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JP6692816B2 - 炎症を処置および予防するための組成物および方法 - Google Patents

炎症を処置および予防するための組成物および方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年９月５日に出願された米国特許仮出願第６２／０４６，４５９号の優先性を主張する。この特許仮出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、「１２８１０＿５１３＿ＳＴ２５」という名称で２０１５年９月８日に作成された５８０キロバイトのサイズを有するコンピュータ可読形式の配列表を含む。このコンピュータ可読形式配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府支援研究または開発に関する記載
該当なし。
発明の分野
本発明は、炎症に関する。より具体的には、本発明は、炎症の予防または処置のためのＮＲＰ１経路の阻害に関する。
局所的急性炎症反応は、ほとんどが有益であり、宿主の感染に対する身体の最前線の防御である。逆に、敗血性ショックなどの急性の全身性炎症は、罹患率および死亡率の主要な原因である（５８）。慢性で低悪性度の炎症が持続する場合、２型糖尿病から、関節炎、癌、いくつかの神経炎症性疾患、さらにその他の疾患に及ぶいくつかの全身性疾患の始まりである可能性がある。
全サイトカイン、炎症プロセスに寄与すると考えられる受容体およびその他の関与物質の中で、まったく見落とされてきた１つのパラダイムは、古典的な神経ガイダンスキューおよびそれらの受容体の影響である。これらには、セマフォリン３Ａ（ＳＥＭＡ３Ａ、例えば、ｍＲＮＡ：ＮＭ＿００６０８０；およびタンパク質：ＮＰ＿００６０７１および図２１）およびそれらの受容体ニューロピリン−１（ＮＲＰ１、例えば、ｍＲＮＡ：ＮＭ＿００１０２４６２８；およびタンパク質：ＮＰ＿００１０１９７９９、ＮＭ＿００３８７３および図２２（アイソフォーム２またはｂ、分泌型）および図２６（アイソフォーム１））が含まれる。ＮＲＰ１は、リンパ系および骨髄細胞の両方上に発現する（５９、３１）。炎症におけるその役割は、特に、サイトカイン産生との関係に関しては、未だにほとんどわかっていない。
最初、セマフォリンは、胚形成中の軸索ガイダンスの中心的存在として特徴付けられた。現在では、セマフォリンの役割は軸索ガイダンスを超えて広がり、血管系、腫瘍増殖および免疫応答に影響を与えることが明らかになっている。セマフォリンファミリーは、少なくとも２１個の脊椎動物遺伝子および８個の追加の無脊椎動物遺伝子の数になっている。全てのセマフォリンは、シグナル伝達に必要な約５００個のアミノ酸のセマドメインを含む。クラス３セマフォリン（ＳＥＭＡ３Ａなど）は、唯一分泌型ファミリーメンバーである。ＳＥＭＡ３Ａは、ジスルフィド結合ホモダイマーとして合成され、二量体化はシグナル伝達に不可欠である。
ニューロンでは、ＳＥＭＡ３Ａのその同族受容体ニューロピリン−１（ＮＲＰ１）への結合により、プレキシンを介して細胞骨格崩壊が誘発される（６０）。内皮細胞中の伝達機序は不明確なままである。ＮＲＰ１は、細胞外ドメイン上の別個の部位を介して、構造的に異なる２つのリガンドに結合する特殊な能力を有している（２７〜２９）。ＮＲＰ１は、ＳＥＭＡ３Ａに結合して細胞骨格崩壊を誘発する（４６、４７）のみでなく、ＶＥＧＦ１６５にも結合して（２８、２９、４７、６１）ＶＥＧＦＲ２への結合を促進し、その結果として、血管新生の潜在能力を高める（６２）。結晶学的エビデンスにより、ＶＥＧＦ１６５およびＳＥＭＡ３Ａは、ＮＲＰ１に対して直接競合することはなく、むしろ、別個の重複しない部位でＮＲＰ１に同時に結合できることが示されている（６３）。さらに、遺伝子研究では、ＮＲＰ１が神経細胞および血管発生に関するＶＥＧＦとＳＥＭＡ３Ａの作用を個別に調節していることも示されている（６４）。最終的に、ＮＲＰ１は、ＴＧＦ−β１に結合し、その不活性型を調節することもわかっている。
ＮＲＰ１は、１回膜貫通型受容体であり、大きな８６０個のアミノ酸の細胞外ドメインおよび短い４０個のアミノ酸の細胞内ドメインを有し、大きなドメインは、３個のサブドメイン（ａ１ａ２、ｂ１ｂ２およびｃ）に細分される（６５）。ニューロンでは、ＳＥＭＡ３ＡのＮＲＰ１への結合により、プレキシンが動員され、これが細胞内シグナルを伝達し（６０）、細胞骨格崩壊を誘発する。内皮細胞での伝達機序は、不明確のまま残されている。ＮＲＰ１は、主に、そのａ１ａ２（しかし、おそらくｂ１も）ドメインを介してＳＥＭＡ３Ａに結合し（細胞骨格崩壊を誘発する）（４６、４７）、およびそのｂ１ｂ２ドメインを介して、ＶＥＧＦ１６５（２８、２９、４７、６１）（ＶＥＧＦＲ２への結合を促進し、その結果として、その血管新生の潜在能力を高める（６２））に結合する。虚血性網膜中のレベルが高くなったＳＥＭＡ３Ａは、その結果として、前進する端細胞を崩壊させ、反発キュー源から端細胞をずらすことにより、硝子体中へ新生血管を押し込むのを支援し得る（２１）。
ＣＮＳは、長い間、免疫特権を有するシステムであると見なされてきたが、しかし、現在では、脳、網膜および脊髄は、複雑な免疫監視を受けていることが明らかになっている（１、２）。ＣＮＳにおける免疫学的作用は、自然免疫応答に大きく依存しており、健康時に存在し、糖尿病性網膜症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症およびアルツハイマー病などの疾患時に強くなっている。これは網膜で明らかであり、網膜における強化された、主にミクログリア／マクロファージに基づく免疫応答は、いくつかの視力を脅かす疾患、例えば、糖尿病性網膜症（ＤＲ）（３〜５）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）（６〜８）および未熟児網膜症（ＲＯＰ）（９、１０）の進行と関連している。合わせて、これらの網膜症は、工業先進国における失明の主要な原因を占める（６、１１、１２）。
多くの現状の炎症性疾患および状態の処置は、重大な副作用および不十分な長期安全性プロファイルに悩まされている。したがって、新規医薬品標的および処置方法に対する必要性が残されている。
本発明の説明では、多数の文献に言及する。これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明者らは、自然免疫応答の存在下における骨髄常在性ＮＲＰ１の機能を明確にしようとしてきた。
本発明者らは、ＳＥＭＡ３Ａ、ＶＥＧＦおよびＴＧＦ−βは、ＮＲＰ１受容体を発現している単核貪食細胞（ＭＰ、例えば、ミクログリアおよびマクロファージ）に対する強力な誘引剤としての役割を果たすと結論付けた。自然免疫細胞におけるＮＲＰ１シグナル伝達の阻害は、自然免疫応答の過剰活性化を伴う、増殖網膜症、敗血性ショックおよび脳虚血／脳卒中などの種々の状態下で、ＭＰ依存性炎症および組織損傷に対する保護を生ずることが示された。さらに、本発明者らは、ＳＥＭＡ３Ａシグナル伝達を阻害する種々の可溶性ＮＲＰ１由来トラップを設計し、ＳＥＭＡ３Ａの阻害が種々の状態の炎症反応を著しく減らすことを示した。
したがって、本発明は、自然免疫応答の過剰活性化（すなわち、病理学的活性化）を伴う炎症性疾患および状態の予防または処置のための、ＮＲＰ１細胞内シグナル伝達（例えば、ＮＲＰ１およびそのリガンド）の阻害に関する。このような疾患および状態の非限定的例には、敗血症、脳卒中、脳虚血、および種々の増殖網膜症が挙げられる。
より具体的には、一態様において、本発明は、炎症を処置または予防する方法に関し、該方法は、ＮＲＰ１依存性細胞内シグナル伝達を阻害することを含む。
別の態様では、本発明は、自然免疫応答の過剰活性化を防止または低減する方法に関し、該方法は、ＮＲＰ１依存性細胞内シグナル伝達を阻害することを含む。一実施形態では、自然免疫応答の過剰活性化は、ｉ）ＩＬ−１βおよびＴＮＦαの分泌および／または単核貪食細胞（ＭＰ）の活性化／動員を含む。
一実施形態では、ＮＲＰ１依存性細胞内シグナル伝達の阻害は、ａ）ＮＲＰ１発現または活性の低減；および／またはｂ）ＮＲＰ１リガンド発現または活性の低減を含む。一実施形態では、ＮＲＰ１リガンドはＳＥＭＡ３Ａ、ＶＥＧＦ１６５またはＴＧＦ−βである。特定の実施形態では、ＮＲＰ１リガンドはＳＥＭＡ３Ａである。
一実施形態では、ＮＲＰ１活性の低減は、ＮＲＰ１の少なくとも１つのＮＲＰ１リガンドへの結合を阻害することからなる。一実施形態では、ＮＲＰ１の少なくとも１つのＮＲＰ１リガンドへの結合の阻害は、ＮＲＰ１抗体（例えば、ＳＥＭＡ３Ａ抗体）を投与することを含む。
上記方法の別の実施形態では、ＮＲＰ１活性を減らすことは、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその機能性断片を含む有効量のＮＲＰ１トラップを投与することを含む。特定の実施形態では、ＮＲＰ１トラップは図１９または２０に示されている。
特定の実施形態では、本発明のＮＲＰ１トラップは、ＳＥＭＡ３ＡのＮＰＲ−１への結合を阻害するが、ＶＥＧＦのＮＲＰ１への結合を実質的に阻害しない。一実施形態では、このようなＮＲＰ１トラップは、ＮＲＰ１のａ１ａ２ドメインを含むが、ＮＲＰ１のｂ１および／またはｂ２サブドメイン（単一または複数）を含まない。別の実施形態では、このようなトラップは、図２２に示すように、ドメインｂ１中のＮＲＰ１アミノ酸配列のチロシン２９７に対応する位置に変異を含み、これは、ＶＥＧＦのこのトラップへの結合を減らすかまたは抑止する。特定の実施形態では、この変異は、位置２９７のチロシンをアラニンに変える。
特定の実施形態では、本発明のＮＲＰ１トラップは、ａ）ＮＲＰ１のドメインａ１、ａ２、ｂ１、ｂ２およびｃを含む；ｂ）ＮＲＰ１のドメインａ１、ａ２、ｂ１およびｂ２を含む；ｃ）ＮＲＰ１のドメインａ１、ａ２およびｂ１を含む；ｄ）ＮＲＰ１のドメインａ１およびａ２を含む；ｅ）ＮＲＰ１のドメインｂ１を含み、このｂ１ドメインがＮＲＰ１のチロシン２９７に対応するアミノ酸の変異を含み、この変異がＶＥＧＦへの結合を減らすかまたは抑止する；ｆ）ＮＲＰ１のドメインｂ１を含み、このｂ１ドメインが、ＮＲＰ１のチロシン２９７に対応するアミノ酸の変異を含み、この変異がチロシンをアラニンに変える；ｇ）ＮＲＰ１のドメインｃを含まない；ｈ）ＮＲＰ１のドメインｂ１を含まない；ｉ）ＮＲＰ１のドメインｂ１およびｂ２を含まない；またはｊ）ＮＲＰ１のドメインｂ１、ｂ２およびｃを含まない。
上記方法の一実施形態では、ＮＲＰ１リガンド発現または活性を阻害することは、ＳＥＭＡ３Ａ発現またはＳＥＭＡ３ＡのＮＲＰ１への結合を特異的に阻害することを含む。特定の実施形態では、ＳＥＭＡ３ＡのＮＲＰ１への結合を阻害することは、ＳＥＭＡ３Ａ抗体を投与することを含む。
特定の実施形態では、本発明の方法は、ＮＲＰ１アンチセンス、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを投与することにより、ＮＲＰ１発現を減らすことを含む。
別の実施形態では、本方法は、ＳＥＭＡ３Ａアンチセンス、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを投与することによりＳＥＭＡ３Ａ発現を減らすことを含む。
さらなる態様では、本発明は、炎症の予防または処置のための化合物に関し、該化合物は、ａ）ＮＲＰ１発現または活性を減らす；またはｂ）ＮＲＰ１リガンド発現または活性を減らす。
別の態様では、本発明は、自然免疫応答の過剰活性化を防止または低減するための化合物に関し、該化合物は、ａ）ＮＲＰ１発現または活性を減らす；またはｂ）ＮＲＰ１リガンド発現または活性を減らす。
一実施形態では、化合物は、ｉ）ＳＥＭＡ３Ａ抗体、ｉｉ）ＮＲＰ１抗体、ｉｉｉ）ＮＲＰ１トラップ、ｉｖ）ＳＥＭＡ３Ａアンチセンス、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ、またはｖ）ＮＲＰ１アンチセンス、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである。別の特定の実施形態では、化合物は、ＮＲＰ１抗体またはＮＲＰ１トラップであり、前記化合物は、ＶＥＧＦのＮＲＰ１への結合を実質的に減らさない。
特定の実施形態では、化合物はＮＲＰ１トラップである。一実施形態では、ＮＲＰ１トラップは図１９、２０、２７および表１に示されている通りである。
別の実施形態では、本発明のＮＲＰ１トラップは、ＳＥＭＡ３ＡのＮＰＲ−１への結合を阻害するが、ＶＥＧＦのＮＲＰ１への結合を実質的に阻害しない。一実施形態では、このようなＮＲＰ１トラップは、ＮＲＰ１のａ１ａ２ドメインを含むが、ＮＲＰ１のｂ１および／またはｂ２サブドメイン（単一または複数）を含まない。別の実施形態では、このようなトラップは、図２２に示すように、ドメインｂ１中のＮＲＰ１アミノ酸配列のチロシン２９７に対応する位置に変異を含み、これは、ＶＥＧＦのこのトラップへの結合を減らすかまたは抑止する。特定の実施形態では、この変異は、位置２９７のチロシンをアラニンに変える。
特定の実施形態では、本発明のＮＲＰ１トラップは、ａ）ＮＲＰ１のドメインａ１、ａ２、ｂ１、ｂ２およびｃを含む；ｂ）ＮＲＰ１のドメインａ１、ａ２、ｂ１およびｂ２を含む；ｃ）ＮＲＰ１のドメインａ１、ａ２およびｂ１を含む；ｄ）ＮＲＰ１のドメインａ１およびａ２を含む；ｅ）ＮＲＰ１のドメインｂ１を含み、このｂ１ドメインがＮＲＰ１のチロシン２９７に対応するアミノ酸の変異を含み、この変異がＶＥＧＦへの結合を減らすかまたは抑止する；ｆ）ＮＲＰ１のドメインｂ１を含み、このｂ１ドメインが、ＮＲＰ１のチロシン２９７に対応するアミノ酸の変異を含み、この変異がチロシンをアラニンに変える；ｇ）ＮＲＰ１のドメインｃを含まない；ｈ）ＮＲＰ１のドメインｂ１を含まない；ｉ）ＮＲＰ１のドメインｂ１およびｂ２を含まない；またはｊ）ＮＲＰ１のドメインｂ１、ｂ２およびｃを含まない。
一実施形態では、本発明のＮＲＰ１トラップは、（ｉ）図２６（配列番号６９）に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１〜８５６（好ましくは２２〜８５６）；（ｉｉ）図２６（配列番号６９）に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１〜５８３（好ましくは２２〜５８３）；（ｉｉｉ）図２６（配列番号６９）に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１〜４２４（好ましくは２２〜４２４）；（ｉｖ）図２６（配列番号６９）に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１〜２６５（好ましくは２２〜２６５）；（ｖ）図２６（配列番号６９）に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１〜４３０および５８４〜８５６（好ましくは２２〜４３０および５８４〜８５６）；（ｖｉ）図２６（配列番号６９）に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１〜２７４および５８４〜８５６（好ましくは２２〜２７４および５８４〜８５６）；（ｖｉｉ）図２６（配列番号６９）に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１〜４３０および５８４（好ましくは２２〜４３０および５８４〜８５６）を含む。特定の実施形態では、上述のトラップは、１つまたは複数の変異を含み、上述のように、ＶＥＧＦまたはＳＥＭＡ３Ａ結合を減らす。
別の態様では、本発明は、ｉ）炎症の処置および予防またはｉｉ）自然免疫応答の過剰活性化の防止または低減のための組成物を提供し、該組成物は、医薬キャリアと一緒に本発明の１種または複数の化合物を含む。
本発明はまた、ｉ）炎症の処置および予防またはｉｉ）自然免疫応答の過剰活性化の防止または低減のための、薬物の製造における本発明の１種または複数の化合物の使用に関する。
関連する態様では、本発明は、ｉ）炎症の処置および予防またはｉｉ）自然免疫応答の過剰活性化の防止または低減のための本発明の１種または複数の化合物の使用に関する。
特定の実施形態では、本発明の方法、化合物（例えば、ＮＲＰ１ポリペプチドトラップ、これをコードする核酸、ベクター、ベクターを含む細胞、など）、組成物および使用は、敗血性ショック、関節炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、皮膚炎症、糖尿病、ぶどう膜炎、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、加齢性認知機能低下／アルツハイマー病または脳卒中からなる群より選択される炎症性疾患および状態を処置または予防するためである。
一実施形態では、本発明の方法、化合物、組成物および使用は、敗血性ショック、脳虚血または脳卒中を処置または予防するためである。
より具体的には、本発明では、次の項目が提供される。
１．対象のＮＲＰ１依存性細胞内シグナル伝達を阻害することを含む炎症を処置または予防する方法。
２．対象のＮＲＰ１依存性細胞内シグナル伝達を阻害することを含む、自然免疫応答の過剰活性化を防止するまたは減らす方法。
３．前記自然免疫応答の過剰活性化が、ｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαの分泌および／または単核貪食細胞（ＭＰ）の動員を含む、項目２に記載の方法。
４．ＮＲＰ１依存性細胞内シグナル伝達の阻害が、（ａ）ＮＲＰ１発現または活性を減らすこと、および／または（ｂ）ＮＲＰ１リガンド発現または活性を減らすことを含み、前記ＮＲＰ１リガンドがＳＥＭＡ３Ａ、ＶＥＧＦおよび／またはＴＧＦ−βである、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
５．（ｉ）ＮＲＰ１の少なくとも１つのＮＲＰ１リガンドへの前記結合を阻害することによるＮＲＰ１活性の低減を含む、項目４に記載の方法。
６．前記ＮＲＰ１リガンドがＳＥＭＡ３Ａ、ＶＥＧＦまたはＴＧＦ−βである、項目５に記載の方法。
７．ＮＲＰ１の少なくとも１つのＮＲＰ１リガンドへの前記結合の阻害が、抗ＮＲＰ１抗体またはＮＲＰ１トラップを投与することを含み、前記トラップがＮＲＰ１ポリペプチドまたはその機能性断片もしくは変異体を含む、項目５または６に記載の方法。
８．前記ＮＲＰ１ポリペプチドが、可溶性ＮＲＰ１アイソフォーム２に対応する、項目７に記載の方法。
９．前記可溶性ＮＰＲ１アイソフォーム２が、シグナルペプチドを含まない図２２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかまたは基本的にそれから構成される、項目８に記載の方法。
１０．前記ＮＲＰ１ポリペプチドが、ＮＲＰ１アイソフォーム１ポリペプチドの細胞外ドメインに対応する、項目７に記載の方法。
１１．前記ＮＲＰ１アイソフォーム１ポリペプチドが、図２６に示す通りであり、前記細胞外ドメインが、図２６（配列番号６６）に示すＮＲＰ１ポリペプチドに対応するアミノ酸２２〜８５９を含む、項目１０に記載の方法。
１２．前記ＮＲＰ１トラップが、（ｉ）配列番号６５で示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸２２〜６０９；（ｉｉ）配列番号６６で示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸２２〜８５９；（ｉｉｉ）配列番号６９で示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸２２〜８５９、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の機能性断片もしくは機能性変異体を含むＮＲＰ１ポリペプチドを含む、項目７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
１３．前記抗ＮＲＰ１抗体がＳＥＭＡ３ＡのＮＰＲ−１への結合を阻害するが、ＶＥＧＦのＮＲＰ１への結合を実質的に阻害せず、前記ＮＲＰ１トラップがＳＥＭＡ３Ａに結合するが、ＶＥＧＦ１６５に実質的に結合しないかまたはＳＥＭＡ３Ａの結合親和性に比べてＶＥＧＦ１６５に対する低い結合親和性を有する、項目７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
１４．前記ＮＲＰ１トラップが、（ｉ）ＮＲＰ１のドメインｂ１および／またはｂ２を完全にまたは部分的に欠いている；または（ｉｉ）ＮＲＰ１へのＶＥＧＦの結合を阻害する、少なくとも１つのアミノ酸点変異を含む、項目１３に記載の方法。
１５．前記抗ＮＲＰ１抗体が、ＮＲＰ１のドメインｂ１および／またはｂ２に結合しない、項目１３に記載の方法。
１６．前記点変異が、（ａ）図２２または図２６に示すＮＲＰ１アミノ酸配列のチロシン２９７に対応するドメインｂ１のアミノ酸残基のアミノ酸置換または欠失；（ｂ）図２２または図２６に示すＮＲＰ１アミノ酸配列のアスパラギン酸３２０に対応するドメインｂ１のアミノ酸残基のアミノ酸置換または欠失；および／または（ｃ）図２２または図２６に示すＮＲＰ１アミノ酸配列のグルタミン酸３１９に対応するドメインｂ１のアミノ酸残基のアミノ酸置換または欠失、を含む、項目１４に記載の方法。
１７．前記点変異がＹ２９７Ａ置換；Ｄ３２０Ｋ置換および／またはＥ３１９Ｋ置換である、項目１６に記載の方法。
１８．前記ＮＲＰ１トラップが、（ａ）前記ＮＲＰ１ポリペプチドのドメインａ１、ａ２、ｂ１、ｂ２、およびｃを含む；（ｂ）前記ＮＲＰ１ポリペプチドのドメインａ１、ａ２、ｂ１およびｂ２を含む；（ｃ）前記ＮＲＰ１ポリペプチドのドメインａ１、ａ２、およびｂ１を含む；（ｄ）前記ＮＲＰ１ポリペプチドのドメインａ１およびａ２を含む；（ｆ）前記ＮＲＰ１ポリペプチドのドメインｂ１を含み、前記ドメインｂ１は、図２６に示すアミノ酸配列を含むＮＲＰ１ポリペプチドの（ｉ）チロシン２９７、（ｉｉ）アスパラギン酸３２０および／または（ｉｉｉ）グルタミン酸３１９に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの点変異を含み、前記少なくとも１つの変異がＶＥＧＦ１６５への結合を減らすかまたは抑止する；（ｇ）前記ＮＲＰ１ポリペプチドのドメインｃを完全にまたは部分的に欠いている；（ｈ）前記ＮＲＰ１ポリペプチドのドメインｂ１を完全にまたは部分的に欠いている；（ｉ）前記ＮＲＰ１ポリペプチドのドメインｂ２を完全にまたは部分的に欠いている；（ｊ）前記ＮＲＰ１ポリペプチドのドメインｂ１およびｂ２を欠いている；または（ｋ）前記ＮＲＰ１ポリペプチドのドメインｂ１、ｂ２およびｃを欠いている、項目７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
１９．（ｉ）前記ドメインａ１が図２６に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸２７〜１４１に対応するアミノ酸配列を含むかまたは基本的にそれから構成される；（ｉｉ）前記ドメインａ２が図２６に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１４７〜２６５に対応するアミノ酸配列を含む；（ｉｉｉ）前記ドメインｂ１が図２６に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸２７５〜４２４に対応するアミノ酸配列を含む；（ｉｖ）前記ドメインｂ２が図２６に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸４３１〜５８３に対応するアミノ酸配列を含む；および／または（ｖ）前記ドメインｃが図２６に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸６４５〜８１１に対応するアミノ酸配列を含む、項目１８に記載の方法。
２０．（ｉ）前記ドメインａ１が図２６に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸２２〜１４８に対応するアミノ酸配列を含むかまたは基本的にそれから構成される；（ｉｉ）前記ドメインａ２が図２６に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１４９〜２７５に対応するアミノ酸配列を含む；（ｉｉｉ）前記ドメインｂ１が図２６に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸２７６〜４２８に対応するアミノ酸配列を含む；（ｉｖ）前記ドメインｂ２が図２６に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸４２９〜５８９に対応するアミノ酸配列を含む；および／または（ｖ）前記ドメインｃが図２６に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸５９０〜８５９に対応するアミノ酸配列を含む、項目１８に記載の方法。
２１．前記方法が、表１に示すトラップから本質的になるＮＲＰ１トラップまたはその機能性変異体を投与することによる、ＮＲＰ１の少なくとも１つのＮＲＰ１リガンドへの前記結合を阻害することを含む、項目７に記載の方法。
２２．前記ＮＲＰ１トラップが、タンパク質精製ドメインをさらに含む、項目７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
２３．前記精製ドメインがポリヒスチジンタグである、項目２２に記載の方法。
２４．前記ＮＲＰ１トラップがＦＣドメインをさらに含む、項目７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
２５．前記ＮＲＰ１トラップが、前記タンパク質精製ドメインまたはＦＣドメインを前記ＮＲＰ１トラップから取り除くことを可能とするプロテアーゼまたはペプチダーゼ切断部位を含む、項目２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
２６．前記プロテアーゼまたはペプチダーゼ切断部位が、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位である、項目２５に記載の方法。
２７．前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位が、アミノ酸配列ＧＳＫＥＮＬＹＦＱＧを含む、項目２６に記載の方法。
２８．ＮＲＰ１リガンドの発現または活性を減らすことを含み、ＮＲＰ１リガンドがＳＥＭＡ３Ａである、項目４に記載の方法。
２９．ＳＥＭＡ３Ａのセマドメインに結合する抗ＳＥＭＡ３Ａ抗体を投与することによるＳＥＭＡ３ＡのＮＲＰ１への結合を阻害することにより、ＳＥＭＡ３Ａ活性を減らすことを含む、項目２８に記載の方法。
３０．ＮＲＰ１アンチセンス、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを投与することにより、ＮＲＰ１発現を減らすことを含む、項目４に記載の方法。
３１．ＳＥＭＡ３Ａアンチセンス、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを投与することにより、ＳＥＭＡ３Ａ発現を減らすことを含む、項目４に記載の方法。
３２．ＳＥＭＡ３Ａ、ＶＥＧＦ１６５および／またはＴＧＦ−βに結合する、ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその機能性断片もしくは変異体を含むＮＲＰ１ポリペプチドトラップ。
３３．可溶性ＮＲＰ１アイソフォーム２に対応する、項目３２に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ。
３４．前記可溶性ＮＰＲ１アイソフォーム２が、シグナルペプチドを含まない図２２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかまたは基本的にそれから構成される、項目３３のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ。
３５．前記ＮＲＰ１ポリペプチドが、ＮＲＰ１アイソフォーム１ポリペプチドの細胞外ドメインに対応する、項目３４に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ。
３６．前記ＮＲＰ１アイソフォーム１ポリペプチドが、図２６に示す通りであり、前記細胞外ドメインがアミノ酸２２〜８５９に対応する、項目３５に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ。
３７．前記ＮＲＰ１トラップが、（ｉ）配列番号６５で示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸２２〜６０９；（ｉｉ）配列番号６６で示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸２２〜８５９；（ｉｉｉ）；配列番号６９で示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸２２〜８５９、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の機能性断片もしくは機能性変異体を含むＮＲＰ１ポリペプチドを含む、項目３２〜３６のいずれか１項に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ。
３８．ＮＲＰ１トラップがＳＥＭＡ３Ａに結合するが、ＶＥＧＦ１６５に実質的に結合しないかまたはＳＥＭＡ３Ａとの結合親和性に比べて、ＶＥＧＦ１６５に対し低い結合親和性を有する、項目３２〜３７のいずれか１項に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ。
３９．前記ＮＲＰ１トラップが、（ｉ）ＮＲＰ１のドメインｂ１および／またはｂ２を完全にまたは部分的に欠いている；または（ｉｉ）ＮＲＰ１へのＶＥＧＦの結合を阻害する、少なくとも１つのアミノ酸点変異を含む、項目３８に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ。
４０．前記点変異が、（ａ）図２２または図２６に示すＮＲＰ１アミノ酸配列のチロシン２９７に対応するドメインｂ１のアミノ酸残基のアミノ酸置換または欠失；（ｂ）図２２または図２６に示すＮＲＰ１アミノ酸配列のアスパラギン酸３２０に対応するドメインｂ１のアミノ酸残基のアミノ酸置換または欠失；および／または（ｃ）図２２または図２６に示すＮＲＰ１アミノ酸配列のグルタミン酸３１９に対応するドメインｂ１のアミノ酸残基のアミノ酸置換または欠失を含む、項目３９に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ。
４１．前記点変異がＹ２９７Ａ置換；Ｄ３２０Ｋ置換および／またはＥ３１９Ｋ置換である、項目４０に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ。
４２．前記トラップが、（ａ）前記ＮＲＰ１ポリペプチドのドメインａ１、ａ２、ｂ１、ｂ２、およびｃを含む；（ｂ）前記ＮＲＰ１ポリペプチドのドメインａ１、ａ２、ｂ１およびｂ２を含む；（ｃ）前記ＮＲＰ１ポリペプチドのドメインａ１、ａ２、およびｂ１を含む；（ｄ）前記ＮＲＰ１ポリペプチドのドメインａ１およびａ２を含む；（ｅ）前記ＮＲＰ１ポリペプチドのドメインｂ１を含み、前記ドメインｂ１は、図２６に示すアミノ酸配列を含むＮＲＰ１ポリペプチドの（ｉ）チロシン２９７、（ｉｉ）アスパラギン酸３２０および／または（ｉｉｉ）グルタミン酸３１９に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの点変異を含み、前記少なくとも１つの変異がＶＥＧＦ１６５への結合を減らすかまたは抑止する；（ｆ）前記ＮＲＰ１ポリペプチドのドメインｃを完全にまたは部分的に欠いている；（ｇ）前記ＮＲＰ１ポリペプチドのドメインｂ１を完全にまたは部分的に欠いている；（ｈ）前記ＮＲＰ１ポリペプチドのドメインｂ２を完全にまたは部分的に欠いている；（ｉ）前記ＮＲＰ１ポリペプチドのドメインｂ１およびｂ２を欠いている；または（ｊ）前記ＮＲＰ１ポリペプチドのドメインｂ１、ｂ２およびｃを欠いている、項目３２〜３８のいずれか１項に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ。
４３．（ｉ）前記ドメインａ１が図２６に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸２７〜１４１に対応するアミノ酸配列を含むかまたは基本的にそれから構成される；（ｉｉ）前記ドメインａ２が図２６に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１４７〜２６５に対応するアミノ酸配列を含む；（ｉｉｉ）前記ドメインｂ１が図２６に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸２７５〜４２４に対応するアミノ酸配列を含む；（ｉｖ）前記ドメインｂ２が図２６に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸４３１〜５８３に対応するアミノ酸配列を含む；および／または（ｖ）前記ドメインｃが図２６に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸６４５〜８１１に対応するアミノ酸配列を含む、項目４２に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ。
４４．（ｉ）前記ドメインａ１が図２６に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸２２〜１４８に対応するアミノ酸配列を含むかまたは基本的にそれから構成される；（ｉｉ）前記ドメインａ２が図２６に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１４９〜２７５に対応するアミノ酸配列を含む；（ｉｉｉ）前記ドメインｂ１が図２６に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸２７６〜４２８に対応するアミノ酸配列を含む；（ｉｖ）前記ドメインｂ２が図２６に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸４２９〜５８９に対応するアミノ酸配列を含む；および／または（ｖ）前記ドメインｃが図２６に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸５９０〜８５９に対応するアミノ酸配列を含む、項目４２に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ。
４５．前記トラップが表１に示すトラップまたはその機能性変異体から本質的になる、項目３２に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ。
４６．前記トラップが、タンパク質精製ドメインをさらに含む、項目３２〜４４のいずれか１項に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ。
４７．前記精製ドメインがポリヒスチジンタグである、項目４６に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ。
４８．前記ＮＲＰ１トラップが、ＦＣドメインをさらに含む、項目３２〜４７のいずれか１項に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ。
４９．前記ＮＲＰ１トラップが、前記タンパク質精製ドメインまたはＦＣドメインを前記ＮＲＰ１トラップから取り除くことを可能とするプロテアーゼまたはペプチダーゼ切断部位を含む、項目４６〜４８のいずれか１項に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ。
５０．前記プロテアーゼまたはペプチダーゼ切断部位が、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位である、項目４９に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ。
５１．前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位が、アミノ酸配列ＧＳＫＥＮＬＹＦＱＧを含む、項目５０に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ。
５２．項目３２〜５１のいずれか１項に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップをコードする核酸。
５３．項目５２に記載の核酸を含む発現ベクター。
５４．項目５３に記載のベクターを含む宿主細胞。
５５．項目３２〜５１のいずれか１項に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ、項目５２に記載の核酸、項目５３に記載のベクターまたは項目５４に記載の宿主細胞および適切なキャリアを含む組成物。
５６．（ｉｉ）炎症を予防または処置するための、または（ｉｉ）自然免疫応答の過剰活性化を防止するまたは減らすための、項目５５に記載の組成物。
５７．炎症を予防または処置するための化合物であって、（ａ）ＮＲＰ１発現または活性を減らし、および／または（ｂ）ＮＲＰ１リガンド発現または活性を減らす、化合物。
５８．自然免疫応答の過剰活性化を防止するまたは減らすための化合物であって、（ａ）ＮＲＰ１発現または活性を減らし、および／または（ｂ）ＮＲＰ１リガンド発現または活性を減らす、化合物。
５９．（ｉ）抗ＳＥＭＡ３Ａ抗体、（ｉｉ）抗ＶＥＧＦ１６５抗体、（ｉｉｉ）抗ＮＲＰ１抗体、（ｉｖ）ＮＲＰ１トラップ、（ｖ）ＳＥＭＡ３Ａアンチセンス、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ、（ｖｉ）ＮＲＰ１アンチセンス、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ、または（ｖｉｉ）ＶＥＧＦアンチセンス、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、項目５７または５８に記載の化合物。
６０．前記化合物がＮＲＰ１ポリペプチドトラップである、項目５９に記載の化合物。
６１．項目５７〜６０のいずれか１項に定められる化合物および適切なキャリアを含む炎症を処置または予防するための組成物。
６２．項目５７〜６０のいずれか１項に定められる化合物および適切なキャリアを含む自然免疫応答の過剰活性化を防止するまたは減らすための組成物。
６３．項目３２〜５１のいずれか１項に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ、項目５２記載の核酸、項目５３に記載のベクター、項目５４に記載の宿主細胞、項目５７〜６０のいずれか１項に記載の化合物または項目５５、６１および６２のいずれか１項に記載の組成物の、炎症を予防または処置するための薬物の製造における使用。
６４．項目３２〜５１のいずれか１項に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ、項目５２記載の核酸、項目５３に記載のベクター、項目５４に記載の宿主細胞、項目５７〜６０のいずれか１項に記載の化合物または項目５５、６１および６２のいずれか１項に記載の組成物の、炎症を予防または処置するための薬物の製造における使用。
６５．項目３２〜５１のいずれか１項に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ、項目５２記載の核酸、項目５３に記載のベクター、項目５４に記載の宿主細胞、項目５７〜６０のいずれか１項で定められる化合物または項目５５、６１および６２のいずれか１項で定められる組成物の、自然免疫応答の過剰活性化を防止または処置するための使用。
６６．項目３２〜５１のいずれか１項に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ、項目５２記載の核酸、項目５３に記載のベクター、項目５４に記載の宿主細胞、項目５７〜６０のいずれか１項で定められる化合物または項目５５、６１および６２のいずれか１項で定められる組成物の、自然免疫応答の過剰活性化を防止または減らすための使用。
６７．前記対象が、敗血性ショック、関節炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、皮膚炎症、糖尿病、ぶどう膜炎、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、加齢性認知機能低下／アルツハイマー病または脳卒中に罹患しているかまたは罹患する可能性がある、項目１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
６８．前記方法、ＮＲＰ１ポリペプチドトラップ、核酸、ベクター、宿主細胞、化合物、組成物または使用が、敗血性ショック、関節炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、皮膚炎症、糖尿病、ぶどう膜炎、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、加齢性認知機能低下／アルツハイマー病または脳卒中を処置または予防するためである、項目１〜３１のいずれか１項に記載の方法、項目３２〜５１のいずれか１項に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ、項目５２記載の核酸、項目５３に記載のベクター、項目５４に記載の宿主細胞、項目５７〜６０のいずれか１項で定められる化合物または項目５５、６１および６２のいずれか１項で定められる組成物。
６９．前記方法、ＮＲＰ１ポリペプチドトラップ、核酸、ベクター、宿主細胞、化合物、組成物または使用が、敗血性ショックまたは脳卒中を処置または予防するためである、項目１〜３１のいずれか１項に記載の方法、項目３２〜５１のいずれか１項に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップ、項目５２記載の核酸、項目５３に記載のベクター、項目５４に記載の宿主細胞、項目５７〜６０のいずれか１項で定められる化合物または項目５５、６１および６２のいずれか１項で定められる組成物。
本発明の他の目的、利点および特徴は、例示のみを目的として示す、以下の特定の実施形態に関する非限定的な説明を添付の図面を参照して解釈することにより、一層明らかになるであろう。
特許または特許出願ファイルは、少なくとも１つのカラー図面を含む。このカラー図面（単一または複数）を含む特許または特許出願公開公報のコピーは、要求があり、必要な手数料を支払えば米国特許商標局より提供される。
ＮＲＰ１が血管傷害に続いて動員されるミクログリア集団を特定することを示す図である。（Ａ）酸素誘導網膜症（ＯＩＲ）のマウスモデルの概略図。第１期（生後７〜１２日（Ｐ７〜Ｐ１２））、７５％酸素下で、血管喪失を誘導する。第２期（室内気下）生後１２日から１７日（Ｐ７〜Ｐ１７）では、最大網膜前血管新生が可能となる。（Ｂ、ＥおよびＨ）は、Ｐ１０（Ｂ）、Ｐ１４（Ｅ）およびＰ１７（Ｈ）でＷＴ ＯＩＲおよび正常酸素圧対照マウスから集められた網膜中のＣＤ１１ｂ＋／Ｆ４−８０＋／Ｇｒ−１−細胞（ミクログリア）の代表的ＦＡＣＳプロットを示す。（Ｃ、ＦおよびＩ）は、Ｐ１０（Ｃ）、Ｐ１４（Ｆ）およびＰ１７（Ｉ）の正常酸素圧（Ｎ）およびＯＩＲでの網膜ミクログリアの数の倍率変化を示す。網膜ミクログリアの数は、分析した全ての時点でＯＩＲ中で大きく増加した（Ｃ、ＦおよびＩ）；ｎ＝７〜８（正常酸素圧（Ｎ））、ｎ＝７〜８（ＯＩＲ）（条件当たり合計２８〜３２個の網膜；各「ｎ」は４個の網膜を含む）。（Ｄ、ＧおよびＪ）は、Ｐ１０（Ｄ）、Ｐ１４（Ｇ）およびＰ１７（Ｊ）のＮＲＰ１陽性ＭＰの数の倍率変化を示す。ＯＩＲ網膜でＮＲＰ１陽性ミクログリア数の比例的増加が観察された（Ｄ、ＧおよびＪ）；ｎ＝３〜５（正常酸素圧（Ｎ））、ｎ＝３〜５（ＯＩＲ）（条件当たり合計１２〜２０個の網膜；各「ｎ」は４個の網膜から構成される）。（Ｋ）ＭＰ常在性ＮＲＰ１の役割を調べるために、網膜ミクログリア中の大きく損なわれたＮＲＰ１を発現しているＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスを生成した；ｎ＝３（ＷＴ）、ｎ＝４（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌ、条件当たり合計１２〜１６個の網膜）。左パネルは、ＦＡＣＳ（右パネル）により測定した、ＷＴ中のＮＰＲ−１陽性ＭＰ（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／ＮＲＰ１＋／＋）およびそれらの骨髄細胞中のＮＲＰ１欠損マウス（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌ）の％を示す。（Ｌ、ＮおよびＰ）は、正常酸素圧およびＯＩＲでのＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス網膜中のＭＰの数を定量化するための、Ｐ１０（Ｌ）、Ｐ１４（Ｎ）およびＰ１７（Ｐ）のＦＡＣＳ分析である。（Ｍ、ＯおよびＱ）は、正常酸素圧およびＯＩＲでのＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス網膜中のＭＰの数の倍率変化を示す。ＯＩＲ（Ｌ、Ｎ）の増殖期中のＰ１０およびＰ１４のＦＡＣＳ分析により、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスは、これらの時点（Ｍ、Ｏ）でＯＩＲ中でＣＤ１１ｂ＋／Ｆ４−８０＋／Ｇｒ−１−細胞数の増加を示さなかったので、ＭＰ常在性ＮＲＰ１は、虚血性網膜中へのＭＰ浸潤のためには不可欠であることが明らかである。Ｐ１７で、ＭＰはＮＲＰ１と関係なく浸潤する（Ｐ、Ｑ）。ｎ＝７〜８（Ｎ）、ｎ＝７〜９（ＯＩＲ）（条件当たり合計２８〜３６個の網膜；各「ｎ」は４個の網膜を含む）。（Ｒ）ＷＴおよびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスにおけるＯＩＲ期間の網膜中のＭＰ蓄積のまとめのグラフである。（Ｓ、Ｔ）Ｇｒ１−／ＣＤ１１ｂ＋／Ｆ４／８０＋細胞が高レベルのＣＸ３ＣＲ１および中／低レベルのＣＤ４５を発現することを示す代表的ＦＡＣＳプロットである。ＷＴ網膜（Ｓ）中でＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈおよびＣＤ４５ｌｏｗ細胞は、ＮＲＰ１を発現し、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス（Ｔ）由来の網膜中ではＮＲＰ１を発現しない。データは、対照と比較した倍率変化±ＳＥＭとして表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＞０．０００１。 Ｂ−Ｊ。ＮＲＰ１が血管傷害に続いて動員されるミクログリア集団を特定することを示す図である。（Ａ）酸素誘導網膜症（ＯＩＲ）のマウスモデルの概略図。第１期（生後７〜１２日（Ｐ７〜Ｐ１２））、７５％酸素下で、血管喪失を誘導する。第２期（室内気下）生後１２日から１７日（Ｐ７〜Ｐ１７）では、最大網膜前血管新生が可能となる。（Ｂ、ＥおよびＨ）は、Ｐ１０（Ｂ）、Ｐ１４（Ｅ）およびＰ１７（Ｈ）でＷＴ ＯＩＲおよび正常酸素圧対照マウスから集められた網膜中のＣＤ１１ｂ＋／Ｆ４−８０＋／Ｇｒ−１−細胞（ミクログリア）の代表的ＦＡＣＳプロットを示す。（Ｃ、ＦおよびＩ）は、Ｐ１０（Ｃ）、Ｐ１４（Ｆ）およびＰ１７（Ｉ）の正常酸素圧（Ｎ）およびＯＩＲでの網膜ミクログリアの数の倍率変化を示す。網膜ミクログリアの数は、分析した全ての時点でＯＩＲ中で大きく増加した（Ｃ、ＦおよびＩ）；ｎ＝７〜８（正常酸素圧（Ｎ））、ｎ＝７〜８（ＯＩＲ）（条件当たり合計２８〜３２個の網膜；各「ｎ」は４個の網膜を含む）。（Ｄ、ＧおよびＪ）は、Ｐ１０（Ｄ）、Ｐ１４（Ｇ）およびＰ１７（Ｊ）のＮＲＰ１陽性ＭＰの数の倍率変化を示す。ＯＩＲ網膜でＮＲＰ１陽性ミクログリア数の比例的増加が観察された（Ｄ、ＧおよびＪ）；ｎ＝３〜５（正常酸素圧（Ｎ））、ｎ＝３〜５（ＯＩＲ）（条件当たり合計１２〜２０個の網膜；各「ｎ」は４個の網膜から構成される）。（Ｋ）ＭＰ常在性ＮＲＰ１の役割を調べるために、網膜ミクログリア中の大きく損なわれたＮＲＰ１を発現しているＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスを生成した；ｎ＝３（ＷＴ）、ｎ＝４（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌ、条件当たり合計１２〜１６個の網膜）。左パネルは、ＦＡＣＳ（右パネル）により測定した、ＷＴ中のＮＰＲ−１陽性ＭＰ（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／ＮＲＰ１＋／＋）およびそれらの骨髄細胞中のＮＲＰ１欠損マウス（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌ）の％を示す。（Ｌ、ＮおよびＰ）は、正常酸素圧およびＯＩＲでのＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス網膜中のＭＰの数を定量化するための、Ｐ１０（Ｌ）、Ｐ１４（Ｎ）およびＰ１７（Ｐ）のＦＡＣＳ分析である。（Ｍ、ＯおよびＱ）は、正常酸素圧およびＯＩＲでのＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス網膜中のＭＰの数の倍率変化を示す。ＯＩＲ（Ｌ、Ｎ）の増殖期中のＰ１０およびＰ１４のＦＡＣＳ分析により、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスは、これらの時点（Ｍ、Ｏ）でＯＩＲ中でＣＤ１１ｂ＋／Ｆ４−８０＋／Ｇｒ−１−細胞数の増加を示さなかったので、ＭＰ常在性ＮＲＰ１は、虚血性網膜中へのＭＰ浸潤のためには不可欠であることが明らかである。Ｐ１７で、ＭＰはＮＲＰ１と関係なく浸潤する（Ｐ、Ｑ）。ｎ＝７〜８（Ｎ）、ｎ＝７〜９（ＯＩＲ）（条件当たり合計２８〜３６個の網膜；各「ｎ」は４個の網膜を含む）。（Ｒ）ＷＴおよびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスにおけるＯＩＲ期間の網膜中のＭＰ蓄積のまとめのグラフである。（Ｓ、Ｔ）Ｇｒ１−／ＣＤ１１ｂ＋／Ｆ４／８０＋細胞が高レベルのＣＸ３ＣＲ１および中／低レベルのＣＤ４５を発現することを示す代表的ＦＡＣＳプロットである。ＷＴ網膜（Ｓ）中でＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈおよびＣＤ４５ｌｏｗ細胞は、ＮＲＰ１を発現し、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス（Ｔ）由来の網膜中ではＮＲＰ１を発現しない。データは、対照と比較した倍率変化±ＳＥＭとして表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＞０．０００１。 ＮＲＰ１が血管傷害に続いて動員されるミクログリア集団を特定することを示す図である。（Ａ）酸素誘導網膜症（ＯＩＲ）のマウスモデルの概略図。第１期（生後７〜１２日（Ｐ７〜Ｐ１２））、７５％酸素下で、血管喪失を誘導する。第２期（室内気下）生後１２日から１７日（Ｐ７〜Ｐ１７）では、最大網膜前血管新生が可能となる。（Ｂ、ＥおよびＨ）は、Ｐ１０（Ｂ）、Ｐ１４（Ｅ）およびＰ１７（Ｈ）でＷＴ ＯＩＲおよび正常酸素圧対照マウスから集められた網膜中のＣＤ１１ｂ＋／Ｆ４−８０＋／Ｇｒ−１−細胞（ミクログリア）の代表的ＦＡＣＳプロットを示す。（Ｃ、ＦおよびＩ）は、Ｐ１０（Ｃ）、Ｐ１４（Ｆ）およびＰ１７（Ｉ）の正常酸素圧（Ｎ）およびＯＩＲでの網膜ミクログリアの数の倍率変化を示す。網膜ミクログリアの数は、分析した全ての時点でＯＩＲ中で大きく増加した（Ｃ、ＦおよびＩ）；ｎ＝７〜８（正常酸素圧（Ｎ））、ｎ＝７〜８（ＯＩＲ）（条件当たり合計２８〜３２個の網膜；各「ｎ」は４個の網膜を含む）。（Ｄ、ＧおよびＪ）は、Ｐ１０（Ｄ）、Ｐ１４（Ｇ）およびＰ１７（Ｊ）のＮＲＰ１陽性ＭＰの数の倍率変化を示す。ＯＩＲ網膜でＮＲＰ１陽性ミクログリア数の比例的増加が観察された（Ｄ、ＧおよびＪ）；ｎ＝３〜５（正常酸素圧（Ｎ））、ｎ＝３〜５（ＯＩＲ）（条件当たり合計１２〜２０個の網膜；各「ｎ」は４個の網膜から構成される）。（Ｋ）ＭＰ常在性ＮＲＰ１の役割を調べるために、網膜ミクログリア中の大きく損なわれたＮＲＰ１を発現しているＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスを生成した；ｎ＝３（ＷＴ）、ｎ＝４（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌ、条件当たり合計１２〜１６個の網膜）。左パネルは、ＦＡＣＳ（右パネル）により測定した、ＷＴ中のＮＰＲ−１陽性ＭＰ（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／ＮＲＰ１＋／＋）およびそれらの骨髄細胞中のＮＲＰ１欠損マウス（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌ）の％を示す。（Ｌ、ＮおよびＰ）は、正常酸素圧およびＯＩＲでのＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス網膜中のＭＰの数を定量化するための、Ｐ１０（Ｌ）、Ｐ１４（Ｎ）およびＰ１７（Ｐ）のＦＡＣＳ分析である。（Ｍ、ＯおよびＱ）は、正常酸素圧およびＯＩＲでのＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス網膜中のＭＰの数の倍率変化を示す。ＯＩＲ（Ｌ、Ｎ）の増殖期中のＰ１０およびＰ１４のＦＡＣＳ分析により、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスは、これらの時点（Ｍ、Ｏ）でＯＩＲ中でＣＤ１１ｂ＋／Ｆ４−８０＋／Ｇｒ−１−細胞数の増加を示さなかったので、ＭＰ常在性ＮＲＰ１は、虚血性網膜中へのＭＰ浸潤のためには不可欠であることが明らかである。Ｐ１７で、ＭＰはＮＲＰ１と関係なく浸潤する（Ｐ、Ｑ）。ｎ＝７〜８（Ｎ）、ｎ＝７〜９（ＯＩＲ）（条件当たり合計２８〜３６個の網膜；各「ｎ」は４個の網膜を含む）。（Ｒ）ＷＴおよびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスにおけるＯＩＲ期間の網膜中のＭＰ蓄積のまとめのグラフである。（Ｓ、Ｔ）Ｇｒ１−／ＣＤ１１ｂ＋／Ｆ４／８０＋細胞が高レベルのＣＸ３ＣＲ１および中／低レベルのＣＤ４５を発現することを示す代表的ＦＡＣＳプロットである。ＷＴ網膜（Ｓ）中でＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈおよびＣＤ４５ｌｏｗ細胞は、ＮＲＰ１を発現し、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス（Ｔ）由来の網膜中ではＮＲＰ１を発現しない。データは、対照と比較した倍率変化±ＳＥＭとして表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＞０．０００１。 Ｌ−Ｑ。ＮＲＰ１が血管傷害に続いて動員されるミクログリア集団を特定することを示す図である。（Ａ）酸素誘導網膜症（ＯＩＲ）のマウスモデルの概略図。第１期（生後７〜１２日（Ｐ７〜Ｐ１２））、７５％酸素下で、血管喪失を誘導する。第２期（室内気下）生後１２日から１７日（Ｐ７〜Ｐ１７）では、最大網膜前血管新生が可能となる。（Ｂ、ＥおよびＨ）は、Ｐ１０（Ｂ）、Ｐ１４（Ｅ）およびＰ１７（Ｈ）でＷＴ ＯＩＲおよび正常酸素圧対照マウスから集められた網膜中のＣＤ１１ｂ＋／Ｆ４−８０＋／Ｇｒ−１−細胞（ミクログリア）の代表的ＦＡＣＳプロットを示す。（Ｃ、ＦおよびＩ）は、Ｐ１０（Ｃ）、Ｐ１４（Ｆ）およびＰ１７（Ｉ）の正常酸素圧（Ｎ）およびＯＩＲでの網膜ミクログリアの数の倍率変化を示す。網膜ミクログリアの数は、分析した全ての時点でＯＩＲ中で大きく増加した（Ｃ、ＦおよびＩ）；ｎ＝７〜８（正常酸素圧（Ｎ））、ｎ＝７〜８（ＯＩＲ）（条件当たり合計２８〜３２個の網膜；各「ｎ」は４個の網膜を含む）。（Ｄ、ＧおよびＪ）は、Ｐ１０（Ｄ）、Ｐ１４（Ｇ）およびＰ１７（Ｊ）のＮＲＰ１陽性ＭＰの数の倍率変化を示す。ＯＩＲ網膜でＮＲＰ１陽性ミクログリア数の比例的増加が観察された（Ｄ、ＧおよびＪ）；ｎ＝３〜５（正常酸素圧（Ｎ））、ｎ＝３〜５（ＯＩＲ）（条件当たり合計１２〜２０個の網膜；各「ｎ」は４個の網膜から構成される）。（Ｋ）ＭＰ常在性ＮＲＰ１の役割を調べるために、網膜ミクログリア中の大きく損なわれたＮＲＰ１を発現しているＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスを生成した；ｎ＝３（ＷＴ）、ｎ＝４（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌ、条件当たり合計１２〜１６個の網膜）。左パネルは、ＦＡＣＳ（右パネル）により測定した、ＷＴ中のＮＰＲ−１陽性ＭＰ（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／ＮＲＰ１＋／＋）およびそれらの骨髄細胞中のＮＲＰ１欠損マウス（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌ）の％を示す。（Ｌ、ＮおよびＰ）は、正常酸素圧およびＯＩＲでのＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス網膜中のＭＰの数を定量化するための、Ｐ１０（Ｌ）、Ｐ１４（Ｎ）およびＰ１７（Ｐ）のＦＡＣＳ分析である。（Ｍ、ＯおよびＱ）は、正常酸素圧およびＯＩＲでのＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス網膜中のＭＰの数の倍率変化を示す。ＯＩＲ（Ｌ、Ｎ）の増殖期中のＰ１０およびＰ１４のＦＡＣＳ分析により、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスは、これらの時点（Ｍ、Ｏ）でＯＩＲ中でＣＤ１１ｂ＋／Ｆ４−８０＋／Ｇｒ−１−細胞数の増加を示さなかったので、ＭＰ常在性ＮＲＰ１は、虚血性網膜中へのＭＰ浸潤のためには不可欠であることが明らかである。Ｐ１７で、ＭＰはＮＲＰ１と関係なく浸潤する（Ｐ、Ｑ）。ｎ＝７〜８（Ｎ）、ｎ＝７〜９（ＯＩＲ）（条件当たり合計２８〜３６個の網膜；各「ｎ」は４個の網膜を含む）。（Ｒ）ＷＴおよびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスにおけるＯＩＲ期間の網膜中のＭＰ蓄積のまとめのグラフである。（Ｓ、Ｔ）Ｇｒ１−／ＣＤ１１ｂ＋／Ｆ４／８０＋細胞が高レベルのＣＸ３ＣＲ１および中／低レベルのＣＤ４５を発現することを示す代表的ＦＡＣＳプロットである。ＷＴ網膜（Ｓ）中でＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈおよびＣＤ４５ｌｏｗ細胞は、ＮＲＰ１を発現し、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス（Ｔ）由来の網膜中ではＮＲＰ１を発現しない。データは、対照と比較した倍率変化±ＳＥＭとして表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＞０．０００１。 Ｒ−Ｔ。ＮＲＰ１が血管傷害に続いて動員されるミクログリア集団を特定することを示す図である。（Ａ）酸素誘導網膜症（ＯＩＲ）のマウスモデルの概略図。第１期（生後７〜１２日（Ｐ７〜Ｐ１２））、７５％酸素下で、血管喪失を誘導する。第２期（室内気下）生後１２日から１７日（Ｐ７〜Ｐ１７）では、最大網膜前血管新生が可能となる。（Ｂ、ＥおよびＨ）は、Ｐ１０（Ｂ）、Ｐ１４（Ｅ）およびＰ１７（Ｈ）でＷＴ ＯＩＲおよび正常酸素圧対照マウスから集められた網膜中のＣＤ１１ｂ＋／Ｆ４−８０＋／Ｇｒ−１−細胞（ミクログリア）の代表的ＦＡＣＳプロットを示す。（Ｃ、ＦおよびＩ）は、Ｐ１０（Ｃ）、Ｐ１４（Ｆ）およびＰ１７（Ｉ）の正常酸素圧（Ｎ）およびＯＩＲでの網膜ミクログリアの数の倍率変化を示す。網膜ミクログリアの数は、分析した全ての時点でＯＩＲ中で大きく増加した（Ｃ、ＦおよびＩ）；ｎ＝７〜８（正常酸素圧（Ｎ））、ｎ＝７〜８（ＯＩＲ）（条件当たり合計２８〜３２個の網膜；各「ｎ」は４個の網膜を含む）。（Ｄ、ＧおよびＪ）は、Ｐ１０（Ｄ）、Ｐ１４（Ｇ）およびＰ１７（Ｊ）のＮＲＰ１陽性ＭＰの数の倍率変化を示す。ＯＩＲ網膜でＮＲＰ１陽性ミクログリア数の比例的増加が観察された（Ｄ、ＧおよびＪ）；ｎ＝３〜５（正常酸素圧（Ｎ））、ｎ＝３〜５（ＯＩＲ）（条件当たり合計１２〜２０個の網膜；各「ｎ」は４個の網膜から構成される）。（Ｋ）ＭＰ常在性ＮＲＰ１の役割を調べるために、網膜ミクログリア中の大きく損なわれたＮＲＰ１を発現しているＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスを生成した；ｎ＝３（ＷＴ）、ｎ＝４（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌ、条件当たり合計１２〜１６個の網膜）。左パネルは、ＦＡＣＳ（右パネル）により測定した、ＷＴ中のＮＰＲ−１陽性ＭＰ（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／ＮＲＰ１＋／＋）およびそれらの骨髄細胞中のＮＲＰ１欠損マウス（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌ）の％を示す。（Ｌ、ＮおよびＰ）は、正常酸素圧およびＯＩＲでのＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス網膜中のＭＰの数を定量化するための、Ｐ１０（Ｌ）、Ｐ１４（Ｎ）およびＰ１７（Ｐ）のＦＡＣＳ分析である。（Ｍ、ＯおよびＱ）は、正常酸素圧およびＯＩＲでのＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス網膜中のＭＰの数の倍率変化を示す。ＯＩＲ（Ｌ、Ｎ）の増殖期中のＰ１０およびＰ１４のＦＡＣＳ分析により、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスは、これらの時点（Ｍ、Ｏ）でＯＩＲ中でＣＤ１１ｂ＋／Ｆ４−８０＋／Ｇｒ−１−細胞数の増加を示さなかったので、ＭＰ常在性ＮＲＰ１は、虚血性網膜中へのＭＰ浸潤のためには不可欠であることが明らかである。Ｐ１７で、ＭＰはＮＲＰ１と関係なく浸潤する（Ｐ、Ｑ）。ｎ＝７〜８（Ｎ）、ｎ＝７〜９（ＯＩＲ）（条件当たり合計２８〜３６個の網膜；各「ｎ」は４個の網膜を含む）。（Ｒ）ＷＴおよびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスにおけるＯＩＲ期間の網膜中のＭＰ蓄積のまとめのグラフである。（Ｓ、Ｔ）Ｇｒ１−／ＣＤ１１ｂ＋／Ｆ４／８０＋細胞が高レベルのＣＸ３ＣＲ１および中／低レベルのＣＤ４５を発現することを示す代表的ＦＡＣＳプロットである。ＷＴ網膜（Ｓ）中でＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈおよびＣＤ４５ｌｏｗ細胞は、ＮＲＰ１を発現し、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス（Ｔ）由来の網膜中ではＮＲＰ１を発現しない。データは、対照と比較した倍率変化±ＳＥＭとして表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＞０．０００１。 Ａ−Ｆ。ＮＲＰ１＋骨髄細胞が網膜中で病理学的血管新生部位に局在化することを示す画像である。Ｐ１４の新生血管出芽タフトを有するＷＴ（Ａ）およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス（Ｇ）中の、ならびにＰ１７の成熟タフトを有するＷＴ（Ｄ）およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス（Ｊ）中のイソレクチンＢ４（血管およびミクログリア染色）およびＮＲＰ１染色網膜のフラットマウントの共焦点画像である。高倍率画像は、ＷＴマウス中の３次元再構成（Ｃ、Ｄ）により確認された、ＮＲＰ１陽性ミクログリア（ＩＢＡ１）と、発生期タフト（Ｂ）および成熟タフト（Ｅ）の両方との共局在を示す。（Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ）は、組織の３次元再構成を示す。（Ａ、右パネル）の白色矢印は、新芽形成タフトを示す。（Ｂ、Ｅ）の白色矢印は、タフトと結合したＮＲＰ１＋ＭＰを示す。ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスは、ＭＰおよびタフト形成が少なかった（Ｇ〜Ｋ）。全てのＩＨＣに対し、３回の独立した実験の代表的画像を示している。スケールバー（Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｊ）：１００μＭ、（Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ）：５０μｍ。 Ｇ−Ｌ。ＮＲＰ１＋骨髄細胞が網膜中で病理学的血管新生部位に局在化することを示す画像である。Ｐ１４の新生血管出芽タフトを有するＷＴ（Ａ）およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス（Ｇ）中の、ならびにＰ１７の成熟タフトを有するＷＴ（Ｄ）およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス（Ｊ）中のイソレクチンＢ４（血管およびミクログリア染色）およびＮＲＰ１染色網膜のフラットマウントの共焦点画像である。高倍率画像は、ＷＴマウス中の３次元再構成（Ｃ、Ｄ）により確認された、ＮＲＰ１陽性ミクログリア（ＩＢＡ１）と、発生期タフト（Ｂ）および成熟タフト（Ｅ）の両方との共局在を示す。（Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ）は、組織の３次元再構成を示す。（Ａ、右パネル）の白色矢印は、新芽形成タフトを示す。（Ｂ、Ｅ）の白色矢印は、タフトと結合したＮＲＰ１＋ＭＰを示す。ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスは、ＭＰおよびタフト形成が少なかった（Ｇ〜Ｋ）。全てのＩＨＣに対し、３回の独立した実験の代表的画像を示している。スケールバー（Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｊ）：１００μＭ、（Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ）：５０μｍ。 ＮＲＰ１リガンドのＳＥＭＡ３Ａは、増殖糖尿病網膜症を罹患している患者において誘導されることを示す図である。血管造影、眼底検査、スペクトル領域光干渉断層撮影（ＳＤ−ＯＣＴ）および３次元（３Ｄ）網膜マップを、調査のために選択された患者から取得した。対照患者は、非血管病態とし、増殖糖尿病網膜症（ＰＤＲ）の患者と比較した。対照ＥＲＭ患者は、線維性組織（Ｃ）（白色矢印）に続発する脈管構造（矢印）上の牽引張力（Ａ、Ｂ）、後部硝子体剥離（矢頭）および斑状隆起（血管造影および３Ｄマップ）などの糖尿病に関連しない網膜損傷の徴候を示す。ＰＤＲ患者由来の網膜は、蛍光染料の漏出（挿入図）からも明らかな高度に透過性の微小血管（Ｄ）を含む血管新生（Ｅ）（挿入図）、毛細血管瘤（Ｆ）（挿入図矢印）および繊維状瘢痕組織（Ｇ）（矢印）を有し、進行した網膜症を示す。（Ｈ）ＰＤＲ患者は、血管外漏出液の局所的合体による嚢胞形成（白色矢頭）を含む黄斑浮腫のいくつかの証拠を示す。（Ｉ）ＥＬＩＳＡによる硝子体液分析は、ＰＤＲ患者の５倍増加レベルのＳＥＭＡ３Ａタンパク質を示す。ｎ＝１７（対照）および１７（ＰＤＲ患者）。（Ｊ）等体積の硝子体のウェスタンブロット分析は、対照に比較して、ＰＤＲ患者でのＳＥＭＡ３Ａ（約１２５ＫＤａおよび９５ＫＤａ）の増加を裏付けている。 ＯＩＲ中に、ＮＲＰ１のリガンドが網膜神経節細胞層中で誘導されることを示す図である。（Ａ、Ｂ）正常酸素圧条件またはＯＩＲ中の、ＷＴおよび骨髄ＮＲＰ１欠損ノックアウトマウス（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス）由来の網膜を、Ｐ１０〜Ｐ１７に集め、ＲＴ−ｑＰＣＲにより分析した（使用したオリゴヌクレオチドは実施例１１、表２に開示の通りとした）。ＷＴおよびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌ網膜の両方で、ＳＥＭＡ３Ａ ｍＲＮＡ（Ａ）発現がＯＩＲ期間中誘導されたが、ＷＴ網膜（星印）に比べて、ノックアウトマウス（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌ）ではＶＥＧＦ（Ｂ）の誘導が極めて少なかった。データは、各時点に対するそれぞれの正常酸素圧対照に比較した倍率変化±ＳＥＭとして表される；ｎ＝４〜７；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｃ）ＯＩＲ中で無血管性網膜ゾーンを選択するように注意して、Ｐ１４マウスに対しレーザー・キャプチャー・マイクロダイセクション（ＬＣＭ）を行った。（Ｄ、Ｅ）対照およびＯＩＲ無血管ゾーン中の網膜層のＬＣＭに対するＲＴ−ｑＰＣＲは、正常酸素圧網膜に比べて、ＯＩＲ中網膜の神経節細胞層（ＧＣＬ）中でＳＥＭＡ３Ａ（Ｄ）およびＶＥＧＦ（Ｅ）ｍＲＮＡの誘導を示した。ＶＥＧＦはまた、ＯＩＲ網膜の内顆粒層中でも誘導された（Ｅ）。データは、正常酸素圧ＧＣＬに比較した倍率変化±ＳＥＭとして表される。 ＮＲＰ１＋ＭＰが血管傷害後に網膜中で増殖しないことを示す図である。Ｐ１３でＢｒｄＵを注射したＷＴ ＯＩＲ（右パネル）および正常酸素圧（左パネル）対照マウスからＰ１４で集めた網膜（Ａ）および脾臓（Ｂ）から得たＣＤ１１ｂ＋／Ｆ４−８０＋／Ｇｒ−１−細胞の代表的ＦＡＣＳヒストグラムである。ＢｒｄＵ＋細胞の数は、脾臓中で極めて多かったが、ＯＩＲマウスと正常酸素圧マウスの間で大きく変化しなかった（Ｃ）。ｎ＝４（正常酸素圧、Ｎ）、ｎ＝４（ＯＩＲ）（条件あたり合計１６個の網膜、各「ｎ」は４個の網膜からなる）。データは、ＢｒｄＵ＋ Ｇｒ−１−／ＣＤ１１ｂ＋／Ｆ４−８０＋細胞±ＳＥＭのパーセンテージとして表される。 Ａ−Ｂ。ＳＥＭＡ３ＡおよびＶＥＧＦが、ＮＲＰ１を介してマクロファージに対し化学誘引性であることを示す図である。（Ａ、Ｂ）一次マクロファージをＷＴまたは骨髄ＮＲＰ１欠損ノックアウトマウス（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス）から単離し、下段チャンバーに添加した、ビークル、ＭＣＰ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＳＥＭＡ３Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）と共にトランスウェル遊走アッセイに供した。ＤＡＰＩ染色した遊走細胞の代表的画像を示す（Ａ）。ＳＥＭＡ３ＡまたはＶＥＧＦは、陽性対照ＭＣＰ−１と同程度マクロファージ遊走を促進した（Ｂ）。ＳＥＭＡ３ＡおよびＶＥＧＦがマクロファージ走化性を刺激していたことを確認するために、細胞を、走化性を消滅させる選択的ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２（１００μｇ／ｍｌ）で前処理した（Ｂ）。ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス由来のマクロファージは、ＳＥＭＡ３ＡまたはＶＥＧＦに無応答性であるが、ＭＣＰ−１には応答する（Ｃ）。データは、対照（非処置細胞）に比較した倍率変化として表される；ｎ＝６〜２２；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。スケールバー：１００μｍ（Ａ）。 ＳＥＭＡ３ＡおよびＶＥＧＦが、ＮＲＰ１を介してマクロファージに対し化学誘引性であることを示す図である。（Ａ、Ｂ）一次マクロファージをＷＴまたは骨髄ＮＲＰ１欠損ノックアウトマウス（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス）から単離し、下段チャンバーに添加した、ビークル、ＭＣＰ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＳＥＭＡ３Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）と共にトランスウェル遊走アッセイに供した。ＤＡＰＩ染色した遊走細胞の代表的画像を示す（Ａ）。ＳＥＭＡ３ＡまたはＶＥＧＦは、陽性対照ＭＣＰ−１と同程度マクロファージ遊走を促進した（Ｂ）。ＳＥＭＡ３ＡおよびＶＥＧＦがマクロファージ走化性を刺激していたことを確認するために、細胞を、走化性を消滅させる選択的ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２（１００μｇ／ｍｌ）で前処理した（Ｂ）。ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス由来のマクロファージは、ＳＥＭＡ３ＡまたはＶＥＧＦに無応答性であるが、ＭＣＰ−１には応答する（Ｃ）。データは、対照（非処置細胞）に比較した倍率変化として表される；ｎ＝６〜２２；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。スケールバー：１００μｍ（Ａ）。 エクスビボで脈絡膜層外植片において、Ｎｒｐ１＋マクロファージが毛細血管の増殖を促進することを示す図である。（Ａ）ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１＋／＋およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスから単離した脈絡膜層外植片の定量化および代表的画像である（ｎ＝６；ｐ＝０．０１８）。（Ｂ、Ｃ）クロドロン酸リポソーム処理（マクロファージを枯渇させるための）およびその後の外来性のマクロファージ（Ｍａ）の添加後のＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１＋／＋（Ｂ）およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌ（Ｃ）マウス由来の脈絡膜層外植片の代表的画像である。（Ｄ、Ｅ）ＢおよびＣに示されたＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１＋／＋（Ｄ）およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌ（Ｅ）由来の脈絡膜層毛細血管の新芽形成の定量化（ｎ＝６、ｎ．ｓ．：有意差なし、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。 骨髄常在性ＮＲＰ１の欠損は、網膜症での血管変性および病理学的血管新生を減らすことを示す図である。野性型、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１＋／＋およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスをＯＩＲに晒し、網膜をＰ１２およびＰ１７で集め、フラットマウントし、イソレクチンＢ４で染色した。対照ＷＴ（＃１）または対照ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１＋／＋マウス（＃２）の両方に比較して、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスは、Ｐ１２では血管喪失が少なく（Ａ、Ｂの＃３）、また、Ｐ１７では無血管領域（Ｃ、Ｄの＃３）および網膜前の血管新生（Ｅ、Ｆの＃３）が減少した。結果は、全網膜領域に対する無血管または新生血管領域のパーセンテージとして表している。ｎ＝５〜１９。スケールバー：ＢとＤ：１ｍｍおよびＦ：５００μｍ。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 硝子体内への可溶性ＮＲＰ１の治療投与が、網膜症におけるＭＰ浸潤および病理学的血管新生を減らすことを示す図である。ＯＩＲ誘導ＮＲＰ１リガンドを捕捉するために、ＷＴマウスをＯＩＲに晒し、Ｐ１２で、可溶性組換えマウスＮＲＰ１（ドメインａ１、ａ２、ｂ１、ｂ２およびｃを含むｒｍＮＲＰ１、図１９Ｃおよび２０Ｒも参照）をトラップとして硝子体内に注入した。Ｐ１４でのＦＡＣＳ分析は、ｒｍＮＲＰ１注入される網膜中の３０％を超える網膜ＭＰ数の減少を示した（Ａ）。データは、対照（ビークル注射網膜）と比較した倍率変化±ＳＥＭとして表される。ｎ＝３〜４（条件あたり合計１２〜１６個の網膜；各「ｎ」は４個の網膜を含む）。Ｐ１７で、ビークル注射眼に比べて、ｒｍＮＲＰ１を使った処置により病理学的血管新生が効果的に減少した（Ｂ、Ｃ）。結果は、全網膜領域に対する新生血管領域のパーセンテージとして表している。ｎ＝１１。スケールバー：５００μｍ。＊ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 糖尿病、などの虚血性網膜症の間の、網膜の無血管ゾーン、虚血性ニューロンおよび神経組織がＮＲＰ１のリガンド（ＳＥＭＡ３ＡおよびＶＥＧＦ）を産生し、これが次に、血管新生促進ミクログリアに対する強力な化学誘引剤として機能すること示す本発明の知見の模式図である。ＮＲＰ１＋ミクログリアはその後、増殖網膜症の発病に関与する。 ＳＥＭＡ３Ａは、敗血性ショック中にいくつかの器官で発現上昇していることを示す図である。ＬＰＳ（１５ｍｇ／ｋｇ）によりマウスに敗血症を誘導後、ＳＥＭＡ３Ａ（左パネル）およびＶＥＧＦ（右パネル）のｍＲＮＡレベルをｑＲＴ−ＰＣＲにより評価した。ＳＥＭＡ３ＡおよびＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルをβ−アクチン発現で正規化し、ＬＰＳ投与後、０、６、１２および２４時間のｍＲＮＡレベルの倍率変化を測定した。Ａ．マウス脳中のＳＥＭＡ３Ａ（左パネル）およびＶＥＧＦ（右パネル）の倍率変化。Ｂ．マウス腎臓中のＳＥＭＡ３Ａ（左パネル）およびＶＥＧＦ（右パネル）の倍率変化。Ｃ．マウス肺中のＳＥＭＡ３Ａ（左パネル）およびＶＥＧＦ（右パネル）の倍率変化。Ｄ．マウス肝臓中のＳＥＭＡ３Ａ（左パネル）およびＶＥＧＦ（右パネル）の倍率変化。 ＬＰＳ誘導敗血症後のサイトカイン発現を示す図である。ＬＰＳ（１５ｍｇ／ｋｇ）によりマウスに敗血症誘導後、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βのｍＲＮＡレベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲにより評価した。ｍＲＮＡレベルをβ−アクチン発現で正規化し、ＬＰＳ投与後、０、６、１２および２４時間のｍＲＮＡレベルの倍率変化を測定した。Ａ．マウス脳中のＴＮＦ−α（左パネル）およびＩＬ−１β（右パネル）の倍率変化。Ｂ．マウス腎臓中のＴＮＦ−α（左パネル）およびＩＬ−１β（右パネル）の倍率変化。Ｃ．マウス肺中のＴＮＦ−α（左パネル）およびＩＬ−１β（右パネル）の倍率変化。Ｄ．マウス肝臓中のＴＮＦ−α（左パネル）およびＩＬ−１β（右パネル）の倍率変化。 ＳＥＭＡ３Ａが骨髄細胞中でＮＲＰ１を介して炎症促進性サイトカインの分泌を誘導することを示す図である。野性型およびＮＲＰ１ノックアウト（ＬｙｚＭ／ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌ）骨髄細胞をＳＥＭＡ３Ａ（１００ｎｇ／ｎｍｌ）またはビークルで処置し、ＩＬ−６（Ａ）、ＴＮＦ−α（Ｂ）およびＩＬ−１β（Ｃ）タンパク質分泌を細胞数測定ビーズアレイ（ＣＢＡ）により分析した。 ＮＲＰ１欠損骨髄は、敗血症中に炎症性サイトカインのインビボ産生を減らすことを示す図である。ＮＲＰ１ノックアウトマウス（ＬｙｚＭ／ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌ）および対照野生型マウスにビークルまたはＬＰＳ（１５ｍｇ／ｋｇ）を投与し、敗血症を誘導した。ＬＰＳ注射の６時間後、脳および肝臓を採取し、ｍＲＮＡを抽出した。ＴＮＦ−α（Ａ、Ｃ）およびＩＬ−１β（Ｂ、Ｄ）発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで分析し、レベルをβ−アクチン発現レベルで正規化した。 ＮＲＰ１活性のインビボ阻害が、敗血症誘導バリア機能破壊を防ぐことを示す図である。マウスに、ｉ）ビークル、ｉｉ）ＬＰＳ（１５ｍｇ／ｋｇ）、またはｉｉｉ）ＬＰＳ（１５ｍｇ／ｋｇ）およびＮＲＰ１トラップ（トラップ−１、図１９Ｃおよび２０Ｒ（但し、ＦＣドメイン不含）、ＮＰ＿０３２７６３、４ｕｇ／０．２ｍｇ／ｋｇ、静注）を投与した。その後、Ｅｖａｎ ｂｌｕｅ透過性アッセイ（ＥＢＰ）を使って、脳（Ａ）、腎臓（Ｂ）および肝臓（Ｃ）の血管透過性を評価した。 ＮＲＰ１活性のインビボ阻害が、敗血症から保護することを示す図である。（Ａ）ｉ）高用量のＬＳＰ（腹腔内、２５／ｍｇ／ｋｇ）；またはｉｉ）ＮＲＰ１トラップ（静注、０．２ｍｇ／ｋｇのトラップ−１、図１９Ｃおよび２０Ｒ（但し、ＦＣドメイン不含）、ＮＰ＿０３２７６３）続けて、高用量のＬＰＳ（腹腔内、２５／ｍｇ／ｋｇ）を投与した対照マウスの生存率。（Ｂ）高用量のＬＰＳ（腹腔内、２５／ｍｇ／ｋｇ）を投与した、骨髄常在性ＮＲＰ１ノックアウトマウス（ＬｙｚＭ／ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌ）と対照マウスとの間の生存率の比較。 ＮＲＰ１由来トラップまたはＮＲＰ１欠損骨髄の投与は、敗血性ショックにおける炎症性サイトカイン産生を低下させることを示す図である。野性型マウスに、ｉ）ビークル（ｎ＝３）、ｉｉ）ＬＰＳ（１５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝３）またはｉｉｉ）ＬＰＳおよびＮＲＰ１トラップ（トラップ−１、図１９Ｃおよび２０Ｒ（但し、ＦＣドメイン不含）、ＮＰ＿０３２７６３）を投与した。ＮＲＰ１欠損骨髄細胞を有するマウス（ＬｙｚＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐｆｌ／ｆｌ）にＬＰＳ（１５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝３）を投与した。ＬＰＳ注射の６時間後、脳を集め、ＴＮＦ−α（Ａ）およびＩＬ−６（Ｂ）の産生を測定した。 ＮＲＰ１由来トラップの投与が、虚血性脳卒中から保護することを示す図である。マウスを一時的な中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）にして、ビークルまたはＮＲＰ１トラップを投与し、梗塞（卒中）のサイズを、クレシルバイオレットで染色した冠状大脳切片上で測定した。未染色領域は、損傷領域に対応する。（Ａ）ビークルで処置したＭＣＡＯマウスの冠状大脳切片。（Ｂ）ＮＲＰ１トラップ−１（図１９Ｃおよび２０Ｒ（但し、ＦＣドメイン不含、ＮＰ＿０３２７６３）参照）で処置したＭＣＡＯマウスの冠状大脳切片。（Ｃ）ＭＣＡＯ後にビークルまたはＮＲＰ１トラップで処置したマウスの平均梗塞サイズのグラフ。（Ｄ）ＭＣＡＯの１時間後、ビークルまたはＮＲＰ１トラップで処置したマウスの神経学的障害（ニューロスコア）。（Ｅ）ＭＣＡＯの２４時間後、ビークルまたはＮＲＰ１トラップで処置したマウスの神経学的障害（ニューロスコア）。 Ａ−Ｃ。ＮＲＰ１タンパク質および本発明のＮＲＰ１−トラップの実施形態の模式図である。（Ａ）ＳＥＭＡ３Ａ結合ドメイン（主にａ１ａ２で、わずかにｂ１が関与）およびＶＥＧＦ結合ドメイン（ｂ１ｂ２）を示すＷＴ ＮＲＰ１の図式表現。ｃドメインは、その他の共受容体とのＮＲＰ二量体化に寄与すると考えられているＭＥＭドメインである。（Ｂ、Ｄ、Ｅ）ヒト由来ＮＲＰ１（Ｃ）およびマウス由来ＮＲＰ１トラップの模式図。 ＮＲＰ１タンパク質および本発明のＮＲＰ１−トラップの実施形態の模式図である。（Ａ）ＳＥＭＡ３Ａ結合ドメイン（主にａ１ａ２で、わずかにｂ１が関与）およびＶＥＧＦ結合ドメイン（ｂ１ｂ２）を示すＷＴ ＮＲＰ１の図式表現。ｃドメインは、その他の共受容体とのＮＲＰ二量体化に寄与すると考えられているＭＥＭドメインである。（Ｂ、Ｄ、Ｅ）ヒト由来ＮＲＰ１（Ｃ）およびマウス由来ＮＲＰ１トラップの模式図。 ＮＲＰ１タンパク質および本発明のＮＲＰ１−トラップの実施形態の模式図である。（Ａ）ＳＥＭＡ３Ａ結合ドメイン（主にａ１ａ２で、わずかにｂ１が関与）およびＶＥＧＦ結合ドメイン（ｂ１ｂ２）を示すＷＴ ＮＲＰ１の図式表現。ｃドメインは、その他の共受容体とのＮＲＰ二量体化に寄与すると考えられているＭＥＭドメインである。（Ｂ、Ｄ、Ｅ）ヒト由来ＮＲＰ１（Ｃ）およびマウス由来ＮＲＰ１トラップの模式図。 ＮＲＰ１タンパク質および本発明のＮＲＰ１−トラップの実施形態の模式図である。（Ａ）ＳＥＭＡ３Ａ結合ドメイン（主にａ１ａ２で、わずかにｂ１が関与）およびＶＥＧＦ結合ドメイン（ｂ１ｂ２）を示すＷＴ ＮＲＰ１の図式表現。ｃドメインは、その他の共受容体とのＮＲＰ二量体化に寄与すると考えられているＭＥＭドメインである。（Ｂ、Ｄ、Ｅ）ヒト由来ＮＲＰ１（Ｃ）およびマウス由来ＮＲＰ１トラップの模式図。 図１９ＢおよびＣに示したＮＲＰ１トラップの核酸およびタンパク質配列を示す図である。（Ａ）トラップ１／ＴｒａｐｐｅＡ−完全ＮＲＰ１−ＦＣアミノ酸（配列番号１１４）およびヌクレオチド（配列番号２）配列；（Ｂ）トラップ２−ＮＲＰ１−ＦＣ−Δｃ−アミノ酸配列（配列番号１１５）；（Ｃ）トラップ２−ＮＲＰ１−ＦＣ−Δｃ−ヌクレオチド配列（配列番号４）；（Ｄ）トラップ３−ＮＲＰ１−ＦＣ−Δｂ２ｃ−アミノ酸配列（配列番号１１６）；（Ｅ）トラップ３−ＮＲＰ１−ＦＣ−Δｂ２ｃ−核酸配列（配列番号６）；（Ｆ）トラップ４−ＮＲＰ１−ＦＣ−Δｂ１ｂ２ｃ−アミノ酸配列（配列番号１１７）；（Ｇ）トラップ４−ＮＲＰ１−ＦＣ−Δｂ１ｂ２ｃ−核酸配列（配列番号８）；（Ｈ）トラップ５／トラップＩ−ＮＲＰ１−ＦＣΔｃ−ｓｈｏｒｔ−アミノ酸配列（配列番号１１８）およびヌクレオチド（配列番号１０）配列；（Ｉ）トラップ６／トラップＤ−ＮＲＰ１−ＦＣΔｂ２ｃ−ｓｈｏｒｔ−アミノ酸配列（配列番号１１９）およびヌクレオチド（配列番号１２）配列；（Ｊ）トラップ７／トラップＣ−ＮＲＰ１−ＦＣΔｂ１ｂ２ｃ−ｓｈｏｒｔ−アミノ酸配列（配列番号１２０）およびヌクレオチド（配列番号１４）配列；（Ｋ）トラップ８／トラップＪ−完全ＮＲＰ１−ＦＣ−ＶＥＧＦ ｌｏｗ−アミノ酸配列（配列番号１２１）およびヌクレオチド（配列番号１６）配列；（Ｌ）トラップ９−ＮＲＰ１−ＦＣ−Δｃ−ＶＥＧＦ ｌｏｗ−アミノ酸配列（配列番号１２２）；（Ｍ）トラップ９−ＮＲＰ１−ＦＣ−Δｃ−ＶＥＧＦ ｌｏｗ−核酸配列（配列番号１８）；（Ｎ）トラップ１０−ＮＲＰ１−ＦＣ−Δｂ２ｃ−ＶＥＧＦ ｌｏｗ−アミノ酸配列（配列番号１２３）；（Ｏ）トラップ１０−ＮＲＰ１−ＦＣ−Δｂ２ｃ−ＶＥＧＦ ｌｏｗ−核酸配列（配列番号２０）；（Ｐ）トラップ１１／トラップＬ−ＮＲＰ１−ＦＣ−Δｃ−ＶＥＧＦ ｌｏｗ−Ｓｈｏｒｔ−アミノ酸（配列番号１２４）およびヌクレオチド（配列番号２２）配列；（Ｑ）トラップ１２／トラップＫ−ＮＲＰ１−ＦＣ−Δｂ２ｃ−ＶＥＧＦ ｌｏｗ−Ｓｈｏｒｔ−アミノ酸（配列番号１２５）およびヌクレオチド（配列番号２４）配列；（Ｒ）マウストラップ１−完全Ｎｒｐ１−ｍＦＣアミノ酸（配列番号１２６）およびヌクレオチド（配列番号２６）配列；（Ｓ）マウストラップ２−Ｎｒｐ１−ｍＦＣΔｃ−ｓｈｏｒｔアミノ酸（配列番号１２７）およびヌクレオチド（配列番号２８）配列；（Ｔ）マウストラップ３−Ｎｒｐ１−ＦＣΔｂ２ｃ−ｓｈｏｒｔアミノ酸（配列番号１２８）およびヌクレオチド（配列番号３０）配列。 ヒトＳＥＭＡ３Ａ前駆体タンパク質配列（配列番号３１）を示す図である。この配列は、成熟型にさらに処理される。残基１〜２０はシグナルペプチドに対応する。 ヒト可溶性ニューロピリン−１（ＮＲＰ１）受容タンパク質配列（例えば、ジェンバンク受入番号ＡＡＨ０７７３７．１−配列番号６５）を示す図である。ドメインａ１、ａ２、ｂ１、ｂ２およびｃが示されている。ドメインａ１は、アミノ酸２３〜１４８からなる；ドメインａ２は、アミノ酸１４９〜２７０からなる；ドメインｂ１は、アミノ酸２７１〜４２８からなる；ドメインｂ２は、アミノ酸４２９〜５９０からなる；およびドメインｃは、アミノ酸５９１〜６０９からなる。 酸素誘導された網膜症モデルにおいて、ＳＥＭＡ３Ａトラップが血管再生を加速し、虚血性マウス網膜中の病理学的血管新生を減らすことを示す図である。（Ａ）網膜症の４つの主な段階、すなわち、正常酸素圧、血管減少／血管喪失、増殖／血管新生および新生血管（ＮＶ）退縮を示す酸素誘導網膜症（ＯＩＲ）のマウスモデルの模式図。（Ｂ）Ｐ１７での、ヒスチジンタグを付けたトラップＧまたはトラップＭ（トラップＧ−ＨＩＳ（配列番号３８）およびトラップＭ−ＨＩＳ（配列番号４２））の硝子体内注射後の無血管領域の平均パーセンテージ（％）（対ビークル）。各群の無血管領域を示す代表的網膜の写真を示す。（Ｃ）Ｐ１７での、ヒスチジンタグを付けたトラップＧおよびトラップＭの硝子体内注射後の新生血管領域の平均パーセンテージ（％）（対ビークル）。各群の新生血管領域を示す代表的網膜の写真を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎ＝８〜１３匹／群。 ＳＥＭＡ３Ａトラップが、糖尿病性網膜の血管漏出および浮腫を防ぐことを示す図である。（Ａ）ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処置前（第０週目）およびＳＴＺ処置後３週目（糖尿病性状態）のマウスの血糖値。（Ｂ）０．５ｕｇ／ｍｌのトラップＧ、トラップＭまたは８０μｇ（１ｕｌ）の抗ＶＥＧＦ１６４抗体（ＡＦ−４９３−ＮＡ、Ｒ＆Ｄ）を、ＳＴＺ投与後６および７週目に硝子体内に注射したマウス網膜の網膜Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ透過性アッセイ（８週目に測定）。（Ｃ）０．５ｕｇ／ｍｌのトラップＧ、トラップＭまたは抗ＶＥＧＦ１６４抗体（ＡＦ−４９３−ＮＡ、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を、ＳＴＺ処置後１２および１３週目に硝子体内に注射したマウス網膜の網膜Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ透過性アッセイ（１４週目に測定）。＊ｐ＜０．０５、ｎ＝４、１２匹の動物由来。 加齢黄斑変性（ＡＭＤ）のモデルで、ＮＲＰ１由来トラップ（抗ＳＥＭＡ３ＡおよびＶＥＧＦ）が、脈絡膜新生血管を減らすことを示す図である（Ａ）マウスの眼に脈絡膜新生血管を誘導するために使用される方法の模式図である。（Ｂ）レーザー照射１４日後の脈絡膜新生血管（灌流後の平均ＦＩＴＣ／レクチン領域）。レーザー照射直後、マウスの眼の硝子体内にトラップＧを注射した。 ＮＲＰ１コンセンサス配列（配列番号６９）と一緒に、ラット（受入番号ＥＤＬ９６７８４、ＮＰ＿６５９５６６）、ヒト（配列番号６８、受入番号ＮＭ００３８７３）およびマウス（配列番号６７、受入番号ＮＰ＿０３２７６３）間の配列アラインメントを示す図である。ＮＲＰ１シグナルドメイン（アミノ酸１〜２１）、ＳＥＭＡ３ａ結合ドメインａ１（アミノ酸２２〜１４８、配列番号７８）、ａ２（アミノ酸１４９〜１７５、配列番号７９）、ＶＥＧＦ結合ドメインｂ１（アミノ酸２７６〜４２８、配列番号８０）およびｂ２（アミノ酸４２９〜５８９、配列番号８１）、ドメインｃ（アミノ酸５９０〜８５９、配列番号８２）、膜貫通ドメイン（アミノ酸８６０〜８８３、配列番号７７）および細胞質ドメイン（アミノ酸８８４〜９２３）が確認される。 図１９に示される（但し、いずれのヒスチジンまたはＦＣタグも含まない）本発明の代表的トラップ間のタンパク質配列の配列アラインメントを示す図である。（Ａ）６Ｘヒスチジンタグ精製ドメインを含む本発明の代表的トラップ（Ｇ（配列番号１００）、Ｒ（配列番号１０１）、Ｚ（配列番号１０２）、ＡＢ（配列番号１０３）、ＡＣ（配列番号１０４）、Ｏ（配列番号１０５）、Ｑ（配列番号１０６）、Ｍ（配列番号１０７）、Ｐ（配列番号１０８）、Ｎ（配列番号１０９）、Ｗ（配列番号１１０）、Ｘ（配列番号１１１）およびＹ（配列番号１１２））間のタンパク質配列（但し、６Ｘヒスチジンタグ精製ドメインを欠く）の配列アラインメント。（Ｂ）本発明の代表的トラップ（（Ａ（配列番号１００）、Ｉ（配列番号１０５）、Ｄ（配列番号１０７）、Ｃ（配列番号１０９）、Ｊ（配列番号１０１）、Ｌ（配列番号１０６）、Ｋ（配列番号１０８）、Ｓ（配列番号１１３）、Ｕ（配列番号１１１）、Ｖ（配列番号１１２））間のタンパク質配列（但し、ＦＣドメインを欠く）の配列アラインメント。
本発明者らは、中枢神経、血管と免疫細胞との間に保存されるＳＥＭＡ３Ａなどの局所的走化作用キューに応答する単核貪食細胞（ＭＰ）のサブセットを特定した。ＮＲＰ１発現ＭＰは、傷害部位に入り、種々の形態の炎症、増殖網膜症（例えば、増殖糖尿病網膜症、未熟児網膜症および加齢黄斑変性）、敗血性ショックおよび脳虚血／脳卒中を含む炎症状態のモデルの（ｉ）組織損傷および／または（ｉｉ）自然免疫応答の病理学的活性化に寄与することが明らかになった。
発明者らは、ストレスを受けた網膜ニューロンおよび神経組織が、特殊な走化性物質を介して、局所的自然免疫応答を調節する固有の能力を有することを示した。ミクログリア上のＮＲＰ１は、ＳＥＭＡ３ＡおよびＶＥＧＦに対する強力な化学誘引性受容体であることが明らかになり、自然免疫細胞におけるＮＲＰ１シグナル伝達の阻害（例えば、ＮＲＰ１由来トラップまたはＮＲＰ１もしくはＳＥＭＡ３Ａ抗体を使った）により、ＭＰ誘導炎症および組織損傷からの保護がもたらされる。
後期の増殖糖尿病網膜症（ＰＤＲ）に罹患している患者は、直感に反して、ニューロピリン−１（ＮＲＰ１）陽性ＭＰに対する強力な誘引剤として作用する、高レベルのＳＥＭＡ３Ａを産生することが示された。これらの血管新生促進ＭＰは、局所的に産生されたＳＥＭＡ３ＡならびにＶＥＧＦおよびＴＧＦ−βに応答して、病理学的血管新生部位に選択的に動員される。さらに、ＳＥＭＡ３Ａは、敗血性ショック中にいくつかの器官で発現上昇し、ＭＰによる炎症性サイトカインの分泌を誘導することが示された。ＮＲＰ１の阻害はまた、敗血症における炎症促進性のサイトカインの産生を減らした。
最終的に、ＮＲＰ１陽性ＭＰは、炎症性疾患の進行に重要な役割を果たすことが明らかになった。ＮＲＰ１骨髄依存性活性の阻害／抑止は、新生血管網膜症（血管変性および病理学的血管新生）、敗血性ショックおよび脳虚血／脳卒中に続発する神経損傷から保護することが示された。
合わせて、これらの知見は、ＮＲＰ１陽性ＭＰおよびそれらのリガンドの炎症（および特に、神経炎症）における役割を強調し、自然免疫応答の過剰活性化（例えば、ミクログリア／マクロファージの動員によるおよび／または炎症促進性のサイトカインの産生および／または分泌の誘導による傷害部位の組織損傷、および／または血管漏出／浮腫）を制限するＮＲＰ１細胞内シグナル伝達の阻害の治療効果を示す。本知見により、持続型（例えば、慢性、持続性）炎症またはＭＰ動員および炎症促進性のサイトカイン産生および分泌を伴う過剰／病理学的炎症を特徴とする疾患および状態、例えば、敗血性ショック、関節炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、皮膚炎症、糖尿病、ぶどう膜炎、糖尿病性網膜症などの神経炎症状態、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、加齢性認知機能低下／アルツハイマー病および脳卒中、などの予防および処置に適用されるようになる。
ＮＲＰ１媒介細胞活性の阻害
本発明者らは、ＮＲＰ１依存性細胞内シグナル伝達（および特に、ＳＥＭＡ３Ａ媒介細胞内シグナル伝達）の阻害により、自然免疫応答の過剰活性化を伴うものなどの炎症性疾患および状態から保護（予防または処置）することが可能であることを見出した。特に、ＮＲＰ１媒介細胞内シグナル伝達の阻害は、単核貪食細胞（ＭＰ、例えば、ミクログリア、マクロファージ）の望ましくない（病理学的）動員および組織損傷（例えば、増加した血管変性、病的な血管新生、細胞死または細胞損傷）、炎症および浮腫の一因となる炎症促進性サイトカインの産生／分泌を減らす。
したがって、一態様では、本発明は、炎症を処置または予防する方法に関し、該方法は、ＮＲＰ１依存性細胞内シグナル伝達を阻害することを含む。特定の態様では、炎症は神経炎症である。
本明細書で使用される場合、「炎症」という用語は、ｉ）炎症または傷害部位でＮＲＰ１受容体を発現している単核貪食細胞（例えば、ミクログリアまたはマクロファージ）の動員；および／またはｉｉ）炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）のＮＲＰ１依存性産生／分泌を含む自然免疫応答の活性化を伴う疾患または状態を意味する。急性炎症の古典的な兆候は、疼痛、発熱、発赤、腫脹、および機能消失である。炎症は急性と慢性に分類できる。急性炎症は、有害な刺激に対する身体の初期反応であり、血液から傷ついた組織への血漿および白血球（特に顆粒球）の移動の増加により達成される。続発する生化学的イベントが伝播し、炎症反応を成熟させて、損傷組織内の局所的血管系、免疫系、および種々の細胞を巻き込む。慢性炎症として知られる長期の（持続する）炎症は、炎症部位に存在する細胞型の徐々に進行する変化に繋がり、炎症プロセスによる組織の同時進行性の破壊と治癒を特徴とする。本発明の方法に従って処置または予防し得る炎症状態の非限定的例には、敗血性ショック、関節炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、皮膚炎症、糖尿病、ぶどう膜炎および糖尿病性網膜症（増殖糖尿病網膜症（ＰＤＲ）を含む）などの神経炎症状態、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、加齢性認知機能低下／アルツハイマー病および脳卒中が挙げられる。
特定の実施形態では、炎症性疾患または状態は、網膜症ではない。別の実施形態では、炎症性疾患または状態は、糖尿病性網膜症ではない。別の実施形態では、炎症性疾患または状態は、黄斑浮腫ではない。別の実施形態では、炎症性疾患または状態は、糖尿病性黄斑浮腫ではない。
関連態様では、本発明は、自然免疫応答の過剰活性化（または病理学的活性化）を抑制する方法に関し、該方法は、ＮＲＰ１依存性細胞内シグナル伝達を阻害することを含む。このような自然免疫応答の過剰活性化は通常、免疫系のいずれか特定の細胞集団の組織恒常性を維持するのに必要なレベルを超える、急性または慢性活性化（自然および獲得免疫系の、例えば、器官／組織での単核細胞動員）に関連している。これは、多くの場合、高まったサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）産生、増加した血管透過性を伴い、組織機能が損なわれることもある。
別の態様では、本発明は、血管変性を処置または予防する方法に関し、該方法は、ＮＲＰ１依存性細胞内シグナル伝達を阻害することを含む。
さらなる態様では、本発明は、病理学的血管新生を処置または予防する方法に関し、該方法は、ＮＲＰ１依存性細胞内シグナル伝達を阻害することを含む。
別の態様では、本発明は、敗血性ショックを処置または予防する方法に関し、該方法は、ＮＲＰ１依存性細胞内シグナル伝達を阻害することを含む。
さらに別の態様では、本発明は、脳虚血／脳卒中に続発する神経損傷を処置または予防する方法に関し、該方法は、ＮＲＰ１依存性細胞内シグナル伝達を阻害することを含む。
ＮＲＰ１媒介細胞内シグナル伝達（例えば、ＭＰ動員および炎症促進性サイトカインの産生／分泌）は、ＮＲＰ１のそのリガンド（例えば、ＳＥＭＡ３Ａ、ＶＥＧＦおよび／またはＴＧＦ−β）への結合に依存するので、ＮＲＰ１媒介細胞内シグナル伝達の阻害は、少なくとも２種の方法：ｉ）ＮＲＰ１の発現または活性を直接的に標的にすることにより（ＮＲＰ１抗体、ＮＲＰ１由来トラップなどの使用により）；またはｉｉ）１つまたは複数のそのリガンド（例えば、ＳＥＭＡ３Ａ、ＶＥＧＦおよび／またはＴＧＦ−β）の発現または活性を標的にすることにより、達成することができる。
いくつかの実施形態では、上記方法は、ＳＥＭＡ３Ａ媒介細胞内シグナル伝達を優先的にまたは特異的に阻害することを含む。「優先的に阻害すること」は、ＳＥＭＡ３Ａ媒介細胞内シグナル伝達の阻害のレベルが、その他のＮＲＰ１リガンド（例えば、ＶＥＧＦ１６５およびＴＧＦ−β）の阻害のレベルより大きいことを意味する。特定の態様では、本発明の方法は、ＮＲＰ１との相互作用により起こるＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ１６５）および／またはＴＧＦ−β媒介細胞内シグナル伝達を減らすまたは阻害することは実質的に行わない。いくつかの実施形態では、本発明の化合物（例えば、ＮＲＰ１トラップ）は、ある１つのリガンドに対し、その他のリガンドよりも「優先的に結合する」（例えば、ＶＥＧＦよりもＳＥＭＡ３Ａに優先的に結合する）。このような優先的相互作用は、各リガンドに対する解離定数（Ｋｄ）を決定することにより求め得る。いくつかの実施形態では、ある１つのリガンド（例えば、ＳＥＭＡ３Ａ）に対する相互作用が、他のリガンド（例えば、ＶＥＧＦ）よりも、少なくとも、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２８、２０、２２、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７５、８０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００倍以上大きい。いくつかの実施形態では、ある１つのリガンドに対するｋＤ（例えば、ｎＭ単位で）が、その他のリガンド（例えば、ＶＥＧＦ）の１つまたは複数に対するｋＤよりも、少なくとも、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２８、２０、２２、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７５、８０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００倍小さい。
一実施形態では、本発明の方法は、炎症に苦しむ可能性のある（例えば、炎症性疾患または状態に罹患する可能性のある）対象に対する投与を含む。他の実施形態では、本発明の方法は、炎症と診断された（例えば、炎症性疾患または状態に罹患する可能性のある）対象に対する投与を含む。一実施形態では、対象は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
ＮＲＰ１トラップ
ＮＲＰ１媒介細胞内シグナル伝達の阻害は、本発明のＮＲＰ１トラップを使って達成することができる。本明細書で使用される場合、「ＮＲＰ１トラップ」または「ＮＲＰ１ポリペプチドトラップ」という用語は、天然の可溶性ＮＲＰ１ポリペプチド（例えば、ＮＲＰ１分泌アイソフォームｂ（図２２、配列番号６５））、および合成（例えば、組換えにより産生）ＮＲＰ１ポリペプチドトラップを包含し、これらには、内在性ＮＲＰ１とリガンド結合に関し競合する任意のＮＲＰ１の機能性可溶断片（例えば、ＮＲＰ１アイソフォーム１または２）または任意のＮＲＰ１の機能性変異体が含まれる。一実施形態では、本発明のＮＲＰ１トラップは、自然界に存在しない（すなわち、天然ではない）が、天然ＮＲＰ１ポリペプチドから「誘導」される（すなわち、それらは合成であり、例えば、ＮＲＰ１アイソフォーム１またはその断片もしくは変異体の細胞外ドメインを含む）。本発明のＮＲＰ１トラップは、最初は、そのＮ末端にシグナルペプチドを含み（例えば、図２６に示すＮＲＰ１（例えば、配列番号６９）のアミノ酸１〜２１（配列番号７０））、これは細胞による分泌時に切断される。したがって、本発明のＮＲＰ１ポリペプチドトラップは、精製ポリペプチドとして投与される場合、または精製されたまたは実質的に純粋な形態を含む医薬組成物として調製される場合、アミノ酸１〜２１を欠いている。本発明のＮＲＰ１トラップをコードする核酸（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３４、３２、３４、３６、３９、４１、４３、４５、４７、など。表１も参照されたい）は、ＮＲＰ１トラップが細胞により合成され、分泌されるのを可能とするシグナルペプチド（Ｎ末端の最初の２１アミノ酸をコードする最初の６３ヌクレオチド）をコードするポリヌクレオチド配列を５’に含む。特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号６５（図２２）または配列番号６９（図２６）で示されるＮＲＰ１ポリペプチドの最初の２０アミノ酸に対応する。本発明のＮＲＰ１トラップは、対応する「野性型」ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその断片（例えば、集団中で天然に見つかる多形変異体）の機能性変異体を包含する。
本発明のＮＲＰ１トラップは、さらなるポリペプチドドメイン（例えば、精製ドメイン）を含んでも、または含まなくてもよい。精製ドメインを欠く、およびＮＲＰ１由来配列のみを含む代表的トラップを図２７に示す。本発明により使用してよいＮＲＰ１トラップの非限定的例は、図１９Ｂ〜Ｅ、図２０、図２７に、および下表１に挙げられている。
ＮＲＰ１がそのリガンドのシグナル伝達および細胞応答に与える影響を個別に調節することを考えれば、１つの特定のリガンドのＮＲＰ１への結合を特異的に阻害するが、他のリガンドへの結合を阻害しないことは有利であろう。例えば、本明細書で示すように、ＳＥＭＡ３Ａレベルが上昇している網膜症の初期の時点で、ＶＥＧＦレベルを低いままにして、非糖尿病性対照に比べて相対的に不変のままにする。また、敗血性ショックでは、ＳＥＭＡ３Ａは、長期効果を有し、敗血症誘導後、２４時間を超えて発現上昇のままとどまった唯一のＮＲＰ１リガンドであった。したがって、それぞれのリガンドに対する発現動力学の差異および１つのリガンド（例えば、ＶＥＧＦ）の中和が特定の状態下では効果的でない（または望ましくない副作用と関連する）可能性があるという事実を考慮すると、ＮＲＰ１に対する１つのリガンド（例えば、ＳＥＭＡ３Ａ）結合の特異的阻害（しかし、他のリガンド（単一または複数）（例えば、ＶＥＧＦ）の結合は阻害しない）は好都合である。したがって、本発明の方法の特定の態様では、ＳＥＭＡ３Ａ媒介細胞内シグナル伝達の阻害は、ＶＥＧＦより大きなＳＥＭＡ３に対する親和性を有する、またはＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ１６５）が結合しないもしくは実質的に結合しないＮＲＰ１トラップを提供することにより達成される。
したがって、一実施形態では、本発明の可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその機能性断片もしくは変異体（ＮＲＰ１トラップ）は、全てのＮＲＰ１の天然リガンド（例えば、ＳＥＭＡ３Ａ、ＶＥＧＦおよびＴＧＦ−β、例えば、細胞外ドメイン（例えば、配列番号６６または６９のアミノ酸２２〜８５６または２２〜９５９）を含む可溶性ＮＲＰ１トラップ、トラップ１（配列番号１）またはトラップＧ（配列番号３８）−また、図１９および２７ならびに表１も参照されたい）に結合する。一実施形態では、本発明のＮＲＰ１由来トラップは、ＳＥＭＡ３ＡおよびＶＥＧＦの両方に結合することにより、ＳＥＭＡ３およびＶＥＧＦシグナル伝達を阻害する。
別の実施形態では、本発明のＮＲＰ１トラップは、ＳＥＭＡ３Ａに結合するがＶＥＧＦには結合しないポリペプチドである。例えば、ＮＲＰ１トラップは、ＳＥＭＡ３Ａに結合するａ１（例えば、配列番号７１）および／またはａ２サブドメイン（単一または複数）（例えば、配列番号７２）を含んでよいが、ＶＥＧＦへの結合に必要なｂ１（例えば、配列番号７３）および／またはｂ２（例えば、配列番号７４）サブドメイン（単一または複数）を含んではいけない（例えば、トラップＭ（配列番号４２）、トラップＮ（配列番号４４）、トラップ１２／トラップＫ（配列番号２３）、トラップ４（配列番号７）、トラップ７／Ｃ（配列番号１３）、図１９および２７ならびに表１も参照されたい）。一実施形態では、ＮＲＰ１由来トラップは、図２６（例えば、配列番号６６のアミノ酸２２〜２７５または配列番号６９のアミノ酸２２〜２７５）に示すＮＲＰ１アミノ酸配列のアミノ酸２２〜２７５に対応するドメインａ１およびａ２を含む。ＮＲＰ１トラップはまた、変異（例えば、欠失または置換）を含んでよく、これは、ＶＥＧＦのＮＲＰ１への結合を顕著に抑止または低減するが、ＳＥＭＡ３ＡのＮＲＰ１への結合は抑止または低減しない（例えば、トラップ８／トラップＪ（配列番号１５）、トラップ９（配列番号１７）、トラップ１０（配列番号１９）、トラップ１１／Ｌ（配列番号２１）、トラップ１２／Ｋ（配列番号２３）、トラップＵ（配列番号３４）、トラップＲ（配列番号４６）、トラップＱ（配列番号４８）、トラップＰ（配列番号５０、トラップＸ（配列番号５４、トラップＡＣ（配列番号６０）、トラップＺ（配列番号６２）、図１９および２７ならびに表１も参照されたい）。このような変異の非制限的一例は、ＮＲＰ１のｂ１ドメインのチロシン２９７の置換である（例えば、Ｙ２９７Ａ、図１９Ｂ〜Ｄ、図２７および表１、例えば、トラップ８、９、１０、１１、１２、Ｖ、Ｒ、Ｑ、ＰおよびＸ）。このような変異のその他の例には、ＮＲＰ１の位置３１９のグルタミン酸の置換および位置３２０のアスパラギン酸の置換（例えば、トラップＡＣおよびＺ（配列番号６０、６２）の場合などのＥ３１９ＫおよびＤ３２０Ｋ）が含まれる。
別の実施形態では、ＮＲＰ１トラップは、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその機能性断片もしくは変異体であり、これはＶＥＧＦに結合するがＳＥＭＡ３Ａには結合しない。例えば、ＮＲＰ１トラップは、ＶＥＧＦに結合するｂ１（例えば、配列番号７３）および／またはｂ２（例えば、配列番号７４）ドメイン（単一または複数）を含んでよいが、ＳＥＭＡ３Ａに結合するａ１（例えば、配列番号７１）および／またはａ２（例えば、配列番号７２）サブドメイン（単一または複数）を含んではいけない。一実施形態では、ＮＲＰ１トラップは、図２６（例えば、配列番号６６のアミノ酸２７６〜５８９または配列番号６９のアミノ酸２７６〜２８９）に示すＮＲＰ１アミノ酸配列のアミノ酸２７６〜５８９に対応するドメインｂ１ｂ２を含む。別の実施形態では、ＮＲＰ１トラップは変異を含んでよく、これは、ＳＥＭＡ３Ａ結合を低減または抑止するが、ＶＥＧＦ結合は低減または抑止しない。このような変異の非限定的一例は、ＮＲＰ１のセリン３４６および／またはグルタミン酸３４８の置換である（例えば、トラップＡＢ（配列番号５８）の場合などのＳ３４６ＡおよびＥ３４８Ｋ変異−図１９および図２７も参照されたい）。
一実施形態では、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその機能性断片は、図１９Ｂ〜Ｅ、２０、２７および表１に示されているトラップを含むまたはそれからなる。
好ましい実施態様では、本発明のＮＲＰ１トラップは、例えば、ＮＲＰ１アイソフォーム１で認められる、膜貫通ドメイン（例えば、図２６（配列番号６６および６９など）に示されるＮＲＰ１ポリペプチド配列のアミノ酸残基８６０〜８８３に対応するドメイン）および細胞質ドメイン（例えば、図２６（配列番号６６および６９など）に示されるＮＲＰ１ポリペプチドアイソフォーム１配列のアミノ酸残基８８４〜９２３に対応するドメイン）を欠いている。いくつかの実施形態では、本発明のＮＲＰ１トラップは、ＮＲＰ１のドメインｃを完全にまたは部分的に欠いている。ＮＲＰ１アイソフォーム１は、より大きなｃドメインを含む（図２６参照）が、アイソフォーム２は、より短い（例えば、図２２に示すアミノ酸配列ＶＬＡＴＥＫＰＴＶＩＤＳＴＩＱＳＧＩＫ（配列番号９９））。特に、ドメインｃは、ＳＥＭＡ３ＡおよびＶＥＧＦ結合に不可欠ではなく、したがって、ＮＲＰ１依存性細胞内シグナル伝達（またはＳＥＭＡ３Ａ媒介細胞内シグナル伝達）を阻害するために使用されるＮＲＰ１トラップから除外してよい。一実施形態では、ＮＲＰ１トラップは、図２６（例えば、配列番号６６または配列番号６９のアミノ酸５９０〜８５９）に示すＮＲＰ１アミノ酸配列のアミノ酸５９０〜８５９に対応するドメインｃを欠いている。一実施形態では、本発明のＮＲＰ１トラップは、図２２（例えば、配列番号９９）に示すアイソフォーム２のｃドメインを完全にまたは部分的に欠いている。一実施形態では、本発明のＮＲＰ１トラップは、ＮＲＰ１アイソフォーム２のドメインｃを含む。別の実施形態では、ＮＲＰ１由来トラップは、配列番号７５で示されるアミノ酸に対応するドメインｃの一部を欠いている。
本発明の可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその機能性断片もしくは変異体は、１つまたは複数の追加のポリペプチドドメイン（単一または複数）を含めて、インビボ安定性を高めてもおよび／または精製を容易にしてもよい。例えば、本発明のＮＲＰ１トラップは、ＦＣドメイン（または配列番号３７で示されるヒトＦＣドメインなどのその一部）または精製タグ（例えば、６Ｘヒスチジンタグ）を含めてもよい。このような追加のポリペプチドドメイン（単一または複数）は、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその機能性断片に直接的にまたは間接的に（リンカーを介して）結合し得る。
本発明の可溶性ＮＰＲ１ポリペプチドまたはその機能性断片は、１つまたは複数のポリペプチドリンカーを任意に含んでもよい。このようなリンカーを使って、１つまたは複数の追加のポリペプチドドメイン（単一または複数）を本発明の可溶性ポリペプチドに結合してもよい（例えば、ポリペプチドのインビボ安定性を高めるポリペプチドドメインおよび／またはポリペプチドの精製を容易にするドメイン）。リンカー配列は、１つまたは複数のポリペプチド断片またはドメインを取り外すために（例えば、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその機能性断片のインビボ投与の前に精製タグを取り外すために）使用可能なペプチダーゼまたはプロテアーゼ切断部位を任意に含んでもよい。ポリペプチド切断および例えば、ポリペプチドドメイン（単一または複数）（例えば、６Ｘヒスチジンタグ精製ドメイン）の取り外しを可能とするリンカーまたはドメインの非限定的一例には、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位（例えば、ＧＳＫＥＮＬＹＦＱ’Ｇ、配列番号７６）を含むポリペプチドが挙げられる。当業者には、多くのその他のＴＥＶ切断部位が知られており、また、多くのその他のプロテアーゼ／ペプチダーゼ切断部位が知られており、それらを本発明のポリペプチド中に導入して、１つまたは複数のポリペプチドドメインまたは断片を任意に取り外してもよい。
また、ポリペプチドリンカーを使って、野性型のＮＲＰ１ポリペプチドに通常認められるが、本発明の可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその機能性断片には存在しないドメインを全体的にまたは部分的に置き換えてもよい。例えば、本発明のＮＲＰ１トラップ中で、合成リンカーがドメインａ１、ａ２、ｂ１、ｂ２およびｃに全体的にまたは部分的に置き換わってもよい。リンカーの長さは、取り除かれたドメインの全長またはその一部に対応してよい。このようなリンカーは、タンパク質折り畳み、安定性またはＮＲＰ１リガンドへの結合を増強し得る。リンカーを含むＮＲＰ１トラップの非限定的例は、図１９および２０（例えば、表１にリストされているトラップ２、トラップ３、トラップ４、トラップ９およびトラップ１０）に示されている。有用なポリペプチドリンカーの非限定的一例は、ポリアルギニンポリペプチドである。その他のリンカーが当技術分野において既知であり、本発明で使用し得る。
一実施形態では、本発明のＮＲＰ１トラップは、（ｉ）図２６（配列番号６９）に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１〜８５６（好ましくは２２〜８５６）；（ｉｉ）図２６（配列番号６９）に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１〜５８３（好ましくは２２〜５８３）；（ｉｉｉ）図２６（配列番号６９）に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１〜４２４（好ましくは２２〜４２４）；（ｉｖ）図２６（配列番号６９）に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１〜２６５（好ましくは２２〜２６５）；（ｖ）図２６（配列番号６９）に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１〜４３０および５８４〜８５６（好ましくは２２〜４３０および５８４〜８５６）；（ｖｉ）図２６（配列番号６９）に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１〜２７４および５８４〜８５６（好ましくは２２〜２７４および５８４〜８５６）；（ｖｉｉ）図２６（配列番号６９）に示すＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１〜４３０および５８４（好ましくは２２〜４３０および５８４〜８５６）を含む。特定の実施形態では、上述のトラップは、１つまたは複数の変異を含み、上述のように、ＶＥＧＦまたはＳＥＭＡ３Ａ結合を減らす。
関連態様では、本発明はＮＲＰ１トラップ（例えば、表１にリストされ、図１９、２０および２７に示されるトラップ）をコードする核酸を提供する。このような核酸は、細胞での発現のために発現ベクター中に含まれてよい。したがって、本発明は、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその機能性断片をコードする核酸を含むベクターおよびこのような発現ベクターを含む細胞にさらに関する。本発明の可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその機能性断片（すなわち、ＮＲＰ由来トラップ）をコードする核酸は、細胞による分泌のためのシグナル配列をコードする（例えば、配列番号６５、６６または６９、または配列番号７０のアミノ酸１〜２１をコードする）ポリヌクレオチド部分を含んでもよい。さらに、本発明の核酸は、３’末端に翻訳終結「停止」コドンを有するおよび有さない核酸を含む。翻訳終結停止コドンは、例えば、本発明の核酸をクローニング可能な発現ベクターにより提供してよい。
本明細書で使用する場合、ＮＲＰ１の「機能性断片」または「機能性変異体」（例えば、ＮＲＰ１などの本発明の可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの機能性断片）は、元の分子と同じ望ましい活性を実質的に保持するが、何らかの修飾、および／またはアミノ酸／ヌクレオチドの置換、欠失もしくは付加（例えば、別のポリペプチドとの融合）がある点で異なる分子を意味する。修飾は、ポリペプチド／ポリヌクレオチド骨格を含むいずれの部分にも生じ得る（例えば、アミノ酸配列、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシ末端）。このような置換、欠失または付加には１つまたは複数のアミノ酸が関与し得、またはポリヌクレオチドの場合には１つまたは複数のヌクレオチドが関与し得る。置換は、保存的であることが好ましく、すなわち、当業者によく知られているように、あるアミノ酸が、類似の物理化学的特性（大きさ、疎水性、電荷／極性など）を有する別のアミノ酸によって置き換えられるのが好ましい。可溶性ＮＲＰ１の機能性断片には、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチド（例えば、ａ１および／またはａ２ドメイン（単一または複数））の断片もしくは一部、または阻害活性を維持する（すなわち、ＳＥＭＡ３Ａ、ＶＥＧＦおよび／またはＴＧＦ−βに結合し、ＮＲＰ１媒介細胞活性の伝達を阻害する）ＮＲＰ１のホモログ変異体もしくはアレル変異体の断片もしくは一部が挙げられる。ＮＲＰ１媒介細胞活性の非限定的例には、ｉ）血管透過性亢進、ｉｉ）ＭＰ活性化および動員、ｉｉｉ）アポトーシスの誘導、ｉｖ）炎症促進性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β）の産生および／または分泌の誘導、が挙げられる。一実施形態では、ＮＲＰ１ポリペプチドは、図２２（ＮＲＰ１アイソフォーム２、配列番号６５）のポリペプチド配列または図２６（配列番号６６および６９）に示されるＮＲＰ１アイソフォーム１のアミノ酸１〜８５９もしくは２２〜８５９と、少なくとも８０、８５、８８、９０、９５、９８または９９％同一である。一実施形態では、ＮＲＰ１機能性断片は、図２２または２６（それぞれ配列番号６５および６６）に示されるＮＲＰ１のサブドメイン（単一または複数）ａ１（例えば、配列番号７１、または配列番号６６のアミノ酸２２〜１４８）、ａ２（例えば、配列番号７２、または配列番号６６のアミノ酸１４９〜２７５）、ｂ１（例えば、配列番号７３、またはアミノ酸）、ｂ２（例えば、配列番号７４、または配列番号６６のアミノ酸４２９〜５８９）および／またはｃ（例えば、配列番号７５、または配列番号６６のアミノ酸５９０〜８５９）に、少なくとも８０、８５、８８、９０、９５、９８または９９％同一であるサブドメインａ１、ａ２、ｂ１、ｂ２および／またはｃを含む。一実施形態では、ＮＲＰ１は、ラット、マウスおよびヒトのＮＲＰ１の間で保存されていないアミノ酸の変異（保存的または非保存的置換（単一または複数）および／または欠失（単一または複数））を含む、機能性変異体である（図２６および配列番号６９に示すコンセンサス配列を参照されたい）。好ましくは、ＮＲＰ１ポリペプチド／ポリヌクレオチドまたはその断片は、ヒトである。
抗体
ＮＲＰ１細胞活性は、ＮＲＰ１の１つまたは複数のそのリガンド（例えば、ＳＥＭＡ３Ａ、ＶＥＧＦおよび／またはＴＧＦ−β）との結合を遮断する薬剤を使用して阻害することができる。このような薬剤の一例は、ＮＲＰ１に結合し、ＮＲＰ１のＳＥＭＡ３Ａ、ＶＥＧＦおよび／またはＴＧＦ−βとの結合を遮断する抗体である。
あるいは、ＮＲＰ１媒介細胞内シグナル伝達の阻害は、ＮＲＰ１リガンドのＮＲＰ１ポリペプチドとの結合を遮断する薬剤を使用することにより達成することができる。このような薬剤の非限定的例には、ＳＥＭＡ３Ａ、ＶＥＧＦまたはＴＧＦ−βに結合し、それらそれぞれのＮＲＰ１への結合を遮断する抗体が挙げられる。
本発明の特定の態様では、ＮＲＰ１を標的にする抗体は、ＳＥＭＡ３Ａの受容体への結合を阻止するが、ＶＥＧＦおよび／またはＴＧＦ−βのＮＲＰ１への結合を実質的に妨げない。一実施形態では、抗ＮＲＰ１抗体は、ＮＲＰ１ポリペプチドのａ１ａ２ドメインに結合する。別の実施形態では、抗ＮＲＰ１抗体は、ＮＲＰ１ポリペプチドのａ１またはａ２サブドメインに結合する。
上述のように、抗ＳＥＭＡ３Ａ抗体を使って、ＮＲＰ１へのＳＥＭＡ３Ａ結合を遮断することにより、ＮＲＰ１媒介細胞内シグナル伝達を阻害（すなわち、完全にまたは部分的に低減）し得る。有用な抗ＳＥＭＡ３Ａ抗体は、ＳＥＭＡ３Ａのセマドメインに結合し、ＮＲＰ１との相互作用を遮断する。いくつかの実施形態では、本発明により使用される抗ＳＥＭＡ３Ａ抗体は、ＳＥＭＡ３Ａのアミノ酸残基２５２〜２６０、３５９〜３６６または３６３〜３８０を含むＳＥＭＡ３Ａポリペプチドドメインに結合する抗体を含む。ＳＥＭＡ３ＡのＮＲＰ１への結合を阻害するＳＥＭＡ３Ａ抗体は、当技術分野において既知であり、本発明で使用し得る。
本明細書で使用する場合、「抗ＮＲＰ１抗体」という表現は、ＮＲＰ１タンパク質に特異的に結合（相互作用）し、ＮＲＰ１タンパク質と同じ抗原決定基を共有する天然タンパク質以外の他の天然タンパク質に実質的に結合しない抗体を意味する。同様に、「抗ＳＥＭＡ３Ａ抗体」、「抗ＶＥＧＦ抗体」または「抗ＴＧＦ−β抗体」という表現は、それぞれ、ＳＥＭＡ３Ａ、ＶＥＧＦまたはＴＧＦ−βタンパク質に特異的に結合（相互作用）し、標的ＳＥＭＡ３Ａ／ＶＥＧＦ／ＴＧＦ−βタンパク質と同じ抗原決定基を共有する天然タンパク質以外の他の天然タンパク質に実質的に結合しない抗体を意味する。
本発明で使用することができる抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体ならびにキメラ抗体が含まれる。抗体または免疫グロブリンという用語は、最も広い意味で使用され、所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体および抗体断片を包含する。抗体断片は、完全長抗体の一部、一般的には、その抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、ディアボディ、直鎖抗体、一本鎖抗体分子、単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ科由来）、ナノボディ、サメＮＡＲ単一ドメイン抗体、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。抗体断片はまた、ＣＤＲまたは抗原結合ドメインを含有する結合部分も意味し、ＶＨ領域（ＶＨ、ＶＨ−ＶＨ）、アンチカリン、ＰｅｐＢｏｄｉｅｓ（商標）、抗体−Ｔ細胞エピトープ融合体（Ｔｒｏｙｂｏｄｙ）またはペプチボディを挙げることができるが、これらに限定されない。
抗ヒトＮＲＰ１／ｓｅｍ３Ａ／ＶＥＧＦ／ＴＧＦ−β抗体は、これまでに調製されており、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＡｂＣａｍ、およびＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇなどの種々供給業者からも市販されている。
一般に、抗体（配列が既知の場合の、モノクローナル抗体、ハイブリドーマおよびヒト化抗体を含む）を調製するための技術および抗体を使用して抗原を検出する技術は、当該技術分野においてよく知られており、また、各種プロトコルもよく知られており、入手可能である。
ＮＲＰ１またはＮＲＰ１リガンドの発現の阻害
ＮＲＰ１またはそのリガンド（例えば、ＳＥＭＡ３Ａ、ＶＥＧＦまたはＴＧＦ−β）の発現を低下させて（ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで）、ＮＲＰ１媒介細胞内シグナル伝達を阻害し、それにより、炎症および自然免疫応答の過剰活性化（すなわち、ｉ）炎症促進性サイトカインの産生および／または分泌；ｉｉ）単核貪食細胞（ＭＰ）の動員；ｉｉｉ）血管透過性亢進化；および／またはｉｖ）浮腫；ｖ）神経損傷、脈絡膜新生血管など）を減らすための種々の手法を利用可能である。非限定的な例には、ＮＲＰ１、ＳＥＭＡ３Ａ、ＶＥＧＦまたはＴｇｆ−βプロモーターなどを標的にする低分子ヘアピンｓｈＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、アンチセンス、リボザイム、ＴＡＬエフェクタの使用が挙げられる。
細胞におけるｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの発現は、プラスミドの送達またはウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）もしくは細菌ベクターを介して行うことができる。
したがって、代替実施形態では、本発明は、目的のｍＲＮＡの分解および／または翻訳の阻害を行うための外因性投与用アンチセンス、ｓｈＲＮＡ分子およびリボザイムを提供する。アンチセンス、ｓｈＲＮＡ分子およびリボザイムが、ヒトＮＲＰ１、ＳＥＭＡ３Ａ、ＶＥＧＦおよび／またはＴＧＦ−β発現を標的にするのが好ましい。治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド用途の例には、１９９２年８月４日出願の米国特許第５，１３５，９１７号；１９９２年３月２４日出願の米国特許第５，０９８，８９０号；１９９２年２月１１日出願の米国特許第５，０８７，６１７号；１９９２年１１月２４日出願の米国特許第５，１６６，１９５号；１９９１年４月２日出願の米国特許第５，００４，８１０号；１９９３年３月１６日出願の米国特許第５，１９４，４２８号；１９８９年２月２１日出願の米国特許第４，８０６，４６３号；１９９４年２月１５日出願の米国特許第５，２８６，７１７号；米国特許第５，２７６，０１９号、および米国特許第５，２６４，４２３号；ＢｉｏＷｏｒｌｄ Ｔｏｄａｙ，Ａｐｒ．２９，１９９４，ｐ．３が挙げられる。
好ましくは、アンチセンス分子では、目的のｍＲＮＡとの相補性の程度は、特異的結合が望まれる状況下、例えば、インビボアッセイもしくは治療処置の場合の生理学的条件下、またはインビトロアッセイの場合のアッセイが実施される条件下で、アンチセンス分子の非標的配列への非特異的な結合を十分に回避するものである。アンチセンス結合のための標的ｍＲＮＡは、タンパク質をコードするための情報だけでなく、関連するリボヌクレオチド、例えば、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、５’キャップ領域およびイントロン／エキソン連結リボヌクレオチドを形成するものも含み得る。本発明のＳｈｃ阻害剤などの分子を得るために使用できるアンチセンスおよびリボザイム核酸の選別方法は、米国特許第５，９３２，４３５号に開示されている。
本発明のアンチセンス分子（オリゴヌクレオチド）には、糖間骨格結合、例えば、ホスホトリエステル、ホスホン酸メチル、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルの糖間結合、または短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式糖間結合、ホスホロチオエートなどを含むもの、ならびにＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる）、ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２およびＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２骨格（式中のホスホジエステルはＯ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２）を有するものを含めてよい。モルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドを用いてもよい（米国特許第５，０３４，５０６号）。代替実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ、時に「タンパク質核酸」とも呼ばれる）骨格を有し得る。この場合、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格がポリアミド骨格により置き換えられ得、ヌクレオシド塩基がポリアミド骨格中のアザ窒素原子またはメチレン基に直接的または間接的に結合している（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７および米国特許第５，５３９，０８２号）。ホスホジエステル結合は、キラルおよび鏡像異性的に特異である構造で置換されてもよい。当業者であれば、本発明の実施に使用するための他の結合を選択できるであろう。
オリゴヌクレオチドはまた、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド塩基を含む種を含み得る。したがって、天然に通常みられないプリンおよびピリミジンも使用できる。同様に、ヌクレオチドサブユニットのペントフラノシル部分の修飾も行ってよい。このような修飾の例は、２’−Ｏ−アルキル−置換および２’−ハロゲン置換のヌクレオチドである。本発明で有用な糖部分の２’位における修飾のいくつかの具体例は、ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２またはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（式中ｎは１〜約１０）；Ｃ１〜Ｃ１０の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリルまたはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；インターカレータ；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善する基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基および類似の特性を有する他の置換基である。１つまたは複数のペントフラノシル基が、別の糖、シクロブチルなどの糖類似体、または糖に代わる別の部分と置き換わってもよい。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約５〜約１００の核酸単位を含んでよい。核酸単位が、ホスホジエステルまたは骨格構造を形成する他の結合を介して、隣接するヌクレオチド単位に適切に結合した塩基−糖の組み合わせ（または類似構造物の組み合わせ）であることは理解されよう。
さらなる実施形態では、目的のポリペプチド（例えば、ＳＥＭＡ３ＡまたはＮＲＰ１）をコードする核酸またはその断片の発現を、転写後遺伝子サイレンシングの一種であるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術を用いて阻害または妨害してよい。ＲＮＡｉを使用して、疑似「ノックアウト」、すなわち、目的の遺伝子またはコード領域がコードする産物の発現を減少させる系を作製し、系内の当該コード産物の活性を全体的に減少させてもよい。このように、ＲＮＡｉは、目的の核酸またはその断片もしくは変異体を標的にし、そのコードする産物の発現および活性レベルを低減するために実施することができる。このような系は、当該産物の機能研究に使用し得るだけでなく、このような産物の活性に関する疾患の処置にも用いることができる。ＲＮＡｉについては、例えば、米国特許出願公開第２００２０１７３４７８号（Ｇｅｗｉｒｔｚ；２００２年１１月２１日公開）および同２００２０１３２７８８号（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．；２００２年１１月７日公開）に記載されている。ＲＮＡｉを実施するための試薬およびキットは、例えば、Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）から市販されている。
一部の系において、ＲＮＡｉの最初の試薬は、標的核酸に対応するｄｓＲＮＡ分子である。次いで、ｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ）が、２１〜２３のヌクレオチド長である低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（１９〜２１塩基対の二重鎖、各々２ヌクレオチド３’オーバーハングを有する）に切断されると考えられる。この最初の切断段階をもたらすと思われる酵素は、「ダイサー」と呼ばれており、ｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼのＲＮアーゼＩＩＩファミリーの１つのメンバーに分類されている。あるいは、このようなｓｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ様分子を細胞に直接導入することによって、またはこのようなｓｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ様分子の適切な前駆体（例えば、前駆体（単一または複数）をコードするベクターなど）を細胞に導入して細胞内で生成させることによって、ＲＮＡｉの機能を発揮させてもよい。その後、ｓｉＲＮＡは、他の細胞内成分と結合し、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成し得る。このようにして形成されたＲＩＳＣは、その後、相同性に基づき、ｓｉＲＮＡ部分と標的転写産物との間の塩基対相互作用を介して、目的の標的転写産物を標的にし得る。これにより、標的転写産物がｓｉＲＮＡの３’末端から約１２ヌクレオチドで切断されることになる。このように、標的ｍＲＮＡが切断され、ｍＲＮＡがコードするタンパク質産物のレベルが減少する。
ＲＮＡｉは、適切にインビトロ合成されたｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはｓｉＲＮＡ様分子の細胞内導入により機能を発揮させ得る。例えば、化学合成されたＲＮＡを用いてＲＮＡｉを行ってもよい。あるいは、適切な発現ベクターを用いて、このＲＮＡをインビトロまたはインビボのいずれかで転写してもよい。センス鎖およびアンチセンス鎖（同じベクターまたは別のベクター上に存在する配列によってコードされるもの）のインビトロ転写は、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて行い得る。この場合、ベクターは、Ｔ７プロモーターに操作可能なように連結された適切なコード配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、インビトロ転写されたＲＮＡを、ＲＮＡｉになる大きさに（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮアーゼＩＩＩを用いて）インビトロ処理してよい。センスおよびアンチセンスの転写産物を組み合わせて、ＲＮＡ二重鎖を形成し、これを目的の標的細胞に導入する。ｓｉＲＮＡ様分子に処理可能な低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現する、他のベクターを使用してもよい。ベクターをベースにした各種方法およびこのようなベクターをインビトロまたはインビボ（例えば、遺伝子治療）のいずれかで細胞に導入するための各種方法は、当技術分野において知られている。
したがって、一実施形態では、目的のポリペプチド、例えば、可溶性ＮＲＰ１、ＮＲＰ１由来トラップをコードする核酸またはその断片の発現は、目的のポリペプチド（例えば、ＳＥＭＡ３ＡまたはＮＲＰ１）をコードする核酸もしくはその断片、またはこれらに相同の核酸に対応するｓｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ様分子を細胞に導入すること、または細胞内で生成させることによって阻害し得る。「ｓｉＲＮＡ様分子」は、ｓｉＲＮＡに類似し（例えば、大きさおよび構造）、ｓｉＲＮＡ活性を誘発できる、すなわち、ＲＮＡｉを介した発現の阻害の機能を発揮する核酸分子を意味する。各種実施形態では、このような方法には、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子の細胞への直接投与、または上述のベクターをベースにした方法の使用が必要となり得る。一実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子は約３０未満のヌクレオチド長である。さらなる実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子は、約２１〜２３のヌクレオチド長である。一実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子は、１９〜２１塩基対の二重鎖部分を含み、各鎖は２ヌクレオチド３’オーバーハングを有する。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子は、目的のポリペプチドをコードする核酸またはその断片もしくは変異体（または変異体の断片）と実質的に同一である。このような変異体は、目的のポリペプチドに類似した活性を有するタンパク質をコードすることができる。
細胞内でのｓｈＲＮＡ／ＲＮＡｉ発現を得るために、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルスおよびレンチウイルスを含む、各種のウイルスベクターを使用することができる。アデノ随伴ウイルスおよびアデノウイルスを用いる場合、ゲノムはエピソームとして残る。これは、挿入変異が回避されるので、有利である。不利な点は、細胞が非常にゆっくり分裂しない限り、細胞の子孫が細胞分裂によってウイルスをすぐに失うことである。ＡＡＶは、ウイルス遺伝子が除去され、詰め込み能力が小さくなっている点で、アデノウイルスとは異なる。レンチウイルスは、転写活性のあるクロマチン部分に統合されるため、子孫細胞に受け継がれる。この方法では挿入変異のリスクが高まるが、インテグラーゼ欠損レンチウイルスを使用することによってこのリスクを軽減することができる。
医薬組成物およびキット
本発明のＮＲＰ１依存性細胞内シグナル伝達を阻害する薬剤（すなわち、ＮＲＰ１阻害剤）は、単独でまたは医薬組成物として、ヒト対象に投与することができる。医薬組成物の場合、標的疾患または状態を処置または予防するまたは所望の細胞の反応を生じる用量で、適切なキャリアまたは賦形剤（単一または複数）と、それらの薬剤を混合する。
これら化合物の混合物（例えば、ＮＲＰ１トラップ、抗体、ドミナントネガティブペプチド、低分子阻害性ペプチド、など）もまた、単純な混合物として、または適切に処方された医薬組成物として、対象に投与することができる。さらに、治療有効量は、標的炎症性疾患または状態（例えば、敗血性ショック、関節炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、皮膚炎症、糖尿病、ぶどう膜炎および糖尿病性網膜症などの神経炎症状態、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、加齢性認知機能低下／アルツハイマー病、など）の予防または処置をもたらすために、または所望の細胞の反応または生理的な反応を得るために、十分な化合物または複数化合物の量（例えば、ｉ）浮腫を低減する、ｉｉ）単核貪食細胞（例えば、ミクログリアまたはマクロファージ）の活性化／動員を減らす、ｉｉｉ）炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、など）の産生または分泌を減らす、ｉｖ）病理学的血管新生を減らす、ｖ）血管変性を減らすために十分な量）を意味する。
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能なキャリア」または「賦形剤」は、生理学的に適合性のある任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、生理的媒体などを含む。いくつかの実施形態では、キャリアは眼投与に適するものである。他の実施形態では、キャリアは全身投与に適するものである。他の実施形態では、キャリアは経口投与に適するものである。
薬学的に許容可能なキャリアは、滅菌水溶液または滅菌分散液、および注入可能な滅菌溶液または滅菌分散液をその場で調製するための滅菌粉末を含む。例えば、眼、全身または経口適用などのための、このような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野においてよく知られている。任意の従来の媒体または薬剤が本発明の化合物と相いれない場合を除き、本発明の組成物におけるこれらの使用が意図されている。また、補助的な活性化合物も、組成物中に組み込むことができる。
本出願の化合物の処方技術および投与技術は、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ中に見出され得る。
本発明はまた、本発明の方法で使用するためのキットまたは市販パッケージにも関する。このようなキットは、このキットを使用するための説明書と一緒に、本発明の化合物（例えば、ＳＥＭＡ３Ａ媒介細胞内シグナル伝達を含むＮＲＰ１細胞内シグナル伝達を阻害する化合物、例えば、トラップ、抗体、ｓｈＲＮＡ、細胞、ベクター、核酸）を含んでよい。
投与経路／製剤
好適な投与経路には、例えば、全身、経口および経眼（点眼薬または眼内注射）を含めてよい。好ましい投与経路としては、眼疾患に対しては点眼薬および眼内注射、慢性炎症状態に対しては経口投与、および敗血症および脳卒中などの特定の神経細胞疾患に対しては全身投与を含む。製剤はまた、持続放出製剤の形態であってもよい。
したがって、本発明による使用のための医薬組成物は、活性化合物の薬学的に使用可能な製剤への処理を容易にする賦形剤および助剤を含む、１つまたは複数の生理学的に許容可能なキャリアを使用して従来の方法で処方することができる。適切な処方は、選ばれた投与経路に依存する。注射の場合、本発明の薬剤を、水溶液、好ましくは生理学的に適合性のある緩衝液、例えば、ハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水緩衝液で処方してよい。
化合物は、眼投与用、例えば、点眼薬または眼内注射用に処方してよい。注射用の製剤は、単位剤形、例えば、アンプル、または防腐剤を添加した複数回投与用容器で提供してよい。組成物は、懸濁液、溶液または油性もしくは水性ビークル中の乳剤などの形態を取ってよく、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含めてもよい。さらに、標的化薬物送達システム、例えば、細胞特異的な抗体をコーティングしたリポソームで、またはその他の送達システム（例えば、特異的組織（例えば、脳）または細胞型（例えば、ミクログリアまたはマクロファージ）を標的として）で薬剤を投与してもよい。ナノシステムおよびエマルジョンは、薬剤用の送達ビークルまたはキャリアのよく知られている追加例である。別の例は、眼疾患のための、Ｎｅｕｒｏｔｅｃｈのカプセル化細胞療法（ＥＣＴ）送達システム由来のものである。ＥＣＴは、２年間にわたり、眼用の治療用タンパク質の連続的産生を可能とする遺伝子組み換えされた眼インプラントである。さらに、治療は、インプラントを除去するだけで、元に戻せる。ＥＣＴインプラントは、２０分の外来患者外科手術により、単一の切開部位を通って硝子体中に挿入され、所定位置で縫合される。
有効投与量
本発明での使用に適する医薬組成物には、活性成分がその使用目的を達成するための有効量で含まれる組成物が挙げられる。より具体的には、治療有効量は、治療対象の既存の症状の進行防止または緩和に対する有効量を意味する。有効量の決定は、当業者の能力の範囲内で適切に行うことができる。
有効量の化合物は、大きな副作用を生じることなく、１つまたは複数の生理的または細胞応答（例えば、血管透過性亢進、血液網膜関門漏出、浮腫、ＭＰ活性化および／または動員、炎症促進性サイトカイン産生および／または分泌、血管新生、神経損傷、など）を減らすもしくは防ぐまたは所定の炎症性疾患または状態を予防もしくは処置するのに十分にＮＲＰ１の細胞シグナル伝達機能を阻害する。このような活性を有する特定の化合物は、ＮＲＰ１媒介細胞内シグナル伝達阻害剤（例えば、ＮＲＰ１の発現もしくは活性を直接標的にする薬剤またはＮＲＰ１のリガンドの発現もしくは活性（例えば、結合活性）を標的にする薬剤）の用量依存的阻害を測定するインビトロアッセイにより特定することができる。
本発明の方法で使用されるいずれの化合物に対しても、治療的有効量を、初めに細胞アッセイから推定することができる。例えば、細胞および動物モデルにおいて、細胞アッセイで決定されたＩＣ５０（すなわち、通常、ＩＬ−１βなどの炎症メディエーター、または低酸素、虚血、細胞ストレス、ＥＲストレスなどの他の活性化刺激に対して、ＮＲＰ１の細胞内シグナル伝達機能の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む血中濃度範囲を達成するように、投与量を処方することができる。
治療的有効量は、対象の症状に改善をもたらす化合物の量を意味する。同様に、予防有効量は、患者の症状（例えば、ＮＲＰ１媒介血管透過性亢進、飛蚊症および／またはかすみ目、毛細血管周皮細胞喪失、黄斑浮腫、網膜腫脹、血液網膜関門漏出、単核貪食細胞動員、炎症促進性サイトカインの産生および分泌、血管変性、病理学的血管新生、神経損傷、など）を予防するまたは進行を遅らせるのに必要な量を意味する。このような化合物の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法、例えば、最大耐量（ＭＴＤ）およびＥＤ（最大反応の５０％の有効量）を求めることによって決定することができる。毒性効果と治療効果を示す用量の比率は、治療指数であり、ＭＴＤとＥＤ５０の比率で表され得る。治療指数の高い化合物が好ましい。的確な処方、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して、個々の医師によって選択することができる。
投与量および投与間隔は、ＮＲＰ１調節効果を維持するのに十分な活性化合物のレベル、または最小有効濃度（ＭＥＣ）を可能とするために、個々に調整してよい。ＭＥＣは、化合物ごとに変動するであろうが、インビトロデータ、例えば、ＳＥＭＡ３Ａ発現または活性（例えば、ＮＲＰ１受容体への結合）の実質的な阻害を達成するのに必要な濃度から推定することができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は、個々の特徴および投与経路による。
組成物の投与量は、当然のことながら、治療対象、対象の体重、病気の重症度、投与方法および処方医師の判断に依存するであろう。
定義
分かりやすくするために、本発明において、次の用語の定義が適用される。
本明細書で使用する場合、「ニューロピリン−１受容体」または「ＮＲＰ１」受容体という用語は、ニューロピリン−１およびそのアイソフォーム、ならびにアレル／多形を意味する（例えば、ＨＧＮＣ：８００４；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：８８２９；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ００００００９９２５０；ＯＭＩＭ：６０２０６９；およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｏ１４７８６；ジェンバンク受入番号ＡＡＨ０７７３７．１、図２２、配列番号６５）。ＮＲＰ１は、細胞外ドメイン上の別々の部位を介して、構造的に異なる３つのリガンドに結合する特殊な能力を有する非チロシンキナーゼ多機能受容体である。ＮＲＰ１は、ＳＥＭＡ３Ａに結合し（１８、１９）（例えば、細胞骨格崩壊を誘発する）、また、ＶＥＧＦ１６５に結合してＶＥＧＦＲ２への結合を促進する（例えば、その血管新生潜在能力を高める）。ＮＲＰ１は、ＴＧＦ−βにも結合する。さらに、遺伝子研究では、ＮＲＰ１が神経細胞および血管発生に対するＶＥＧＦとＳＥＭＡ３Ａの作用を個別に調節していることも示されている。したがって、リガンドに応じて、ＮＲＰ１媒介細胞反応が変化する。
ニューロピリン−１の基本構造は、５個のドメイン：３個の細胞外ドメイン（ａ１ａ２（ＣＵＢ）、ｂ１ｂ２（ＦＶ／ＦＶＩＩＩ）およびｃ（ＭＡＭ）、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む（図１９Ａおよび２２ならびに配列番号６５、６６および６８を参照されたい）。ａ１ａ２ドメインは、ジスルフィド架橋を形成する４個のシステイン残基を通常含有する、補体成分Ｃ１ｒおよびＣ１ｓ（ＣＵＢ）と相同である。このドメインがＳＥＭＡ３Ａと結合する。ドメインｂ１ｂ２（ＦＶ／ＦＶＩＩＩ）はＶＥＧＦに結合する。サブドメインｂ１のアミノ酸Ｙ２９７は、ＶＥＧＦへの結合にとって重要である。理由は、Ｙ２９７のアラニンへの置換により、ＮＲＰ１へのＶＥＧＦの結合が顕著に減少するためである。ＮＲＰ１にはいくつかのスプライスバリアントアイソフォームおよび可溶型が存在し、これらはすべて本発明に包含される。
「相同性」および「相同」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、整列させた配列のそれぞれの位置を比較することによって決定することができる。核酸配列間またはアミノ酸配列間の相同性の程度は、配列の共有する位置で、ヌクレオチドまたはアミノ酸が同一である数もしくは一致した数の関数である。本明細書でその用語を使用する場合、２つの配列が実質的に同一であり、その配列の機能活性が保存されている場合、核酸／ポリヌクレオチド配列は、他方の配列と「相同」である（本明細書で使用する場合、「相同」という用語は進化的関係を意味するものではない）。最適に整列された場合（ギャップ許容あり）、少なくとも約５０％の配列類似性または同一性を共有するか、または定義した機能モチーフを配列が共有していれば、２つの核酸配列は実質的に同一であるとみなされる。代替実施形態では、最適に整列された実質的に同一の配列における配列類似性は、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であり得る。本明細書で使用する場合、配列間の相同性を示す一定の割合は、最適に整列された配列における配列同一性の程度を示す。「無関係」または「非相同」の配列は、本明細書で開示のいずれかの核酸およびポリペプチドと、４０％未満の同一性を共有するが、好ましくは約２５％未満の同一性を共有する。
実質的に相補的な核酸は、一方の分子の相補配列が他方の分子と実質的に同一である核酸である。２つの核酸配列またはタンパク質配列は、最適に整列された場合に、少なくとも約７０％の配列同一性を共有すれば、実質的に同一であるとみなされる。代替実施形態では、配列同一性は、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であり得る。同一性を比較するための配列の最適アラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム（１９８１、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ２：４８２）、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３）、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索方法（１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４）、ならびにこれらのアルゴリズムのコンピュータ処理（例えば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）などの各種アルゴリズムを用いて行うことができる。配列同一性はまた、Ａｌｔｓｃｈｕｌらが記述したＢＬＡＳＴアルゴリズム（１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）を用いて決定することもできる（発表されたデフォルト設定を使用）。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センターより（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／からインターネットを介して）入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードと整列化を行ったときに、ある正の値の閾値スコアＴと一致するかまたは満足させる、検索配列中の長さＷの短いワードを特定することにより、高スコアの配列ペア（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる。最初の隣接ワードヒットは、より長いＨＳＰを見出すための検索を開始するシードとして作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に拡張される。ワードヒットの両方向への拡張は、次のパラメータが満たされるときに停止する。累積アラインメントスコアが最大到達値から量Ｘだけ低下した場合、１つまたは複数の負のスコア残基アラインメントが蓄積したことにより累積スコアがゼロ以下になった場合、またはいずれかの配列の末端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５−１０９１９）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０（または１または０．１または０．０１または０．００１または０．０００１）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を用いることができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いる２つの配列間の統計的類似性の一つの尺度は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸の配列間の一致が偶然により生じ得る確率の指標を提供する。本発明の代替実施形態では、試験配列の比較における最小和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、実質的に同一とみなされる。
２つの核酸配列が実質的に相補的であることの代替指標は、中程度にストリンジェントな条件下、または好ましくはストリンジェントな条件下で、２つの配列が互いにハイブリダイズすることである。中程度にストリンジェントな条件下でのフィルタ結合配列に対するハイブリダイゼーションは、例えば、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中６５℃で行い、０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで４２℃で洗浄することで実施できる（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ａｔ ｐ．２．１０．３参照）。あるいは、ストリンジェントな条件下でのフィルタ結合配列に対するハイブリダイゼーションは、例えば、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中６５℃にて行い、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６８℃にて洗浄することで実施できる（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），１９８９、上述、参照）。ハイブリダイゼーションの条件は、目的の配列に応じて、既知の方法に従って変更してよい（Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９９３，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２ “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびｐＨでの特定の配列に対する熱的融点よりも約５℃低くなるように選択される。例えば、一実施形態では、本発明の化合物は、ＮＲＰ１またはＳＥＭＡ３Ａ核酸配列（好ましくはヒト配列）にハイブリダイズするアンチセンス／ＲＮＡｉまたはｓｈＲＮＡである。
本明細書で使用される場合、炎症性疾患または状態（例えば、網膜症、脳虚血、脳卒中、敗血症、など）に関連して、「処置すること」または「処置」という用語は、前記疾患または状態に関連する１つまたは複数の症状または病理学的、生理的反応の低減／改善を意味することが意図されている。非限定的例には、浮腫、腫脹、そう痒、疼痛、血管透過性亢進、血液網膜関門の完全性、ＳＥＭＡ３Ａ、ＶＥＧＦおよび／またはＴＧＦ−β発現の増加、単核貪食細胞動員／走化性、炎症促進性サイトカインの産生および／または分泌、血管または神経細胞変性、などが挙げられる。
本明細書で使用する場合、炎症性疾患または状態に関連して、「予防すること」または「予防」という用語は、疾患または状態に関連する少なくとも１つの症状の進行の低減または発症の遅延を意味することが意図されている。
冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、本明細書では、１または２以上（すなわち、少なくとも１）の文法上の目的語たる物品を意味するものとして使用される。
本明細書では、用語の「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「限定されるものではないが、以下が含まれる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」および「限定されるものではないが、以下が含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」なる語句を意味するように使用され、およびこれらの語句と同義に使用される。
本明細書で使用される場合、用語の「などの」は、「限定されないが、〜などの（ｓｕｃｈ ａｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」なる語句を意味するように使用され、およびこの語句と同義に使用される。
本発明を以下の非限定的な実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１
材料と方法（実施例２〜９および１２）
ＬｙｚＭ−ｃｒｅ／Ｎｒｐｆｌ／ｆｌマウスの生成。Ｃ５７Ｂｌ／６野生型（ＷＴ）マウスをＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ＬｙｚＭ−Ｃｒｅ（Ｌｙｚ２ｔｍ１（ｃｒｅ）Ｉｆｏ／Ｊ；ｎｏ．００４７８１）およびＮＲＰ１ ｆｌｏｘｅｄマウス（Ｎｒｐ１ｔｍ２Ｄｄｇ／Ｊ；ｎｏ．００５２４７）を、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、交配して、ＮＲＰ１欠損骨髄細胞を有するＬｙｚＭ−ｃｒｅ／Ｎｒｐｆｌ／ｆｌマウスを得た。
Ｏ２誘導網膜症。マウスの仔（ＷＴまたはＬｙｚＭ−Ｃｒｅ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）またはＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌ）およびそれらの里親（ＣＤ１、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を生後７日（Ｐ７）〜１２日まで７５％Ｏ２に暴露し、室内気に戻した（５２）。このモデルは、ヒトの眼の新生血管疾患、例えば、後期の有害な病理学的血管新生を特徴とする糖尿病性網膜症の代用としての役割をする（５３、５４）。室内気に戻すと、Ｐ１４から以降に、低酸素駆動血管新生（ＮＶ）が発生する（２６）。種々の時点で眼を摘出し、記載のＦＡＣＳ分析またはｍＲＮＡ分析用に網膜を切開した。他の実験では、切開した網膜をフラットマウントし、１ｍＭのＣａＣｌ２中の蛍光標識イソレクチンＢ４（１：１００）と共に一晩インキュベートし、ＩｍａｇｅＪおよびＳＷＩＦＴ−ＮＶ法を使ってＰ１７での無血管領域または血管新生領域の広さを測定した（５５）。
消化網膜および脾臓のＦＡＣＳ。ＷＴまたはＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス由来の網膜をホモジナイズし、７５０Ｕ／ｍＬのＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ）および０．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ）の溶液中、緩やかな振盪を加えながら、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、ホモジネートを７０μｍのセルストレーナーで濾過し、ＰＢＳ＋３％ウシ胎仔血清中で洗浄した。脾臓試料をホモジナイズし、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＤと共に３７℃で１０分間インキュベートした。ホモジネートをＰＢＳ＋３％ウシ胎仔血清中で洗浄し、ペレットを再懸濁し、リシスバッファー（１０ｍＭ ＫＣＨＯ３；１５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で室温下、５分間インキュベートした。細胞懸濁液（網膜または脾臓）を、ＬＥＡＦ（商標）精製抗マウスＣＤ１６／３２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と共に室温で１５分間インキュベートして、Ｆｃ受容体をブロッキングした。その後、下記の抗体と共に、細胞を室温で３０分間インキュベートした。ＦＩＴＣ抗マウス／ヒトＣＤ１１ｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ／ＣＹ７抗マウスＬｙ−６Ｇ／Ｌｙ−６Ｃ（Ｇｒ−１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）抗マウスＦ４／８０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、７ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびアロフィコシアニン標識抗ｍＮｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１ラットＩｇＧ２Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはアロフィコシアニン標識ラットＩｇＧ２Ａアイソタイプ対照（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。
ＣＸ３ＣＲ１およびＣＤ４５発現の分析のために、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００抗マウスＣＤ４５．２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびフィコエリトリン標識抗マウスＣＸ３ＣＲ１ヤギＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはヤギＩｇＧアイソタイプを補充した上述の抗体を使って追加の細胞外染色を行った。ＬＳＲＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）装置でフィコエリトリン標識対照のＦＡＣＳを行い、データをＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（バージョン７．６．５）を使って解析した。
ＢｒｄＵ注射。ＯＩＲに晒されたまたは正常酸素圧条件に保持された野性型マウスに、Ｐ１３で、５−ブロモ−２−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ：Ｓｉｇｍａ）を、ＰＢＳ中に溶解した１ｍｇ／マウスの用量で腹腔内に注射した。
ＢｒｄＵ取り込みの分析。Ｐ１４ ＷＴマウス由来の網膜細胞に染色を行った。上述のようにして試料を得た。細胞外染色を上述のように行った（ＣＤ４５．２（中／低）；Ｇｒ−１−；ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋；７ＡＡＤ）。次に、細胞をＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で３０分間固定し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で１０分間透過処理した。次に、細胞を３００ｕｇ／ｍＬのＤＮアーゼで３７℃、１時間処理し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）で洗浄した。抗ＢｒｄＵ−ＰＥ抗体（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはＰＥ標識マウスＩｇＧκアイソタイプ対照（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使って、４℃で２５分間、ＢｒｄＵの細胞内染色を行った。その後、細胞をＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）で洗浄し、ＰＢＳ＋３％ウシ胎仔血清に再懸濁後、ＬＳＲＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＦＡＣＳ分析を行った。
硝子体切除。以前にＰＤＲと診断された全患者を追跡調査し、単独の硝子体網膜外科医により手術を行った（ＦＡＲ）。対照患者は非血管病変（ＥＲＭ（網膜上膜）またはＭＨ（黄斑円孔））に対して同じ外科医により外科的処置を受けた。手術室の設定で、患者は、局所的後方／眼球周囲麻酔下で手術を受けた。５％のポビドン−ヨウ素溶液を使って、眼周囲皮膚を洗浄し、眼中へのおよび結膜嚢内への局所的点滴を所定位置で５分間保持した。２５ゲージバルブ付きカニューレ（Ａｃｏｎ）を介して、３ポート２５ゲージ経結膜経扁平部硝子体切除術を行った。顕微鏡可視化下で、広角目視装置（Ｒｅｓｉｇｈｔ（商標）、Ｚｅｉｓｓ）を使って、２５ゲージ硝子体切除装置で無希釈硝子体を収集した。硝子体生検後、糖尿病性硝子体出血および牽引性網膜剥離を処置する通常の方式で、インフュージョンラインを開いて、硝子体切除術および膜剥離を行った。この後続けて、汎網膜眼内レーザー光凝固、液空気置換 、および硝子体内抗ＶＥＧＦ注射を行った。
ＥＬＩＳＡによるＳＥＭＡ３Ａタンパク質の定量化。生検の直後に硝子体試料をドライアイス上で凍結し、−８０℃で貯蔵した。分析前に、試料を１５０００ｘｇ、４℃で５分間遠心分離した。製造業者のインストラクション（ＵＳＣＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）に従い、酵素結合免疫吸着測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使って、上清中のＳＥＭＡ３Ａレベルを定量化した。
ウェスタンブロットによるＳＥＭＡ３Ａタンパク質レベルの評価。標準的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ技術により、ＳＥＭＡ３Ａの存在に関し、ＰＤＲおよび対照患者由来の同体積の硝子体液（２０ｕＬ）を評価した（Ａｂｃａｍ）。
リアルタイムＰＣＲ分析。ＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いてＲＮＡを単離し、ゲノムＤＮＡの増幅を防ぐためにＤＮアーゼＩで消化した。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使って逆転写を実施し、ＡＢＩ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓリアルタイムＰＣＲ装置でＳｙｂｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ（ＢｉｏＲａｄ）を使って遺伝子発現を解析した。β−アクチンをリファレンス遺伝子として使用した（使用したオリゴヌクレオチド配列の詳細に関しては、実施例１０の表２を参照されたい）。
免疫組織化学。汎網膜脈管構造を視覚化するために、フラットマウント網膜を、ＰＢＳ中の１ｍＭのＣａＣｌ２中のローダミン標識Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ）Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ Ｌｅｃｔｉｎ Ｉ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使って網膜脈管構造染色用として染色し、さらに、抗ラットニューロピリン−１抗体（ヤギＩｇＧ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＩＢＡ１（ウサギポリクローナル；Ｗａｋｏ）を使って染色した。
腹膜マクロファージの初代培養。成体ＷＴまたはＬｙｚＭｃｒｅ／ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌマウスを酸素２Ｌ／分中の２％イソフルランで麻酔し、その後、頸部脱臼により安楽死させた。その後、マウスの腹部皮膚の小切開を行った。皮膚をマウスのそれぞれのサイズに引っ張り、腹膜腔を５ｍｌのＰＢＳ＋３％ＦＢＳで２分間洗浄した。その後、採取した細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培地（ＤＭＥＭ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳおよび１％ストレプトマイシン／ペニシリン）中に再懸濁し、平板培養した。５％のＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間の培養後、培地を交換し、同じ条件中で細胞をさらに２４時間培養した後、サイトカインまたはトランスウェル遊走アッセイに使用した。
トランスウェル遊走アッセイ。８μｍのポアインサートを備えた２４ウエルプレート中で遊走アッセイを行った。２００μｌの培地（ＤＭＥＭ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳおよび１％ストレプトマイシン／ペニシリン）中に再懸濁した初代腹膜マクロファージ（５ｘ１０５細胞）を上段チャンバーに添加した。遊走性因子：ＭＣＰ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＳＥＭＡ３Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびＶＥＧＦ１６５（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有または非含有の８００μｌの培地を下段チャンバーに添加した。５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で、細胞をインサート膜を通して一晩遊走させた。いくつかの実験では、細胞を最初に、Ｙ−２７６３２（Ｓｉｇｍａ）：選択的ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ結合コイルドコイル形成タンパク質セリン／トレオニンキナーゼ）阻害剤（１００μｇ／ｍｌ）を使って、３７℃で１時間前処理した。その後、インサートをＰＢＳで洗浄し、インサート膜の上面から非遊走性細胞を綿棒で拭き取った。次いで、遊走細胞を有する膜を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で２０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、スライドにマウントした。細胞をＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を含む封入剤を用いて染色した。その後、各膜９個の無作為視野を倒立蛍光顕微鏡を用いて２０ｘの倍率で撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて細胞を計数した。
脈絡膜外植片および毛細血管の新芽形成アッセイ。エクスビボ脈絡膜層外植片および毛細血管新芽形成の定量化を前述の通り行った（５６）。簡単に説明すると、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１＋／＋およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス（各条件ｎ＝６）由来の脈絡膜層を眼の摘出直後に切開した。分割した脈絡膜層を２４ウエル組織培養皿に播種し、マトリゲル（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でカバーした後、試料をＥＧＭ（商標）−２培地、ＰＢＳを入れたリポソーム（リポソーム−ＰＢＳ）を含むＥＧＭ−２培地、またはジクロロメチレンジホスホン酸二ナトリウム塩を入れたリポソーム（リポソーム−クロドロン酸）（Ｓｉｇｍａ）を含むＥＧＭ（商標）−２培地で処理した。リポソームのパッケージングは、（５７）に従って行った。１２時間後、パッセンジャー化合物を含むリポソームをウエルから取り出し、続けてＰＢＳで洗浄した。（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１＋／＋またはＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスの）初代腹膜マクロファージ培養由来のマクロファージを脈絡膜外植片培養液に加え、マクロファージの毛細血管新芽形成に与える影響を調べた。
可溶性組換えＮＲＰ１。ＯＩＲに晒された野性型マウスに、Ｐ１２で、プラスミド（２９）またはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ由来のｒｍＮＲＰ１トラップ−１（図１９Ｃおよび２０Ｒ、配列番号２５）を硝子体内に注射した。
使用した組換えタンパク質。組換えマウスＣＣＬ２／ＪＥ／ＭＣＰ−１（大腸菌由来）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、インビトロで使用した濃度：１００ｎｇ／ｍｌ。組換えヒトＳＥＭＡ３Ａ Ｆｃキメラ（マウス骨髄腫細胞株、ＮＳ０由来）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、インビトロで使用した濃度：１００ｎｇ／ｍｌ。組換えヒトＶＥＧＦ１６５（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、インビトロで使用した濃度：５０ｎｇ／ｍｌ。
統計解析。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．で表される。異なる群を比較するために、適切な場合には、スチューデントのＴ検定およびＡＮＯＶＡを用いた。Ｐ＜０．０５を統計的に異なると見なした。ＥＬＩＳＡに対しては、ノンパラメトリックマン・ホイットニー検定を使って統計分析を行った（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）。
試験承認：ヒト試料。我々は、Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ−Ｒｏｓｅｍｏｎｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＨＭＲ）倫理委員会（Ｒｅｆ．ＣＥＲ：１００５９）によるヒト臨床的プロトコルおよびインフォームドコンセントの承認、ならびにＴ１ＤＭまたはＴ２ＤＭ罹患患者からの局所的コア硝子体生検標本を得るための患者募集の承認を得た。Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ−Ｒｏｓｅｍｏｎｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌの眼科の変更可能な医院内の簡単な処置ルームにおける外来患者処置として全体の処置を行った。全装置は開放され、無菌状態で取り扱われる。試験はヘルシンキ宣言の主張に従う。
試験承認：動物。すべての研究は、視覚と眼科学研究協会会議（ＡＲＶＯ）の眼科視覚研究における動物使用に関する記載に従って実施し、カナダ動物管理協会により規定されたガイドラインに従ってモントリオール大学動物保護委員会による承認を受けた。Ｃ５７Ｂｌ／６野生型（ＷＴ）マウスをＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ＬｙｚＭ−Ｃｒｅ（Ｌｙｚ２ｔｍ１（ｃｒｅ）Ｉｆｏ／Ｊ；ｎｏ．００４７８１）およびニューロピリン１ ｆｌｏｘｅｄマウス（Ｎｒｐ１ｔｍ２Ｄｄｇ／Ｊ；ｎｏ．００５２４７）を、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。
実施例２
ＮＲＰ１が血管傷害に続いて動員される単核貪食細胞（ＭＰ）集団を特定する
ミクログリアまたはマクロファージなどのＭＰ（単核貪食細胞）が増殖網膜症に関連する血管病変形成に加わるかどうかを判定するために、マウス全網膜に対し最初にＦＡＣＳ分析を行い、酸素誘導網膜症の進展全体（ＯＩＲ、図１Ａ、Ｐ７〜Ｐ１２（生後７〜１２日）に７５％酸素下で血管喪失を誘導し、Ｐ１７まで室内気下で最大網膜前血管新生を得る（２６、３３））（図１Ｂ、Ｅ、Ｈ）にわたるマクロファージ／ミクログリア蓄積の動力学を明らかにした。結果から、ＯＩＲ中の解析した全時点で、Ｐ１０（Ｐ＝０．０００４）（図１Ｃ）での血管喪失期中の３６％の増加、Ｐ１４での新生血管期中の６３％の上昇（Ｐ＜０．０００１）（図１Ｆ）およびＰ１７での最大血管新生中の１７２％の急増（Ｐ＝０．０００６）（図１Ｉ）を含む著しく高い数の網膜マクロファージ／ミクログリア細胞（Ｇｒ−１−、Ｆ４／８０＋、ＣＤ１１ｂ＋細胞、データは示さず）が明らかになった。
重要なのは、それぞれの調査時点で、我々は、ＯＩＲ中にＮＲＰ１陽性ＭＰの比例的増大、すなわち、Ｐ１０での３７％の上昇（Ｐ＝０．０２４０）（図１Ｄ）、Ｐ１４での６１％の上昇（Ｐ＝０．０１９６）（図１Ｇ）およびＰ＝１７での１５５％の上昇（Ｐ＝０．００５８）（図１Ｊ）を観察し、これは、疾患の進行中に、このＮＲＰ１陽性ＭＰの亜集団が神経網膜へ動員されたことを示唆していることである。全てのＯＩＲ実験に関し、十分に正常代謝（３５）であることを確認するためにマウスの仔の体重を記録した（データは示さず）。
網膜症におけるＭＰ常在性ＮＲＰ１の役割を確定するために、Ｎｒｐ１ ｆｌｏｘｅｄマウスをＬｙｓＭ−Ｃｒｅマウスと交雑させて（３６）ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌ子孫を得ることにより、骨髄特異的ＮＲＰ１ノックアウトを生成した。得られたマウスは、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１＋／＋同腹仔対照に比べて、網膜ＭＰ中のＮＲＰ１発現の約８０％の減少を示した（Ｐ＝０．０００４）（図１Ｋ）。注目すべきことに、マウスは、Ｃｒｂ１遺伝子のｒｄ８変異に対する試験結果は陰性であった（３７）。ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスは、同腹仔と比較した場合、実験の全期間（Ｐ１〜Ｐ１７）を通して、体重、サイズ、またはオープンフィールド活性の差異は何ら認められず（データは示さず）、類似の数の常在性網膜ミクログリアが存在した（データは示さず）。注目すべきことは、Ｐ１０およびＰ１４のＯＩＲ（図１Ｌ〜Ｏ）で、骨髄細胞上のＮＲＰ１の欠失がマクロファージ／ミクログリアの侵入を完全に抑止し、虚血性網膜傷害の初期段階の間のＭＰ走化性におけるこの受容体の重要な役割を示していることである。Ｐ１７で、最大病理学的血管新生後、ＮＲＰ１にほとんど関係なく、ＭＰ浸潤が発生する（図１Ｐ、ＱおよびＲ）。潜在的ミクログリア固有の特性に一致して、上記で特定されたＮＲＰ１発現Ｇｒ１−／ＣＤ１１ｂ＋／Ｆ４／８０＋細胞は、高レベルのＣＸ３ＣＲ１および中／低レベルのＣＤ４５を発現する（図１Ｓ、データは示さず）。予想通り、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌ網膜中で、ＣＤ４５ｌｏｗ／ＣＸ３ＸＲ１ ｈｉｇｈ ＭＰは、ＮＲＰ１を欠いている（図１Ｔ）。
実施例３
ＮＲＰ１＋骨髄細胞は網膜中で病理学的血管新生部位に局在化する
ＯＩＲ中のＮＲＰ１＋マクロファージ／ミクログリアの顕著な流入を考慮して、疾患の進行中のこれらの細胞の局在化を次に測定した。網膜フラットマウントへの免疫蛍光法により、ＮＲＰ１陽性マクロファージ／ミクログリア（ＩＢＡ１およびＮＲＰ１で同時標識）は、ＯＩＲのＰ１４での発生期病理学的タフト（図２Ａ〜Ｃ）ならびにＯＩＲのＰ１７での成熟タフト（図２Ｄ〜Ｆ）と完全に結合することが明らかになった。図２Ｂおよび２Ｅ白色矢印は、網膜前タフトと結合したＮＲＰ１陽性ＭＰを指す。以前に報告したように（２１）、ＮＲＰ１はまた、新生血管タフトの内皮上の内皮細胞にも発現した。図１に示すデータと一致して、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスは、より小さい数のマクロファージ／ミクログリア、およびそれほど多くない血管新生を有した（全体の定量化については下記を参照されたい）（図２Ｇ〜Ｋ）。
実施例４
ＳＥＭＡ３Ａは活動性増殖糖尿病網膜症に罹患している患者の硝子体中で上昇している
我々の知見と、網膜症でのＭＰ走化性におけるＮＲＰ１の必須の役割との臨床的関連性を確かめるために、活動性ＰＤＲに罹患している患者の硝子体の内部のＳＥＭＡ３Ａの濃度をじかに決定した。１７個の無希釈硝子体試料をＰＤＲに罹患している患者から、および１７個を非血管病変を有する対照患者から採取した。患者の詳細特徴は表１（実施例１）に含まれている。対照患者（２０）は、非血管病変を呈し、線維性組織および斑状隆起（図３Ｃ）に続発する脈管構造への牽引張力（図３Ａ、Ｂ（白色矢印））などの糖尿病に関連しない網膜損傷の徴候を示す。対照的に、ＰＤＲ患者由来の全ての網膜は、乳頭（図３Ｄ）または網膜前血管新生（図３Ｆ）の徴候を示し、高度に透過性微小血管（蛍光染料の漏出）（図３Ｄ、Ｇ挿入図）、毛細血管瘤（図３Ｄ〜Ｇ）および繊維状瘢痕組織を有し、進行した網膜症を示す（図３Ｇ）。さらに、患者は、血管外漏出液の局所的合体による嚢胞形成（白色矢頭）を含む、損なわれた血管障壁機能が原因の黄斑浮腫のいくつかの証拠を示す（図３Ｈ）。
ＰＤＲにおける役割と一致して、ＳＥＭＡ３ＡのＥＬＩＳＡベース検出により、対照患者由来の硝子体に比べて、ＰＤＲ患者の硝子体液中の５倍高い濃度のタンパク質が明らかになった（Ｐ＝０．０１３２）（図３Ｉ）。結果は、ＰＤＲの患者中でＳＥＭＡ３Ａ（１２５および９５ｋＤａアイソフォーム）（３８、３９）が増加している同体積の硝子体に対するウェスタンブロット分析により確証された（図３Ｊ）。したがって、硝子体中のＳＥＭＡ３Ａの発現上昇は、糖尿病性眼病変において誘導される。
実施例５
ＮＲＰ１のリガンドは、ＯＩＲ中に、網膜神経節細胞層中で誘導される
増殖網膜症での２つの主要なＮＲＰ１リガンド発現の正確な動力学的プロファイルを得るために、ＯＩＲマウスモデルにおけるＳＥＭＡ３ＡおよびＶＥＧＦメッセージのレベルを測定した。全網膜に対するリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）は、ＳＥＭＡ３Ａが、Ｐ１０での高酸素圧（血管退行性）期およびＰ１２〜Ｐ１７での虚血／新生血管段階の両方の間に、ＯＩＲにおいて確実に誘導されたことを明らかにした（図４Ａ）。観察された誘導は、野性型およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌ網膜の両方で発生した。逆に、予測したように、ＶＥＧＦ転写物は、Ｐ１２〜Ｐ１７のＯＩＲの虚血性期においてのみ上昇した（図４Ｂ）。重要なのは、野性型網膜に比べて、ＶＥＧＦのＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌにおける誘導が著しく少く、Ｐ１２でわずかに増加し（Ｐ＝０．０４５１）、Ｐ１４で野性型ＯＩＲに比べて約５５％低く（Ｐ＝０．０００３）（図４Ｂ）、これは、より健康な網膜であることを示すことである。
次に、無血管ゾーン中の網膜層に対しレーザー・キャプチャー・マイクロダイセクション（ＬＣＭ）、続けて、ＲＴ−ｑＰＣＲを行い、ＯＩＲにおけるＳＥＭＡ３ＡおよびＶＥＧＦメッセージの発生源を特定した（図４Ｃ）。ＳＥＭＡ３ＡおよびＶＥＧＦの両方が神経節細胞層中で確実に誘導され、ＶＥＧＦは内顆粒層中でも増加している（図４Ｄ、Ｅ）。したがって、両リガンドの発生源は、網膜ＭＰの局在化（図２）と位置的に一致している。
実施例６
単核貪食細胞（ＭＰ）は血管傷害後、網膜中で増殖しない
ＮＲＰ１＋ ＭＰの顕著な上昇が体循環からの流入によるのか、または網膜内のＭＰ増殖の増加によるのかを明らかにするために、これらの細胞の局所的網膜増殖を調査した。マウスに、Ｐ１３でＢｒｄＵを全身注入し（屠殺の２４時間前）、網膜（図５Ａ）および脾臓（図５Ｂ）のＦＡＣＳ分析を行った。網膜内で、Ｇｒ１−／ＣＤ１１ｂ＋／Ｆ４／８０＋ ＭＰは、顕著な増殖を示さなかった（Ｐ＝０．４７０８）。脾臓中では、かなり多い増殖が観察された。正常酸素圧とＯＩＲとの間では大きな差異は観察されなかった（図５Ｃ）。網膜中でのＭＰの増殖の欠除は、網膜症の間の顕著な付着物ＮＲＰ１＋ ＭＰが、全身起原を有することを示唆している。
実施例７
ＳＥＭＡ３ＡおよびＶＥＧＦ１６５はＮＲＰ１を介してＭＰを動員する
骨髄細胞の血管病変の部位への動員（図１）のためのＮＲＰ１の要件ならびに網膜症におけるＮＲＰ１の主なリガンドの誘導（図３〜４）およびこれらの細胞の考えられる全身起原（図５）を考慮して、ＭＰ走化性を誘発するこれらのキューの性質を明確にした。初代マクロファージ培養物を野性型マウスから単離し、トランスウェルボイデンチェンバ遊走アッセイに供した。ＳＥＭＡ３Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）（ｐ＜０．０００１）およびＶＥＧＦ１６５（５０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐ＝０．００２７）の両方は、陽性対照ＭＣＰ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）（ｐ＜０．０００１）と類似の程度にマクロファージ走化性を誘発した（図６Ａ、Ｂ）。これらのデータを、Ｙ−２７６３２：選択的阻害剤ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ結合コイルドコイル形成タンパク質セリン／トレオニンキナーゼ）がそれらの走化特性を消滅させることを示して検証した。ＲＯＣＫは、ＮＲＰ１シグナル伝達の下流にあり（４０）、単球遊走を媒介することが知られている（４１）。ＶＥＧＦ遊走を、部分的に減少させ、それほど著しく減少させてはいないことは、最近報告されたＶＥＧＦＲ１などの別の受容体からの寄与を示唆している（３３）。ＳＥＭＡ３ＡおよびＶＥＧＦ媒介走化性におけるＮＲＰ１に対する役割と一致して、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス由来のマクロファージはＭＣＰ−１に特異的に応答し、ＳＥＭＡ３ＡまたはＶＥＧＦによっては動員されない（図６Ｃ）。
実施例８
ＮＲＰ１＋マクロファージは、エクスビボ毛細血管新芽形成を増強する
ＮＲＰ１発現マクロファージの毛細血管の血管新生に対する影響を調査するために、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１＋／＋マウスまたはＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス由来の脈絡膜層組織を単離し、マトリゲル（商標）中で増殖させて、毛細血管の新芽形成を評価した。ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス由来の脈絡膜層は、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１＋／＋マウスと比較して、約２０％少ない微小血管を発芽する（Ｐ＝０．０１８）（図７Ａ）。毛細血管の新芽形成の促進におけるＮＲＰ１＋マクロファージの役割を調査するために、クロドロン酸リポソームを使って、内在性マクロファージを単離脈絡膜層組織から除去した。ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌおよびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１＋／＋マウスの両方由来の外植片では、リポソーム含有ＰＢＳ（すなわち、ビークル対照）は、血管の新芽形成に対し影響を与えなかったが、クロドロン酸リポソームは、毛細血管の新芽形成を約６０％低減させた（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１＋／＋脈絡膜層ではＰ＝０．０１１４、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌ脈絡膜層ではＰ＝０．０００７）（図７Ｂ〜Ｅ）。ＮＲＰ１＋マクロファージが血管新生を促進する性質を有するかどうかを検証するために、腹膜マクロファージをＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１＋／＋またはＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスから抽出し、前もってクロドロン酸リポソームで処理し、洗浄した脈絡膜層外植片培養液中に導入した。ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１＋／＋マクロファージは、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウス由来のマクロファージに比べて、毛細血管の新芽形成を５０〜１００％確実に増強し（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１＋／＋脈絡膜層ではＰ＝０．００６８、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌ脈絡膜層ではＰ＝０．０４９１）（図７ＤおよびＥ）、脈絡膜外植片の遺伝子型には無関係であった。
実施例９
骨髄常在性ＮＲＰ１の欠損は、網膜症における血管変性および病理学的血管新生を減らす
ＯＩＲの初期段階中のＭＰ浸潤におけるＮＲＰ１細胞内シグナル伝達に必須の役割（図１）を考慮して、ＮＲＰ１の骨髄細胞特異的除去の疾患の進行に与える影響を次に明確にした。Ｐ１２で、７５％Ｏ２から出す際に、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスは、野性型（Ｐ＝０．００１１）およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１＋ｌ＋（Ｐ＜０．０００１）対照に比べて、著しく低レベルの網膜血管喪失を示した（８Ａ、Ｂ）。これは、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスの網膜中に存在する、より低いレベルのＩＬ−１βが原因である可能性がある（データは示さず）。重要なのは、Ｐ１７で、病理学的血管新生ピークの場合（２６）、骨髄常在性ＮＲＰ１の欠失が無血管領域を大きく低減させたことである（野性型と比較した場合に約３５％（Ｐ＜０．０００１）およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１＋ｌ＋マウスと比較した場合に約３０％（Ｐ＝０．０００８））（図８Ｃ、Ｄ）。さらには、虚血性網膜症と関連する有害な網膜前血管新生の大きな低減が観察された（野性型と比較した場合に約３６％（Ｐ＝０．０００８）およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐ１＋ｌ＋マウスと比較した場合に約３４％（Ｐ＝０．００１３））（図８Ｅ、Ｆ）。
実施例１０
可溶性ＳＥＭＡ３Ａ中和トラップの調製
ＳＥＭＡ３Ａを阻害／中和するための高親和性トラップを生成した。これらのトラップは、ニューロピリン１（ＮＲＰ１）から誘導し、任意選択で、６ＸヒスチジンタグまたはＦＣタンパク質と結合した（図１９、２０および２７、および表１を参照）。ＳＥＭＡ３Ａ結合を維持することができる全ＮＲＰ１細胞外ドメインまたは機能性変異体を含む種々の変異体を生成した。ｂ１ドメイン（これは、ＶＥＧＦに結合する）を含み、中和ＶＥＧＦ１６５変異を含むトラップを生成した。トラップは高度に発現し、形質転換ヒト細胞中で分泌されることが示された。簡単精製および処方プロトコルを開発し、後ほど行うＳＡＲおよびインビボ効力調査用のトラップ試料を産生した。
方法
細胞培養および材料。ヒトニューロピリン１（ジェンバンク（商標）受入番号ＮＭ＿００３８７３、配列番号６６）をＯｒｉｇｅｎｅ Ｉｎｃ．から取得した。Ｏｒｉｇｅｎクローンは、アミノ酸１４０に保存的変異を含み、これはロイシンをイソロイシンと交換する。２９３Ｔ（ＡＴＣＣ）細胞を、１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地中で増殖させた。ｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ１ベクターをＩｎｖｉｖｏＧｅｎ Ｉｎｃ．から購入した。
クローニング。ニューロピリン−１の細胞外ドメイン（残基１〜８５６）、またはその一部を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使ってＯｒｉｇｅｎｅクローンＲＣ２１７０３５からＰＣＲで増幅し、ｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ１のＥｃｏＲ１−ＢｇｌＩＩにヒトＦＣ−１コード配列とインフレームでクローニングした。ＴＥＶプロテアーゼ切断部位とそれに続く６Ｘ Ｈｉｓ残基および対応するＦＣ構築物のＦＣコード部分の上流に停止コドンをコードする配列を挿入することにより、可溶性タイプのトラップをコードする構築物を生成した。追加の欠失（ｂ１、ｂ１ｂ２）またはＶＥＧＦ１６５結合変異（例えば、Ｙ２９７Ａ）を、Ｑ５部位特異的変異誘発キット（ＮＥＢ）を使って導入した。全構築物配列をＳａｎｇｅｒシーケンシング（Ｇｅｎｏｍｅ Ｑｕｅｂｅｃ）により実証した。組み立てたトラップのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図２０及び２７に示す。
ヒト細胞中のトラップの発現の評価。マウスおよびヒトトラップをコードする構築物を２９３Ｔ細胞に遺伝子導入した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で形質導入後、細胞を４８時間増殖した。形質導入の４８時間後、細胞ライセートを２９３Ｔ細胞から調製した。細胞をＰＢＳで十分に洗浄し、標準的量のプロテアーゼ阻害剤（ＡＥＢＳＦ、ＴＰＣＫ、ＴＬＣＫ、アプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチンおよびＥ６４、Ｓｉｇｍａ）を補充した氷冷リシスバッファー（５０ｍＭヘペス ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％トリトンＸ−１００および１０％グリセロール）で溶解した。細胞ライセートを微量遠心分離（１２０００ｇ、２０分）で清澄化した。ライセート濃度は、標準的マイクロＢＣＡ（Ｓｉｇｍａ）により測定した。等量のタンパク質を５〜２０％ＰＡＧＥ−ＳＤＳ勾配ゲルにロードし、ＰＶＤＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写した。遺伝子導入細胞からの清澄化した培養上清を、ＦＣまたは６ｘヒスチジンタグ用のプロテインＡセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）またはＴａｌｏｎレジン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と共にインキュベートした。レジンをＰＢＳで洗浄し、２Ｘ ＰＡＧＥ−ＳＤＳ試料緩衝液に希釈後、ゲル分離および転写を行った。イムノブロッティングに使用した抗体は、抗ヒトニューロピリン−１（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、マウスモノクローナル抗６Ｘ−ＨＩＳ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）およびレポーターＨＲＰ結合抗ヒト、マウスおよびウサギＩｇＧ（ＢｉｏＲａｄ）であった。全抗体を１／２０００の希釈で使用した。膜をＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共にインキュベーション後、化学発光シグナルをＦｕｊｉイメージングシステムを使って取得した。
トラップ発現および精製。２９３−Ｔ細胞に、種々のトラップをコードしたプラスミドを、ポリエチルアミン（ＰＥＩ）またはリン酸カルシウム沈殿による標準的遺伝子導入法により遺伝子導入した。翌日、細胞を無血清培地で２回洗浄し、無血清完全培地（Ｆｒｅｅ ｓｔｙｌｅ２９３培地、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。無血清培地中で６０〜７２時間の増殖後、培養上清を採取し、スイングバケットでの遠心分離により壊死細胞片を清澄化した（２０００ＲＰＭ、２０分）。プロテインＡまたはＧセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通過させ、続けて、ＰＢＳで十分に洗浄し、０．１Ｍのグリシン（ｐＨ３．０）で溶出することにより、ＦＣトラップを遺伝子導入２９３Ｔ細胞の培養上清から精製した。１／１０体積の１Ｍ トリス（ｐＨ８）および１／１０体積の１０Ｘ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）の添加により、溶出画分を直ちに中和した。Ｔａｌｏｎアガロース（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）上を通過させ、続けて、ＰＢＳで十分に洗浄し、段階的にイミダゾール溶出（通常、１０〜１５０ｕＭの範囲）することにより、可溶性６Ｘヒスチジンタグトラップを遺伝子導入２９３Ｔ細胞の培養上清から精製した。トラップの精製画分の試料を、５〜１５％または５〜２０％勾配ＰＡＧＥ−ＳＤＳゲルで分析した。ゲルをＳａｆｅｌｙ Ｂｌｕｅ染色キット（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を使って染色した。
インビボ注入用の精製トラップの無菌処方。４０ｍｌの培養上清からの精製溶出画分をプールし、ＰＢＳで１０ｍｌの全体積に希釈した。希釈トラップタンパク質を０．２ｕＭの低タンパク質結合フィルタ（Ｐｒｏｇｅｎｅ）を通してろ過することで滅菌した。タンパク質溶液を濃縮し、無菌のＰＥＳ濃縮装置（Ｐｉｅｒｃｅ、名目ＭＷＣＯ ３０ＫＤ）によりＰＢＳで緩衝液交換した。無菌濃縮トラップ試料（約３０〜５０ｕｌ）を、上述のようにＰＡＧＥ−ＳＤＳで分析および染色した。
実施例１１
ＳＥＭＡ３ＡおよびＶＥＧＦに対するトラップの親和性
ＡＰ−ＶＥＧＦ１６５の産生。ヒトＶＥＧＦ１６５変異体１（ＮＭ＿００１０２５３６６）のコード配列を、ｐＡＰｔａｇ５ベクター（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ）に、アルカリフォスファターゼドメインとインフレームで、サブクローニングした（ＡＰ−ＶＥＧＦ１６５）。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）遺伝子導入法を使って、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＡＰ−ＶＥＧＦ１６５構築物を遺伝子導入した。一晩の形質導入段階後、無血清培地（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で細胞をさらに６０時間培養した。細胞培地を集め、ＰＥＳ装置（Ｐｉｅｒｃｅ）で濃縮した。濃縮したＡＰ−ＶＥＧＦ１６５リガンドをＰＡＧＥ−ＳＤＳで分析し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ｓａｆｅ ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使って定量化した。
Ｓｅｍａ３ＡおよびＡＰ−ＶＥＧＦ１６５結合アッセイ。ＳＥＭＡ３ＡまたはＶＥＧＦ１６５に対する結合ＫＤの決定用の飽和曲線を下記のようにして取得した。高タンパク質結合９６ウエルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）ウエルをＰＢＳ中希釈精製トラップでコートし、その後、結合バッファー（２％カゼインおよび０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳ）でブロッキングした。ＳＥＭＡ３Ａ−ＦＣ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＡＰ−ＶＥＧＦ１６５リガンドを広範囲の濃度にわたり結合バッファーで希釈し、ウエルに加えた。一晩のインキュベーション後、ウエルを０．０５％のツイーンを含むＰＢＳで洗浄した。結合ＳＥＭＡ３ａ−ＦＣをＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ（Ｂｉｏｒａｄ）およびＥＣＬ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を使って検出した。あるいは、結合ＡＰ−ＶＥＧＦ１６５をＣＰＤスター基質（Ｒｏｃｈｅ）で検出した。化学発光シグナルをＴＥＣＡＮリーダーで取得した。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅを使って、解離定数（ＫＤ）を非線形曲線フィッティングにより決定した。
本発明のＳＥＭＡ３ＡおよびＶＥＧＦに対するトラップの相対的親和性を評価した。トラップを実施例１０に記載のように調製した。試験したトラップの模式図も図１９に示す。
本発明の可溶性ＮＲＰ１トラップは、ＶＥＧＦよりＳＥＭＡ３Ａに対し、より効率的に結合する。このようなＳＥＭＡ３Ａに対する選択性は、意外であった。理由は、ＳＥＭＡ３ＡおよびＶＥＧＦは通常、ＮＲＰ１に対し、同じ全体的親和性を有すると考えられているためである。ＳＥＭＡ３Ａに対し増加した親和性は、ＳＥＭＡ３Ａ阻害がＶＥＧＦの阻害よりも好ましく、ＶＥＧＦ阻害に関連する副作用を減らし得る条件下では、有利であろう。
実施例１２
硝子体内への可溶性ＮＲＰ１の治療投与が、網膜症におけるＭＰ浸潤および病理学的血管新生を減らす
上記知見の技術移転の可能性を明確にするために、可溶性組換えマウス（ｒｍ）ＮＲＰ１ ｍＴｒａｐ１ポリペプチド（配列番号２５のドメインａ１、ａ２、ｂ１、ｂ２およびｃを含む図１９Ｃおよび２０Ｒ）をＯＩＲ誘導ＮＲＰ１リガンドを捕捉するためのトラップとして、次に採用した。Ｐ１２でのｒｍＮＲＰ１の単回の硝子体内注射により、Ｐ１４でのＯＩＲに晒された網膜中に存在するミクログリアの数の３０％の低減（Ｐ＝０．０２８２）がもたらされる（図９Ａ）。この知見は、可溶性ＮＲＰ１（１μｌの５０μｇ／ｍｌ）のミクログリア動員を損なう効力を立証する。可溶性ＮＲＰ１の硝子体内投与が、ビークル注射対照に比べて、病理学的網膜前血管新生の約４０％の顕著な減少を誘発した（Ｐ＝０．００２５）（図９Ｂ、Ｃ）。上記の結果は共に、これらのデータが、ＮＲＰ１のリガンドの中和が網膜症における有害な血管新生の低減に効果的な戦略であることを示唆している。
実施例１３
敗血症モデル−実施例１４〜１９に対する材料と方法
敗血症マウスモデル。研究は、カナダ動物管理協会による研究における動物使用に関するカナダのガイドラインによる規制に従って行われた。ＬＰＳ注射を６〜８週齡のＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内（ｉ．ｐ）に行った。
生存アッセイ。生存データの生成のために、２５ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを、マウス重量に調節されたほぼ１００ｕｌの体積で、腹腔内単回注射することによりマウスを刺激した。その後、カナダ動物管理協会により定められた危険限界点に達するまで、マウスをモニターした。
炎症促進性サイトカインの測定。炎症促進性サイトカインの評価のために、マウスを１５ｍｇ／ｋｇのＬＰＳの単回腹腔内注射により、ｉ．ｐ刺激し、２４時間までの種々の時点で屠殺した。組織（脳、肝臓、腎臓）を取り出し、ＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いてｍＲＮＡ単離し、ゲノムＤＮＡの増幅を防ぐためにＤＮアーゼＩで消化した。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を使って逆転写を行い、ＡＢＩ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓリアルタイムＰＣＲ装置でＳｙｂｒ Ｇｒｅｅｎを使って遺伝子発現を解析した。βアクチンをリファレンス遺伝子として使用した。
初代腹膜マクロファージ培養。成体ＷＴまたはＬｙｚＭｃｒｅ／ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌマウスを酸素２Ｌ／分中の２％イソフルランで麻酔し、その後、頸部脱臼により安楽死させた。その後、マウスの腹部皮膚の小切開を行った。皮膚をマウスのそれぞれのサイズに引っ張り、腹膜腔を５ｍｌのＰＢＳ＋３％ＦＢＳで２分間洗浄した。その後、採取した細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培地（ＤＭＥＭ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳおよび１％ストレプトマイシン／ペニシリン）中に再懸濁し、平板培養した。５％のＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間の培養後、培地を交換した。
細胞数測定ビーズアレイ（ＣＢＡ）。製造業者（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のガイドラインに従ってＣＢＡを行った。マクロファージを、野生型またはＬｙｚＭｃｒｅ／ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌマウスから単離し、ＳＥＭＡ３Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはビークルに１２時間晒し、ＣＢＡにより処理した。
トラップおよび抗ＶＥＧＦ抗体投与。マウスの敗血症実験モデルをヒトまたはマウスＮＲＰ１トラップ−１（図１９Ｂ、Ｃおよび２０Ａ、２０Ｒ、配列番号２５または配列番号８３）またはＶＥＧＦ中和抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ−４９３−ＮＡ）で処置した。
実験設計：群当たり３匹のマウス。群：１−ビークル、２−ＬＰＳ、および３−ＬＰＳ＋ＮＲＰ１トラップ；１−ビークル：ＮａＣｌ、２−ＬＰＳ：１５ｍｇ／ｋｇ、および３−ＬＰＳ＋ＮＲＰ１−トラップ：マウスは、ＬＰＳ注射の数分後、４ｕｇ（１００ｕＬの体積中の）の組換えマウスＮＲＰ１トラップ（０．２ｍｇ／ｋｇに相当）の単回静注を受けた。
透過性試験。透過性アッセイのために、１５ｍｇ／ｋｇのＬＰＳの単回腹腔内の注射によりマウスをｉ．ｐ刺激し、２４時間後、組織サンプリングのために屠殺した。組織中のＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅ（ＥＢ）血管外漏出を定量化することにより、肝臓、腎臓、および脳血管透過性の変化を評価した。２４時間後、ＥＢの１０ｍｇ／ｍｌの溶液を静脈内に注入した（５５ｍｇ／ｋｇ）。２時間後、マウスを屠殺し、心臓を通してＰＢＳで潅流した。その後、組織を取り出し、室温で２４時間乾燥させ、乾燥重量を測定した。ＥＢをフォルムアミド中、６５℃で一晩抽出した。その後、分光光度計を用いて、６２０ｎｍおよび７４０ｎｍでＥＢを測定した。
リアルタイムＰＣＲ分析。ＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いてＲＮＡを単離し、ゲノムＤＮＡの増幅を防ぐためにＤＮアーゼＩで消化した。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を使って逆転写を実施し（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＡＢＩ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓリアルタイムＰＣＲ装置でＳｙｂｒＧｒｅｅｎ（ＢｉｏＲａｄ）を使って遺伝子発現を解析した。βアクチンをリファレンス遺伝子として使用した。使用したオリゴヌクレオチド配列の詳細に関しては、下表３を参照されたい。
実施例１４
セマフォリン３Ａは、敗血性ショック中にいくつかの器官で発現上昇している
ＯＩＲにおけるＳＥＭＡ３Ａ、ＮＲＰ１および自然免疫応答の間の関連（上記実施例２〜９で示すように）を考慮して、全身性炎症におけるＮＲＰ１依存性細胞応答の意味を次に評価した。これは、最初、敗血性ショック中のＳＥＭＡ３Ａ発現の動力学を測定することにより調査した。
ＬＰＳを６〜８週齡のＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）に投与（１５ｍｇ／ｋｇ）し、マウスを、ＬＰＳ投与の０、４、８、１２および２４時間後に屠殺し、脳、腎臓、肺および肝臓などの重要な器官を集め、ｍＲＮＡを単離した。ＬＰＳ注射後既に６時間で、全ての解析された器官において、いくつかのレベルのＳＥＭＡ３Ａ ｍＲＮＡが確実に誘導され、２４時間持続した（図１１Ａ〜Ｄ）。同様に、別のＮＲＰ１リガンド、ＶＥＧＦの発現レベルも、敗血性ショックの最初の６時間以内に、腎臓（図１１Ｂ）、肺（図１１Ｃ）および肝臓（図１１Ｄ）において極めて増加した。古典的な炎症促進性サイトカインのＴＮＦ−αおよびＩＬ１−βの増加は、ＬＰＳ投与６時間後に上昇し、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡと同様に減少した（図１２）。したがって、炎症調査した全てのメディエーター中で、ＳＥＭＡ３Ａが長期動力学的プロファイルを有し、敗血症誘導後、少なくとも２４時間にわたり上昇のままでとどまった。このＳＥＭＡ３Ａの特定の発現プロファイルは、その敗血性ショックに対する寄与が、その他のサイトカインに比べて、長く続き得ることを示唆している。
実施例１５
ＳＥＭＡ３Ａは骨髄細胞中でＮＲＰ１を介して炎症促進性サイトカインの分泌を誘導する
単球および骨髄細胞の急性炎症反応に対する寄与および骨髄細胞上のＮＲＰ１の存在を考慮して、炎症性サイトカインの産生におけるＳＥＭＡ３Ａおよび骨髄常在性ＮＲＰ１の寄与を明らかにした。
単離マクロファージをＳＥＭＡ３Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはビークルに暴露し、細胞数測定ビーズアレイ（ＣＢＡ）によりサイトカインの産生を分析した。図１３に示す結果は、ＳＥＭＡ３Ａが、ＩＬ−６（図１３Ａ）およびＴＮＦ−α（図１３Ｂ）などの、敗血性ショックに寄与することが知られている炎症促進性サイトカインの産生／分泌を誘導することができることを示す。特に重要なのは、骨髄細胞中のＮＲＰ１の特異的ノックアウト（ＬｙｚＭ／ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌ）が、ＳＥＭＡ３Ａ誘導ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの産生を抑止したことである。特に、ビークル処置対照ＬｙｚＭ／ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌマクロファージは、野性型対照より少ないＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの産生を示し、骨髄常在性ＮＲＰ１の敗血症誘導炎症における役割を明確にした。
実施例１６
骨髄常在性ＮＲＰ１の欠損は、敗血症における炎症促進性サイトカインのインビボ産生を減らす
骨髄常在性ＮＲＰ１はＩＬ−６およびＴＮＦ−αなどのインビトロでの炎症促進性サイトカインの放出にとって重要であったので、インビボでのその寄与を次に調査した。ＬｙｚＭ／ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌおよび対照野性型マウスにビークルまたはＬＰＳ（１５ｍｇ／ｋｇ）を投与し、脳および肝臓をＬＰＳ注射の６時間後に集めた。ＴＮＦ−α（図１４Ａ、Ｃ）およびＩＬ−１ｂ（図１４Ｂ、Ｄ）レベルのリアルタイムＰＣＲ分析は、ＬｙｚＭ／ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌ中のこれらのサイトカインの比較的大きい低下を示した。これらの結果は、敗血症のインビボ発生に対するＮＲＰ１およびそのリガンドの大きな寄与を明確に示す。
実施例１７
ＮＲＰ１シグナル伝達の阻害が、敗血症誘導バリア機能破壊を防ぐ
しかし、臓器不全の一因となると思われる、重篤な敗血性ショックの病理学的機構の１つは、血液関門（肺の血液と空気、腎臓の血液と尿、肝臓の血液と胆汁、および脳中の体液分子）の損傷である。血液網膜関門の破壊におけるＳＥＭＡ３Ａの役割（４６）および敗血症中のＳＥＭＡ３Ａの発現に関する本件の新規データを考慮して、ヒトＮＲＰ１の細胞外ドメイン由来のトラップによるＳＥＭＡ３Ａの中和の効果を評価した（トラップ−１（ＦＣ含まず）、図１９Ｂ、配列番号８３）。Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ透過性（ＥＢＰ）アッセイを使って、我々は、マウスが４ｕｇのＮＲＰ１由来トラップ（０．２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）で処置された場合、調査した全器官、すなわち、脳（図１５Ａ）、腎臓（図１５Ｂ）および肝臓（図１５Ｃ）において、ＬＰＳ誘導バリア機能破壊の顕著な減少が観察されることを見出した。これらの結果は、可溶性ＮＲＰ１およびその誘導体のトラップが敗血症を阻止するための注目すべき治療薬であることを強く示唆している。
実施例１８
ＮＲＰ１由来トラップは、敗血症から保護する
敗血症中のＮＲＰ１リガンドの中和またはＮＲＰ１阻害の治療効果を明らかにするために、生存調査を行った。高用量のＬＰＳ（２５ｍｇ／ｋｇ）をマウスに投与した。その後、マウスをモニターし、適切な終了点に到達すると、倫理的に屠殺した。第２の群では、マウスに４ｕｇの組換えトラップ−１（ＦＣ含まず）（０．２ｍｇ／ｋｇ、図１９Ｂおよび２０Ａ、配列番号８３）をｉ．ｖ．注射し、続いて、ＬＰＳ腹腔内の注射を行った。対照群では、ＬＰＳ注射後の最初の３０時間以内に、５／５マウス（１００％）が死亡した（図１６Ａ）。逆に、トラップで処置した全てのマウスが、３０時間後でもまだ生存し、大きく改善された６０時間後の生存率（３／５）を示した。したがって、死亡率は、３０時間後の１００％（対照群の）から、６０時間後の４０％（図１６Ａ）まで低下した。さらに、４０％のトラップ処置マウスは、ＬＰＳ注射の８０時間後に生存したままであった。したがって、生存時間は、ＮＲＰ１を通る細胞内シグナル伝達を阻害した場合、６０％の場合で少なくとも２倍、４０％の場合でほぼ３倍であった。
類似の結果は、骨髄細胞中のＮＰＲ１の特異的ノックアウトを含むマウスでも得られた（図１６Ｂ）。骨髄細胞中のＮＲＰ１の非存在は、生存時間を延長し、敗血症誘導死亡率（３／５）を３０時間後で１００％から４０％に減らし（図１６Ｂ）、６０時間後で１００％から４０％に減らした。さらに、４０％のＮＲＰ１ノックアウトマウスは、ＬＰＳ注射の８０時間後に生存したままであった。
まとめると、これらの結果は、敗血症処置におけるＮＲＰ１依存性細胞内シグナル伝達の阻害による治療効果を明らかにしている。
実施例１９
ＮＲＰ１由来トラップは、敗血性ショックにおける炎症性サイトカインの産生を低下させる
ＮＲＰ１−トラップの敗血性ショックにおける生存率に対する治療効果を考慮して、敗血性ショック中の炎症性サイトカインの産生に与えるＮＲＰ１リガンドの中和の影響を、次に明らかにした。野性型マウスに、ｉ）ビークル（ｎ＝３）、ｉｉ）ＬＰＳ（１５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝３）またはｉｉｉ）ＬＰＳおよびＮＲＰ１マウストラップ１（ＦＣ不含、図１９Ｃ、配列番号２５（ＦＣ領域不含））を投与し、ＬＰＳ注射６時間後に脳を採集した。ＮＲＰ１トラップ−１の注射は、ＴＮＦ−α（図１７Ａ）およびＩＬ−６（図１７Ｂ）の産生を顕著に低減させた。同様に、ＮＲＰ１欠損骨髄細胞（ＬｙｚＭ−Ｃｒｅ／Ｎｒｐｆｌ／ｆｌ）を有するマウス（ｎ＝３）は、大幅に少ないＴＮＦ−αおよびＩＬ−６を産生し、この細胞経路の敗血性ショックの進行に対する寄与を明らかにした。
実施例２０
実施例２１に記載の脳虚血／脳卒中モデルの材料と方法
この調査で使用したマウスは、２〜３月齢の雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（２２〜２８ｇ）であった。
ＭＣＡＯモデル。Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ ｅｔ ａｌ．（６６）により記載の腔内縫合技術を使用してＭＣＡＯマウスモデルを機能させた。簡単に説明すると、酸素（１Ｌ／分）中の３％イソフルランを含むチャンバー中でマウスを麻酔し、ブプレノルフィン（皮下に、０．１ｍｇ／ｋｇ体重）で鎮痛化した。顔マスク経由で供給された酸素中の１．５％のイソフルランを使用して、手術中に麻酔を維持した。直腸温を記録し、加温パッドを使って、３７±０．５℃で安定に保持した。頸部の正中切開後、右頸動脈分岐部を露出させ、５−０絹縫合糸を使って総頸動脈（ＣＣＡ）を一時的に閉塞した。右内総頸動脈（ＩＣＡ）および外総頸動脈（ＥＣＡ）の分岐部を分離した。永続的な縫合糸をＥＣＡのまわりで、可能な限り遠位に配置し、わずかに堅く締め付けた別の一時的縫合糸を分岐の遠位のＥＣＡ上に配置した。右ＩＣＡを５−０絹縫合糸で一時的に閉塞し、出血を回避した。その後、ＥＣＡの永続的な縫合糸と一時的縫合糸との間に小孔を形成し、それを通して１２ｍｍ長さの６−０シリコンコート（約９〜１０ｍｍをシリコンでコートした）モノフィラメント縫合糸を導入した。このフィラメントをＥＣＡからＩＣＡの管腔中を、ウィリス動脈輪中の中大脳動脈（ＭＣＡ）の起始部を封鎖するまで前進させた。モノフィラメントをＣＣＡ中に挿入しているが、ＭＣＡまでは前進させないことにより、シャム動物を得た。ＥＣＡ上の縫合糸を堅く結び、モノフィラメントを適切な位置に固定した。ＭＣＡＯ後３０分で、モノフィラメントを完全に取り出し、再灌流を可能とした。ＣＣＡ上の一時的縫合糸を同様に取り出し、血液再循環を可能とした。創傷が閉じた後、１ｍｌの食塩水を皮下に注射し、手術後脱水を回避した。マウスをケージに置き、加温パッド上で１時間保持した。その間に、マウスが完全に麻酔から目覚めると、そのマウスのいくつかの基本的運動障害を調べ（歩行中の回旋および尾を保持中の屈曲；手術の成功の指標）、ＮＲＰ１−トラップ−１（ＦＣ不含）（図１９Ｂ、配列番号８３）を１２５ｕｌのＰＢＳ中０．４ｕｇの用量で尾静脈に投与した（再灌流開始の約１５分後）。対照動物は、ＭＣＡＯ後にビークル（ＰＢＳ）を受けたＮＲＰ１処置動物と同じ方法で手術された。手術後重量減少が通常観察されるので、すりつぶした食物をペトリ皿上に置いて、摂食を促進した。
梗塞体積の測定。ＭＣＡＯ後に２４時間行われた神経学的評価（下記セクション参照）後、酸素（１Ｌ／分）中の３％イソフルランで動物を深く麻酔し、断頭した。脳を直ちに単離し、ドライアイス上の冷却イソペンタン中に移した後、−８０℃で貯蔵した。その後、凍結脳を−２２℃のクライオスタット中で冠状に２０μｍ切片に切断し、１５スライス毎に正に帯電したスライドガラス上にマウントした。脳切片をクレシルバイオレットで１５分間染色した。各切片を撮影した。虚血領域中の梗塞領域を相対的染色欠除に基づいて描写し、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使って測定した。各断面の梗塞領域を、反対側半球の総面積−同側半球の無影響領域、として決定した。
神経学的評価。手術の１時間後、ならびにＭＣＡＯの２４時間後、動物を一連の運動テストに供した。試験およびスコアリングは、以下の通りとした：０、正常；１、尾で動物全身を持ち上げた時に反対側に起こる前肢または後肢の屈曲；２、歩行中の反対側への回旋および尾を保持中のＣ形状横曲げ；４、歩行中の反対側への回旋および尾を保持中の四肢屈曲を伴うＣ形状横曲げ；５、昏睡状態または瀕死。得られたニューロスコアの大きさは、障害の重症度に直接正比例する。
実施例２１
ＮＲＰ１−トラップは、脳虚血および脳卒中から保護する
ＳＥＭＡ３Ａ中和が脳虚血または脳卒中に与える結果を評価するために、成体（８〜１２週齢）マウスを一時的な中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデルとした。実験の詳細は、実施例２０で提供される。簡単に説明すると、ＭＣＡＯの終了後、マウスＮＲＰ１−トラップ（トラップ−１（ＦＣ不含））の１２５ｕｌのＰＢＳ中の０．４ｕｇ（図１９Ｃ、図２０Ｒ、配列番号２５）を尾静脈に投与した（再灌流開始の約１５分後）。ＭＣＡＯにより誘導された脳損傷を可視化するために、冠状大脳切片をクレシルバイオレットで染色した。それぞれの切片上で、未染色領域は、脳の虚血領域に対応する（図１８Ａ）。連続冠状大脳切片のこれらの領域の測定により、ＭＣＡＯの２４時間後に、梗塞ゾーンは、脳が損傷されていないシャム手術動物に比べて、閉塞マウスにおける同側半球の４８％になることが明らかになった。ＮＲＰ１処置は、脳損傷を低減した；同側半球の梗塞体積を８０％低減した（図１８Ｂ、Ｃ）。
身体の四肢屈曲、Ｃ形状横曲げおよび回旋運動の存在の神経学的スコアリングにより神経学的障害を評価した。手術の１時間後に回旋および屈曲挙動を示さなかったＭＣＡＯマウスを以降の調査から除外した（図１８Ｄ）。ＭＣＡＯを受けたマウスの前肢または後肢屈曲、身体のＣ形状横曲げ、回旋運動を、シャム手術動物と比較して観察した。手術後２４時間で評価した場合、ＮＲＰ１処置は、非処置ＭＣＡＯマウスと比べて、虚血性マウスの神経学的スコアを劇的に６０％も改善した（図１８Ｅ）。
まとめると、これらの結果は、ＮＲＰ１経路の阻害が、脳虚血および脳卒中から保護し、脳虚血および脳卒中に関連する神経学的障害を低減することを示している。
実施例２２
糖尿病性網膜症および未熟児網膜症のマウスモデルで、虚血性網膜におけるニューロピリン由来トラップは、血管再生を強化し、病理学的血管新生を防ぐ
酸素誘導された増殖網膜症（ＯＩＲ）のよく確立されたマウスモデル（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４）を使って病理学的血管変性ならびに網膜前血管増殖を調査した。このモデルは、未熟児網膜症（ＲＯＰ）を基準にしており、増殖性（血管新生期）の糖尿病性網膜症およびＲＯＰの代用として、度々使われる。
乳母およびそれらの仔を、Ｐ７〜Ｐ１２にわたり７５％酸素に暴露した。血管退行性（Ｐ１２で評価）および血管増殖性（Ｐ１７で評価）期の両方が存在し、高度に再現可能であり、疾患進行に対する介入評価を正確かつ迅速にする。トラップＧ（配列番号３８）、またはトラップＭ（ｂ２およびｃドメインを欠く、配列番号４２）をＰ１２の硝子体に注射した（０．５ｕｇ／ｕｌの１ｕｌ）。切開した網膜をフラットマウントし、１ｍＭのＣａＣｌ２中の蛍光標識イソレクチンＢ４（１：１００）と共に一晩インキュベートし、Ｐ１７での無血管領域または血管新生領域の広さを測定した。レクチン染色網膜中の無血管領域を、染色を欠くゾーンとして測定した。血管新生を、網膜前タフトを囲む、飽和レクチン染色の領域として測定した（５４、５５）。
トラップＧは、ビークル対照と比較して、血管再生を４０％を超えて効果的に高めることが示された（図２３Ｂ）。同様に、トラップＧは、病理学的血管新生を約４５％抑制することが示された（図２３Ｃ）。トラップ−Ｍは、ビークル対照と比較して、血管再生を約６０％高め（図２３Ｂ）、病理学的血管新生を約６０％抑制した（図２３Ｃ）。したがって、トラップＭは、損なわれたＶＥＧＦ結合により、虚血性網膜における病理学的血管新生をより効果的に防ぎ、また、向上した血管再生をより容易にもたらす。
実施例２３
ニューロピリン由来トラップは、糖尿病性網膜における血管漏出を減らす
糖尿病性網膜症におけるトラップの血管漏出／透過性に対する効果は、１型糖尿病のストレプトゾトシン（ＳＴＺ）モデルにおいても調査された。ＳＴＺ（５５ｍｇ／ｋｇ）を約６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに連続５日間にわたって投与し、血糖をモニターした。マウスは、非絶食状態での血糖が１７ｍＭ（３００ｍｇ／ｄＬ）より高い場合に糖尿病とみなした。マウスに、０．５ｕｇ（０．５ｕｇ／ｕｌ）のトラップＧ（配列番号３８）またはトラップＭ（配列番号４２）を、またはマウス抗ＶＥＧＦ抗体（ＡＦ−４９３−ＮＡ、Ｒ＆Ｄから入手）を、ＳＴＺ投与の６および７週後に、硝子体内に投与した。あるいは、ＳＴＺ投与後１２および１３週目にマウスの硝子体内に注射し、血管透過性を１４週目に評価した。マウスは、ＳＥＭＡトラップ（図２４Ａ参照）または抗ＶＥＧＦ抗体の硝子体内注射の少なくとも３週前には、高血糖性／糖尿病性であった。ＳＴＺ注射の８週後に、Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅアッセイにより網膜血管漏出を以下のように測定した。網膜Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ（ＥＢ）透過性を、読み当たり３個の網膜を使って実施した。４５ｍｇ／ｋｇのＥｖａｎ Ｂｌｕｅを静脈内に注射し、網膜抽出の前に、２時間にわたり循環させた。網膜におけるＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅ透過性を、ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｍ１０００ＰＲＯを使って、蛍光定量法（６２０ｎｍ最大吸光度−７４０ｎｍ最小吸光度（バックグラウンド））により定量化した。Ｅｖａｎ Ｂｌｕｅ透過性（ＥＢＰ）［ｕＬ／（グラム＊時間）として測定］を次のように計算した：［ＥＢ（ｕｇ）／湿潤網膜重量（ｇ）］／［血漿ＥＢ（ｕｇ／ｕＬ）＊循環時間（時間）］。Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ透過性を対照と比較して示した。
トラップ−Ｇ（配列番号３８）およびトラップ−Ｍ（配列番号４２）の両方が、血管透過性を４０％を超えて著しく低減させた（図２４Ｂ）。マウス抗ＶＥＧＦ抗体（ＡＦ−４９３−ＮＡ）は、この初期段階では、血管透過性を防止しなかった。トラップＧは、Ｐ１７で、抗ＶＥＧＦ中和抗体と同様に、血管漏出の低減に効果的であった（図２４Ｃ）、＊Ｐ＜０．０５、１２匹の動物からｎ＝４。
実施例２４
ニューロピリン由来トラップは、加齢黄斑変性モデルの脈絡膜新生血管を低減する
ＮＲＰ１トラップＧ（配列番号３８）の脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）に対する効果を、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）のマウスモデルで測定した。マウスのＣＮＶ、したがって、模倣湿潤ＡＭＤを誘導するために、６〜８週齡のマウス（１〜２乳頭直径）に、コヒーレントスリットランプ（４００ｍＷ、５０ｍｓおよび５０μｍ）上にマウントしたアルゴンレーザー（５３２ｎｍ）を使って乳頭からレーザー凝固術を行った（Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）。レーザー照射後、処置マウスに０．５ｕｇのトラップＧを硝子体内に注射した。１４日（Ｐ１４）後、脈絡膜層を半径方向に切開し、フラットマウントし、内皮細胞マーカーの蛍光標識イソレクチンＢ４で染色し（また、動物を任意選択で、フルオレセインデキストランで潅流し、管腔内血管を可視化した）、レーザー走査型共焦点顕微鏡によりＣＮＶの体積を測定した（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。
トラップＧは、レーザー照射１４日後に脈絡膜新生血管を著しく低減することが示された（図２５Ｂ）。
請求項の範囲は、実施例で示された好ましい実施形態に限定されるべきではなく、全体としての記載と一致する最も広い解釈を与えられるべきである。
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５．Ｊｏｕｓｓｅｎ，Ａ．Ｍ．，Ｐｏｕｌａｋｉ，Ｖ．，Ｌｅ，Ｍ．Ｌ．，Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｋ．，Ｅｓｓｅｒ，Ｃ．，Ｊａｎｉｃｋｉ，Ｈ．，Ｓｃｈｒａｅｒｍｅｙｅｒ，Ｕ．，Ｋｏｃｉｏｋ，Ｎ．，Ｆａｕｓｅｒ，Ｓ．，Ｋｉｒｃｈｈｏｆ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．２００４．Ａ ｃｅｎｔｒａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ．ＦＡＳＥＢ Ｊ １８：１４５０−１４５２．
６．Ａｍｂａｔｉ，Ｊ．，ａｎｄ Ｆｏｗｌｅｒ，Ｂ．Ｊ．２０１２．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｎ ７５：２６−３９．
７．Ｓｅｎｎｌａｕｂ，Ｆ．，Ａｕｖｙｎｅｔ，Ｃ．，Ｃａｌｉｐｐｅ，Ｂ．，Ｌａｖａｌｅｔｔｅ，Ｓ．，Ｐｏｕｐｅｌ，Ｌ．，Ｈｕ，Ｓ．Ｊ．，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｅ．，Ｃａｍｅｌｏ，Ｓ．，Ｌｅｖｙ，Ｏ．，Ｇｕｙｏｎ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．２０１３．ＣＣＲ２（＋）ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅ ａｔｒｏｐｈｉｃ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｘ３ｃｒ１ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ５：１７７５−１７９３．
８．Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅ，Ｃ．，Ｆｅｕｍｉ，Ｃ．，Ｒａｏｕｌ，Ｗ．，Ｋｅｌｌｅｒ，Ｎ．，Ｒｏｄｅｒｏ，Ｍ．，Ｐｅｚａｒｄ，Ａ．，Ｌａｖａｌｅｔｔｅ，Ｓ．，Ｈｏｕｓｓｉｅｒ，Ｍ．，Ｊｏｎｅｔ，Ｌ．，Ｐｉｃａｒｄ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．２００７．ＣＸ３ＣＲ１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｃｅｌｌ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃａｒｄｉｎａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１７：２９２０−２９２８．
９．Ｄａｍｍａｎｎ，Ｏ．２０１０．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ．Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒ ９９：９７５−９７７．
１０．Ｔｒｅｍｂｌａｙ，Ｓ．，Ｍｉｌｏｕｄｉ，Ｋ．，Ｃｈａｙｃｈｉ，Ｓ．，Ｆａｖｒｅｔ，Ｓ．，Ｂｉｎｅｔ，Ｆ．，Ｐｏｌｏｓａ，Ａ．，Ｌａｃｈａｐｅｌｌｅ，Ｐ．，Ｃｈｅｍｔｏｂ，Ｓ．，ａｎｄ Ｓａｐｉｅｈａ，Ｐ．２０１３．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｐｅｒｔｕｒｂｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｒｅｔｉｎａｌ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｒｅｔｉｎａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５４：８１２５−８１３９．
１１．Ｈａｒｔｎｅｔｔ，Ｍ．Ｅ．，ａｎｄ Ｐｅｎｎ，Ｊ．Ｓ．２０１２．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６７：２５１５−２５２６．
１２．Ｋｅｍｐｅｎ，Ｊ．Ｈ．，Ｏ’Ｃｏｌｍａｉｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｌｅｓｋｅ，Ｍ．Ｃ．，Ｈａｆｆｎｅｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｋｌｅｉｎ，Ｒ．，Ｍｏｓｓ，Ｓ．Ｅ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｈ．Ｒ．，ａｎｄ Ｈａｍｍａｎ，Ｒ．Ｆ．２００４．Ｔｈｅ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ａｍｏｎｇ ａｄｕｌｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １２２：５５２−５６３．
１３．Ｓａｐｉｅｈａ，Ｐ．，Ｈａｍｅｌ，Ｄ．，Ｓｈａｏ，Ｚ．，Ｒｉｖｅｒａ，Ｊ．Ｃ．，Ｚａｎｉｏｌｏ，Ｋ．，Ｊｏｙａｌ，Ｊ．Ｓ．，ａｎｄ Ｃｈｅｍｔｏｂ，Ｓ．２０１０．Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ：ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｈａｔ ｂｌｉｎｄｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４２：５−１２．
１４．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｇ．Ｓ．，Ｊｕ，Ｍ．，Ｓｈｉｈ，Ｓ．Ｃ．，Ｘｕ，Ｘ．，ＭｃＭａｈｏｎ，Ｇ．，Ｃａｌｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｂ．，ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｅ．２００１．Ｎｏｎｖａｓｃｕｌａｒ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＶＥＧＦ：ＶＥＧＦＲ−１，２ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｎｅｕｒａｌ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＦＡＳＥＢ Ｊ １５：１２１５−１２１７．
１５．Ｓａｉｎｔ−Ｇｅｎｉｅｚ，Ｍ．，Ｍａｈａｒａｊ，Ａ．Ｓ．，Ｗａｌｓｈｅ，Ｔ．Ｅ．，Ｔｕｃｋｅｒ，Ｂ．Ａ．，Ｓｅｋｉｙａｍａ，Ｅ．，Ｋｕｒｉｈａｒａ，Ｔ．，Ｄａｒｌａｎｄ，Ｄ．Ｃ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ｐ．Ａ．２００８．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＶＥＧＦ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｖｉｓｕａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒｏｌｅ ｏｎ ｍｕｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ３：ｅ３５５４．
１６．Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ａ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｅ．，ａｎｄ Ｄａｍｍａｎｎ，Ｏ．２０１３．Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ．Ｌａｎｃｅｔ．
１７．Ｓａｐｉｅｈａ，Ｐ．２０１２．Ｅｙｅｉｎｇ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ １２０：２１８２−２１９４．
１８．Ｋｅｒｎ，Ｔ．Ｓ．，ａｎｄ Ｂａｒｂｅｒ，Ａ．Ｊ．２００８．Ｒｅｔｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ５８６：４４０１−４４０８．
１９．Ｂｉｎｅｔ，Ｆ．，Ｍａｗａｍｂｏ，Ｇ．，Ｓｉｔａｒａｓ，Ｎ．，Ｔｅｔｒｅａｕｌｔ，Ｎ．，Ｌａｐａｌｍｅ，Ｅ．，Ｆａｖｒｅｔ，Ｓ．，Ｃｅｒａｎｉ，Ａ．，Ｌｅｂｏｅｕｆ，Ｄ．，Ｔｒｅｍｂｌａｙ，Ｓ．，Ｒｅｚｅｎｄｅ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎｅｕｒｏｎａｌ ＥＲ Ｓｔｒｅｓｓ Ｉｍｐｅｄｅｓ Ｍｙｅｌｏｉｄ−Ｃｅｌｌ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ＩＲＥ１ａｌｐｈａ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｔｒｉｎ−１．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ １７：３５３−３７１．
２０．Ｃｅｒａｎｉ Ａ，Ｔ．Ｎ．，Ｍｅｎａｒｄ Ｃ，Ｌａｐａｌｍｅ Ｅ，Ｐａｔｅｌ Ｃ，Ｓｉｔａｒａｓ Ｎ，Ｂｅａｕｄｏｉｎ Ｆ，Ｌｅｂｏｅｕｆ Ｄ，Ｄｅ Ｇｕｉｒｅ Ｖ，Ｂｉｎｅｔ Ｆ，Ｄｅｊｄａ Ａ，Ｒｅｚｅｎｄｅ Ｆ，Ｍｉｌｏｕｄｉ Ｋ，Ｓａｐｉｅｈａ Ｐ．２０１３．Ｎｅｕｒｏｎ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ３Ａ ｉｓ ａｎ Ｅａｒｌｙ Ｉｎｄｕｃｅｒ ｏｆ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｖｉａ Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．，１８（４）：５０５−５１８．
２１．Ｊｏｙａｌ，Ｊ．−Ｓ．，Ｓｉｔａｒａｓ，Ｎ．，Ｂｉｎｅｔ，Ｆ．，Ｒｉｖｅｒａ，Ｊ．Ｃ．，Ｓｔａｈｌ，Ａ．，Ｚａｎｉｏｌｏ，Ｋ．，Ｓｈａｏ，Ｚ．，Ｐｏｌｏｓａ，Ａ．，Ｚｈｕ，Ｔ．，Ｈａｍｅｌ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ｐｒｅｖｅｎｔ ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｂｙ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ３Ａ．Ｂｌｏｏｄ １１７：６０２４−６０３５．
２２．Ｃｈｅｃｃｈｉｎ，Ｄ．，Ｓｅｎｎｌａｕｂ，Ｆ．，Ｌｅｖａｖａｓｓｅｕｒ，Ｅ．，Ｌｅｄｕｃ，Ｍ．，ａｎｄ Ｃｈｅｍｔｏｂ，Ｓ．２００６．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｉｎ ｒｅｔｉｎａｌ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４７：３５９５−３６０２．
２３．Ｃｏｎｎｏｒ，Ｋ．Ｍ．，ＳａｎＧｉｏｖａｎｎｉ，Ｊ．Ｐ．，Ｌｏｆｑｖｉｓｔ，Ｃ．，Ａｄｅｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ａ．，Ｈｏｎｇ，Ｓ．，Ｐｒａｖｄａ，Ｅ．Ａ．，Ｍａｊｃｈｒｚａｋ，Ｓ．，Ｃａｒｐｅｒ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．２００７．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｄｉｅｔａｒｙ ｉｎｔａｋｅ ｏｆ ｏｍｅｇａ−３−ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｒｅｄｕｃｅｓ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｔｉｎａｌ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １３：８６８−８７３．
２４．Ｓａｐｉｅｈａ，Ｐ．，Ｓｔａｈｌ，Ａ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｓｅａｗａｒｄ，Ｍ．Ｒ．，Ｗｉｌｌｅｔｔ，Ｋ．Ｌ．，Ｋｒａｈ，Ｎ．Ｍ．，Ｄｅｎｎｉｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｏｎｎｏｒ，Ｋ．Ｍ．，Ａｄｅｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｌｉｃｌｉｃａｎ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．２０１１．５−Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ４−ＨＤＨＡ Ｉｓ ａ Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｛ｏｍｅｇａ｝−３ Ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ３：６９ｒａ１２．
２５．Ｓｔａｈｌ，Ａ．，Ｓａｐｉｅｈａ，Ｐ．，Ｃｏｎｎｏｒ，Ｋ．Ｍ．，Ｓａｎｇｉｏｖａｎｎｉ，Ｊ．Ｐ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ａｄｅｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｉｌｌｅｔｔ，Ｋ．Ｌ．，Ｋｒａｈ，Ｎ．Ｍ．，Ｄｅｎｎｉｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｓｅａｗａｒｄ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｓｈｏｒｔ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ：ＰＰＡＲ ｇａｍｍａ ｍｅｄｉａｔｅｓ ａ ｄｉｒｅｃｔ ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｏｍｅｇａ ３−ＰＵＦＡｓ ｉｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ １０７（４）：４９５−５００．
２６．Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｅ．，Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉ，Ｅ．，ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ａ．，Ｋｏｓｔｙｋ，Ｓ．Ｋ．，Ｄ’Ａｍａｔｏ，Ｒ．，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｒ．，ａｎｄ Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ｐ．Ａ．１９９４．Ｏｘｙｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：１０１−１１１．
２７．Ｌｅｅ，Ｐ．，Ｇｏｉｓｈｉ，Ｋ．，Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ａ．Ｊ．，Ｍａｎｎｉｘ，Ｒ．，Ｚｏｎ，Ｌ．，ａｎｄ Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．２００２．Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｓ ａ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ＶＥＧＦ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９９：１０４７０−１０４７５．
２８．Ｇｌｕｚｍａｎ−Ｐｏｌｔｏｒａｋ，Ｚ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｔ．，Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｍ．，ａｎｄ Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｇ．２００１．Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−２ ｆｏｒｍ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：１８６８８−１８６９４．
２９．Ｍａｍｌｕｋ，Ｒ．，Ｇｅｃｈｔｍａｎ，Ｚ．，Ｋｕｔｃｈｅｒ，Ｍ．Ｅ．，Ｇａｓｉｕｎａｓ，Ｎ．，Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．２００２．Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１ ｂｉｎｄｓ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １６５，ｐｌａｃｅｎｔａ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−２，ａｎｄ ｈｅｐａｒｉｎ ｖｉａ ｉｔｓ ｂ１ｂ２ ｄｏｍａｉｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２４８１８−２４８２５．
３０．Ｓｏｋｅｒ，Ｓ．，Ｔａｋａｓｈｉｍａ，Ｓ．，Ｍｉａｏ，Ｈ．Ｑ．，Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｇ．，ａｎｄ Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．１９９８．Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｓ ａｎ ｉｓｏｆｏｒｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｃｅｌｌ ９２：７３５−７４５．
３１．Ｆａｎｔｉｎ，Ａ．，Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．Ｍ．，Ｇｅｓｔｒｉ，Ｇ．，Ｄｅｎｔｉ，Ｌ．，Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｑ．，Ｐｒｙｋｈｏｚｈｉｊ，Ｓ．，Ｐｅｒｉ，Ｆ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｓ．Ｗ．，ａｎｄ Ｒｕｈｒｂｅｒｇ，Ｃ．２０１０．Ｔｉｓｓｕｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｃｔ ａｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ ｆｏｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ａｎａｓｔｏｍｏｓｉｓ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ ＶＥＧＦ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｔｉｐ ｃｅｌｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ １１６：８２９−８４０．
３２．Ｃａｒｒｅｒ，Ａ．，Ｍｏｉｍａｓ，Ｓ．，Ｚａｃｃｈｉｇｎａ，Ｓ．，Ｐａｔｔａｒｉｎｉ，Ｌ．，Ｚｅｎｔｉｌｉｎ，Ｌ．，Ｒｕｏｚｉ，Ｇ．，Ｍａｎｏ，Ｍ．，Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ，Ｍ．，Ｍａｉｏｎｅ，Ｆ．，Ｓｅｒｉｎｉ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．２０１２．Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ａ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ Ｇｒ１− ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｔｈａｔ ｃａｎ ｉｎｄｕｃｅ ｔｕｍｏｒ ｖｅｓｓｅｌ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７２：６３７１−６３８１．
３３．Ｃａｓａｚｚａ，Ａ．，Ｌａｏｕｉ，Ｄ．，Ｗｅｎｅｓ，Ｍ．，Ｒｉｚｚｏｌｉｏ，Ｓ．，Ｂａｓｓａｎｉ，Ｎ．，Ｍａｍｂｒｅｔｔｉ，Ｍ．，Ｄｅｓｃｈｏｅｍａｅｋｅｒ，Ｓ．，Ｖａｎ Ｇｉｎｄｅｒａｃｈｔｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｔａｍａｇｎｏｎｅ，Ｌ．，ａｎｄ Ｍａｚｚｏｎｅ，Ｍ．２０１３．Ｉｍｐｅｄｉｎｇ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｅｎｔｒｙ ｉｎｔｏ Ｈｙｐｏｘｉｃ Ｔｕｍｏｒ Ａｒｅａｓ ｂｙ ＳＥＭＡ３Ａ／Ｎｒｐ１ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｒｅｓｔｏｒｅｓ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２４：６９５−７０９．
３４．Ｒｉｔｔｅｒ，Ｍ．Ｒ．，Ｂａｎｉｎ，Ｅ．，Ｍｏｒｅｎｏ，Ｓ．Ｋ．，Ａｇｕｉｌａｒ，Ｅ．，Ｄｏｒｒｅｌｌ，Ｍ．Ｉ．，ａｎｄ Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ，Ｍ．２００６．Ｍｙｅｌｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１６：３２６６−３２７６．
３５．Ｓｔａｈｌ，Ａ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｓａｐｉｅｈａ，Ｐ．，Ｓｅａｗａｒｄ，Ｍ．Ｒ．，Ｋｒａｈ，Ｎ．Ｍ．，Ｄｅｎｎｉｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｆａｖａｚｚａ，Ｔ．，Ｂｕｃｈｅｒ，Ｆ．，Ｌｏｆｑｖｉｓｔ，Ｃ．，Ｏｎｇ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｐｏｓｔｎａｔａｌ Ｗｅｉｇｈｔ Ｇａｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｅｓ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ Ｏｘｙｇｅｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１７７（６）：２７１５−２７３３．
３６．Ｃｌａｕｓｅｎ，Ｂ．Ｅ．，Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ，Ｃ．，Ｒｅｉｔｈ，Ｗ．，Ｒｅｎｋａｗｉｔｚ，Ｒ．，ａｎｄ Ｆｏｒｓｔｅｒ，Ｉ．１９９９．Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ＬｙｓＭｃｒｅ ｍｉｃｅ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ ８：２６５−２７７．
３７．Ｍａｔｔａｐａｌｌｉｌ，Ｍ．Ｊ．，Ｗａｗｒｏｕｓｅｋ，Ｅ．Ｆ．，Ｃｈａｎ，Ｃ．Ｃ．，Ｚｈａｏ，Ｈ．，Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｊ．，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｔ．Ａ．，ａｎｄ Ｃａｓｐｉ，Ｒ．Ｒ．２０１２．Ｔｈｅ Ｒｄ８ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｒｂ１ ｇｅｎｅ ｉｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｖｅｎｄｏｒ ｌｉｎｅｓ ｏｆ Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ｃｏｎｆｏｕｎｄｓ ｏｃｕｌａｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｔａｎｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５３：２９２１−２９２７．
３８．Ｋｌｅｂａｎｏｖ，Ｏ．，Ｎｉｔｚａｎ，Ａ．，Ｒａｚ，Ｄ．，Ｂａｒｚｉｌａｉ，Ａ．，ａｎｄ Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ａ．Ｓ．２００９．Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ３Ａ ａｎｄ ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ．Ｇｒａｅｆｅｓ Ａｒｃｈ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２４７：７３−８６．
３９．Ｋｏｐｐｅｌ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｒａｐｅｒ，Ｊ．Ａ．１９９８．Ｃｏｌｌａｐｓｉｎ−１ ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｄｉｍｅｒｉｚｅｓ，ａｎｄ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｃｏｌｌａｐｓｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３：１５７０８−１５７１３．
４０．Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｇ．，ａｎｄ Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｏ．２００８．Ｔｈｅ ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｓ：ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｕｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ８：６３２−６４５．
４１．Ｗｏｒｔｈｙｌａｋｅ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ Ｂｕｒｒｉｄｇｅ，Ｋ．２００３．ＲｈｏＡ ａｎｄ ＲＯＣＫ ｐｒｏｍｏｔｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：１３５７８−１３５８４．
４２．Ｄａｍｍａｎｎ，Ｏ．，Ｂｒｉｎｋｈａｕｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｂａｒｔｅｌｓ，Ｄ．Ｂ．，Ｄｏｒｄｅｌｍａｎｎ，Ｍ．，Ｄｒｅｓｓｌｅｒ，Ｆ．，Ｋｅｒｋ，Ｊ．，Ｄｏｒｋ，Ｔ．，ａｎｄ Ｄａｍｍａｎｎ，Ｃ．Ｅ．２００９．Ｉｍｍａｔｕｒｉｔｙ，ｐｅｒｉｎａｔａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ：ａ ｍｕｌｔｉ−ｈｉｔ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ．Ｅａｒｌｙ Ｈｕｍ Ｄｅｖ ８５：３２５−３２９．
４３．Ｋａｓｔｅｌａｎ，Ｓ．，Ｔｏｍｉｃ，Ｍ．，Ｇｖｅｒｏｖｉｃ Ａｎｔｕｎｉｃａ，Ａ．，Ｓａｌｏｐｅｋ Ｒａｂａｔｉｃ，Ｊ．，ａｎｄ Ｌｊｕｂｉｃ，Ｓ．２０１３．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ．Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ Ｉｎｆｌａｍｍ ２０１３：２１３１３０．
４４．Ｓｉｌｖａ，Ｐ．Ｓ．，Ｃａｖａｌｌｅｒａｎｏ，Ｊ．Ｄ．，Ｓｕｎ，Ｊ．Ｋ．，Ａｉｅｌｌｏ，Ｌ．Ｍ．，ａｎｄ Ａｉｅｌｌｏ，Ｌ．Ｐ．２０１０．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｏｎｓｅｔ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６：４９４−５０８．
４５．Ｃｅｒａｎｉ，Ａ．，Ｔｅｔｒｅａｕｌｔ，Ｎ．，Ｍｅｎａｒｄ，Ｃ．，Ｌａｐａｌｍｅ，Ｅ．，Ｐａｔｅｌ，Ｃ．，Ｓｉｔａｒａｓ，Ｎ．，Ｂｅａｕｄｏｉｎ，Ｆ．，Ｌｅｂｏｅｕｆ，Ｄ．，Ｄｅ Ｇｕｉｒｅ，Ｖ．，Ｂｉｎｅｔ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎｅｕｒｏｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ３Ａ ｉｓ ａｎ ｅａｒｌｙ ｉｎｄｕｃｅｒ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｖｉａ ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ １８：５０５−５１８．
４６．Ｍｉａｏ，Ｈ．Ｑ．，Ｓｏｋｅｒ，Ｓ．，Ｆｅｉｎｅｒ，Ｌ．，Ａｌｏｎｓｏ，Ｊ．Ｌ．，Ｒａｐｅｒ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．１９９９．Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｃｏｌｌａｐｓｉｎ−１／ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ＩＩＩ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｍｏｔｉｌｉｔｙ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｐｓｉｎ−１ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−１６５．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４６：２３３−２４２．
４７．Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．，ａｎｄ Ｅｉｃｈｍａｎｎ，Ａ．２００５．Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ａｘｏｎ ｇｕｉｄａｎｃｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｉｇａｎｄｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ １６：５３５−５４８．
４８．Ｇｕｔｔｍａｎｎ−Ｒａｖｉｖ，Ｎ．，Ｓｈｒａｇａ−Ｈｅｌｅｄ，Ｎ．，Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ，Ａ．，Ｇｕｉｍａｒａｅｓ−Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｃ．，Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｏ．，ａｎｄ Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｇ．２００７．Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ−３Ａ ａｎｄ ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ−３Ｆ ｗｏｒｋ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｔｏ ｒｅｐｅｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅｉｒ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｂｙ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２：２６２９４−２６３０５．
４９．Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｇ．，Ｓａｂａｇ，Ａ．Ｄ．，Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｚ，Ｎ．，ａｎｄ Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｏ．２０１２．Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｓ ｉｎ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ ２：ａ００６７１８．
５０．Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏ，Ｆ．，Ｖａｌｄｅｍｂｒｉ，Ｄ．，Ｃａｃｃａｖａｒｉ，Ｆ．，ａｎｄ Ｓｅｒｉｎｉ，Ｇ．２００６．Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｇ ｖａｓｃｕｌａｒ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ １３：８１−９１．
５１．Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｄ．２０１０．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＶＥＧＦ．Ｃｅｌｌ １４３：１３−１６．
５２．Ｍｉｌｏｕｄｉ，Ｋ．，Ｄｅｊｄａ，Ａ．，Ｂｉｎｅｔ，Ｆ．，Ｌａｐａｌｍｅ，Ｅ．，Ｃｅｒａｎｉ，Ａ．，ａｎｄ Ｓａｐｉｅｈａ，Ｐ．２０１４．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ＣＮＳ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｒｅｔｉｎａ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．８８：ｅ５１３５１．
５３．Ｓａｐｉｅｈａ，Ｐ．，Ｊｏｙａｌ，Ｊ．Ｓ．，Ｒｉｖｅｒａ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｅｒｍｏｒｖａｎｔ−Ｄｕｃｈｅｍｉｎ，Ｅ．，Ｓｅｎｎｌａｕｂ，Ｆ．，Ｈａｒｄｙ，Ｐ．，Ｌａｃｈａｐｅｌｌｅ，Ｐ．，ａｎｄ Ｃｈｅｍｔｏｂ，Ｓ．２０１０．Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ：ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｒｅｔｉｎａｌ ｖａｓｃｕｌｏｐａｔｈｉｅｓ ａｔ ａｎ ｅｘｔｒｅｍｅ ｏｆ ｌｉｆｅ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２０：３０２２−３０３２．
５４．Ｓｔａｈｌ，Ａ．，Ｃｏｎｎｏｒ，Ｋ．Ｍ．，Ｓａｐｉｅｈａ，Ｐ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｄｅｎｎｉｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｋｒａｈ，Ｎ．Ｍ．，Ｓｅａｗａｒｄ，Ｍ．Ｒ．，Ｗｉｌｌｅｔｔ，Ｋ．Ｌ．，Ａｄｅｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｇｕｅｒｉｎ，Ｋ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｒｅｔｉｎａ ａｓ ａｎ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｍｏｄｅｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５１：２８１３−２８２６．
５５．Ｓｔａｈｌ，Ａ．，Ｃｏｎｎｏｒ，Ｋ．Ｍ．，Ｓａｐｉｅｈａ，Ｐ．，Ｗｉｌｌｅｔｔ，Ｋ．Ｌ．，Ｋｒａｈ，Ｎ．Ｍ．，Ｄｅｎｎｉｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｇｕｅｒｉｎ，Ｋ．Ｉ．，ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｅ．２００９．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ａｉｄｅｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｔｉｎａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ １２：２９７−３０１．
５６．Ｓｈａｏ，Ｚ．，Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ，Ｍ．，Ｈｕｒｓｔ，Ｃ．Ｇ．，Ｃｕｉ，Ｚ．，Ｐｅｉ，Ｄ．Ｔ．，Ｅｖａｎｓ，Ｌ．Ｐ．，Ｊｕａｎ，Ａ．Ｍ．，Ｔａｈｉｒ，Ｈ．，Ｄｕｈａｍｅｌ，Ｆ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｃｈｏｒｏｉｄ ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ ａｓｓａｙ：ａｎ ｅｘ ｖｉｖｏ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８：ｅ６９５５２．
５７．Ｖａｎ Ｒｏｏｉｊｅｎ，Ｎ．，ａｎｄ ｖａｎ Ｋｅｓｔｅｒｅｎ−Ｈｅｎｄｒｉｋｘ，Ｅ．２００３．”Ｉｎ ｖｉｖｏ” ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｂｙ ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ”ｓｕｉｃｉｄｅ”．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３７３：３−１６．
５８．Ｄｅｕｔｓｃｈｍａｎ，Ｃ．Ｓ．，ａｎｄ Ｔｒａｃｅｙ，Ｋ．Ｊ．２０１４．Ｓｅｐｓｉｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｄｏｇｍａ ａｎｄ ｎｅｗ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４０：４６３−４７５．
５９．Ｂｒｕｄｅｒ，Ｄ．，Ｐｒｏｂｓｔ−Ｋｅｐｐｅｒ，Ｍ．，Ｗｅｓｔｅｎｄｏｒｆ，Ａ．Ｍ．，Ｇｅｆｆｅｒｓ，Ｒ．，Ｂｅｉｓｓｅｒｔ，Ｓ．，Ｌｏｓｅｒ，Ｋ．，ｖｏｎ Ｂｏｅｈｍｅｒ，Ｈ．，Ｂｕｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ Ｈａｎｓｅｎ，Ｗ．２００４．Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１：ａ ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３４：６２３−６３０．
６０．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．，Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ａ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｆ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．Ｈ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｙ．，Ｋａｌｂ，Ｒ．Ｇ．，Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｈ．，ａｎｄ Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｓ．Ｍ．１９９９．Ｐｌｅｘｉｎ−ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒｍ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ−３Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ ９９：５９−６９．
６１．Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．，Ｔａｋａｓｈｉｍａ，Ｓ．，ａｎｄ Ｍａｍｌｕｋ，Ｒ．２００２．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ ｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ ５１５：３３−４８．
６２．Ｓｏｋｅｒ，Ｓ．，Ｍｉａｏ，Ｈ．Ｑ．，Ｎｏｍｉ，Ｍ．，Ｔａｋａｓｈｉｍａ，Ｓ．，ａｎｄ Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．２００２．ＶＥＧＦ１６５ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＶＥＧＦＲ−２ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１ ｔｈａｔ ｅｎｈａｎｃｅ ＶＥＧＦ１６５−ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ８５：３５７−３６８．
６３．Ａｐｐｌｅｔｏｎ，Ｂ．Ａ．，Ｗｕ，Ｐ．，Ｍａｌｏｎｅｙ，Ｊ．，Ｙｉｎ，Ｊ．，Ｌｉａｎｇ，Ｗ．Ｃ．，Ｓｔａｗｉｃｋｉ，Ｓ．，Ｍｏｒｔａｒａ，Ｋ．，Ｂｏｗｍａｎ，Ｋ．Ｋ．，Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｄｅｓｍａｒａｉｓ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．２００７．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ／ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｐｒｏｖｉｄｅ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ａｎｄ ＶＥＧＦ ｂｉｎｄｉｎｇ．ＥＭＢＯ Ｊ ２６：４９０２−４９１２．
６４．Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｑ．，ａｎｄ Ｒｕｈｒｂｅｒｇ，Ｃ．２００７．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ ｌｉｇａｎｄｓ ＶＥＧＦ１６４ ａｎｄ ＳＥＭＡ３Ａ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ．Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｆｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ ２８３：２３０−２３５；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ２３５−２４１．
６５．Ｇｅｒｅｔｔｉ，Ｅ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ａ．，ａｎｄ Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．２００８．Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｇｏｖｅｒｎｓ ＶＥＧＦ ａｎｄ ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ １１：３１−３９．
６６．Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ，Ｅ．，Ｋｒｉｚ，Ｊ．，Ｓｅｉｄａｈ，Ｎ．Ｇ．Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｉｎｔｒａｌｕｍｉｎａｌ ＭＣＡＯ：ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｎｆａｒｃｔ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１２ Ｎｏｖ ６；（６９）．ｐｉｉ：４０３８．ｄｏｉ：１０．３７９１／４０３８．
６７．Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅ，Ｃ．，Ｃ．Ｆｅｕｍｉ，Ｗ．Ｒａｏｕｌ，Ｎ．Ｋｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｒｏｄｅｒｏ，Ａ．Ｐｅｚａｒｄ，Ｓ．Ｌａｖａｌｅｔｔｅ，Ｍ．Ｈｏｕｓｓｉｅｒ，Ｌ．Ｊｏｎｅｔ，Ｅ．Ｐｉｃａｒｄ，Ｐ．Ｄｅｂｒｅ，Ｍ．Ｓｉｒｉｎｙａｎ，Ｐ．Ｄｅｔｅｒｒｅ，Ｔ．Ｆｅｒｒｏｕｋｈｉ，Ｓ．Ｙ．Ｃｏｈｅｎ，Ｄ．Ｃｈａｕｖａｕｄ，Ｊ．Ｃ．Ｊｅａｎｎｙ，Ｓ．Ｃｈｅｍｔｏｂ，Ｆ．Ｂｅｈａｒ−Ｃｏｈｅｎ，ａｎｄ Ｆ．Ｓｅｎｎｌａｕｂ．２００７．ＣＸ３ＣＲ１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｃｅｌｌ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃａｒｄｉｎａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１７：２９２０−２９２８．
６８．Ｔａｋｅｄａ，Ａ．，Ｊ．Ｚ．Ｂａｆｆｉ，Ｍ．Ｅ．Ｋｌｅｉｎｍａｎ，Ｗ．Ｇ．Ｃｈｏ，Ｍ．Ｎｏｚａｋｉ，Ｋ．Ｙａｍａｄａ，Ｈ．Ｋａｎｅｋｏ，Ｒ．Ｊ．Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ，Ｓ．Ｄｒｉｄｉ，Ｋ．Ｓａｉｔｏ，Ｂ．Ｊ．Ｒａｉｓｌｅｒ，Ｓ．Ｊ．Ｂｕｄｄ，Ｐ．Ｇｅｉｓｅｎ，Ａ．Ｍｕｎｉｔｚ，Ｂ．Ｋ．Ａｍｂａｔｉ，Ｍ．Ｇ．Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ，Ｊ．Ｄ．Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．Ａ．Ｈｕｍｂｌｅｓ，Ｃ．Ｊ．Ｇｅｒａｒｄ，Ｙ．Ｏｇｕｒａ，Ｙ．Ｐａｎ，Ｊ．Ｒ．Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．Ｇｒｉｓａｎｔｉ，Ｍ．Ｅ．Ｈａｒｔｎｅｔｔ，Ｍ．Ｅ．Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，ａｎｄ Ｊ．Ａｍｂａｔｉ．２００９．ＣＣＲ３ ｉｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ ４６０：２２５−２３０．

Claims (10)

  1. 対象における、敗血症を予防または処置するための組成物であって、
    前記組成物は、セマフォリン3A（SEMA3A）へのニューロピリン−１（NRP１）の結合を阻害する物質を含んでなり、当該物質は；
    （ｉ）NRP１トラップであり、このNRP１トラップは、ヒトNRP１のドメインa1及びa2のアミノ酸配列（配列番号：66のアミノ酸22〜275）を含むNRP１ポリペプチドであるか、又は当該NRP１ポリペプチドの機能性断片若しくは機能性変異体であって前記アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含むものであり、或いは
    （ii）抗−NRP１抗体である、
    前記組成物。
  2. 前記NRP１トラップが、
    （ａ）ヒトNRP１のドメインa1、a2、b1、b2及びｃのアミノ酸配列（配列番号：66のアミノ酸22〜859）を含むNRP１ポリペプチドであるか、又は当該NRP１ポリペプチドの機能性断片若しくは機能性変異体であって前記アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもの；
    （ｂ）ヒトNRP１のドメインa1、a2、b1及びb2のアミノ酸配列（配列番号：66のアミノ酸22〜589）を含むNRP１ポリペプチドであるか、又は当該NRP１ポリペプチドの機能性断片若しくは機能性変異体であって前記アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもの；又は
    （ｃ）ヒトNRP１のドメインa1、a2及びb1のアミノ酸配列（配列番号：66のアミノ酸22〜428）を含むNRP１ポリペプチドであるか、又は当該NRP１ポリペプチドの機能性断片若しくは機能性変異体であって前記アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもの；
    を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記NRP１トラップが、ヒトNRP１のドメインa1、a2及びb1のアミノ酸配列（配列番号：66のアミノ酸22〜428）を含むNRP１ポリペプチドであるか、又は当該NRP１ポリペプチドの機能性断片若しくは機能性変異体であって前記アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含むものである、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記NRP１トラップが、ヒトNRP１のドメインa1、a2、b1及びb2のアミノ酸配列（配列番号：66のアミノ酸22〜589）を含むNRP１ポリペプチドであるか、又は当該NRP１ポリペプチドの機能性断片若しくは機能性変異体であって前記アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含むものである、請求項２に記載の組成物。
  5. 前記NRP１ポリペプチドが、完全に又は部分的にヒトNRP１のドメインb2（配列番号：66のアミノ酸429〜589）を欠く、請求項２に記載の組成物。
  6. 前記NRP１ポリペプチドが、完全に又は部分的にヒトNRP１のドメインｃ（配列番号66：のアミノ酸590〜859）を欠く、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記NRP１トラップが、ヒトNRP１のドメインa1、a2及びb1のアミノ酸配列（配列番号66：のアミノ酸22〜428）を含むNRP１ポリペプチドを含んでなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 前記NRP1トラップがFcドメインをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  9. 前記Fcドメインは、配列番号37のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の組成物。
  10. 対象の障害部位における、IL-6、IL-1βおよびTNFαの分泌を低減し、および／または単核貪食細胞（MP）の動員を低減する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
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