JP6594891B2 - ジンクフィンガータンパク質発現を調節するための方法および組成物 - Google Patents

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関連出願への相互参照
本出願は、２０１４年３月１８日に出願された米国仮出願第６１／９５５，００２号（この開示内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。

本開示は、ゲノム発現および操作の分野、特に、細胞における転写因子およびヌクレアーゼのような遺伝子モジュレーターの発現の調節にある。

内因性ゲノムＤＮＡの遺伝子発現の標的化調節のための種々の方法および組成物が、記載されている。ＤＮＡ結合タンパク質による遺伝子発現の標的化調節は、例えば、米国特許第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，５９９，６９２号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，９４７，８７３号；同第７，２５３，２７３号；同第７，３５８，０８５号；同第７，３６１，６３５号；同第７，５３４，７７５号；同第８，５８６，５２６号、および米国特許公開第２０１１００８２０９３号において記載される。さらに、部位特異的ヌクレアーゼを使用した標的化切断事象を使用して、例えば、標的化変異誘発が誘導され、細胞ＤＮＡ配列の標的化欠失が誘導され、予め決定された染色体遺伝子座における標的化組換えが促進され得る。例えば、参照によりそれらの開示の全体が全目的のため本明細書に組み込まれる第８，６２３，６１８号；第８，０３４，５９８号；第８，５８６，５２６号；第６，５３４，２６１号；第６，５９９，６９２号；第６，５０３，７１７号；第６，６８９，５５８号；第７，０６７，３１７号；第７，２６２，０５４号；第７，８８８，１２１号；第７，９７２，８５４号；第７，９１４，７９６号；第７，９５１，９２５号；第８，１１０，３７９号；第８，４０９，８６１号；米国特許公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号、および同第２０１３０１７７９６０号、ならびに米国特許出願第１４／２７８，９０３号を参照されたい。

これらの方法は、標的遺伝子または操作されたヌクレアーゼ系の発現を調節する操作されたタンパク質の使用をしばしば含む。特に、操作された転写因子は、標的化遺伝子を活性化するかまたは抑制し、ヌクレアーゼは、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）による切断の修復が、遺伝子のノックアウト、および／または目的の配列の挿入（標的化組み込み）をもたらすことができるように、標的ＤＮＡ配列における二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックを誘導する。内因性遺伝子の調節および／または切断は、ジンクフィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ−ＴＦ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクター転写因子（ＴＡＬＥ−ＴＦ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ転写因子（例えば、Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａら、（２０１３年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０巻：９７３〜９７６頁を参照のこと）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｔｔａｇｏヌクレアーゼのようなタンパク質および系の使用を介して、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を特異的切断をガイドするための操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡ（「単鎖ガイドＲＮＡ」）と共に使用して生じることができる。ジンクフィンガータンパク質を含有するこれらの操作された転写因子を使用した臨床試験は、これらの新規転写因子が、種々の状態を処置する能力があることを示した（例えば、Ｙｕら、（２００６年）、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、２０巻：４７９〜４８１頁を参照のこと）。加えて、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼを使用した臨床試験は、治療上の有用性も示した（例えば、Ｔｅｂａｓら、（２０１４年）、Ｎｅｗ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ、３７０巻（１０号）：９０１頁を参照のこと）。

これらのタンパク質および系を使用した遺伝子調節は、例として、ＨＩＶ感染症、嚢胞性線維症、神経膠芽腫のようながん、神経障害、トリヌクレオチド反復障害、ＨＬＡ関連障害、血友病、神経学的状態、病原体感染症、リソソーム蓄積症、および異常ヘモグロビン症を含む様々な疾患ならびに障害を処置する潜在能力を有する。例えば、米国特許第７，９５１，９２５号；米国特許公開第２０１４００１７２１２号；同第２０１４００９３９１３号；同第２０１４００８０２１６号；同第２０１３０１４５４８４号、同第２００８０１８８０００号、同第２０１１００８２０７８号、同第２０１１００８２０９３号、同第２０１２０１９６３７０号、同第２０１２０１２８６３５号、同第２０１２０２１４２４１号、同第２０１３０２５３０４０号を参照されたい。しかしながら、モジュレーターが、野生型対立遺伝子と比較して、標的部位変異体対立遺伝子に（配列特異的様式で）優先的に結合する（例えば、米国特許公開第２０１１００８２０９３号、および同第２０１３０２５３０４０号を参照のこと）例においてでさえ、モジュレーターの過剰発現は、野生型配列への結合、および／または野生型配列の望ましくない変化をもたらし得る。

米国特許第８，６２３，６１８号明細書 米国特許第８，０３４，５９８号明細書 米国特許第８，５８６，５２６号明細書

したがって、モジュレーターの発現の最適なレベル、および遺伝子発現レベルの続く修飾を達成するために細胞内で外因性遺伝子モジュレーターの発現を調節するための組成物ならびに方法が依然として必要とされている。

本発明は、遺伝子治療、遺伝子発現、およびゲノム操作における使用のための組成物ならびに方法を記載する。具体的には、記載される方法および組成物は、調節されるべき遺伝子が内因性遺伝子であり得るか、または目的の導入遺伝子の発現を引き起こす細胞内の発現カセットにあり得る細胞内での遺伝子発現のモジュレーター（例えば、遺伝子発現を増大または低減する１つまたは複数のジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ成分等を含む分子）の自己調節を含む調節に関する。

一態様において、本発明は、遺伝子モジュレーター（例えば、ＺＦＰ−ＴＦ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥ−ＴＦ、ＴＡＬＥＮ、Ｔｔａｇｏヌクレアーゼのような転写因子もしくはヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼもしくは転写因子のタンパク質成分）の少なくとも１種の成分をコードするポリヌクレオチド、および配列（例えば、プロモーター）を含む構築物であって、ポリヌクレオチドが、遺伝子モジュレーターにより結合され得る１つまたは複数の低親和性（自己調節性）標的配列をさらに含む、構築物を含む。ある特定の実施形態において、転写因子またはヌクレアーゼ（もしくはその成分）をコードする配列は、遺伝子調節因子により結合され得る１つまたは複数の低親和性（自己調節性）標的配列を含む配列に作動可能に連結されている。このようにして、遺伝子モジュレーター（例えば、転写因子またはヌクレアーゼ）の発現は、外因性構築物中の低親和性標的配列への遺伝子モジュレーターの結合が、遺伝子モジュレーターの発現を調節する（例えば、増大させるか、または低減させる）点で自己調節性である。任意の数、例えば、１〜３０の間（もしくはその間の任意の数）の低親和性標的配列または標的配列の部分が、構築物に含まれ得る。ある特定の実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個の低親和性標的配列またはその部分が、転写因子またはヌクレアーゼをコードする構築物に含まれる。低親和性標的配列またはその部分の数は、例えば、ジンクフィンガータンパク質との結合親和性に基づき得、それらの標的部位に対する高い親和性を有するジンクフィンガータンパク質は、代表的に、それらの標的部位に対してより低い親和性を有するジンクフィンガータンパク質より少ない低親和性標的部位を有する配列に連結される。ある特定の実施形態において、目的とする標的部位は、内因性ゲノムにある。低親和性標的部位は、目的とする標的部位と同一または異なってもよい。ある特定の実施形態において、低親和性標的部位は、目的とする標的部位、およびさらなる目的とする標的部位、さらなる標的サブサイト（例えば、ジンクフィンガータンパク質について３個の塩基対）、またはさらなる塩基対を含む。ある特定の実施形態において、低親和性（自己調節性）標的部位は、異なる数の標的部位またはサブサイト、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個もしくはさらにそれ超のさらなるもしくは少ない標的部位または標的サブサイトを含む（例えば、低親和性標的部位は、目的とする標的部位中の６または７個のＣＡＧ反復と比較して、１５〜２０個のＣＡＧ反復で作られ得る）。ある特定の実施形態において、低親和性標的配列は、複数の反復（例えば、ＣＡＧおよび／またはＣＣＧ反復）を含み、トリヌクレオチド反復障害において関与する遺伝子（例えば、Ｈｔｔ遺伝子、米国特許公開第２０１１００８２０９３号を参照のこと）を標的化する転写因子またはヌクレアーゼの発現を引き起こす制御エレメント（複数可）に含まれる。配列が、転写因子またはヌクレアーゼにより結合されないとき、転写は、配列の存在によって大いに影響されないが、結合されるとき、転写は調節される（増大されるか、もしくは低減され、および／またはシャットオフされる）という条件で、低親和性標的部位を含む配列は、発現構築物中のプロモーター配列または任意の他の配列（例えば、エンハンサー配列）内および／または近位に位置され得る。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されている構築物は、ドナー核酸（または導入遺伝子）をさらに含む。

一部の実施形態において、目的の導入遺伝子の発現は、融合導入遺伝子が、遺伝子モジュレーターおよび目的の遺伝子の両方をコードするように、融合導入遺伝子を作製することによっても調節され得る。一部の場合では、遺伝子モジュレーターおよび目的の遺伝子は、自己切断ペプチド配列（例えば、２Ａ）またはリボソーム休止部位（例えば、ＩＲＥＳ）によって隔てられている。さらなる実施形態において、目的の遺伝子は、レポーター遺伝子をコードする。

ある特定の実施形態において、本明細書に記載されているポリヌクレオチドを含む構築物は、ウイルス構築物、例えば、レンチウイルスベクター（ＬＶ）、組み込み欠陥レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）、アデノウイルス、またはＡＡＶ構築物である。一部の実施形態において、構築物によりコードされる遺伝子モジュレーターは、転写因子（例えば、ジンクフィンガーもしくはＴＡＬＥのようなＤＮＡ結合ドメイン、または活性化ドメインのような単鎖ガイドＲＮＡおよび転写調節ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のための修飾されたＣａｓ９トランス活性化因子、またはＺＦＰもしくはＴＡＬＥ系での使用のためのＨＳＶ ＶＰ１６ドメイン）、または抑制ドメイン（例えば、ＫＲＡＢドメイン））を含む。他の実施形態において、構築物は、ヌクレアーゼ、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガータンパク質もしくはＴＡＬＥ）、およびヌクレアーゼドメイン（例えば、切断ドメイン）、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼをコードする。ある特定の実施形態において、遺伝子モジュレーター（例えば、転写因子および／またはヌクレアーゼ）は、野生型対立遺伝子に結合する。したがって、遺伝子モジュレーターは、標的部位への結合の際に遺伝子発現を増大させるか、または低減し得る。他の実施形態において、遺伝子モジュレーターは、変異体対立遺伝子に結合する。なお他の実施形態において、遺伝子モジュレーターは、野生型および変異体対立遺伝子の両方に結合する（両対立遺伝子性（ｂｉ−ａｌｌｅｌｉｃ））。ヌクレアーゼは、標的ＤＮＡに二本鎖（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ニック）を誘導することができる。一部の実施形態において、２種のニッカーゼを使用して、２個のニックを導入することによってＤＳＢを作製する。一部の場合では、ニッカーゼはＺＦＮであるが、他の場合では、ニッカーゼはＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼである。

他の態様において、１つまたは複数の本明細書に記載されている構築物を含む細胞が、本明細書に記載されている。ある特定の実施形態において、細胞は、ドナー核酸（例えば、導入遺伝子）をさらに含み、それは、構築物上に含まれるか、または別々に（例えば、別々の構築物において）提供されてもよい。したがって、ドナーは、ヌクレアーゼ（複数可）をコードする核酸の前、後、または一緒に送達されてもよい。ドナー核酸は、細胞のゲノム、例えば、内因性遺伝子座に組み込まれるべき外因性配列（導入遺伝子）を含む。一部の実施形態において、ドナーは、標的化された切断部位との相同性の領域により隣接される全長遺伝子を含む。一部の実施形態において、ドナーは、相同な領域を欠き、相同性非依存性機序（すなわち、ＮＨＥＪ）を介して標的遺伝子座に組み込まれる。他の実施形態において、ドナーは、細胞における使用のため（すなわち、遺伝子修正のため）相同な領域により隣接される核酸のより小さな小片を含む。一部の実施形態において、ドナーは、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ等のような機能性または構造性成分をコードする遺伝子を含む。他の実施形態において、ドナーは、目的の遺伝子に結合し、および／または目的の遺伝子の発現を調節する調節エレメントをコードする遺伝子を含む。本発明の好ましい実施形態によると、構築物は、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を含み、および／またはプラスミドＤＮＡによりコードされる。

他の態様において、本明細書に記載されている構築物（複数可）は、ウイルスおよび／または非ウイルス遺伝子導入方法により送達される。２Ａペプチド、ＳＡ部位、ＩＲＥＳ等をコードする配列、ならびにレポーター、治療用ポリペプチド等のようなさらなるコード配列が挙げられるがこれらに限定されないさらなる配列（コードまたは非コード配列）が、構築物に含まれ得る。

別の態様において、細胞において遺伝子発現を変える方法であって、細胞に本明細書に記載されている構築物を導入することを含む方法が、本明細書に記載されている。ある特定の実施形態において、構築物は、１つまたは複数の機能性ドメイン（例えば、転写抑制因子、転写活性化因子、またはヌクレアーゼ）に作動可能に連結されたＤＮＡ結合分子（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ単鎖ガイドＲＮＡ等）をコードする。本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて、ドナー核酸は、ドナー核酸が、ＤＳＢの部位において組み込まれるように、例えば、本明細書に記載されているヌクレアーゼで細胞のゲノムにおいて二本鎖切断（ＤＳＢ）を作製することにより、細胞のゲノムに組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、ドナー核酸は、非相同性依存性方法（例えば、ＮＨＥＪ）を介して組み込まれる。ある特定の実施形態において、ＤＳＢは、１つまたは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ジンクフィンガー結合ドメインを含む融合タンパク質により作製され、それを操作して、目的の領域内の配列、および切断ドメインまたは切断ハーフドメインが結合される。他の実施形態において、ＤＳＢは、ヌクレアーゼドメイン（ＴＡＬＥＮ、ｍｅｇａ ＴＡＬ、および／またはｃＴＡＬＥＮ）に融合された１つまたは複数のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン（天然に存在する、または天然に存在しない）により作製される。なおさらなる実施形態において、ＤＳＢは、操作された単鎖ガイドＲＮＡまたはその機能性等価物を使用して、ヌクレアーゼがゲノム中の標的化部位にガイドされるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系を使用して作製される。

他の態様において、本開示は、細胞に導入された外因性遺伝子モジュレーターの発現を調節する方法であって、本明細書に記載されている構築物を導入することを含む方法を提供する。ある特定の実施形態において、遺伝子モジュレーターは、（例えば、目的とする標的部位の結合能力を上回るのに十分高いレベルで）構築物中の低親和性標的部位に結合するとき、内因性遺伝子の発現を抑制するか、または不活性化し、自己調節が生じ、ここで、低親和性標的部位への結合は、構築物由来の遺伝子モジュレーターおよび／またはさらなるコード配列の発現を調節する（例えば、抑制する）。

他の態様において、本開示は、本明細書に記載されている構築物を使用して遺伝子的に修飾される細胞を提供する。哺乳動物、植物、真菌、細菌、魚等が挙げられるがこれらに限定されない任意の細胞タイプを使用することができる。ある特定の実施形態において、細胞は細胞系である。他の実施形態において、細胞は初代細胞である。さらに他の実施形態において、細胞は幹細胞（例えば、造血幹細胞）である。

一部の態様において、本明細書に記載されているポリペプチド、ポリヌクレオチド（例えば、自己調節性構築物）、および／または細胞を含む医薬組成物が、提供される。ある特定の実施形態において、組成物は、例えば、疾患または障害の予防および／または処置のために被験体に投与される。医薬組成物を、全身性投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、肺性または頭蓋内注入）、または局所適用のため製剤化することができる。

遺伝子モジュレーターについて目的とする標的部位を含むゲノムを有する細胞、および遺伝子モジュレーター（または遺伝子モジュレーター、例えば、単鎖ガイドＲＮＡと共発現されたとき機能するタンパク質モジュレーターの成分）をコードする配列に作動可能に連結される本明細書に記載されている低親和性（自己調節性）標的部位を含む外因性構築物を含む、１つまたは複数の遺伝子モジュレーターの発現を調節する系も、本明細書において提供される。遺伝子モジュレーターの発現は、遺伝子モジュレーターの低親和性標的部位への結合の際にそれ自体調節される（低減または増大される）。ある特定の実施形態において、低親和性標的部位は、目的とする標的部位と同一の配列を含む。他の実施形態において、低親和性標的部位は、目的とする標的部位と異なる配列を含む。

本発明の構築物および／またはドナー分子を含むキットも提供される。構築物は、ＺＦＰ−ＴＦ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥ−ＴＦ、ＴＡＬＥＮ、ＭｅｇａＴＡＬ、ｃＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードし得る。キットは、本明細書に記載されているドナー分子、本発明の方法を実施するための説明書等をさらに含んでもよい。キットは、選択またはスクリーニングマーカーのような目的のドナー分子も含んでもよい。

これらおよび他の態様は、全体的な開示に照らして当業者に容易に明らかであろう。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
目的とする標的部位に結合する遺伝子モジュレーターの少なくとも１種の成分をコードするポリヌクレオチドを含む構築物であって、前記ポリヌクレオチドは、前記遺伝子モジュレーターにより結合される自己調節性標的部位に作動可能に連結され、さらに、前記遺伝子モジュレーターの前記自己調節性標的配列への結合は、前記ポリヌクレオチドの発現を調節する、構築物。
（項目２）
前記目的とする標的部位が細胞のゲノムにある、項目１に記載の構築物。
（項目３）
前記ポリヌクレオチドの発現が、前記遺伝子モジュレーターが前記自己調節性標的配列に結合すると低減される、項目１または２に記載の構築物。
（項目４）
前記自己調節性標的部位が、前記目的とする標的部位の配列と少なくとも１個の塩基対が異なる、項目１〜３のいずれかに記載の構築物。
（項目５）
制御エレメントを含み、前記自己調節性標的部位が前記制御エレメント内にある、項目１〜４のいずれかに記載の構築物。
（項目６）
ウイルス構築物である、項目１〜５のいずれかに記載の構築物。
（項目７）
前記ウイルス構築物が、レンチウイルス（ＬＶ）、組み込み欠陥レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）、アデノウイルス、またはＡＡＶ構築物である、項目５に記載の構築物。
（項目８）
前記遺伝子モジュレーターが、転写因子またはヌクレアーゼである、項目１〜７のいずれかに記載の構築物。
（項目９）
前記転写因子または前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥタンパク質、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む、項目８に記載の構築物。
（項目１０）
ドナー核酸をさらに含む、項目８に記載の構築物。
（項目１１）
遺伝子調節因子をコードする前記ポリヌクレオチドおよび前記自己調節性標的部位に作動可能に連結された少なくとも１個のさらなるポリペプチドコード配列をさらに含む、項目１に記載の構築物。
（項目１２）
前記さらなるポリペプチドコード配列が、２Ａ自己切断ペプチド配列またはＩＲＥＳ部位により、前記遺伝子調節因子をコードする配列から隔てられている、項目１１に記載の構築物。
（項目１３）
項目１〜１２のいずれかに記載の構築物を含む細胞。
（項目１４）
遺伝子モジュレーターがヌクレアーゼを含み、さらに前記細胞が、前記細胞のゲノムに組み込まれるドナー核酸を含む、項目１３に記載の細胞。
（項目１５）
前記ドナー核酸が、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）にあるか、またはプラスミドＤＮＡによりコードされる、項目１４に記載の細胞。
（項目１６）
細胞に導入された外因性遺伝子モジュレーターの発現を調節する方法であって、前記方法は、項目１〜１２のいずれか記載の構築物を細胞に導入する工程を含み、前記遺伝子モジュレーターの発現は、前記遺伝子モジュレーターが自己調節性標的部位に結合すると抑制される、方法。
（項目１７）
前記細胞が哺乳動物細胞または植物細胞である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記細胞が幹細胞である、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
項目１〜１２のいずれかに記載の構築物、または項目１３〜１５のいずれかに記載の細胞を含む、医薬組成物。
（項目２０）
項目１〜１２のいずれかに記載の構築物、項目１３〜１５のいずれかに記載の細胞を含み、任意選択でドナー分子および／または説明書を含むキット。

図１Ａ〜１Ｄは、ＺＦＰ抑制因子（「ＺＦＰ−ＫＯＸ」）およびＧＦＰバリアントＶｅｎｕｓ（「ＶＥＮＵＳ」）を含む構築物を描写する概略図である。ＫＯＸは、ＫＯＸ１タンパク質由来のＫＲＡＢ抑制ドメインを指す。図１Ａは、タンパク質発現がＨｔｔプロモーターにより引き起こされる構築物を示す。図１Ｂは、タンパク質発現が構成的ＣＭＶプロモーターにより引き起こされる構築物を示す。図１Ｃは、ＣＭＶプロモーターが、ＣＡＧ結合ＺＦＰに対する低親和性標的部位として作用する、７〜２０個のＣＡＧ反復を含むよう修飾された構築物を示す。図１Ｄは、発現が、ＣＡＧ結合ＺＦＰに対する低親和性標的部位として作用する、１７個のＣＡＧ反復を含有する非コードエキソン１を有するＨｔｔプロモーターにより引き起こされる構築物を示す。ヒトベータグロビンイントロン、核局在化シグナル（「ＮＬＳ」）、ＦＬＡＧエピトープタグ、２Ａ配列、およびヒト成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化シグナル（ｈＧＨ ポリＡ）も示される。

図２は、示された構築物を含むＬＶで感染させたハンチントン病（ＨＤ）ニューロンにおけるＺＦＰ−２Ａ−Ｖｅｎｕｓ ｍＲＮＡコピー数の発現を描写するグラフである。構築物において使用されたＺＦＰは、実施例１において記載されるＨｔｔまたは対照（Ｃｈｋ２）結合タンパク質である。

図３は、示されたＬＶ構築物で感染させたＨＤニューロンにおいて定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により測定された相対的Ｈｔｔ発現を描写するグラフである。

図４は、示されたＩＤＬＶ構築物で感染させた２９３Ｔ細胞において定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により測定された相対的Ｈｔｔ発現を描写するグラフである。

図５は、ＣＭＶプロモーター、Ｈｔｔプロモーター（Ｈｔｔｐ）、またはＨｔｔプロモーター、および１７個のＣＡＧ反復を有するエキソン１（Ｈｔｔｐ−ＣＡＧ１７）を有するプラスミドをトランスフェクトさせた２９３Ｔ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を描写するグラフである。

図６Ａおよび６Ｂは、示された構築物のプラスミドをトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の分析を描写するグラフである。図６Ａは、図１Ｃおよび実施例１において示されるものを含む構築物をトランスフェクトされた細胞において発現されたＧＦＰのＭＦＩを描写する。示される通り（左パネル）、構築物は、低親和性Ｈｔｔ標的部位を含まない（０）か、または７、１０、１３、１５、１８、もしくは２０個のＣＡＧ反復の形態の低親和性Ｈｔｔ標的部位を含んでいた。図６Ｂは、図６Ａに記載される構築物をトランスフェクトされた細胞の定量的Ｔａｑｍａｎ（登録商標）分析によるＺＦＰ−２Ａ−ＶＥＮＵＳ発現を描写するグラフである。 図６Ａおよび６Ｂは、示された構築物のプラスミドをトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の分析を描写するグラフである。図６Ａは、図１Ｃおよび実施例１において示されるものを含む構築物をトランスフェクトされた細胞において発現されたＧＦＰのＭＦＩを描写する。示される通り（左パネル）、構築物は、低親和性Ｈｔｔ標的部位を含まない（０）か、または７、１０、１３、１５、１８、もしくは２０個のＣＡＧ反復の形態の低親和性Ｈｔｔ標的部位を含んでいた。図６Ｂは、図６Ａに記載される構築物をトランスフェクトされた細胞の定量的Ｔａｑｍａｎ（登録商標）分析によるＺＦＰ−２Ａ−ＶＥＮＵＳ発現を描写するグラフである。

図７は、示された構築物をトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の分析を描写するグラフである。図７Ａは、実施例１に記載される通り、示された構築物をトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のＧＦＰのＭＦＩを描写するグラフである。

図８Ａ〜８Ｃは、示された構築物を含むＡＡＶで形質導入された２９３Ｔ細胞の分析を描写するグラフである。図８Ａは、実施例１に記載される通り、示された構築物で形質導入された２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現のＭＦＩを描写するグラフである。図８Ｂは、ＺＦＰ発現についての細胞のＴａｑｍａｎ（登録商標）分析を示すグラフである。図８Ｃは、０〜２０個のＣＡＧ反復を含む構築物からのレポーター遺伝子発現（ＶＥＮＵＳ）を描写し、ここで、発現は、フローサイトメトリーを介して、および蛍光顕微鏡により可視化される。 図８Ａ〜８Ｃは、示された構築物を含むＡＡＶで形質導入された２９３Ｔ細胞の分析を描写するグラフである。図８Ａは、実施例１に記載される通り、示された構築物で形質導入された２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現のＭＦＩを描写するグラフである。図８Ｂは、ＺＦＰ発現についての細胞のＴａｑｍａｎ（登録商標）分析を示すグラフである。図８Ｃは、０〜２０個のＣＡＧ反復を含む構築物からのレポーター遺伝子発現（ＶＥＮＵＳ）を描写し、ここで、発現は、フローサイトメトリーを介して、および蛍光顕微鏡により可視化される。 図８Ａ〜８Ｃは、示された構築物を含むＡＡＶで形質導入された２９３Ｔ細胞の分析を描写するグラフである。図８Ａは、実施例１に記載される通り、示された構築物で形質導入された２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現のＭＦＩを描写するグラフである。図８Ｂは、ＺＦＰ発現についての細胞のＴａｑｍａｎ（登録商標）分析を示すグラフである。図８Ｃは、０〜２０個のＣＡＧ反復を含む構築物からのレポーター遺伝子発現（ＶＥＮＵＳ）を描写し、ここで、発現は、フローサイトメトリーを介して、および蛍光顕微鏡により可視化される。

図９Ａおよび９Ｂは、実施例１に記載される通り、プロモーター構築物を含有するＡＡＶの異なる感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入されたＨＤニューロンの分析を描写するグラフである。図９Ａは、実施例１に記載される通り、プロモーター構築物においてＣＡＧ結合３３０７４または対照５４７５ ＺＦＰを有するＡＡＶの存在下で、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子（「ＣＡＧ１７」）または変異体（疾患関連）Ｈｔｔ対立遺伝子（「ＣＡＧ４８」）のいずれか由来のＨｔｔ遺伝子の発現を描写する。図９Ｂは、図９Ａに記載される構築物で形質導入されたニューロンの定量的Ｔａｑｍａｎ（登録商標）分析により測定されたＺＦＰ ＴＦ発現を示す。 図９Ａおよび９Ｂは、実施例１に記載される通り、プロモーター構築物を含有するＡＡＶの異なる感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入されたＨＤニューロンの分析を描写するグラフである。図９Ａは、実施例１に記載される通り、プロモーター構築物においてＣＡＧ結合３３０７４または対照５４７５ ＺＦＰを有するＡＡＶの存在下で、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子（「ＣＡＧ１７」）または変異体（疾患関連）Ｈｔｔ対立遺伝子（「ＣＡＧ４８」）のいずれか由来のＨｔｔ遺伝子の発現を描写する。図９Ｂは、図９Ａに記載される構築物で形質導入されたニューロンの定量的Ｔａｑｍａｎ（登録商標）分析により測定されたＺＦＰ ＴＦ発現を示す。

細胞内の外因性遺伝子モジュレーターの発現を調節するための組成物および方法が、本明細書において開示される。特に、本発明は、１つまたは複数の操作された遺伝子モジュレーター（例えば、転写因子および／またはヌクレアーゼ）をコードする構築物に関し、ここで、操作された遺伝子モジュレーターの発現は、転写因子またはヌクレアーゼのための１つまたは複数の低親和性標的部位の包含により調節することができる。例えば、低親和性標的部位は、遺伝子モジュレーターの発現を引き起こすプロモーター内に含まれる。このようにして、転写因子またはヌクレアーゼが、細胞内で十分高いレベルで発現される（例えば、過剰発現される）と、低親和性標的部位が遺伝子モジュレーターにより結合され、遺伝子モジュレーターの発現が調節される（ＴＦ抑制因子またはヌクレアーゼの場合において下方調節され、ＴＦ活性化因子の場合において上方調節される）。一部の実施形態において、目的の導入遺伝子の発現は、融合導入遺伝子が、遺伝子モジュレーターおよび目的の遺伝子の両方をコードするように、融合導入遺伝子を作製することによっても調節され得る。本発明は、本明細書に記載されている構築物を含む細胞、ならびに本明細書に記載されている構築物および／または細胞を含む医薬組成物にさらに関する。

したがって、本発明の組成物および方法は、過剰発現が、望ましくないか、および／または細胞に有害である細胞内での遺伝子モジュレーター発現の下方調節を含む、構築物上のコード配列の調節をもたらす。

概要
方法の実践、ならびに本明細書に開示の組成物の調製および使用は、別途示されない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、および当分野の技術の範囲内の関連分野における従来の技法を用いる。これらの技法は、文献内で十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９およびＴｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌら，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７および定期的最新版；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹのシリーズ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒら）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。

定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、線状または環状構造であり、かつ一本鎖または二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈されるべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基部分、糖部分、および／またはリン酸部分において修飾されるヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包含することができる。概して、特定のヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対合特異性を有し、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。

「結合」とは、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的かつ非共有結合的な相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用のすべての構成要素が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格におけるリン酸残基と接触する）必要はない。そのような相互作用は、概して、１０^−６Ｍ^−１以下の解離定数（Ｋ_ｄ）を特徴とする。「親和性」は、結合の強度を指し、結合親和性の増加は、Ｋ_ｄの低下と相関性がある。

「結合タンパク質」は、別の分子に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合し得る。タンパク質結合タンパク質の場合、それは、それ自身に結合してホモ二量体、ホモ三量体等を形成することができ）、かつ／または、異なるタンパク質（単数または複数）の１つ以上の分子に結合し得る。結合タンパク質は、２つ以上の種類の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、およびタンパク質結合活性を有する。

「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、亜鉛イオンの配位によってその構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的な様式でＤＮＡに結合するタンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。

「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥの、その同族の（ｃｏｇｎａｔｅ）標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には、３３〜３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列に少なくともある程度の配列相同性を示す。

ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識へリックス領域を操作する（１つ以上のアミノ酸を改変する）ことによって、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」され得る。したがって、操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、非天然タンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作するための方法の非限定的な例には、設計および選択がある。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が主に合理的判定基準によってもたらされる非天然タンパク質である。設計のための合理的判定基準は、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計ならびに結合データの情報を格納するデータベース内の情報を処理するためのコンピュータ化アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号、同第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、および同第８，５８６，５２６号を参照されたく、国際公開第ＷＯ９８／５３０５８号、同第ＷＯ９８／５３０５９号、同第ＷＯ９８／５３０６０号、同第ＷＯ０２／０１６５３６号、および同第ＷＯ０３／０１６４９６号も参照されたい。

「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その生成が主にファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択等の実験によるプロセスからもたらされる天然には見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号、同第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、同第８，５８６，５２６号、国際公開第ＷＯ９５／１９４３１号、同第ＷＯ９６／０６１６６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ９８／５４３１１号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／６０９７０号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、同第ＷＯ０２／０９９０８４号を参照されたい。

「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられる原核生物のアルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する。例えば、Ｓｗａｒｔｓら、同書、Ｇ． Ｓｈｅｎｇら、（２０１３年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１巻、６５２頁を参照されたい。「ＴｔＡｇｏ系」とは、例えば、ＴｔＡｇｏ酵素による切断のためのガイドＤＮＡを含む、必要な成分全てである。「組換え」とは、２つのポリヌクレオチドの間の遺伝情報の交換プロセスを指し、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）によるドナー捕捉および相同組換えが挙げられるがこれらだけに限定されない。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、相同組換え修復機構を介して細胞における二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）の修復中に生じるような交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝子情報の伝達をもたらすことから、「非交叉遺伝子変換」または「ショートトラクト（ｓｈｏｒｔ ｔｒａｃｔ）遺伝子変換」として広く知られている。任意の特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、そのような伝達は、切断された標的（ｂｒｏｋｅｎ ｔａｒｇｅｔ）とドナーとの間に形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／または標的の一部になる遺伝子情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存的鎖アニーリング（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔｒａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ）」、および／または関連プロセスを含み得る。そのような特殊なＨＲは、多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、標的分子の配列の改変をもたらす。

「組換え」は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝子情報の交換のプロセスを指し、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）によるドナー捕捉、および相同組換えが挙げられるがこれらだけに限定されない。この開示の目的のため、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復機序を介した細胞における二本鎖切断の修復中に生じる交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ドナー由来の遺伝子情報の標的への伝達を導くので、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「ドナー」分子を使用して、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験したもの）の修復を鋳型にし、「非クロスオーバー遺伝子転換」または「ショートトラクト遺伝子転換」として様々に公知である。任意の特定の理論に拘束されることを望まないが、このような伝達は、切断された標的とドナーの間で形成するヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／または「合成依存性鎖アニーリング」を含み得、ここで、ドナーを使用して、標的の一部となる遺伝子情報、および／または関連するプロセスが再合成される。このような特殊なＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが、標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、標的分子の配列の変更をしばしばもたらす。本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて、ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥＮのさらなる対を、細胞内のさらなる標的部位の追加の二本鎖切断のため使用することができる。

外因性核酸配列は、例えば、１つ以上の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の種類のコード配列もしくは非コード配列、ならびに１つ以上の制御エレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。加えて、外因性核酸配列は、１つ以上のＲＮＡ分子（例えば、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等）を生成し得る。

「切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）」とは、ＤＮＡ分子の共有結合の骨格の切断（ｂｒｅａｋａｇｅ）を指す。切断は、リン酸ジエステル結合の酵素加水分解または化学的加水分解を含むが、これらに限定されない様々な方法によって開始され得る。一本鎖切断も二本鎖切断もいずれも可能であり、二本鎖切断は、２つのはっきりと異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらし得る。ある実施形態において、融合ポリペプチドは、標的化二本鎖ＤＮＡ切断に用いられる。

「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なる）とともに、切断活性（好ましくは、二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。「第１および第２の切断ハーフドメイン」、「＋および−切断ハーフドメイン」、ならびに「右および左切断ハーフドメイン」という用語は、二量体化する切断ハーフドメインの対を指すために交換可能に使用される。

「操作された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作された切断ハーフドメイン）を有する偏性ヘテロ二量体を形成するように修飾された切断ハーフドメインである。参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９１４，７９６号、同第８，０３４，５９８号、同第８，６２３，６１８号および米国特許公開第２０１１／０２０１０５５号も参照されたい。

「配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、線状、環状、または分岐状であってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。

「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大半は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４をそれぞれ２つ含む八量体と会合した約１５０個の塩基対のＤＮＡを含み、（生物に応じて多様な長さの）リンカーＤＮＡは、ヌクレオソームコアの間に広がって存在する。ヒストンＨ１の分子は、概して、リンカーＤＮＡと会合している。本開示の目的のために、「クロマチン」という用語は、すべての種類の細胞核タンパク質（原核および真核の両方）を包含することを意味する。細胞クロマチンは、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方を含む。

「染色体」は、細胞のゲノムのすべてまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、その核型を特徴とし、これは、この細胞のゲノムを含むすべての染色体の集合である。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含み得る。

「エピソーム」は、複製核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造物である。エピソームの例として、プラスミドおよびあるウイルスゲノムが挙げられる。

「標的部位」または「標的配列」は、結合分子が結合する核酸の一部を定義する核酸配列であるが、但し、結合に十分な条件が存在することを条件とする。「目的とする」標的部位は、ＤＮＡ結合分子が結合するように設計されるか、および／または選択される標的部位である（例えば、表２を参照のこと）。

「低親和性」または「自己調節性」標的部位または標的配列は、過剰な結合分子（例えば、遺伝子モジュレーター）が存在する場合に、結合分子により結合される核酸配列、および／または目的とする標的部位より低い結合親和性で結合分子により結合される核酸配列である。低親和性（自己調節性）標的部位は、０、１、２、３、４、５、６個またはそれ超の塩基対が目的とする標的部位と異なってもよく、および／または目的とする標的部位、例えば、目的とする標的部位と比較してさらに多いもしくはより少ない塩基対を含む標的部位を含んでもよい（例えば、ＣＡＧまたはＣＣＧのようなさらなる反復を含んでもよい）。ある特定の実施形態において、例えば、低親和性標的部位が、目的とする標的部位と同一の配列を含む場合、低親和性標的部位は、過剰な結合分子が存在する場合（すなわち、目的とする標的部位（例えば、内因性標的部位）が、結合分子により全て結合される場合）のみ結合される。この用語は、標的部位の部分、例えば、標的部位に存在するモチーフの反復も含む。

「外因性」分子は、通常は細胞に存在しないが、１つ以上の遺伝学的方法、生化学的方法、または他の方法によって細胞内に導入され得る分子である。「細胞における通常の存在」については、細胞の特定の発達段階および環境条件に対して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、成人筋肉細胞に対して外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に対して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全型内因性分子の機能バージョン、または正常機能型内因性分子の機能不全バージョンを含み得る。

外因性分子は、とりわけ、小分子（コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成される小分子等）、または高分子（タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記の分子の任意の修飾誘導体）、または上記の分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体であり得る。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖であってもよく、線状、分岐状、または環状であってもよく、任意の長さであってもよい。核酸には、二重鎖を形成することができる核酸、ならびに三重鎖形成核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、およびヘリカーゼが含まれるが、これらに限定されない。

外因性分子は、内因性分子と同一の種類の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であってもよい。例えば、外因性核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞に導入されるプラスミドもしくはエピソーム、または通常は細胞に存在しない染色体を含み得る。外因性分子を細胞に導入するための方法は、当業者に既知であり、脂質媒介導入（すなわち、中性脂質および陽イオン性脂質を含むリポソーム）、電気穿孔、直接注入、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介導入、およびウイルスベクター媒介導入を含むが、これらに限定されない。外因性分子は、内因性分子と同一の種類の分子でもあり得るが、細胞が由来するものとは異なる種に由来し得る。例えば、ヒト核酸配列は、本来はマウスまたはハムスターに由来する細胞系に導入され得る。

対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下で特定の発達段階にある特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。さらなる内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含み得る。

「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が好ましくは共有結合的に連結した分子である。サブユニット分子は、同一の化学的種類の分子であり得るか、または異なる化学的種類の分子であり得る。第１の種類の融合分子の例として、融合タンパク質、例えば、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥおよび／またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）とヌクレアーゼ（切断）ドメイン（例えば、エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼなど）との間の融合物および融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。第２の種類の融合分子の例として、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合物、および副溝結合剤と核酸との間の融合物が挙げられるが、これらに限定されない。

細胞における融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達から、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達によって生じ得、ここで、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断、およびポリペプチド連結も、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを細胞に送達するための方法は、本開示の他の個所で示される。

「多量体化ドメイン」（「二量体化ドメイン」または「タンパク質相互作用ドメイン」とも呼ばれる）は、ＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦのアミノ、カルボキシ、もしくはアミノおよびカルボキシ末端領域において組み込まれたドメインである。これらのドメインは、より大きなトラクトのトリヌクレオチド反復ドメインが、野生型の長さの数を有するより短いトラクトと比較して、多量体化されたＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦにより優先的に結合されるように、複数のＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦ単位の多量体化を可能にする。多量体化ドメインの例には、ロイシンジッパーが挙げられる。多量体化ドメインは、小分子によっても調節され得、ここで、多量体化ドメインは、小分子または外部リガンドの存在下でのみ別の多量体化ドメインとの相互作用を可能にする適切なコンフォメーションを想定する。このようにして、外因性リガンドを使用して、これらのドメインの活性を調節することができる。

本開示の目的のために、「遺伝子」は、遺伝子産物（以下を参照のこと）をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域（そのような調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているか否かに関わらず）を含む。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列（リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位等）、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位、および遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されない。

「遺伝子発現」とは、遺伝子内に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、もしくは任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等のプロセスによって修飾されたＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含む。

遺伝子発現の「調整（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調整は、遺伝子活性化および遺伝子抑制を含み得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、切断、改変、不活性化、ランダム変異）を用いて発現を調整することができる。遺伝子の不活性化とは、本明細書に記載のＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含まない細胞と比較して遺伝子発現における任意の低下を指す。したがって、遺伝子の不活性化は、部分的または完全であり得る。

「目的の領域」は、細胞クロマチンの任意の領域であり、例えば、遺伝子、または遺伝子内もしくは遺伝子に隣接する非コード配列等であり、そこで外因性分子に結合することが望ましい。結合は、標的化ＤＮＡ切断および／または標的化組換えの目的のためであり得る。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリア、クロロプラスト）、または感染ウイルスゲノムに存在し得る。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、転写された非コード領域（例えば、リーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロン等）内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内に存在し得る。目的の領域は、単一のヌクレオチド対と同程度に小さいか、または最大２，０００ヌクレオチド対の長さであるか、またはヌクレオチド対の任意の整数値であり得る。

「真核」細胞には、真菌細胞（酵母等）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が含まれるが、これらに限定されない。

「作用的連結」および「作用的に連結した」（または「作動可能に連結した」）という用語は、２つ以上の構成要素（配列エレメント等）の並列に関して交換可能に使用され、これらの構成要素は、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素のうちの少なくとも１つが他の構成要素のうちの少なくとも１つに及ぼす機能を媒介し得ることを可能にするように配置される。例として、プロモーター等の転写調節配列は、その転写調節配列が１つ以上の転写調節因子の存在または不在に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合にコード配列に作用的に連結される。転写調節配列は、概して、コード配列とシスに作用的に連結されるが、それに直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、たとえそれらが隣接していなくても、コード配列に作用的に連結される転写調節配列である。

融合ポリペプチドに関して、「作用的に連結した」という用語は、構成要素の各々が、そのように連結されていない場合に実行したであろう機能と同一の機能を、他の構成要素と連結して実行するという事実を指し得る。例えば、ＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＰ、ＴＡＬＥ）を切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ等のエンドヌクレアーゼドメイン、メガヌクレアーゼドメイン等）に融合する融合ポリペプチドに関しては、融合ポリペプチドにおいて、ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、一方、切断（ヌクレアーゼ）ドメインが標的部位の近傍でＤＮＡを切断することができるならば、ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは作用的に連結している。ヌクレアーゼドメインはまた、ＤＮＡ結合能力を提示することができる（例えば、ＤＮＡにも結合することができるＺＦＰまたはＴＡＬＥドメインに融合したヌクレアーゼ）。同様に、ＤＮＡ結合ドメインが活性化または抑制ドメインに融合した融合ポリペプチドに関しては、融合ポリペプチドにおいて、ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／もしくはその結合部位に結合でき、一方、活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御することができるか、または抑制ドメインが遺伝子発現を下方制御することができるならば、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化または抑制ドメインは作用的に連結している。

タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能性断片」は、その配列が、完全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一ではないが、完全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一の機能を保持するタンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能性断片は、対応する天然の分子よりも多いか、少ないか、もしくは同一の数の残基を有することができ、かつ／または１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当技術分野において周知である。同様に、タンパク質の機能を決定するための方法も周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によって評価することができる。上記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または相補性（遺伝子的相補性もしくは生化学的相補性の両方）によって決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６、米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／４４３５０号を参照されたい。

「ベクター」または「構築物」は、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子導入ベクター」は、目的とする遺伝子の発現を指示することができ、かつ遺伝子配列を標的細胞に導入し得る任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニング、および発現ビヒクル、ならびに組み込みベクターを包含する。

用語「被験体」および「患者」は、互換的に使用され、ヒト患者および非ヒト霊長類、ならびにウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、および他の動物のような実験動物のような哺乳動物を指す。したがって、本明細書において使用されている用語「被験体」または「患者」は、本発明の細胞または幹細胞を投与することができる、任意の患者または被験体（例えば、哺乳動物）を意味する。

ＤＮＡ結合ドメイン
本明細書に記載されている構築物、およびこれらの構築物を含む細胞は、任意の内因性遺伝子中の標的配列に特異的に結合する１つまたは複数のＤＮＡ結合ドメインをコードする配列を含む。メガヌクレアーゼまたは単鎖ガイドＲＮＡ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）由来のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインが挙げられるがこれらに限定されない、任意のＤＮＡ結合ドメインを、本明細書に開示されている組成物および方法において使用することができる。

ある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択した標的部位に結合するよう操作される点で天然には存在しない。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に全て組み込まれるＢｅｅｒｌｉら、（２００２年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０巻：１３５〜１４１頁；Ｐａｂｏら、（２００１年）、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７０巻：３１３〜３４０頁；Ｉｓａｌａｎら、（２００１年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９巻：６５６〜６６０頁；Ｓｅｇａｌら、（２００１年）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１２巻：６３２〜６３７頁；Ｃｈｏｏら、（２０００年）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．、１０巻：４１１〜４１６頁；米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０３０，２１５号；同第６，７９４，１３６号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，０７０，９３４号；同第７，３６１，６３５号；同第７，２５３，２７３号；および米国特許公開第２００５／００６４４７４号；同第２００７／０２１８５２８号；同第２００５／０２６７０６１号を参照されたい。

操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して新規結合特異性を有することができる。操作方法には、合理的設計、および様々なタイプの選択が挙げられるがこれらに限定されない。合理的設計は、例えば、３塩基（または４塩基）ヌクレオチド配列、および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、ここで、それぞれの３塩基または４塩基ヌクレオチド配列は、特定の３塩基または４塩基配列に結合するジンクフィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列と会合する。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，４５３，２４２号、および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。

ファージディスプレイ、およびツーハイブリッド系を含む例示的な選択方法が、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号；および同第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７、およびＧＢ２，３３８，２３７において開示される。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。

加えて、これらおよび他の参考文献において開示されているジンクフィンガードメイン、および／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、例えば、５個またはそれ超のアミノ酸長のリンカーを含む、任意の適当なリンカー配列を使用して一緒に連結され得る。例示的な６個またはそれ超のアミノ酸長のリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されているタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間の適当なリンカーの任意の組合せを含んでもよい。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。

標的部位の選択、および融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）を設計および構築するための方法は、当業者に知られており、米国特許第８，５８６，５２６号、同第６，１４０，０８１号、同第５，７８９，５３８号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、国際公開第ＷＯ９５／１９４３１号、同第ＷＯ９６／０６１６６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ９８／５４３１１号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／６０９７０号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、同第ＷＯ０２／０９９０８４号、同第ＷＯ９８／５３０５８号、同第ＷＯ９８／５３０５９号、同第ＷＯ９８／５３０６０号、同第ＷＯ０２／０１６５３６号、および同第ＷＯ０３／０１６４９６号に詳細に記載されている。

加えて、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、例えば、５アミノ酸長以上のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を用いてともに連結され得る。例示の６アミノ酸長以上のリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。

ＺＦＰは、１つまたは複数の調節ドメインを含む融合タンパク質であることもでき、そのドメインは、転写活性化または抑制ドメインであることができる。一部の実施形態において、融合タンパク質は、一緒に連結された２個のＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインを含む。したがって、これらのジンクフィンガータンパク質は、８、９、１０、１１、１２個またはそれ超のフィンガーを含むことができる。一部の実施形態において、２個のＤＮＡ結合ドメインは、１個のＤＮＡ結合ドメインが、４、５、または６個のジンクフィンガーを含み、第２のＤＮＡ結合ドメインが、さらなる４、５、または５個のジンクフィンガーを含むように、拡大可能な可撓性リンカーを介して連結される。一部の実施形態において、リンカーは、フィンガーアレイが、８、９、１０、１１、もしくは１２個またはそれ超のフィンガーを含む１個のＤＮＡ結合ドメインを含むように、標準的フィンガー間リンカーである。他の実施形態において、リンカーは、可撓性リンカーのような非定型的リンカーである。ＤＮＡ結合ドメインは、少なくとも１個の調節ドメインに融合され、「ＺＦＰ−ＺＦＰ−ＴＦ」構造として考えることができる。これらの実施形態の具体例は、可撓性リンカーと連結され、ＫＯＸ抑制因子に融合された２個のＤＮＡ結合ドメインを含む「ＺＦＰ−ＺＦＰ−ＫＯＸ」、および２つのＺＦＰ−ＫＯＸ融合タンパク質がリンカーを介して一緒に融合される「ＺＦＰ−ＫＯＸ−ＺＦＰ−ＫＯＸ」と呼ばれ得る。

あるいは、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来し得る。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩのようなホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列が公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら、（１９９７年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５巻：３３７９〜３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら、（１９８９年）、Ｇｅｎｅ、８２巻：１１５〜１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら、（１９９４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２巻、１１２５〜１１２７頁；Ｊａｓｉｎ、（１９９６年）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、１２巻：２２４〜２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら、（１９９６年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６３巻：１６３〜１８０頁；Ａｒｇａｓｔら、（１９９８年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２８０巻：３４５〜３５３頁、およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓのカタログも参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性を操作して、非天然の標的部位を結合することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら、（２００２年）、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ、１０巻：８９５〜９０５頁；Ｅｐｉｎａｔら、（２００３年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３１巻：２９５２〜２９６２頁；Ａｓｈｗｏｒｔｈら、（２００６年）、Ｎａｔｕｒｅ、４４１巻：６５６〜６５９頁；Ｐａｑｕｅｓら、（２００７年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、７巻：４９〜６６頁；米国特許公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。

「２枝の（ｔｗｏ ｈａｎｄｅｄ）」ジンクフィンガータンパク質は、２個のジンクフィンガードメインが２個の不連続標的部位に結合するように、２つのクラスターのジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインがアミノ酸を介在することにより隔てられている、タンパク質である。２枝型のジンクフィンガー結合タンパク質の例は、ＳＩＰ１であり、ここで、４個のジンクフィンガーのクラスターが、タンパク質のアミノ末端に位置し、３個のフィンガーのクラスターが、カルボキシル末端に位置する（Ｒｅｍａｃｌｅら、（１９９９年）、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、１８巻（１８号）：５０７３〜５０８４頁を参照のこと）。これらのタンパク質中のジンクフィンガーの各クラスターは、固有の標的配列に結合することができ、２個の標的配列の間のスペーシングは、多くのヌクレオチドを含むことができる。２枝のＺＦＰは、例えば、一方または両方のＺＦＰに融合された機能性ドメインを含んでもよい。したがって、機能性ドメインは、ＺＦＰの一方または両方の外部に付着され得るか、あるいはＺＦＰの間に位置し得る（両方のＺＦＰに付着され得る）ことは明らかであろう。例えば、米国特許公開第２０１３０２５３９４０号を参照されたい。

ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するか、または操作された（天然には存在しない）ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８９，５２６号を参照されたい。キサントモナス属の植物病原性細菌は、重要な作物に多くの病害を引き起こすことで知られている。キサントモナスの病原性は、２５個を超える異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注入する保存ＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されるタンパク質の中には、植物の転写活性化因子を模倣し、かつ植物のトランスクリプトームを操る転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）がある（Ｋａｙら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：６４８−６５１を参照のこと）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む。最もよく特徴付けられたＴＡＬＥのうちの１つに、キサントモナス・カンペストリス病原型ベシカトリア由来のＡｖｒＢｓ３がある（Ｂｏｎａｓら（１９８９）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２１８：１２７−１３６および国際公開第ＷＯ２０１００７９４３０号を参照のこと）。ＴＡＬＥは、タンデム反復の集中ドメイン（ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ ｄｏｍａｉｎ）を含み、それぞれの反復は、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性に重要な約３４個のアミノ酸を含有する。加えて、これらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含む（概説については、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ Ｓ，ら（２００６）Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６３（３）：２５６−２７２を参照のこと）。加えて、植物病原性細菌である青枯病菌において、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と称される２つの遺伝子は、青枯病菌の次亜種１株ＧＭＩ１０００および次亜種４株ＲＳ１０００において、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが見出されている（Ｈｅｕｅｒら（２００７）Ａｐｐｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒ Ｍｉｃｒｏ ７３（１３）：４３７９−４３８４を参照のこと）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列において互いに９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおいて１，５７５ｂｐの欠失分だけ異なる。しかしながら、両方の遺伝子産物は、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。

これらのＴＡＬＥの特異性は、タンデム反復に見出される配列に左右される。反復した配列には約１０２ｂｐが含まれ、反復は典型的に互いに９１〜１００％相同である（Ｂｏｎａｓら、同書）。反復の多型は、通常１２位および１３位に位置し、１２位および１３位の高頻度可変二残基の正体と、ＴＡＬＥの標的配列において近接したヌクレオチドの正体との間に１対１対応があるものと考えられる（ＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ、（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６巻：１５０１頁およびＢｏｃｈら（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６巻：１５０９〜１５１２頁を参照のこと）。実験的に、これらのＴＡＬＥのＤＮＡ認識のためのコードは、１２位および１３位のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、ＩＧがＴに結合するように決定された。これらのＤＮＡ結合反復は新たな組み合わせおよび反復数でタンパク質に組み立てられて、新たな配列と相互作用し、植物細胞において非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化することができる人工的な転写因子を作製する（Ｂｏｃｈら、同書）。操作されたＴＡＬタンパク質は、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインに連結されて、酵母レポーターアッセイ（プラスミドベースの標的）において活性を示すＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合物（ＴＡＬＥＮ）を生じた。Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、（（２０１０年）＜Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｅｐｕｂ １０．１５３４／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１１０．１２０７１７）。加えて、Ｃおよび／またはＮ末端トランケーション（Ｃ−キャップおよび／またはＮ−キャップ配列）、ならびに非定型的反復可変二残基領域（ＲＶＤ）を有するＴＡＬＥＮも記載されている。参照によりその全体が組み込まれる米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。

ユーザーの選択である標的配列との頑強な部位特異的相互作用のためこれらのＴＡＬＥＮタンパク質を操作するための方法および組成物が公開されている（米国特許第８，５８６，５２６号を参照のこと）。一部の実施形態において、ＴＡＬＥＮは、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。他の実施形態において、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼはｍｅｇａ ＴＡＬである。これらのｍｅｇａ ＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびメガヌクレアーゼ切断ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ切断ドメインは、モノマーとして活性であり、活性のための二量体化を必要としない。（Ｂｏｉｓｓｅｌら、（２０１３年）、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ：１〜１３頁、ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１２２４を参照のこと）。加えて、ヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合機能性も示し得る。

なおさらなる実施形態において、ヌクレアーゼは、コンパクトなＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ）を含む。これらは、ＴｅｖＩヌクレアーゼドメインへＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインに連結している単鎖融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインがＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに対してどこに位置するかに応じて、ＴＡＬＥ領域によって局在させられるニッカーゼとして作用するか、または二本鎖切断を生ずることができる（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙら、（２０１３年）、Ｎａｔ Ｃｏｍｍ：１〜８頁、ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２７８２を参照のこと）。任意のＴＡＬＥＮは、さらなるＴＡＬＥＮとの組合せ（例えば、１つまたは複数のｍｅｇａ−ＴＡＬと１つまたは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮもしくはＦｏｋＩ−ＴＡＬＥＮ））で使用されてもよい。

融合分子
本明細書に記載されているＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、単鎖ガイド）、および異種の調節（機能）ドメイン（またはその機能性断片）を含む融合分子（例えば、融合タンパク質）も提供される。

共通の機能性ドメインは、例えば、転写因子ドメイン（活性化因子、抑制因子、活性化補助因子、補助抑制因子）、サイレンサー、癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバー等）；ＤＮＡ修復酵素、ならびにそれらの関連する因子および修飾因子；ＤＮＡ転位酵素（ＤＮＡ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅ）、ならびにそれらの関連する因子および修飾因子；クロマチン関連タンパク質およびそれらの修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼ、およびデアセチラーゼ）；ならびにＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）、ならびにそれらの関連する因子および修飾因子を含む。ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインの融合物に関する詳細について、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８６，５２６号；同第７，８８８，１２１号；同第８，４０９，８６１号；および同第７，９７２，８５４号。

活性化を達成するのに適当なドメインには、ＨＳＶ ＶＰ１６活性化ドメイン（例えば、Ｈａｇｍａｎｎら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７１巻、５９５２〜５９６２頁、（１９９７年）を参照のこと）；核ホルモン受容体（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、１０巻：３７３〜３８３頁、（１９９８年）を参照のこと）；核因子カッパーＢのｐ６５サブユニット（ＢｉｔｋｏおよびＢａｒｉｋ、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：５６１０〜５６１８頁、（１９９８年）、ならびにＤｏｙｌｅおよびＨｕｎｔ、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ、８巻：２９３７〜２９４２頁、（１９９７年））；Ｌｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、５巻：３〜２８頁、（１９９８年）、またはＶＰ６４のような人工キメラ機能性ドメイン（Ｂｅｅｒｌｉら、（１９９８年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９５巻：１４６２３〜３３頁）、ならびにデグロン（Ｍｏｌｉｎａｒｉら、（１９９９年）、ＥＭＢＯ Ｊ．、１８巻、６４３９〜６４４７頁）が含まれる。さらなる例示的な活性化ドメインには、Ｏｃｔ １、Ｏｃｔ−２Ａ、Ｓｐ１、ＡＰ−２、およびＣＴＦ１（Ｓｅｉｐｅｌら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１１巻、４９６１〜４９６８頁、（１９９２年））、ならびにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１ ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２Ａ、およびＥＲＦ−２が含まれる。例えば、Ｒｏｂｙｒら、（２０００年）、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１４巻：３２９〜３４７頁；Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄら、（１９９９年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、２３巻：２５５〜２７５頁；Ｌｅｏら、（２０００年）、Ｇｅｎｅ、２４５巻：１〜１１頁；Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ−Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ、（１９９９年）、Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｐｏｌ．、４６巻：７７〜８９頁；ＭｃＫｅｎｎａら、（１９９９年）、Ｊ． Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、６９巻：３〜１２頁；Ｍａｌｉｋら、（２０００年）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．、２５巻：２７７〜２８３頁；およびＬｅｍｏｎら、（１９９９年）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ．、９巻：４９９〜５０４頁を参照されたい。さらなる例示的な活性化ドメインには、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ−１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ−５、−６、−７、および−８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰ、ならびにＴＲＡＢ１ならびに修飾されたＣａｓ９トランス活性化因子タンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｏｇａｗａら、（２０００年）、Ｇｅｎｅ、２４５巻：２１〜２９頁；Ｏｋａｎａｍｉら、（１９９６年）、Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ、１巻：８７〜９９頁；Ｇｏｆｆら、（１９９１年）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、５巻：２９８〜３０９頁；Ｃｈｏら、（１９９９年）、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４０巻：４１９〜４２９頁；Ｕｌｍａｓｏｎら、（１９９９年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９６巻：５８４４〜５８４９頁；Ｓｐｒｅｎｇｅｒ−Ｈａｕｓｓｅｌｓら、（２０００年）、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、２２巻：１〜８頁；Ｇｏｎｇら、（１９９９年）、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４１巻：３３〜４４頁；Ｈｏｂｏら、（１９９９年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９６巻：１５，３４８〜１５，３５３頁；およびＰｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａら、（２０１３年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０巻：９７３〜９７６頁）を参照されたい。

本明細書に記載されているＤＮＡ結合ドメインと機能性ドメインの間での融合分子（または融合タンパク質をコードする核酸）の形成において、活性化ドメインまたは活性化ドメインと相互作用する分子のいずれかが、機能性ドメインとして適当であることは、当業者に明確であろう。本質的には、活性化複合体および／または活性化活性（例えば、ヒストンアセチル化のような）を標的遺伝子に動員する能力がある任意の分子は、融合タンパク質の活性化ドメインとして有用である。融合分子における機能性ドメインとしての使用に適当なインスレータードメイン、局在化ドメイン、ならびにＩＳＷＩ含有ドメインおよび／またはメチル結合ドメインタンパク質のようなクロマチンリモデリングタンパク質が、例えば、米国特許第６，９１９，２０４号および同第７，０５３，２６４号において記載される。

例示的な抑制ドメインには、ＫＲＡＢ Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ−ベータ−誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ−ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｂｉｒｄら、（１９９９年）、Ｃｅｌｌ、９９巻：４５１〜４５４頁；Ｔｙｌｅｒら、（１９９９年）、Ｃｅｌｌ、９９巻：４４３〜４４６頁；Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒら、（１９９９年）、Ｃｅｌｌ、９９巻：４４７〜４５０頁；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎら、（２０００年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、２５巻：３３８〜３４２頁を参照されたい。さらなる例示的な抑制ドメインには、ＲＯＭ２、およびＡｔＨＤ２Ａが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｃｈｅｍら、（１９９６年）、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、８巻：３０５〜３２１頁；およびＷｕら、（２０００年）、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、２２巻：１９〜２７頁を参照されたい。

融合分子は、当業者に周知であるクローニングおよび生化学的コンジュゲーションの方法により構築される。融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインおよび機能性ドメイン（例えば、転写活性化または抑制ドメイン）を含む。融合分子は、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０ミディアムＴ抗原由来のもの等）、およびエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧおよび赤血球凝集素等）も任意選択で含む。融合タンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、翻訳リーディングフレームが融合物の成分の間で保存されるように、設計される。

一方の側（ｈａｎｄ）上の機能性ドメイン（またはその機能性断片）のポリペプチド成分と、他方上の非タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、単鎖ガイドＲＮＡ、抗生物質、介入物、副溝結合剤、核酸）の間の融合物には、生化学的コンジュゲーション、細胞における共発現等が挙げられるがこれらに限定されない、当業者に公知の方法により構築される。

ある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインにより結合される標的部位（例えば、目的とする標的部位、および／または低親和性部位）は、制御エレメントに存在するか、および／またはその近くにあり、例えば、内因性制御エレメントまたは宿主細胞において外因性遺伝子モジュレーターの発現を引き起こす制御エレメント（例えば、プロモーター）内、それに隣接、もしくはその近くにある。ある特定の実施形態において、標的部位は、細胞クロマチンのアクセス可能な領域である。アクセス可能な領域は、例えば、米国特許第６，５１１，８０８号に記載される通り決定することができる。標的部位が、細胞クロマチンのアクセス可能な領域に存在しないなら、１つまたは複数のアクセス可能な領域が、米国特許第７，００１，７６８号に記載される通り生み出すことができる。

本明細書に記載されている融合分子は、当業者に公知である、薬学的に許容される担体と共に製剤化されてもよい。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８５年；および共同出願されたＷＯ００／４２２１９を参照されたい。

融合分子が、標的配列にそのＤＮＡ結合ドメインを介して結合したなら、融合分子の機能性成分／ドメインは、遺伝子の転写に影響する能力がある種々の異なる成分のいずれかから選択することができる。ゆえに、機能性成分には、活性化因子、抑制因子、活性化補助因子、補助抑制因子、およびサイレンサーのような種々の転写因子ドメインが挙げられ得るがこれらに限定されない。

外因性小分子またはリガンドにより調節される機能性ドメインも選択されてもよい。例えば、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）テクノロジーが利用されてもよく、ここで、機能性ドメインのみが、外部ＲｈｅｏＣｈｅｍ（商標）リガンドの存在下でその活性コンフォメーションをとる（例えば、ＵＳ２００９０１３６４６５を参照のこと）。したがって、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、またはＴＡＬＥ、または単鎖ガイド）は、調節可能な機能性ドメインに作動可能に連結されてもよく、ここで、遺伝子モジュレーター（例えば、ＺＦＰ−ＴＦ、またはＴＡＬＥ−ＴＦ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＴＦ）の結果として得られた活性は、外部リガンドにより制御される。

ヌクレアーゼ
ある特定の実施形態において、融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインおよび切断（ヌクレアーゼ）ドメインを含む。かくして、遺伝子修飾は、ヌクレアーゼ、例えば、操作されたヌクレアーゼを使用して達成することができる。操作されたヌクレアーゼテクノロジーは、天然に存在するＤＮＡ結合タンパク質の操作に基づく。例えば、目的に合わせて調整されたＤＮＡ結合特異性を有するホーミングエンドヌクレアーゼの操作が記載されている。（Ｃｈａｍｅｓら、（２００５年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、３３巻（２０号）：ｅ１７８頁；Ａｒｎｏｕｌｄら、（２００６年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３５５巻：４４３〜４５８頁を参照のこと。）加えて、ＺＦＰおよびＴＡＬＥの操作も記載されている。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；同第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９７９，５３９号；同第６，９３３，１１３号；同第７，１６３，８２４号；および同第７，０１３，２１９号を参照されたい。

加えて、ＺＦＰおよびＴＡＬＥをヌクレアーゼドメインに融合させて、それらの目的とする核酸標的をそれらの操作された（ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを介して認識し、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合部位の近くでヌクレアーゼ活性を介してＤＮＡを切断させることができる、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ機能性実体が作製された。例えば、Ｋｉｍら、（１９９６年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、ＵＳＡ、９３巻（３号）：１１５６〜１１６０頁を参照されたい。さらに最近、ＺＦＮは、種々の生物においてゲノム修飾のため使用されている。例えば、米国特許第８，６２３，６１８号；同第８，０３４，５９８号；同第８，５８６，５２６号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；米国特許公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号、および同第２０１３０１７７９６０号を参照されたい。

したがって、本明細書に記載されている方法および組成物は、広く適用可能であり、目的の任意のヌクレアーゼを含んでもよい。ヌクレアーゼの非限定的な例には、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、Ｔｔａｇｏヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系、およびジンクフィンガーヌクレアーゼが挙げられる。ヌクレアーゼは、異種のＤＮＡ結合および切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬＥＮ；異種の切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含むか、あるいは、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位に結合するよう変更されてもよい（例えば、同族の結合部位と異なる部位に結合するよう操作されたメガヌクレアーゼ）。

ある特定の実施形態において、組成物は、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）由来のＤＮＡ結合ドメインおよび／またはヌクレアーゼ（切断）ドメインを含む。天然に存在するメガヌクレアーゼは、１５〜４０個の塩基対切断部位を認識し、４種のファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓｔボックスファミリー、およびＨＮＨファミリーに通常グループ化される。ある特定の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）は、操作される（天然に存在しない）。Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩのようなホーミングエンドヌクレアーゼならびにメガヌクレアーゼの認識配列が、公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら、（１９９７年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５巻：３３７９〜３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら、（１９８９年）、Ｇｅｎｅ、８２巻：１１５〜１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら、（１９９４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２巻、１１２５〜１１２７頁；Ｊａｓｉｎ、（１９９６年）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、１２巻：２２４〜２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら、（１９９６年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２６３巻：１６３〜１８０頁；Ａｒｇａｓｔら、（１９９８年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２８０巻：３４５〜３５３頁、およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓのカタログも参照されたい。

主にＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー由来の天然に存在するメガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインを使用して、植物、酵母、ショウジョウバエ、哺乳動物細胞、およびマウスにおいて部位特異的ゲノム修飾が促進されているが、このアプローチは、メガヌクレアーゼ認識配列を保存する相同な遺伝子（Ｍｏｎｅｔら、（１９９９年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｏｎ．、２５５巻：８８〜９３頁）、または認識配列が導入された予め操作されたゲノム（Ｒｏｕｔｅら、（１９９４年）、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、１４巻：８０９６〜１０６頁；Ｃｈｉｌｔｏｎら、（２００３年）、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１３３巻：９５６〜６５頁；Ｐｕｃｈｔａら、（１９９６年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９３巻：５０５５〜６０頁；Ｒｏｎｇら、（２００２年）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１６巻：１５６８〜８１頁；Ｇｏｕｂｌｅら、（２００６年）、Ｊ． Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．、８巻（５号）：６１６〜６２２頁）のいずれかの修飾に制限されている。したがって、医療上または生物工学的に関連した部位において新規結合特異性を示すようにメガヌクレアーゼを操作するための試みが成された（Ｐｏｒｔｅｕｓら、（２００５年）、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３巻：９６７〜７３頁；Ｓｕｓｓｍａｎら、（２００４年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３４２巻：３１〜４１頁；Ｅｐｉｎａｔら、（２００３年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３１巻：２９５２〜６２頁；Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら、（２００２年）、Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ、１０巻：８９５〜９０５頁；Ｅｐｉｎａｔら、（２００３年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３１巻：２９５２〜２９６２頁；Ａｓｈｗｏｒｔｈら、（２００６年）、Ｎａｔｕｒｅ、４４１巻：６５６〜６５９頁；Ｐａｑｕｅｓら、（２００７年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、７巻：４９〜６６頁；米国特許公開第２００７０１１７１２８号；同第２００６０２０６９４９号；同第２００６０１５３８２６号；同第２００６００７８５５２号；および同第２００４０００２０９２号）。加えて、メガヌクレアーゼ由来の天然に存在するまたは操作されたＤＮＡ結合ドメインはまた、異種のヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）由来の切断ドメインと作動可能に連結されている。

他の実施形態において、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。ＺＦＮは、最適な遺伝子中の標的部位、および切断ドメインまたは切断ハーフドメインに結合するよう操作されているジンクフィンガータンパク質を含む。

上で詳細に記載した通り、ジンクフィンガー結合ドメインは、選択した配列に結合するように操作され得る。例えば、Ｂｅｅｒｌｉら、（２００２年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０巻：１３５〜１４１頁；Ｐａｂｏら、（２００１年）、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７０巻：３１３〜３４０頁；Ｉｓａｌａｎら、（２００１年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９巻：６５６〜６６０頁；Ｓｅｇａｌら、（２００１年）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１２巻：６３２〜６３７頁；Ｃｈｏｏら、（２０００年）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．、１０巻：４１１〜４１６頁を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して新規の結合特異性を有し得る。操作方法には、合理的設計および種々の種類の選択が含まれるが、これらに限定されない。合理的設計には、例えば、三重鎖（ｔｒｉｐｌｅｔ）（または四重鎖（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ））ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用が含まれ、各三重鎖または四重鎖ヌクレオチド配列は、特定の三重鎖または四重鎖配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と会合している。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、共有の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。

ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号；および同第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７において開示される。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強が、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。

加えて、これらおよび他の参考文献において開示されているＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥタンパク質等）は、一緒に、または任意の適当なリンカー配列を使用して機能性ドメインに連結され得る。例えば、米国特許第８，７７２，４５３号；同第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号；米国特許公開第２００９０３０５４１９号；ならびに米国特許出願第１４／４７１，７８２号を参照されたい。

ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ヌクレアーゼ系は、ゲノム操作のため使用することができる細菌系に基づく最近操作されたヌクレアーゼ系である。それは、多くの細菌および古細菌の適応免疫応答の一部に基づく。ウイルスまたはプラスミドが細菌に侵入すると、侵入者のＤＮＡのセグメントが、「免疫」応答によりＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に変換される。次に、このｃｒＲＮＡは、「プロトスペーサー」と呼ばれる標的ＤＮＡ中のｃｒＲＮＡに相同な領域にＣａｓ９ヌクレアーゼをガイドするためのｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる別のタイプのＲＮＡと、部分的な相補性の領域を介して会合する。Ｃａｓ９は、ＤＮＡを切断して、ｃｒＲＮＡ転写物内に含有される２０ヌクレオチドガイド配列により特定される部位におけるＤＳＢにおいて平滑末端を生成する。Ｃａｓ９は、部位特異的ＤＮＡ認識および切断のためｃｒＲＮＡならびにｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とする。この系は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、１個の分子（「単鎖ガイドＲＮＡ」）組み合わされ得、単鎖ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ等価部分を操作して、任意の所望の配列を標的化するためのＣａｓ９ヌクレアーゼをガイドし得るように、現在操作されている（Ｊｉｎｅｋら、（２０１２年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７巻、８１６〜８２１頁、Ｊｉｎｅｋら、（２０１３年）、ｅＬｉｆｅ、２巻：ｅ００４７１頁、およびＤａｖｉｄ Ｓｅｇａｌ、（２０１３年）、ｅＬｉｆｅ、２巻：ｅ００５６３頁を参照のこと）。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を操作して、ゲノム中の所望の標的においてＤＳＢを作製することができ、ＤＳＢの修復は、誤りがちな修復の増大を生じる修復阻害剤の使用により影響され得る。

本明細書に記載されているヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ（切断ドメイン、切断ハーフドメイン）も含む。上に記す通り、切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼ由来の切断ドメイン）は、ＤＮＡ結合ドメインに対し異種であり得る。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼとして、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、２００２〜２００３年カタログ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ；およびＢｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５巻：３３７９〜３３８８頁を参照されたい。ＤＮＡを切断する追加的な酵素は、公知のものである（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅ Ｉ；ミクロコッカスヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ； Ｌｉｎｎら（編）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９３年も参照のこと）。これらの酵素（またはその機能断片）のうち１つまたは複数は、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの源として使用することができる。

同様に、上記のように、切断活性のために二量体化を必要とする切断ハーフドメインは、任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。概して、融合分子が切断ハーフドメインを含む場合、２つの融合分子が切断に必要とされる。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質が用いられ得る。２つの切断ハーフドメインは同一のエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能性断片）に由来し得るか、または各切断ハーフドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能性断片）に由来し得る。加えて、２つの融合タンパク質のそれらの各標的部位への結合が、互いに空間的配向でこれらの切断ハーフドメインを配置して、例えば二量体化によって切断ハーフドメインが機能性切断ドメインを形成することを可能にするように、２つの融合タンパク質の標的部位は、好ましくは、互いに対して配置される。したがって、ある実施形態において、標的部位の近端は、５〜８個のヌクレオチドまたは１５〜１８個のヌクレオチド分だけ離れている。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対は、２つの標的部位の間に介在してもよい（例えば、２〜５０個以上のヌクレオチド対）。概して、切断部位は、標的部位の間に存在する。

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに配列特異的に結合し（認識部位で）、かつ結合部位でまたはその付近でＤＮＡを切断することができる。ある制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素Ｆｏｋ Ｉは、一方の鎖上でその認識部位から９ヌクレオチド離れた位置で、他方の鎖上でその認識部位から１３ヌクレオチド離れた位置でＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、および同第５，４８７，９９４、ならびにＬｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２７５−４２７９、Ｌｉら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２７６４−２７６８、Ｋｉｍら（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８３−８８７、Ｋｉｍら（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照されたい。したがって、一実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）および１つ以上のジンクフィンガー結合ドメイン（操作され得るか否かに関わらず）を含む。

その切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示のＩＩＳ型制限酵素は、Ｆｏｋ Ｉである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１０，５７０−１０，５７５。したがって、本開示の目的のために、開示される融合タンパク質において使用されるＦｏｋ Ｉ酵素の一部は、切断ハーフドメインと見なされる。したがって、ジンクフィンガー−Ｆｏｋ ＩまたはＴＡＬＥ−Ｆｏｋ Ｉ融合物を用いた細胞配列の標的化二本鎖切断および／または標的化置き換えのために、それぞれＦｏｋ Ｉ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を用いて、触媒的に活性な切断ドメインを再構築することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋ Ｉ切断ハーフドメインを含む単一のポリペプチド分子を用いることもできる。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩまたはＴＡＬＥ−Ｆｏｋ Ｉ融合物を使用した標的化切断および標的化配列改変のためのパラメータは、本開示の他のところで提供されている。

切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持するか、または多量体化（例えば、二量体化）して機能性切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であり得る。

例示のＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００７０１３４７９６号に記載されている。さらなる制限酵素も分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを含み、これらは、本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照されたい。

ある実施形態において、切断ドメインは、例えば、すべての開示が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号、同第８，４０９，８６１号、同第７，９１４，７９６号、および同第８，０３４，５９８号に記載されるように、ホモ二量体化を最小限に抑えるか、または阻止する１つ以上の操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン変異体とも称される）を含む。Ｆｏｋ Ｉの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８位のアミノ酸残基は、すべてＦｏｋ Ｉ切断ハーフドメインの二量体化に影響を与える標的である。偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋ Ｉの例示の操作された切断ハーフドメインには、第１の切断ハーフドメインがＦｏｋ Ｉの４９０位および５３８位のアミノ酸残基に変異を含み、かつ第２の切断ハーフドメインが４８６位および４９９位のアミノ酸残基に変異を含む対が含まれる。

したがって、一実施形態において、４９０位における変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え、５３８位における変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え、４８６位における変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置き換え、４９９位における変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換える。具体的には、本明細書に記載の操作された切断ハーフドメインを１つの切断ハーフドメインにおいて４９０位での変異（Ｅ→Ｋ）および５３８位での変異（Ｉ→Ｋ）によって調製して「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と称される操作された切断ハーフドメインを生成し、別の切断ハーフドメインにおいて４８６位での変異（Ｑ→Ｅ）および４９９での変異（Ｉ→Ｌ）によって調製して「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と称される操作された切断ハーフドメインを生成した。本明細書に記載の操作された切断ハーフドメインは、異常な切断が最小限に抑えられるか、または無効にされる偏性ヘテロ二量体変異体である。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号、同第８，４０９，８６１号、同第７，９１４，７９６号および同第８，０３４，５９８号ならびに米国特許公開第２０１２００４０３９８号を参照されたく、これらの開示は、参照によりその全体がすべての目的のために組み込まれる。

ある実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、４８６、４９９、および４９６位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付けられた）での変異、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で、かつ４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える（それぞれ、「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも称される）変異を含む。他の実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、４９０、５３８、および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付けられた）での変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、かつ５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える（それぞれ、「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも称される）変異を含む。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、４９０および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対する番号付け）での変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、かつ５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える（それぞれ、「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも称される）変異を含む。（米国特許第８，６２３，６１８号を参照されたい））。

本明細書に記載の操作された切断ハーフドメインは任意の好適な方法を用いて、例えば、米国特許公開第７，８８８，１２１号および同第７，９１４，７９６号に記載の野生型切断ハーフドメイン（Ｆｏｋ Ｉ）の部位特異的変異誘発によって調製され得る。

あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素」技術を用いて、核酸標的部位においてインビボで組み立てられ得る（例えば、米国特許公開２００９００６８１６４号を参照のこと）。そのようなスプリット酵素の構成要素は、別個の発現構築物のいずれかで発現され得るか、または個々の構成要素が例えば自己切断２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって分離される１つのオープンリーディングフレームにおいて連結され得る。構成要素は、個々のジンクフィンガー結合ドメインであり得るか、またはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。

一部の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、植物病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ（Ｂｏｃｈら、（２００９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２６巻：１５０９〜１５１２頁、ならびにＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ、（２００９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２６巻：１５０１頁を参照のこと）、ならびにＲａｌｓｔｏｎｉａ（Ｈｅｕｅｒら、（２００７年）Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、７３巻（１３号）：４３７９〜４３８４頁を参照のこと）に由来するものと類似するＴＡＬエフェクター由来の操作されたドメインである。また、米国特許第８，５８６，５２６号。

ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）は、例えば、米国特許第８，５６３，３１４号に記載されている酵母ベースの染色体系における使用に先立ち、活性についてスクリーニングすることができる。ヌクレアーゼ発現構築物は、当該技術分野において公知の方法を使用して、容易に設計することができる。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号、および同第８，４０９，８６１号、ならびに米国特許公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００６００６３２３１号；および同第２００７０１３４７９６号を参照されたい。ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化され（脱抑制され）、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にあってもよい。

ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは天然に存在する。他の実施形態において、ヌクレアーゼは、天然に存在しない、すなわち、ＤＮＡ結合ドメインおよび／または切断ドメインにおいて操作される。例えば、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位に結合するよう変更されてもよい（例えば、同族の結合部位と異なる部位に結合するよう操作されたメガヌクレアーゼ）。他の実施形態において、ヌクレアーゼは、異種のＤＮＡ結合および切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼ；異種の切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）、または特異的ガイドＲＮＡによりガイドされる一般的なヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＰＩＳＲ／Ｃａｓ）を含む。

標的部位
本明細書に記載されている構築物は、ＤＮＡ結合ドメインに対する１つまたは複数の低親和性標的部位も含む。上で言及した通り、存在する遺伝子モジュレーターが過剰であるとき、および／またはＤＮＡ結合ドメインが、目的とする標的部位（それに対して、ＤＮＡ結合ドメインが設計され、試験される）より低い親和性で結合するとき、低親和性標的部位は、遺伝子モジュレーターのＤＮＡ結合ドメインにより典型的に結合されるものである。結合親和性は、レポーターもしくは内因性遺伝子でのＫｄ分析または機能分析（例えば、遺伝子発現または切断のレベルを測定すること）が挙げられるがこれらに限定されない任意の適当な手段により決定することができる。結合親和性は、定量的に（例えば、Ｋｄ、遺伝子発現、または切断レベル）、または定性的に（例えば、同一遺伝子内の同一または異なる標的配列に結合するものを含む、他の結合ドメインに関連して）発現させることができる。

上で言及した通り、本明細書において開示されている構築物の転写因子および／またはヌクレアーゼについての標的部位は、複数の結合部位（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７個もしくはそれ超）を典型的に含む。例えば、３個のフィンガーを含むＺＦＰは、９または１０個のヌクレオチドを含む標的部位を典型的に認識し、４個のフィンガーを含むＺＦＰは、１２〜１４個のヌクレオチドを含む標的部位を典型的に認識し、一方、６個のフィンガーを有するＺＦＰは、マルチフィンガータンパク質の各ジンクフィンガーが、標的部位全体内の任意選択の未結合のヌクレオチドを含む３塩基対標的サブサイトに結合する、１８〜２１個のヌクレオチドを含む標的部位を認識することができる。同様に、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合タンパク質により結合される標的部位は、任意の数のヌクレオチドを含み、ここで、１〜２個のヌクレオチドが、単鎖ＴＡＬＥ反復（またはハーフ反復）の反復可変二残基（ＲＶＤ）により結合される。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。

ＤＮＡ結合分子は、目的とする標的部位に結合するよう設計され、および／または選択される。例えば、表２を参照されたい。それにもかかわらず、十分高いレベルで発現されるとき、これらのＤＮＡ結合分子は、あまり好ましくない低親和性標的部位に結合し得る。本明細書に記載されている自己調節性構築物は、十分高いレベルで発現されるとき、遺伝子モジュレーターが、プロモーターに存在する低親和性部位に結合するように、遺伝子モジュレーター（抑制因子またはヌクレアーゼ）の発現を引き起こす低親和性標的部位をもたらすことにより、この現象を使用する。遺伝子モジュレーター（抑制因子またはヌクレアーゼ）の低親和性標的部位への結合は、遺伝子モジュレーターの発現を順に抑制し、これにより、自己調節性構築物がもたらされる。

低親和性標的部位の配列は、目的とする標的部位の配列と典型的には同一ではない。全てのヌクレオチドを含む１つまたは複数のヌクレオチドは変更することができる。ある特定の実施形態において、低親和性標的部位は、目的とする標的部位と同一の塩基対（近接したまたは近接していない）の少なくとも半分を含む。他の実施形態において、低親和性標的部位は、目的とする標的部位と同一の塩基対の少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を含む。例えば、１８個の塩基対である標的部位において、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７個の塩基対は、低親和性標的部位と目的とする標的部位の間で異なってもよい。同様に、２１個の塩基対の目的とする標的部位について、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の塩基対は、低親和性標的部位において異なっていてもよく、目的とする標的部位と異なっていてもよい。ある特定の実施形態において、低親和性標的部位は、目的とする標的部位において見られる標的サブサイトの近接した配列（例えば、部分）（反復されるか、またはされない）、例えば、トリヌクレオチド反復障害において関与する遺伝子のモジュレーターにおいて見られるＣＡＧまたはＣＣＧ反復を含んでもよい。ある特定の実施形態において、低親和性標的部位および目的とする標的部位は同一であるが、ＤＮＡ結合ドメインにより結合される標的サブサイトは近接しない。

任意の数の低親和性標的部位（またはその部分）が、構築物に含まれ得る。ある特定の実施形態において、低親和性標的部位は、目的とする標的配列において見られるモチーフの１つまたは複数の反復、例えば、トリヌクレオチド反復障害を有する被験体において見られる変異体および／もしくは野生型対立遺伝子に結合するモジュレーターにおいて見られるＣＡＧまたはＣＣＧ反復を含む。したがって、構築物に含まれる低親和性標的部位の数は、所望の自己調節の量または程度に応じて、当業者により容易に決定することができる。例えば、目的とする標的部位に対して強い結合親和性を有するモジュレーターの調節のため、それらの目的とする標的部位に対するより低い結合親和性を有するモジュレーターに対するよりも少ない低親和性標的部位が含まれ得る。以下の実施例を参照されたい。

ドナー
上で言及した通り、外因性配列（「ドナー配列」、または「ドナー」、または「導入遺伝子」とも呼ばれる）の挿入は、例えば、変異体遺伝子の修正のため、または野生型遺伝子の発現の増大のため、本明細書に記載されている遺伝子モジュレーター（例えば、ヌクレアーゼ）を使用して行われ得る。ドナー配列は、それが置かれるゲノム配列に同一である必要はないことは容易に明らかであろう。ドナー配列は、目的の位置において効率的なＨＤＲを可能にする相同な２つの領域により隣接される非相同な配列を含有することができる。加えて、ドナー配列は、細胞クロマチンにおいて目的の領域に相同でない配列を含有するベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、いくつかの、細胞クロマチンに相同な不連続領域を含有することができる。例えば、目的の領域に通常存在しない配列の標的化挿入のため、前記配列は、ドナー核酸分子に存在することができ、目的の領域中の配列に相同な領域により隣接され得るか、あるいは、ドナー分子は、切断された標的遺伝子座に非相同末端連結（ＮＨＥＪ）機序を介して組み込まれ得る。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号、および同第７，９７２，８４３号、および米国特許第８，７０３，４８９号、ならびに米国公開第２０１１０２８１３６１号および同第２０１１０２０７２２１号を参照されたい。

選択した位置への挿入のための任意のポリヌクレオチドの標的化挿入の方法が、本明細書に記載される。挿入のためのポリヌクレオチドは、「外因性」ポリヌクレオチド、「ドナー」ポリヌクレオチドまたは分子あるいは「導入遺伝子」とも呼ばれ得る。ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、一本鎖および／または二本鎖であってもよく、線状または環状（例えば、ミニサークル）形態で細胞に導入され得る。例えば、米国特許第８，７０３，４８９号ならびに米国特許出願公開第２０１１０２８１３６１号および同第２０１１０２０７２２１号を参照されたい。線状形態で導入される場合、当業者に公知の方法により、ドナー配列の末端を保護することができる（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）。例えば、１つまたは複数のジデオキシヌクレオチド残基が、線状分子の３’末端に付加される、および／または自己相補的オリゴヌクレオチドが、一方または両方の末端に連結される。例えば、Ｃｈａｎｇら（１９８７年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４巻：４９５９〜４９６３頁；Ｎｅｈｌｓら（１９９６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２巻：８８６〜８８９頁を参照されたい。分解から外因性ポリヌクレオチドを保護するための追加的な方法として、末端アミノ基（複数可）の付加、ならびに例えばホスホロチオエート、ホスホルアミデートおよびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基等の修飾ヌクレオチド間結合の使用が挙げられるがこれらに限定されない。

ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーターおよび抗生物質耐性をコードする遺伝子等、追加的な配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入することができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として、リポソームまたはポロキサマー等の作用物質と複合体形成した核酸として導入することができる、あるいはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））により送達することができる。

ある特定の実施形態において、二本鎖ドナーは、１ｋｂより長い、例えば、２〜２００ｋｂの間、２〜１０ｋｂの間（または間にある任意の値）の長さの配列（例えば、コード配列、導入遺伝子とも呼ばれる）を含む。二本鎖ドナーは、例えば、少なくとも１つのヌクレアーゼ標的部位も含む。ある特定の実施形態において、ドナーは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓでの使用のため、少なくとも１つの標的部位、または例えば、ＺＦＮおよび／もしくはＴＡＬＥＮの対に対する２つの標的部位を含む。典型的には、ヌクレアーゼ標的部位は、導入遺伝子の切断のため、導入遺伝子配列の外側、例えば、導入遺伝子配列の５’および／または３’にある。ヌクレアーゼ切断部位（複数可）は、任意のヌクレアーゼ（複数可）についてであり得る。ある特定の実施形態において、二本鎖ドナーに含有されるヌクレアーゼ標的部位（複数可）は、切断されたドナーが相同性非依存性方法を介して組み込まれる内因性標的を切断するために使用される同一のヌクレアーゼ（複数可）についてである。

ドナーは、通常、その発現が、組み込み部位における内因性プロモーター、すなわち、ドナーが挿入される内因性遺伝子の発現を引き起こすプロモーターにより引き起こされるように、挿入される。しかしながら、ドナーが、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成的プロモーター、または誘導性もしくは組織特異的プロモーターを含んでもよいことは明らかであろう。

ドナー分子は、内因性遺伝子の全部、一部が発現するか、または全く発現しないように、内因性遺伝子に挿入されてもよい。例えば、本明細書に記載されている導入遺伝子は、例えば、導入遺伝子との融合物として、内因性配列の一部が発現するか、または全く発現しないように、選択された遺伝子座に挿入されてもよい。他の実施形態において、導入遺伝子は、任意の内因性遺伝子座、例えば、セーフハーバー遺伝子座に組み込まれる。さらに、発現のため必要とされないが、外因性配列はまた、転写または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列、および／またはポリアデニル化シグナルを含んでもよい。

本明細書に記載されているドナー配列上に保有される導入遺伝子は、ＰＣＲのような当該技術分野において公知の標準的技法を使用して、プラスミド、細胞、または他の供給源から単離され得る。使用のためのドナーは、スーパーコイルの環状、弛緩した環状、直線状等を含む様々なタイプの形態を含むことができる。あるいは、それらは、標準的オリゴヌクレオチド合成技法を使用して、化学的に合成されてもよい。加えて、ドナーは、メチル化されるか、またはメチル化を欠いてもよい。ドナーは、細菌または酵母人工染色体（ＢＡＣまたはＹＡＣ）の形態であってもよい。

本明細書に記載されている二本鎖ドナーポリヌクレオチドは、１つもしくは複数の非天然の塩基、および／または骨格を含み得る。特に、メチル化シトシンを有するドナー分子の挿入を、本明細書に記載されている方法を使用して行い、目的の領域において転写静止状態が達成され得る。

外因性（ドナー）ポリヌクレオチドは、目的の任意の配列（外因性配列）を含んでもよい。例示的な外因性配列には、任意のポリペプチドコード配列（例えば、ｃＤＮＡ）、プロモーター配列、エンハンサー配列、エピトープタグ、マーカー遺伝子、切断酵素認識部位、および様々なタイプの発現構築物が挙げられるがこれらに限定されない。マーカー遺伝子には、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、着色された、または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、増強型緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、ならびに増強された細胞成長および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素）が挙げられるがこれらに限定されない。エピトープタグは、例えば、１つまたは複数のコピーのＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡ、もしくは任意の検出可能なアミノ酸配列を含む。

好ましい実施形態において、外因性配列（導入遺伝子）は、細胞における発現が所望される任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、それには、抗体、抗原、酵素、受容体（細胞表面、または核）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーターポリペプチド、増殖因子、および上記のいずれかの機能性断片が挙げられるがこれらに限定されない。コード配列は、例えば、ｃＤＮＡであってもよい。

ある特定の実施形態において、外因性配列は、標的化組み込みを経験した細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子（上記）、およびさらなる機能性をコードする連結された配列を含むことができる。マーカー遺伝子の非限定的な例には、ＧＦＰ、薬物選択マーカー（複数可）等が挙げられる。

挿入され得るさらなる遺伝子配列は、例えば、変異した配列を置き換えるための野生型遺伝子も含んでもよい。例えば、野生型ベータグロビン遺伝子配列は、遺伝子の内因性コピーが変異されている幹細胞のゲノムに挿入されてもよい。野生型コピーは、内因性遺伝子座において挿入されてもよいか、または、セーフハーバー遺伝子座に対して代替的に標的化されてもよい。

このような発現カセットの構築は、本明細書の教示に従い、分子生物学の分野において周知の方法論を利用する（例えば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＭａｎｉａｔｉｓを参照のこと）。トランスジェニック動物を生み出すための発現カセットの使用の前に、選択された制御エレメントと関連するストレスインデューサーに対する発現カセットの応答性を、発現カセットを適当な細胞系（例えば、初代細胞、形質転換された細胞、または不死化細胞系）に導入することにより試験することができる。

さらに、発現のため必要とされないが、外因性配列はまた、転写または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列、および／またはポリアデニル化シグナルを含んでもよい。さらに、目的の遺伝子の制御エレメントをレポーター遺伝子に作動可能に連結させて、キメラ遺伝子（例えば、レポーター発現カセット）を作製することができる。

非コード核酸配列の標的化挿入も達成され得る。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする配列をまた、標的化挿入のため使用してもよい。さらなる実施形態において、ドナー核酸は、さらなるヌクレアーゼ設計のための特異的標的部位である非コード配列を含み得る。続いて、さらなるヌクレアーゼは、オリジナルのドナー分子が切断され、目的の別のドナー分子の挿入により修飾されるように、細胞において発現され得る。このようにして、ドナー分子の反復組み込みが生成され得、これにより、目的の特定の遺伝子座における、またはセーフハーバー遺伝子座における形質スタッキング（ｔｒａｉｔ ｓｔａｃｋｉｎｇ）が可能になる。

送達
タンパク質（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）、それをコードするポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載されているタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、例えば、ＺＦＰ−ＴＦ、ＴＡＬＥ−ＴＦタンパク質の注射による、またはＺＦＮもしくはＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡの使用による、またはポリヌクレオチド（例えば、単鎖ガイドＲＮＡ）と関連する機能性ドメイン（例えば、活性化、抑制、ヌクレアーゼ等）の共導入を含む任意の適当な手段により、標的細胞に送達され得る。

適当な細胞には、真核細胞または原核細胞ならびに／または細胞系が挙げられるがこれらに限定されない。このような細胞、またはこのような細胞から生成された細胞系の非限定的な例には、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）のような昆虫細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのような真菌細胞を挙げられる。ある特定の実施形態において、細胞系は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＭＤＣＫ、またはＨＥＫ２９３細胞系である。適当な細胞には、例として、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、および間葉系幹細胞のような幹細胞も挙げられる。

本明細書に記載のジンクフィンガータンパク質を含むタンパク質を送達する方法は、例えば、米国特許第８，５８６，５２６号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号に記載されており、これらのすべての開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物も、本明細書に記載の組成物のうちの１つ以上をコードする配列を含むベクターを用いて送達され得る。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター等を含むが、これらに限定されない任意のベクター系を用いてもよい。米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号も参照されたく、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。さらに、これらのベクターのいずれも１つ以上のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質をコードする配列を含み得ることは明らかである。したがって、１つもしくは複数のＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質が、細胞に導入されるとき、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする配列は、同一のベクター上または異なるベクター上に保有されてもよい。複数のベクターが使用されるとき、各ベクターは、１つもしくは複数のＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする配列を含み得る。

従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入方法を使用して、細胞（例えば、哺乳動物細胞）ならびに標的組織において操作されたＺＦＰ、ＴＡＬＥ、Ｔｔａｇｏ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸を導入することができる。このような方法を使用して、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、Ｔｔａｇｏ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸も細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで投与することができる。ある特定の実施形態において、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、Ｔｔａｇｏ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸が、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療使用のため投与される。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソームまたはポロクサマーのような送達ビヒクルと複合体化された核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含み、それは、細胞への送達後、エピソームまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有する。遺伝子治療手順の概説について、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：８０８〜８１３頁、（１９９２年）；ＮａｂｅｌおよびＦｅｌｇｎｅｒ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：２１１〜２１７頁、（１９９３年）；ＭｉｔａｎｉおよびＣａｓｋｅｙ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：１６２〜１６６頁、（１９９３年）；Ｄｉｌｌｏｎ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：１６７〜１７５頁、（１９９３年）；Ｍｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３５７巻：４５５〜４６０頁、（１９９２年）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻（１０号）：１１４９〜１１５４頁、（１９８８年）；Ｖｉｇｎｅ、Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、８巻：３５〜３６頁、（１９９５年）；ＫｒｅｍｅｒおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、５１巻（１号）：３１〜４４頁、（１９９５年）；Ｈａｄｄａｄａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＢｏｅｈｍ（編）、（１９９５年）；ならびにＹｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１巻：１３〜２６頁、（１９９４年）を参照されたい。

核酸の非ウイルス送達の方法は、電気穿孔、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、人工ビリオン、および作用物質によって強化されたＤＮＡの取り込みを含む。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を用いたソノポレーションも、核酸の送達のために使用され得る。好ましい実施形態において、１つまたは複数の核酸は、ｍＲＮＡとして送達される。翻訳効率および／またはｍＲＮＡ安定性を増大させるためのキャップされたｍＲＮＡの使用も好ましい。ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップ類似体）キャップまたはそのバリアントが特に好ましい。本明細書において参照により組み込まれる米国特許ＵＳ７０７４５９６およびＵＳ８１５３７７３を参照されたい。

さらなる例示の核酸送達系は、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃによって提供されるものを含む（例えば、米国特許第６００８３３６号を参照のこと）。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性脂質および中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第ＷＯ９１／１７４２４号、同第ＷＯ９１／１６０２４号に記載のものを含む。送達は、細胞に対するもの（エクスビボ投与）または標的組織に対するもの（インビボ投与）であり得る。

免疫脂質複合体等の標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅら，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）、Ｇａｏ ｅｔら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号を参照のこと）。

さらなる送達方法は、送達される核酸のＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）へのパッケージングの使用を含む。これらのＥＤＶは、二重特異性抗体を用いて標的組織に特異的に送達され、この抗体の一方のアームは、標的組織に対する特異性を有し、他方のアームは、ＥＤＶに対する特異性を有する。この抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面に運び、その後、ＥＤＶは、エンドサイトーシスによって細胞内に運び込まれる。一旦細胞内に運び込まれると、その内容物は放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄら（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（７）：６４３を参照のこと）。

操作されたＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸を送達するためのＲＮＡウイルスベースのまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し、ウイルス負荷量を核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与され得るか（インビボ）、またはインビトロで細胞を処置するために使用され得、修飾細胞が患者に投与される（エクスビボ）。ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を送達するための従来のウイルスベースの系は、遺伝子導入用のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。宿主ゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスによる遺伝子導入方法を用いて可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、高い形質導入効率が多くの異なる細胞型および標的組織において観察されている。

レトロウイルスの向性を、外来性エンベロープタンパク質を組み込むことによって変化させ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡張することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入するか、または感染させることができ、かつ典型的には高いウイルス力価を生成するレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列のパッケージング能力を有する、シス作用性の長い末端反復配列からなる。最小のシス作用ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、これはその後、治療用遺伝子を標的細胞に組み込んで恒久的な導入遺伝子の発現を提供するために用いられる。一般に用いられているレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびこれらの組み合わせに基づくベクターを含む（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照のこと）。

一過性の発現が好ましい用途において、アデノウイルスベースの系を用いることができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において極めて高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて、高力価かつ高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純なシステムにおいて大量に生成することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターも、細胞を標的核酸で形質導入するために、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ生成において、かつインビボおよびエクスビボ遺伝子治療手順のために用いられる（例えば、Ｗｅｓｔら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、国際公開第ＷＯ９３／２４６４１号、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ９４：１３５１（１９９４）を参照のこと）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６−６４７０（１９８４）、およびＳａｍｕｌｓｋｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）を含むいくつかの出版物に記載されている。

少なくとも６つのウイルスベクターのアプローチが、臨床試験における遺伝子導入に現在利用可能であり、それらは、形質導入剤を生成するためにヘルパー細胞系に挿入される遺伝子による欠損ベクターの補完に関与するアプローチを利用する。

ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験に使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら，Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８−３０５（１９９５）、Ｋｏｈｎら，Ｎａｔ． Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）、Ｍａｌｅｃｈら，ＰＮＡＳ ９４：２２ １２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験で使用された最初の治療用ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０（１９９５））。５０％以上の形質導入効率が、ＭＦＧ−Ｓパッケージングベクターにおいて観察されている（Ｅｌｌｅｍら，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）、Ｄｒａｎｏｆｆら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７）。

本明細書に記載されているポリヌクレオチドの導入に適当なベクターは、非組み込みレンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）も含む。例えば、Ｏｒｙら、（１９９６年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９３巻：１１３８２〜１１３８８頁；Ｄｕｌｌら、（１９９８年）、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：８４６３〜８４７１頁；Ｚｕｆｆｅｒｙｅｔら、（１９９８年）、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：９８７３〜９８８０頁；Ｆｏｌｌｅｎｚｉら、（２０００年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２５巻：２１７〜２２２頁；米国特許公開第２００９０１１７６１７号を参照されたい。

組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）を使用して、本明細書に記載されている組成物も送達され得る。すべてのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノムへの組み込みに起因した効率的な遺伝子導入および安定した導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特徴である（Ｗａｇｎｅｒら，Ｌａｎｃｅｔ ３５１：９１１７ １７０２−３（１９９８）、Ｋｅａｒｎｓら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７４８−５５（１９９６））。他のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０ならびにシュードタイプ化ＡＡＶ（ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、およびＡＡＶ２／６）の例が挙げられる）も本発明に従って使用することができる。

複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で生成することができ、いくつかの異なる細胞型を容易に感染させる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えるように操作され、その後、複製欠損ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において増幅する。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉に見出されるもの等の非分裂の分化細胞を含む複数の種類の組織をインビボで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、高い輸送能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射での抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド治療を含んだ（Ｓｔｅｒｍａｎら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例として、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４：１ ５−１０（１９９６）、Ｓｔｅｒｍａｎら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７ １０８３−１０８９（１９９８）、Ｗｅｌｓｈら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）、Ａｌｖａｒｅｚら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）、Ｔｏｐｆら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）、Ｓｔｅｒｍａｎら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８）が挙げられる。

宿主細胞を感染させることができるウイルス粒子を形成するために、パッケージング細胞が使用される。そのような細胞は、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞を含む。遺伝子治療に用いられるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする生産細胞系によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主への組み込み（適切な場合）に必要な最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられる。失われたウイルス機能は、パッケージング細胞系によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療に用いられるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組み込みに必要なＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含む細胞系内にパッケージングされる。細胞系は、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。このヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如のため、相当な量でパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性の高い熱処理によって減少させることができる。

多くの遺伝子治療適用において、特定の組織型に対して高度の特異性を有する遺伝子治療ベクターが送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面上のウイルスのコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることにより、所与の細胞型に対して特異性を有するように改変され得る。リガンドは、目的とする細胞型上に存在することが知られている受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９７４７−９７５１（１９９５）は、モロニーマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現するように改変することができ、その組換えウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現するあるヒト乳がん細胞を感染させることを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、かつ、ウイルスが細胞表面受容体のリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルスと標的細胞とのペアにまで拡張することができる。例えば、繊維状ファージは、実質的に任意の選択された細胞受容体に対する特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように操作され得る。上記の説明は、主としてウイルスベクターに適用されるが、同一の原理が非ウイルスベクターにも適用され得る。そのようなベクターは、特定の標的細胞による取り込みを好む特定の取り込み配列を含むように操作され得る。

遺伝子治療ベクターは、以下に記載されるように、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、くも膜下腔内、皮下、もしくは頭蓋内注入）または局所適用による個々の患者への投与によってインビボで送達することができる。あるいは、ベクターは、細胞、例えば、個々の患者から移植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検材料）または万能ドナーの造血幹細胞等にエクスビボで送達することもでき、その後、該細胞が、通常はベクターを組み込んだ細胞の選択後に、患者に再移植される。

診断、研究、または遺伝子治療（例えば、トランスフェクトされた細胞の宿主生物への再注入を介した）のためのｅｘ ｖｉｖｏ細胞トランスフェクションが、当業者に周知である。好ましい実施形態において、細胞は、対象生物から単離され、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系核酸（遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）をトランスフェクトされ、対象生物（例えば、患者）に再注入して戻される。好ましい実施形態において、１つまたは複数の核酸は、ｍＲＮＡとして送達される。翻訳効率および／またはｍＲＮＡ安定性を増大させるためのキャップされたｍＲＮＡの使用も好ましい。ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップ類似体）キャップまたはそのバリアントが特に好ましい。参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，０７４，５９６号および同第８，１５３，７７３号を参照されたい。ｅｘ ｖｉｖｏトランスフェクションに適当な種々の細胞タイプが、当業者に周知である（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ， Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、（第３版、１９９４年）、および患者から細胞を単離し、培養する方法の考察のためそこで引用される参考文献を参照のこと）。

一実施形態において、幹細胞は、細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療のためのｅｘ ｖｉｖｏの手順において使用される。幹細胞を使用する利点は、それらが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで他の細胞タイプに分化され得るか、または哺乳動物（例えば、細胞のドナー）に導入され得、そこでそれらが骨髄において生着することである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αのようなサイトカインを使用して、ＣＤ３４＋細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで臨床上重要な免疫細胞タイプに分化させる方法が、公知である（Ｉｎａｂａら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１７６巻：１６９３〜１７０２頁、（１９９２年）を参照のこと）。

幹細胞は、公知の方法を使用して、形質導入および分化のため単離される。例えば、幹細胞は、骨髄細胞を、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（汎Ｂ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、ならびにＩａｄ（分化した抗原提示細胞）のような不要な細胞を結合する抗体でパニングすることにより、骨髄細胞から単離される（Ｉｎａｂａら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１７６巻：１６９３〜１７０２頁（１９９２年）を参照のこと）。

修飾された幹細胞も、一部の実施形態において使用され得る。例えば、アポトーシスに対して耐性にした神経幹細胞が、治療組成物として使用され得、ここで、幹細胞は、本発明のＺＦＰ ＴＦも含有する。アポトーシスに対する耐性は、例えば、幹細胞においてＢＡＸもしくはＢＡＫ特異的ＴＡＬＥＮ、またはＺＦＮ（米国特許公開第２０１００００３７５６号を参照のこと）を使用して、ＢＡＸおよび／またはＢＡＫをノックアウトすること、あるいは例えば、カスパーゼ−６特異的ＺＦＮを再度使用して、カスパーゼにおいて破壊されるものにより起こり得る。これらの細胞は、変異体または野生型Ｈｔｔを調節することが公知であるＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦをトランスフェクトすることができる。

治療用ＺＦＰ核酸を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）は、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。あるいは、裸のＤＮＡは投与され得る。投与は、注射、注入、局所適用、および電気穿孔を含むが、これらに限定されない、通常、血液または組織細胞との最終的な接触へと分子を導入するために用いられる経路のうちのいずれかによる。そのような核酸を投与する好適な方法は、利用可能であって、かつ当業者に周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路が用いられてもよいが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりも即時的かつより効果的な反応を提供することができる。

ある特定の実施形態において、本明細書に記載されている組成物（融合タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、および／または修飾された細胞を含む）（例えば、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質）は、ｉｎ ｖｉｖｏで直接送達される。組成物（細胞、ポリヌクレオチド、および／またはタンパク質）は、ＣＮＳに直接投与されてもよく、それには、脳または脊髄への直接的注射が挙げられるがこれらに限定されない。脳の１つまたは複数のエリアが、標的化されてもよく、それには、海馬、黒質、マイネルト基底核（ＮＢＭ）、線条体、および／または皮質が挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、またはＣＮＳ送達に加えて、組成物は、全身的に投与され得る（例えば、静脈内、腹腔内、心臓内、筋肉内、くも膜下腔内、皮下、および／または頭蓋内注入）。本明細書に記載されている組成物の被験体への直接的な送達（ＣＮＳに直接を含む）のための方法および組成物には、ニードルアセンブリを介した直接注射（例えば、定位的注射（ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ））が挙げられるがこれに限定されない。このような方法は、例えば、脳への組成物の送達のためのニードルアセンブリに関して、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，８３７，６６８号；同第８，０９２，４２９号、および米国特許公開第２００６０２３９９６６号に記載されている。

ＤＮＡの造血幹細胞への導入方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号において開示される。導入遺伝子の造血幹細胞、例えば、ＣＤ３４^＋細胞への導入に有用なベクターは、アデノウイルス３５型を含む。

薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物により、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法により、ある程度決定される。したがって、以下に記載される、広範な、利用可能な医薬組成物の適当な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８９年を参照のこと）。

診断、研究、または遺伝子治療（例えば、トランスフェクトされた細胞の宿主生物への再注入を介した）のためのｅｘ ｖｉｖｏ細胞トランスフェクションが、当業者に周知である。好ましい実施形態において、細胞は、対象生物から単離され、ＺＦＰ核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）をトランスフェクトされ、対象生物（例えば、患者）に再注入して戻される。ｅｘ ｖｉｖｏトランスフェクションに適当な種々の細胞タイプが、当業者に周知である（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ， Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、（第３版、１９９４年）、および患者から細胞を単離し、培養する方法の考察のためそこで引用される参考文献を参照のこと）。

上で言及した通り、開示された方法および組成物を、原核細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、およびヒト細胞が挙げられるがこれらに限定されない任意のタイプの細胞において使用することができる。タンパク質発現に適当な細胞系は、当業者に公知であり、それには、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、ｐｅｒＣ６、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）のような昆虫細胞、任意の植物細胞（分化または未分化）、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）のような昆虫細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのような真菌細胞が挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態において、細胞系は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＭＤＣＫ、またはＨＥＫ２９３細胞系である。加えて、初代細胞は、単離され、遺伝子モジュレーター（例えば、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）、または遺伝子モジュレーター系（例えば、Ｔｔａｇｏおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）での処理の後、処置されるべき被験体への再導入のためｅｘ ｖｉｖｏで使用され得る。適当な初代細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、およびそれらに限定されないがＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＣＤ８＋Ｔ細胞のような他の血液細胞サブセットを含む。適当な細胞は、例として、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞（ＣＤ３４＋）、神経幹細胞、および間葉系幹細胞のような幹細胞も含む。

一実施形態において、幹細胞は、細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療のためのｅｘ ｖｉｖｏの手順において使用される。幹細胞を使用する利点は、それらが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで他の細胞タイプに分化され得るか、または哺乳動物（例えば、細胞のドナー）に導入され得、そこでそれらが骨髄において生着することである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αのようなサイトカインを使用して、ＣＤ３４＋細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで臨床上重要な免疫細胞タイプに分化させる方法が、公知である（Ｉｎａｂａら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１７６巻：１６９３〜１７０２頁、（１９９２年）を参照のこと）。

幹細胞は、公知の方法を使用して、形質導入および分化のため単離される。例えば、幹細胞は、骨髄細胞を、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（汎Ｂ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、ならびにＩａｄ（分化した抗原提示細胞）のような不要な細胞を結合する抗体でパニングすることにより、骨髄細胞から単離される（Ｉｎａｂａら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１７６巻：１６９３〜１７０２頁（１９９２年）を参照のこと）。

修飾された幹細胞も、一部の実施形態において使用され得る。例えば、アポトーシスに対して耐性にした幹細胞が、治療組成物として使用され得、ここで、幹細胞は、本発明のＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、および／またはドナーも含有する。アポトーシスに対する耐性は、例えば、幹細胞においてＢＡＸもしくはＢＡＫ特異的ヌクレアーゼ（米国特許公開第２０１０／０００３７５６号を参照のこと）を使用して、ＢＡＸおよび／またはＢＡＫをノックアウトすること、あるいは例えば、カスパーゼ−６特異的ＺＦＮを再度使用して、カスパーゼにおいて破壊されるものにより起こり得る。あるいは、アポトーシスに対する耐性は、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（カルボベンゾキシ−バリル−アラニル−アスパルチル−［Ｏ−メチル］−フルオロメチルケトン）のようなカスパーゼ阻害剤の使用によっても達成することができる。

治療用ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、および／またはドナー核酸を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）はまた、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞の形質導入のため生物に直接投与され得る。あるいは、裸のＤＮＡまたはｍＲＮＡが投与され得る。投与は、分子を血液または組織との最終接触に導入するために通常使用される経路のいずれかによるものであり、それには、注射、注入、局所適用、および電気穿孔が挙げられるがこれらに限定されない。このような核酸を投与する適当な方法が利用可能であり、当業者に周知であり、１種類より多くの経路が、特定の組成物を投与するために使用され得るが、特定の経路は、別の経路より即時かつより有効な反応をしばしばもたらすことができる。

以下の実施例は、組成物が、ジンクフィンガー転写因子抑制因子（ＺＦＰ−ＴＦ抑制因子）を含む、本開示の例示的な実施形態に関する。これは、例示のみの目的であること、ならびに他の組成物、例えば、ＺＦＰ−ＴＦ活性化因子、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥ−ＴＦ（活性化因子または抑制因子）、ＴＡＬＥＮ（例えば、標準的ＴＡＬＥＮ、Ｍｅｇａ−ＴＡＬ、ならびに／またはコンパクトなＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ））、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（転写因子、および／またはヌクレアーゼ系）、操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）、ならびに／または天然に存在するもしくは操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインおよび異種の切断ドメインの融合物、ならびに／またはメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー、ならびに／またはＴＡＬＥタンパク質の融合物が使用され得ることが、理解される。さらに、例示のみの目的のため、自己調節性プロモーターが、ＣＡＧ結合タンパク質の複数の標的を含有した、Ｈｔｔ対立遺伝子の調節が例示されるが、本発明の方法および組成物が、発現構築物中の任意の低親和性標的部位（複数可）を使用して実施され得、それにより、同一の自己調節をもたらすことが理解される。

実施例１：構築物
Ｈｔｔ結合ＺＦＰ（米国特許公開第２０１３０２５３０４０号を参照のこと）、およびＧＦＰ Ｖｅｎｕｓバリアント（Ｎａｇａｉら、（２００２年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０巻（１号）：８７〜９０頁）を発現する、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルス（ＬＶ）、および組み込み欠陥レンチウイルス（ＩＤＬＶ）構築物（Ｈｏｎｇら、（２００２年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ．、２９５巻（５５５６号）：８６８〜７２頁）を、Ｈｔｔプロモーター配列（図１Ａ）、ＣＭＶプロモーター（図１Ｂ）、ＴＡＴＡボックスの下流のＣＭＶプロモーターにＣＡＧ反復（７〜２０）をクローニングした修飾されたＣＭＶプロモーター（図１Ｃ、「自己調節性プロモーター構築物」または「低親和性標的部位構築物」とも呼ばれる）、およびＣＡＧ結合ＺＦＰに対する低親和性標的部位として作用する１７個のＣＡＧ反復を含有する非コードエキソン１を有する修飾されたＨｔｔプロモーター（図１Ｄ）に作動可能に連結させたＺＦＰをコードする配列を用いて生成した。

ＺＦＰ設計および標的部位を、表１および２において以下に示す。ＺＦＰを、ＫＯＸ１のＫＲＡＢ抑制ドメインに連結させる。３２５２８および３１８０９と命名したＺＦＰは、Ｈｔｔのプロモーターに結合し、変異体および野生型Ｈｔｔ対立遺伝子の両方からの転写を抑制する。３３０７４、３０６４０、および３０６４８と命名したＺＦＰは、ＣＡＧ反復に結合するように設計され、３０６４８は、変異体および野生型Ｈｔｔ対立遺伝子の両方の上のＣＡＧ反復に結合し、両方の転写を抑制することができ、３０６４０および３３０７４は、拡大したＣＡＧ反復に優先的に結合し、変異体Ｈｔｔの転写を選択的に抑制する。５４７５と命名したＺＦＰは、Ｃｈｋ２遺伝子に結合し、ＣＡＧ反復に結合しないよう設計した対照ＺＦＰである。表２において、ＺＦＰ認識ヘリックスが接触する標的部位中のヌクレオチドを大文字で示し、接触しないヌクレオチドを小文字で示す。

実施例２：ＨｔｔおよびＣＭＶプロモーター駆動構築物
構築物ＬＶ−ＣＭＶ−ＺＦＰ−２Ａ−ＶＥＮＵＳ、またはＬＶ−Ｈｔｔｐ−ＺＦＰ−２Ａ−ＶＥＮＵＳでＨＤニューロンを感染させ、感染の２１日後に細胞を採取した（図２および３）。加えて、２９３Ｔ細胞を異なるプロモーター（ＣＭＶまたはＨｔｔ）を有するＩＤＬＶ構築物（図４）で感染させ、または発現プラスミド（図５）で、トランスフェクトした。形質導入またはトランスフェクションの４８時間後に２９３Ｔ細胞を採取し、フローサイトメトリー（Ｇａｕｖａ）により、ＧＦＰ／ＶＥＮＵＳ発現を分析した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）も行い、Ｈｔｔおよび／またはＺＦＰ−２Ａ−ＶＥＮＵＳのｍＲＮＡ発現レベルを測定した。

Ｈｔｔプロモーターを標的化するＺＦＰ（３２５２８）について、Ｈｔｔプロモーター駆動構築物は、ＨＤニューロンにおいて、より低いＺＦＰ ｍＲＮＡ発現（ＣＭＶプロモーター駆動構築物と比較して、図２）、および結果的により小さな、内因性Ｈｔｔの抑制（図３）をもたらした。

Ｈｔｔプロモーターも標的化する異なるＺＦＰ（３１８０９）について、Ｈｔｔプロモーター駆動構築物はまた、ＣＭＶプロモーター駆動構築物と比較したとき、より小さな、内因性Ｈｔｔの抑制をもたらした（図４）。

トランスフェクトした細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）により、異なるプロモーターにより引き起こされるＺＦＰ−２Ａ−ＶＥＮＵＳの発現レベルを測定した（図５に示す）。ＺＦＰ３０６４０はＣＡＧ反復に結合し、一方、ＺＦＰ３１０８９はＨｔｔプロモーター中の非ＣＡＧ標的部位に結合する。ＣＭＶプロモーター構築物について、３０６４０−２Ａ−ＶＥＮＵＳおよび３１８０９−２Ａ−ＶＥＮＵＳの発現レベルは類似した。Ｈｔｔプロモーター構築物について、３１８０９−２Ａ−ＶＥＮＵＳは、３０６４０−２Ａ−ＶＥＮＵＳと比較してより低いレベルで発現し、これは、ＺＦＰ３１８０９が、Ｈｔｔプロモーター中のその標的部位を介してその発現を下方調節することを示唆している。他方、１７個のＣＡＧ反復も含むＨｔｔプロモーターから発現させるとき、３０６４０−２Ａ−ＶＥＮＵＳの発現レベルは低減し、これは、ＺＦＰ３０６４０が、ＣＡＧ反復を介してそれ自体の発現を調節することを示唆している。

実施例３：修飾されたＣＭＶプロモーターを有する自己調節性構築物
変動する数のＣＡＧ反復をＣＭＶプロモーターの下流に含む、ＣＭＶプロモーター構築物に操作した低親和性標的部位を含有する構築物（図１Ｃ）も評価した。

プラスミドＤＮＡ １μｇ（図６Ａおよび６Ｂ）、または３μｇ（図６Ｂおよび７）で、２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、フローサイトメトリー（図６Ａ）、および定量的ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ（登録商標））分析（図６Ｂ）を使用して、ＺＦＰ−２Ａ−ＶＥＮＵＳの発現レベルの分析を行った。これらの実験において、ＣＭＶプロモーターが多数（０〜２０の間）のＣＡＧ反復を含有し、ＺＦＰ３３０７４がＣＡＧ反復に結合する、ＣＭＶ−３３０７４−ＫＯＸ−ＦＬＡＧ−２Ａ−ＶＥＮＵＳベクターを含むＤＮＡプラスミドで２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。

図６Ａにおいて示す結果は、約１５〜２０個のＣＡＧ反復が存在する修飾されたＣＭＶプロモーターを使用して、ＺＦＰ３３０７４の発現が自己調節性であることを示す。図６Ｂは、ＺＦＰ発現レベルが高かった（例えば、３μｇのトランスフェクション由来）とき、ＺＦＰが、より少ないＣＡＧ反復を含んだ構築物由来のそれ自体の発現を調節することができたことを示す。ＣＡＧ反復自体の存在は、対照ＺＦＰ５４７５の発現を低減せず、それは、ＣＡＧ反復に結合しない。

異なるＣＡＧ結合ＺＦＰ、３３０７４、３０６４０、または３０６４８で、修飾されたＣＭＶプロモーター（７〜２０個のＣＡＧを有する）を試験したとき、より活性な抑制因子（３０６４８）は、より弱い抑制因子（３３０７４および３０６４０）よりも、自己調節を示すのに少ないＣＡＧ反復を必要とした。図７を参照されたい。

ＡＡＶベクター、ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＣＡＧ（０−２０）−ＺＦＰ−２Ａ−ＶＥＮＵＳでも２９３Ｔ細胞を感染させた。形質導入の４日後に、２９３Ｔ細胞を採取し、フローサイトメトリー（図８Ａ）または顕微鏡（図８Ｃ）により、ＧＦＰ／ＶＥＮＵＳ発現を測定した。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）も行い、ＺＦＰ−２Ａ−ＶＥＮＵＳのｍＲＮＡレベルを決定した（図８Ｂ）。共に、これらの結果は、ＣＡＧ反復標的化ＺＦＰが、発現ベクターのプロモーターに操作した標的部位（ＣＡＧ反復）を介してそれ自体の発現レベルを調節することができ、プロモーター中のＣＡＧ反復領域が長いほど、ＺＦＰのより低い発現と相関することを示した。

野生型Ｈｔｔ対立遺伝子（「ＣＡＧ１７」）および変異体Ｈｔｔ対立遺伝子（「ＣＡＧ４８」）を保有するＨＤ胚性幹細胞由来のニューロンにおいて、変異体Ｈｔｔの対立遺伝子特異的抑制因子である、ＺＦＰ３３０７４を含む自己調節性プロモーター構築物も試験した。１０，０００より大きいＭＯＩでのＡＡＶ感染（図９Ａを参照のこと）で、いかなるＣＡＧ反復も欠く（「０」）プロモーターから発現したＺＦＰ３３０７４は、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子（ＣＡＧ１７）を部分的に抑制することができ（最大約５０％）、全用量において変異体Ｈｔｔ対立遺伝子（ＣＡＧ４８）を約９０％またはそれ超抑制した。１８個または２０個のＣＡＧ反復を有するプロモーター構築物において、いずれの用量においても野生型ＣＡＧ１７対立遺伝子の抑制を観察しなかった。加えて、より長いＣＡＧ反復発現構築物を含む試料において、ＣＡＧ４８対立遺伝子の抑制は、低いＭＯＩにおいて、より短いＣＡＧ反復を有するかまたは有しない構築物由来のものより小さかった。

ＺＦＰ３３０７４のｍＲＮＡを検出するよう設計したｑＰＣＲプローブセットを使用して、ＺＦＰ３３０７４の発現レベルを評価した（図９Ｂ）。発現ベクターのプロモーター中のＣＡＧ反復が長いほど、ＺＦＰの発現の低減と一般に相関する。

共に、これらの実施例は、ＺＦＰが、発現構築物のプロモーターに操作した標的部位を介して発現を調節することができ、自己調節の程度は、発現構築物に含まれる結合部位の数に依存することを示す。これらの結果は、このような自己調節が、プラスミドベクター、またはＡＡＶ、ＬＶ、もしくはＩＤＬＶベクターとの関連で実現可能であることも示す。

本明細書に言及されているあらゆる特許、特許出願および刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

理解を明確にするために、例示および実施例として本開示を詳細に提示してきたが、当業者であれば、本開示の精神または範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正を実施してよいことが明らかとなろう。したがって、前述の記載および実施例は、限定的に解釈するべきではない。

Claims (20)

1. 目的とする標的部位に結合する操作されたＤＮＡ結合ドメインを含む遺伝子モジュレーターの少なくとも１種の成分をコードするポリヌクレオチドを含む構築物であって、前記ポリヌクレオチドは、前記目的とする標的部位よりも低い親和性で前記遺伝子モジュレーターの前記ＤＮＡ結合ドメインにより結合される自己調節性標的部位を含む異種のプロモーターに作動可能に連結され、さらに、前記遺伝子モジュレーターの前記自己調節性標的配列への結合は、前記ポリヌクレオチドの発現を調節する、構築物。
2. 前記目的とする標的部位が細胞のゲノムにある、請求項１に記載の構築物。
3. 前記ポリヌクレオチドの発現が、前記遺伝子モジュレーターが前記自己調節性標的配列に結合すると低減される、請求項１または２に記載の構築物。
4. 前記自己調節性標的部位が、前記目的とする標的部位の配列と少なくとも１個の塩基対が異なる、請求項１〜３のいずれかに記載の構築物。
5. 制御エレメントを含み、前記自己調節性標的部位が前記制御エレメント内にある、請求項１〜４のいずれかに記載の構築物。
6. ウイルス構築物である、請求項１〜５のいずれかに記載の構築物。
7. 前記ウイルス構築物が、レンチウイルス（ＬＶ）、組み込み欠陥レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）、アデノウイルス、またはＡＡＶ構築物である、請求項５に記載の構築物。
8. 前記遺伝子モジュレーターが、転写因子またはヌクレアーゼである、請求項１〜７のいずれかに記載の構築物。
9. 前記転写因子または前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥタンパク質、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む、請求項８に記載の構築物。
10. ドナー核酸をさらに含む、請求項８に記載の構築物。
11. 遺伝子モジュレーターをコードする前記ポリヌクレオチドおよび前記自己調節性標的部位に作動可能に連結された少なくとも１個のさらなるポリペプチドコード配列をさらに含む、請求項１に記載の構築物。
12. 前記さらなるポリペプチドコード配列が、２Ａ自己切断ペプチド配列またはＩＲＥＳ部位により、前記遺伝子モジュレーターをコードする配列から隔てられている、請求項１１に記載の構築物。
13. 請求項１〜１２のいずれかに記載の構築物を含む細胞。
14. 遺伝子モジュレーターがヌクレアーゼを含み、さらに前記細胞が、前記細胞のゲノムに組み込まれるドナー核酸を含む、請求項１３に記載の細胞。
15. 前記ドナー核酸が、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）にあるか、またはプラスミドＤＮＡによりコードされる、請求項１４に記載の細胞。
16. 細胞に導入された外因性遺伝子モジュレーターの発現の調節に使用するための組成物であって、前記組成物は、細胞に導入する請求項１〜１２のいずれか記載の構築物を含み、前記遺伝子モジュレーターの発現は、前記遺伝子モジュレーターが自己調節性標的部位に結合すると抑制される、組成物。
17. 前記細胞が哺乳動物細胞または植物細胞である、請求項１６に記載の組成物。
18. 前記細胞が幹細胞である、請求項１６に記載の組成物。
19. 請求項１〜１２のいずれかに記載の構築物、または請求項１３〜１５のいずれかに記載の細胞を含む、医薬組成物。
20. 請求項１〜１２のいずれかに記載の構築物、および／または請求項１３〜１５のいずれかに記載の細胞を含み、任意選択でドナー分子および／または説明書を含むキット。