起因する可能性がある。ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓの濃度が、全てのＡＰＣが阻害されたレベルまで増大されると、トロンビンも阻害される。これは、図１１Ｂに見られる結果を説明し得るが、更に調査をしなかった。ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋは、ヒト血漿で行ったように、ＨＢマウス血漿においてＴＭ添加によってトロンビン生成ノックダウンを補助した（図１１Ｄ）。しかしながら、ＴＭの不在下でＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’ＫをＨＢマウス血漿に添加した場合、トロンビン生成の増大も観察された（図１１Ｃ）。この効果は、これらの実験で採用された採血方法に関連する可能性がある。血漿を採取するため、尾部を切断し、クエン酸中に血液を採取した。その後、これを遠心沈殿させて血漿を除去し、凍結した。採血のため負わせた傷害は凝固系の活性化をもたらし、実験に先立って血漿中にＡＰＣの生成を引き起こす場合がある。さらに、マウスは血漿中にＰＣＩを有さず（Zechmeister-Machhart et al, 1996）、これはＡＰＣの循環半減期を増加する可能性があり、そのためＰＣＩはＴＧＡアッセイに先立って不活性化されない。現時点で排除することができない代替的な説明は、マウス血漿におけるオフターゲット凝血促進効果であろう。しかしながら、この効果はヒト血漿中では見られないことから、マウス特異的抗凝固性プロテアーゼの阻害に関与し得る。

ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋの可能性のあるｉｎ ｖｉｖｏ効果を調べるため、また血友病の予防剤又は治療のいずれかとして有用な可能性があるかどうかを判定するため、本発明者らは２つのｉｎ ｖｉｖｏマウスアッセイ、すなわちテールクリップ及び精巣挙筋細動脈レーザー傷害モデルを使用した。使用したマウスは、ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドの雄性ｆＩＸノックアウトマウスであった（Lin et al,
1997; Ivanciu et al, 2011）。

テールクリップアッセイでは、尾静脈を通してタンパク質又はバッファーを注射し、５分間のインキュベーション期間の後、尾部を直径３ｍｍで切断し、３７℃の水浴中の１４ｍｌの３７℃生理食塩水溶液に入れた。１０分間に亘って血液を採取し、得られた失血を５７５ｎｍで吸光度を測定することによる赤血球溶解後の総ヘモグロビンを測定することによって定量した（Ivanciu et al, 2011）。尾部切断により採取された既知容量の血液
をテールクリップ試料と類似の方式で加工し、標準曲線を作成することによって失血容量を計算した。赤血球溶解の後、５７５ｎｍでの吸光度を特定し、失血容量に対してプロットして標準曲線を作成した。テールクリップアッセイは、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋの強力な凝血促進効果を示した（図１２）。１５ｍｇ／ｋｇの用量において、ＨＢマウスの失血を、ＰＢＳを注射したＷＴマウスのレベルまで回復した（図１２）。より低用量のＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋもまた、ＨＢマウスに関して出血の減少傾向を示したが、これは統計学的には有意ではなかった。ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓは、７．５ｍｇ／ｋｇで失血に対して有意な効果を示さなかった。

凝血促進剤を評価するため使用した別のｉｎ ｖｉｖｏモデルは、生体内精巣挙筋細静脈レーザー傷害モデル（Falati et al, 2002）である。この系では、マウス頚静脈にカニューレを挿入して治療用タンパク質、またフィブリン及び血小板に対する蛍光タグ付抗体の注入を可能とする。その後、精巣挙筋を画像化のため広げる。細動脈に対するレーザーによる傷害誘導後の凝固塊形成を画像化し、蛍光顕微鏡を使用して定量する。

全体的な質的判断のため、傷害を３つのカテゴリー、すなわち、凝固塊なし（蛍光が検出されなかった）、血小板凝固塊（血小板のみが見える、これらの凝固塊は一般的には不安定であり一連の画像化の間に溶解した）、及び血小板＋フィブリン（血小板及びフィブリンの両方の蛍光が見え、一連の画像化の間凝固塊は安定なままであった）に選別した。これは、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋの増大する濃度に伴って、安定な血小板及びフィブリンの凝固塊形成において用量依存的な増加があったことを示した（図１３）。全ての画像を血小板及びフィブリンの蛍光について定量した。各時間点に対する中央値を計算し、結果を図１４にプロットした。これらのデータは、図１３に対して割り当てられたカテゴリーに関わらず、全て画像からの定量を含んだ。中央値のプロットは、対照又はＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓを注入されたマウスは凝固塊形成を呈しなかったのに対し、高用量及び低用量のいずれのＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋも傷害部位における血小板の凝集及びフィブリンの堆積を示したことを示す。血小板凝集に関して２つの用量の間で差は検出することができなかった。フィブリンについて、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋに対するフィブリン堆積、及び対照又はＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓのいずれかを注入されたマウスに対するフィブリンがないことについて用量依存的な増加があった（図１４）。

まとめると、これらの結果は、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋがｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ及び血友病のｉｎ ｖｉｖｏモデルの両方において凝血促進効果を有することを示す。ｉｎ ｖｉｖｏ実験は全て、血友病Ｂのマウスモデルにおいて行ったが、ヒト血漿におけるＴＧＡの結果（図９及び図１０）、及びＦＬ α_１ＡＴ
Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋの提案された作用機序は、その凝血促進効果はｆＩＸ又はｆＶＩＩＩの欠乏と無関係のはずであることから、血友病Ａ及びＢの両方において使用され得ることを示す。ｉｎ ｖｉｖｏで見られた凝血促進効果は、ＷＴマウスについて見られたものと同じレベルまで出血を減少するのに十分であり（図１２）、ＡＰＣを阻害するセルピンを、予防として、又は既存の治療に対するアジュバントとしてのみならず出血障害の治療に使用可能であることを示す。

また、α_１ＡＴスカフォールドに対する可能性のある更なるＡＰＣ特異的変異体を探索するため、α_１ＡＴスカフォールドに対して標的化ランダム変異導入の戦略を採用した。

ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓバックグラウンドに対して３つの異なるα_１ＡＴバリアントライブラリ、すなわちＰ２においてランダム化されたもの、Ｐ１’でランダム化されたもの、及びＰ２とＰ１’との両方においてランダム化された第３のライブラリを作製した。得られたプラスミドライブラリをＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ発現株に形質転換し、９６ウェルプレートでタンパク質を発現させた。細菌を溶解し、溶解物をトロンビン及びＡＰＣの阻害についてアッセイした。

シングルバリアントのライブラリに対して、１つのライブラリ当たり８８のコロニーをアッセイした。ダブル（Ｐ２Ｐ１’）バリアントライブラリに対して、４６０のコロニーをアッセイした。ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ及びＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋ（有力なＡＰＣ特異的バリアント）を参照として全てのアッセイプレートで発現させた。Ｐ２ＫＰ１’Ｋ α_１ＡＴと比較して、より高い又は同等のＡＰＣ阻害活性（より低い又は同等の残留ＡＰＣ活性）を有し、より低い又は同等のトロンビン阻害活性（より高い又は同等の残留トロンビン活性）を有するバリアントを、トロンビンよりもＡＰＣに対して特異的なバリアントの候補と考えた。候補バリアントのサブセットを選別し、同じ設定で再度アッセイして第１のスクリーンによる結果を検証した。その後、両方のアッセイで同様の特性を示す変異体の配列決定を行った。得られた配列を表９に示す。トロンビンよりもＡＰＣに対して特異的であったバリアントを選び出すためのこのアッセイの能力を検証するため、表９で同定された９つのバリアントをより大きな規模で大腸菌において発現させ、精製した。その後、各変異体についてトロンビン及びＡＰＣに関する阻害の二次速度定数を決定した。結果を表１０に示す。これらの結果は、試験された全てのバリアントが、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓバリアントは異なり、トロンビンに対するよりもＡＰＣに対してより高い特異性を有したことを確認した。

幾つかの種類の残基は、Ｐ２位及びＰ１’位の両方でα_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓスカフォールドにおいて有利であった（表９）。特異性は、主にＰ２及びＰ１’における大きな極性残基（Ｑ、Ｎ、Ｙ）、大きな疎水性残基（Ｗ）、又は正電荷を持つ残基（Ｒ、Ｈ、Ｋ）の存在によって与えられた。これらの位置に見られる他の残基として、Ｃ、Ａ、Ｔ、Ｓ及びＶが挙げられる。これらの中〜小の残基は、他の位置に、特異性の交換に対してより大きな影響を有する可能性が高い、補完する大きな正電荷を持つ残基（Ｒ、Ｋ）、又はより大きな極性残基（Ｙ、Ｎ、Ｑ）をダブルバリアントライブラリにおいて伴った。しかしながら、特にＰ１’がＲである場合に、これらの変異体の協同効果が存在することもあり得る。Ｐ１’Ｒは、シングルバリアントライブラリのスクリーンにおいて変化しやすい結果を示し、いくらかの残留トロンビン阻害活性を有する可能性がある。Ｐ２Ｐは基質のトロンビン開裂に重要であることが知られている（Gallwitz et al, 2012）。Ｐ１’における特異性交換変異とつながるこの残基の単純な除去は、わずかな残留トロンビン阻害活性を有するＡＰＣ特異的インヒビターの作製に十分な可能性がある。特にＰ２のＴは、それ自体に対していくらかの効果を有し、Ｐ１’のパートナー残基（Ｑ、Ｎ、Ｙ、Ｒ）のうち、Ｒのみがそれ自体で特異性交換をもたらすのに十分であるとして単一残基Ｐ１’バリアントライブラリにおいて同定された。

興味深いことに、α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ対照の周りに集まった非特異的変異体は大半がα_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓであったことが示された。全てＰ２Ｐを保持し、トロンビン阻害活性の維持におけるその重要性を示した。Ｐ１’はより変動的であり、Ｐ１’バリアントライブラリの変異体の分布と一致した。Ｐ２及びＰ１’のライブラリにおけるバリアントの拡散を比較すると、トロンビンはＰ２変異よりもＰ１’変異に対してより寛容のようであ
る。しかしながら、シングルバリアントライブラリに存在しなかった、ダブルバリアントライブラリにおける有利な残基の出現は特異性に対するこれらの残基の効果が協同的である可能性があり、特異性の増大において単一変異よりも二重変異の方がより効果的な可能性があることを示す。

上に提示されるランダム変異導入の結果は、既に同定されたリジン変異以外のトロンビンよりもＡＰＣに特異性を示す変異体の作製が可能であったことを示した。これまで、ランダム変異導入戦略が使用され、トロンビンに対する特異性が一旦得られれば、これらの変異体は他の凝固原プロテアーゼよりもＡＰＣに対してある程度の特異性も示すであろうとみなされてきた。これを試験するため、表１０のランダム変異体のＰＴ及びａＰＴＴを試験した。これらの結果を表１１に示す。ＦＬ α１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓに対して先に示されたのと異なり、いずれの変異体もＰＴに対して顕著な効果を有しなかった（図４）。これは、その変異体が凝固原プロテアーゼに対する阻害活性を大幅に喪失したという指標を提供する。しかしながら、ａＰＴＴはインヒビターの存在に対してより感受性である。したがって、ａＰＴＴの手段は、より小さな残留阻害のより正確な表示を与え得る。先の実験（図５）は、ＦＬ α１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２ＳがａＰＴＴアッセイにおいて血漿を凝固不可能（unclottable）とすることを示した。対照的に、ここで１
つの変異体のみがこの効果を示した（Ｐ２ＴＰ１’Ｎ）。Ｐ２ＫＰ１’Ｈ及びＰ２ＫＰ１’Ｎ等の幾つかの変異体は、比較的小さいａＰＴＴの延長を示したに過ぎず、したがって興味深い可能性があった。

これらの結果より、本発明者らは４つの変異体、Ｐ２Ｒ、Ｐ２ＱＰ１’Ｋ、Ｐ２ＫＰ１’Ｈ及びＰ２ＫＰ１’Ｎを選択した（全てＰｉｔｔｓ、Ｐ１Ｒバックグラウンドに対する）。これらの変異体は、トロンビンよりもＡＰＣの高い阻害（表１０）、また幾つかについてはａＰＴＴ（Ｐ２ＫＰ１’Ｈ及びＰ２ＫＰ１’Ｎ）の短い延長のいずれかを示した。これらの変異体がＰＴを延長しなかったことから、変異体はＴＦ：ｆＶＩＩａを阻害することはなさそうである。ａＰＴＴの延長に対して最も可能性の高い候補は、ｆＸＩａ又はｆＸａの阻害であろう。これらのうち、ｆＸａ阻害は、凝固の初期段階を最も阻害し得ることから、好結果のインヒビターに対するより顕著なバリアとみなした。したがって、これら４つの変異体によるｆＸａの阻害に対する阻害定数は、上述のように決定された（表１２）。Ｐ２ＲはｆＸａの顕著な阻害を示し、これはａＰＴＴの延長の理由である可能性がある。他の３つの変異体はより低いｆＸａ阻害を示したが、いずれの変異体も先に同定されたＰ２ＫＰ１’Ｋ変異体ほど特異的ではなかった。それにもかかわらず、Ｐ２ＫＰ１’Ｎ、Ｐ２ＱＰ１’Ｋ及びＰ２ＫＰ１’Ｈは、トロンビン及びｆＸａよりもＡＰＣに対して特異性を示すことから、更なる開発のための追加の有望な候補を代表する。さらに、それらのＡＰＣの阻害は、先に記載されるＰ２ＫＰ１’Ｋ変異体に関して、おおよそ２倍増大される。このより速い阻害は、わずかに減少した特異性を部分的に補償する可能性がある。

しかしながら、これらの結果は、トロンビンよりもＡＰＣに対する特異性について選択することが、ｆＸａ及び他の凝固原プロテアーゼに対しても特異性を示すインヒビターを設計するために完全に十分ではないことを示した。したがって、ランダム変異導入の戦略を更に拡大した。低いトロンビン阻害及びＡＰＣ阻害を維持しながら、減少したｆＸａ阻害を有する、トロンビンよりもＡＰＣに対する特異性について先に選択された変異体を、ｆＸａ及び選択された変異体に対して再度スクリーンした。

４つの更なる変異体をこの追加のスクリーンより同定した。これらは全てＰ１Ｒ変異を有し、更にＰ２ＲＰ１’Ａ、Ｐ２ＲＰ１’Ｑ、Ｐ２ＷＰ１’Ｉ又はＰ２ＷＰ１’Ｈのいずれかを有した。これらの変異体の特異性を検証するため、１つの濃度のセルピンのみを使用し、変異体のトロンビン及びｆＸａの阻害を試験する初期の実験を行った。変異体がト
ロンビン及びｆＸａの低阻害に基づいて選択されたことから、ＡＰＣ阻害はこの段階では考慮しなかった。セルピン及びプロテアーゼを種々の時間に亘ってインキュベートし、指定の時間点で過剰な発色基質の添加により反応を停止した。残留プロテアーゼ活性を初期プロテアーゼ活性で除し、この値の自然対数を時間に対してプロットした（図１５）。セルピン濃度で除されたこの線の傾きは、阻害の二次速度定数の推定を与える。これらのアッセイは、最も速いインヒビターである二次速度定数約５０．３Ｍ^−１．ｓ^−１を有するＰ２ＷＰ１’Ｈによる（ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓの阻害定数２．９２８×１０^５Ｍ^−１．ｓ^−１と比較して）以外は、全ての変異体がほとんどトロンビンを阻害しないことを示した。しかしながら、Ｐ２ＲＰ１’Ａ、Ｐ２ＷＰ１’Ｉ及びＰ２ＷＰ１’Ｈは、ｆＸａに対しては顕著な阻害を示した。二次速度定数は、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓと比較してわずか約１０倍減少されたに過ぎない（ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓに対する４．１３×１０^４Ｍ^−１．ｓ^−１と比較して、Ｐ２ＲＰ１’Ａに対して４０７０．１Ｍ^−１．ｓ^−１）。Ｐ２ＲＰ１’Ａ、Ｐ２ＷＰ１’Ｉ及びＰ２ＷＰ１’Ｈは、互いに同様のｆＸａ阻害を示した。

１つの変異体のみがトロンビン及びｆＸａの両方に対して特異的な選択性を示した。この変異体はＰｉｔｔｓ（Ｐ１Ｒ）変異に加えてＰ２ＲＰ１’Ｑを有した。その選択性のため、より徹底的な調査が興味深かった。ランダム及び合理的な変異導入の研究の両方による先の結果は、Ｒ残基及びＫ残基が合理的に同様に作用することを示した。したがって、本発明者らは、本明細書に示される結果から同様の特性を有すると予想される、Ｐ１Ｒバックグラウンドに対するＰ２ＫＰ１’Ｑ変異体も作製した。両方の変異体に対する阻害定数の測定及びａＰＴＴ（前に記載される通り行われた実験）による結果を表１３に示す。比較のためＰ２ＫＰ１’Ｋ変異体を示す。Ｐ２ＫＰ１’Ｑ及びＰ２ＲＰ１’Ｑは、いずれもトロンビン及びｆＸａの非常に低い阻害を示した。さらに、ａＰＴＴにはほぼ何らの効果もなかった。ＡＰＣ阻害は、Ｐ２ＫＰ１’Ｋと比較してごくわずかに減少されたに過ぎず、顕著であった。したがって、これら２つの変異体は、Ｐ２ＫＰ１’Ｋと同様に作用すると期待され、更なる開発のための他の有望な可能性のある代替分子を代表する可能性がある。

本発明者らは、ＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋによるネズミ科動物のトロンビン及びＡＰＣの阻害を評価した。トロンビン及びＡＰＣを組換え起源から得た。ＡＰＣに対してはＥＧＦ２−プロテアーゼドメインのみ（Ｇｌａ−ドメインレスＡＰＣ）、及びトロンビンに対してはプロテアーゼドメインを含めて、使用したプロテアーゼを血漿型に応じて切断する。したがって、本発明者らは、任意の差がコンストラクトの差よりも種の差に起因することを確実にするため、これらのプロテアーゼのヒト型も試験した。ヒト及びネズミ科動物のトロンビンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＦＬ α_１ＡＴ Ｐｉｔｔｓ Ｃ２３２Ｓ Ｐ２ＫＰ１’Ｋと全く反応性を示さないか、又は非常にわずかな反応性を示し、これに関して、モデル系による結果がヒト系に適切であろうことを示した。阻害の二次速度定数は、ヒト血漿ＡＰＣに対する（１４．８８±１．８７）×１０^３Ｍ^−１．ｓ^−１と比較して、ヒトＧｌａ−ドメインレスＡＰＣに対して（８．１４±０．５８）×１０^３Ｍ^−１．ｓ^−１であり、ネズミ科動物Ｇｌａ−ドメインレスＡＰＣに対して（３．８０±０．３７）×１０^３Ｍ^−１．ｓ^−１であった。これらの結果は、マウスモデルにおける変異の反応性がヒトにおけるよりも低い可能性がある、すなわち、同じ効果に対する相対的用量がより高くなければならない可能性があるものの、プロテアーゼ阻害に関する効果は同様である可能性が高いという指標を提供する。

提示されるデータは、原理証明として、セルピンスカフォールドを、非常にわずかな変異を使用して特異的なＡＰＣインヒビターを作製するため使用することが可能であることを示し、これらのインヒビターがｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で凝血促進活性を有することができ、それ自体が血友病等の出血性障害の治療及び予防に対する凝血促
進剤として有望であることを示す。

配列番号１ プロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）
プロペプチドを含む成熟タンパク質は残基２０〜４０６に対応する。シグナル配列は残基１〜１９に対応する。プロペプチドは残基２０〜２５に対応する。ＲＣＬのＰ４、Ｐ２、Ｐ１及びＰ１’の残基を太字及び下線で示す。

配列番号２ アルファ−１−抗キモトリプシン
成熟タンパク質は残基２６〜４２３に対応する。ＲＣＬのＰ４、Ｐ２、Ｐ１、及びＰ１’の残基を太字及び下線で示す。

配列番号３ Ｃ１−エステラーゼインヒビター
成熟タンパク質は残基２３〜５００に対応する。ＲＣＬのＰ４、Ｐ２、Ｐ１、及びＰ１’の残基を太字及び下線で示す。

配列番号４ α_２−抗プラスミン
成熟タンパク質は残基２８〜４９１に対応する。キモトリプシンの阻害に対するＲＣＬのＰ４、Ｐ２、Ｐ１及びＰ１’の残基を太字、プラスミンの阻害に対する残基を下線で示す。

配列番号５ 抗トロンビン（ＡＴＩＩＩ）
成熟タンパク質は残基３３〜４６４に対応する。ＲＣＬのＰ４、Ｐ２、Ｐ１、及びＰ１’の残基を太字及び下線で示す。

配列番号６ ヘパリンコファクターＩＩ
成熟タンパク質は残基２０〜４９９に対応する。ＲＣＬのＰ４、Ｐ２、Ｐ１、及びＰ１’の残基を太字及び下線で示す。

配列番号７ α_１−抗トリプシン（α_１ＡＴ）
成熟タンパク質は残基２５〜４１８に対応する。ＲＣＬのＰ４、Ｐ２、Ｐ１、及びＰ１’の残基を太字及び下線で示す。

配列番号８ カリスタチン
成熟タンパク質は残基２１〜４２７に対応する。ＲＣＬのＰ４、Ｐ２、Ｐ１、及びＰ１’の残基を太字及び下線で示す。

配列番号９ プラスミノーゲン活性化因子インヒビター
成熟タンパク質は残基２４〜４０２に対応する。ＲＣＬのＰ４、Ｐ２、Ｐ１、及びＰ１’の残基を太字及び下線で示す。

配列番号１０ プロテインＺ依存性インヒビター
成熟タンパク質は残基２２〜４４４に対応する。ＲＣＬのＰ４、Ｐ２、Ｐ１、及びＰ１’の残基を太字及び下線で示す。

配列番号１１ プロテアーゼネキシン１
成熟タンパク質は残基２０〜３９８に対応する。ＲＣＬのＰ４、Ｐ２、Ｐ１、及びＰ１’の残基を太字及び下線で示す。

配列番号１２ α_１ＡＴスカフォールドにおける変性セルピン
成熟タンパク質は残基２５〜４１８に対応する。ＲＣＬのＰ４、Ｐ２、Ｐ１、及びＰ１’の残基を太字及び下線で示す。

Claims (18)

1. 改変セルピンであって、その反応中心ループ（ＲＣＬ）の残基Ｐ１’及び残基Ｐ２に変異を有し、
   改変セルピンの残基Ｐ１がＲであり、又はＲに変異されており、
   残基Ｐ１’がＱ、Ｈ、Ｋ又はＲに変異されており、且つ残基Ｐ２がＨ、Ｋ又はＲに変異されており、且つ
   前記変異が、トロンビン、ｆＶＩＩａ、ｆＸａ、ｆＩＸａ及びｆＸＩａから選択される１又は複数の凝固原プロテアーゼの阻害に対する活性化プロテインＣの阻害を増大する、
   改変セルピン。
2. 前記Ｐ１’残基がＫ、又はＱに変異されている、請求項１に記載の改変セルピン。
3. 前記Ｐ２残基がＫに変異されている、請求項１又は２に記載の改変セルピン。
4. 前記改変セルピンにおける前記Ｐ２残基及び前記Ｐ１’残基がそれぞれ、ＫＫ、ＲＫ、ＲＨ、ＫＨ、ＲＱ又はＫＱである、請求項１に記載の改変セルピン。
5. 前記改変セルピンがＰ４に変異を含み、
   任意に、前記Ｐ４残基がＦ、Ｓ、Ｒ、Ｖ、Ｃ、Ｗ、Ｋ、Ｇ、Ｌ、Ｈ、Ｔ、Ｑ又はＡに変異されている、
   請求項１〜４のいずれか一項に記載の改変セルピン。
6. 前記改変セルピンの前記ＲＣＬにおける前記Ｐ４残基がＡであり、前記Ｐ２残基がＫであり、前記Ｐ１’残基がＫである；
   前記改変セルピンの前記ＲＣＬにおける前記Ｐ４残基がＡであり、前記Ｐ２残基がＲであり、前記Ｐ１’残基がＨである；
   前記改変セルピンの前記ＲＣＬにおける前記Ｐ４残基がＡであり、前記Ｐ２残基がＫであり、前記Ｐ１’残基がＨである；
   前記改変セルピンの前記ＲＣＬにおける前記Ｐ４残基がＡであり、前記Ｐ２残基がＲであり、前記Ｐ１’残基がＱである；
   前記改変セルピンの前記ＲＣＬにおける前記Ｐ４残基がＡであり、前記Ｐ２残基がＫであり、前記Ｐ１’残基がＱである；
   前記改変セルピンの前記ＲＣＬにおける前記Ｐ４残基がＡであり、前記Ｐ２残基がＫであり、前記Ｐ１残基がＲであり、前記Ｐ１’残基がＫである；
   前記改変セルピンの前記ＲＣＬにおける前記Ｐ４残基がＡであり、前記Ｐ２残基がＫであり、前記Ｐ１残基がＲであり、前記Ｐ１’残基がＱである；
   前記改変セルピンの前記ＲＣＬにおける前記Ｐ４残基がＡであり、前記Ｐ２残基がＲであり、前記Ｐ１残基がＲであり、前記Ｐ１’残基がＱである；
   前記改変セルピンの前記ＲＣＬにおける前記Ｐ４残基がＫであり、前記Ｐ２残基がＲであり、前記Ｐ１’残基がＨである；
   前記改変セルピンの前記ＲＣＬにおける前記Ｐ４残基がＦであり、前記Ｐ２残基がＫであり、前記Ｐ１’残基がＫである；
   前記改変セルピンの前記ＲＣＬにおける前記Ｐ４残基がＦであり、前記Ｐ２残基がＲであり、前記Ｐ１’残基がＫである；又は
   前記改変セルピンの前記ＲＣＬにおける前記Ｐ４残基がＳであり、前記Ｐ２残基がＨであり、前記Ｐ１’残基がＲである、
   請求項１〜５のいずれか一項に記載の改変セルピン。
7. 野生型セルピンの配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を
   含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の改変セルピン。
8. 前記野生型セルピンが、α_１−抗キモトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ３）、Ｃ１−エステラーゼインヒビター、α_２−抗プラスミン（ＳＥＲＰＩＮＦ２）、抗トロンビン（ＡＴＩＩＩ）（ＳＥＲＰＩＮＣ１）、ヘパリン補因子ＩＩ（ＨＣＩＩ）（ＳＥＲＰＩＮＤ１）、プロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）（ＳＥＲＰＩＮＡ５）又はα_１−抗トリプシン（α_１ＡＴ）（ＳＥＲＰＩＮＡ１）、カリスタチン（ＳＥＲＰＩＮＡ４）、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター（ＳＥＲＰＩＮＥ１）、プロテアーゼネキシン１（ＳＥＲＰＩＮＥ２）及びプロテインＺ依存性プロテアーゼインヒビター（ＳＥＲＰＩＮＡ１０）からなる群から選択される、請求項７に記載の改変セルピン。
9. 配列番号１２の残基２５〜４１８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記改変セルピンの前記ＲＣＬにおける前記Ｐ４残基がＡであり、前記Ｐ２残基がＫであり、Ｐ１残基がＲであり、前記Ｐ１’残基がＫである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の改変セルピン。
10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の改変セルピンをコードする核酸。
11. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の改変セルピンをコードする核酸を含むベクター。
12. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の改変セルピンを発現するベクターを含む組換え細胞。
13. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の改変セルピン、及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
14. ヒト又は動物の身体の治療用である、請求項１３に記載の医薬組成物。
15. 個体における出血の治療用若しくは予防用、又は止血の促進用である、請求項１３に記載の医薬組成物。
16. 前記個体が出血性障害を有する、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 前記出血性障害が血友病である、請求項１６に記載の医薬組成物。
18. 前記個体が外傷患者である、請求項１５に記載の医薬組成物。