JP6629198B2

JP6629198B2 - ３５位にβ−ホモアルギニン置換を有するＨＰＹＹ（１−３６）

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Description

本発明は、ペプチドYY(PYY)の類似体及び/又は誘導体、並びにそれらの薬学的使用に関する。

配列表の参照による組み入れ
「配列表」という表題の配列表は、25054バイトであり、2013年11月12日に作成されたものであり、参照により本明細書に組み入れられる。

PYYは、食事中に遠位小腸及び結腸中のL細胞から放出される。PYYは、胃腸(GI)管において末梢作用を有し、更に満腹シグナルとしても中心的に作用することが知られている。PYYは、C末端アミドを有する36アミノ酸のペプチド[PYY(1-36)]として自然に分泌されるが、循環PYYのおよそ50%を構成するPYY(3-36)に切断される。分解に関与する酵素は、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV)である。PYY(3-36)は、プロテアーゼ及び他のクリアランスメカニズムによって迅速に除去される。PYY(3-36)の半減期は、ブタにおいて30分未満であることが報告されている(Ito T et al, Journal of Endocrinology (2006), 191, pp113-119)。したがってPYYは最善には及ばない薬物動態学的特性を示し、これは、このペプチドは少なくとも1日2回投与する必要があることを意味する。

PYY(1-36)は、極めて小さい選択性でY1、Y2及びY5受容体を活性化し、それよりもわずかに低くY4受容体を活性化するが、DPPIVによるプロセシングを受けたPYY(3-36)は、ある程度のY1及びY5親和性は保持されるが、Y1、Y4及びY5受容体よりもY2受容体に高い選択性を示す。Y2受容体の活性化は、食欲及び食物摂取を減少させることが知られており、それに対してY1及びY5受容体の活性化は、食欲及び食物摂取の増加をもたらす。更に、Y1及びY5受容体の活性化は、血圧の増加をもたらす可能性がある。

PYY(3-36)は、動物モデル及びヒトにおけるこれらのペプチドのうちある特定のペプチドの実証された作用、並びに肥満の人はPYYの低い基底レベルを有すること、並びにこのペプチドのより低い食事応答に基づいて、肥満症及び関連する疾患の治療での使用が示唆されてきた。更に、Y2アゴニストは、胃腸(GI)管において抗分泌及び吸収促進作用を有することが実証されてきた。多数の胃腸障害の治療においてY2アゴニストが使用される可能性が示唆されてきた。

例えばZuckerラット及び食物誘発性肥満(DIO)マウスにおいて実証された作用に基づいて、Y2選択的PYY(3-36)類似体はグルコース代謝に正の作用を有することから、糖尿病の治療のために使用されることが示唆されている(van den Hoek A. et al., Am J Physiol Endocrinol Metab (2006), 292, ppE238-E245; 及び Ortiz A. et al, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics (2007), 323, pp 692-700)。

WO2009/138511A1は、長時間作用性のY2及び/又はY4受容体アゴニストに関する。WO2011/033068A1は、C末端のタンパク質分解による分解に対して安定化されたPYY類似体に関する。WO2011/058165A1は、延長された薬物動態学的特性を有するY2受容体アゴニストに関する。

WO2009/138511A1 WO2011/033068A1 WO2011/058165A1 WO98/08871 WO2006/097537

Ito T et al, Journal of Endocrinology (2006), 191, pp113-119 van den Hoek A. et al., Am J Physiol Endocrinol Metab (2006), 292, ppE238-E245 Ortiz A. et al, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics (2007), 323, pp 692-700Greene及びWuts、「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons、1999 Florencio Zaragoza Dorwald、「Organic Synthesis on solid Phase」、Wiley-VCH Verlag GmbH、2000 「Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis」、W. C. Chan及びP. D. White編、Oxford University Press、2000 Protein Purification、J.-C. Janson及びLars Ryden編、VCH Publishers、New York、1989

肥満症及び糖尿病等のY受容体のモジュレーションに応答する状態の治療のために、Y受容体サブタイプであるY2に特異的であり、重要なことに延長された薬物動態学的特性も示し、したがってPYY又はPYY(3-36)より投与頻度が低い用量レジメンで使用できるPYY類似体を使用することが魅力的であると予想される。

本発明は、ヒトPYY(1-36)（hPYY(1-36)、配列番号1）の35位に対応する位置にβ-ホモアルギニンを含むPYY化合物に関する。

更に、又は代わりに、一態様において、PYY化合物は、hPYY(1-36)の7位に対応する位置におけるリシン、及びこのリシンのイプシロンアミノ基に連結された改変基を更に含む。

一態様において、本発明はまた、このようなPYY化合物及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物、並びにPYY化合物の医学的使用にも関する。

更に、又は代わりに、一態様において、本発明は、Y2受容体アゴニストであるPYY化合物に関する。

更に、又は代わりに、一態様において、本発明は、Y受容体サブタイプであるY1、Y4及びY5と比較して、Y受容体サブタイプであるY2への選択性を示すPYY化合物に関する。

更に、又は代わりに、一態様において、本発明は、hPYY(3-36)の半減期より長い半減期を有するPYY化合物に関する。更に、又は代わりに、一態様において、本発明は、hPYY(1-36)の半減期より長い半減期を有するPYY化合物に関する。

本発明は、PYY化合物に関する。本発明のPYY化合物は、hPYY(1-36)の35位に対応する位置におけるアミノ酸がβ-ホモアルギニンで置換されたものである。

更に、又は代わりに、一態様において、本発明は、Y受容体サブタイプであるY2のアゴニストであるPYY化合物に関する。

一態様において、他の受容体よりも特異的な受容体に「選択的」なペプチドは、インビトロにおいて、受容体の機能に関するアッセイ、例えばActone機能的効力アッセイで測定して、EC₅₀値で比較した場合、又はシンチレーション近接アッセイ(SPA)で受容体結合親和性を測定して、Ki値で比較した場合、あるY受容体に、他のY受容体よりも少なくとも10倍、例えば少なくとも20倍、少なくとも50倍、又は少なくとも100倍高い効力を示すペプチドを指す。

以下の記載において、ギリシャ文字は、それらの記号又は対応する記述名で表される場合があり、例えばα=アルファ、β=ベータ、ε=イプシロン、γ=ガンマ、ω=オメガ等である。

PYY化合物
用語「hPYY(1-36)」は、本明細書で使用される場合、ヒトペプチドYYを指し、その配列は、配列番号1として配列表に包含される。配列番号1の配列を有するペプチドはまた、ネイティブhPYYと称される場合もある。

用語「PYY化合物」は、本明細書で使用される場合、hPYY(1-36)のバリアントであるペプチド又は化合物を指す。また用語「PYY化合物」は、本明細書で使用される場合、hPYY(3-36)(配列番号2)のバリアントであるペプチド又は化合物を指す場合もある。

また用語「PYY化合物」は、本明細書で使用される場合、hPYY(4-36)のバリアントであるペプチド又は化合物を指す場合もある。

本発明のPYY化合物のC末端は、ネイティブhPYY(1-36)(配列番号1)及びhPYY(3-36)(配列番号2)のC末端がそれぞれそうであるように、アミドである。

本発明のPYY化合物は、PYY類似体及び/又はそれらの誘導体であってもよい。

用語「PYY類似体」は、骨格中少なくとも1つのアミノ酸改変が存在するPYY化合物に関して使用される。

用語「PYY誘導体」は、共有結合で連結された少なくとも1つの非アミノ酸置換基を含むPYY化合物に関して使用される。

したがってPYY類似体の誘導体は、少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、共有結合で連結された少なくとも1つの非アミノ酸置換基を含むPYY化合物である。

本発明のPYY化合物は、hPYY(3-36)と比較して10個までのアミノ酸改変を含んでいてもよい。

本出願にわたり使用される用語「アミノ酸改変」は、hPYY(3-36)と比較したアミノ酸への改変の意味で使用される。この改変は、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、あるアミノ酸の別のアミノ酸での置換、又はペプチドのアミノ酸に共有結合で連結された置換基の結果であり得る。

本発明のPYY化合物は、hPYY(1-36)の35位に対応する位置にL-β-ホモアルギニン(β-homoArg35)を含んでおり、これは、本発明のPYY化合物は、hPYY(1-36)の35位に対応する位置におけるこの改変に加えて、9個までのアミノ酸改変を含み得ることを意味する。

更に別の態様において、本発明のPYYペプチドは、hPYY(3-36)に少なくとも70%、75%又は80%の配列同一性を示し得る。2つの類似体間の配列同一性を決定するための方法の一例として、2つのペプチド[β-homoArg35]hPYY(3-36) 及びhPYY(3-36)が並べられる。hPYY(3-36)に対する[β-homoArg35]hPYY(3-36)類似体の配列同一性は、並べられた同一の残基の数から異なる残基の数を引いた値をhPYY(3-36)中の残基の総数で割ることによってもたらされる。したがって、前記例において、配列同一性は、(34-1)/34である。

本発明のPYY化合物又はPYY類似体は、i)変化したアミノ酸残基に対応するhPYY(1-36)中のアミノ酸残基の番号[すなわち、hPYY(1-36)中の対応する位置]、及びii)実際の変化を参照することによって記述される場合がある。

以下は、好適な類似体の学術名の非限定的な例である。[β-homoArg35]hPYY(3-36)は、ヒトPYY(1-36)の類似体であって、35位における天然に存在するアルギニンがL-β-ホモアルギンで置換されており、それぞれ1及び2位における天然に存在するチロシン及びプロリンが欠失している類似体を指す。

以下は、好適な類似体の学術名の非制限的な例である。[β-homoArg35]hPYY(3-36)は、ヒトPYY(1-36)の類似体であって、35位における天然に存在するアルギニンがβ-ホモアルギンで置換されており、それぞれ1及び2位における天然に存在するチロシン及びプロリンが欠失している類似体を指す。

以下は、PYY類似体の誘導体に関する好適な学術名の非限定的な例である。7-N{イプシロン}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]-[Lys7、β-homoArg35]hPYY(3-36)は、ヒトhPYY(3-36)の類似体の誘導体を指し、ここで[Lys7、β-homoArg35]は、hPYY(3-36)(配列番号2)と比較したアミノ酸の変化を指定しており、更に置換基[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-は、hPYY(1-36)中の7位に対応する位置におけるリシンのイプシロンアミノ基に連結されている。

表現「〜と同等の位置」又は「対応する位置」は、hPYY(1-36)を参照することによりバリアントPYY配列中の変化の部位を特徴付けるのに使用し得る。

一般的に、本出願にわたり、PYY類似体の特定の位置に言及する場合、言及された位置は、hPYY(1-36)のその特定の位置に対応するPYY類似体の位置である。

本出願にわたり使用される、PYY化合物はhPYY(1-36)のある特定の位置に対応する位置に特定のアミノ酸を含むという表現は、その位置におけるネイティブアミノ酸が、その特定のアミノ酸で置き換えられていることを意味する。

アミノ酸残基は、それらの完全な名称、それらの1文字コード、及び/又はそれらの3文字コードで識別することができる。これらの3つの方法は、完全に等価である。

ある特定の具体的な変化を「含む」類似体は、hPYY(1-36)と比較した場合、更なる変化を含んでいてもよい。一態様において、類似体は、具体的な変化を「有する」。

PYY類似体
PYY類似体は、hPYY(1-36)と比較した場合、アミノ酸残基の数が改変されているPYYペプチドである。これらの改変は、置換、挿入、及び/又は欠失を、単独で、又は組み合わせて包含する。

具体的な態様において、本発明のPYY類似体は、「非必須」アミノ酸残基の1つ又は複数の改変を包含する。本発明の状況において、「非必須」アミノ酸残基は、Y2受容体に対するPYY類似体の活性を無効にしたり又は実質的に低減したりすることなく、ヒトPYYのアミノ酸配列において変更されうる、すなわち欠失又は置換されうる残基である。

置換。一態様において、アミノ酸は、保存的置換によって置換されていてもよい。本明細書で使用される場合、用語「保存的置換」は、1つ又は複数のアミノ酸が、別の生物学的に類似した残基で置き換えられることを示す。例としては、類似の特徴を有するアミノ酸残基との置換、例えば小さいアミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸及び芳香族アミノ酸との置換が挙げられる。

一態様において、本発明のPYY類似体は、PYYの配列への、1つ又は複数の天然にはない及び/又は非アミノ酸、例えばアミノ酸模倣物の置換を含んでいてもよい。

欠失及びトランケーション。一態様において、本発明のPYY類似体は、ヒトPYYのアミノ酸配列から欠失した1つ又は複数のアミノ酸残基を、単独で、又は1つ又は複数の挿入若しくは置換と組み合わせて有していてもよい。

挿入。一態様において、本発明のPYY類似体は、ヒトPYYのアミノ酸配列に挿入された1つ又は複数のアミノ酸残基を、単独で、又は1つ又は複数の欠失及び/若しくは置換と組み合わせて有していてもよい。

一態様において、本発明のPYY類似体は、PYYの配列への、1つ又は複数の天然にはないアミノ酸及び/又は非アミノ酸の挿入を包含していてもよい。

PYYペプチドは、脊椎動物、例えばヒト、マウス、ヒツジ、ヤギ、ウシ、又はウマから誘導されてもよい。用語「脊椎動物」は、脊索動物門の主要な部門である、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、及び哺乳動物を含む脊椎動物亜門のメンバーを意味し、これらは全て、セグメント化した脊柱と独特な高分化した頭を特徴とする。用語「哺乳動物」は、ヒト並びに哺乳綱における恒常性メカニズムを有する動物界の全ての他の温血種、例えば、コンパニオン哺乳動物、動物園の哺乳動物、及び食料源としての哺乳動物を意味する。コンパニオン哺乳動物のいくつかの例は、イヌ類(例えば、イヌ)、ネコ類(例えば、ネコ)及びウマであり、食料源としての哺乳動物のいくつかの例は、ブタ、ウシ、ヒツジ、及び同種のものである。一態様において、哺乳動物は、ヒト又はコンパニオン哺乳動物である。一態様において、哺乳動物は、ヒト、男性又は女性である。

用語「ペプチド」は、例えば本発明のPYY化合物に関して使用される場合、アミド(又はペプチド)結合によって相互に接続された一連のアミノ酸を含む化合物を指す。

本発明のPYYペプチドは、ペプチド結合によって接続された少なくとも25の構成要素としてのアミノ酸を含む。特定の実施形態において、PYYペプチドは、少なくとも33アミノ酸を含む。特定の実施形態において、PYYペプチドは、少なくとも34アミノ酸を含む。

アミノ酸は、アミン基及びカルボン酸基、並びに任意選択でしばしば側鎖と称される1つ又は複数の追加の基を含有する分子である。

用語「アミノ酸」は、タンパク質生成性の(proteinogenic)(又は天然)アミノ酸(20種の標準アミノ酸のなかから)、並びに非タンパク質生成性の(又は非天然)アミノ酸を包含する。タンパク質生成性のアミノ酸は、天然においてタンパク質に取り込まれるアミノ酸である。標準アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされたアミノ酸である。非タンパク質生成性のアミノ酸は、タンパク質中に存在しないか、又は標準的な細胞機構によって産生されないかのいずれかである(例えば、それらは、翻訳後修飾で処理されたものであり得る)。非タンパク質生成性のアミノ酸の非限定的な例は、Aib(α-アミノイソ酪酸)、β-homoArg(L-β-ホモアルギニン)、並びにタンパク質生成性のアミノ酸のD-異性体である。

以下の記載において、光学異性体が明示されていないPYY化合物の全てのアミノ酸は、(特に他の規定がない限り)L-異性体を意味すると理解されるものとする。

PYY誘導体
用語「誘導体」は、本明細書においてPYYペプチド又は類似体に関して使用される場合、1つ又は複数の置換基がペプチドに共有結合で連結された化学改変PYYペプチドを意味する。

本発明の一態様において、置換基は、N末端置換基であってもよい。

更に、又は代わりに、一態様において、置換基は、改変基であってもよいし、又は代わりに、延長化部分と称される場合もある。

N末端置換基
本発明の一態様において、PYY化合物は、PYY化合物のN末端におけるアミノ酸残基中のアルファ-アミノ基に共有結合で連結された置換基を含む。一態様において、hPYY(1-36)の1〜3位に対応する位置におけるアミノ酸残基は存在せず、N末端置換基は、hPYY(1-36)の4位に対応する位置におけるアミノ酸残基に共有結合で連結されている。

一態様において、N末端置換基は、アルコキシ基である。一態様において、N末端置換基は、12個までの炭素原子を含むアルコキシ基である。別の態様において、N末端置換基は、最大6個の炭素原子を含むアルコキシ基である。

改変基/延長化部分
一態様において、PYY化合物は、hPYY(1-36)の7位に対応する位置におけるアミノ酸残基に共有結合で連結された置換基又は改変基を含む。更なる一態様において、置換基又は改変基は、タンパク質との非共有結合によるコンジュゲートを形成することができ、それによって、誘導体の血流による循環が促進され、更にはPYY誘導体とアルブミンとのコンジュゲートが腎クリアランスではゆっくりとしか除去されないことにより、誘導体の作用時間を延長化する作用も付与される。したがって、置換基又は改変基は、総じて延長化部分と称される場合もある。

改変基は、アシル化により、すなわち、改変基のカルボン酸基とリシン残基のイプシロンアミノ基との間に形成されるアミド結合を介して、PYYペプチドのリシン残基に共有結合で連結されていてもよい。またリシンのアミノ基は、還元的アミノ化により改変基のアルデヒドにカップリングされてもよい。別の態様において、システインのチオール基は、マイケル付加により改変基のマレイミド(maleiimido)基にカップリングされてもよいし、又は求核置換により改変基のクロロ-又はヨードアセチル基にカップリングされてもよい。

一態様において、改変基は、アシル化により、すなわち、改変基のカルボン酸基とリシン残基のイプシロンアミノ基との間に形成されるアミド結合を介して、hPYY(1-36)の7位に対応する位置におけるリシン残基に共有結合で連結されていてもよい。

本発明の誘導体は、同じ分子式及び結合した原子の配列を有するが、空間中でのそれらの原子の3次元方位においてのみ異なっている、異なる立体異性体の形態で存在し得る。例示された本発明の誘導体の立体異性は、実験のセクションにおいて、標準的な学術名を使用して、名称と構造で提示される。特に他の指定がない限り、本発明は、特許請求された誘導体の全ての立体異性体の形態に関する。

本発明の一態様において、光学異性体が明示されていないPYY化合物の全てのアミノ酸は、L-異性体(特に他の規定がない限り)を意味すると理解されるものとする。

薬学的に許容される塩
本発明のPYY化合物は、薬学的に許容される塩の形態であってもよい。

塩は、例えば塩基と酸との化学反応によって形成され、例えば、2NH₃+H₂SO₄→(NH₄)₂SO₄によって形成される。

塩は、塩基性塩、酸性塩であってもよいし、又は塩は、そのどちらでもない場合もある(すなわち中性塩)。水中で、塩基性塩は水酸化物イオンを産生し、酸性塩はヒドロニウムイオンを産生する。

本発明の誘導体の塩は、付加されたカチオン又はアニオンと、それぞれアニオン性又はカチオン性基とで形成されてもよい。これらの基は、本発明の誘導体のペプチド部分及び/又は側鎖中に存在していてもよい。

本発明の誘導体のアニオン性基の非限定的な例としては、側鎖中の遊離のカルボン酸基、もしあれば、並びにペプチド部分中の遊離のカルボン酸基が挙げられる。ペプチド部分は、Asp及びGlu等の内部の酸のアミノ酸残基に遊離のカルボン酸基を包含することが多い。

ペプチド部分中のカチオン性基の非限定的な例としては、N末端における遊離のアミノ基、存在する場合、並びにHis、Arg、及びLys等の内部の塩基性アミノ酸残基のあらゆる遊離のアミノ基が挙げられる。

機能特性
第一の機能的な態様において、本発明のPYY化合物は、優れたY2受容体の効力を有する。更に、又は代わりに、第二の態様において、本発明のPYY化合物は、Y2受容体に極めてよく結合する。好ましくは、本発明のPYY化合物は、hPYY(1-36)及びhPYY(3-36)と比較して、受容体を十分に活性化する能力と組み合わされたY2受容体に強く結合するそれらの能力によって反映されるように、完全なY2受容体アゴニストである。

更に、又は代わりに、第二の機能的な態様において、本発明は、Y受容体サブタイプであるY1、Y4及びY5と比較して、Y受容体サブタイプであるY2への選択性を示すPYY化合物に関する。

更に、又は代わりに、第三の機能的な態様において、本発明のPYY化合物は、改善された薬物動態学的特性を有する。更に、又は代わりに、第四の機能的な態様において、本発明のPYY化合物は、増加した半減期及び/又は減少したクリアランスを有する。更に、又は代わりに、第五の機能的な態様において、それらは、インビボで血糖を減少させる作用を有する。更に、又は代わりに、第六の機能的な態様において、それらは、インビボで食物摂取を減少させる作用を有する。

生物活性-インビトロにおける効力
第一の機能的な態様によれば、本発明のPYY化合物は、生物学的に活性であるか又は効力を有する。

特定の実施形態において、効力及び/又は活性は、インビトロにおける効力、すなわち機能的なY2受容体アッセイにおける性能を指し、より詳細にはヒトY2受容体を活性化する能力を指す。

最大有効濃度(EC₅₀)という用語は、一般的に、用量反応曲線を参照して、ベースラインと最大値の半分の応答を誘導する濃度を指す。EC₅₀は、化合物の効力の尺度として使用され、その最大の作用の50%が観察される濃度を表す。

本発明の誘導体のインビトロにおける効力は、実施例31で説明されているようにして決定することができ、対象となる誘導体のEC₅₀が決定される。EC₅₀値が低ければ低い程、効力はより優れている。

一態様において、本発明の誘導体は、実施例31の方法を使用して決定された、100nM又はそれ未満におけるEC₅₀に対応するインビトロにおける効力を有する。他の態様において、本発明の誘導体は、実施例31の方法を使用して決定された、50nM又はそれ未満におけるEC₅₀に対応するインビトロにおける効力を有する。他の態様において、本発明の誘導体は、実施例31の方法を使用して決定された、25nM又はそれ未満におけるEC₅₀に対応するインビトロにおける効力を有する。

生物活性-インビトロでの受容体結合
第二の機能的な態様によれば、本発明のPYY化合物は、Y2受容体に極めてよく結合する。これは、実施例32で説明されているようにして決定され得る。

一般的に、Y2受容体への結合は、低いKi値に対応して可能な限り優れていると予想される。Ki値は、チェン-プルソフの方程式Ki=IC50/(1+[L]/Kd)によって決定され、式中、IC50は、アゴニストの最大阻害濃度の半分であり、[L]は、放射性リガンドの濃度であり、Kdは、結合に関する解離定数である。

一例として、一態様において、Y2受容体の結合親和性(Ki)は、100nM未満である。一態様において、Y2受容体の結合親和性(Ki)は、50nM未満である。一態様において、Y2受容体の結合親和性(Ki)は、10nM未満である。

生物活性-インビボにおける薬理学
別の特定の実施形態において、本発明のPYY化合物は、インビボで効力を有しており、これは、あらゆる好適な動物モデルで、並びに臨床試験において当業界において公知のように決定され得る。

糖尿病db/dbマウスが好適な動物モデルの一例であり、このようなマウスで、例えば実施例34で説明されているように血糖を低下させる作用をインビボで決定することができる。

加えて、db/dbマウスにおける食物摂取の阻害も、食物摂取及び体重に対する作用を決定するための好適なモデルであり、これも実施例34で説明されている通りである。

一般的に、1 umol/kgの用量のグルコース低下作用は可能な限り優れていると予想され、これはグルコースレベルの低い相対的%に一致する。

一例として、本発明の特定の態様において、投与後16時間において、グルコースレベルの相対的%は、80%未満である。本発明の一態様において、投与後16時間において、グルコースレベルの相対的%は、70%未満である。本発明の一態様において、投与後16時間において、グルコースレベルの相対的%は、60%未満である。

一例として、本発明の特定の態様において、投与後16時間おいて、相対的食物摂取の%は、40%未満である。本発明の一態様において、投与後16時間において、相対的食物摂取の%は、30%未満である。本発明の一態様において、投与後16時間において、相対的食物摂取の%は、20%未満である。

薬物動態プロファイル
第三の機能的な態様によれば、本発明のPYY化合物は、改善された薬物動態学的特性、例えば増加した終末相半減期(terminal half-lief)及び/又は減少したクリアランスを有する。

終末相半減期を増加させること及び/又はクリアランスを減少させることは、対象となる化合物が体からより遅く除去されることを意味する。本発明の化合物に関して、これは、薬理効果の持続時間の延長をもたらす。

本発明の誘導体の薬物動態学的特性は、好適には、薬物動態学的(PK)研究においてインビボで決定され得る。このような研究は、どのように医薬化合物が体内で吸収されるか、分散されるか、及び除去されるか、並びにどのようにこれらのプロセスが時間経過にわたり体内で化合物の濃度に影響を与えるかを評価するために行われる。

医薬開発の発見期及び前臨床期において、この特徴付けを行うために、マウス、ラット、サル、イヌ、又はブタ等の動物モデルを使用してもよい。これらのモデルのいずれも、本発明の誘導体の薬物動態学的特性を試験するために使用することができる。

終末相半減期及び/又はクリアランスの推測は、新しい医薬化合物の評価において、用量レジメン及び医薬開発中の重要なパラメーターを評価するのに適している。

薬物動態プロファイル-ミニブタにおけるインビボでの半減期
第三の機能的な態様によれば、本発明の誘導体は、改善された薬物動態学的特性を有する。

特定の実施形態において、薬物動態学的特性は、例えば本明細書において実施例33で説明されているように、i.v.投与後のミニブタにおけるインビボでの終末相半減期(T_1/2)として決定されてもよい。

本発明の一態様において、ミニブタにおける終末相半減期は、少なくとも10時間である。本発明の一態様において、ミニブタにおける終末相半減期は、少なくとも20時間である。本発明の更に別の態様において、ミニブタにおける終末相半減期は、少なくとも40時間である。

PYY化合物の産生
本発明のPYY化合物のようなペプチドの産生は当業界において周知である。

本発明の誘導体のPYY部分は、例えば、古典的なペプチド合成、例えばt-Boc若しくはFmoc化学を使用する固相ペプチド合成、又は他の十分に確立された技術によって産生してもよい。例えば、Greene及びWuts、「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons、1999、Florencio Zaragoza Dorwald、「Organic Synthesis on solid Phase」、Wiley-VCH Verlag GmbH、2000、及び「Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis」、W. C. Chan及びP. D. White編、Oxford University Press、2000を参照されたい。

更に、又は代わりに、これらは、組換え方法によって産生してもよく、すなわち類似体をコードするDNA配列を含有しており、ペプチドの発現を許容する条件下における好適な栄養培地中でペプチドを発現することができる宿主細胞を培養することによって産生してもよい。これらのペプチドの発現に好適な宿主細胞の非限定的な例は、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)、並びに哺乳動物BHK又はCHO細胞株である。

非天然アミノ酸及び/又は共有結合で連結された置換基を包含する本発明のPYY化合物は、例えば実験の部で説明されているようにして産生してもよい。

多数の本発明のPYY化合物を調製する方法の具体的な例は、実験の部に記載される。

タンパク質精製
本発明のPYY化合物は、これらに限定されないが、クロマトグラフィー[例えば、イオン交換、アフィニティ、疎水性、及び逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)]、電気泳動手法、又は抽出等の当業界において公知の様々な手法によって精製され得る(例えば、Protein Purification、J.-C. Janson及びLars Ryden編、VCH Publishers、New York、1989を参照)。

投与様式
用語「治療」は、特に他の指定がない限り、又は明らかに状況と矛盾しない限り、言及された疾患、障害、又は状態の予防と最小化の両方を包含することを意味する(すなわち、「治療」は、本発明のPYY化合物又は本発明のPYY化合物を含む組成物の予防的及び治療的投与の両方を指す)。

投与経路は、体内の所望の又は適切な場所に本発明の化合物を、例えば非経口的に、例えば皮下に、筋肉内に、又は静脈内に効果的に輸送するあらゆる経路であり得る。代わりに、本発明の化合物は、経口的に、肺に、直腸に、経皮的に、頬側に、舌下に、又は経鼻的に投与することができる。

医薬組成物
本発明のPYY化合物を含む注射用組成物は、必要に応じて成分を溶解させて混合し、所望の最終産物を得ることを含む医薬産業の従来の技術を使用して調製することができる。したがって、手法の1つによれば、沈殿が最小化又は回避されるような好適なpHで、本発明のPYY化合物を好適な緩衝液に溶解させる。注射用組成物は、例えば濾過滅菌によって滅菌される。

組成物は、安定化された配合物であり得る。用語「安定化された配合物」は、増加した物理的及び/又は化学的安定性、好ましくはその両方を有する配合物を指す。一般的に、配合物は、有効期限に達するまで使用中及び貯蔵中に(推奨された使用及び貯蔵条件に従って)安定でなければならない。

用語「物理的安定性」は、熱機械的ストレスへの曝露、及び/又は不安定な境界面及び表面(例えば疎水性表面)との相互作用の結果として、生物学的に不活性及び/又は不溶性の集合体を形成するポリペプチドの傾向を指す。水性ポリペプチド配合物の物理的安定性は、様々な期間にわたり異なる温度で機械的/物理的ストレス(例えばかき混ぜ)に曝露した後、目視検査を用いて、及び/又は濁度測定によって評価され得る。代わりに、物理的安定性は、例えばチオフラビンT又は「疎水性パッチ」プローブ等の、ポリペプチドのコンフォメーション状態の分光学的物質又はプローブを使用して評価され得る。

用語「化学的安定性」は、無傷のポリペプチドと比較して低減した生物学的な効力及び/又は増加した免疫原性作用を有する可能性がある化学分解産物の形成を引き起こす、ポリペプチド構造における化学的(特定には共有結合の)変化を指す。化学的安定性は、例えばSEC-HPLC、及び/又はRP-HPLCによって、異なる環境条件に曝露した後の様々なタイムポイントで化学分解産物の量を測定することによって評価され得る。

一態様において、本発明は、改善された物理的安定性を有するPYY化合物を提供する。一態様において、本発明は、改善された化学的安定性を有するPYY化合物を提供する。

組合せ治療
本発明に係るPYY化合物での治療はまた、1種又は複数の追加の薬理学的に活性な物質と組み合わされてもよく、このような物質は、例えば、抗糖尿病剤、抗肥満剤、食欲を調節する薬剤、抗高血圧剤、糖尿病の結果生じるか又はそれに関連する合併症の治療及び/又は予防のための薬剤、並びに肥満症の結果生じるか又はそれに関連する合併症及び障害の治療及び/又は予防のための薬剤から選択される。

これらの薬理学的に活性な物質の例は、GLP-1受容体アゴニスト、インスリン、DPP-IV(ジペプチジルペプチダーゼ-IV)阻害剤、アミリンアゴニスト及びレプチン受容体アゴニストである。

医薬に関する提示
また本発明は、医薬品として使用するための、本発明のPYY化合物にも関する。

本発明の特定の態様において、本発明のPYY化合物は、以下の薬物療法のために使用され得る:
(i)糖尿病の全ての形態、例えば高血糖症、2型糖尿病、耐糖能異常、1型糖尿病、非インスリン依存性糖尿病、MODY(若年発症成人型糖尿病)、妊娠糖尿病の予防及び/若しくは治療、並びに/又はHbA1Cの低減のための予防及び/若しくは治療;
(ii)糖尿病性疾患の進行、例えば2型糖尿病の進行の遅延若しくは予防、耐糖能異常(IGT)からインスリンを必要とする2型糖尿病への進行の遅延、インスリン耐性の遅延若しくは予防、及び/又はインスリンを必要としない2型糖尿病からインスリンを必要とする2型糖尿病への進行の遅延;
(iii)β細胞の機能の改善、例えばβ細胞のアポトーシスの低減、β細胞の機能及び/若しくはβ細胞の質量の増加、並びに/又はβ細胞へのグルコース感受性の回復;
(iv)例えば食物摂取を減少させること、体重を低減すること、食欲を抑制すること、満腹を誘導することによる、摂食障害、例えば肥満症の予防及び/又は治療;抗精神病薬若しくはステロイドの投与により誘発された過食障害、神経性大食症、及び/若しくは肥満症の治療若しくは予防;胃運動の低減;胃内容排出の遅延;身体の可動性の増加;並びに/又は肥満症との共存症、例えば変形性関節症及び/若しくは尿失禁の予防及び/若しくは治療;
(v)糖尿病の合併症、例えば脈管障害;ニューロパシー、例えば末梢神経疾患;腎症;及び/又は網膜疾患の予防及び/又は治療;
(vi)脂質パラメーターの改善、例えば、脂質代謝異常の予防及び/又は治療、総血清中脂質の低下;HDLの増加;小型高密度LDLの低下;VLDLの低下;トリグリセリドの低下;コレステロールの低下;ヒトにおけるリポタンパク質a[Lp(a)]の血漿濃度の低下;インビトロ及び/又はインビボでのアポリポタンパク質a[アポ(a)]の生成の阻害;
(vii)心臓血管疾患の予防及び/又は治療;並びに/或いは
(viii)睡眠時無呼吸の予防及び/又は治療。

以下に示すもの、すなわち2型糖尿病、及び/又は肥満症が特に好ましい。

一態様において、対象においてエネルギー代謝を変更するための方法が本明細書で開示される。本方法は、治療有効量の本発明のPYY化合物を対象に投与すること、それによってエネルギー消費を変更することを包含する。エネルギーは、全ての生理学的プロセスで燃焼される。体は、それらのプロセスの効率をモジュレートすること、又は発生するプロセスの数と性質を変化させることによってエネルギー消費の速度を直接変更することができる。例えば、消化中、体は、食物を腸に通過させて食物を消化することによりエネルギーを消費し、細胞内では、細胞代謝の効率を変更して、程度の差はあるが熱を産生することができる。

一態様において、食物摂取を協調的に変更し、エネルギー消費を相互に変更する、本出願で説明される正確な回路構成のありとあらゆる操作のための方法が本明細書で開示される。エネルギー消費は、細胞代謝、タンパク質合成、代謝率、及びカロリー利用の結果である。したがって、この実施形態において、末梢投与は、エネルギー消費の増加、及びカロリー利用効率の減少をもたらす。一態様において、治療有効量の本発明に係るPYY化合物が対象に投与され、それによってエネルギー消費を増加させる。

「肥満症」は一般的に30を超える肥満指数と定義されるが、本開示の目的に関して、体重の低減を必要とするか又は願う30未満の肥満指数を有する対象を含むあらゆる対象が、「肥満」の範囲に包含される。理論によって限定されることは意図しないが、食物摂取の低減、胃内容排出を遅延させること、栄養素の利用可能性の低減、及び体重の減少を引き起こすことにおける、末梢投与された本発明のPYY化合物の作用は、PPファミリー中の、又はそれに類似した1つ又は複数の独特な受容体クラスとの相互作用によって決定されると考えられる。より特定には、PYY選択性(又はY2)受容体に類似した1種又は複数の受容体が含まれると考えられる。

特定の実施形態
以下の本発明の非限定的な実施形態によって本発明を更に説明する。

1. hPYY(1-36)(配列番号1)の35位に対応する位置にL-β-ホモアルギニンを含むPYY化合物、及びそれらの薬学的に許容される塩。

2. hPYY(3-36)と比較して最大で10個のアミノ酸改変を有する、実施形態1に係るPYY化合物。

3. hPYY(3-36)と比較して最大で8個のアミノ酸改変を有する、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

4. hPYY(3-36)と比較して最小で4個のアミノ酸改変を有する、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

5. hPYY(3-36)と比較して最小で6個のアミノ酸改変を有する、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

6. hPYY(3-36)と比較して最小で8個のアミノ酸改変を有する、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

7. hPYY(3-36)と比較して4から10個の範囲のアミノ酸改変を有する、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

8. hPYY(3-36)と比較して6から8個の範囲のアミノ酸改変を有する、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

9. hPYY(3-36)と比較して6個のアミノ酸改変を有する、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

10. hPYY(3-36)と比較して8個のアミノ酸改変を有する、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

11. hPYY(3-36)に少なくとも70%の配列同一性を示す、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

12. hPYY(3-36)に少なくとも75%の配列同一性を示す、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

13. hPYY(3-36)に少なくとも80%の配列同一性を示す、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

14. hPYY(1-36)(配列番号1)の1及び2位に対応する位置が存在しない、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

15. hPYY(1-36)(配列番号1)の1〜3位に対応する位置が存在しない、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

16. hPYY(1-36)(配列番号1)の4位に対応する位置にアルギニンを更に含む、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

17. hPYY(1-36)(配列番号1)の18位に対応する位置にグルタミンを更に含む、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

18. hPYY(1-36)(配列番号1)の22位に対応する位置にAibを更に含む、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

19. hPYY(1-36)(配列番号1)の24位に対応する位置にアラニンを更に含む、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

20. hPYY(1-36)(配列番号1)の24位に対応する位置にAibを更に含む、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

21. hPYY(1-36)(配列番号1)の30位に対応する位置にトリプトファンを更に含む、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

22. hPYY(1-36)(配列番号1)の1〜3位に対応する位置が存在せず、PYY化合物がN末端置換基を更に含み、N末端置換基が12個までの炭素原子を含むアルコキシ基である、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

23. N末端置換基が、最大で10個の炭素原子を含むアルコキシ基である、実施形態22に係るPYY化合物。

24. N末端置換基が、最大で8個の炭素原子を含むアルコキシ基である、実施形態22に係るPYY化合物。

25. N末端置換基が、最大で6個の炭素原子を含むアルコキシ基である、実施形態22に係るPYY化合物。

26. N末端置換基が、6個の炭素原子を含むアルコキシ基である、実施形態22に係るPYY化合物。

28. N末端置換基が、3-メチルブタノイルである、実施形態27に係るPYY化合物。

28. hPYY(1-36)(配列番号1)の7位に対応する位置におけるリシン、及び7位におけるリシン残基のイプシロンアミノ基に連結された改変基を更に含み、前記改変基は、A-B-C-によって定義され、式中、A-は、カルボン酸又はスルホン酸を含む、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

29. A-が、

(式中、aは、12から19の整数であり、bは、10から16の整数であり、*は、-B-との連結点を示す)
から選択される、実施形態28に係るPYY化合物。

30. aが15であり、cが13である、実施形態29に係るPYY化合物。

31. A-が、

(式中、aは、12から19の整数であり、*は、-B-との連結点を示す)
である、実施形態28に係るPYY化合物。

32. aが15である、実施形態31に係るPYY化合物。

33. A-が、

(式中、bは、10から16の整数であり、*は、-B-との連結点を示す)
である、実施形態29に係るPYY化合物。

34. bが13である、実施形態33に係るPYY化合物。

35. B-が、

(式中、cは、1又は2であり、dは、1又は2であり、***は、A-との連結点を示し、**は、-C-との連結点を示す)
から選択される、実施形態28〜34のいずれか一つに係るPYY化合物。

36. B-が、

(式中、cは、1又は2であり、***は、A-との連結点を示し、**は、-C-との連結点を示す)
である、実施形態35に係るPYY化合物。

37. -C-が、

[式中、eは、1〜5の範囲の整数であり、fは、1〜5の範囲の整数であり、gは、2から6の範囲の整数であり、****は、-B-との連結点を示し、*****は、hPYY(1-36)の7位に対応する位置におけるリシン残基のイプシロンアミノ基との連結点を示す]
である、実施形態28〜36のいずれか一つに係るPYY化合物。

38. e及びfがそれぞれ、1である、実施形態37に係るPYY化合物。

39. gが、2、4又は6から選択される、実施形態37〜38のいずれか一つに係るPYY化合物。

40. gが、2である、実施形態39に係るPYY化合物。

41. gが、4である、実施形態39に係るPYY化合物。

42. gが、6である、実施形態39に係るPYY化合物。

43. 塩ではない、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

44. 以下:
[L-β-アルギニン35]hPYY(3-36) (配列番号3)

[L-β-ジホモアルギニン35]hPYY(3-36) (配列番号4)

[D-β-ホモアルギニン35]hPYY(3-36) (配列番号5)

[β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号6)

[Trp30,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号7)

[Gln18,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号8)

[Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号9)

[Gln18,Ala24,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号10)

[Gln18,Aib24,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号11)

[Aib24,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号12)

[Aib24,Trp30,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号13)

[Arg4,Gln18,Aib24,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号14)

[Arg4,Gln18,Ala24,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号15)

7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys7,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号16)

7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys7,Gln18, β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号17)

7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys7,Gln18,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号18)

7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号19)

7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys7,Gln18,Trp30, β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号20)

7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys7,Gln18,Aib22, β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号21)

7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg4,Lys7, β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号22)

7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg4,Lys7,Gln18, β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号23)

4-N{α}-(3-メチルブタノイル)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[,Lys7,Gln18, β-homoArg35]hPYY(4-36) (配列番号24)

4-N{α}-(3-メチルブタノイル)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]-[,Lys7,Gln18, β-homoArg35]hPYY(4-36) (配列番号25)

4-N{α}(3-メチルブタノイル)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]-[Lys7,Gln18,Trp30, β-homoArg35]hPYY(4-36) (配列番号26)

4-N{α}(3-メチルブタノイル)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(16-スルホヘキサデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys7,Gln18,Trp30,
β-homoArg35]hPYY(4-36) (配列番号27)

4-N{α}(3-メチルブタノイル)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(16-スルホヘキサデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]-[Lys7,Gln18,Trp30, β-homoArg35]hPYY(4-36) (配列番号28)

4-N{α}-(3-メチルブタノイル)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]- エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg4,Lys7,Gln18,Trp30, β-homoArg35]hPYY(4-36) (配列番号29)

4-N{α}-(3-メチルブタノイル)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(16-スルホヘキサデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ] エトキシ]アセチル]-[Arg4,Lys7,Gln18,Trp30, β-homoArg35]hPYY(4-36) (配列番号30)

から選択される、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

45. ヒトY2受容体アゴニストである、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

46. 完全ヒトY2受容体アゴニストである、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

47. 選択的なヒトY2受容体アゴニストである、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

48. 選択的な完全ヒトY2受容体アゴニストである、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

49. ヒトY2受容体を活性化することができる、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

50. ヒトY2受容体を発現する全細胞を用いたアッセイにおいてヒトY2受容体を活性化することができる、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

51. 実施例31のActone機能的効力アッセイにおいてヒトY2受容体を活性化することができる、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

52. ヒトY2受容体に結合することができる、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

53. ヒトY2受容体に結合することができ、ここでヒトY2受容体への結合は、競合結合アッセイ、例えば実施例32のアッセイで測定される、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

54. 改善された薬物動態学的特性を有する、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

55. 増加した半減期及び/又は減少したクリアランスを有する、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

56. db/dbマウスモデルでの単回投与研究で決定された、インビボでの血糖を減少させる作用を有する、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

57. db/dbマウスモデルでの単回投与研究で決定された、インビボでの食物摂取を減少させる作用を有する、前述の実施形態のいずれか一つに係るPYY化合物。

58. 医薬品として使用するための、実施形態1〜44のいずれか一つに係るPYY化合物。

59. 糖尿病の全ての形態及び関連疾患、例えば摂食障害、糖尿病の合併症、心臓血管疾患及び/若しくは睡眠時無呼吸の治療及び/若しくは予防で使用するため;並びに/又は脂質パラメーターの改善、β細胞の機能の改善のために使用するため、及び/若しくは糖尿病性疾患の進行の遅延若しくは予防のために使用するための、実施形態1〜44のいずれか一つに係るPYY化合物。

60. 糖尿病の全ての形態及び関連疾患、例えば摂食障害、糖尿病の合併症、心臓血管疾患及び/若しくは睡眠時無呼吸の治療及び/若しくは予防のため;並びに/又は脂質パラメーターの改善、β細胞の機能の改善のため、及び/若しくは糖尿病性疾患の進行の遅延若しくは予防のための医薬品を製造するための、実施形態1〜44のいずれか一つに係るPYY化合物の使用。

61. 医薬活性を有する量の実施形態1〜44のいずれか一つに係るPYY化合物を投与することによる、糖尿病の全ての形態及び関連疾患、例えば摂食障害、糖尿病の合併症、心臓血管疾患及び/若しくは睡眠時無呼吸の治療及び/若しくは予防のため;並びに/又は脂質パラメーターの改善、β細胞の機能の改善のため、及び/若しくは糖尿病性疾患の進行の遅延又は予防のための方法。

この実験の部は略語の列挙で始まり、それに続いて本発明の化合物を合成し特徴付けるための一般的な方法を包含するセクションを記載する。それに続いて具体的なPYY化合物の調製に関する多数の実施例を記載し、最後にこれらの化合物の活性及び特性に関する多数の実施例を記載する(薬理学的な方法という見出しのセクション)。

実施例は、本発明を例示するのに役立つ。

略語の一覧
Aib:α-アミノイソブタン酸
r.t.:室温
ACN:アセトニトリル
DIPEA:ジイソプロピルエチルアミン
H₂O:水
CH₃CN:アセトニトリル
DMF:N,N-ジメチルホルムアミド
Fmoc:9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニル
Boc:tertブチロキシカルボニル
OtBu:tertブチルエステル
tBu:tertブチル
Trt:トリフェニルメチル
Pbf:2,2,4,6,7ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル
PyBOP:ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
HFIP:ヘキサフルオロイソプロパノール
Mtt:4-メチルトリチル
DCM:ジクロロメタン
TIPS:トリイソプロピルシラン
TFA:トリフルオロ酢酸
Et2O:ジエチルエーテル
NMF:1-メチル-ホルムアミド
NMP:1-メチル-ピロリジン-2-オン
DIPEA:ジイソプロピルエチルアミン
HOAc:酢酸
HOAt:1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
HOBt:1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
DIC:ジイソプロピルカルボジイミド
Min:分
MW:分子量
HMWP:高分子タンパク質
β-homoArg:L-ベータ-ホモアルギニン

材料及び方法
一般的な調製方法
このセクションは、ペプチド骨格の固相合成及び骨格に連結された側鎖の合成のための方法(アミノ酸のカップリング、Fmoc-アミノ酸の脱保護のための方法、樹脂からのペプチドの切断及びその精製のための方法を含む、SPPS方法)に関する。

1.樹脂に結合した保護されたペプチド骨格の合成
ペプチド骨格の自動的な段階的アセンブリのための手法。製造元によって供給された機械のプロトコールを使用した0.25mmolスケール又は0.4mmolスケールのいずれかによる固相ペプチド合成装置のPrelude(Protein Technologies社、Tucson、USA)でのFmoc戦略に従って、保護されたペプチジル樹脂を合成した。使用されたFmoc-保護アミノ酸誘導体は、例えばBachem社、Iris Biotech社、Protein Technologies社又はNovabiochem社から供給された、標準的な推奨物:Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Mtt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、又は、Fmoc-Val-OH等であった。特に何も特定されていない場合、アミノ酸の天然L-型が使用される。NMP(N-メチルピロリドン)中のDIC(ジシクロヘキシルカルボジイミド)及びOzyma Pure[エチル2-シアノ-2-(ヒドロキシイミノ)-アセテート、メルク、Novabiochem社、Switzerland]が媒介するカップリングの使用によって、カップリングを行った。Fmoc-アミノ酸のカップリングを、上述したようにして、樹脂置換に対して4〜8倍過量のアミノ酸(4〜8当量)を使用して行った。カップリング時間は、1時間から4時間までの範囲であった。ダブルカップリング手法(1時間+1時間)を使用してFmoc-Arg(pbf)-OHをカップリングした。ペプチドアミドの合成に使用された樹脂は、Tentagel RAM(Rapp Polymere社、Germany)、Rink amid ChemMatrix樹脂(Matrix Innovation社、Canada)、Rink-Amide樹脂(Merck社/Novabiochem社)であり得る。使用された保護アミノ酸誘導体は、標準的なFmoc-アミノ酸(例えばProtein Technologies社、又はNovabiochem社から供給された)であった。誘導体化しようとするリシンのイプシロンアミノ基をMttで保護した。N末端アミノ酸又は構成単位を、Boc-保護アミノ酸、例えばBoc-Ileとしてカップリングした。或いは上記で説明したFmoc-アミノ酸に関するカップリング手法に従ってイソ吉草酸をカップリングした。以下の工程:1)2×4分でのNMP中の25%ピペリジンの使用による脱保護(Fmocの除去)、工程2)NMP及びDCMでの洗浄(ピペリジンの除去)、工程3)1/10体積のNMP中3MのDIC及び1/10体積のNMP中のコリジンを添加することによって開始させた1〜4時間のカップリングでの、4〜8当量過量のFmoc-アミノ酸(NMP中0.3MのOxyma Pure中の、0.3MのFmoc-アミノ酸)のカップリングを使用して、Preludeでの段階的固相アセンブリを行った。窒素を用いた不定期のバブリングによって混合を行い、工程4)洗浄(NMP及びDCMの使用による、過量のアミノ酸及び試薬の除去)を行った。最後の工程にはDCMでの洗浄が包含され、それにより樹脂は、リシン側鎖上のアルブミン結合部分の連結が可能な状態になった。

2.樹脂に結合した保護されたペプチド骨格への改変基の連結
Mtt-保護[リシン(Mtt)]の手作業による除去のための手法:改変基を合成する前に、連結部位(リシン)上のMtt基は除去されなければならない。シリンジ又は反応フラスコ中に樹脂を入れ、75%ヘキサフルオロイソプロパノール(hexafluroisopropanol)(HFIP)+25%DCMで2×30分処置して、Mtt基を除去した。次いで樹脂を上述したようにDCM及びNMPで洗浄し、NMP中の5%DIPEA(中和工程)又はNMP中の25%ピペリジンで中和し、続いてアルブミン部分をカップリングする前にNMPで洗浄した。或いは中和工程を省略した。

Mtt-保護[リシン(Mtt)]のPreludeによる除去のための手法:Preludeで、樹脂を、75%ヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)+25%DCMで2×2分、続いて2×30分処置して、リシン上のMtt基を除去した。次いで樹脂をDCM及びNMPで洗浄し、続いてNMP中の25%ピペリジンを使用した中和工程を4分行い、次いで改変基の合成に備えた。

リシン残基への改変基の手作業による合成のための手法:
構成単位であるFmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、Fmoc-Glu-OtBu、及びエイコサン二酸モノ-tert-ブチルエステル(CAS番号843666-40-0)を、樹脂置換に対して4〜8当量でDIC及びOxyma Pureを使用してカップリングした。カップリング時間は通常2〜16時間であり、続いて1Mの無水酢酸を使用したキャッピング工程を15〜60分行った。Fmoc-基をNMP中の25%ピペリジンによって10〜30分かけて除去し、続いて洗浄した。

16-スルホヘキサデカン酸を、NMP又はN-メチルホルムアミド(NMF)中に60セルシウス度又はそれ超で可溶化し、スルホヘキサデカン酸に対して1当量のPyBOPによって活性化し、更にスルホヘキサデカン酸に対して2当量のジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)も添加した。活性化スルホヘキサデカン酸の添加の直前に、ペプチジル樹脂を熱いNMP又はNMFで洗浄した。3〜4倍過量のスルホン酸構成単位を使用して、カップリングを16時間より長く進行させた。

リシン残基上への改変基の自動合成のための手法:
改変基を合成するために、以下の構成単位:Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、Fmoc-Glu-OtBu、及びエイコサン二酸モノ-tert-ブチルエステル(CAS番号843666-40-0)を使用した。改変基を、樹脂置換に対して4〜8当量でDIC及びOxyma Pureを使用してカップリングした。カップリング時間は通常2〜16時間であり、続いて1Mの無水酢酸を使用したキャッピング工程を20分行った。Fmoc-基をNMP中の25%ピペリジンによって2×4分で除去し、続いてペプチド骨格のSPPSで説明されているようにして洗浄した。全ての他の合成工程も骨格合成に関して上述したのと同じであった。16-スルホヘキサデカン酸のカップリングを、カップリング試薬としてpyBOPを使用して上述したような手作業による手法によって行った。

3.連結された改変基を有する又は有さない、樹脂に結合したペプチドの切断及び精製
TFA脱保護の前に、ペプチジル樹脂をDCM又はジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させた。ペプチド及び側鎖保護基を、20〜40ml(0.25mmolスケール)、30〜60ml(0.4mmolスケール)の92%TFA、5%TIPS及び3%H₂Oの添加によって、2〜4時間で除去した。次いでTFAを濾過し、場合によりアルゴン流によって濃縮し、ジエチルエーテルを添加してペプチドを沈殿させた。ペプチドをジエチルエーテルで3〜5回洗浄し、乾燥させた。

検出及び特徴付けの一般的な方法
このセクションは、LCMS、MALDI及びUPLC方法等の、得られたペプチドの検出及び特徴付けのための方法に関する。

1. LC-MS方法(LCMS1)
Agilent Technologies社のLC/MSD TOF(G1969A)質量分析計を使用して、Agilent 1200シリーズHPLCシステムから溶出させた後のペプチドの分子量を同定した。Agilents社のソフトウェアを使用して質量データのデコンボリューションを計算した。

溶離剤:
緩衝液A:水中の0.1%TFA
緩衝液B:CH₃CN中の0.1%TFA

LC-MS Waters社のAcquity(LCMS2)
LC-システム:Waters社のAcquity UPLC
カラム:Waters社のAcquity UPLC BEH、C-18、1.7μm、2.1mm×50mm
検出器:Waters(Micromass)社のLCT Premier XE
直線勾配:5%から95%のB
勾配実行時間:4.0分
総実行時間:7.0分
流速:0.4ml/分
カラム温度:40℃
溶媒A:99.90%MQ水、0.1%ギ酸
溶媒B:99.90%アセトニトリル、0.1%ギ酸

2. UPLC方法
UPLC26v01方法
緩衝液A:0.05%TFA
緩衝液B:CH3CN+0.05%TFA
流れ:0.45ml/分
勾配:5〜60%の緩衝液B(0.5〜4分)
カラム:Acquity UPLC BEH C18、1.7μm、2.1×50mm
カラム温度:40℃

UPLC29v01方法
緩衝液A:0.05%TFA
緩衝液B:CH3CN+0.05%TFA
流れ:0.45ml/分
勾配:15〜35%の緩衝液B(0.5〜4分)
カラム:Acquity UPLC BEH C18、1.7μm、2.1×50mm
カラム温度:40℃

UPLC30v01方法
緩衝液A:0.05%TFA
緩衝液B:CH3CN+0.05%TFA
流れ:0.45ml/分
勾配:20〜40%の緩衝液B(0.5〜4分)
カラム:Acquity UPLC BEH C18、1.7μm、2.1×50mm
カラム温度:40℃

UPLC31v01方法
緩衝液A:0.05%TFA
緩衝液B:CH3CN+0.05%TFA
流れ:0.45ml/分
勾配:25〜45%の緩衝液B(0.5〜4分)
カラム:Acquity UPLC BEH C18、1.7μm、2.1×50mm
カラム温度:40℃

UPLC02v01方法
システム:Waters社のAcquity UPLCシステム
緩衝液A:H₂O中の0.05%TFA
緩衝液B:CH3CN+0.05%TFA
流れ:0.40ml/分
勾配:5〜95%の緩衝液B (16分)
カラム:Acquity UPLC BEH C18、1.7μm、2.1×150mm
カラム温度:40℃

UPLC07v01方法
システム:Waters社のAcquity UPLCシステム
緩衝液A:0.09Mリン酸水素二アンモニウム(水溶液)及び10%アセトニトリル、pH3.6
緩衝液B:20%イソプロパノール、20%水及び60%アセトニトリル
流れ:0.50ml/分
勾配:35〜65%の緩衝液B(2〜17分)
カラム:Phenomenex社のKinetex C18、1.7μm、2.1mm×150mmのカラム
カラム温度:60℃

UPLC16v01方法
システム:Waters社のAcquity UPLCシステム
緩衝液A:0.2M硫酸ナトリウム、0.02Mリン酸水素二ナトリウム、0.02Mリン酸二水素ナトリウム、90%水及び10%アセトニトリル、pH 7.2
緩衝液B:70%アセトニトリル、30%水
流れ:0.40ml/分
勾配:20〜50%の緩衝液B(3〜20分)
カラム:ACQUITY UPLC BEH Shield RP18、1.7μm、2.1mm×150mmのカラム
カラム温度:60℃

UPLC17v01方法
システム:Waters社のAcquity UPLCシステム
緩衝液A:0.2M硫酸ナトリウム、0.02Mリン酸水素二ナトリウム、0.02Mリン酸二水素ナトリウム、90%水及び10%アセトニトリル、pH7.2
緩衝液B:70%アセトニトリル、30%水
流れ:0.40ml/分
段階的な勾配:3分にわたり10〜20%のB、次いで17分にわたり20〜80%のB、次いで1分にわたり80〜90%のB
カラム:ACQUITY UPLC BEH Shield RP18、1.7μm、2.1mm×150mmのカラム
カラム温度:60℃

UPLC-AP-01方法
緩衝液A:H₂O中の0.1%TFA
緩衝液B:CH3CN+0.1%TFA
流れ:0.40ml/分
勾配:5〜95%の緩衝液B(16分)
カラム;Acquity UPLC BEH130;150×2.1;1.7μm
カラム温度:40℃

UPLC-AP-02方法
緩衝液A:20mMのNa2HPO4、20mMのNaH2PO4、200mMのNa2SO4、90%水/10%アセトニトリル中、pH7.20
緩衝液B:70%アセトニトリル/30%水
流れ:0.40ml/分
勾配:10〜20%の緩衝液B(0〜3分);20〜50%の緩衝液B(3〜20分);50〜80%(20〜21分)
カラム;Acquity UPLC BEH Shield、RP18、1.7μm、2.1×150mm
カラム温度:40℃

3. MALDI-MS方法
マトリックス支援レーザー脱離飛行時間型質量分析法(MALDI-MS)を使用してペプチドの分子量を決定し、Microflex(Bruker社)で記録した。アルファ-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸のマトリックスを使用した。製造元から供給されたソフトウェアを使用してMALDI-MS分析の結果に基づき生成物の分子量を計算した。

中間体の合成
16-スルホ-ヘキサデカン酸の合成
16-ヘキサデカノリド(997g、3.92mol)をメタノール(15.1L)中に溶解させ、トルエン-4-スルホン酸一水和物(90.0g、0.473mol)を添加した。50Lの反応装置中で反応混合物を55℃で16時間加熱した。冷却後、炭酸水素ナトリウム(56.0g、0.67mol)を添加し、反応混合物を15分攪拌した。Heidolph社の20Lロータリーエバポレーターで溶媒を蒸発させた。酢酸エチル(12L)を添加し、混合物を炭酸水素ナトリウムの5%溶液(10L)で抽出した。有機層を分離し、エマルジョン層を酢酸エチル(3×3L)で抽出し、白い不溶性の泥状の材料を分離し、酢酸エチル層を炭酸水素ナトリウムの5%溶液(5L)で再度洗浄した。有機層を合わせ、炭酸水素ナトリウムの飽和溶液(5L)及びブライン(10L)で洗浄した。Heidolph社の20Lロータリーエバポレーターで溶媒を蒸発させた。ヘキサン(8L)から粗生成物を結晶化した。ヘキサン中の熱い溶液をデカンテーションし、次いで氷浴中でそのまま結晶化させた。大きいフリットで材料を濾過し、冷たいヘキサン(2L)で洗浄した。純粋な材料を真空中で乾燥させた。

収量:1062.2g(95%)。
R_F(SiO₂、95:5のジクロロメタン/メタノール):0.65。

Heidolph社の20Lロータリーエバポレーターで上記のエステル(957g、3.34mol)をジクロロメタン(7L)中に溶解させた。トリエチルアミン(695mL、4.98mol)を添加し、反応混合物を0℃に冷却し(エバポレーター槽に氷を投入することにより)、ジクロロメタン(200mL)中の塩化メタンスルホニル(325mL、4.19mol)を、小規模な真空を使用して外部の管により10分かけてゆっくり添加した。次いで反応混合物を35℃に1時間加熱した。NMR分析により変換が完了したことが示された。水を添加し(690mL)、溶媒を蒸発させた。酢酸エチル(8L)を添加し、混合物を1M塩酸(4L)及び炭酸ナトリウムの5%溶液(4L)で洗浄した。炭酸ナトリウム抽出によりエマルジョンが形成されたため、この層を酢酸エチル(4L)で抽出し、主要な部分に添加した。合わせた酢酸エチル層をブライン(4L)で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過した。溶媒を蒸発させて、16-メタンスルホニルオキシ-ヘキサデカン酸メチルエステルを白色の固体として得た。

収量:1225.4g(100%)。

上記のメシレート(1.23kg、3.34mol)をアセトン(8L)に溶解させ、臭化リチウム(585g、6.73mol)を添加し、Heidolph社の20Lロータリーエバポレーターで反応混合物を50℃で12時間加熱した。冷却後、溶媒を蒸発させ、酢酸エチル(10L)を添加し、混合物を、炭酸水素ナトリウムの5%溶液(3×15L)及びブライン(8L)で洗浄した。溶媒を乾燥するまで蒸発させて、16-ブロモ-ヘキサデカン酸メチルエステルを薄黄色の油状物として得て、これが結晶化し始めた。

収量:1219g(105%);アセトン及びアセトンのアルドール化(aldolization)の生成物を含有する。
R_F(SiO₂、9:1のヘキサン/酢酸エチル):0.90。

水(1.26L)中の亜硫酸ナトリウムの溶液(327g、2.60mol)と、1-プロパノール(945mL)及びメタノール(420mL)中の16-ブロモ-ヘキサデカン酸メチルエステル(728g、2.00mol、96%純度)とを、機械式攪拌器を備えた6Lの反応装置中で48時間加熱還流した。反応混合物を27℃に冷却し、テトラヒドロフラン(2L)で希釈した。反応混合物を濾過し、固体材料をテトラヒドロフラン(3×700mL)で洗浄した。ろ液を0℃に冷却し、材料の別の部分を沈殿させた。この沈殿を濾過し、テトラヒドロフラン(2×200mL)で洗浄した。固体を合わせ、20Lのポット中で水(8.4L)と混合した。水酸化ナトリウム(120g、3.00mol)の溶液を添加した。混合物を加熱して、約5時間沸騰させた。反応混合物に水(500mL)中の硫酸の溶液(430mL、8.00mol)をゆっくり添加した(二酸化硫黄が形成される)。反応混合物を加熱して、10分沸騰させ、次いでそのまま15℃に冷却した(氷浴)。ブフナー漏斗で、真空を適用して濾紙のSeitz(数層のフィルター)を通して混合物を濾過した。この手法は極めて遅く、2日を要した。固体材料を、ろ液のpHが2から3の間になるまで蒸留水で数回洗浄した。この手法は約3日を要した。白い泥状の材料をオーブン中80℃で乾燥させ、望ましい生成物を得た。

収量:510g(76%)。

本発明の化合物の合成

(実施例1)
配列番号1
hPYY(1-36)
YPIKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH₂

(実施例2)
配列番号2
hPYY(3-36)
IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH₂
保持時間(HPLC法 UPLC16v01): 3.37分 (91.4%)
保持時間(HPLC法 UPLC29v01): 10.07分 (85.6%)
MW計算値: 4049.6g/mol
MALDI MS: 4048.2g/mol

(実施例3)
配列番号3
[L-β-アルギニン35]hPYY(3-36)

保持時間(HPLC法 UPLC16v01): 9.35分 (79.4%)
保持時間(HPLC法 UPLC29v01): 3.3分 (82.3%)
MW計算値: 4049.55g/mol
MALDI(観察されたMALDSI-MS): 4048.3g/mol

(実施例4)
配列番号4
[L-β-ジホモアルギニン35]hPYY(3-36)

保持時間(HPLC法 UPLC16v01): 9.53分 (83.4%)
保持時間(HPLC法 UPLC29v01): 3.33分 (88.9%)
MW計算値: 4077.61g/mol
MALDI(観察されたMALDSI-MS): 4076.1g/mol

(実施例5)
配列番号5
[D-β-ホモアルギニン35]hPYY(3-36)

保持時間(HPLC法 UPLC16v01): 9.47分 (82.8%)
保持時間(HPLC法 UPLC29v01): 3.31分 (88%)
MW計算値: 4063.58g/mol
MALDI(観察されたMALDSI-MS): 4062.8g/mol

(実施例6)
配列番号6
[β-homoArg35]hPYY(3-36)

保持時間(HPLC法 UPLC16v01): 9.47分 (92.9%)
保持時間(HPLC法 UPLC29v01): 3.4分 (97.3%)
MW計算値: 4063.58g/mol
MALDI(観察されたMALDSI-MS): 4060.5g/mol

(実施例7)
配列番号7
[Trp30,β-homoArg35]hPYY(3-36)

保持時間(HPLC法 UPLC16v01): 10.25分 (84.4%)
保持時間(HPLC法 UPLC29v01): 3.39分 (93.9%)
MW計算値: 4136.63g/mol
LCMS (LCMS1): m/z: 1379.7 ((M/3)+3); 1035.0 ((M/4)+4); 690.4 ((M/6+6)

(実施例8)
配列番号8
[Gln18,β-homoArg35]hPYY(3-36)

保持時間(HPLC法 UPLC16v01): 9.70分 (94.1%)
保持時間(HPLC法 UPLC29v01): 3.37分 (96.5%)
MW計算値: 4077.61g/mol
MALDI(観察されたMALDSI-MS): 4076.2g/mol

(実施例9)
配列番号9
[Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(3-36)

保持時間(UPLC-AP-01): 5.92分 (95.1%)
保持時間(UPLC-AP-02): 10.23分 (90.6%)
MW計算値: 4150.66g/mol
LCMS2: ((M/3+3) 1384.3; ((M/4)+4) 1038.5; ((M/5+5) 831.1

(実施例10)
配列番号10
[Gln18,Ala24,β-homoArg35]hPYY(3-36)

保持時間(UPLC-AP-01): 5.38分 (97.3%)
保持時間(UPLC-AP-02): 8.29分 (95.7%)
MW計算値: 4035.53g/mol
LCMS2: ((M/3+3) 1346.0; ((M/4)+4) 1009.3; ((M/5+5) 808.4

(実施例11)
配列番号11
[Gln18,Aib24,β-homoArg35]hPYY(3-36)

保持時間(HPLC法 UPLC16v01): 11.01分 (94.4%)
保持時間(HPLC法 UPLC29v01): 3.19分 (100%)
MW計算値: 4049.55g/mol
LCMS (LCMS1): m/z: 1350.7 ((M/3)+3); 1013.3 ((M/4)+4)

(実施例12)
配列番号12
[Aib24,β-homoArg35]hPYY(3-36)

保持時間(HPLC法 UPLC16v01): 8.6分 (81.3%)
保持時間(HPLC法 UPLC29v01): 3.11分 (98.7%)
MW計算値: 4035.53g/mol
LCMS (LCMS1): m/z: 1346 ((M/3)+3); 1009.8 ((M/4)+4); 673.5 ((M/6+6)

(実施例13)
配列番号13
[Aib24,Trp30,β-homoArg35]hPYY(3-36)

保持時間(HPLC法 UPLC16v01): 9.05分 (84.4%)
保持時間(HPLC法 UPLC29v01): 3.19分 (100%)
MW計算値: 4108.58g/mol
LCMS (LCMS1): m/z: 1370.4 ((M/3)+3); 1028.0 ((M/4)+4)

(実施例14)
配列番号14
[Arg4,Gln18,Aib24,β-homoArg35]hPYY(3-36)

保持時間(UPLC-AP-01): 5.61分 (99.3%)
保持時間(UPLC-AP-02): 10.0分 (97.2%)
MW計算値: 4077.57g/mol
LCMS2: ((M/3+3) 1360.1; ((M/4)+4) 1020.5; ((M/5+5) 816.3

(実施例15)
配列番号15
[Arg4,Gln18,Ala24,β-homoArg35]hPYY(3-36)

保持時間(UPLC-AP-01): 5.4分 (98%)
保持時間(UPLC-AP-02): 9.14分 (95.1%)
MW計算値: 4063.54g/mol
LCMS2: ((M/3+3) 1355.8; ((M/4)+4) 1016.9; ((M/5+5) 814.4

(実施例16)
配列番号16
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys7, β-homoArg35]hPYY(3-36)

保持時間(UPLC-AP-01): 7.34 分 (96.7%)
保持時間(UPLC-AP-02): 12.37 分 (91.4%)
MW計算値: 4836.57 g/mol
LCMS2: ((M/3+3) 1613.0; ((M/4)+4) 1209.3; ((M/5+5) 968.1

(実施例17)
配列番号17
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys7,Gln18, β-homoArg35]hPYY(3-36)

保持時間(HPLC法 UPLC16v01): 12.21 分 (97.9%)
保持時間(HPLC法 UPLC30v01): 3.72 分 (98.2%)
MW計算値: 4850.59 g/mol
LCMS (LCMS1): m/z: 1617.9 ((M/3)+3); 1213.7 ((M/4)+4); 809.5 ((M/6+6)

(実施例18)
配列番号18
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys7,Gln18,β-homoArg35]hPYY(3-36)

保持時間(HPLC法 UPLC16v01): 11.63 分 (96.2%)
保持時間(HPLC法 UPLC30v01): 3.788 分 (95.9%)
MW計算値: 5140.91 g/mol
MALDI (MALDI-MS found): 5139.1 g/mol

(実施例19)
配列番号19
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(3-36)

保持時間(HPLC法 UPLC16v01): 11.45 分 (95.1%)
保持時間(HPLC法 UPLC02v01): 7.26 分 (100%)
MW計算値: 5052.76 g/mol
LCMS (LCMS1): m/z: 2527.3 ((M/2)+2); 1685.23 ((M/3)+3); 1264.18 ((M/4)+4)

(実施例20)
配列番号20
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys7,Gln18,Trp30, β-homoArg35]hPYY(3-36)

保持時間(HPLC法 UPLC16v01): 12.25 分 (96.0%)
保持時間(HPLC法 UPLC02v01): 7.34 分 (99.1%)
MW計算値: 4923.65 g/mol
LCMS (LCMS1): m/z: 2462.78 ((M/2)+2); 1642.21 ((M/3)+3); 1231.92 ((M/4)+4)

(実施例21)
配列番号21
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys7,Gln18,Aib22, β-homoArg35]hPYY(3-36)

保持時間(HPLC法 UPLC16v01): 12.37 分 (91.5%)
保持時間(HPLC法 UPLC30v01): 3.88 分 (93%)
MW計算値: 4864.62 g/mol
MALDI (観察されたMALDI-MS): 4863.1 g/mol

(実施例22)
配列番号22:
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg4,Lys7, β-homoArg35]hPYY(3-36)

保持時間(UPLC-AP-01): 7.31 分 (98.8%)
保持時間(UPLC-AP-02): 11.8 分 (94.1%)
MW計算値: 4864.58 g/mol
LCMS2: ((M/3+3) 1622.7; ((M/4)+4) 1216.8; ((M/5+5) 973.9

(実施例23)
配列番号23:
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg4,Lys7,Gln18, β-homoArg35]hPYY(3-36

保持時間(UPLC-AP-01): 7.31 分 (95.3%)
保持時間(UPLC-AP-02): 11.9 分
MW計算値: 4878.61 g/mol
LCMS2: ((M/3+3) 1626.4; ((M/4)+4) 1220.2; ((M/5+5) 976.4

(実施例24)
配列番号24
4-N{α}-(3-メチルブタノイル)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[,Lys7,Gln18,β-homoArg35]hPYY(4-36)

保持時間(HPLC法 UPLC16v01): 11.03 分 (98.9%)
保持時間(HPLC法 UPLC02v01): 7.5 分 (100%)
MW計算値: 4950.67 g/mol
LCMS (LCMS1): m/z 1653.23 ((M/3)+3); 1238.6 ((M/4)+4)

(実施例25)
配列番号25
4-N{α}-(3-メチルブタノイル)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]-[,Lys7,Gln18,β-homoArg35]hPYY(4-36)

保持時間(HPLC法 UPLC16v01): 12.18 分 (97.7%)
保持時間(HPLC法 UPLC02v01): 7.58 分 (99.3%)
MW計算値: 4821.55 g/mol
LCMS (LCMS1): m/z 2411.79 ((M/2)+2); 1607.89 ((M/3)+3); 1206.43 ((M/4)+4)

(実施例26)
配列番号26
4-N{α}(3-メチルブタノイル)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]-[Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(4-36)

保持時間(HPLC法 UPLC16v01): 12.56 分 (98.5%)
保持時間(HPLC法 UPLC31v01): 3.37 分 (98.8%)
MW計算値: 4894.61 g/mol
LCMS (LCMS1): m/z: 1632.49 ((M/3)+3); 1224.35 ((M/4)+4); 979.67 ((M/5)+5)

(実施例27)
配列番号27
4-N{α}(3-メチルブタノイル)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(16-スルホヘキサデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys7,Gln18,Trp30,
β-homoArg35]hPYY(4-36)

保持時間(HPLC法 UPLC16v01): 12.21 分 (83.11%)
保持時間(HPLC法 UPLC30v01): 3.44 分 (90.5%)
MW計算値: 5045.75 g/mol
LCMS (LCMS1): m/z: 1682.85 ((M/3)+3); 1262.37 ((M/4)+4); 1010.09 ((M/5)+5)

(実施例28)
配列番号28
4-N{α}(3-メチルブタノイル)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(16-スルホヘキサデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]-[Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(4-36)

保持時間(HPLC法 UPLC16v01): 11.23 分 (88.1%)
保持時間(HPLC法 UPLC30v01): 3.35 分 (91.7%)
MW計算値: 4916.63 g/mol
MALDI (MALDI-MS found): 4914.5 g/mol

(実施例29)
配列番号29
4-N{α}-(3-メチルブタノイル)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]- エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg4,Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(4-36)

保持時間(HPLC法 UPLC16v01): 12.65 分 (94.8%)
保持時間(HPLC法 UPLC32v01): 2.5 分 (96.6%)
MW計算値: 4922.62 g/mol
LCMS (LCMS1): m/z: 1641.48 ((M/3)+3); 985.46 ((M/5)+5)

(実施例30)
配列番号30
4-N{α}-(3-メチルブタノイル)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(16-スルホヘキサデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ] エトキシ]アセチル]-[Arg4,Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(4-36)

保持時間(HPLC法 UPLC16v01): 11.36 分 (83.4%)
保持時間(HPLC法 UPLC30v01): 3.37 分 (93.0%)
MW計算値: 4944.64 g/mol
MALDI (観察されたMALDI-MS): 4944.3 g/mol

薬理学的な方法
哺乳動物(例えばヒト)での体重の増加の低減及び肥満症の治療における、並びに糖尿病を治療するための医薬活性物質としての、本発明のPYYペプチド誘導体又はそれらの類似体の有用性は、従来のアッセイ並びに後述するインビトロ及びインビボでのアッセイにおけるアゴニスト活性によって実証され得る。

このようなアッセイはまた、本発明のPYY化合物の活性を公知の化合物の活性と比較することができる手段も提供する。

(実施例31)
PYY化合物の受容体の効力
この実施例の目的は、インビトロでのPYY化合物の活性又は効力を試験することである。インビトロにおける効力は、全細胞アッセイにおけるヒトY1、Y2、Y4及びY5受容体サブタイプそれぞれの活性化の尺度である。

後述するようなActone機能的効力アッセイを使用して、実施例2〜30のPYY化合物の効力を決定した。参照としてhPYY(3-36)(実施例2、配列番号2)を含めた。実施例3〜5の化合物は、比較例として含めた。

Actone機能的効力アッセイ
神経ペプチドY(NPY)受容体は、ATPからのcAMP産生の減少をもたらすアデニル酸シクラーゼ活性を阻害することによって主としてcAMP依存性経路を介してシグナル伝達するG_i共役7回膜貫通受容体である。Actoneアッセイは、カルシウム応答性色素によって検出される細胞のカルシウム流入をもたらすcAMPに選択的な結合を有する改変されたカルシウムチャネルに基づく。NPY受容体の活性化の結果としてのcAMPの減少したレベルを測定するために、β1/β2-アドレナリン受容体アゴニストであるイソプロテレノールを添加して、アデニル酸シクラーゼを活性化し、細胞中のcAMPレベルを増加させる。NPY受容体の活性化によるcAMPレベルの減少を反映する減少した細胞のカルシウム濃度は、カルシウム感受性色素からの蛍光の減少として検出される。

cAMP感受性カルシウムチャネル及びNPYR-Y1、NPYR-Y2、NPYR-Y4又はNPYR-Y5の1つを発現するHEK-293細胞(CodexBiosolution社、Gaithersburg、MD、USA)を、ポリリシンでコーティングした384ウェルプレートに、10%ウシ胎児血清(FCS)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、250μg/mlアミノグリコシド抗生物質G418及び1μg/mlアミノヌクレオシド抗生物質ピューロマイシンを含有するDMEM培地中の25μlの体積で、細胞14.000個/ウェルの密度で植え付けた。細胞を、5%CO₂の加湿した環境中、+37℃で一晩インキュベートし、続いて20mMのHepes、0.1%オボアルブミン、0.005%Tween 20、1.5mMのプロベネシド、250μMのPDE阻害剤4-(3-ブトキシ-4-メトキシベンジル)イミダゾリジン-2-オン及び8mMのCaCl₂を含有する緩衝液100ml中に溶解させた1バイアルのカルシウム5色素(Molecular Devices社、Sunnyvale、CA、USA)を含有するカルシウム色素緩衝液25μlを添加し、pHを7.40に調整した。細胞をカルシウム色素緩衝液と共に1時間インキュベートし、次いでFLIPR Tetra System(Molecular Devices社)中に置き、そこで液体操作システムにより類似体(1000〜1nMの最終濃度)及びイソプロテレノール(0.05μMの最終濃度)を同時に直接的に添加し、続いて蛍光シグナルを、30秒のインターバルで360秒測定した(Ex540/Em590)。全ての測定を2連で行い、GraphPad Prismバージョン5.02(Graph Pad software社、La Jolla、CA、USA)を使用したS字状用量反応曲線の非線形回帰分析によってEC₅₀値を計算した。以下のtable 1(表1)にEC₅₀値を示す。

本発明のPYY化合物は全て優れたY2効力を示すが、それに対して受容体Y1、Y4及びY5への効力は強く低減される。

(実施例32)
Y1、Y2、Y4及びY5受容体サブタイプの結合
この実施例の目的は、インビトロにおけるY1、Y2、Y4及びY5受容体サブタイプそれぞれへのPYY化合物の結合を試験することである。受容体結合親和性は、ヒトY1、Y2、Y4及びY5受容体サブタイプそれぞれに関する化合物の親和性の尺度である。

後述するようなシンチレーション近接アッセイ(SPA)で、インビトロでの実施例6〜30のPYY化合物の結合を決定した。参照としてhPYY(3-36)(実施例2、配列番号2)を含めた。

シンチレーション近接アッセイ(SPA)
NPY-受容体を発現する細胞株。全ての細胞を、5%CO₂を含む加湿した雰囲気中、+37℃で培養した。ヒトNPY-Y1受容体の誘導性の発現を示すBHK-482-8細胞(P25929、NPY1R_HUMAN、Uniprot)を、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(P/S)、1mg/mlのG418抗生物質、1mg/mlハイグロマイシンB抗生物質及び1%非必須アミノ酸を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で培養した。NPY-Y1受容体発現の誘導のために、細胞を回収する24時間前に1mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加した。ヒトNPY-Y2受容体を安定して発現するCHO-K1細胞(P49146、NPY2R_HUMAN、Uniprot)を、10%FBS、1%P/S、150μg/mlハイグロマイシンB及び10μg/mlピューロマイシン抗生物質を含むDMEM F-12中で培養した。ヒトNPY-Y4受容体を安定して発現するCHO-K1細胞(P50391、NPY4R_HUMAN、Uniprot)を、10%FBS、1%P/S、10μg/mlピューロマイシンを含むDMEM F-12中で培養した。ヒトNPY-Y5受容体を安定して発現するHEK-293細胞(Q15761、NPY5R_HUMAN、Uniprot)を、10%FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、250μg/mlのG418及び1μg/mlピューロマイシンを含有するDMEM F-12培地中で培養した。

膜調製物。培養細胞を掻き取ることにより機械的に取り外し、氷冷PBS(137mMのNaCl、2.7mMのKCl、4.3mMのNa₂HPO₄、1.47mMのKH₂PO₄、pHを7.4に調整)中で洗浄し、チューブに移し、+4℃、1000gで5分遠心分離した。ペレットを、氷冷した均質化緩衝液;Y1:2つの完全EDTA非含有プロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット/50ml(Roche社、Mannheim、Germany)を含む、20mMのHepes、10mMのEDTA、pH7.4;Y2、Y4:20mMのHepes、5mMのMgCl₂、1mg/mlバシトラシン、pH7.1;Y5:10mMのNaCl、20mMのHepes、0.22mMのKH₂PO₄、1.26mMのCaCl₂、0.81mMのMgSO₄、pH7.4に再懸濁し、次いで組織ホモジナイザーを中程度の速度で使用して30秒均質化した。+4℃で10分の超遠心分離を使用してホモジネートを35000gで遠心分離し、上清を捨て、新鮮な均質化緩衝液を添加した。ペレットの均質化を合計3回繰り返した。最終的なペレットを数ミリリットルの均質化緩衝液中に再懸濁し、ブラッドフォード方法を使用してタンパク質濃度を決定し、マイクロプレートリーダーにおいて595nmで測定した。タンパク質濃度を1mg/mlに調整し、低温用チューブに移し、-80℃で保存した。凍結前、Y5膜に250mMのスクロースを添加した。

アッセイ。1ウェル当たり総体積200μlの白色の96-ウェルプレートでヒトNPY-Y受容体SPA結合アッセイを行った。シンチレーション液(PerkinElmer社、Waltham、MA、USA)を含有する小麦胚芽アグルチニンでコーティングしたビーズを、結合緩衝液;Y1、Y2:50mMのHepes、1mMのCaCl₂、5mMのMgCl₂、0.02%のtween 20、0.25%オボアルブミン、pH7.4;Y4、Y5:20mMのHepes、10mMのNaCl、0.22mMのKH₂PO₄、1.26mMのCaCl₂、0.81mMのMgSO₄、0.1%バシトラシン及び0.25%オボアルブミン、pH7.4に再溶解させ、膜調製物と混合して、1ウェル当たり1mgのビーズ及び3μgのY1膜、1ウェル当たり3μgのY2膜、1ウェル当たり1μgのY4膜又は1ウェル当たり20μgのY5膜の最終濃度を得た。Y1、Y2及びY5結合アッセイにおいて100pMの濃度に相当する1ウェル当たり50000cpmの放射性リガンドであるヒト[¹²⁵I]-PYYを添加した。100pMの濃度に相当する1ウェル当たり50000cpmの放射性リガンドであるヒト[¹²⁵I]-膵臓ポリペプチド(PP)を、Y4結合アッセイで使用した。

凍結乾燥した類似体を、80%ジメチルスルホキシド(DMSO)、19%H₂O及び1%酢酸(CH₃COOH)に溶解させて2000μM(Y1、Y4及びY5)及び200μM(Y2)のストック溶液とし、Y1、Y4及びY5アッセイでは10000nMから1pM、Y2アッセイでは1000nMから0.1pMの範囲の最終濃度に、結合緩衝液で連続希釈(1:10)を行った。プレートを密封し、400rpmに設定されたプレート振盪機で+25℃で2時間インキュベートし、その後、マイクロプレートシンチレーション及び発光カウンターでの発光の読み取りの前に、1500rpmで10分遠心分離した。読み取り前に、Y1のSPAプレートをそのまま室温で16時間静置した。放射性リガンドの排出を、発光の低減として測定し、S字状用量応答曲線の非線形回帰分析によってIC₅₀値を計算した。受容体特異的なKd値(Y1=0.556;Y2=0.275;Y4=0.111;Y5=0.345)、放射性リガンド濃度及びIC50値を含むチェン-プルソフ方程式[Ki=IC50/(1+[L]/Kd)]によって、結合親和性に関するKi値を得た。

本発明のPYY化合物は全て優れたY2結合を示すが、受容体Y1、Y4及びY5への結合親和性は強く低減する。

(実施例33)
ミニブタにおける薬物動態学的な研究
この研究の目的は、ミニブタにi.v.投与した後のインビボにおけるPYY化合物の半減期を決定すること、すなわちそれらの体内の時間の延長とそれによるそれらの作用時間の延長を決定することである。これは、問題の誘導体の終末相半減期が決定される薬物動態学的な(PK)研究でなされる。終末相半減期は、一般的に、それが最初の分布相の後に測定されたある特定の血漿濃度を半分にするのに要する期間を意味する。

静脈内投与後のGottingenミニブタにおけるインビボでの薬物動態学的な評価に関する研究
動物。Gottingenミニブタの雌、15〜25kgは、Ellegaard Minipigs社、Denmarkから購入した。動物をNovo Nordisk A/S社の動物ユニット中で飼育し、動物ユニットでの通常の手法に従って維持し取り扱った。最短で2週間の順化後に、各動物の尾の大静脈に2つの永久的な中心静脈カテーテルを実行した。外科手術後、薬物動態学的な実験の間は動物をそれらの通常の個別の囲いに入れた。

体重。動物の体重を毎週量った。投与前、午前中、動物を絶食させたが、水は自由に摂取させた。食物は投与中に供給された。

ペプチド及び投与溶液の投与。中心の短いカテーテルを介して静脈注射を行い、投与後にカテーテルを最小10mlの滅菌生理食塩水でフラッシングした。15nmol/kg、n=3、体積0.05ml/kgで試験物質を投与した。緩衝液:50mMのリン酸ナトリウム、70mMの塩化ナトリウム、0.05%のtween 80、pH7.4又は20mMのHEPES、2.2%グリセロール、0.05%ポリソルベート80、pH6.5。

血液サンプル及び分析。以下のスケジュール:投与前、5、15、30、45分、1時間、1.5時間、2時間、3時間、4時間、6時間、8時間、10時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間、168時間、192時間、216時間、240時間、264時間及び288時間に従って、中心カテーテルを介して血液サンプルを採取した。1日目にカテーテルを延長チューブに接続するが、延長チューブは1日目の最後に除去されると予想される。カテーテルを介してサンプル(0.8ml)を採取した。EDTA緩衝液(8mM)及び50μlのVal-Pyr緩衝液を含有する試験管(50mlのトラジロールに溶解させた3.097gのK3EDTA及び0.5mlの20mMのVal-Pyrを含有する安定化緩衝液を添加した。pHを7.4に調節した。)に血液を収集した。毎回の血液のサンプリング後に、カテーテルを最小5mlの滅菌0.9%NaCl及び10IE/mlのヘパリンでフラッシングした。カテーテル中での血栓形成の危険を高めるカテーテル中の細菌増殖を回避するために、無菌の技術が求められた。遠心分離(10分、4℃、1942g)まで、湿った氷上でサンプルを維持した。その後、血漿(最小200μl)をMicronicチューブに即座に移し、分析まで-20℃で維持した。後述するようなLC/MSによって血漿サンプルを分析した。

データ及び結果。Phoenix(Pharsight Inc.社、Mountain View、CA、USA)を使用したノンコンパートメントの薬物動態分析によって、血漿濃度-時間プロファイルを分析した。各動物からの個々の濃度-時間値を使用して計算を行った。

サンプル分析
血漿サンプルごとの定量アッセイ。液体クロマトグラフィーに連結したTurbulent Flow Chromatographyに続いての質量分析検出(TFC/LC/MS)によって、血漿中の試験物質をアッセイした。方法の選択によって、1つのサンプルにおける、例えば動物あたり4種の化合物のカセット投与における様々な化合物の定量が可能になった。未知のサンプル中の試験物質の濃度を、ピーク領域を使用して、量の関数として計算した。分析物を加えた血漿サンプルに基づくキャリブレーショングラフを回帰分析によって構築した。アッセイに関する典型的なダイナミックレンジは1〜2,000nmol/lであった。3つの濃度レベルで品質管理(QC)サンプルを2連で共にアッセイすることによって方法の性能を保証した。分析物のストック及び使用溶液を血漿で調製し、37℃で1時間インキュベートした。

サンプルの調製。40.0μlのEDTA-血漿を160μlの50%メタノール、1%ギ酸に添加し、次いでボルテックスで混合し、14300rpm(16457g)、4℃で20分遠心分離した。上清を96ウェルプレートに移した(プレートは、0.4%のBSAと共に37℃で1/2時間プレインキュベート済みのものであった)。注射体積は25μlであった。

サンプルの清浄化のために、どちらもThermo Scientific社、Franklin、MA、USAからの、TurboFlow、Cycloneカラム(0.5×50mm)を使用して、Phenomenex社、Torrance、CA、USAからのOnyx、C18カラム(2.0×50mm)のいずれかでLC分離を行った。溶出はイソクラクティックで行い、勾配（グラジエント）の組合せはメタノール、アセトニトリル、Milli-Q水及びギ酸であった。選択的な検出を、ポジティブモードイオン化で稼働させた質量分析によって行った。

データの取り扱い。Phoenix(Pharsight Inc.社、Mountain View、CA、USA)を使用したノンコンパートメントの薬物動態分析によって、血漿濃度-時間プロファイルを分析した。各動物からの個々の濃度-時間値を使用して計算を行った。

試験された本発明のPYY誘導体は、hPYY(3-36)及び誘導体化していないhPYY(3-36)類似体の半減期と比較して極めて長い半減期を有する。

(実施例34)
db/dbマウスにおける薬力学的研究
db/dbマウスにおいて血糖及び食物摂取に対するPYY化合物のインビボにおける作用を決定するために、後述するように、db/dbマウスに化合物を投与し、血糖及び食物摂取に対する効果を測定した。

雄db/dbマウスを正常な日周リズム(午後6時から午前6時までが暗期サイクル)で飼育し、餌のアルトロミンを不断給餌する。11〜13週齢で血糖と体重に関してマウスを適合させ、マウス9匹の適合グループに分け、1ケージ当たり3匹で飼育する。午後4時(時間=0)に、提示された用量で提示された化合物又はビヒクル(50mMのNa2HPO4、pH7.4、70mMのNaCl、0.05%のTween 80)を2.5ml/kgの体積でマウスに皮下投与し、いくつかの実験では時間=23時間に2回目の注射を与えた。提示された注射後のタイムポイントで、例えば注射後4時間、16時間、23時間及び40時間で、血糖及び食物摂取を測定する。血糖のための血液サンプルを、尾静脈から5μlのヘパリンでコーティングした毛細管に採取し、これを、Biosen(登録商標)システム溶液(250μl)を用いてエッペンドルフチューブに入れる。Biosen(登録商標)機器で即座にサンプルを分析する。

血糖(BG)測定は、処理前に対する、ビヒクルで調整されたBG%の平均±SEMとして報告され、以下のように計算される:
100-[BG%(ビヒクル、平均)-BG%]、式中、
BG%は、100×[BG(時間=t)/BG(処理前)]であり、
BG%(ビヒクル、平均)は、ビヒクルでの処理前に対する、時間=tにおけるビヒクルグループのBG%値の平均である。

食物摂取は、提示されたインターバルにわたるビヒクルグループの平均食物摂取のパーセンテージとしての1ケージ当たりの食物摂取の平均±SEMとして報告される。

これらのデータは、本発明のPYY化合物の血糖を低下させる作用及び食物摂取阻害を強く裏付ける。

本発明のある特定の特徴を本明細書で例示し説明したが、当業者であればここで多くの改変、置換、変化、及び均等物に想到すると予想される。それゆえに、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の主旨の範囲内に含まれるものとしてこのような全ての改変及び変化を網羅することが意図されていると理解されるものとする。

Claims

hPYY(1-36)(配列番号1)の35位に対応する位置にL-β-ホモアルギニンを含み、hPYY(3-36)と比較して最大で6個のアミノ酸改変を有し、Y受容体サブタイプであるY2に特異的であるPYY化合物、又はその薬学的に許容される塩。
hPYY(1-36)(配列番号1)の30位に対応する位置にトリプトファンを更に含む、請求項1に記載のPYY化合物。
hPYY(1-36)(配列番号1)の1〜3位に対応する位置が存在せず、N末端置換基を更に含み、前記N末端置換基が12個までの炭素原子を含むアルカノイル基である、請求項1又は2に記載のPYY化合物。
前記N末端置換基が、3-メチルブタノイルである、請求項3に記載のPYY化合物。
hPYY(1-36)(配列番号1)の7位に対応する位置におけるリシン、及び7位におけるリシン残基のイプシロンアミノ基に連結された改変基を更に含み、前記改変基は、A-B-C-によって定義され、
式中、A-は、
(式中、aは、12から19の整数であり、bは、10から16の整数であり、*は、-B-との連結点を示す)
から選択され、
B-は、
(式中、cは、1又は2であり、dは、1又は2であり、***は、A-との連結点を示し、**は、-C-との連結点を示す)
から選択され、
-C-は、
(式中、eは、1〜5の範囲の整数であり、fは、1〜5の範囲の整数であり、gは、2から6の範囲の整数であり、****は、-B-との連結点を示し、*****は、hPYY(1-36)の7位に対応する位置におけるリシン残基のイプシロンアミノ基との連結点を示す)
である、請求項1から4のいずれか一項に記載のPYY化合物。
B-が、
(式中、cは、1又は2であり、***は、A-との連結点を示し、**は、-C-との連結点を示す)
である、請求項5に記載のPYY化合物。
e及びfがそれぞれ、1である、請求項5又は6に記載のPYY化合物。
gが、2、4又は6から選択される、請求項5〜7のいずれか一項に記載のPYY化合物。
以下:
[β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号6)
; [Trp30,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号7)
; [Gln18,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号8)
; [Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号9)
; [Gln18,Ala24,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号10)
; [Gln18,Aib24,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号11)
; [Aib24,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号12)
; [Aib24,Trp30,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号13)
; [Arg4,Gln18,Aib24,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号14)
; [Arg4,Gln18,Ala24,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号15)
; 7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys7,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号16)
; 7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys7,Gln18,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号17)
; 7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys7,Gln18,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号18)
; 7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号19)
; 7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号20)
; 7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys7,Gln18,Aib22,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号21)
; 7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg4,Lys7,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号22)
; 7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg4,Lys7,Gln18,β-homoArg35]hPYY(3-36) (配列番号23)
; 4-N{α}-(3-メチルブタノイル)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[,Lys7,Gln18,β-homoArg35]hPYY(4-36) (配列番号24)
; 4-N{α}-(3-メチルブタノイル)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]-[,Lys7,Gln18,β-homoArg35]hPYY(4-36) (配列番号25)
; 4-N{α}(3-メチルブタノイル)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]-[Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(4-36) (配列番号26)
; 4-N{α}(3-メチルブタノイル)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(16-スルホヘキサデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(4-36) (配列番号27)
; 4-N{α}(3-メチルブタノイル)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(16-スルホヘキサデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]-[Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(4-36) (配列番号28)
; 4-N{α}-(3-メチルブタノイル)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]- エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg4,Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(4-36) (配列番号29)
; 4-N{α}-(3-メチルブタノイル)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(16-スルホヘキサデカノイルアミノ)-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ] エトキシ]アセチル]-[Arg4,Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(4-36) (配列番号30)
から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載のPYY化合物。
請求項1から9のいずれか一項に記載のPYY化合物を含む、医薬。
糖尿病の全ての形態及び関連疾患の治療及び/又は予防で使用するため;並びに/或いは、脂質パラメーターを改善するため、β細胞の機能を改善するため、及び/若しくは糖尿病性疾患の進行を遅延させ又は予防するための、請求項10に記載の医薬。