JP6598106B2

JP6598106B2 - 脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨の作製方法

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Publication number: JP6598106B2
Application number: JP2015120615A
Authority: JP
Inventors: 向方; 弘行土屋; 克洋林
Original assignee: Kanazawa University NUC
Current assignee: Kanazawa University NUC
Priority date: 2015-06-15
Filing date: 2015-06-15
Publication date: 2019-10-30
Anticipated expiration: 2035-06-15
Also published as: JP2017000626A

Description

本発明は、脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨の作製方法、並びに該作製方法で作製された脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨に関する。詳しくは、本発明は、骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートを、特定のカルシウム濃度である骨形成培地で培養することを特徴とする、脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨の作製方法に関する。

（再生医療）
近年、再生医療が注目され、整形外科分野でも、骨再生を目的とした再生医療が実施されている。幹細胞を骨形成系列に分化させ、続いて骨再生に使用することは再生医療における主要な目標である。再生医療分野において、重要な３つのファクターである細胞、制御因子及び足場｛以下、スキャホールド（scaffolds）と称する場合がある｝が、その地位を確立してきている。

（骨芽細胞）
骨形成においては骨芽細胞が重要な役割を果たしている。骨芽細胞は、骨組織において骨形成を行う細胞であり、タンパク質等を産生及び分泌して骨基質をつくる。具体的には、骨芽細胞は、生体内でコラーゲン等の基質タンパク質を分泌し、そこに基質小胞（matrix vesicle）を作る。この基質小胞の周囲にリン酸カルシウムが沈着して骨の基質が完成し、骨芽細胞は最終的にはこの基質の中で骨細胞となる。
骨芽細胞は、間葉系幹細胞から分化するものであり、間葉系幹細胞にデキサメタゾン、β−グリセロリン酸、及びアスコルビン酸を作用させることにより分化誘導できることが知られている。
また、インビトロにおいて多能性幹細胞から分化させた間葉系幹細胞を、骨形成タンパク質（Bone Morphogenetic Protein；ＢＭＰ）−４、アスコルビン酸−２−リン酸塩、デキサメタゾン及びβ−グリセロリン酸塩を含む培養培地を使用して、ゼラチンでコートした培養プレートで培養することにより、骨芽細胞に分化誘導できたことが開示されている（特許文献１）。

（脂肪由来幹細胞）
間葉系幹細胞の１つとして認められている脂肪由来幹細胞（adipose-derived stem cell；以下、ＡＤＳＣｓと称することがある）も、ＢＭＳＣｓ、ＥＳＣｓ及びｉＰＳＣｓに加えて、骨再生医療における使用が検討されている。損傷を受けた組織及び臓器の修復及び再建へのＡＤＳＣｓの利用にはいくつかの選択肢がある。
修復部位へＡＤＳＣｓを直接注入する方法が知られている。また、ＡＤＳＣｓをフィブリン糊などの生物学的接着剤に混ぜて修復部位に注入する方法が知られている。しかしながら、これら方法では皮質骨表面への細胞の生着や固定が困難であった。

また、ＡＤＳＣｓを様々な担体と共に移植する方法が知られている。心血管疾患における幹細胞治療において、天然の生物分解性マトリクス（biodegradable matrixes）で構成されたスキャホールドを使用することにより、該治療の大きな制約であった細胞生着の不足を回避することができた（非特許文献１）。しかしながら、この様な方法によっても、細胞を移植部位に確実に固定することは困難であり、細胞が経時的に脱落する問題があった。

一方、個々の分散状態にあるＡＤＳＣｓ（以下、分散ＡＤＳＣｓと称する場合がある）がシート状に形成してなるＡＤＳＣｓシートが、心血管分野及び形成外科分野において、組織再生に一定の成果を挙げていることが報告されている。
現在利用できるＡＤＳＣｓシートは、大まかに２種類に分けることができ、一方は、CellSeed社の製品などのような特別な担体を支持体とするＡＤＳＣｓシートであり、もう一方は、コラーゲンタンパク質担体と共に移植部位に移植するＡＤＳＣｓシートである。

（細胞シート）
細胞シートの製造方法は、様々な報告がある。例えば、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、滑膜由来細胞、滑膜幹細胞、骨芽細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来細胞、又は脂肪由来幹細胞を、支持体や担体上で培養することにより製造する方法が報告されている（特許文献２、３）。また、間葉系幹細胞、滑膜細胞、及び胚性幹細胞から選択される細胞を細胞培養支持体上で培養して、該培養した細胞を、シート状三次元構造体として作製する方法が報告されている（特許文献４）。さらに、脂肪細胞を含有する細胞シートを含む心臓疾患治療用移植材料を製造する方法であって、ａ）温度応答性高分子が被覆された細胞培養支持体上で、脂肪細胞を含有する細胞群を培養液中で培養する工程、ｂ）培養液の温度を、上限臨界溶解温度以上又は下限臨界溶解温度以下とする工程、ｃ）細胞群を、細胞培養支持体から細胞シートとして剥離する工程、さらに工程ｃ）の前にｄ）培養液にアスコルビン酸又はその誘導体を加える工程を含む方法が開示されている（特許文献５）。

本願発明者らは、骨塊を液体窒素中で凍結後に骨マトリクスを維持し、その後、それを元の位置に戻して固定する液体窒素療法を開発している（非特許文献２−４）。
なお、整形外科分野でのＡＤＳＣｓの応用は、分散ＡＤＳＣｓと他の物質、例えば標準生理食塩水、フィブリンゲル及びコラーゲンゲルなどとの混合物を海綿質骨に注入するといった方法により行われているのみである。
しかしながら、ＡＤＳＣｓは、整形外科分野においては、移植箇所で固定するためにフィブリン糊様の物質を構成成分とする混合物として使用されるため、そのような混合物に含まれるＡＤＳＣｓの濃度には制限がある。

（先行技術）
脂肪由来幹細胞を骨芽細胞に分化する試みも知られている。
本発明者らは、脂肪由来幹細胞シートを市販の骨芽細胞分化誘導培地で培養して、骨芽細胞に分化できることを確認したが、骨形成まで確認できなかった（非特許文献５）。
また、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸塩で誘導した脂肪由来幹細胞を公知の培地で培養し、骨形成を示すマーカーを検出できたことが報告されているが、骨形成まで確認できていない（非特許文献６）。

国際公開第２００４／１０６５０２号パンフレット特許第０４９２１３５３号公報特許第０４６２０１１０号公報特許第０４９４３８４４号公報国際公開第２０１１／０６７９８３号パンフレット

Arana M, Pena E, Abizanda G, Cilla M, Ochoa I, et al. (2013) Preparation and characterization of collagen-based ADSC-carrier sheets for cardiovascular application. Acta Biomater. 9(4):6075-83. Tsuchiya H, Wan S. L, Sakayama K, Yamamoto N, Nishida H, et al. (2005) Reconstruction using an autograft containing tumour treated by liquid nitrogen. J Bone Joint Surg. 87-B: 218-25. Hayashi K, Tsuchiya H, Yamamoto N, Takeuchi A, Tomita K. (2008) Functional outcome in patients with osteosarcoma around the knee joint treated by minimised surgery. Int Orthop. 32(1): 63-68. Yamamoto N, Tsuchiya H, Tomita K. (2003) Effects of liquid nitrogen treatment on the proliferation of osteosarcoma and the biomechanical properties of normal bone. J Orthop Sci. 8(3):374-80. Xiang Fang, Hideki Murakami, Satoru Demura, et al. (2014) A Novel Method to Apply Osteogenic Potential of Adipose Derived Stem Cells in Orthopaedic Surgery. PLOS ONE. Volume 9 Issue 2 e8874. Yu J, Tu YK, Tang YB, Cheng NC.(2014) Stemness and transdifferentiation of adipose-derived stem cells using L-ascorbic acid 2-phosphate-induced cell sheet formation. Biomaterials. 2014 Apr;35(11):3516-26.

脂肪由来幹細胞シートを骨芽細胞に分化する方法が知られている。しかしながら、該方法では、実際の骨の形状まで分化することができないのが現状である。
これにより、本発明の課題は、脂肪由来幹細胞を実際の骨の形状まで分化することができる方法を提供することである。

本発明者らは、上記目的を達成すべく、鋭意研究を行った。骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートを、特定のカルシウム濃度である骨形成培地で培養することにより、実際の骨の形状まで分化することができることを確認した。
以上により、本発明は、これら知見により達成したものである。

即ち、本発明は以下に関する。
「１．骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートを、カルシウム濃度が２．２５ｍｍｏｌ／Ｌ〜５．００ｍｍｏｌ／Ｌである骨形成培地で培養することを特徴とする、脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨の作製方法。
２．前記カルシウム濃度は、プロピオン酸カルシウムを前記骨形成培地に添加することにより調整されていることを特徴とする、前項１に記載の作製方法。
３．前記骨形成培地には、少なくとも以下が含まれていることを特徴とする、前項１又は２に記載の作製方法。
（１）デキサメタゾン
（２）アスコルビン酸−２−リン酸塩
（３）β−グリセロリン酸塩
（４）プロピオン酸カルシウム
４．前記骨芽細胞含有脂肪由来幹細胞シートは、脂肪由来幹細胞シートを１．００ｍｍｏｌ／Ｌ〜２．００ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウム濃度である骨芽細胞分化誘導培地で培養することで得られることを特徴とする、前項１〜３のいずれか１に記載の作製方法。
５．前記脂肪由来幹細胞シートは、脂肪由来幹細胞を、細胞分化誘導剤を含まずかつアスコルビン酸又はその塩を添加して調製した細胞培養培地で、スキャホールドを使用しないで、培養することで得られることを特徴とする、前項１〜４のいずれか１に記載の作製方法。
６．前記アスコルビン酸又はその塩が、５０μＭ〜５００μＭの濃度になるように細胞培養培地に添加されることを特徴とする、前項５に記載の作製方法。
７．前記脂肪由来幹細胞シートが単層の脂肪由来幹細胞シートであることを特徴とする、前項５又は６に記載の作製方法。
８．以下の工程で得られる脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨、
（１）脂肪由来幹細胞を、細胞分化誘導剤を含まずかつアスコルビン酸又はその塩を添加して調製した細胞培養培地で、スキャホールドを使用しないで、培養して、脂肪由来幹細胞シートを得る工程、
（２）上記（１）で得られた脂肪由来幹細胞シートを、カルシウム濃度が１．００ｍｍｏｌ／Ｌ〜２．００ｍｍｏｌ／Ｌである骨芽細胞分化誘導培地で培養して、骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートを得る工程、及び
（３）上記（２）で得られた骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートを、カルシウム濃度が２．２５ｍｍｏｌ／Ｌ〜５．００ｍｍｏｌ／Ｌである骨形成培地で培養して、脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨を得る工程。
９．前項１〜７のいずれか１項に記載の作製方法により作製された、脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨。
１０．前項１〜７のいずれか１項に記載の作製方法により作製された、脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞若しくは骨、又は、前項８若しくは９に記載の脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞若しくは骨を含む骨形成用生体材料。」

本発明の作製方法によれば、実際の骨の形状の脂肪由来幹細胞シート由来の骨（参照：図２）を得ることができる。

脂肪由来幹細胞シートが細胞培養支持体（ホルダー）に掛けてあることを示す。実施例２で作製した脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨の外観形状図。実施例２で作製した脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨のＡＬＰ染色図（１０倍）。実施例２で作製した脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨のＨＥ染色図（左図４倍、右図１０倍）。実施例２で作製した脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨のアリザリンレッド染色図（１０倍）。

（本発明の概要）
本発明は、骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートを特定のカルシウム濃度である骨形成培地で培養することにより、実際の骨の形状まで分化することができる脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨の作製方法、並びに該作製方法で作製された脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨に関する。
より詳しくは、以下の工程で得られる脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨である。
（１）脂肪由来幹細胞を、細胞分化誘導剤を含まずかつアスコルビン酸又はその塩を添加して調製した細胞培養培地で、スキャホールドを使用しないで、培養して、脂肪由来幹細胞シートを得る工程。
（２）上記（１）で得られた脂肪由来幹細胞シートを、カルシウム濃度が１．００ｍｍｏｌ／Ｌ〜２．００ｍｍｏｌ／Ｌである骨芽細胞分化誘導培地で培養して、骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートを得る工程。
（３）上記（２）で得られた骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートを、カルシウム濃度が２．２５ｍｍｏｌ／Ｌ〜５．００ｍｍｏｌ／Ｌである骨形成培地で培養して、脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨を得る工程。

本発明の脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨は、骨の欠損部分に直接移植することができるという利点を有する。
また、本発明の脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨は、その力学的強度が高いため、それ自身を単独で修復部位に移植されたときにその部位に固定できる利点を有する。

（幹細胞）
「幹細胞（stem cell）」とは、複数系統の細胞に分化できる能力（多分化能）と、細胞分裂を経ても多分化能を維持できる能力（自己複製能）を併せ持つ細胞をいう。幹細胞は、発生の過程や組織・器官の維持において細胞を供給する役割を担っている。幹細胞には、全ての系統の細胞に分化することのできる胚性幹細胞、通常は分化系統が限定されている成体幹細胞（組織幹細胞、体性幹細胞）、胚体外組織を除く全ての系統に分化する多能性を有し、人工的に作製された人工多能性幹細胞等が知られている。

（脂肪由来幹細胞）
「脂肪由来幹細胞（adipose-derived stem cell；ＡＤＳＣｓ）」は、脂肪組織に存在する幹細胞である。主に間葉系幹細胞で構成され、骨髄由来の幹細胞と同様に、骨芽細胞、軟骨細胞、心筋細胞、脂肪細胞、肝細胞、血管内皮細胞及びインスリン分泌細胞等の多種類の細胞に分化することができる多能性を有する。脂肪組織は採取が容易であり、また多量の幹細胞を含むため、脂肪由来幹細胞は容易かつ大量に調製することが可能である。

（脂肪由来幹細胞の分離及び精製）
脂肪組織からの脂肪由来幹細胞の分離及び精製は、従来報告された公知の方法を参考にして実施できる。例えば、文献Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2009;29:1723-1729に記載の方法を用いることができる。あるいは、市販のヒト脂肪由来幹細胞（例：Invitrogen社製品）を使用することもできる。

（脂肪由来幹細胞シート）
「脂肪由来幹細胞シート（ＡＤＳＣｓシート）」は、個々別々の分散状態にある脂肪由来幹細胞がシート状を形成してなる細胞構築物をいう。
「単層の脂肪由来幹細胞シート」とは、脂肪由来幹細胞が一層のシート状態を形成してなり、重層構造や三次元構造を形成していない細胞構築物をいう。
本明細書において、個々別々の分散状態にあるＡＤＳＣｓを単にＡＤＳＣｓ又は分散ＡＤＳＣｓといい、シート状に形成してなるＡＤＳＣｓをＡＤＳＣｓシートという。

（脂肪由来幹細胞の由来）
ＡＤＳＣｓ及びＡＤＳＣｓシートは、哺乳動物の脂肪由来のものであればいずれでもよく、哺乳動物として、ヒト、サル、ブタ、ブタ、ウマ、ウシ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、モルモット等を例示できる。
好ましくは、ヒトの脂肪由来のＡＤＳＣｓ及びＡＤＳＣｓシートである。
さらに、脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨は、骨形成用生体材料として使用される場合、同種ＡＤＳＣｓ及び同種ＡＤＳＣｓシート由来であることが好ましく、自家ＡＤＳＣｓ及び自家ＡＤＳＣｓシート由来であることがさらに好ましい。
同種ＡＤＳＣｓ及び同種ＡＤＳＣｓシートとは、同じ動物種に由来するＡＤＳＣｓ及びＡＤＳＣｓシートを意味する。
自家脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨とは、骨移植を受ける対象自身に由来するＡＤＳＣｓシート由来の脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨であることを意味する。

（骨分化能）
「骨分化能」とは、骨芽細胞、骨細胞又はそれらの前駆細胞に分化する能力をいう。すなわち、骨分化誘導条件下で、骨芽細胞、骨細胞又はそれらの前駆細胞に分化する能力をいう。骨分化誘導条件は、インビボ及びインビトロのいずれの条件下であってもよい。インビトロの骨分化誘導として、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸、及びアスコルビン酸を含む培地での培養や、ＢＭＰ−４、アスコルビン酸−２−リン酸塩、デキサメタゾン及びβ−グリセロリン酸塩を含む培養培地での培養を例示できる。

（脂肪由来幹細胞シートの作製方法）
本発明の脂肪由来幹細胞シート（特に、骨分化能を有する脂肪由来幹細胞シート）の作製方法では、細胞培養支持体を添加していない培養容器内に、細胞分化誘導剤を含まない細胞培養培地にアスコルビン酸又はその塩を添加して調製した溶液を加え、該溶液中で、脂肪由来幹細胞を培養することを特徴とする。

細胞培養に使用する容器は、細胞培養用に一般的に使用されているものであれば特に限定されず、シャーレやフラスコなどの細胞培養容器を例示できる。接着性の細胞であれば、このような細胞培養容器の壁面に接着して増殖し、浮遊性の細胞であれば、培養溶液中に遊離の状態で増殖する。このような細胞培養容器を基体と称することがある。

（細胞培養支持体）
「細胞培養支持体」とは、細胞の付着及び増殖、あるいは細胞による三次元構造の構築を目的として基体に被覆又は積層されたコーティング材料で形成された構造体をいう。細胞培養支持体として、高分子が架橋した三次元網目構造体であるハイドロゲルやコラーゲンマトリクス等を好ましく例示できる。
細胞培養支持体を添加していない培養容器として、例えば通常市販されているシャーレや細胞培養フラスコ等を例示できる。

（アスコルビン酸又はその塩）
本発明に係る方法で使用するアスコルビン酸は、Ｌ−アスコルビン酸又はその誘導体、例えばＬ−アスコルビン酸−２−グルコシドやＬ−アスコルビン酸−２−リン酸等であり、好ましくはＬ−アスコルビン酸−２−リン酸である。
アスコルビン酸の塩とは、ナトリウム塩又はカルシウム塩等の薬理学的に許容される塩であればいずれの塩であってもよい。
アスコルビン酸−２−リン酸は、間葉系細胞のコラーゲンタンパク質分泌を増加させるが、該細胞に他の影響は何ら与えないことが報告されている。
細胞培養培地に添加されるアスコルビン酸又はその塩は、最終濃度が１０μＭ〜８００μＭ、好ましくは５０μＭ〜５００μＭ、より好ましくは１００μＭ〜２００μＭ、最も好ましくは約１５０μＭになるように細胞培養培地に添加する。

（細胞培養培地）
細胞培養培地は、ＡＤＳＣｓの培養に一般的に使用されている培養培地を使用することができる。例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's modified Eagle's medium；ＤＭＥＭ）、α−最小必須培地（alpha-Minimum Essential Media；α−ＭＥＭ）を好ましく例示できるが、特に限定されない。

（脂肪由来幹細胞の培養条件）
ＡＤＳＣｓの培養条件は一般的に知られている培養条件を採用することができる。
ＡＤＳＣｓシートの作製のためのＡＤＳＣｓ培養日数は、３日〜１５日、好ましくは４日〜１３日、より好ましくは５日〜１０日、さらに好ましくは７日〜１０日、最も好ましくは約７日間である。

（骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シート）
本発明の骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートは、脂肪由来幹細胞シートを、骨芽細胞分化誘導培地で培養して得ることができる。

（骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートの作製方法）
骨芽細胞分化誘導培地は、カルシウム濃度が１．００ｍｍｏｌ／Ｌ〜２．００ｍｍｏｌ／Ｌであり、必須成分として骨芽細胞分化誘導剤を含む。
骨芽細胞分化誘導剤とは、幹細胞や骨系列前駆細胞を、骨芽細胞に分化させ得る薬剤をいう。骨芽細胞分化誘導剤として、公知の骨芽細胞分化誘導剤をいずれも使用することができるが、デキサメタゾン、アスコルビン酸、アスコルビン酸−２−リン酸、アスコルビン酸−２−リン酸塩、β−グリセロリン酸、ＢＭＰ−４、β−グリセロリン酸塩を例示することができる。
インビトロにおける骨芽細胞分化誘導は、骨芽細胞分化誘導剤を加えた培養培地中で、幹細胞や骨系列前駆細胞を、培養することにより実施できる。骨芽細胞分化誘導剤を加える培養培地は、一般的に使用されている培地であればいずれも使用できるが、ＤＭＥＭ、α−ＭＥＭを好ましく例示することができる。
培養条件は、骨芽細胞分化誘導剤を含む細胞培養培地中で、本発明に係る作製方法で作製された脂肪幹細胞シートを培養し、該シート中での骨芽細胞の分化誘導を検出することにより適宜変更して設定することができる。
骨芽細胞の分化誘導の検出は、公知方法、例えばＡＬＰ染色（ALP staining）やアリザリンレッド染色、あるいはＡＬＰ活性の測定により実施することができる。

（脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨）
本発明の脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨は、骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートを、カルシウム濃度が２．２５ｍｍｏｌ／Ｌ〜５．００ｍｍｏｌ／Ｌである骨形成培地で培養して得ることができる。
本発明の脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨は、図２に記載のように、実際の骨のような形状や硬さまで分化された状態を意味する。

（脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨の作製方法）
骨形成培地とは、骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートを骨細胞又は骨に分化させ得る培地を意味する。骨形成培地は、公知の培地｛α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ培地等｝に、好ましくは、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸、アスコルビン酸、ＢＭＰ−４、アスコルビン酸−２−リン酸、アスコルビン酸−２−リン酸塩、β−グリセロリン酸塩、及び／又は、プロピオン酸カルシウムを含む。
なお、骨形成培地中のカルシウム濃度は、２．２５ｍｍｏｌ／Ｌ〜５．００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２．４０ｍｍｏｌ／Ｌ〜３．００ｍｍｏｌ／Ｌである。なお、公知の培地を使用する場合において、培地のカルシウム濃度を調整するために、好ましくは、プロピオン酸カルシウムを使用する。

培養条件は、骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートを骨形成培地で培養し、該シート中での骨細胞又は骨の分化誘導を検出することにより適宜変更して設定することができる。
培養時間は、特に限定されないが、１日〜十数か月である。
培養温度は、特に限定されないが、室温でも十分に分化誘導することできるが、好ましくは約３７℃である。
骨細胞又は骨の分化誘導の検出は、公知方法、例えばＡＬＰ染色、ＨＥ染色やアリザリンレッド染色、あるいはＡＬＰ活性の測定により実施することができる。

（骨形成用生体材料）
骨形成用生体材料とは、骨移植、骨再生及び骨再建のために使用する材料をいう。
本発明の骨形成用生体材料は、本発明の作製方法により作製された脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞若しくは骨を含む。特に、本発明の骨形成用生体材料では、該骨細胞若しくは骨が力学的強度を有し、かつ自身単独で骨修復部位に移植して固定されるので、スキャホールドを必要としないことが特徴である。

以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。

（脂肪由来幹細胞シートの作製方法）
以下の方法により、脂肪由来幹細胞シートを作成した。詳細は、以下の通りである。

（脂肪由来幹細胞の作製）
ヒト脂肪由来幹細胞は、Life Technologies社より購入した。ＡＤＳＣｓの細胞表面タンパク質の特徴は、フローサイトメトリーにより解析しており、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ１６６陽性であり、ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ４５及びＬｉｎ１陰性である。
凍結保存されていたｈＡＤＳＣｓを融解した後、１０％牛胎仔血清（ＦＢＳ）（NICHIREI BIOSCIENCES社）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｐ／Ｓ）(Wako Pure Chemical Industries社）を加えたＤＭＥＭ（Wako Pure Chemical Industries, Ltd社）にけん濁し、３７℃で１日間インキュベーションした。
前記１日間のインキュベーション後、活性化したｈＡＤＳＣｓの形態が円形から紡錘形に変化することが、光学顕微鏡により観察した。これらの形態の変化は、細胞からのコラーゲン線維性タンパク質の分泌によるものであり、コラーゲン線維性タンパク質を分泌した細胞はシャーレの底に接着した。
シャーレは予備加温したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）で静かに３回すすぎ、非接着細胞を除去した。残っているｈＡＤＳＣｓを１０％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓを加えたＤＭＥＭ中で培養し、そしてそれらがシャーレの面積の９０％を覆うように増殖するまで継代培養した。継代３代目のｈＡＤＳＣｓを以下で使用した。

（脂肪由来幹細胞シートの作製）
継代３代目のｈＡＤＳＣｓを、１０ｃｍシャーレに１×１０^６細胞／シャーレで播種し、１０％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓを添加したＤＭＥＭ中でオーバーコンフルエントになるまで培養し（約１週間）、ｈＡＤＳＣｓシートを作製した。
作製培地は、１０％ＦＢＳ、５０μＭアスコルビン酸−２−リン酸塩、１％Ｐ／Ｓを含むものである。培地は１週間の間、３日毎に交換した。

（骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートの作製）
実施例１で作製した脂肪由来幹細胞シートを骨芽細胞分化誘導培地で培養し、骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートの作製を行った。詳細は、以下の通りである。

（骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートの作製）
実施例１で作製した脂肪由来幹細胞シートを、骨芽細胞分化誘導培地（１０％ＦＢＳ、０．１μＭデキサメタゾン、１５０μＭアスコルビン酸−２−リン酸塩、１０ｍＭβ−グリセロリン酸塩及び１％Ｐ／Ｓを含むα−ＭＥＭ培地）で、約３７℃で約１週間培養して、骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートを作製した。

（脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨の作製）
実施例２で作製した骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートを骨形成培地で培養し、脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨の作製を行った。詳細は、以下の通りである。

（骨芽細胞又は骨細胞の作製）
実施例２で作製した骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートを細胞培養支持体（ホルダー：参照：図１）に掛けて、骨形成培地で、約３７℃で約１５週間培養した。
骨形成培地は、１０％ＦＢＳ、０．１μＭデキサメタゾン、５０μＭアスコルビン酸−２−リン酸塩、１０ｍＭβ−グリセロリン酸塩及び１％Ｐ／Ｓをα−ＭＥＭ培地に添加し、さらに、プロピオン酸カルシウムを添加して、該培地中のカルシウム濃度を２．５ｍｍｏｌ／Ｌに調整して得た。

（骨分化能を有する脂肪由来幹細胞シートが骨細胞又は骨への分化の確認）
実施例３で作製した脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨の特性を確認した。詳細は、以下の通りである。

（外観形状の確認）
実施例３で作製した脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨は、図２で示すように、骨の形状まで分化していることを確認した。

（カルシウム含有量の確認）
実施例３で作製した脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨の一部を自体公知の方法により３日間の脱灰をした。そして、脱灰前の質量と脱灰後の質量を比較した。脱灰前の質量が0.0032ｇであり、脱灰後の質量が0.0015ｇであったことにより、実施例３で作製した脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨の成分の５３％以上がカルシウムに相当することを確認した。一般的な骨に含まれているカルシウム含有量を考慮すれば、本発明の脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨の強度は、十分にあることを確認した。

（各染色による骨形成の確認）
自体公知の染色方法により、実施例２で作製した本発明の脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨を１日脱灰した後に染色した。
図３から明らかなように、ＡＬＰ染色により、骨に分化していることを確認した。
図４から明らかなように、ＨＥ染色により、骨に分化していることを確認した。
図５から明らかなように、アリザリンレッド染色により、骨に分化していることを確認した。

（総論）
本発明の骨細胞又は骨の作製方法で得られた脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨は、実施例３で示すように、骨まで十分に分化していることを確認した。脂肪由来幹細胞がこのような形状や強度の骨まで分化できることは報告されておらず、本発明により初めて成し得ることができた。

本発明によれば、実際の骨の形状まで分化することができる脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨の作製方法を提供することができる。

Claims

骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートを、カルシウム濃度が２．２５ｍｍｏｌ／Ｌ〜５．００ｍｍｏｌ／Ｌである骨形成培地で培養することを特徴とする、脂肪由来幹細胞シート由来の骨細胞又は骨の作製方法。
前記カルシウム濃度は、プロピオン酸カルシウムを前記骨形成培地に添加することにより調整されていることを特徴とする、請求項１に記載の作製方法。
前記骨形成培地には、少なくとも以下が含まれていることを特徴とする、請求項１又は２に記載の作製方法。
（１）デキサメタゾン
（２）アスコルビン酸−２−リン酸塩
（３）β−グリセロリン酸塩
（４）プロピオン酸カルシウム
前記骨芽細胞含有脂肪由来幹細胞シートは、脂肪由来幹細胞シートを１．００ｍｍｏｌ／Ｌ〜２．００ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウム濃度である骨芽細胞分化誘導培地で培養することで得られることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１に記載の作製方法。
前記脂肪由来幹細胞シートは、脂肪由来幹細胞を、細胞分化誘導剤を含まずかつアスコルビン酸又はその塩を添加して調製した細胞培養培地で、スキャホールドを使用しないで、培養することで得られることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１に記載の作製方法。
前記アスコルビン酸又はその塩が、５０μＭ〜５００μＭの濃度になるように細胞培養培地に添加されることを特徴とする、請求項５に記載の作製方法。
前記脂肪由来幹細胞シートが単層の脂肪由来幹細胞シートであることを特徴とする、請求項５又は６に記載の作製方法。
以下の工程で得られる脂肪由来幹細胞シート由来の骨、
（１）脂肪由来幹細胞を、細胞分化誘導剤を含まずかつアスコルビン酸又はその塩を添加して調製した細胞培養培地で、スキャホールドを使用しないで、培養して、脂肪由来幹細胞シートを得る工程、
（２）上記（１）で得られた脂肪由来幹細胞シートを、カルシウム濃度が１．００ｍｍｏｌ／Ｌ〜２．００ｍｍｏｌ／Ｌである骨芽細胞分化誘導培地で培養して、骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートを得る工程、及び
（３）上記（２）で得られた骨形成能を有する脂肪由来幹細胞シートを、カルシウム濃度が２．２５ｍｍｏｌ／Ｌ〜５．００ｍｍｏｌ／Ｌである骨形成培地で培養して、脂肪由来幹細胞シート由来の骨を得る工程。
請求項１〜７のいずれか１項に記載の作製方法により作製された、脂肪由来幹細胞シート由来の骨。
請求項１〜７のいずれか１項に記載の作製方法により作製された、脂肪由来幹細胞シート由来の骨、又は、請求項８若しくは９に記載の脂肪由来幹細胞シート由来の骨を含む骨形成用生体材料。