JP6638913B2 - 生体物質検出用デバイス、生体物質検出用検出装置、イオン電流の測定方法、及び、生体物質の識別方法 - Google Patents

Description

本発明は、生体物質検出用デバイス（以下、単に「デバイス」と記載することがある。）、生体物質検出用検出装置（以下、単に「検出装置」と記載することがある。）、イオン電流の測定方法（以下、単に「測定方法」と記載することがある。）、及び、生体物質の識別方法（以下、単に「識別方法」と記載することがある。）に関する。特に、生体物質等のサンプルが通過する貫通孔にサンプルと相互作用する分子を形成することで、サンプルが貫通孔を通過する時間が長くなり、サンプルの識別ができるデバイス、検出装置、測定方法、及び、識別方法に関する。

基板に貫通孔（ナノポア）を形成し、該貫通孔をサンプルが通過する際のイオン電流を測定するデバイスは、細菌、ウイルス、ＤＮＡ、タンパク質等のセンシングに幅広く応用可能なデバイスとして注目されている。

図１は、サンプルの大きさや個数等の検出方法の従来技術を示しており、シリコン等の基板上に形成した細孔（マイクロポア）をサンプルが通過する際に生じるイオン電流の変化を検出することで、サンプルの体積を識別できる（非特許文献１参照）。また、貫通孔の厚さをサンプルより薄くすることで、サンプルの形状に応じたイオン電流を測定できることも知られている（特許文献１参照）。

国際公開第２０１３／１３７２０９号公報

Ｗａｓｅｅｍ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ， Ｖｏｌ．１２， ｐｐ．２３４５−２３５２ （２０１２）

上記特許文献１及び非特許文献１に記載されている検出方法（デバイス）では、イオン電流の変化からサンプルのサイズや形状を推定できる。しかしながら、特許文献１及び非特許文献１に記載されている方法では、サンプルのサイズや形状が類似している場合は、サンプルの識別をすることが困難であるという問題がある。

本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、
（１）サンプルが通過する貫通孔に、サンプルと相互作用する分子を形成しておくことで、サンプルが分子と相互作用しながら貫通孔を通過する、（２）そのため、分子と相互作用するサンプルが貫通孔を通過した場合、サンプルが貫通孔を通過する時間が長くなり、測定するイオン電流の波形が変化する、（３）その結果、測定したイオン電流の波形からサンプルの識別ができること、を新たに見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明の目的は、サンプルと相互作用する分子を貫通孔に形成したデバイス、検出装置、測定方法、及び、識別方法を提供することである。

本発明は、以下に示す、デバイス、検出装置、測定方法、及び、識別方法に関する。

（１）基板、
該基板に形成された被検生体物質が通過する貫通孔
該貫通孔に形成され、通過する被検生体物質と相互作用する分子、
該基板の一方の面側の少なくとも貫通孔を含む面とで電解液を充填する第１チャンバーを形成する第１チャンバー部材、
該基板の他方の面側の少なくとも貫通孔を含む面とで電解液を充填する第２チャンバーを形成する第２チャンバー部材、
を具備し、被検生体物質が貫通孔を通過する時のイオン電流の波形により被検生体物質を識別することを特徴とする生体物質検出用デバイス。
（２）前記被検生体物質が、細菌、ウイルス、ＤＮＡ、タンパク質のいずれか一つ以上である、上記（１）に記載の生体物質検出用デバイス。
（３）前記相互作用する分子が、ペプチド、糖鎖又は核酸である、上記（１）又は（２）に記載の生体物質検出用デバイス。
（４）前記相互作用する分子が、配列番号２に示す鞭毛認識ペプチドである、上記（１）〜（３）の何れか一つに記載の生体物質検出用デバイス。
（５）前記相互作用する分子が、配列番号３乃至５から選択される１種のインフルエンザ認識ペプチドである、上記（１）〜（３）の何れか一つに記載の生体物質検出用デバイス。
（６）前記相互作用する分子が、インフルエンザ認識糖鎖（６’−ｓｉａｌｙｌａｃｔｏｓｅ）を含む、上記（１）〜（３）の何れか一つに記載の生体物質検出用デバイス。
（７）前記貫通孔に金属層が積層され、前記相互作用する分子が金属層上に形成されている、上記（１）〜（３）の何れか一つに記載の生体物質検出用デバイス。
（８）上記（１）に記載の生体物質検出用デバイス、
前記第１チャンバーに形成された第１電極、
前記第２チャンバーに形成された第２電極、及び、
前記貫通孔をサンプルが通過する時のイオン電流を計測するための電流計、
を含む、
生体物質検出用検出装置。
（９）基板に形成した貫通孔を被検生体物質が通過する時のイオン電流を測定するイオン電流の測定方法であって、
前記貫通孔には被検生体物質と相互作用する分子が形成され、被検生体物質が前記分子と相互作用しながら前記貫通孔を通過することで、イオン電流の波形の差異により、被検生体物質を識別することを特徴とする、
イオン電流の測定方法。
（１０）前記被検生体物質が、細菌、ウイルス、ＤＮＡ、タンパク質のいずれか一つ以上である、上記（９）に記載のイオン電流の測定方法。
（１１）前記相互作用する分子が、ペプチド、糖鎖又は核酸である、上記（９）又は（１０）に記載のイオン電流の測定方法。
（１２）前記相互作用する分子が、配列番号２に示す鞭毛認識ペプチドである、上記（９）〜（１１）の何れか一つに記載のイオン電流の測定方法。
（１３）前記相互作用する分子が、配列番号３乃至５から選択される１種のインフルエンザ認識ペプチドである、上記（９）〜（１１）の何れか一つに記載のイオン電流の測定方法。
（１４）前記相互作用する分子が、インフルエンザ認識糖鎖（６’−ｓｉａｌｙｌａｃｔｏｓｅ）を含む、上記（９）〜（１１）の何れか一つに記載のイオン電流の測定方法。
（１５）上記（９）〜（１４）に記載のイオン電流の測定方法により測定したイオン電流から、被検生体物質を識別する生体物質の識別方法。

本発明のデバイスを用いると、分子と相互作用するサンプルが貫通孔を通過した場合、サンプルが貫通孔を通過する時間が長くなる。そのため、測定したイオン電流の波形を解析することで、大きさが類似しているサンプルを識別することができる。

図１は、サンプルの大きさや個数等の検出方法の従来技術を示す図である。 図２は、本発明のデバイス１の概略を示す図である。 図３は、貫通孔３に金属層を形成する方法を説明するための図である。 図４は、貫通孔３に金属層を形成する方法を説明するための図である。 図５は、デバイス１の他の実施形態を示す図である。 図６は、本発明の検出装置の一例を示す概略図である。 図７は、図面代用写真で、貫通孔３付近のＳＥＭ画像である。 図８は、実施例３及び比較例２で測定したイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。 図９（Ａ）は、実施例４で測定したイオン電流の波形を重ね合わせたグラフ、図９（Ｂ）は、比較例３で測定したイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。 図１０（Ａ）は、実施例６で測定したイオン電流の波形を重ね合わせたグラフ、図１０（Ｂ）は、比較例５で測定したイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。 図１１（Ａ）は配列番号３、図１１（Ｂ）は配列番号４、図１１（Ｃ）は配列番号５の分子を用いた際の実施例８で測定したイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。図１１（Ｄ）は、比較例７で測定したイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。 図１２は、実施例１０及び比較例８で測定したイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。

以下に、デバイス、検出装置、測定方法、及び識別方法について詳しく説明する。

図２は、本発明のデバイス１の概略を示す図である。本発明のデバイス１は、基板２、基板２に形成されサンプルが通過する貫通孔３、貫通孔３に形成されサンプルと相互作用する分子（以下、単に「分子」と記載することがある。）４を少なくとも含んでいる。図２に示すデバイス１は、公知の貫通孔を用いた検出装置の検出用デバイスとして組込むこともできる。

基板２は、半導体製造技術の分野で一般的に用いられている絶縁性の材料であれば特に制限は無い。例えば、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｅ、Ｔｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＧａＮ、ＩｎＳｂ、ＩｎＰ、ＳｉＮ等が挙げられる。また、基板２は、ＳｉＮ、ＳｉＯ₂、ＨｆＯ₂等の材料を用い、固体メンブレンと呼ばれる薄膜状、または、グラフェン、酸化グラフェン、二酸化モリブデン（ＭｏＳ₂）、窒化ホウ素（ＢＮ）等の材料を用い、２次元材料と呼ばれるシート状に形成してもよい。サンプルの検出感度は、貫通孔３の体積が小さいほど高くなることから、貫通孔３を形成する基板２は薄い方が好ましい。例えば、５μｍ以下が好ましく、５００ｎｍ以下がより好ましく、１００ｎｍ以下がさらに好ましく、５０ｎｍ以下が特に好ましい。なお、例えば、グラフェンは１ｎｍ以下の膜厚の基板２の作製が可能である等、基板２として固体メンブレンまたは２次元材料を用いた場合は、膜厚を非常に薄くできる。しかしながら、基板２の膜厚が非常に薄いと、破損せずに取り扱うことが困難な場合がある。そのため、基板２は、上記の絶縁性の材料で形成した支持板の上に固体メンブレンまたは２次元材料を積層した積層構造としてもよい。積層構造にする場合は、貫通孔３より大きな孔を形成した支持板の上に固体メンブレンまたは２次元材料を積層し、固体メンブレンまたは２次元材料に貫通孔３を形成すればよい。

貫通孔３は、基板２を貫通するように形成されている。イオン電流を検出する際には、貫通孔３の体積が少ないほど感度が高くなる。したがって、上記基板２を薄くするとともに、貫通孔３の大きさは、測定対象サンプルよりは大きいが、大き過ぎないように適宜調整すればよい。サンプルとしては、細菌、細胞、ウイルス、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、花粉等の生体物質が挙げられるが、分子４と相互作用するものであれば特に制限はない。例えば、硫黄酸化物（ＳＯｘ）、窒素酸化物（ＮＯｘ）、揮発性有機化合物（ＶＯＣ）、酸化鉱物（ケイ素、アルミニウム、チタン、鉄等）等の非生体物質が挙げられる。

分子４は、サンプルと相互作用するものであれば特に制限はない。なお、本発明において「相互作用」とは、分子４が測定対象サンプルを認識あるいは測定対象サンプルと影響を及ぼしあうことで、分子４と測定対象サンプルの間に弱い結合力が働き、貫通孔３に分子４を形成していない場合と比較して、測定対象サンプルが貫通孔３を通過する時間が長くなるような分子を意味する。相互作用としては、イオン間相互作用、水素結合、電気的相互作用等が挙げられる。したがって、測定対象サンプルと強固に結合し分離しない分子は、本発明の分子４には含まれない。

分子４としては、ペプチド、核酸、糖鎖、有機分子等が挙げられる。分子４は、測定対象サンプルに特異的なペプチド、核酸配列、表面分子等を調べ、当該特異的なペプチド、核酸、表面分子等と弱く結合するペプチド又は核酸配列、或いは糖鎖等を決めればよい。弱く結合する配列としては、例えば、ペプチドの場合、測定対象サンプルの特異的なペプチドを認識する抗体配列の一部の配列や測定対象サンプルの表層分子と相互作用する配列などが挙げられる。また、弱く結合する配列が核酸の場合、測定対象サンプルの特異的な核酸にハイブリダイズする配列の一部が挙げられる。ペプチド及び核酸とも、配列が決まれば、公知のペプチド合成装置、核酸合成装置で合成すればよい。又は、ペプチド・核酸の受託合成サービスを利用してもよい。また、弱く結合する分子が糖鎖の場合、測定対象サンプルに特異的なペプチドや表面分子と相互作用する糖鎖を選択すればよい。測定対象サンプルが非生体物質の場合は、例えば表面電荷等を調べ、当該電荷に相互作用する電荷を持つ有機分子を選択すればよい。

なお、上記に例示した分子４は、予め測定したいサンプルが決まっている場合の例であるが、任意に設計した核酸、ペプチド、糖鎖等を貫通孔に形成することで、当該核酸に相互作用するサンプルをスクリーニングすることもできる。例えば、ヒト細胞表面のタンパク質や糖鎖に結合する可能性がある細菌、ウイルス等をスクリーニングする場合を想定する。その場合、先ず、ヒト細胞表面から任意のタンパク質や糖鎖を選択し、当該タンパク質や糖鎖に基づいて、ペプチドや糖鎖を設計する。そして、設計したペプチドや糖鎖を貫通孔に形成したデバイスと、形成していないデバイスを作製し、サンプルを流した際にイオン電流の波形が異なるサンプルを選択すればよい。つまり、「サンプルと相互作用する分子」とは、特定のサンプルと相互作用することが予め明らかであるものでもよいし、相互作用するサンプルが明らかでない（相互作用する可能性がある）ものでもよい。上記のとおり、貫通孔３に形成する分子４は、任意に設計した核酸、ペプチド、糖鎖、有機分子等であればよい。

分子４は、貫通孔３に形成できれば、特に制限はない。例えば、貫通孔３に、金、プラチナ、アルミニウム、銅、鉄、コバルト、銀、錫、インジウム、亜鉛、ガリウム、クロム、チタン等の金属を蒸着することで金属層を形成し、分子４を含む水溶液に基板２を浸漬することで金属層に分子４を形成すればよい。分子４がペプチドの場合は、ペプチドの一方の末端がチオール基を含むように配列を設計し、チオール基と金属層を吸着すればよい。また、分子４が核酸の場合は、公知の方法により核酸にチオール基を導入し、金属層に吸着すればよい。また、分子４が糖鎖の場合は、公知の方法により、糖鎖の一部をチール基に置換すればよい。

図３及び図４は、貫通孔３に金属層を形成する方法を説明するための図である。図３に示す例では、（１）基板２の上に、先ず、金属層２１をスパッタリング等により積層し、次いで、金属層２１の上に絶縁層２２をスパッタリング等により積層する。絶縁層２２としては、ＳｉＯ₂、ＳｉＮｘ、ＳｉＯＮ、Ａｌ₂Ｏ₃、Ｙ₂Ｏ_3、Ｔａ₂Ｏ_5、ＨｆＯ₂等が挙げられるが、絶縁性の材料であれば特に制限はない。（２）そして、貫通孔３を形成する部分を電子線描画法により描画を行い、反応性イオンエッチング等により貫通孔３を形成すればよい。上記方法により、貫通孔３に金属層２１を露出させることができる。

図４に示す例では、（１）基板２に先ず貫通孔３を形成する。貫通孔３は、上記と同様、電子線描画法により描画を行い、反応性イオンエッチング等により形成すればよい。（２）基板２に電子線レジスト２３を塗布し、電子線描画法により貫通孔３の周囲を電子線レジスト２３でカバーする。電子線レジスト２３は、ネガ型でもポジ型のどちらでも良い。（３）スパッタリング等により金属層２１を貫通孔３及び電子線レジスト２３上に積層する。（４）電子線レジスト２３をリフトオフすることで、電子線レジスト上の金属層２１も除去し、貫通孔３に金属層２１を形成できる。

なお、図３及び図４に示す例は、分子４のチオール基を金属層２１に吸着しているが、貫通孔３に分子４を形成できれば金属層２１を設けなくてもよい。例えば、基板２の材料としてＳｉＯ_２を用いた場合、分子４にシランカップリング反応によりアミノ基またはカルボキシル基を導入することにより、分子４を基板２に結合させてもよい。また、基板２の貫通孔３部分をポリウレタンで被覆し、修飾したポリドーパミンを足場として有する分子４をポリウレタン表面に結合させてもよい。

図５は、デバイス１の他の実施形態を示す図である。図５に示すデバイス１は、基板２の一方の面側の少なくとも貫通孔３を含む面とで電解液を充填する第１チャンバー５を形成できる第１チャンバー部材５１、基板２の他方の面側の少なくとも貫通孔３を含む面とで電解液を充填する第２チャンバー６を形成できる第２チャンバー部材６１、を少なくとも含んでいる。

第１チャンバー部材５１及び第２チャンバー部材６１は、電気的および化学的に不活性な材料で形成することが好ましく、例えば、ガラス、サファイア、セラミック、樹脂、ゴム、エラストマー、ＳｉＯ₂、ＳｉＮ、Ａｌ₂Ｏ₃などが挙げられる。

第１チャンバー５及び第２チャンバー６は、貫通孔３を挟むように形成され、第１チャンバー５に投入したサンプルが、貫通孔３を通り第２チャンバー６に移動できるように形成されていれば特に制限はない。例えば、第１チャンバー部材５１及び第２チャンバー部材６１を別々に作成し、基板２に液密となるように接着すればよい。又は、１つの面が解放状態の略直方体の箱部材を形成し、箱の中央に基板２を挿入・固定し、その後、解放状態の面を液密に封止してもよい。その場合、第１チャンバー部材５１及び第２チャンバー部材６１は別々の部材を意味するのではなく、基板２を境に分けた箱部材の一部を意味する。なお、図示はしていないが、第１チャンバー部材５１及び第２チャンバー部材６１には、電解液及びサンプル液を充填・排出、電極及び／又はリードを挿入するための孔を必要に応じて形成してもよい。

図６は、本発明の検出装置１−１の一例を示す概略図である。検出装置１−１は、デバイス１に加え、第１チャンバー５内の電解液と接する箇所に形成された第１電極５２、第２チャンバー６内の電解液と接する個所に形成された第２電極６２、サンプル３１ａ、３１ｂが貫通孔３を通過する時のイオン電流を測定するための電流計７を少なくとも含んでいる。

また、検出装置１−１は、必要に応じて、電流計７で測定したイオン電流を解析する解析部８、測定したイオン電流値及び／または解析部８が解析した結果を表示するための表示部９、予め解析部８や表示部９を機能させるためのプログラムを格納したプログラムメモリ１０、プログラムメモリ１０に格納されているこのプログラムを読み出し実行するための制御部１１を含んでいてもよい。プログラムは、予めプログラムメモリ１０に記憶しておいても良いし、記録媒体に記録され、インストール手段を用いてプログラムメモリ１０に格納されるようにしてもよい。

第１電極５２及び第２電極６２は、アルミニウム、銅、白金、金、銀、チタン等の公知の導電性金属で形成することができる。第１電極５２及び第２電極６２は、貫通孔３を挟むように形成し、直流電流を印加することで電解液中のイオンを輸送する。したがって、第１電極５２は、第１チャンバー５内の電解液に接する場所に形成されていればよく、基板２の面上、第１チャンバー部材５１の内面、又は第１チャンバー５内の空間にリード５３を介して配置すればよい。第２電極６２も第１電極５１と同様に、第２チャンバー６内の電解液に接する場所に形成されていればよく、基板２の面上、第２チャンバー部材６１の内面、又は第２チャンバー６内の空間にリード６３を介して配置すればよい。なお、図５に示す例では、第１電極５２は第１チャンバー部材５１の内面に、第２電極６２は第２チャンバー部材６１の内面にそれぞれ形成されているが、第１電極５２及び第２電極６２は、第１チャンバー部材５１及び第２チャンバー部材６１に形成した孔から挿入してもよい。

第１電極５２は、リード５３を介して電源５４、アース５５に接続している。第２電極６２は、リード６３を介して電流計７、アース６４に接続している。なお、図６に示す例では、電源５４は第１電極５２側に、電流計７は第２電極６２側に接続しているが、電源５４と電流計７は、同じ電極側に設けてもよい。

電源５４は、第１電極５２及び第２電極６２に直流電流を通電できるものであれば特に制限はない。電流計７は、第１電極５２及び第２電極６２に通電した際に、発生するイオン電流を経時的に測定できるものであれば特に制限はない。なお、図６には図示していないが、必要に応じてノイズ除去回路や電圧安定化回路等を設けてもよい。

本発明の検出装置１−１の貫通孔３にサンプルが通過すると、貫通孔３を流れているイオン電流がサンプルにより遮断され、イオン電流が減少する。このイオン電流の減少量が貫通孔３内のサンプルの体積に比例する。しかしながら、従来の検出装置では、サンプルの体積がほぼ同じであると、同じ種類のサンプルであるのか、違う種類であるのか、イオン電流の測定値から識別することは困難であった。本発明では、サンプルの体積が同じであっても、分子４と相互作用するサンプルと分子４と相互作用しないサンプルとでは、貫通孔３を通過する時間は明らかに異なる。したがって、イオン電流の変化時間（サンプルが貫通孔３に入り、出るまでの時間）と波形を解析することで、サンプルの種類を識別することができる。

また、同じ種類であっても、エクソソームやＤＮＡ塩基配列のように形状が異なるサンプルがある。図６に示すようにサンプル３１ａと３１ｂでは、貫通孔３を通過する時の貫通孔３内の体積変化が異なることから、測定するイオン電流の波形が異なる。しかしながら、従来の検出装置１−１では、サンプルが貫通孔３を通過するスピードが速いため、サンプルの形状の違いを精度よく測定することは難しかった。本発明では、分子４との相互作用により、サンプルが貫通孔３を通過する時間を長くできることから、同じ種類のサンプルの形状の違いの測定も期待できる。

解析部８は、電流計７で測定したイオン電流の値（波形）を解析する。サンプルが球形でない場合、図６に示すように同じ種類のサンプルであっても貫通孔３に入る際の向きが異なると、測定するイオン電流の波形（通過時間、形状等）が異なる場合がある。その場合、複数の測定結果に基づき解析すればよい。

表示部９は、測定したイオン電流の値（波形）、解析部８で解析した結果を表示できればよく、液晶ディスプレイ、プラズマディスプレイ、有機ＥＬディスプレイなど、公知の表示装置を用いればよい。

次に、本発明の検出装置１−１を用いた測定方法、及び識別方法について説明する。先ず、測定方法は、以下の手順で行うことができる。
（１）第１チャンバー５及び第２チャンバー６に、電解液を充填する。電解液は、第１電極５２及び第２電極６２が通電できれば特に制限は無く、ＴＥバッファー、ＰＢＳバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、ＫＣｌ水溶液等を用いればよい。このとき、第１チャンバー５内と第２チャンバー６内との間は、貫通孔３を介して液絡が取れている。
（２）サンプルを第１チャンバー５に添加する。
（３）電源５４により、第１電極５２及び第２電極６２に通電する。この通電により発生するイオン電流の値を電流計７で経時的に測定する。なお、細菌等のサンプルは表面電化を有する。したがって、第１電極５２及び第２電極６２に通電すると、通常の拡散に加え、第１チャンバー５に添加したサンプルは電気泳動により基板２に形成した貫通孔３を通過し、第２チャンバー６に移動するが、必要に応じて、サンプルが分散している溶液にポンプ等で圧力を加え、水流によってサンプルが貫通孔３を通過するようにしてもよい。

以上の手順により、サンプルが検出装置１−１の貫通孔３を通過する時のイオン電流を測定することができる。そして、サンプルの識別方法は、イオン電流の測定方法により測定した結果から、サンプルを識別すればよい。具体的には、イオン電流の測定値の低下の程度によりサンプルの大きさが分かる。また、サンプルの大きさが同じ場合でも、イオン電流の測定値が変化し定常状態に戻るまでの時間及び波形から、サンプルが分子４と相互作用するかどうかが分かるので、サンプルの種類を特定できる。

以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。

〔デバイス１の作製〕
＜実施例１＞
まず、両表面に５０ｎｍの窒化シリコン膜を持つ面方位（１００）のシリコンウエハー（Ｅ＆Ｍ ＣＯ．，ＬＴＤ）を２９ｍｍ四方に切った。基板の一方の面に約５００μｍ四方の領域の孔が形成されているエッチング防止用のメタルマスクをかぶせ、ＲＩＥ装置（ＲＩＥ−１０ＮＲ、ＳＡＭＣＯ ＣＯ．，Ｌｔｄ）によって、孔が形成されている５００μｍ四方の領域のみ窒化シリコン膜を除去し、シリコン表面をむき出しにした。その後、むき出しにした部分のシリコンのみを選択的に水酸化カリウム水溶液（和光純薬株式会社）によって、約３時間かけて１２５℃のホットプレート（Ｈｏｔ ｐｌａｔｅ ＮＩＮＯＳ ＮＤ−１、Ａｓ Ｏｎｅ ＣＯ．，Ｌｔｄ）上でウェットエッチングを行った。この操作により、基板の他方の面の窒化シリコン膜に到達するまでシリコンをエッチングした。窒化シリコン膜に到達したシリコンの孔は約１５０μｍ四方であった。

次に、上記約１５０μｍ四方のシリコンの孔を覆っている窒化シリコン膜のほぼ中央に、電子線描画法により貫通孔３のパターンの描画を行った。次いで、現像液に浸して現像を行い、ＲＩＥ装置によって反応性イオンエッチングにより、窒化シリコン膜に直径約２μｍの円筒状の貫通孔３を形成した。

次に、電子線レジスト（日本ゼオン社製ＺＥＰ５２０Ａ）を窒化シリコン上にスピンコーター（ミカサ社製ＭＳ−Ｂ１００）を用いてコートした。ホットプレート上で、１８０℃でベーキングの後、電子線描画装置法により貫通孔３の周囲のレジストを除去した。次に、サンユー電子社製ＳＶＣ−７００ＬＲＦを用い、貫通孔３に金を蒸着した。図７は、貫通孔３付近のＳＥＭ画像である。電子線レジストが除去されていた貫通孔３の周囲に金が蒸着しているのを確認した。写真からは分かりにくいが、貫通孔３内面にも金が蒸着していることを確認した。

次に、以下の手順により、大腸菌と相互作用するペプチドを貫通孔３に形成した。
（１）大腸菌表面の糖鎖と相互作用するペプチドを設計した。設計したペプチドのアミノ酸配列を以下に示す。
ＧＲＨＩＦＷＲＲＧＧＧＣ（配列番号１）
（２）設計したアミノ酸配列のペプチドを定法により合成し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１ｍＭとなるように溶解し、ペプチド溶液を作製した。
（３）デバイス１の貫通孔３に、上記（２）で作製したペプチド溶液を滴下し、２時間室温で静置した。
（４）ペプチド溶液をＰＢＳで数回リンスした。以上の手順によりデバイス１を作製した。

〔検出装置１−１の作製〕
＜実施例２＞
次に、実施例１で作製したデバイス１の基板２の上下に、電極、電解液及びサンプル投入用の孔を設けたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製のポリマーブロック（ＴＯＲＡＹ社製）を液密に貼り付け、第１チャンバー５及び第２チャンバー６を作製した。第１チャンバー５及び第２チャンバー６の容量は、各々約１０μｌであった。第１電極５２及び第２電極６２には銀塩化銀電極を用い、ポリマーブロックに設けた孔から第１チャンバー５及び第２チャンバー６に挿入した。電源５４として電池駆動のバイアス電源（アクシスネット）を用い、リードを介して第１電極５２に接続した。電流計７には、電流アンプと１ＭＨｚの高時間分解能を持つデジタイザ（ＮＩ５９２２， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてデータの取得を行い、取得したデータは、ＲＡＩＤドライブＨＤＤ（ＨＤＤ−８２６３、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏ．）に格納した。

＜比較例１＞
実施例１で作製したデバイスに、金蒸着とペプチドの結合を行わなかった以外は、実施例２と同様の手順で検出装置を作製した。

〔イオン電流の測定及び識別〕
次に、作製した検出装置１−１を用いて、サンプルが貫通孔３を通過する際のイオン電流を測定した。サンプルの調整と測定方法は以下のとおりである。
（１）サンプルの調整
サンプルには、大腸菌（ＪＭ１０９；タカラバイオ株式会社）及び枯草菌（２５９７５；ＡＴＣＣ）を用いた。枯草菌の大きさは、０．７−０．８×３．０μｍ、大腸菌の大きさは０．５×１．０〜３．０μｍで、ほぼ同じ大きさである。サンプルは定法により培養した。培養液を遠心分離で沈降し、遠心沈降物を２．５％のＬＢ培地（ＬＢ Ｂｒｏｔｈ ｍｉｌｌｅｒ，ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ，Ｃｏ．ＬＬＣ．）で洗浄した後、再度遠心分離により沈降した。遠心沈降物を５×１０^７ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈して、大腸菌懸濁液を作製した。
（２）イオン電流の測定
実施例２及び比較例１で作製した検出装置１−１の第２チャンバー６に、電解液（ＰＢＳバッファー：和光純薬社製）を充填した。次に、上記（１）で調整したサンプルをＰＢＳバッファーによって１００倍に希釈した１０μｌの溶液を第１チャンバー５に加え、第１電極５２及び第２電極６２に５０ｍＶの電圧を印加し、イオン電流Ｉ_ｉｏｎを測定した。

＜実施例３＞
サンプルとして大腸菌を用い、実施例２で作製した検出装置１−１を用いてイオン電流の測定を行った。

＜比較例２＞
実施例２で作製した検出装置１−１に代え、比較例１で作製した検出装置１−１を用いた以外は、実施例３と同様にイオン電流の測定を行った。

図８は、実施例３及び比較例２で測定したそれぞれ１個のサンプルのイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。図８から明らかなように、低下したイオン電流の値（Ｉｐ）は、実施例３及び比較例２とも同じであったことから、実施例３及び比較例２の測定では、大腸菌の大きさを正確に測定できたことを表している。一方、サンプルが貫通孔３に入ることでイオン電流値が低下し、サンプルが貫通孔３を出ることでイオン電流値が定常状態に戻るまでの時間（ｔｄ）は、実施例３の方が比較例２より明らかに長くなっていた。また、サンプルが貫通孔３を通過する時間が長くなったことで、図中の点線矢印で示すように、従来の測定では観察できなかった波形が見られるようになった。イオン電流値の低下は貫通孔３中のサンプル量に比例することから、本発明の測定方法により、サンプルの形状をより正確に測定したと考えられる。

＜実施例４＞
貫通孔３の直径を約３μｍとした以外は、実施例３と同様の手順で大腸菌及び枯草菌のイオン電流の測定を行った。図９（Ａ）は、実施例４で測定した結果のグラフである。

＜比較例３＞
貫通孔３の直径を約３μｍとした以外は、比較例２と同様の手順で大腸菌及び枯草菌のイオン電流の測定を行った。図９（Ｂ）は、比較例３で測定した結果のグラフである。

図９（Ｂ）に示すように、貫通孔３に分子を形成していない検出装置を用いた場合、大腸菌と枯草菌を測定したイオン電流の波形はほぼ同じであり、両者を区別することはできなかった。一方、図９（Ａ）に示すように、貫通孔３に分子を形成した検出装置を用いた場合は、分子との相互作用により、大腸菌と枯草菌を測定したイオン電流の波形は明らかに異なっていた。以上の結果より、貫通孔３にサンプルと相互作用する分子を形成することで、大きさがほぼ同じサンプルであっても、サンプルを識別できることが明らかとなった。

次に、相互作用する分子の種類、及びサンプルの種類を変えた種々の実験を行った。

［鞭毛あり大腸菌と鞭毛なし大腸菌の識別、分子：ペプチド］
＜実施例５＞
貫通孔３の直径を約３００ｎｍとし、分子４として大腸菌の鞭毛と相互作用するように設計したペプチドを用いた以外は、実施例１と同様の手順でデバイス１を作製し、次いで、実施例２と同様の手順で検出装置１−１を作製した。設計したペプチドのアミノ酸配列を以下に示す。
ＦＬＬＲＶＰＨＬＧＧＧＣ（配列番号２）

＜比較例４＞
配列番号２に示すペプチドを貫通孔に形成しなかった以外は、実施例５と同様の手順で、デバイス、及び検出装置を作製した。

＜実施例６（分子あり）および比較例５（分子なし）＞
次に、実施例５及び比較例４で作製した検出装置を用い、サンプルとして、鞭毛がある大腸菌［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，ＢＷ２５１１３（Ｎａｔｉｏｎａｌ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ，ＫＥＩＯ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）］、及び、鞭毛を構成する主要タンパク質であるＦｌｉＣを欠損させることで鞭毛をなくした大腸菌［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，ΔｆｌｉＣ（Ｎａｔｉｏｎａｌ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ， ＫＥＩＯ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）］を用いた以外は、上記〔イオン電流の測定及び識別〕と同様の手順で、サンプルを調製し、イオン電流の測定を行った。なお、大腸菌の大きさは、鞭毛の有無を除いて、ほぼ同じであった。

図１０（Ａ）は、実施例６で測定したそれぞれ１個のサンプルのイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。図１０（Ａ）から明らかなように、大腸菌の鞭毛を認識するペプチドを貫通孔に結合した実施例５の検出装置でイオン電流の値（Ｉｐ）を測定した場合、鞭毛の有無により、イオン電流値の波形が明らかに異なっていた。一方、図１０（Ｂ）は、比較例５で測定したそれぞれ１個のサンプルのイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。図１０（Ｂ）から明らかなようにペプチドを貫通孔に結合していない比較例５の検出装置では、波形はほぼ同じであり、鞭毛あり大腸菌、鞭毛なし大腸菌の識別はできなかった。

［インフルエンザウイルスの識別、分子：ペプチド］
＜実施例７＞
配列番号２に代え、インフルエンザウイルスを認識するように設計した以下の３種類のペプチドをそれぞれ用いた以外は、実施例５と同様の手順で、デバイス１及び検出装置１−１を作製した。
ＡＳＨＲＶＧＳＴＹＩＡＧＧＧＣ（配列番号３）
ＡＳＨＲＶＧＳＴＹＩＧＧＧＣ（配列番号４）
ＲＶＧＳＴＹＧＧＧＣ（配列番号５）

＜実施例８（分子あり）および比較例６、７（分子なし）＞
次に、実施例７及び比較例４で作製した検出装置を用い、サンプルとして、Ａ型のインフルエンザウイルス［Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ（Ｈ１Ｎ１），Ａ／ＰＲ／８／３４（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＶＲ−９５）］及びＢ型のインフルエンザウイルス［Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ ｖｉｒｕｓ，Ｂ／Ｌｅｅ／４０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＶＲ−１５３５）］を用い、以下に記載する手順でサンプルを調製した以外は、実施例６と同様の手順でイオン電流の測定を行った。

＜ウイルスの調整方法＞
ウイルスは、ふ化鶏卵内培養法の定法にて培養した。すなわち、ふらん器にて３７℃、湿度６０％以上で転卵しながら培養した１０〜１１日卵を検卵後、漿尿膜内にインフルエンザウイルスを接種し、さらに３日間培養した。気室から卵殻膜を破って吸引し漿尿液を採取した。

図１１（Ａ）は配列番号３、図１１（Ｂ）は配列番号４、図１１（Ｃ）は配列番号５の分子を用いた際の、それぞれ１個のサンプルのイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。図１１（Ａ）〜（Ｃ）から明らかなように、インフルエンザウイルスを認識するように設計したペプチドを貫通孔に結合した実施例８では、Ａ型、Ｂ型のインフルエンザウイルスを識別することができた。また、ペプチド配列の違いにより、測定したイオン電流の波形が大幅に異なることも確認した。一方、ペプチドを結合しなかった比較例６では、インフルエンザウイルスが貫通孔の周りに吸着し、イオン電流の測定ができなかった。なお、インフルエンザウイルスが貫通孔の周りに吸着したのは、金蒸着が原因と考えられた。そのため、貫通孔の直径を３００ｎｍとし、及び、金蒸着を行わず且つ分子を結合していない検出装置を実施例１および２に記載の手順に基づき作製し、イオン電流の測定を行った（比較例７）。図１１（Ｄ）は、比較例７でそれぞれ１個のサンプルのイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。図１１（Ｄ）に示すように、単に貫通孔を形成したのみでは、インフルエンザウイルスを識別することができなかった。以上の結果より、インフルエンザウイルスを識別できるのみならず、相互作用する分子を貫通孔に結合させることで、インフルエンザウイルスを測定できた。

［インフルエンザウイルスの識別、分子：糖鎖］
＜実施例９＞
配列番号２のペプチドに代え、インフルエンザウイルスを認識する下記の糖鎖（６’−シアリルラクトース；東京化成社製）を、以下の結合方法により貫通孔に結合した以外は、実施例５と同様の手順で、デバイス１及び検出装置１−１を作製した。
＜結合方法＞
オキシルアミノ基を有するウンデカンジスルフィド（Ｈ₂Ｎ−Ｏ−（ＣＨ₂）₁₁−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ₂）₁₁−ＯＨ、Ｈ₂Ｎ−Ｏ−（ＣＨ₂）₁₁−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ₂）₁₁−ＮＨ₂）（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）をＰａｒｋらの文献（Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００８，Ｖｏｌ．２４，６２０１−６２０７）を参考に合成を行った。得られた中間層形成材料をエタノールに溶解させ、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）形成用溶液を調製した。金の層を有する貫通孔をＳＡＭ形成用溶液に浸し、１時間置くことにより糖を固定化するためのＳＡＭを形成した。糖はｐＨ５．３の酢酸溶液中で０．１ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で調製し、１５分間貫通孔を浸すことで糖の固定化を行った。

＜実施例１０（分子あり）および比較例８（分子なし）＞
次に、実施例９及び比較例４で作製した検出装置を用い、サンプルとして無害化したインフルエンザウイルスを用い、実施例６と同様の手順でイオン電流の測定を行った。なお、無害化したインフルエンザウイルスは、以下に記載する手順で調整した。
＜無害化ウイルス調製方法＞
検体溶液の原液として、０．０５％パラホルムアルデヒド溶液により、無害化されたＡ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１（ＨＡ価２５６）を含む溶液を調製した。

図１２は、実施例１０及び比較例８で測定したそれぞれ１個のサンプルのイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。図１２から明らかなように、インフルエンザウイルスを認識する糖鎖を貫通孔に結合した実施例９の検出装置でイオン電流の値（Ｉｐ）を測定した場合、糖鎖を結合していない比較例４の検出装置で測定したイオン電流値の波形と明らかに異なっていた。したがって、糖鎖を貫通孔に形成することで、インフルエンザウイルスを識別できることが明らかとなった。

［その他の実施形態］
また、本発明は、以下のサンプル検出用デバイス、サンプル検出装置、イオン電流の検出方法及びサンプルの識別方法の実施形態を採ることもできる。また、上記に例示した実施形態と適宜組み合わせてもよい。
（１）基板、
該基板に形成されたサンプルが通過する貫通孔、
該貫通孔に形成され、通過するサンプルと相互作用する分子、
を含む、サンプル検出用デバイス。
（２）前記相互作用する分子が、ペプチド又は核酸である、
上記（１）に記載のサンプル検出用デバイス。
（３）前記貫通孔に金属層が積層され、前記相互作用する分子が金属層上に形成されている、
上記（１）又は（２）に記載のサンプル検出用デバイス。
（４）前記基板の一方の面側の少なくとも貫通孔を含む面とで電解液を充填する第１チャンバーを形成する第１チャンバー部材、
前記基板の他方の面側の少なくとも貫通孔を含む面とで電解液を充填する第２チャンバーを形成する第２チャンバー部材、
を含む、上記（１）〜（３）の何れか一に記載のサンプル検出用デバイス。
（５）上記（４）に記載のサンプル検出用デバイス、
前記第１チャンバーに形成された第１電極、
前記第２チャンバーに形成された第２電極、及び、
前記貫通孔をサンプルが通過する時のイオン電流を計測するための電流計、
を含む、
サンプル検出装置。
（６）基板に形成した貫通孔をサンプルが通過する時のイオン電流を測定するイオン電流の測定方法であって、
前記貫通孔にはサンプルと相互作用する分子が形成され、サンプルが前記分子と相互作用しながら前記貫通孔を通過することで、サンプルが前記貫通孔を通過する時間を長くした、
イオン電流の測定方法。
（７）前記相互作用する分子が、ペプチド又は核酸である、
上記（６）に記載のイオン電流の測定方法。
（８）上記（６）又は（７）に記載のイオン電流の測定方法により測定したイオン電流から、サンプルを識別するサンプルの識別方法。

本発明のデバイス１を用いることで、ほぼ同じ大きさサンプルであっても、識別することができる。したがって、イオン電流を測定する機器の検査装置の測定部として用いることができるので、検出装置の開発に有用である。

Claims (15)

1. 基板、
   該基板に形成された被検生体物質が通過する貫通孔、
   該貫通孔のみに形成され、通過する被検生体物質と相互作用する分子、
   を具備し、
   前記相互作用する分子は、
   前記貫通孔のみに金属層が積層され、前記貫通孔のみに積層された前記金属層上に形成されることで、前記貫通孔に形成され、
   被検生体物質が貫通孔を通過する時のイオン電流の波形により被検生体物質を識別することを特徴とする生体物質検出用デバイス。
2. 前記被検生体物質が、細菌、ウイルス、ＤＮＡ、タンパク質のいずれか一つ以上である、請求項１に記載の生体物質検出用デバイス。
3. 前記相互作用する分子が、ペプチド、糖鎖又は核酸である、請求項１または２に記載の生体物質検出用デバイス。
4. 基板、
   該基板に形成された被検生体物質が通過する貫通孔
   該貫通孔に形成され、通過する被検生体物質と相互作用する分子、
   を具備し、
   前記相互作用する分子が、配列番号２に示す鞭毛認識ペプチドである、被検生体物質が貫通孔を通過する時のイオン電流の波形により被検生体物質を識別することを特徴とする生体物質検出用デバイス。
5. 基板、
   該基板に形成された被検生体物質が通過する貫通孔
   該貫通孔に形成され、通過する被検生体物質と相互作用する分子、
   を具備し、
   前記相互作用する分子が、配列番号３乃至５から選択される１種のインフルエンザ認識ペプチドである、被検生体物質が貫通孔を通過する時のイオン電流の波形により被検生体物質を識別することを特徴とする生体物質検出用デバイス。
6. 基板、
   該基板に形成された被検生体物質が通過する貫通孔
   該貫通孔に形成され、通過する被検生体物質と相互作用する分子、
   を具備し、
   前記相互作用する分子が、インフルエンザ認識糖鎖（６’−ｓｉａｌｙｌｌａｃｔｏｓｅ）を含む、被検生体物質が貫通孔を通過する時のイオン電流の波形により被検生体物質を識別することを特徴とする生体物質検出用デバイス。
7. 前記基板の一方の面側の少なくとも貫通孔を含む面とで電解液を充填する第１チャンバーを形成する第１チャンバー部材、
   前記基板の他方の面側の少なくとも貫通孔を含む面とで電解液を充填する第２チャンバーを形成する第２チャンバー部材、
   を具備する、
   請求項１〜６の何れか一項に記載の生体物質検出用デバイス。
8. 請求項７に記載の生体物質検出用デバイス、
   前記第１チャンバーに形成された第１電極、
   前記第２チャンバーに形成された第２電極、及び、
   前記貫通孔をサンプルが通過する時のイオン電流を計測するための電流計、
   を含む、
   生体物質検出用検出装置。
9. 基板に形成した貫通孔を被検生体物質が通過する時のイオン電流を測定するイオン電流の測定方法であって、
   前記貫通孔には、被検生体物質と相互作用する分子が形成され、
   前記相互作用する分子は、
   前記貫通孔のみに金属層が積層され、前記貫通孔のみに積層された前記金属層上に形成されることで、前記貫通孔に形成され、
   被検生体物質が前記分子と相互作用しながら前記貫通孔を通過することで、イオン電流の波形の差異により、被検生体物質を識別することを特徴とする、
   イオン電流の測定方法。
10. 前記被検生体物質が、細菌、ウイルス、ＤＮＡ、タンパク質のいずれか一つ以上である、請求項９に記載のイオン電流の測定方法。
11. 前記相互作用する分子が、ペプチド、糖鎖又は核酸である、請求項９または１０に記載のイオン電流の測定方法。
12. 基板に形成した貫通孔を被検生体物質が通過する時のイオン電流を測定するイオン電流の測定方法であって、
    前記貫通孔には被検生体物質と相互作用する分子である配列番号２に示す鞭毛認識ペプチドが形成され、被検生体物質が前記分子と相互作用しながら前記貫通孔を通過することで、イオン電流の波形の差異により、被検生体物質を識別することを特徴とする、
    イオン電流の測定方法。
13. 基板に形成した貫通孔を被検生体物質が通過する時のイオン電流を測定するイオン電流の測定方法であって、
    前記貫通孔には被検生体物質と相互作用する分子である配列番号３乃至５から選択される１種のインフルエンザ認識ペプチドが形成され、被検生体物質が前記分子と相互作用しながら前記貫通孔を通過することで、イオン電流の波形の差異により、被検生体物質を識別することを特徴とする、
    イオン電流の測定方法。
14. 基板に形成した貫通孔を被検生体物質が通過する時のイオン電流を測定するイオン電流の測定方法であって、
    前記貫通孔には被検生体物質と相互作用する分子であるインフルエンザ認識糖鎖（６’−ｓｉａｌｙｌｌａｃｔｏｓｅ）を含む分子が形成され、被検生体物質が前記分子と相互作用しながら前記貫通孔を通過することで、イオン電流の波形の差異により、被検生体物質を識別することを特徴とする、
    イオン電流の測定方法。
15. 請求項９〜１４の何れか一項に記載のイオン電流の測定方法により測定したイオン電流から、被検生体物質を識別する生体物質の識別方法。