CN103193888B - 神经毡蛋白片段与神经毡蛋白抗体复合物的晶体结构 - Google Patents

Abstract

本发明涉及神经毡蛋白片段与神经毡蛋白抗体复合物的晶体结构。本发明提供了单独的或与抗神经毡蛋白抗体复合的神经毡蛋白1(Nrp1)和神经毡蛋白2(Nrp2)片段的晶体结构，及其使用方法。本发明进一步提供了抗Nrp抗体及其治疗应用的方法。

Description

神经毡蛋白片段与神经毡蛋白抗体复合物的晶体结构

本申请是申请日为2007年05月17日、中国申请号为200780053793.1、发明名称为“神经毡蛋白片段与神经毡蛋白抗体复合物的晶体结构”的发明申请的分案申请。

发明领域

本发明提供了单独的或与抗神经毡蛋白抗体复合的神经毡蛋白1(Nrp1)和神经毡蛋白2(Nrp2)片段的晶体结构及其用途。本发明进一步提供了结合Nrp1和/或Nrp2的抗体及其使用方法。

发明背景

血管系统的发育是许多生理性和病理性过程的基本要求。活跃生长中的组织诸如胚胎和肿瘤要求充足的血液供应。它们通过生成促血管发生因子来满足这一需要，所述促血管发生因子经由一般称为血管发生(angiogenesis)的过程促进新血管形成和维持。血管形成是复杂但有序的生物学事件，涉及所有或许多以下步骤：a)自已有的内皮细胞(EC)增殖出EC或自祖细胞分化出EC；b)EC迁移并接合以形成索样结构；c)血管索然后发生管发生(tubulogenesis)以形成具有中央内腔的血管；d)已有的索或血管伸出芽以形成次生血管；e)初级血管丛发生进一步重塑(remodeling)和整形(reshaping)；及f)内皮周细胞(peri-endothelial cell)被募集来包围内皮管，为血管提供维持和调节功能，此类细胞包括用于小毛细血管的周细胞、用于大血管的平滑肌细胞、和心脏中的心肌细胞。Hanahan,D.Science277:48-50(1997)；Hogan,B.L.和Kolodziej,P.A.Nature Reviews Genetics.3:513-23(2002)；Lubarsky,B.和Krasnow,M.A.Cell.112:19-28(2003)。

现在完全确立了血管发生涉及多种病症的发病机理。这些包括实体瘤和转移、动脉粥样硬化、晶状体后纤维组织增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新血管疾病诸如增殖性视网膜病变例如糖尿病性视网膜病、年龄相关黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜组织和其它组织的免疫排斥、类风湿性关节炎、和银屑病。Folkman等,J.Biol.Chem.,267:10931-10934(1992)；Klagsbrun等,Annu.Rev.Physiol.53:217-239(1991)；GarnerA.,"Vasculardiseases",在Garner A和Klintworth GK编的《Pathobiology of Ocular Disease.ADynamic Approach》第2版(Marcel Dekker,NY,1994)中,pp1625-1710。

在肿瘤生长的情况中，血管发生对于自增生至瘤形成的转换，及为肿瘤的生长和转移提供营养似乎是至关重要的。Folkman等,Nature339:58(1989)。新血管形成(neovascularization)让肿瘤细胞获得了与正常细胞相比的生长优势和增殖自治。肿瘤通常开始于单个异常细胞，由于与可利用毛细管床的距离，该细胞只能增殖至几立方毫米的尺寸，而且它能在较长的一段时间里保持“休眠”状态而不进一步生长和传播。有些肿瘤细胞然后转向血管发生表型以激活内皮细胞，所述内皮细胞增殖并成熟成新的毛细血管。这些新形成的血管不仅让原发性肿瘤继续生长，而且让转移性肿瘤细胞传播并再建群(recolonization)。因而，在肿瘤切片中的微血管密度与乳腺癌及数种其它肿瘤的患者存活之间观察到了相关性。Weidner等,N.Engl.J.Med324:1-6(1991)；Horak等,Lancet340:1120-1124(1992)；Macchiarini等,Lancet340:145-146(1992)。尚未完全了解控制血管发生转换的精确机制，但是认为肿瘤块的新血管形成源自众多血管发生刺激物与抑制物的净平衡(Folkman,Nat Med1(1):27-31(1995))。

血管发育的过程受到紧密调节。迄今为止，多种分子，多为由周围细胞生成的分泌性因子，已显示出调节EC分化、增殖、迁移和接合成索样结构。例如，血管内皮生长因子(VEGF)已鉴定为涉及刺激血管发生和诱导血管通透性的关键因子。Ferrara等,Endocr.Rev.18:4-25(1997)。甚至单个VEGF等位基因的遗失导致胚胎致死的发现指向此因子在血管系统的发育和分化中所发挥的不可代替的作用。此外，VEGF已显示为与肿瘤和眼内病症有关的新血管形成的关键介导物。Ferrara等,Endocr.Rev.见上文。VEGF mRNA在多数所检查的人肿瘤中过表达。Berkman等,J.Clin.Invest.91:153-159(1993)；Brown等,HumanPathol.26:86-91(1995)；Brown等,Cancer Res.53:4727-4735(1993)；Mattern等,Brit.J.Cancer73:931-934(1996)；Dvorak等,Am.J.Pathol.146:1029-1039(1995)。

同样，眼部液体中VEGF的浓度水平与糖尿病性和其它缺血相关视网膜病患者中的活泼血管增殖的存在高度相关。Aiello等,N.Engl.J.Med.331:1480-1487(1994)。此外，研究证明了VEGF在AMD患者脉络膜新血管膜中的定位。Lopez等,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.37:855-868(1996)。

抗VEGF中和性抗体在裸鼠中遏制多种人肿瘤细胞系的生长(Kim等,Nature362:841-844(1993)；Warren等,J.Clin.Invest.95:1789-1797(1995)；Cancer Res.56:4032-4039(1996)；Melnyk等,Cancer Res.56:921-924(1996))，而且在缺血性视网膜病症模型中还抑制眼内血管发生。Adamis等,Arch.Ophthalmol.114:66-71(1996)。因此，抗VEGF单克隆抗体或其它VEGF作用抑制剂是有希望用于治疗肿瘤和多种眼内新血管病症的候选物。此类抗体记载于例如1998年1月14日公开的EP817,648和1998年10月15日公开的WO98/45331和WO98/45332。抗VEGF抗体之一，贝伐单抗(bevacizumab)已获FDA批准与化疗方案联合用于治疗转移性结肠直肠癌(CRC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。而且，贝伐单抗正在许多进行中的治疗各种癌症适应证的临床试验中进行研究。

在神经系统的发育过程中，神经元伸出缆样轴突，所述轴突迁移长距离以到达它们的靶点。见综述Carmeliet and Tessier-Lavigne(2005)Nature436:193-200。生长中的轴突的领先尖端是高度能动的感觉结构，称为生长锥。通过丝足伸展(filopodial extension)的伸展和收缩的动态循环，生长锥不断感觉和评估其空间环境中的众多提示，并精确选择正确航迹来向其最终靶点延伸。

在过去的十年里，在了解轴突导向机制方面取得了可观的进展。见综述Dickson(2002)Science298:1959-64。导向提示来自四种：引诱物和驱除物；可以作用于近程（即细胞或基质相关的）或远程（即可扩散的）。迄今为止，已鉴定了四大族轴突导向分子：netrins(神经生长因子)、semaphorins(脑信号蛋白)、ephrins和slits。见综述Huber等(2003)Annu Rev Neurosci26:509-63。

脑信号蛋白(Sema)，也称作脑衰蛋白(collapsin)，属于一大族在系统发生上保守的分泌性和膜结合性蛋白质。脑信号蛋白家族的成员能够在神经发育过程中介导驱除性和引诱性轴突导向事件。Raper(2000)Curr Opin Neurobiol10:88-94。迄今为止鉴定的超过三十种脑信号蛋白都享有大约500个氨基酸的保守N-末端Sema结构域。脑信号蛋白成员根据它们的结构相似性和物种起源归入八个亚家族。关于脑信号蛋白统一命名法的更多详情见SemaphorinNomenclature Committee(1999)Cell97:551-552。

神经毡蛋白(neuropilin,NRP)家族由两种同源蛋白质构成，神经毡蛋白-1(NRP1)和神经毡蛋白-2(NRP2)。NRP1首先鉴定为在生长中的轴突的生长锥中表达的I型130kDa跨膜糖蛋白。NRP2随后通过表达克隆得到鉴定。Fujisawa and Kitsukawa(1998)Curr Opin Neurobiol8:587-592。发现NRP是脑信号蛋白的一个子集（即第3类脑信号蛋白）的受体。有人提出NRP与另一个脑信号蛋白受体家族（即神经丛素(plexin)）一起发挥非信号传导性共同受体的功能。

尽管最初描述为轴突导向的介导物，已发现NRP在血管发育中发挥至关重要的作用。Carmeliet and Tessier-Lavigne(2005)。它被鉴定为在肿瘤和内皮细胞上表达的同等型特异性VEGF受体，大大促进了对NRP在血管和肿瘤生物学中的作用的了解。Soker等(1998) Cell92:735-745；Klagsbrun等(2002)Adv Exp Med Biol515:33-48。遗传研究提供了有力的证据来证明Nrp1是血管形态发生所要求的。Nrp1功能的丧失导致血管重塑和分支缺陷，这种表型可以因Nrp2功能丧失而进一步增强。Kawasaki等(1999)Development126:4895-4902；Takashima等(2002)Proc Natl Acad Sci USA99:3657-3662。这些结果说明在发育早期Nrp1和Nrp2可能具有重叠的功能。然而，每一种Nrp的表达在发育晚期隔开，Nrp1主要在动脉中表达，而Nrp2主要在静脉和淋巴管中表达。Yuan等(2002)Development129:4797-4806；Herzog等(2001)MechDev109:115-119。注意，仅仅Nrp2功能的丧失特异性的削弱淋巴发育。

因为Nrp1在发育过程中在许多其它细胞类型中表达，所以通过生成EC特异性敲除（其导致与无效等位基因中所看到的类似的血管缺陷）得出了血管Nrp1的作用。Gu等(2003)Dev Cell5:45-57。有趣的是，此研究还显示出Sema3A与NRP1结合不是血管发育所要求的。在另一项研究中，在Nrp1敲除胚胎的发育中的后脑的内皮顶端细胞的导向中观察到缺陷。Gerhardt等(2004) Dev Dyn231:503-509。

尽管对NRP1在血管发育中的作用进行了广泛研究，仍然不清楚NRP1是否是专门通过VEGF-VEGF受体2(VEGFR2)途径（作为VEGF结合VEGFR2的增强剂并由此作为VEGFR2信号传导的增强剂）或通过不依赖VEGFR2的信号传导途径或二者的组合来发挥其血管功能的。

单克隆抗体可以使用重组DNA技术来制备。单克隆抗体得到了广泛使用，特别是那些衍生自啮齿类的单克隆抗体，然而非人抗体在人体中常常是抗原性的。本领域试图通过构建“嵌合”抗体来克服这个问题，在嵌合抗体中非人抗原结合结构域与人恒定域偶联(Cabilly等,美国专利No.4,816,567)。人恒定域的同种型可以选择成适合嵌合抗体参与抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性的。在试图解决抗体的抗原结合功能和将人抗体中异源序列的使用最小化的另一项努力中，对多种抗原生成了人源化抗体，其中基本上少于整个人可变域被来自非人物种的相应序列替代。例如，将啮齿类残基用于替代人抗体的相应区段。在实践中，人源化抗体通常是这样的人抗体，其中一些互补决定区(CDR)残基及可能的一些框架区(FR)残基用啮齿类抗体中类似位点的残基替代。Jones等(1986)Nature321:522-525；Riechmann等(1988)Nature332:323-327；Verhoeyen等(1988)Science239:1534-1536。

在对人施用治疗性抗体之前，一般需要在非人哺乳动物中进行临床前研究以评估抗体的疗效和/或毒性。理想的是，进行这些研究的抗体能够识别靶抗原并以高效力与靶抗原起作用，其中所述靶抗原对于宿主动物诸如小鼠或非人灵长类是内源的。

噬菌体展示技术提供了用于生成和选择能与配体诸如抗原结合的新蛋白质的有力工具。使用噬菌体展示技术，可以生成蛋白质变体的大型文库并快速分拣那些能以高亲和力与靶抗原结合的序列。将编码变异多肽的核酸与编码病毒外壳蛋白诸如基因III蛋白或基因VIII蛋白的核酸序列融合。已经开发了单价噬菌体展示系统，其中将编码蛋白质或多肽的核酸序列与编码基因III蛋白一部分的核酸序列融合。(Bass,S.(1990)Proteins8:309；Lowman andWells(1991)Methods:ACompanion to Methods in Enzymology3:205)。在单价噬菌体展示系统中，基因融合物以低水平表达，而野生型基因III蛋白也表达，使得（病毒）颗粒的感染性得到保留。生成肽文库和筛选那些文库的方法已经公开于许多专利（例如美国专利No.5,723,286、美国专利No.5,432,018、美国专利No.5,580,717、美国专利No.5,427,908和美国专利No.5,498,530）。

证明肽在丝状噬菌体表面上表达和功能性抗体片段在大肠杆菌周质中表达对于开发噬菌体展示抗体文库是重要的。(Smith等(1985)Science228:1315；Skerra and Pluckthun (1988) Science 240:1038)。已经以多种方式制备了抗体或抗原结合多肽的文库，包括通过插入随机DNA序列来改变单一基因或者通过克隆一族相关基因。使用噬菌体展示来展示抗体或抗原结合片段的方法已经记载于美国专利No.5,750,373、5,733,743、5,837,242、5,969,108、6,172,197、5,580,717和5,658,727。然后对文库筛选具有期望特征的抗体或抗原结合蛋白的表达。

噬菌体展示技术在制备具有期望特征的抗体方面相对于常规杂交瘤和重组方法具有数项优势。此技术容许以较少的时间、无需使用动物就开发出具有多样序列的大型抗体文库。杂交瘤的制备或人源化抗体的制备动则就需要数月制备。另外，由于不需要进行免疫，可以对有毒的或具有低抗原性的抗原生成噬菌体抗体文库(Hogenboom(1988)Immunotechniques4:1-20)。噬菌体抗体文库还可用于生成和鉴定新的治疗性抗体。

噬菌体展示文库已经用于自经免疫的、未免疫的人、种系序列、或未接触过抗原的B细胞Ig全集生成人抗体(Barbas和Burton(1996)Trends Biotech14:230；Griffiths等(1994)EMBOJ.13:3245；Vaughan等(1996)Nat.Biotech.14:309；Winter EP0368 684B1)。已经使用多种淋巴样组织生成了未接触过抗原的或非免疫的抗原结合文库。这些文库中的一些可以通过商业途径购买，诸如那些由Cambridge Antibody Technology和Morphosys开发的文库(Vaughan等(1996)Nature Biotech14:309；Knappik等(1999)J.Mol.Biol.296:57)。然而，这些文库中的许多具有有限的多样性。

自噬菌体展示文库中鉴定和分离高亲和力抗体的能力在分离用于治疗用途的新抗体中是重要的。自文库中分离高亲和力抗体依赖于文库的容量、细菌细胞的生产效率、和文库的多样性。参见例如Knappik等(1999)J.Mol.Biol.296:57。由于抗体或抗原结合蛋白的不正确折叠和终止密码子的存在，文库的容量会因低效生产而缩小。如果抗体或抗原结合结构域没有得到正确折叠，那么在细菌细胞中的表达会受到抑制。可以通过突变可变/恒定界面的表面转角中的残基或选定的CDR残基来提高表达。(Deng等(1994)J.Biol.Chem.269:9533；Ulrich等(1995)PNAS,92:11907-11911；Forsberg等(1997)J.Biol.Chem.272:12430)。在细菌细胞中生成噬菌体抗体文库时，框架区的序列是提供正确折叠的一个因素。

生成抗体或抗原结合蛋白的多样性文库对于分离高亲和力抗体也是重要的。已经使用多种方法生成了在有限CDR中具有多样性的文库。参见例如Tomlinson(2000)Nature Biotech.18:989-994。CDR3区是受关注的，部分因为常常发现它们参与抗原结合。重链上的CDR3区的长度、序列和结构构象变化极大。

其他人也已经通过在每个位置使用所有20种氨基酸来随机化重链和轻链可变域CDR区而产生了多样性。认为使用所有20种氨基酸会产生变异抗体序列的大量多样性并增加鉴定到新抗体的机会。(Barbas(1994)PNAS91:3809；Yelton,DE(1995)J.Immunology155:1994；Jackson,J.R.(1995)J.Immunology 154:3310；Hawkins,RE(1992)J.Mol.Biology226:889)。

发明概述

本发明提供了单独的或与选择性阻断脑信号蛋白或VEGF结合的抗体复合的神经毡蛋白-1和神经毡蛋白-2(Nrp1和Nrp2)片段的晶体结构。Nrp采取出乎意料的结构域排列，其中a2、b1、和b2结构域形成一个紧密核心。抗体表位的位置与体外实验一起显示了VEGF和脑信号蛋白不直接竞争Nrp结合。基于由a1结构域介导的结晶Nrp二聚体，本发明另外为受体二聚化或配体结合提供了模型。

基于这些结果，一方面，本发明提供了一种由Nrp1_b1b2片段形成的晶体，其衍射x射线辐射以生成代表所述片段三维结构的衍射图样，该衍射图样大致具有晶胞常数 及空间群P2₁2₁2₁。

另一方面，本发明关注一种由Nrp1_a2b1b2片段形成的晶体，其衍射x射线辐射以生成代表所述片段三维结构的衍射图样，该衍射图样大致具有晶胞常数 及空间群P2₁。

又一方面，本发明关注Nrp1_b1片段与抑制血管内皮生长因子(VEGF)结合Nrp1的抗Nrp1^B抗体(YW107.4.87)的Fab片段之间形成的复合物的晶体，其中所述晶体其衍射x射线辐射以生成代表所述复合物三维结构的衍射图样，该衍射图样大致具有晶胞常数 及空间群H3。

又一方面，本发明关注一种由Nrp2_b1b2片段形成的晶体，其衍射x射线辐射以生成代表所述片段三维结构的衍射图样，该衍射图样大致具有晶胞常数 及空间群P2₁2₁2₁。

又一方面，本发明关注一种由Nrp2_a2b1b2片段形成的晶体，其衍射x射线辐射以生成代表所述片段三维结构的衍射图样，该衍射图样大致具有晶胞常数 及空间群P2₁。

另一方面，本发明关注Nrp2_ala2b1b2片段与抑制脑信号蛋白结合Nrp2的抗泛NrpA抗体(anti-panNrp^A antibody)的Fab片段之间形成的复合物的晶体，其中所述晶体其衍射x射线辐射以生成代表所述复合物三维结构的衍射图样，该衍射图样大致具有晶胞常数 及空间群C2。

本发明还关注Nrp2_ala2b1b2片段与抑制脑信号蛋白结合Nrp2的抗泛Nrp^A抗体的Fab片段之间形成的复合物的晶体，其中所述晶体其衍射x射线辐射以生成代表所述复合物三维结构的衍射图样，该衍射图样大致具有晶胞常数片段 及空间群P3₂21。

另一方面，本发明关注一种抗泛Nrp^A抗体或其片段，包含图7中所示轻链可变域序列和/或图8中所示重链可变域序列。

又一方面，本发明关注一种抗泛Nrp^AYW68.11抗体Fab片段，其包含图9A中所示序列。

又一方面，本发明关注一种抗泛Nrp^AYW68.11.26抗体Fab片段，其包含图9B中所示序列。

又一方面，本发明关注一种抗Nrp抗体，其与抗泛Nrp^A抗体竞争Nrp结合。

在一个实施方案中，所述抗Nrp抗体基本上与抗泛Nrp^A抗体结合相同表位。

在另一个实施方案中，所述抗Nrp抗体结合包含由Nrp2_ala2b1b2氨基酸序列的氨基酸残基Y39，Y45，P46，Q47，F72，N73P74，H75，F76，A133，和R138限定的界面至少一部分的表位。

在又一个实施方案中，所述抗Nrp抗体结合Nrp1和Nrp2二者。

在又一个实施方案中，所述抗Nrp抗体具有至少约0.10nM的对Nrp1和Nrp2二者的，或至少约0.15nM的对Nrp1和Nrp2二者的，或至少约0.20nM的对Nrp1和Nrp2二者的，或至少约0.25nM的对Nrp1和Nrp2二者的，或至少约0.30nM的对Nrp1和Nrp2二者的结合亲和力。

在另一个实施方案中，所述抗Nrp抗体阻断Sema3结合Nrp1和Nrp2二者。

在又一个实施方案中，所述抗Nrp抗体不阻断VEGF结合Nrp1或Nrp2。

在一个不同实施方案中，所述抗Nrp抗体在体外抑制脑信号蛋白生物学活性。

在另一个实施方案中，所述抗Nrp抗体在体内抑制脑信号蛋白生物学活性。

另一方面，本发明关注一种制备脑信号蛋白拮抗剂的方法，包括设计结合包含由Nrp2_ala2b1b2氨基酸序列的氨基酸残基Y39，Y45，P46，Q47，F72，N73P74，H75，F76，A133和R138限定的界面至少一部分的位点的分子，合成所述化合物，并证实所述化合物阻断脑信号蛋白结合Nrp1和Nrp2。

在一个实施方案中，所述拮抗剂不干扰VEGF结合Nrp1或Nrp2，而且所述方法可包括证实所述拮抗剂不干扰VEGF结合Nrp1或Nrp2的额外步骤。

在另一个实施方案中，所述方法进一步包括证实所述拮抗剂不干扰VEGF生物学活性的步骤。

所述拮抗剂可以例如选自下组：抗体，抗体片段，结合性多肽，肽，和非肽小分子，而且优选是抗体或抗体片段，其中所述抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)₂、scFv、(scFv)₂、dAb、线性抗体、单链抗体分子、微型抗体(minibody)、双抗体、和由抗体片段形成的多特异性抗体。

另一方面，本发明关注一种制备VEGF拮抗剂的方法，包括使用自Nrp1_b1片段与抗Nrp1^B抗体(YW107.4.87)的Fab片段之间的复合物形成的晶体衍生的三维结构来设计结合包含所述Nrp1^B抗体结合的表位至少一部分的位点的分子，合成所述化合物，并证实所述化合物抑制VEGF结合Nrp1，其中所述晶体其衍射x射线辐射以生成代表所述复合物三维结构的衍射图样，该衍射图样大致具有晶胞常数 及空间群H3。

在一个实施方案中，所述拮抗剂不干扰脑信号蛋白结合Nrp1，而且所述方法可额外包括证实这一点的步骤。

在另一个实施方案中，所述拮抗剂抑制VEGF生物学活性。

在又一个实施方案中，所述方法进一步包括证实所述拮抗剂抑制VEGF生物学活性的步骤。

在又一个实施方案中，其中所述拮抗剂抑制血管重构。

在又一个实施方案中，所述拮抗剂选自下组：抗体，抗体片段，结合性多肽，肽和非肽小分子，而且优选是抗体或抗体片段，其中所述抗体片段可以是例如Fab、Fab’、F(ab’)₂、scFv、(scFv)₂、dAb、线性抗体、单链抗体分子、微型抗体、双抗体、或由抗体片段形成的多特异性抗体。

本发明进一步关注一种用于治疗癌症的方法，包括对有需要的哺乳动物受试者施用有效量的通过本发明上述方法制备的VEGF拮抗剂。所述癌症可以例如选自下组：乳腺癌，结肠直肠癌，非小细胞肺癌，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，肾癌，前列腺癌，肝癌，头颈癌，黑素瘤，卵巢癌，间皮瘤，和多发性骨髓瘤。

在另一个实施方案中，所述治疗进一步包括第二治疗剂，其中所述第二治疗剂可以是但不限于选自下组的试剂：抗血管发生剂，抗肿瘤组合物，化疗剂和细胞毒剂，诸如别的VEGF拮抗剂。

在又一个实施方案中，所述别的VEGF拮抗剂是抗hVEGF抗体或其片段。

所述抗hVEGF抗体可以例如能够与抗体A4.6.1结合相同的VEGF表位，而且具体是bevacizumab或ranibizumab。

在其它实施方案中，所述第二治疗剂是选自下组的受体酪氨酸激酶抑制剂：vatalanib(PTK787)，erlotinibOSI-7904，ZD6474ZD6126(ANG453)，ZD1839，sunitinibsemaxanib(SU5416)，AMG706，AG013736，ImatinibMLN-518，CEP-701，PKC-412，Lapatinib(GSK572016)，AZD2171，sorafenibXL880，和CHIR-265。

本发明涉及下述各项。

1.一种由Nrp1_b1b2片段形成的晶体，其衍射x射线辐射以生成代表所述片段三维结构的衍射图样，该衍射图样大致具有晶胞常数b=66.7 及空间群P2₁2₁2₁。

2.一种由Nrp1_a2b1b2片段形成的晶体，其衍射x射线辐射以生成代表所述片段三维结构的衍射图样，该衍射图样大致具有晶胞常数b=68.2 及空间群P2₁。

3.Nrp1_b1片段与抑制血管内皮生长因子(VEGF)结合Nrp1的抗Nrp1^B抗体(YW107.4.87)的Fab片段之间形成的复合物的晶体，其中所述晶体衍射x射线辐射以生成代表所述复合物三维结构的衍射图样，该衍射图样大致具有晶胞常数 及空间群H3。

4.一种由Nrp2_b1b2片段形成的晶体，其衍射x射线辐射以生成代表所述片段三维结构的衍射图样，该衍射图样大致具有晶胞常数b=70.5 及空间群P2₁2₁2₁。

5.一种由Nrp2_a2b1b2片段形成的晶体，其衍射x射线辐射以生成代表所述片段三维结构的衍射图样，该衍射图样大致具有晶胞常数b=193 及空间群P2₁。

6.Nrp2_ala2b1b2片段与抑制脑信号蛋白结合Nrp2的抗泛Nrp^A抗体的Fab片段之间形成的复合物的晶体，其中所述晶体其衍射x射线辐射以生成代表所述复合物三维结构的衍射图样，该衍射图样大致具有晶胞常数a=148 及空间群C2。

7.Nrp2_ala2b1b2片段与抑制脑信号蛋白结合Nrp2的抗泛Nrp^A抗体的Fab片段之间形成的复合物的晶体，其中所述晶体其衍射x射线辐射以生成代表所述复合物三维结构的衍射图样，该衍射图样大致具有晶胞常数a=121 及空间群P3₂21。

8.一种抗泛Nrp^A抗体，其包含图7中所示轻链可变域序列和/或图8中所示重链可变域序列，或其片段。

9.一种抗泛Nrp^A YW68.11抗体Fab片段，其包含图9A中所示序列。

10.一种抗泛Nrp^A YW68.11.26抗体Fab片段，其包含图9B中所示序列。

11.一种抗Nrp抗体，其与抗泛Nrp^A抗体竞争结合Nrp。

12.项11的抗Nrp抗体，其基本上与抗泛Nrp^A抗体结合相同表位。

13.项11的抗Nrp抗体，其结合包含由Nrp2_ala2b1b2氨基酸序列的氨基酸残基Y39、Y45、P46、Q47、F72、N73、P74、H75、F76、A133和R138限定的界面至少一部分的表位。

14.项11的抗Nrp抗体，其结合Nrp1和Nrp2二者。

15.项14的抗Nrp抗体，其具有至少约0.10nM的对Nrp1和Nrp2二者的结合亲和力。

16.项14的抗Nrp抗体，其具有至少约0.15 nM的对Nrp1和Nrp2二者的结合亲和力。

17.项14的抗Nrp抗体，其具有至少约0.20 nM的对Nrp1和Nrp2二者的结合亲和力。

18.项14的抗Nrp抗体，其具有至少约0.25 nM的对Nrp1和Nrp2二者的结合亲和力。

19.项14的抗Nrp抗体，其具有至少约0.30 nM的对Nrp1和Nrp2二者的结合亲和力。

20.项14的抗Nrp抗体，其阻断Sema3结合Nrp1和Nrp2二者。

21.项20的抗Nrp抗体，其不阻断VEGF结合Nrp1或Nrp2。

22.项20或项21的抗Nrp抗体，其在体外抑制脑信号蛋白生物学活性。

23.项20或项2的抗Nrp抗体，其在体内抑制脑信号蛋白生物学活性。

24.一种制备脑信号蛋白拮抗剂的方法，包括设计结合包含由Nrp2_ala2b1b2氨基酸序列的氨基酸残基Y39、Y45、P46、Q47、F72、N73、P74、H75、F76、A133和R138限定的界面至少一部分的位点的分子，合成所述化合物，并证实所述化合物阻断脑信号蛋白结合Nrp1和Nrp2。

25.项24的方法，其中所述拮抗剂不干扰VEGF结合Nrp1或Nrp2。

26.项25的方法，进一步包括证实所述拮抗剂不干扰VEGF结合Nrp1或Nrp2的步骤。

27.项25的方法，进一步包括证实所述拮抗剂不干扰VEGF生物学活性的步骤。

28.项24的方法，其中所述拮抗剂选自：抗体，抗体片段，结合性多肽，肽和非肽小分子。

29.项28的方法，其中所述拮抗剂是抗体或抗体片段。

30.项29的方法，其中所述抗体片段选自：Fab，Fab’，F(ab’)₂，scFv，(scFv)₂，dAb，线性抗体，单链抗体分子，微型抗体，双抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。

31.一种制备VEGF拮抗剂的方法，包括使用自Nrp1_b1片段与抗Nrp1^B抗体(YW107.4.87)的Fab片段之间的复合物形成的晶体衍生的三维结构来设计结合包含所述Nrp1^B抗体结合的表位至少一部分的位点的分子，合成所述化合物，并证实所述化合物抑制VEGF结合Nrp1，其中所述晶体衍射x射线辐射以生成代表所述复合物三维结构的衍射图样，该衍射图样大致具有晶胞常数 及空间群H3。

32.项31的方法，其中所述拮抗剂不干扰脑信号蛋白结合Nrp1。

33.项32的方法，进一步包括证实所述拮抗剂不干扰脑信号蛋白结合Nrp1的步骤。

34.项31的方法，其中所述拮抗剂抑制VEGF生物学活性。

35.项34的方法，进一步包括证实所述拮抗剂抑制VEGF生物学活性的步骤。

36.项35的方法，其中所述拮抗剂抑制血管重构。

37.项35的方法，其中所述拮抗剂选自下组：抗体，抗体片段，结合性多肽，肽和非肽小分子。

38.项37的方法，其中所述拮抗剂是抗体或抗体片段。

39.项38的方法，其中所述抗体片段选自：Fab，Fab’，F(ab’)₂，scFv，(scFv)₂，dAb，线性抗体，单链抗体分子，微型抗体，双抗体和自抗体片段形成的多特异性抗体。

40.一种用于治疗癌症的方法，包括对有需要的哺乳动物受试者施用有效量的通过项31的方法制备的VEGF拮抗剂。

41.项40的方法，其中所述癌症选自下组：乳腺癌，结肠直肠癌，非小细胞肺癌，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，肾癌，前列腺癌，肝癌，头颈癌，黑素瘤，卵巢癌，间皮瘤和多发性骨髓瘤。

42.项41的方法，其中所述治疗进一步包括第二治疗剂。

43.项42的方法，其中所述第二治疗剂选自下组：抗血管发生剂，抗肿瘤组合物，化疗剂和细胞毒剂。

44.项43的方法，其中所述抗血管发生剂是别的VEGF拮抗剂。

45.项44的方法，其中所述别的VEGF拮抗剂是抗hVEGF抗体或其片段。

46.项45的方法，其中所述抗hVEGF抗体能够与抗体A4.6.1结合相同的VEGF表位。

47.项45的方法，其中所述抗hVEGF抗体是bevacizumab或ranibizumab。

48.项42的方法，其中所述第二治疗剂是选自下组的受体酪氨酸激酶抑制剂：vatalanib(PTK787)，erlotinibOSI-7904，ZD6474ZD6126(ANG453)，ZD1839，sunitinibsemaxanib(SU5416)，AMG706，AG013736，ImatinibMLN-518，CEP-701，PKC-412，Lapatinib(GSK572016)，AZD2171，sorafenibXL880和CHIR-265。

附图简述

表1–数据收集和精化统计

图1A和1B–VEGF不阻断Sema3A诱导的DRG神经元生长锥塌陷。图1A)轴突生长锥的图像。未处理的DRG具有大的、富含肌动蛋白的生长锥（箭头），其在添加Sema3A后显著缩小。以50μg/ml添加抗Nrp抗体。图1B)对Sema3A诱导的生长锥塌陷的定量。塌陷的生长锥的百分比通过对塌陷的和未塌陷的生长锥计数来计算（N=4个外植体每种条件）。误差条代表均值的标准误差。

图2A和2B–神经毡蛋白晶体结构的汇总。图2A)Nrp胞外域由串联的CUB(a1a2)、串联的凝血因子V/VIII(b1b2)、和一个MAM(c1)结构域构成。此报告中所呈现的七种晶体结构的卡通展示及下面列出的分辨极限。橙色球体指示a2结构域中结合的钙离子。图2B)人Nrp1和Nrp2的a1a2b1b2结构域的序列比对。二级结构元件指Nrp2-a1a2b1b2结构（蓝色，a1；绿色，a2；黄色，b1；红色，b2），而且是依照spermadhesin CUB结构域(Romero，A.等，Nat StructBiol4，783-8(1997))和凝血因子V C2结构域(Macedo-Ribeiro，S.等，Nature402，434-9(1999))所采用的规则命名的。以蓝色和黄色框式的残基分别描绘抗泛Nrp^A和抗Nrp1^B的抗体表位。以橙色着重显示的氨基酸指示a2中的Ca2+结合位点，而红色残基代表a1结构域中的推定Ca2+结合位点。绿色阴影的残基着重显示破坏Sema3A与Nrp1之间相互作用的氨基酸替代位置(Gu，C.等，J Biol Chem277，18069-76(2002))。此比对是用EsPript (Gouet，P.等，NucleiAcids Res31，3320-3(2003))生成的。

图3A至3C– 神经毡蛋白的整体结构域体系结构。图3A)与抗泛Nrp^A的Fab片段（浅橙色，重链；灰色，轻链）形成的复合物中Nrp2（蓝色，a1；绿色，a2；黄色，b1；红色，b2）的结构域组织。N-糖基化的残基以品红标示。图3B)Nrp1和Nrp2a2b1b2结构的条带展示；橙色球体着重显示了结合的钙离子。图3C)来自基于a2b1b2结构域的两种不同晶形的Nrp2/Fab复合物的重叠。注意a1结构域与a2b1b2区相比的较差重叠。所有结构图都是用PyMol(http://www.pymol.org)生成的。

图4A至4D–神经毡蛋白CUB结构域的分子详情。图4A)在a2b1b2结构中，a2结构域包括结合的钙离子（橙色）。Nrp a1（见图4C）和a2结构域缺少在spermadhesin(Romero等，见上文)中发现的b1链。图4B)Nrp1a2结构域的钙离子由三个带负电荷的氨基酸、两个主链羰基氧和水分子配位。这些相互作用在Nrp中是高度保守的（见图S2-A至S2-C和图S3）。图4C)（左图）氨基酸是依照埋藏在Nrp2/Fab界面处的溶剂可及表面百分比着色的（红色，75-100%；橙色，50-74%；黄色，25-49%）。抗泛Nrp^A与Nrp1和Nrp2起交叉反应，而且结构性表位的十四个残基中有十一个是相同的（黑色文本，相同；白色文本，不保守的；信号标示侧链指向a1蛋白质核心的残基）。以绿色描绘的残基代表Nrp1与Sema3A²³之间的相互作用所必需的氨基酸替代的位置。（右图）这些氨基酸替代的Cα原子标示为绿色球体。紫色阴影的Cα原子代表推定的钙结合位点。图4D)抗泛Nrp^A/Nrp2界面。Nrp2依照静电势显示为分子表面（红色，酸性；蓝色，碱性）。抗体接触残基以来自CDR H2、H3、和L3的芳香族残基为主。

图5A至5E–Nrp VEGF结合域和肝素结合域的特征。图5A) Nrp b1b2晶体结构（Nrp1，黄色(b1)和红色(b2)；Nrp2，灰色）的重叠。蓝色(Nrp1)和绿色(Nrp2)残基着重显示b2而非b1的“刺突”中的构象差异。图5B)以静电势对大鼠（PDB登录号2ORZ）(Vancer Kooi，C.W.，et al.，Proc Natl Acad Sci USA(2007))和人b1b2晶体结构的分子表面着色。黄色箭头标示由b1结构域中的“刺突”形成并代表大鼠结构(Vander Kooi等，见上文)中促吞噬肽(tuftsin)结合位点的酸性沟。绿色箭头标示肝素结合片的大致位置。图5C)将十二种Nrp（图S3）中b1b2结构域的相对序列保守性（绿色，100%；黄色，≥75%）绘制到人Nrp1 b1b2结构的表面上。两个高度保守的片以橙色描绘。以青色描绘的残基标示那些在抗Nrp1^B-Fab/b1复合物中接触Fab的残基。a2结构域（小麦色）是使用来自Nrp1的b1b2和a2b1b2结构域的重叠显示的。图5D)抗Nrp1^B-Fab/b1复合物的条带展示（黄色，b1；橙色，重链；灰色，轻链）。图5E)抗Nrp1^B/b1界面。b1结构域依照静电势卡通显示为分子表面；黄色箭头标示VEGF尾结合沟。只有CDR H3和L1接触b1。

图6A和6B–Nrp2结晶二聚体提示VEGF和脑信号蛋白结合的模型。图6A)Nrp2在Nrp2/Fab复合物的两种晶形中都形成鞍形二聚体。此图强调来自单斜晶形Fab复合物的Nrp2a1a2b1b2结构域。标示了推定的VEGF尾结合位点、肝素结合位点、和脑信号蛋白结合位点。图6B)VEGF/Nrp和脑信号蛋白/Nrp复合物的潜在模型，其基于晶体结构中Nrp a1介导的二聚体。

图7–抗泛Nrp^A克隆YW68.11和YW68.11.26的轻链可变域序列比对。

图8–抗泛Nrp^A克隆YW68.11和YW68.11.26的重链可变域序列比对。

图9A–人抗泛Nrp^AIgG1抗体YW68.11的完整序列。

图9B–人抗泛Nrp^AIgG1抗体YW68.11.26的完整序列。

表S1–用于进行结晶和防冻的条件。

图S1–抗Nrp抗体结合动力学分析。抗泛Nrp^A抗体的BIAcore动力学分析。于25°C在IgG固定化BIAcore传感器芯片上注射500nM每种人NRP蛋白的传感图证明了结合特异性。抗泛Nrp^A结合Nrp1和Nrp2a1a2b1b2，但不结合Nrp2b1b2结构域。

图S2-A至S2-C–Nrp CUB结构域包括保守的钙结合位点。图S2-A)Nrp1a2b1b2结构中钙离子周围的电子密度（最终2Fo-Fc图在1.5σ处定型）。图S2-B)Nrp2a2结构域的钙离子。图S2-C)描绘钙结合位点的三个带负电荷的氨基酸（橙色阴影）在来自Nrp1和Nrp2的CUB结构域中是保守的。

图S3–神经毡蛋白的序列比对。来自人、小鼠、大鼠、斑马鱼(BRARE)、蛙(XENLA)、和鸡Nrp1和Nrp2的a1a2b1b2结构域的全长序列比对。此图是使用与图2B相同的方案着色的，而且是用EsPript (Gouet P.等，见上文)生成的。

图S4-A至S4-C – Nrp1/促吞噬肽与b1/Fab结构之间的比较。图S4-A)在nrp1-b1/抗Nrp1^B-Fab复合物中，来自对称相关分子的重链的C-端尾（紫色）占据促吞噬肽结合位点（Nrp2，分子表面以静电势标示；橙色，抗体重链；灰色，抗体轻链）。图S4-B)促吞噬肽（绿色）在与大鼠Nrp1b1b2形成的复合物（PDB登录号2ORZ）(Vander Kooi，et al.，见上文)中的位置。图S4-C)图S4-A中着重显示的所述两个结构的重叠。抗体和促吞噬肽如先前的小图中那样着色，其中人Nrp1b1着黄色而大鼠Nrp1b1b2着青色。

图S5-A至S5-C–Nrp2二聚体界面。图S5-A)在单斜晶形结构中看到的Nrp2-a1a2b1b2/Fab二聚体条带展示。图S5-B)Nrp1-b1/抗Nrp1^B-Fab结构重叠到Nrp2/Fab晶体结构上。图S5-C)埋藏在a1/a1界面处的氨基酸依照二聚化时埋藏的溶剂可及表面百分比着色（红色，75-100%；橙色，50-74%；黄色，25-49%）。

发明详述

本发明涉及新的晶体结构、用于调控NRP介导的生物学活性的方法、和用于鉴定能够调控NRP介导的生物学活性的候选物的筛选测定法。

定义

“神经毡蛋白/(neuropilin)”或NRP指神经毡蛋白-1(NRP1)、神经毡蛋白-2(NRP2)及其同等型(isoform)和变体全体，如Rossignol等(2000)Genomics70:211-222中所述。神经毡蛋白是120-130kDa非酪氨酸激酶受体。有多种NRP-1和NRP-2剪接变体和可溶性同等型。神经毡蛋白的基本结构包含五个结构域：三个胞外结构域（a1a2、b1b2和c）、一个跨膜结构域、和一个胞质结构域。a1a2结构域与补体成分C1r和C1s(CUB)同源，其一般包含四个半胱氨酸残基，形成两个二硫键。b1b2结构域与凝血因子V和VIII同源。c结构域的中央部分称为MAM，因为它与跨膜肽酶(meprin)、A5和受体酪氨酸磷酸酶μ蛋白同源。a1a2和b1b2结构域负责配体结合，而c结构域对于同型二聚化或异型二聚化是至关重要的。Gu等(2002)J.Biol.Chem.277:18069-76；He andTessier-Lavigne(1997)Cell90:739-51。

“神经毡蛋白介导的生物学活性”一般指其中神经毡蛋白-1和/或神经毡蛋白-2发挥重大作用的生理性或病理性事件。此类活性的非限制性例子有胚胎神经系统发育或神经元再生、血管发生（包括血管造型）、肿瘤发生和肿瘤转移过程中的轴突导向。

术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体（包括全长单克隆抗体）、多克隆抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体）、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各抗体个体是相同的，除了可以以极小量存在的可能的天然存在突变形式外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。此外，与典型的包含针对不同决定簇（表位）的不同抗体的常规（多克隆）抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler等(1975)Nature256:495记载的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson等(1991)Nature352:624-628和Marks等(1991)J.Mol.Biol.222:581-597中记载的技术从噬菌体抗体库分离。

单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体（免疫球蛋白）以及此类抗体的片段，其中所述抗体重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567；Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855)。

非人（例如鼠）抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白（受体抗体）中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种（供体抗体）诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等(1986)Nature321:522-525；Riechmann等(1988)Nature332:323-329；Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596。

“物种依赖性抗体”指对来自第一哺乳动物物种的抗原的结合亲和力强于对来自第二哺乳动物物种的所述抗原同系物的亲和力的抗体。通常，物种依赖性抗体“特异性结合”人抗原（即结合亲和力(K_d)数值不超过大约1x10^-7M，优选不超过大约1x10^-8M，且最优选不超过大约1x10^-9M），但是对来自第二非人哺乳动物物种的所述抗原同系物的结合亲和力比对人抗原的结合亲和力弱至少大约50倍、或至少大约500倍、或至少大约1000倍。物种依赖性抗体可以是上文所定义的各种类型抗体中的任一种，但是优选人源化抗体或人抗体。

在用于本文时，“抗体突变体”或“抗体变体”指物种依赖性抗体的氨基酸序列变体，其中物种依赖性抗体的一个或多个氨基酸残基发生了修饰。此类突变体与物种依赖性抗体必然具有小于100%的序列同一性或相似性。在一个优选的实施方案中，抗体突变体所具有的氨基酸序列与物种依赖性抗体的重链或轻链可变域的氨基酸序列具有至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、最优选至少95%的氨基酸序列同一性或相似性。关于此序列的同一性或相似性在本文中定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，候选序列中与物种依赖性抗体残基相同（即相同残基）或相似（即根据共同侧链特性来自同一组的氨基酸残基，见下文）的氨基酸残基的百分比。N-末端、C-末端、或内部的延伸、删除、或插入可变域以外的抗体序列都不应视为影响序列同一性或相似性。

“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95%，最优选重量超过99%，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或优选的银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。

在用于本文时，“抗体可变域”指抗体分子的轻链和重链中包含互补决定区(CDR；即CDR1、CDR2、和CDR3)和框架区(FR)氨基酸序列的那部分。V_H指重链可变域。V_L指轻链可变域。依照本发明所使用的方法，归为CDR和FR的氨基酸位置可以依照Kabat(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987和1991))来限定。抗体或抗原结合片段的氨基酸编号方式也依照Kabat。

在用于本文时，术语“互补决定区(CDR；即CDR1、CDR2、和CDR3)指抗体可变域中其存在是抗原结合所必需的氨基酸残基。每个可变域通常具有三个CDR，鉴定为CDR1、CDR2和CDR3。每个互补决定区可以包含来自如Kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基（即大约是轻链可变域的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变域的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))和/或来自“高变环”的残基（即大约是轻链可变域的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变域的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothiaand Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。在有些情况中，互补决定区可以包含来自Kabat定义的CDR和高变环二者的氨基酸。例如，抗体4D5重链的CDRH1包含氨基酸26-35。

“框架区”（以下的FR）指可变域中CDR残基以外的残基。每个可变域通常具有四个FR，鉴定为FR1、FR2、FR3和FR4。如果CDR是依照Kabat定义的，那么轻链FR残基位于大约轻链残基1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)、和98-107(LCFR4)，而重链FR残基位于大约重链残基1-30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)、和103-113(HCFR4)。如果CDR包含来自高变环的氨基酸残基，那么轻链FR残基位于大约轻链残基1-25(LCFR1)、33-49(LCFR2)、53-90(LCFR3)、和97-107(LCFR4)，而重链FR残基位于大约重链残基1-25(HCFR1)、33-52(HCFR2)、56-95(HCFR3)、和102-113(HCFR4)。在有些情况中，在CDR包含来自Kabat定义的CDR和高变环二者的氨基酸时，FR残基将做相应的调整。例如，当CDRH1包含氨基酸H26-H35时，重链FR1残基位于1-25位，而FR2残基位于36-49位。

在用于本文时，“密码子集”指用于编码期望变异氨基酸的一套不同核苷酸三联体序列。可以通过例如固相合成来合成一套寡核苷酸，其包括呈现密码子集所提供的核苷酸三联体的所有可能组合并编码期望氨基酸组的序列。一种标准形式的密码子命名是IUB代码，其是本领域已知的且在本文中有记载。密码子集通常以3个斜体大写字母表示，例如NNK、NNS、XYZ、DVK等等。如此，“非随机密码子集”在用于本文时指编码部分、优选完全满足本文所述氨基酸选择标准的选定氨基酸的密码子集。在某些位置具有选定核苷酸“简并性”的寡核苷酸的合成是本领域众所周知的，例如TRIM法(Knappek等(1999)J.Mol.Biol.296:57-86)；Garrard和Henner(1993)Gene128:103)。此类具有某些密码子集的寡核苷酸集可以使用商品化核酸合成仪来合成(可购自例如Applied Biosystems, Foster City,CA)，或者可以通过商业途径获得(例如购自Life Technologies,Rockville,MD)。因此，一套具有特定密码子集的合成寡核苷酸通常包括具有不同序列（在整个序列中由密码子集所建立的差异）的多种寡核苷酸。寡核苷酸，在依照本发明使用时，具有容许与可变域核酸模板杂交的序列，而且还可以但非必须包含可用于例如克隆目的的限制酶位点。

“Fv”片段是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段。此区由紧密结合（该结合的本质可以是共价的，例如在scFv中）的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。正是在这种构造中，每个可变域的三个CDR相互作用而在V_H-V_L二聚体表面上确定了抗原结合位点。六个CDR或其子集共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域（或只包含对抗原特异性的三个CDR的半个Fv）也具有识别和结合抗原的能力，只是通常亲和力低于完整结合位点。

“Fab”片段包含轻链的可变域和恒定域及重链的可变域和第一恒定域(CH1)。F(ab')₂抗体片段包含一对Fab片段，这对Fab片段一般通过它们之间的铰链半胱氨酸在它们羧基末端附近共价连接。本领域还知道抗体片段的其它化学偶联形式。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，Fv多肽在V_H与V_L结构域之间还包含多肽接头，使得scFv能够形成结合抗原所需的结构。关于scFv的综述参见Pluckthun,在Rosenburg and Moore编的《The Pharmacology of MonoclonalAntibodies》第113卷中,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。

术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链（V_H及V_L）中包含相连的重链可变域(V_H)和轻链可变域(V_L)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP404,097；WO93/11161；Hollinger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448。

表述“线性抗体”指Zapata等(1995)ProteinEng,8(10):1057-1062中所描述的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联的Fd区段(V_H-C_H1-V_H-C_H1)，该区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的，或者是单特异性的。

在用于本文时，“文库”或“库”指众多抗体或抗体片段序列（例如本发明的多肽），或者编码这些序列的核酸，这些序列在根据本发明方法导入这些序列的变异氨基酸组合方面是不同的。

“噬菌体展示”是一种将变异多肽作为与外壳蛋白至少一部分的融合蛋白展示在噬菌体（例如丝状噬菌体）颗粒表面上的技术。噬菌体展示的效用在于能够对随机化蛋白质变体的大型文库快速且高效分选那些能以高亲和力与靶抗原结合的序列的实情。肽和蛋白质文库在噬菌体上的展示已经用于对数以百万计的多肽筛选那些具有特异性结合特性的多肽。多价噬菌体展示法已经用于展示小随机肽和小蛋白，其通过与丝状噬菌体的基因III或基因VIII融合来实现。Wells and Lowman(1992)Curr.Opin.Struct.Biol.3:355-362,及其中引用的参考文献。在单价噬菌体展示中，将蛋白质或肽文库与基因III或其一部分融合，并在存在野生型基因III蛋白时以低水平表达，使得噬菌体颗粒展示一个拷贝的融合蛋白或者不展示融合蛋白。亲合效应(avidity effect)相对于多价噬菌体得到了降低，使得分选基于内在的配体亲和力，而且使用噬菌粒载体，这简化了DNA操作。Lowman and Wells(1991)Methods:Acompanion to Methods in Enzymology3:205-0216。

“噬菌粒”是具有细菌复制起点（例如Co1E1）和噬菌体基因间区拷贝的质粒载体。噬菌粒可利用任何已知噬菌体，包括丝状噬菌体和λ类噬菌体。质粒一般也包含抗生素抗性的可选择标志物。克隆入这些载体的DNA区段可以像质粒一起而扩增。在给容纳这些载体的细胞提供生成噬菌体颗粒所必需的所有基因时，质粒的复制模式变成滚环复制，以生成质粒DNA的一条链的拷贝，并包装噬菌体颗粒。噬菌粒可形成感染性或非感染性噬菌体颗粒。此术语包括这样的噬菌粒，它们包含与异源多肽基因连接成基因融合物的噬菌体外壳蛋白基因或其片段，使得异源多肽展示在噬菌体颗粒的表面上。

术语“噬菌体载体”指包含异源基因且能够复制的双链复制型噬菌体。噬菌体载体具有容许噬菌体复制和噬菌体颗粒形成的噬菌体复制起点。噬菌体优选是丝状噬菌体，诸如M13、f1、fd、Pf3噬菌体或其衍生物，或者是λ类噬菌体，诸如λ、21、 、82、424、434等或其衍生物。

在用于本文时，“溶剂可及位置”指源抗体或抗原结合片段重链和轻链可变区中根据抗体或抗原结合片段的结构、结构系综(ensemble)和/或建模结构确定为潜在触及溶剂和/或接触分子（诸如抗体特异性抗原）的氨基酸残基位置。这些位置通常发现于CDR中和蛋白质外部上。如本文所定义的抗体或抗原结合片段的溶剂可及位置可使用本领域已知的多种算法来确定。优选的是，溶剂可及位置是使用来自抗体三维模型的坐标而确定的，优选使用计算法程序，诸如InsightII程序(Accelrys,San Diego,CA)。溶剂可及位置还可以使用本领域已知的算法来确定(例如Lee and Richards(1971)J.Mol.Biol.55,379和Connolly(1983)J.Appl.Cryst.16,548)。溶剂可及位置的确定可使用适于蛋白质建模的软件和自抗体得到的三维结构信息来进行。可用于这些目的的软件包括SYBYL Biopolymer Module软件(Tripos Associates)。一般和优选的是，若算法（程序）要求用户输入大小参数，计算中所使用的探针的“大小”设为半径大约1.4埃或更小。另外，Pacios(1994)Comput.Chem.18(4):377-386记载了使用供个人计算机用的软件确定溶剂可及区域和面积的方法。

“血管发生因子”或“血管发生剂”指刺激血管发育，例如促进血管发生(angiogenesis)、内皮细胞生长、血管稳定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生长因子。例如，血管发生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成员、PlGF、PDGF家族、成纤维细胞生长因子家族(FGF)、TIE配体（血管生成素）、ephrin、Del-1、酸性(aFGF)和碱性(bFGF)成纤维细胞生长因子、卵泡抑素(Follistatin)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)/散射因子(SF)、白介素-8(IL-8)、Leptin、Midkine、神经毡蛋白、胎盘生长因子、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血小板衍生生长因子尤其是PDGF-BB或PDGFR-β、Pleiotrophin(PTN)、Progranulin、Proliferin、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等。它还包括加速伤口愈合的因子，诸如生长激素、胰岛素样生长因子-I (IGF-I)、VIGF、表皮生长因子(EGF)、CTGF及其家族的成员、及TGF-α和TGF-β。参见例如Klagsbrun and D’Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53:217-39；Streit andDetmar(2003)Oncogene22:3172-3179；Ferrara和Alitalo(1999)NatureMedicine5(12):1359-1364；Tonini等(2003)Oncogene22:6549-6556(例如列举已知血管发生因子的表1)；Sato(2003)Int.J.Clin.Oncol.8:200-206。

“抗血管发生剂”或“血管发生抑制剂”指或直接或间接抑制血管发生(angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)、或不想要的血管通透性的小分子量物质、多核苷酸、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白、抗体、或其偶联物或融合蛋白。应当理解，抗血管发生剂包括那些结合并阻断血管发生因子或其受体的血管发生活性的药剂。例如，抗血管发生剂是上文定义的血管发生剂的抗体或其它拮抗剂，例如VEGF-A的抗体、VEGF-A受体（例如KDR受体或Flt-1受体)的抗体、抗PDGFR抑制剂诸如Gleevec^TM(Imatinib Mesylate）。抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂，例如血管他丁(angiostatin)、内皮他丁(endostatin)等。参见例如Klagsbrun and D’Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53:217-39；Streit and Detmar(2003)Oncogene22:3172-3179(例如列举恶性黑素瘤中抗血管发生疗法的表3)；Ferrara和Alitalo(1999)NatureMedicine5(12):1359-1364；Tonini等(2003)Oncogene22:6549-6556(例如列举已知抗血管发生因子的表2)；Sato(2003)Int.J.Clin.Oncol.8:200-206(例如列举临床试验中所使用的抗血管发生剂的表1)。

术语“VEGF”和“VEGF-A”在用于本文时指165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子及相关的121个、189个和206个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如Leung等(1989)Science246:1306和Houck等(1991)Mol.Endocrin,5:1806所述，及其天然存在等位基因形式和加工形式。术语“VEGF”还指来自非人物种诸如小鼠、大鼠或灵长类动物的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示小鼠VEGF，等等。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的截短形式多肽。本申请中可能通过例如“VEGF(8-109)”、“VEGF(1-109)”或“VEGF₁₆₅”来鉴别任何此类形式VEGF。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示编号。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸（甲硫氨酸）也是天然VEGF中的第17位（甲硫氨酸）。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-1受体的结合亲和力。

“VEGF抗体”指以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体。优选的是，本发明的抗VEGF抗体可在靶向和干预其中涉及VEGF活性的疾病或疾患时用作治疗剂。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同系物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不会结合其它生长因子，诸如PlGF、PDGF或bFGF。一种优选的抗VEGF抗体是与杂交瘤ATCCHB10709所生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体。更优选的是，抗VEGF抗体是依照Presta等,Cancer Res.57:4593-4599(1997)生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体，包括但不限于称为贝伐单抗(bevacizumab；BV；Avastin^TM)的抗体。

抗VEGF抗体“贝伐单抗(Bevacizumab,BV)”，也称为“rhuMAb VEGF”或是依照Presta等,Cancer Res.57:4593-4599(1997)生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体。它包含突变的人IgG1框架区和来自阻断人VEGF结合其受体的鼠抗hVEGF单克隆抗体A4.6.1的抗原结合互补决定区。贝伐单抗大约93%的氨基酸序列，包括大部分框架区，衍生自人IgG1，而大约7%的序列衍生自小鼠抗体A4.6.1。贝伐单抗具有约149,000道尔顿的分子量且是糖基化的。

“VEGF拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性（包括但不限于其与一种或多种VEGF受体的结合）的分子。VEGF拮抗剂包括但不限于抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体结合的受体分子及衍生物、抗VEGF受体抗体和VEGF受体拮抗剂诸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂。如本文中所使用的，术语“VEGF拮抗剂”明确包括结合神经毡蛋白-1和/或神经毡蛋白-2(Nrp-1和/或Nrp-2)且能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性的分子，包括抗体、抗体片段、其它结合性多肽、肽、和非肽小分子，包括但不限于抗Nrp1和抗Nrp2抗体及与Nrp1和Nrp2起交叉反应的抗体，前提是它们能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性。如此，术语“VEGF活性”明确包括神经毡蛋白介导的VEGF生物学活性（如上文所定义的）。

“脑信号蛋白拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰脑信号蛋白活性（包括但不限于其与一种或多种脑信号蛋白受体的结合）的分子。脑信号蛋白拮抗剂包括但不限于抗脑信号蛋白抗体及其抗原结合片段、特异性结合脑信号蛋白由此使其隔绝与一种或多种受体结合的受体分子及衍生物、抗脑信号蛋白受体抗体和脑信号蛋白受体拮抗剂诸如脑信号蛋白的小分子抑制剂。如本文中所使用的，术语“脑信号蛋白拮抗剂”明确包括结合神经毡蛋白-1和/或神经毡蛋白-2(Nrp-1和/或Nrp-2)且能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰脑信号蛋白活性的分子，包括抗体、抗体片段、其它结合性多肽、肽、和非肽小分子，包括但不限于抗Nrp1和抗Nrp2抗体及与Nrp1和Nrp2起交叉反应的抗体，前提是它们能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰脑信号蛋白活性。如此，术语“脑信号蛋白活性”明确包括神经毡蛋白介导的第3类脑信号蛋白生物学活性（如上文所定义的）。所述生物学活性包括例如胚胎神经系统发育和神经元再生期间的神经突生长抑制效应。

“治疗”或“处理”指治疗性处理和预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者包括早就患有病症的受试者以及要预防病症的受试者。

“病症”指任何会受益于治疗的疾患。例如，患有或需要预防异常血管发生（过度的、不当的或失控的血管发生）或血管通透性的哺乳动物。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。本文中待治疗的病症的非限制性例子包括恶性和良性肿瘤；非白血病和淋巴样恶性肿瘤；神经元、神经胶质、星细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚腔病症；及炎性、血管发生性和免疫学病症。

异常血管发生发生于病情中的或引起病情的新血管生长过度、不足或不当（例如从医学观点看不良的血管发生位置、时间或启动）时。过度的、不当的或失控的血管发生发生于有促成病情恶化或引起病情的新血管生长时，诸如癌症尤其是血管化实体瘤和转移瘤（包括结肠癌、肺癌（尤其是小细胞肺癌、或前列腺癌），由眼部新血管形成引起的疾病尤其是糖尿病性失明、视网膜病变、原发性糖尿病性视网膜病变(primarily diabetic retinopathy)或年龄相关黄斑变性(AMD)，银屑病、银屑病关节炎、成血管细胞瘤诸如血管瘤；炎性肾病，诸如肾小球肾炎，尤其是膜增生性肾小球肾炎、溶血性尿毒综合征(haemolytic uremic syndrome)、糖尿病肾病或高血压肾硬化；各种炎性疾病，诸如关节炎，尤其是类风湿性关节炎、炎性肠病、银屑病、结节病、动脉硬化和移植后发生的疾病、子宫内膜异位症或慢性哮喘，及超过70种其它疾患。新血管可供应患病组织，破坏正常组织，而且，在癌症的情况中，新血管可容许肿瘤细胞逃入循环并停留在其它器官中（肿瘤转移）。不足的血管发生发生于有不足血管生长促成病情恶化时，例如在诸如冠状动脉疾病、中风和伤口愈合迟缓的疾病中。此外，溃疡、中风和心脏病发作可源自没有自然愈合通常所要求的血管发生。本发明设想了治疗那些有风险发生上述疾病的患者。

作为接受本发明抗体或其它分子的候选者的其他患者具有或者有风险发生维管组织(fibrovascular tissue)异常增殖、酒渣鼻（红斑痤疮）、获得性免疫缺陷综合征、动脉阻塞、特应性角膜炎、细菌性溃疡、贝切特氏病(Bechetsdisease)、血液传播的肿瘤(blood borne tumor)、颈动脉阻塞性疾病、脉络膜新血管形成、慢性炎症、慢性视网膜剥离、慢性葡萄膜炎、慢性玻璃体炎、接触镜佩戴过度、角膜移植物排斥、角膜新血管形成、角膜移植物新血管形成、克罗恩氏病(Crohn's disease)、伊尔斯病(Eales disease)、流行性角膜结膜炎、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、高粘滞综合征、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、白血病、脂质变性、莱姆氏病(Lyme's disease)、边缘角质层分离(marginal keratolysis)、莫伦溃疡(Mooren ulcer)、除麻风以外的分枝杆菌感染、近视、眼部新血管疾病、眼窝、奥-韦二氏综合征(Osler-Webersyndrome)（奥斯勒-韦伯-朗迪(Osler-Weber-Rendu)病）、骨关节炎、佩吉特氏病(Pagets disease)、扁平部睫状体炎(pars planitis)、类天疱疮、phylectenulosis、多动脉炎、激光后并发症(post-laser complication)、原生动物感染、弹性假黄色瘤、翼状胬肉(pterygium)、干燥性角膜炎、放射状角膜切开术、视网膜新血管形成、早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生、类肉瘤/结节病(sarcoid)、巩膜炎、镰状细胞贫血、斯耶格伦氏综合征(Sogrens syndrome)、实体瘤、斯塔加特病(Stargarts disease)、约-斯病(Steven's Johnson disease)、上缘角膜炎(superior limbic keratitis)、梅毒、全身性狼疮、特里昂氏边缘变性(Terrien's marginal degeneration)、弓形虫病、外伤、尤因肉瘤(Ewing sarcoma)的肿瘤、成神经细胞瘤的肿瘤、骨肉瘤的肿瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、溃疡性结肠炎、静脉阻塞、维生素A缺乏和韦格纳结节病(Wegenerssarcoidosis)、与糖尿病有关的不良血管发生、寄生虫病、异常伤口愈合，外伤、损伤或手术后肥大、毛发生长抑制、排卵和黄体形成抑制、子宫中胚胎发育抑制和植入抑制。

抗血管发生疗法可用于以下各项的一般治疗：移植物排斥、肺部炎症、肾病综合征、先兆子痫、心包积液（诸如与心包炎有关的）和胸腔积液、特征为不良血管通透性的疾病和病症，例如与脑瘤有关的水肿、与恶性肿瘤有关的腹水、梅格斯氏(Meigs)综合征、肺部炎症、肾病综合征、心包积液、胸腔积液、与心血管疾病有关的通透性，诸如心肌梗死和中风后的疾患，诸如此类。

依照本发明的其它血管发生依赖性疾病包括血管纤维瘤（倾向于出血的异常血管）、新生血管性青光眼（眼中的血管生长）、动静脉畸形（动脉与静脉之间的异常联络）、不连接的骨折（不会愈合的骨折）、动脉粥样硬化斑块（动脉的硬化）、脓性肉芽肿（由血管构成的普通皮肤损伤）、硬皮病（结缔组织疾病的一种形式）、血管瘤（由血管构成的肿瘤）、沙眼（第三世界失明的第一位原因）、血友病性关节、血管粘连和肥厚性瘢痕（异常瘢痕形成）。

术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、肺癌（包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鳞癌）、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric orstomach cancer)（包括胃肠癌）、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝肉瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney or renalcancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、及各种类型的头和颈癌，以及B细胞淋巴瘤（包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小无核裂细胞性NHL、贮积病(bulky disease) NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症）、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及与瘢痣病(phakomatoses)、水肿（诸如与脑瘤有关的）和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖。

术语“抗肿瘤组合物”指可用于治疗癌症的组合物，其包含至少一种活性治疗剂，例如“抗癌剂”。治疗剂（抗癌剂）的例子包括但不限于例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、放射疗法中所使用的药剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其它用于治疗癌症的药剂诸如抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂（例如酪氨酸激酶抑制剂）、HER1/EGFR抑制剂（例如erlotinib (Tarceva^TM)、血小板衍生生长因子抑制剂（例如Gleevec^TM(Imatinib Mesylate)）、COX-2抑制剂（例如塞来考昔(celecoxib)）、干扰素、细胞因子、能与ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受体中的一种或多种靶物结合的拮抗剂（例如中和性抗体）、TRAIL/Apo2、及其它生物活性和有机化学剂等。本发明还包括它们的组合。

术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素（例如I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰和Re¹⁸⁶）、化疗剂、和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素或其片段。

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)（尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)）；喜树碱(camptothecin)（包括合成类似物托泊替康(topotecan)）；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065（包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物）；隐藻素类(cryptophycins)（特别是隐藻素1和隐藻素8）；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin（包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1）；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)（例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew(1994)Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186)；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicinA；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团）、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)（包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星）、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2''-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)（尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin)）；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇类(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel) (Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANE^TM不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白改造纳米颗粒剂型帕利他塞(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)和多西他塞(doxetaxel)Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar,CPT-11)（包括伊立替康及5-FU和亚叶酸的治疗方案）；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸类(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；亚叶酸(leucovorin)(LV)；奥沙利铂(oxaliplatin)，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如erlotinib(Tarceva^TM))和VEGF-A的、降低细胞增殖的抑制剂；及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物。

该定义还包括作用于调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂诸如抗雌激素类和选择性雌激素受体调控物类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)（包括他莫昔芬）、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)；抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏罗唑(vorozole)、来曲唑(letrozole)和阿那曲唑(anastrozole)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)（1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物）；反义寡核苷酸，特别是抑制涉及异常(abherant)细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf和H-Ras；核酶，诸如VEGF表达抑制剂（例如核酸）和HER2表达抑制剂；疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如疫苗、疫苗和疫苗；rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；长春瑞滨(Vinorelbine)和埃斯波霉素(Esperamicins)(见美国专利No.4,675,187)；及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物。

术语“前体药物”在用于本申请时指与母药(parent drug)相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的药用活性物质的前体或衍生物形式。参见例如Wilman(1986)“Prodrugs in CancerChemotherapy”,Biochemical Society Transactions,14,pp.375-382,615thMeeting Belfast和Stella等(1985)“Prodrugs:AChemical Approach to TargetedDrug Delivery”, Directed Drug Delivery, Borchardt等,编,pp.247-267,HumanaPress。本发明的前体药物包括但不限于含磷酸盐/酯前体药物、含硫代磷酸盐/酯前体药物、含硫酸盐/酯前体药物、含肽前体药物、D-氨基酸修饰前体药物、糖基化前体药物、含β-内酰胺前体药物、含任选取代苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代苯乙酰胺的前体药物、可转化为更具活性而无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物。可衍生为本发明使用的前体药物形式的细胞毒性药物的例子包括但不限于上文描述的那些化疗剂。

能用脑信号蛋白拮抗剂治疗的疾病和疾患包括但不限于神经病学疾病和要求神经再生的或受益于神经再生的疾病。

“小分子”在本文中定义为具有低于约500道尔顿的分子量。

“分离的”核酸分子指已经鉴定且与抗体核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中时的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括通常表达该抗体的细胞中所包含的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。

表述“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。

若一段核酸与另一段核酸序列处于功能性相互关系中，则它是“可操作连接的”。例如，若前序列(presequence)或分泌前导(secretory leader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein)，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。一般而言，“可操作连接的”意味着相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可以通过在方便的限制性位点处的连接来实现。若没有此类位点，则依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。

在用于本文时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，而且所有此类名称包括后代。如此，词语“转化子”和“（经）转化细胞”包括原代受试细胞及由其衍生的培养物，不管传代的次数。还应理解，所有后代在DNA内容上可能不是精确相同的，这是由于有意或无意的突变。包括与最初对转化细胞所筛选的具有相同功能或生物学活性的突变后代。在意指不同的名称时，上下文会有清楚表述。

本发明的实施方式

基于结构域体系结构和功能特性，通常将Nrp的胞外结构域分出三个功能单元：a1a2，b1b2，和c，分别代表它们主要的脑信号蛋白结合、VEGF结合、和二聚化区(Ellis，L.M.，Mol Cencer Ther5，1099-107(2006))。虽然结构－功能研究描绘了神经毡蛋白功能的总体结构域要求，但是这些受体/配体复合物的分子细节仍然了解很少。至今，关于Nrp的结构信息限于Nrp1的b1b2结构域(Vander Kooi等，见上文；Lee，C.等，J Biol Chem 281，5702-10(2006))。与Tuftsin（一种与VEGF165的C末端同源的四肽）复合的Nrp1 b1b2的晶体结构提供了关于Nrp与其结合配偶VEGF的相互作用的第一手结构信息(VanderKooi，et al.，见上文；von Wronski，M.A.，et al.，J. Biol Chem 281，5702-10(2006))。

本发明提供了与能在体外阻断Sema3结合Nrp1和Nrp2二者的抗体的Fab片段复合的Nrp2a1a2b1b2的晶体结构。还比较和对比了这两种Nrp同等型(isoforms)的a2b1b2和b1b2片段的结构。另外，还提供和评估了与最近描述的在体内特异性抑制VEGF165结合Nrp1的噬菌体衍生抗体的Fab片段组合的Nrp1的b1结构域的结构(Liang，W.C.，J Mol Biol 366，815-29(2007)；Pan，Q.等，Cancer Cell 11，53-67(2007))。总之，这些结构呈现了Nrp胞外结构域一大部分的详细画面，并为VEGF和脑信号蛋白结合提出了模型。基于两种不同晶形中存在的Nrp2二聚体，对Nrp二聚化和配体结合提出了新的机制。

在下文实施例中提供了结晶学研究的详情。在本文中和在实施例1中描述了用于生成抗NRP抗体的一般方法。

抗NRP抗体的生成

本发明包括抗NRP抗体的生成和使用。产生抗体的示例性方法在以下章节中有更详细的描述。

用衍生自哺乳动物物种的NRP（例如NRP1和/或NRP2）抗原选出抗NRP抗体。抗原优选是人NRP(hNRP)。然而，来自其它物种的NRP，诸如小鼠NRP(mNRP)，也可用作靶抗原。来自各种哺乳动物物种的NRP抗原可分离自天然来源。在其它实施方案中，抗原是重组生产的或者是利用本领域已知的其它合成方法而制备的。

所选的抗体通常将具有足够强的针对NRP抗原的结合亲和力。例如，所述抗体结合hNRP的Kd值可不超过约5nM，优选不超过约2nM，而更优选不超过约500pM。例如，抗体亲和力可由基于表面等离振子共振的测定法(如实施例所述的BIAcore测定法)；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测定法(如RIA的)来测定。

而且，所述抗体可进行其它生物学活性测定法，如，用以评估其作为治疗剂的有效性。此类测定法是本领域已知的，而且依赖于靶抗原并意图用于抗体。实例包括HUVEC抑制测定法(如下文实施例所述的)；肿瘤细胞生长抑制测定法(如例如WO89/06692所述的)；抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)测定法(美国专利5,500,362);和激动剂活性或造血作用测定法(参见WO95/27062)。

为了筛选能结合感兴趣的抗原上的特定表位的抗体，可进行常规的交叉阻断测试，如Antibodis,A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane (1988)所述的。另外，可进行表位作图，如Champe等(1995)J.Biol.Chem.270:1388-1394所述的，来确定抗体是否结合感兴趣的表位。

从合成的抗体噬菌体文库中产生抗NRP抗体

在一个优选的实施方案中，利用独特的噬菌体展示法来选择抗NRP抗体。该方法包括产生基于单个框架模板的合成抗体噬菌体文库，设计可变域内的足够的多样性，展示具有多样化可变域的多肽，选择对靶NRP抗原具有高亲和力的候选抗体，和分离所选的抗体。

噬菌体展示方法的详情可在例如2003年12月11日公开的WO03/102157中找到。

在一个方面，抗体文库可通过在抗体可变域的至少一个CDR中突变溶剂可及的和/或高度多变的位置来产生。一些或全部CDR可用本文提供的方法来突变。在一些实施方案中，优选突变CDRH1、CDRH2和CDRH3中的位置以形成单个文库或突变CDRL3和CDRH3中的位置以形成单个文库或突变CDRL3和CDRH1、CDRH2和CDRH3中的位置以形成单个文库，由此产生多样的抗体文库。

例如，可产生这样的抗体可变域文库，其在CDRH1、CDRH2和CDRH3中溶剂可及的和/或高度多变的位置上有突变。产生的另一种文库在CDRL1、CDRL2和CDRL3中有突变。这些文库也可互相结合使用以产生具有期望亲和力的结合物。例如，在一或多轮选择对靶抗原结合的重链文库后，在其它轮次的选择中可将轻链文库替换入重链结合物群中以提高结合物的亲和力。

文库优选通过用重链序列可变区CDRH3区中的变异氨基酸替代原始氨基酸来产生。所得文库可包含多种抗体序列，其中序列多样性主要位于重链序列的CDRH3区中。

在一个方面，文库在人源化抗体4D5序列、或人源化抗体4D5序列的框架氨基酸序列的背景中产生。所述文库优选通过用DVK密码子集编码的氨基酸至少替代重链残基95-100a来产生，其中DVK密码子集用于编码这些位置中每个位置的变异氨基酸集。可用于产生这些替代的寡核苷酸集的例子包括序列(DVK)7。在一些实施方案中，文库通过用DVK和NNK两个密码子集编码的氨基酸替代残基95-100a来产生。可用于产生这些替代的寡核苷酸集的例子包括序列(DVK)₆(NNK)。在另一个实施方案中，文库通过用DVK和NNK两个密码子集编码的氨基酸替代残基95-100a来产生。可用于产生这些替代的寡核苷酸集的例子包括序列(DVK)₅(NNK)。可用于产生这些替代的寡核苷酸集的另一个例子包括序列(NNK)₆。根据本文所述标准，本领域技术人员可确定合适寡核苷酸序列的其它例子。

在另一个实施方案中，利用不同的CDRH3设计来分离高亲和力结合物和分离针对各种表位的结合物。该文库中产生的CDRH3的长度范围是11至13个氨基酸，尽管也可产生不同于此的长度。通过用NNK、DVK和NVK密码子集也可拓展H3多样性，以及在N和/或C-末端处的更有限的多样性。

CDRH1和CDRH2中也可产生多样性。CDR-H1和H2多样性的设计遵循目标为模拟所述带有如下修饰的天然抗体全集的策略，所述修饰使多样性较前述设计更紧密地与天然多样性相匹配。

对于CDRH3中的多样性，可分开构建多个文库，它们具有不同长度的H3，然后组合起来以选择针对靶抗原的结合物。合并多个文库并用前述和本文下述的固体支持物选择和溶液分选法来选择。可采用多种选择策略。例如，一种变化涉及在结合至固相的靶物上选择，然后分选可能在融合多肽上存在的标签(如抗gD标签)，然后再一次在结合至固相的靶物上分选。或者，文库可首先在结合至固相表面的靶物上选择，然后用靶抗原浓度逐渐减低的溶液相结合来分选所洗脱的结合物。利用不同分选方法的组合来最低限度地只选择高度表达的序列并选择许多不同的高亲和力克隆。

针对靶NRP抗原的高亲和力结合物可由文库分离。H1/H2区中的有限多样性可降低简并性约10⁴至10⁵倍并允许为更多高亲和力结合物提供更大的H3多样性。利用在CDRH3中具有不同类型多样性的文库(如利用DVK或NVT)可分离能与靶抗原的不同表位结合的结合物。

对于如上所述合并的文库中分离的结合物，已经发现亲和力可通过提供轻链中的有限多样性来进一步提高。在该实施方案中，轻链多样性如下产生，在CDRL1中：氨基酸第28位由RDT编码；氨基酸第29位由RKT编码；氨基酸第30位由RVW编码；氨基酸第31位由ANW编码；氨基酸第32位由THT编码；任选的，氨基酸第33位由CTG编码；在CDRL2中：氨基酸第50位由KBG编码；氨基酸第53位由AVC编码；任选地，氨基酸第55位由GMA编码；在CDRL3中：氨基酸第91位由TMT或SRT或这两者编码；氨基酸第92位由DMC编码；氨基酸第93位由RVT编码；氨基酸第94位由NHT编码；和氨基酸第96位由TWT或YKG或这两者编码。

在另一个实施方案中，产生在CDRH1、CDRH2和CDRH3区中具有多样性的一个或多个文库。在该实施方案中，用各种长度的H3区并主要用密码子集XYZ和NNK或NNS来产生CDRH3中的多样性。用各寡核苷酸形成文库并合并，或者合并寡核苷酸来形成文库子集。该实施方案的文库可针对结合至固相的靶物进行分选。分离自多次分选的克隆可利用ELISA测定法来筛选特异性和亲和力。对于特异性，所述克隆可以针对期望靶抗原以及其它非靶抗原进行筛选。然后，在溶液结合竞争ELISA测定法或点竞争测定法中对那些针对靶NRP1抗原的结合物筛选那些结合物。可以用如上所述制备的XYZ密码子集由所述文库分离高亲和力结合物。可方便地在细胞培养中以高产率将这些结合物制备成抗体或抗原结合片段。

在一些实施方案中，可能希望产生在CDRH3区长度方面具有更大多样性的文库。例如，可能希望产生CDRH3区的长度范围为约7至19个氨基酸的文库。

由这些实施方案中的文库分离的高亲和力结合物可方便地在细菌和真核细胞培养中以高产率产生。可设计载体以方便地去除如下序列如gD标签、病毒外壳蛋白成分序列，和/或增加恒定区序列来高产率地产生全长抗体或抗原结合片段。

可以将CDRH3中有突变的文库与包含不同型式的其它CDR（例如CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1和/或CDRH2）的文库组合。因此，例如，在一个实施方案中，将CDRH3文库与CDRL3文库组合，所述CDRL3文库用预先确定的密码子集在第28、29、30、31、和/或32位有变异氨基酸的人源化4D5抗体序列的背景中产生。在另一个实施方案中，将CDRH3有突变的文库与包含变异CDRH1和/或CDRH2重链可变域的文库组合。在一个实施方案中，CDRH1文库用第28、30、31、32和33位有变异氨基酸的人源化抗体4D5序列产生。CDRH2文库可用预先确定的密码子集用第50、52、53、54、56和58位有变异氨基酸的人源化抗体4D5序列产生。

抗NRP抗体突变体

可进一步修饰噬菌体文库产生的抗NRP抗体以产生抗体突变体，所述突变体具有比亲本抗体改善了的物理、化学和/或生物学性质。当所用的测定法是生物学活性测定法时，优选抗体突变体在所选测定法中的生物学活性比亲本抗体在该测定法中的生物学活性好至少约10倍，优选好至少约20倍，更优选好至少约50倍，有时好至少约100倍或200倍。例如，优选抗NRP1抗体突变体针对NRP的结合亲和力比亲本抗NRP抗体的结合亲和力强至少约10倍，优选强至少约20倍，更优选强至少约50倍，有时强至少约100倍或200倍。

为了产生抗体突变体，将一处或多处氨基酸改变(如替代)导入亲本抗体的一个或多个高变区。或者/另外，可将框架区残基的一处或多处改变（如替代）导入亲本抗体，这些改变导致抗体突变体针对来自第二哺乳动物物种的抗原的结合亲和力有所改善。要修饰的框架区残基的实例包括那些直接非共价结合抗原的(Amit等(1986)Science233:747-753)；相互作用于/影响CDR构象的(Chothia等(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)；和/或参与V_L-V_H界面的(EP239400B1)的残基。在某些实施方案中，一个或多个这类框架区残基的修饰导致抗体针对来自第二哺乳动物物种的抗原的结合亲和力有所增强。例如，在本发明的该实施方案中，可改变约1个至约5个框架残基。有时，这可足以产生适用于临床前试验中的抗体突变体，甚至其中没有高变区残基被改变。可是通常，所述抗体突变体将包含别的高变区改变。

改变的高变区残基可以是随机改变的，尤其是在其中亲本抗体的起始结合亲和力使得这类随机产生的抗体突变体可方便地被筛选出来。

可用于生成此类抗体突变体的一种方法称作“丙氨酸扫描诱变”(Cunningham and Wells(1989)Science244:1081-1085)。这里，一个或多个高变区残基用丙氨酸或多丙氨酸残基替代，以影响氨基酸与来自第二哺乳动物物种的抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它突变，推敲那些对替代展现出功能敏感性的高变区残基。如此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但是突变本身的性质不需要预先决定。如本文所述对如此生成的丙氨酸突变体筛选它们的生物学活性。

通常，从保守替代诸如下文显示在标题“优选替代”下的那些开始。如果此类替代导致生物学活性（例如结合亲和力）的改变，那么可以引入下表中称为“例示替代”的更实质性改变，或如下文中关于氨基酸种类的进一步描述，并筛选产物。

优选替代：

对抗体生物学特性的甚至更实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来完成：(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。基于共同的侧链特性，将天然存在残基如下分组：

(1)疏水性的：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；

(2)中性、亲水性的：cys、ser、thr、asn、gln；

(3)酸性的：asp、glu；

(4)碱性的：his、lys、arg；

(5)影响链取向的残基：gly、pro；及

(6)芳香族的：trp、tyr、phe。

非保守替代将需要用这些类别之一的一个成员替换另一个类别的。

在另一个实施方案中，利用噬菌体展示（见上），对为修饰而选择的位点进行亲和力成熟。

编码氨基酸序列突变体的核酸分子由本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于，寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变、和盒式诱变早先制备的突变或非突变型式的亲本抗体。制备突变体的优选方法是定点诱变(参见例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488)。

在某些实施方案中，抗体突变体仅有单个高变区残基被替代。在其它实施方案中，有亲本抗体的两个或更多个高变区残基被替代，如约2个至约10个高变区被替代。

通常，生物学特性得到改善的抗体突变体所具有的氨基酸序列与亲本抗体重链或轻链可变域的氨基酸序列有至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，和最优选至少95%的氨基酸序列同一性或相似性。关于此序列的同一性或相似性在本文中定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，候选序列中与亲本抗体残基相同（即相同残基）或相似（即根据共同侧链特性来自同一组的氨基酸残基，见上文）的氨基酸残基的百分比。N-末端、C-末端、或内部的延伸、删除、或插入可变域以外的抗体序列都不应视为影响序列同一性或相似性。

产生抗体突变体后，测定该分子相对于亲本抗体的生物学活性。如上所示，这可包括测定抗体的结合亲和力和/或其它生物学活性。在本发明的一个优选实施方案中，制备一组抗体突变体并筛选针对抗原（诸如NRP1或其片段）的结合亲和力。任选将该初始筛选中选出的一个或多个抗体突变体进行一种或多种其它生物学活性测定法以确证结合亲和力增强的抗体突变体是真正有用的，例如可用于临床前研究。

这样选出的抗体突变体可进一步修饰，修饰时常取决于抗体的预期用途。此类修饰可包括进一步改变氨基酸序列，融合异源多肽和/或共价修饰，诸如下文所详述的那些。对于氨基酸序列改变，示例性的修饰上文有详述。例如，也可替代任何不涉及保持抗体突变体正确构象的半胱氨酸残基，一般替代为丝氨酸，用以改善所述分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反地，可向抗体中加入半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是在抗体是抗体片段，诸如Fv片段时)。另一类氨基酸突变体具有改变的糖基化模式。这可通过删除抗体中发现的一个或多个碳水化合物模块和/或添加不存在于抗体中的一个或多个糖基化位点来实现。抗体糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸，是碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中存在这些三肽序列之任一产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一附着于羟基氨基酸（最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸）。在抗体上增加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使之包含一个或多个上述的三肽序列来方便地实现(用于N-连接的糖基化位点)。也可在原始抗体序列中通过添加、或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来产生改变(用于O-连接的糖基化位点)。

载体、宿主细胞和重组方法

本发明的抗NRP抗体可使用易于得到的技术和材料而重组生产。

为了重组生产抗NRP抗体，分离编码抗体的核酸，并插入可复制载体，用于进一步克隆（DNA扩增）或表达。编码抗体的DNA易于使用常规规程分离或合成（例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的DNA特异性结合的寡核苷酸探针）。可以获得许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。

(i)信号序列构件

本发明的抗体不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽优选是成熟蛋白质或多肽的N-末端处的信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。所选择的异源信号序列优选是受到宿主细胞识别并加工（即受到信号肽酶切割）的。对于不识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列用例如选自碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列取代。为了酵母分泌，天然信号序列可以用例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列（包括糖酵母属和克鲁维氏酵母属α因子前导序列）、酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡萄糖淀粉酶前导序列、或WO 90/13646中记载的信号取代。在哺乳动物细胞表达中，可以利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。

将此类前体区(precursor region)的DNA以符合读码框的方式与编码抗体的DNA连接。

(ii)复制起点构件

表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种所选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列是能够使载体不依赖于宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。众所周知多种细菌、酵母和病毒的此类序列。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点（SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV）可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件（SV40起点的使用通常可能只是因为它包含早期启动子）。

(iii)选择基因构件

表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足营养缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的必需营养物，例如用于芽孢杆菌的编码D-丙氨酸消旋酶的基因。

选择方案的一个例子利用药物来阻滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。

适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个例子是那些能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。

例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx)，DHFR的一种竞争性拮抗剂的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。

或者，可以通过细胞在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中的生长来选择经编码抗体、野生型DHFR蛋白质、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞（特别是包含内源DHFR的野生型宿主）。参阅美国专利No.4,965,199。

适用于酵母的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等(1979)Nature282:39)。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株，例如ATCC No.44076或PEP4-1提供了选择标志。Jones(1977)Genetics85:12。酵母宿主细胞基因组中存在trp1损伤随之提供了用于通过在缺乏色氨酸时的生长来检测转化的有效环境。类似的，用携带Leu2基因的已知质粒补足Leu2缺陷型酵母菌株（ATCC 20,622或38,626）。

此外，衍生自1.6μm环状质粒pKD1的载体可用于转化克鲁维氏酵母属酵母。或者，报导了用于在乳酸克鲁维氏酵母中大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统。Van den Berg(1990)Bio/Technology8:135。还披露了用于由克鲁维氏酵母属的工业用菌株分泌成熟重组人血清清蛋白的稳定多拷贝表达载体。Fleer等(1991)Bio/Technology9:968-975。

(iv)启动子构件

表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，而且它与抗体核酸可操作连接。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac启动子。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还将包含与编码抗体的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。

已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处找到的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3'端添加聚腺苷酸尾的信号。所有这些序列合适的插入真核表达载体。

适用于酵母宿主的启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。

作为具有通过生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步记载于EP 73,657。酵母增强子也可以有利的与酵母启动子一起使用。

在哺乳动物宿主细胞中由载体转录抗体受到例如从病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒（诸如腺病毒2）、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和最优选的猿猴病毒40 (SV40)基因组，从异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，及此热休克启动子获得的启动子的控制，倘若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。

方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利No.4,419,446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中记载了该系统的一种改良。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参阅Reyes等(1982)Nature297:598-601。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。

(v)增强子元件构件

常常通过将增强子序列插入载体来提高高等真核细胞对编码本发明抗体的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因（球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素）的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子（bp100-270）、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参阅Yaniv(1982)Nature297:17-18。可以将增强子剪接到载体中，位于抗体编码序列的5'或3'位置，但是优选位于启动子的5'位点。

(vi)转录终止构件

用于真核宿主细胞（酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞）的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5'端和偶尔的3'端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参阅WO 94/11026及其中披露的表达载体。

(vii)宿主细胞的选择和转化

适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)（例如1989年4月12日公开的DD266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P）、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC27,325)也是合适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。

在原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，通常可获得许多其它属、种和菌株且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24,178)、K.waltii(ATCC56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。

适于表达糖基化抗体的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾Spodoptera frugiperda（毛虫）、埃及伊蚊Aedes aegypti（蚊子）、白纹伊蚊Aedes albopictus（蚊子）、黑腹果蝇Drosophila melanogaster（果蝇）和家蚕Bombyx mori等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖Autographa californica NPV的L-1变体和家蚕Bombyx mori NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。还可利用棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。

然而，脊椎动物细胞得到最多关注，而且培养（组织培养）中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7,ATCC CRL1651)；人胚肾系（293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham等(1977)J.Gen Virol.36:59）；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216))；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4,Mather(1980)Biol.Reprod.23:243-251)；猴肾细胞(CV1,ATCCCCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCCCRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA,ATCCCCL2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A,ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL75)；人肝细胞(HepG2,HB8065)；小鼠乳瘤(MMT060562,ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等(1982)Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。

用上文所述用于生产抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。

(viii)培养宿主细胞

可以在多种培养基中培养用于生产本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM,Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM,Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham等(1979),Meth.Enz.58:44；Barnes等(1980),Anal.Biochem.102:255；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO90/03430；WO87/00195；或美国专利复审30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子（诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子）、盐（诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐）、缓冲剂（诸如HEPES）、核苷酸（诸如腺苷和胸苷）、抗生素（诸如GENTAMYCIN^TM药物）、痕量元素（定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物）、和葡萄糖或等效能源。还可以以本领域技术人员知道的适宜浓度包含任何其它必需补充物。培养条件，诸如温度、pH等，就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。

(ix)抗体纯化

在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤除去宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter等(1992)Bio/Technology10:163-167记载了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的流程。简单的说，在存在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)时使细胞糊融化约30分钟。可通过离心除去细胞碎片。如果将抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。

可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，优选的纯化技术是亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等(1983)J.Immunol.Meth.62:1-13)。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等(1986)EMBOJ.5:1567-1575)。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯容许获得比琼脂糖所能获得的更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABX^TM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSE^TM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂（诸如聚天冬氨酸柱）上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀。

在任何预备性纯化步骤后，包含目的抗体和污染物的混合物可进行低pH疏水相互作用层析，使用pH大约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度进行（例如大约0-0.25M盐）。

药用配制剂

抗体的治疗用配制剂可通过将具有期望纯度的抗体与任选的生理学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16thedition,Osol,A.Ed.,1980)混合，以冻干剂型或水溶液的形式制备供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂（诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚）；低分子量（少于约10个残基）多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物（例如Zn-蛋白质复合物）；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。例如，可能希望进一步提供免疫抑制剂。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。

活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中（例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊）、在胶状药物投递系统中（例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊）、或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington'sPharmaceutical Sciences,16thedition,Osol,A.Ed.,1980。

用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶（例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)）、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸与L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOT^TM（由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体）及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化抗体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可以根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫-二硫化物互换的分子间S-S键形成，那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定。

治疗用途

设想了本发明的抗体可用于治疗哺乳动物。例如，在一个实施方案中，给非人哺乳动物施用抗体用以获得临床前数据。示例性的要治疗的非人哺乳动物包括非人灵长类动物、犬、猫、啮齿类动物和其它临床前研究所用的哺乳动物。这类哺乳动物可以是用抗体治疗的疾病的已确立的动物模型，或者可用于研究目的抗体的毒性。在这些实施方案的每一个中，可以在哺乳动物中进行剂量放大研究。例如，当抗体是抗NRP1抗体时，将它施用给实体瘤模型的宿主啮齿类动物。

另外/或者，抗体用于治疗人，例如患有能由施用抗体而受益的疾病或病症的患者。

本发明涵盖抗血管发生癌症疗法，一种新的癌症治疗策略，其目标在于抑制提供营养以支持肿瘤生长所需的肿瘤血管发育。因为血管发生涉及原发性肿瘤生长和转移，所以本发明提供的抗血管发生治疗能够在原发性位置处抑制肿瘤的瘤生长，以及在继发性位置处防止肿瘤转移，因而容许其它治疗剂攻击肿瘤。本文中要治疗的癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、肺癌（包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鳞癌）、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)（包括胃肠癌）、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝肉瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney or renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、及各种类型的头和颈癌，以及B细胞淋巴瘤（包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL) NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小无核裂细胞性NHL、贮积病(bulky disease) NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症）、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及与瘢痣病(phakomatoses)、水肿（诸如与脑瘤有关的）和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖。更具体地，本发明抗体能治疗的癌症包括乳腺癌、结肠直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西氏肉瘤、类癌(carcinoid carcinoma)、头和颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤、和多发性骨髓瘤。

设想了在用于治疗各种疾病诸如肿瘤时，本发明的抗体可以与其它适用于相同或相似疾病的治疗剂组合在一起。在用于治疗癌症时，本发明的抗体可以与常规癌症疗法（诸如手术、放疗、化疗或其组合）组合使用。

在某些方面，可用于与本发明抗体一起构成组合癌症疗法的其它治疗剂包括其他抗血管发生剂。许多抗血管发生剂已得到鉴定并且是本领域已知的，包括Carmeliet和Jain(2000)所列的那些。

在一个方面，本发明的抗体与VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂（诸如抗VEGF抗体、VEGF变体、可溶性VEGF受体片段、能阻断VEGF或VEGFR的适体、中和性抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶的抑制剂及其任何组合）组合使用。或者/另外，两种或更多种抗NRP1抗体可共施用给患者。在一个更优选的实施方案中，本发明的抗NRP1^A或抗NRP^B抗体与抗VEGF抗体组合使用以产生叠加或协同效应。优选的抗VEGF抗体包括那些与抗hVEGF抗体A4.6.1结合相同表位的抗体。更优选的是，抗VEGF抗体是bevacizumab（贝伐单抗）或ranibizumab（兰尼单抗）。

在一些其它方面，可用于与本发明抗体一起构成组合肿瘤疗法的其它治疗剂包括涉及肿瘤生长的其它因子（诸如EGFR、ErbB2(也称为Her2)、ErbB3、ErbB4、或TNF）的拮抗剂。优选的是，本发明的抗NRP1抗体可以与靶向一种或多种酪氨酸激酶受体（诸如VEGF受体、FGF受体、EGF受体和PDGF受体）的小分子受体酪氨酸激酶抑制剂(RTKI)组合使用。许多治疗性小分子RTKI是本领域已知的，包括但不限于vatalanib(PTK787)、erlotinibOSI-7904、ZD6474ZD6126(ANG453)、ZD1839、sunitinibsemaxanib(SU5416)、AMG706、AG013736、ImatinibMLN-518、CEP-701、PKC-412、Lapatinib(GSK572016)、AZD2171、sorafenibXL880、和CHIR-265。

本发明的抗NRP抗体，单独的或与第二治疗剂(诸如抗VEGF抗体)组合的，都可进一步与一种或多种化疗剂组合使用。多种化疗剂可用于与本发明一起构成组合治疗方法。所设想的示例性的和非限制性的化疗剂列表在本文“定义”小节中有提供。

当抗NRP抗体与第二治疗剂共施用时，可首先施用第二治疗剂，然后施用抗NRP抗体。然而，也设想了同时施用或首先施用抗NRP抗体。第二治疗剂的合适剂量就是当前所用的那些，而且可以由于该药剂与抗NRP抗体的组合（协同）作用而降低。

为了预防或治疗疾病，抗体的合适剂量将取决于要治疗的疾病的类型、疾病的严重性和进程、是为了预防还是为了治疗目的而施用抗体的、以前的疗法、患者的临床史和对抗体的应答、和主治医师的判断。合适的是，抗体在一次或在一系列治疗中施用于患者。

根据疾病类型和严重性，例如，约1μg/kg至50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗体是向患者施用的初始候选剂量，无论是一次或多次分开给药，或者通过连续输注。根据上述因素，典型的每日剂量的范围可以是约1μg/kg至约100mg/kg或更多。对于持续数天或更长时间的重复给药，根据状况，治疗持续到发生疾病症状所希望的消退。然而，可以用其它剂量方案。在一个优选的方面，本发明的抗体每两至三周施用一次，剂量范围为约5mg/kg至约15mg/kg。更优选的是，这类剂量给药方案与化疗方案组合使用，作为治疗转移性结肠直肠癌的一线疗法。在一些方面，化疗方案包括传统的高剂量间歇性给药。在一些其它方面，用更小且更频繁的剂量施用化疗剂而无预定的中断(“节奏性化疗”)。本发明疗法过程可容易地用常规技术和测定法来监测。

抗体组合物将以与优良医学实践一致的方式配成剂型、确定剂量(dosed)、和施用。本文考虑的因素包括所治疗的特定疾病、所治疗的特定哺乳动物、患者个体的临床状况、病症成因、药剂投递位置、施用方法、施用计划、和医学从业人员已知的其它因素。要施用的抗体的“治疗有效量”将根据这类考量而决定，而且是预防、改善、或治疗疾病或病症所必需的最小量。抗体不必是但任选与一种或多种当前用于预防或治疗所讨论病症的药剂配制成剂型。这类其它药剂的有效量取决于存在于配方中的抗体量、病症或治疗法的类型、和以上讨论的其它因素。这些通常是以与上文所用相同剂量和施用路径使用，或是迄今所用剂量的大约1-99%。一般而言，疾病或病症的改善或治疗包括减轻一种或多种症状或与疾病或病症相关的医学问题。对于癌症，药物的治疗有效量可实现以下一项或它们的任意组合：减少癌细胞数；缩小肿瘤尺寸；抑制(即降低到某种程度和/或停止)癌细胞浸润入周围组织；抑制肿瘤转移；以某种程度抑制肿瘤生长；和/或以某种程度减轻一种或多种与癌症相关的症状。到药物可防止已有癌细胞生长和/或杀死已有癌细胞的程度，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。在一些实施方案中，本发明的组合物可用于防止受试者或哺乳动物中疾病或病症的发作或复发。

非治疗用途

本发明的抗体可用作亲和纯化试剂。在这种方法中，使用本领域众所周知的方法将抗体固定在固相上，诸如Sephadex树脂或滤纸。使固定化抗体接触含有待纯化抗原的样品，然后用合适的溶剂清洗支持物，这将基本上除去样品中固定化抗体所结合的待纯化抗原以外的所有物质。最后，用另一种合适的将从抗体上释放抗原的溶剂清洗支持物，诸如甘氨酸缓冲液pH 5.0。

本发明的抗体还可用于诊断性测定法，例如用于检测目的抗原在特定细胞、组织或血清中的表达。

就诊断性应用而言，通常用可检测模块标记抗体。可利用许多标记物，一般可分成以下几类：

(a)放射性同位素，诸如³⁵S、¹⁴C、¹²⁵I、³H和¹³¹I。例如，可使用CurrentProtocols in Immunology,Volumes 1 and2,Coligen等,Ed.,Wiley-Interscience,New York,New York,Pubs.1991中描述的技术用放射性同位素标记抗体，并可使用闪烁计数来测量放射性。

(b)荧光标记物，诸如可利用稀士螯合物（铕螯合物）或荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹酰、丽丝胺、藻红蛋白和德克萨斯红。例如，可使用Current Protocols in Immunology, 见上文中披露的技术使荧光标记物与抗体偶联。可使用荧光计对荧光进行定量。

(c)可利用各种酶-底物标记物且美国专利No.4,275,149中提供了有关它们中的一些的综述。酶一般催化可使用多种技术测量的显色底物的化学改变。例如，酶可以催化可通过分光光度法测量的底物的颜色改变。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。上文描述了用于对荧光改变进行定量的技术。化学发光底物通过化学反应变成电子激发态，然后可发射可测量（例如使用化学发光计）或给荧光受体提供能量的光。酶标记物的例子包括萤光素酶（例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No.4,737,456）、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮类、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶（例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）、杂环氧化酶（诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶）、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于使酶与抗体偶联的技术描述于O'Sullivan等(1981)MethodsforthePreparationof Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay,Methods inEnzym.,J.Langone和H.Van Vunakis Ed.,Academic Press, New York,73:147-166。

酶-底物组合的例子包括例如：

(i)辣根过氧化物酶(HRPO)，其以过氧化氢为底物，其中过氧化氢氧化染料前体（例如邻苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB)）;

(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为显色底物的对硝基苯基磷酸酯；和

(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与显色底物（例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷)或荧光底物4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷。

本领域技术人员可利用许多其它酶-底物组合。有关它们的一般性综述参见美国专利No.4,275,149和4,318,980。

有时，将标记物与抗体间接偶联。熟练技术人员了解实现这一目的的多种技术。例如，可将抗体与生物素偶联，而且可以将上述三大类标记物中的任一种与亲合素偶联，或反之亦然。生物素选择性结合亲合素，由此标记物可与抗体以这种间接方式偶联。或者，为了实现标记物与抗体的间接偶联，将抗体与小型半抗原（例如地高辛）偶联，并将上述不同类型的标记物之一与抗半抗原抗体（例如抗地高辛抗体）偶联。由此，可实现标记物与抗体的间接偶联。

在本发明的另一个实施方案中，抗体无需标记，而且可使用结合该抗体的经标记抗体检测其存在。

本发明的抗体可用于任何已知测定方法，诸如竞争性结合测定法、直接和间接夹心式测定法、及免疫沉淀测定法。Zola,Monoclonal Antibodies:AManual of Techniques,pp.147-158,CRC Press,Inc.,1987。

竞争性结合测定法依赖于经标记标准品与测试样品分析物竞争结合有限量的抗体的能力。测试样品中的抗原量与结合至抗体的标准品量成反比。为了便于测定得到结合的标准品的量，一般在竞争之前或之后使抗体不溶解，从而可以方便的将结合至抗体的标准品和分析物与仍然未结合的标准品和分析物分离。

三明治/夹心式测定法涉及使用两种抗体，它们都能够结合待检测蛋白质的不同免疫原性部分或表位。在三明治/夹心式测定法中，测试样品分析物得到固定在固体支持物上的第一抗体的结合，此后第二抗体结合至分析物，如此形成不溶性三元复合物。参见例如美国专利No.4,376,110。第二抗体自身可以是用可检测模块标记的（直接夹心测定法），或者可以使用经可检测模块标记的抗免疫球蛋白抗体来测量（间接夹心测定法）。例如，一种类型的夹心测定法是ELISA测定法，其中的可检测模块是酶。

对于免疫组织化学，例如，肿瘤样品可以是新鲜的或冷冻的，或者可以包埋在石蜡中并用防腐剂诸如福尔马林固定。

抗体还可用于体内诊断性测定法。一般而言，用放射性核素（诸如¹¹¹In、⁹⁹Tc、¹⁴C、¹³¹I、¹²⁵I、³H、³²P或³⁵S）或染料标记抗体，从而可使用免疫闪烁描记法(immunoscintiography)来定位肿瘤。

在一个实施方案中，检测生物学样品（例如组织、血液、血清、脊髓液）或所制备生物学样品中的NRP1的方法可包括使本发明抗体接触该样品并观察结合至样品中NRP1的抗NRP1抗体或测定结合至样品中NRP1的抗NRP1抗体的量的步骤。在另一个实施方案中，检测受试者（例如人、小鼠、兔、大鼠等）中的NRP1的方法包括对受试者施用本发明的抗体并观察结合至受试者中NRP1的抗NRP1抗体或测定结合至受试者中NRP1的抗NRP1抗体的量的步骤。

诊断试剂盒

为方便起见，可以在试剂盒中提供本发明的抗体，即以预定量包装的试剂组合及实施诊断测定法的说明书。若抗体是用酶标记的，则试剂盒将包括酶所需要的底物和辅因子（例如提供可检测生色团或荧光团的底物前体）。另外，可以包括其它添加剂，诸如稳定剂、缓冲剂（例如封闭缓冲液或裂解缓冲液）等等。各种试剂的相对量可以广泛变化，以提供实质性优化测定法灵敏度的、试剂在溶液中的浓度。具体而言，可以以包含赋形剂的干粉形式提供试剂，通常是冻干的，它们在溶解后提供具有适宜浓度的试剂溶液。

制品

在本发明的另一个实施方案中提供了包含可用于治疗上文所述病症的物质的制品。所述制品包括容器和标签。合适的容器包括例如药瓶、药管、注射器和试管。所述容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。所述容器装有有效治疗所述疾患的组合物，可以具有无菌存取口（例如所述容器可以是带有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或药瓶）。所述组合物中的活性药剂是抗体。容器上或与容器相连的标签指明该组合物用于治疗所选疾患。所述制品可进一步包括第二容器，其中装有药剂学可接受的缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和用户立场出发需要的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器和带有使用说明书的包装插页。

以下实施例仅仅意图例示本发明的实施，而非作为限制提供的。本文中所引用的所有专利和科学文献的公开内容完整收录作为参考。

实施例

实施例1：抗Nrp1^B和抗泛Nrp^A抗体的构建和功能

Liang等，J Mol Biol366，815-29(2007)和Pan等，Cancer Cell 11，53-67(2007)报告了开发选择性阻断脑信号蛋白或VEGF结合Nrp1的噬菌体衍生抗体的一种策略。这些单克隆抗体被设计成用于区分Nrp1介导的各种应答和用于在鼠肿瘤模型中评估它们作为治疗剂的潜力的工具。

简言之，设计了一种人合成抗体噬菌体文库，其是在单一共有支架上用VH/VL多样性建立的。此抗体文库的设计和选择的详情记载于Liang等，见上文，而且还可见于2003年12月11日公布的WO 03/102157，通过述及将其完整公开内容收入本文。自此文库生成了针对人和鼠NRP1的功能阻断性抗体。定位于NRP1 b1b2结构域的抗体能阻断VEGF与NRP1的结合，及VEGF诱导的HUVEC细胞迁移。所鉴定的抗体包括以0.2nM的亲和力结合Nrp1的VEGF阻断性抗体（克隆YW107.4.87；抗Nrp1^B）(Liang等，见上文；Pan等，见上文)。虽然此抗体阻断VEGF与Nrp1之间的相互作用，但是它不拮抗Sema3A功能。在体内，抗Nrp1^B不仅降低小鼠视网膜中的血管重构，而且还与抗VEGF的作用相加以减缓肿瘤生长(Liang等，见上文和Pan等，见上文)。

遵循相同的办法，使用在单一共有框架上建立的人合成抗体噬菌体文库，开发了一种分别以0.21和0.15nM的亲和力与Nrp1和Nrp2二者起交叉反应的抗体（克隆YW68.11.26，抗泛Nrp^A）（图S1）。YW68.11.26和相关YW68.11的轻链和重链可变域序列分别显示于图7和8。抗泛Nrp^AIgG1抗体YW68.11和YW68.11.26的Fab片段的氨基酸序列分别显示于图9A和9B。

与抗Nrp1^B形成对比，抗泛Nrp^A不影响VEGF165或VEGF-C的结合（数据未显示）。对这两种抗体抑制Sema3A介导的轴突生长锥（来自鼠背根神经节(DRG)）塌陷的能力的评估（图1A和1B）。添加Sema3A导致伴DRG生长锥的肌动蛋白前行(actin processes)的收回(retraction)；此作用受到抗泛Nrp^A的完全拮抗，但不受抗Nrp1^B拮抗。

实施例2：神经毡蛋白/抗体复合物的结构研究

材料和方法

功能测定法和抗体结合亲和力

塌陷测定法和抗Nrp抗体结合亲和力的测定如先前所述那样实施(He，Z和Tessier-Lavigne，M.，Cell90，739-51(1997)；Liang等，见上文和Pan等，见上文)。

用于进行结晶学研究的蛋白质的表达和纯化

将Nrp1-b1、Nrp1-b1b2、和Nrp2-b1b2（结构域边界见表S1）克隆入pET15b(Novagen)并在大肠杆菌中表达，于37°C（Nrp1-b1和-b1b2）或16°C（Nrp2-b1b2）温育。所有神经毡蛋白b型片段以可溶性蛋白质的形式表达，不需要再折叠方案。在裂解细胞后，使用镊-氨三乙酸(Ni-NTA)树脂在50mMTris(pH8.0)、300-500mM NaCl、和20mM咪唑中纯化蛋白质，并在相同的缓冲剂加250mM咪唑中洗脱。用凝血酶切除his₆标签，并使用在25mMTris(pH8.0)和150mMNaCl中平衡的Superdex-75柱通过凝胶过滤层析进一步纯化样品。

生成重组杆状病毒以便于自Hi5细胞分泌Nrp1-a2b1b2、Nrp2-a2b1b2、Nrp2-a1a2b1b2、和全长Nrp2-ECD（表S1）。将Nrp2-a1a2b1b2和全长Nrp2-ECD与Nrp2天然分泌信号和C末端His₆标签一起亚克隆入pENTR/D-TOPO(Invitrogen)并重组入pDEST8(Invitrogen)以生成病毒杆粒(bacmid)。将Nrp1-a2b1b2和Nrp2-a2b1b2亚克隆入pAcGP67B(Clonetech)。感染后，收集培养物培养液并补充50mM Tris(pH8.0)、5mMCaCl₂、和1mMNiCl₂；如关于细菌表达的神经毡蛋白构建体所述那样用Ni-NTA和凝胶过滤层析纯化蛋白质。

将抗Nrp1^B（YW107.4.87）和抗泛Nrp^A（YW68.11.26）的Fab片段在大肠杆菌中表达，在PBS中平衡的蛋白G柱上捕捉，并用0.58%乙酸洗脱。通过离子交换层析(SP-sepharose)在20mM MES(pH5.5)中进一步纯化蛋白质级分，并用0至250mMNaCl的梯度洗脱。Fab/Nrp复合物通常以1:1的摩尔比混和，并且使用在25mMTris-HCl(pH7.5)和200mM NaCl中平衡的Superdex-200柱进一步纯化。为了结晶，如表S1中详述地那样浓缩所有未结合的神经毡蛋白和Nrp/Fab复合物样品。

结晶、结构测定、和精化

所有晶体都是通过蒸气扩散法于19°C通过混和等体积的蛋白质加孔溶液得到的（细节见表S1）。为了防冻，一般将晶体转移至母液加20%甘油或乙二醇的溶液（表S1）。将Nrp1-b1/Fab复合物晶体转移至10mMHepes(pH7.2)、25%PEG1,500、和10%乙二醇；让其对10mMHepes(pH7.2)、25%PEG1,500、和20%乙二醇脱水过夜；并在液氮中闪冻。在Advanced Light Source（beam-lines 5.0.1或5.0.2）或Stanford Synchrotron Radiation Laboratory（beam-lines 9-2或11-1）处收集数据集。使用来自HKL套件的Denzo和Scalepack(Otwinowski，Z和Minor，W.，Methods in Enzymology 276,307-326(1997))加工数据。晶胞参数和数据统计总结于表1。

所有晶体结构都使用Phaser(McCoy等，Acta Crystallogr D BiolCrystallogr 61，458-64 (2005))通过分子置换来解析。使用Nrp1-b1晶体结构（pdb登录号1KEX）(Lee，et al.，Structure 11，99-108(2003))作为每个凝血因子结构域的搜索模型解析了Nrp1-b1b2结构。用Nrp1-b1b2结构的精化座标充当Nrp2-b1b2结构的搜索探针。使用Nrp2-b1b2结构和含有来自B20-4/VEGF复合物（pdb登录号2FJH）的可变域(V_H/V_L)或恒定域(C_H1/C_L)的Fab片段解析了Nrp2a1a2b1b2/抗泛Nrp^A-Fab复合物的单斜晶形。使用来自MASP-2的N末端CUB结构域通过分子置换鉴定了a2结构域；a1结构域不能通过分子置换来定位，在电子密度内手工放置。使用上文所述Nrp1-b1晶体结构和B20-4Fab片段解析了Nrp1-b1/Fab复合物。使用来自Nrp2-a1a2b1b2/Fab复合物的b1b2结构和a2CUB结构域的精化座标解析了所有剩余结构。原子模型使用Coot(Emsley，P.和Cowtan，K.Coot，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr60，2126-32(2004))来构建，并使用Refmac(Murshudov，et al.，Acta Crystallographica D53，240-255(1997))来精化。

Nrp1、Nrp2、和神经毡蛋白/Fab复合物的结晶

使用两种不同策略来为结构研究生成蛋白质。只包括b型结构域的较小神经毡蛋白片段在大肠杆菌中表达，而较大Nrp构建体需要作为自杆状病毒感染的昆虫细胞分泌的蛋白质生成。关于七种结构的概况呈现于图2A和2B。简言之，Nrp1和Nrp2的VEGF结合部分(b1b2)的晶体分别衍射至1.8和1.95的最大分辨率。Nrp1和Nrp2的a2b1b2结构域的晶体分别精化至2.0和而与VEGF阻断性Fab，抗Nrp1^B形成的复合物中Nrp1的b1结构域衍射至分辨率。最后，Nrp2 a1a2b1b2结构域的晶体结构是在与脑信号蛋白阻断性Fab，抗泛Nrp^A形成的复合物中解析的；鉴定了此复合物的衍射至2.75和的两种晶形。所有结构通过分子置换来解析，并以具有好的立体化学的低于20/25%的最终R_工作/R_游离（R_work/R_free）值来报告（表1）。Nrp1 a2b1b2结构在a2结构域的对边上具有两个N-连接的糖基化位点（图3B）。Nrp2/Fab复合物的单斜晶形也显示a2结构域内的两个糖基化位点（图3A）；然而，这些糖模块在Nrp2-a2b1b2结构的电子密度中没有很好地被限定，因此没有建模（图3B）。

神经毡蛋白胞外域的总体结构域体系结构

神经毡蛋白胞外区常常分成三个单元，分别称作主要脑信号蛋白结合结构域(a1a2)、VEGF结合结构域(b1b2)、二聚化结构域(c)(Ellis，L.M.，MolCancer Ther5，1099-107(2006))。事实上，最近的大鼠Nrp1 b1b2晶体结构(Vander Kooi，C.W.，et al.，Proc Natl Acad Sci USA 104，6152-6157(2007))鉴定了b1与b2结构域之间的大界面，及埋藏在结构域之间的残基在序列方面是保守的，此b1b2结构域排列被公认是Nrp家族的一般特征。在此，已经自多种结晶条件（表S1）解析了包括a2、b1、和b2结构域的Nrp的四种晶体结构（图2A和2B,3A至3C）。两种模型包括结合至Fab片段的a1结构域，而另两种模型包括a2结构域中的钙离子。不管这些差异，三个结构域（即a2，b1，和b2）在所有晶体结构中共享相同的排列，而且紧密包围在假3-折叠轴(pseudo 3-fold axis)周围（图3A至3C）。Nrp1和Nrp2 a2b1b2结构非常相似而且在317个Cα原子上以1.2（均方根差）重叠。b1与b2之间的界面在两种神经毡蛋白间是保守的，埋藏约的溶剂可及表面。有趣的是，a2结构域与b1b2之间的界面在所有结构中也是保守的，而且埋藏超过的溶剂可及面积，指示所有三个结构域形成刚性结构单元（图3A至3C）。

相反，a1与a2b1b2之间的结构域排列在Nrp2/抗泛Nrp^A-Fab复合物的两种晶形间没有得到保留。在重叠受体的a2b1b2核心时，a1结构域相对于彼此移位约a1与a2b1b2之间的界面是小的（约埋藏表面积）且不是保守的。强相互作用的缺乏鉴定了a1结构域的柔性，提示它能在溶液中或在受体结合时相对于Nrp的剩余部分发生构象变化（图3C）。

NrpCUB结构域包括钙结合位点和脑信号蛋白结合位点

Nrp1和Nrp2的a1和a2结构域是CUB结构域(Ellis，L.M，Mol Cencer Ther5，1099-107(2006))。在CUB结构域原型，spermadhesin(Romero，A.，et al.，Nat Struct Biol 4，783-8 (1997)中，折叠结构(fold)包含两个5链β-片层，其形成β-三明治。链β2、β4、β9、β6和β7形成一个β-片层，而另一个片层含有链β1、β3、β10、β5和β8；然而，链β1和β2在来自数个补体家族蛋白质的CUB结构域中频繁缺失(Feinberg，H.等，EMBO J 22，2348-59 (2003)；Gregory，L.A.等，J Biol Chem 278，32157-64 (2003)；Gregory，L.A.等，J Bol Chem 279，29391-7(2004))。与这些蛋白质相似，Nrp的a1和a2结构域缺少β1链（图4A至4D）。总体而言，CUB结构域展现高度的相似性。例如，Nrp a2结构域在结构上与Nrp1 a2结构域Nrp2 a1结构域和来自spermadhesin(Romero，A.等，见上文)的CUB结构域相似。

来自补体家族蛋白质C1s和MASP-2^36,37的CUB结构域的晶体结构在三明治的一端含有钙结合位点。Nrp1和Nrp2 a2b1b2结构在结构域a2内的此位置也含有结合的离子（图3B,4A）。在Nrp1结构中，在电子密度中清楚观察到所述离子（图S2-A至S2-C），即使在结晶过程中没有包括二价离子（表S1）。在Nrp1，钙离子由三个带负电荷的侧链（Glu¹⁹⁵、Asp²⁰⁹、和Asp²⁵⁰）、两个羰基氧（Ala²⁵²和Ile²⁵³）、和水分子配位（图4B）。类似地，在Nrp2中，钙配位涉及三个带负电荷的氨基酸（Glu¹⁹⁷、Asp²¹¹、和Asp²⁵²；见图S2-A至S2-C）；这三个残基在来自十二种关系较远的物种的a2结构域中是绝对保守的（图S3）。

Nrp的a1和a2结构域间的序列比对（图S2-A至S2-C）显示了此带电荷残基三联体在Nrp的a1结构域内也是严格保守的。然而，在Nrp2/抗Nrp^A-Fab复合物中，没有关于a1结构域中结合的离子的指示。促成限定推定a1Ca²⁺结合位点的残基的环较为无序，提示Ca²⁺在稳定结构域的折叠结构中发挥作用。基于高度的序列保守性，有可能的是钙结合代表Nrp CUB结构域的共享特征。

神经毡蛋白发挥第3类脑信号蛋白家族选定成员的共同受体的功能。N-端含有签名“Sema”结构域，即一种7片β-螺旋桨(Antipenko，A.，et al.，Neuron39，589-98(2003))，它是结合神经毡蛋白a1a2结构域所需要的。抗泛Nrp^A阻断Sema3结合Nrp1和Nrp2二者（图1A和1B），但是不影响VEGF结合（数据未显示）。在Nrp2/抗泛Nrp^A-Fab复合物结构（图4C）中，Fab片段只在埋藏约溶剂可及表面的三明治β8-5-10-3面上接触Nrp2的a1结构域。受到此抗体识别的界面在Nrp1与Nrp2之间是很保守的，14个有超过25%的它们可及表面埋藏在界面中的Nrp2残基中有11个在两种受体之间是相同的（图4C）。在Nrp1与Nrp2之间保守的表位的识别解释了该抗体以亚纳摩尔范围内的亲和力结合两种受体的能力（图S1）。

在抗体侧，来自CDR L3、H2和H3的11个侧链接触Nrp2，其中7个在性质上是芳香族的（图4D）。先前的研究使用定点诱变概述了Nrp1的脑信号蛋白结合位点(Gu，C.等，J Biol Chem 277，18069-76 (2002)。基于spermadhesin模型，选择a1结构域表面上的推定溶剂暴露残基进行氨基酸替代。使用此办法，鉴定了许多突变，它们破坏Sema3A与Nrp1之间的相互作用(Gu等，见上文)，而且在定位到Npr1 a1模型上时，定位在a1 β-三明治的一个极处的环上（图4C）。所述结构域另一端处的替代对Sema3A结合没有影响(Gu等，见上文)。破坏Sema3A结合的突变在受到Sema3A阻断性Fab识别的表位附近（图4C），强烈提示sema结构域结合Nrp2a1结构域内三明治的环和8-5-10-3面。脑信号蛋白结合位点的位置也在a1结构域的推定钙结合位点附近（图4C），提示钙结合可能在配体与受体的相互作用中发挥作用。

Nrp型b结构域含有肝素结合位点和VEGF结合位点

来自人神经毡蛋白b1b2结构的b结构域（图5A和Vander Koo等，见上文，Lee等，见上文）与来自凝血因子V和VIII(F5/8)的磷脂结合（C2型）模块(Macedo-Ribeiro等，Nature402，434-9(1999)；Pratt，K.P.，et al.，Nature402，439-42(1999))及与细菌唾液酸酶的半乳糖结合域(Gaskell，A.等，Structure 3，1197-205(1995))共享显著同源性。总之，这些结构域限定盘菌素(discoidin)折叠结构，其在拓扑学上归类为由八个核心β-链构成的变形果冻卷β-桶(jelly-roll β-barrel)。该结构域的一个极含有三个延伸的“刺突”或环，其通常构成盘菌素家族成员的配体结合位点(Macedo-Ribeiro等，见上文；Pratt等，见上文；Gaskell等，见上文)。Nrp1和Nrp2的b1b2片段共享50%序列同一性，而且在307个Cα原子上以的r.m.s.d.重叠（图5A）。虽然Nrp1和Nrp2的b1结构域几乎不能区分，但是b2结构域重叠不太好（r.m.s.d.差异主要源自“刺突”的不同构象（图5A）。因为这些刺突常常限定盘菌素家族内的结合位点(Vander Kooi等，见上文；Lee等，见上文；Macedo-Ribeiro等，见上文；Pratt等，见上文；Gaskell等，见上文)，Nrp1与Nrp2之间的不相似性可能代表Nrp识别不同结合配偶的一种方式。

尽管Nrp1和Nrp2的b2结构域之间有差异，但是b结构域被压紧并形成刚性支架（图5A至5E）。结构域间连接处形成深裂，其大致垂直于两个b结构域的长轴（图5A至5E）。由b1的β4:β5环和b2的β5:β6环创建的此裂由许多带正电荷的残基围绕，基于在大鼠Nrp1上进行的诱变实验(Vander Koo等，见上文)，这代表了Nrp的肝素结合位点。两种人Nrp的结构中也都存在正电片（图5B）。VEGF₁₆₅的C-端结构域（也称作VEGF55）(Fairbrother等，Structure 6，637-48(1998))也含有肝素结合位点。因为肝素将b1b2对VEGF₁₆₅的亲和力提高多达100倍(Mamluk，R.等，J Biol Chem277，24818-25(2002)；Fuh，G.等，J Biol Chem 275，26690-5(2000))，可行的是，Nrp利用肝素来募集VEGF₁₆₅至此区域。

在此肝素介导的、VEGF₁₆₅的外显子7之间的相互作用之外，由外显子8编码的VEGF C-端尾(CDKPRRC_OOH)能直接结合Nrp。在与促吞噬肽(VanderKooi等，见上文)（即VEGF尾的一种四肽模拟物(TKPR_COOH)(von Wronski，M.A.等，J Biol Chem 281，5702-10(2006))）形成的复合物中的大鼠Nrp1-b1b2晶体结构中，C-端精氨酸紧密挤入由来自b1结构域保守“刺突”的残基创建的酸性沟中。在我们的数种结构中，包括所有三种Fab复合物，来自对称相关分子的C-端残基（组氨酸）占据促吞噬肽的同一酸性袋（图S4-A至S4-C）。

为了进一步细化涉及VEGF结合的潜在残基，检查了b1b2表面上Nrp残基的表面保守性（图5C）。两个连续片在十二种Nrp1和Nrp2蛋白质中是保守的（图S3）。这些位点之一直接定位至促吞噬肽结合位点，而第二个位点包括肝素结合片边缘上的残基，提示Nrp与VEGF之间的相互作用涉及另外的面积。

在Nrp1-b1/抗Nrp1^B-Fab复合物的晶体结构（图5D）中，Fab接触位于两个推定VEGF结合位点之间且与促吞噬肽结合裂部分交叠的表位。此VEGF阻断性抗体的表位是不常见的，只涉及来自CDR L1和H3的残基。平均而言，Fab/抗原界面埋藏的溶剂暴露表面(Lo Conte等，J Mol Biol285,2177-98(1999))，然而在Nrp1-b1/Fab界面处仅遮蔽了虽然所述界面较小，但是抗Nrp1_B以0.2nM的亲和力紧密结合Nrp1(Liang等，见上文；Pan等，见上文)。

VEGF和Sema3A不竞争Nrp结合

在本发明的Nrp/Fab晶体结构中，阻断VEGF和脑信号蛋白结合的结合表位相距且位于Nrp的对边上（图S5-A至S5-C）。数项研究报告了VEGF和脑信号蛋白竞争细胞表面结合且此竞争涉及b1结构域上部分交叠的结合位点(Gu等，见上文；Miao，H.Q.等，J Cell Biol 146，2177-98(1999)；Narazaki，M.和Tosato，G.，Blood107，3892-901(2006))。由于VEGF₁₆₅和第3类脑信号蛋白的羧基尾都富含碱性残基，提示这些尾可能竞争由b1结构域中的“刺突”创建的负电沟(Vander Kooi等，见上文；Lee等，见上文)。最近的b1b2/促吞噬肽晶体结构鉴定了VEGF₁₆₅尾可能占据此结合位点。我们先前已经显示了抗Nrp1^B不拮抗Sema3A介导的来自背根神经节(DRG)的轴突的塌陷(Liang等，见上文；Pan等，见上文)，提示Sema3的C-端尾不结合同一条沟。

先前的竞争实验(Gu等，见上文；Miao等，见上文；Narazaki等，见上文)采用在蛋白质的C端含有异源标签（诸如碱性磷酸酶）的VEGF和脑信号蛋白。有可能的是，所观察到的竞争是来自所述标签的立体冲突的结果，而非VEGF与Sema3尾之间的直接竞争。我们检查了VEGF165拮抗Sema3介导的来自DRG的轴突生长的塌陷的能力。即使在100mM的浓度，VEGF₁₆₅也不影响Sema3A引起肌动蛋白前行的收回的能力（图1A和1B）。这些数据证明了Sema3不与VEGF竞争对b1结构域的结合，而且脑信号蛋白的所述尾接触此结构域内的不同位点。

神经毡蛋白二聚化的模型

Nrp1和Nrp2能形成同型或异型多聚体，即使没有配体也行(Takahashi，L.等，Cell99，59-69(1999)；Chen，H.等，Neuron21，1283-90(1998)；Giger，R.J.等，Neuron21，1079-92(1998)；Takahashi等，Nat Neurosci 1，487-93(1998))，而且虽然神经毡蛋白复合物的精确化学计量尚未确立，但是广泛推定Nrp在配体结合后形成同二聚体。当前数据显示c结构域是必需的，但是不足以进行Nrp寡聚化，因为缺少此结构域的截短突变体展示相对于全长ECD降低的多聚化(Takahashi等，Cell99，59-69(1999)；Chen等，见上文；Giger等，见上文；Nakamura等,Neuron 21，1093-100(1998))。包括a1a2和b1b2结构域的神经毡蛋白构建体对有些VEGF同等型具有比只跨越b1b2结构域的构建体高的亲和力(Mamluk，R.等，J.Biol.Chem.277，24818-25(2002)；Karpanen，T.等，FASEB J 20，1462-72(2006)；Giger，R.J.等，Neuron25，29-41(2000))，即使a1a2结构域不结合VEGF。因此，可行的是，a1a2结构域直接促成Nrp二聚化，并如此通过稳定2:2复合物而增强Nrp与VEGF二聚体之间的相互作用。有趣的是，来自两种不同晶形的Nrp2-a1a2b1b2晶体结构（表1）含有由a1介导的保守的、结晶界面。在此二聚体中，a1结构域以沿着β7和β8链的大致反平行排列方式而排列。该界面埋藏约的溶剂可及表面积，而且受疏水相互作用控制（图S5-A至S5-C）。有趣的是，已经对其它CUB结构域家族成员观察到相似的二聚体(Romero等，见上文)。然而，通过多角度光散射对三种Nrp2构建体（a2b1b2，a1a2b1b2和a1a2b1b2c）分子量的检查揭示了所有三种Nrp2构建体在溶液中是单体的（数据未显示）。这些数据暗示Nrp在溶液中的同二聚化是非常弱的，即使存在MAM结构域也如此，而且受体二聚化可能只在配体结合时发生。结晶Nrp2二聚体的取向提示VEGF结合的模型。a1界面创建鞍形二聚体，宽度约（图6A和6B），大得足以容纳尺寸约的VEGF₁₀₉二聚体。重要的是，在所述鞍的内表面找到了促吞噬肽结合位点和肝素结合片。肝素能稳定Nrp肝素结合位点与VEGF之间的相互作用，并进一步促进VEGF尾与b1的“刺突”的结合。此排列还会能够容纳经由VEGF受体结合域的VEGFR结合以进行下游信号传导。因此，虽然a1结构域不直接涉及VEGF，但是它们能增强Nrp的VEGF结合，因为它们促进Nrp二聚化。此二聚化能进一步容纳Sema3结合（图6A和6B）。在Sema3A晶体结构(Antipenko，A.等，Neuron39，589-98(2003))中，两个“sema”结构域在界面处压紧在一起。在Nrp结合时，Sema3A的sema结构域解离以容许与a1a2上主要结合位点的相互作用(Antipenko，et al.，见上文)。在本文所呈现的a1介导的Nrp二聚体模型中，两个推定Sema3A结合位点位于对边上，而且远得足以容纳两个结合的Sema3分子的大β-螺旋桨（图6A和6B和S5-A至S5-C）。

本发明的结构分析提供了Nrp ECD的VEGF结合部分（b1b2）和脑信号蛋白结合部分（a1a2）二者的第一手详细图像。抗体复合物（图3A至3C、4A至4D和5A至5E）及先前的突变研究(Gu等，见上文；Vander Kooi等，见上文)描绘了Nrp上供脑信号蛋白的Sema结构域和VEGF的肝素结合结构域结合的位点。这些结构为未来的诱变实验提供了基础，而且提供了策略来阐明Nrp在与其配体和信号传导受体VEGF、VEGFR、脑信号蛋白、和丛蛋白形成的复合物中的结构。另外，本发明提供的晶体结构和其它信息能够设计VEGF和/或脑信号蛋白的拮抗剂和激动剂，而且能在筛选测定法中用于鉴定此类拮抗剂或激动剂。

虽然在上文描述中参照某些实施方案例示了本发明，但是本发明不限于此。实际上，根据上面的描述，在本文所显示和描述之外，本发明的多种修饰对于本领域技术人员是显而易见的，而且在所附权利要求的范围内。

通过述及将整篇说明书中引用的所有参考文献及其中引用的参考文献完整收入本文。

Claims (9)

1.Nrp2_ala2b1b2片段与抑制脑信号蛋白结合Nrp2的抗泛Nrp^A抗体的Fab片段之间形成的复合物的晶体，其中所述晶体衍射x射线辐射以生成代表所述复合物三维结构的衍射图样，该衍射图样具有晶胞常数 及空间群C2。

2.权利要求1的晶体，其以的分辨率衍射x射线。

3.权利要求1的晶体，其中所述Fab片段包含在SEQ ID NO:10中。

4.一种组合物，其包含权利要求1的晶体。

5.Nrp2_ala2b1b2片段与抑制脑信号蛋白结合Nrp2的抗泛Nrp^A抗体的Fab片段之间形成的复合物的晶体，其中所述晶体衍射x射线辐射以生成代表所述复合物三维结构的衍射图样，该衍射图样具有晶胞常数 及空间群P3₂21。

6.权利要求5的晶体，其以的分辨率衍射x射线。

7.权利要求5的晶体，其中所述Fab片段包含在SEQ ID NO:10中。

8.一种组合物，其包含权利要求5的晶体。

9.权利要求1或5的晶体，其用于鉴定脑信号蛋白拮抗剂的筛选测定法。