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JP6576251B2 - ＰＴＤ−Ｓｍａｄ７薬物療法 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月８日出願された米国仮特許出願第ＵＳＳＮ６１／７７５，２５２号の優先権を主張し、その開示内容の全体を参照として本明細書に援用する。
政府所有権の表示
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（National Institutes of Health）により授与された助成金番号ＡＲ０６１７９６のもとで、政府の支援によりなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出されかつその全体が参照により本明細書に組み込まれる、配列表を含む。2014年4月29日に作成された当該ASCIIコピーは、089491-0303_SL.txtというファイル名で、サイズは120,505バイトである。
背景
口腔粘膜炎（重篤な経口潰瘍化）は、骨髄移植のための放射線または癌のための頭蓋顔面放射線療法の、大量照射の一般的な有害作用である。重篤な口腔粘膜炎は、栄養管、激痛の管理、および早めな放射線治療中止を必要とすることもあり得る。重度炎症および上皮剥離は、口腔粘膜炎の主な特徴である。
パリフェルミン（ＫＧＦ（ヒトケラチン合成細胞増殖因子）組換えタンパク質）は、骨髄移植患者で口腔粘膜炎を防止するために承認されている。頭頸部癌患者における２通りのパリフェルミン臨床試験は、パリフェルミンが重篤な口腔粘膜炎発生率をそれぞれ６７％および６９％から５１％および５４％まで減少させることを示した。臨床試験または前臨床試験における他の口腔粘膜炎薬として、増殖因子、放射線防護のための薬剤、消炎剤、または免疫変調成分が挙げられる。
パリフェルミンおよび上述のカテゴリーで開発されている薬の適度な効果は、新規治療法のバイオマーカーを同定する必要性を強調している。しかしながら、ルーチン診断生検または口腔粘膜炎患者由来の破棄組織の欠如は、このような取り組みの妨げとなった。
皮膚の創傷治癒は、３つのオーバーラッピング相、すなわち、炎症、組織形成、および組織再構築を経て、進行する。これらは、表皮、白血球、細胞間マトリックス（ＥＣＭ）、および皮膚繊維芽細胞の間の相互作用を伴うダイナミックなプロセスである。皮膚損傷に応答して、創傷内の血栓、炎症性細胞、および他の細胞型は、複数のサイトカインおよびケモカインを放出する。これらのサイトカインは、繊維芽細胞の増殖と、創傷欠損を満たして創傷の閉鎖をもたらすＥＣＭの合成とを引き起こす。
一方、創傷端のケラチノサイトは、増殖および移動を開始して、創傷面を覆う。再上皮化された表皮の下に、新しいストロマ（肉芽組織と呼ばれている）が損傷空間を満たし始める。この空間には、暫定的なＥＣＭ、炎症性細胞、繊維芽細胞、および血管が含まれる。創傷部が肉芽組織で満たされて、新しく再上皮化された表皮によって覆われると、創傷閉鎖のプロセスが完了する。その後、創傷は、組織再構築を通じて、正常な強度および質感に徐々に戻る。
創傷治癒に影響するために知られている多くの分子のなかでも、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）は、作用の範囲が最も広く、創傷治癒の全ての段階で関わる全ての細胞型に影響を及ぼす（Feng et al., Annu Rev Cell Dev Biol 21:659-693, 2005（非特許文献1））。ＴＧＦ−βの種々の機能は、Ｓｍａｄファミリーメンバーを含むいくつかのシグナル伝達分子によって媒介される。リガンドがＴＧＦ−βＩ型およびＩＩ型の受容体（ＴＧＦβＲＩおよびＴＧＦ−β ＲＩＩ）に結合する場合、ＴＧＦ−β ＲＩはＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３をリン酸化する。リン酸化されたＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３は、共通のＳｍａｄであるＳｍａｄ４に結合して、ヘテロマーのＳｍａｄ複合体を形成し、さらに核の中に転位することで、ＴＧＦ−β標的遺伝子の転写を調節する。
ＴＧＦ−βシグナル伝達は、正および負の両方の効果を創傷面に発揮することが報告されている（Wang et al., J Investig Dermatol Symp Proc 11: 112-117, 2006（非特許文献2））。例えば、Ｓｍａｄ３欠損マウス（ＴＧＦ−βシグナル伝達を部分的に抑止）は、創傷治癒の促進を示した（Ashcroft et al, Nat Cell Biol 1:260-266, 1999（非特許文献3））。対照的に、外因性Ｓｍａｄ３を創傷部位に導入してＴＧＦ−βシグナル伝達を増進させることも、ウサギ皮膚潰瘍モデルでの創傷治癒を促進した（Sumiyoshi et al., J Invest Dermatol 123:229-236, 2004（非特許文献4）)。Sｍａｄ４欠損マウスの皮膚創傷は、炎症および血管新生の急激な増加を呈し、創傷閉鎖の遅れを引き起こし、過剰な瘢痕を形成した（Owens et al., Am J Pathol 176:122-133, 2010（非特許文献5））。角膜上皮およびストロマにおけるＳｍａｄ７（ＴＧＦ−βシグナル伝達のアンタゴニスト）の一過性アデノウイルス遺伝子導入は、炎症の減少を伴う角膜創傷治癒の促進をもたらした（Saika et al., Am J Pathol 166:1405-1418, 2005（非特許文献6））。さらに、水晶体上皮およびストロマに対するＳｍａｄ７遺伝子導入は、レンズ上皮細胞の損傷によって誘発された上皮間葉移行を妨げて、莢膜線維症の予防におけるＳｍａｄ７の潜在的役割を示唆している（Saika et al., Lab Invest 84:1259-1270, 2004（非特許文献7））。しかしながら、ラット頸動脈のバルーン損傷に対するＳｍａｄ７のアデノウイルスベクター送達は、脈管治癒の減少をもたらした（Mallawaarachchi et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 25: 1383-1387, 2005（非特許文献8）)。これらの研究は、創傷治癒に関するＴＧＦ−βシグナル伝達成分（例えばＳｍａｄ７）の効果が複雑かつ高度に状況特異的であることを示唆している。その上、Ｓｍａｄ７の効果は、ＴＧＦ−βシグナル伝達におけるその役割によって必ずしも説明されるわけではないと思われる。例えば、Ｓｍａｄ７はＷｎｔ／β−カテニン（Han et al., Dev Cell Biol 11:301-312, 2006（非特許文献9）)およびＴＮＦβ／ＮＦ−κＢ（Hong et al., Nat Immunol 8:504-513, 2007（非特許文献10））ファミリーの成分と相互作用することも示されている。
Feng et al., Annu Rev Cell Dev Biol 21:659-693, 2005 Wang et al., J Investig Dermatol Symp Proc 11: 112-117, 2006 Ashcroft et al, Nat Cell Biol 1:260-266, 1999 Sumiyoshi et al., J Invest Dermatol 123:229-236, 2004 Owens et al., Am J Pathol 176:122-133, 2010 Saika et al., Am J Pathol 166:1405-1418, 2005 Saika et al., Lab Invest 84:1259-1270, 2004 Mallawaarachchi et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 25: 1383-1387, 2005 Han et al., Dev Cell Biol 11:301-312, 2006 Hong et al., Nat Immunol 8:504-513, 2007
概要
本技術は、コドン最適化ヒトＳｍａｄ７ ｃＤＮＡヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。いくつかの実施形態において、コドン最適化ヒトＳｍａｄ７ヌクレオチド配列は、１または複数の細菌または酵母での発現に最適化されたアルギニンの１または複数のコドンを含んでもよく、１または複数の細菌または酵母の発現に最適化されたセリンの１または複数のコドンが含まれ、および／または、１または複数の細菌または酵母の発現に最適化されたヒスチジンの１または複数のコドンが含まれる。いくつかの実施形態において、コドン最適化ヒトＳｍａｄ７ヌクレオチド配列は１または複数の細菌または酵母の発現に最適化された２８のセリンコドン、６つのヒスチジンコドン、および９つのアルギニンコドンを含んでもよい。いくつかの実施形態において、コドン最適化ヒトＳｍａｄ７ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、２１、２３、２４、２６、２８、３０、３２〜３４、３６、３８、３９、８７、８９、９１、９３、９６、９７、９９、および１００からなる群から選択されてもよい。いくつかの実施形態において、コドン最適化ヒトＳｍａｄ７ヌクレオチド配列はヒトＳｍａｄ７ ｃＤＮＡに対して約６５〜７５パーセントの相同性を有してもよく、Ｎ末端フラグメントＳｍａｄ７をコードしているヌクレオチド配列を含んでもよく、Ｓｍａｄ７のＣ末端フラグメントをコードしているヌクレオチド配列を含んでもよく、ヒトＳｍａｄ７タンパク質のアミノ酸２〜２５８をコードしているヌクレオチドを含んでもよく、ヒトＳｍａｄ７タンパク質のアミノ酸２５９〜４２６をコードしているヌクレオチドを含んでもよく、または、ヒトＳｍａｄ７タンパク質のアミノ酸２０４〜２５８をコードしているヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態において、前述のいずれも、タンパク質導入ドメイン（例えばＴａｔ）をコードしているヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、前述のいずれも、エピトープタグまたは精製タグ（例えばＶ５、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、または６−ヒスチジン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０））の１または複数をコードしているヌクレオチド配列を、さらに含んでもよい。
いくつかの実施形態において、前述のいずれも、単離および／または精製されてもよい。いくつかの実施形態において、前述のいずれか１つは、ポリペプチドもコードしてもよく、このポリペプチドは、Ｓｍａｄ２のリン酸化の減少または除去、ＮＦ−κＢｐ５０サブユニットの核転座の減少または除去、細胞増殖の増加、アポトーシスの減少、放射線誘発ＤＮＡ損傷の減少、炎症の減少、脈管形成の減少、口腔粘膜炎治癒の促進、創傷治癒の促進、および自己免疫疾患の処置からなる群から選択される、１または複数の生物活性を有する。いくつかの実施形態において、上記の核酸分子と１または複数の薬学的に許容される賦形剤とを含んでいる医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態において、プロモーターに作動可能に連結した上記の核酸分子を含む発現ベクター、そのような発現ベクターを含む宿主細胞、そのようなベクターおよび宿主細胞を１または複数の薬学的に許容される賦形剤とともに含む医薬組成物が提供される。
一態様では、位置２１６でロイシンを有しているヒトＳｍａｄ７タンパク質を含むタンパク分子が提供される。いくつかの実施形態において、ヒトＳｍａｄ７タンパク質は、Ｃ末端でトランケートされてもよく、または、Ｎ末端でトランケートされてもよい。いくつかの実施形態において、トランケートされたヒトＳｍａｄ７タンパク質は、完全長Ｓｍａｄ７配列の約５０％を含んでもよく、または、完全長Ｓｍａｄ７配列の約１３％を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ヒトＳｍａｄ７タンパク質は、ヒトＳｍａｄ７タンパク質のアミノ酸２〜２５８、アミノ酸２０４〜２５８、またはアミノ酸２５９〜４２６を含むか、あるいは、それらからなってもよい。いくつかの実施形態において、そのタンパク質分子は、Ｓｍａｄ２のリン酸化の減少または除去、ＮＦ−κＢｐ５０サブユニットの核転座の減少または除去、細胞増殖の増加、アポトーシスの減少、放射線誘発ＤＮＡ損傷の減少、炎症の減少、脈管形成の減少、口腔粘膜炎治癒の促進、創傷治癒の促進、および自己免疫疾患の処置からなる群から選択される１または複数の生物活性を有してもよい。いくつかの実施形態において、上記のいずれかは、タンパク質導入ドメイン（例えばＴａｔ）を、さらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、上記のいずれかは、エピトープタグまたは精製タグ（例えばＶ５、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたは６−ヒスチジン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０））の１または複数を、さらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、上記のいずれかと、タンパク分子と、１または複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。
別の態様では、方法は、対象の炎症状態を処置または予防するために提供され、対象に対して治療上有効量の上記医薬組成物を投与すること含む。いくつかの実施形態において、炎症状態は慢性損傷、皮膚炎、乾癬または自己免疫疾患のうちの１または複数であってもよい。いくつかの実施形態において、組成物はＴＧＦ−βおよびＮＦ−κＢシグナル伝達の抑制を介して、炎症を減少させてもよい。
もう一つの態様では、方法は、対象における疾患または障害の予防または処置を行うために、提供される。この方法は、細胞増殖もしくは細胞遊走の１もしくは複数を増加させること、または、対象におけるアポトーシスもしくはＤＮＡ損傷の１もしくは複数を防止することのうちの１または複数を含み、上述のような医薬組成物の治療上有効量を対象に与えることを含むもので、細胞増殖もしくは細胞遊走の１もしくは複数を増加させること、または、対象におけるアポトーシスもしくはＤＮＡ損傷の１もしくは複数を防止することのうちの１または複数は、疾患または障害の予防または処置に有用である。いくつかの実施形態において、疾患または障害には、慢性損傷、急性損傷、または粘膜炎の１または複数が含まれ得る。いくつかの実施形態において、慢性損傷には、糖尿病性潰瘍、圧迫潰瘍、静脈性潰瘍、または口腔潰瘍の１または複数が含まれ得る。急性損傷には、外傷誘発性創傷、手術性創傷、または瘢痕の１または複数が含まれ得る。粘膜炎には、放射線誘発粘膜炎または化学療法誘発粘膜炎の１または複数が含まれ得る。さらに、粘膜炎には、口腔粘膜炎または消化管粘膜炎の１または複数が含まれ得る。
本明細書中に記載されるいずれの方法または組成物も、本明細書中に記載される他の方法または組成物を基準にして、実現できると考えられる。
「１つ（a）」または「ある（an）」という語が特許請求の範囲および／または明細書で「含む（comprising）」という用語とともに使用される場合、「１（one）」を意味し得るが、「１または複数（one or more）」、「少なくとも１つ（at least one）」、および「１または１よりも多い（one or more than one）の意味も合わせ持つ。「約（about）」という語は、定まった数のプラスマイナス5%を意味する。
[本発明1001]
コドン最適化ヒトＳｍａｄ7 ｃＤＮＡヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
[本発明1002]
前記コドン最適化ヒトＳｍａｄ7ヌクレオチド配列が、1または複数の細菌または酵母での発現に最適化されたアルギニンの1または複数のコドンを含む、本発明1001の核酸分子。
[本発明1003]
前記コドン最適化ヒトＳｍａｄ7ヌクレオチド配列が、1または複数の細菌または酵母での発現に最適化されたセリンの1または複数のコドンを含む、本発明1001または1002の核酸分子。
[本発明1004]
前記コドン最適化ヒトＳｍａｄ7ヌクレオチド配列が、1または複数の細菌または酵母での発現に最適化されたヒスチジンの1または複数のコドンを含む、本発明1001から1003のいずれかの核酸分子。
[本発明1005]
前記コドン最適化ヒトＳｍａｄ7ヌクレオチド配列が、1または複数の細菌または酵母での発現に最適化されたセリンの1または複数のコドン、ヒスチジンの1または複数のコドン、およびアルギニンの1または複数のコドンを含む、本発明1001から1004のいずれかの核酸分子。
[本発明1006]
前記コドン最適化ヒトＳｍａｄ7ヌクレオチド配列が、1または複数の細菌または酵母での発現に最適化された28個のセリンコドン、6個のヒスチジンコドン、および9個のアルギニンコドンを含む、本発明1005の核酸分子。
[本発明1007]
前記コドン最適化ヒトＳｍａｄ7ヌクレオチド配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：9〜11、21、および23〜41からなる群から選択される、本発明1001の核酸分子。
[本発明1008]
前記コドン最適化ヒトＳｍａｄ7ヌクレオチド配列が、ヒトＳｍａｄ7 ｃＤＮＡに対して、約65〜75パーセントの相同性を有する、本発明1001の核酸分子。
[本発明1009]
前記ヌクレオチド配列が、Ｓｍａｄ7のＮ末端フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む、本発明1001の核酸分子。
[本発明1010]
前記ヌクレオチド配列が、Ｓｍａｄ7のＣ末端フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む、本発明1001の核酸分子。
[本発明1011]
前記ヌクレオチド配列が、ヒトＳｍａｄ7タンパク質のアミノ酸2〜258をコードするヌクレオチドを含む、本発明1001の核酸分子。
[本発明1012]
前記ヌクレオチド配列が、ヒトＳｍａｄ7タンパク質のアミノ酸259〜426をコードするヌクレオチドを含む、本発明1001の核酸分子。
[本発明1013]
前記ヌクレオチド配列が、ヒトＳｍａｄ7タンパク質のアミノ酸204〜258をコードするヌクレオチドを含む、本発明1001の核酸分子。
[本発明1014]
前記ヌクレオチド配列が、タンパク質導入ドメインをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、本発明1001から1014のいずれかの核酸分子。
[本発明1015]
前記タンパク質導入ドメインがＴａｔである、本発明1014の核酸分子。
[本発明1016]
前記ヌクレオチド配列が、1または複数のエピトープタグまたは精製タグをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、本発明1001から1015のいずれかの核酸分子。
[本発明1017]
前記エピトープタグがＶ5である、本発明1016の核酸。
[本発明1018]
前記精製タグが1または複数のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたは6−ヒスチジン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）である、本発明1016の核酸。
[本発明1019]
1または複数の単離または精製された核酸分子である、本発明1001から1018のいずれかの核酸分子。
[本発明1020]
前記核酸分子が、Ｓｍａｄ2のリン酸化を減少または除去すること、ＮＦκＢ ｐ50サブユニットの核転座を減少または除去すること、細胞増殖を増加すること、アポトーシスを減少すること、放射線誘発ＤＮＡ損傷を減少すること、炎症を減少すること、脈管形成を減少すること、口腔粘膜炎治癒を促進すること、創傷治癒を促進すること、および自己免疫疾患を処置すること、からなる群から選択される1または複数の生物活性を有するポリペプチドをコードする、本発明1001から1019のいずれかの核酸。
[本発明1021]
本発明1001〜1020のいずれかの核酸分子と1または複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
[本発明1022]
プロモーターに作動可能に連結した本発明1001〜1020のいずれかの核酸分子を含む、発現ベクター。
[本発明1023]
本発明1022の発現ベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1024]
本発明1022の発現ベクターと1または複数の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
[本発明1025]
216位にロイシンを有するヒトＳｍａｄ7タンパク質を含む、タンパク質分子。
[本発明1026]
前記ヒトＳｍａｄ7タンパク質がＣ末端でトランケートされている、本発明1025のタンパク質分子。
[本発明1027]
前記ヒトＳｍａｄ7タンパク質がＮ末端でトランケートされている、本発明1025のタンパク質分子。
[本発明1028]
前記トランケートされたヒトＳｍａｄ7タンパク質が完全長Ｓｍａｄ7配列の約50％を含む、本発明1026から1027のいずれかのタンパク質分子。
[本発明1029]
前記トランケートされたヒトＳｍａｄ7タンパク質が完全長Ｓｍａｄ7配列の約13％を含む、本発明1026から1027のいずれかのタンパク質分子。
[本発明1030]
前記ヒトＳｍａｄ7タンパク質のアミノ酸2〜258を有するヒトＳｍａｄ7タンパク質を含む、タンパク質分子。
[本発明1031]
前記Ｓｍａｄ7タンパク質がアミノ酸204〜258を有する、本発明1030のタンパク質分子。
[本発明1032]
前記ヒトＳｍａｄ7タンパク質のアミノ酸259〜426を有するヒトＳｍａｄ7タンパク質を含む、タンパク質分子。
[本発明1033]
前記タンパク質分子が、Ｓｍａｄ2のリン酸化を減少または除去すること、ＮＦκＢ ｐ50サブユニットの核転座を減少または除去すること、細胞増殖を増加すること、アポトーシスを減少すること、放射線誘発ＤＮＡ損傷を減少すること、炎症を減少すること、脈管形成を減少すること、口腔粘膜炎治癒を促進すること、創傷治癒を促進すること、および自己免疫疾患を処置すること、からなる群から選択される1または複数の生物活性を有する、本発明1025から1032のいずれかのタンパク質分子。
[本発明1034]
前記アミノ酸配列がタンパク質導入ドメインをさらに含む、本発明1025から1033のいずれかのタンパク質分子。
[本発明1035]
前記タンパク質導入ドメインがＴａｔである、本発明1034のタンパク質分子。
[本発明1036]
前記アミノ酸配列が1または複数のエピトープタグまたは精製タグをさらに含む、本発明1025から1035のいずれかのタンパク質分子。
[本発明1037]
前記エピトープタグがｖ5である、本発明1036のタンパク質分子。
[本発明1038]
前記精製タグが1または複数のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたは6−ヒスチジン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）である、本発明1036のタンパク質分子。
[本発明1039]
本発明1025から1038のいずれかのタンパク質分子と1または複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
[本発明1040]
対象における炎症状態を処置または予防するための方法であって、本発明1021、1024、または1039のいずれかの医薬組成物の治療上有効量を前記対象に与えることを含む、方法。
[本発明1041]
前記炎症状態が慢性創傷、皮膚炎、乾癬、または自己免疫疾患のうちの1または複数である、本発明1040の方法。
[本発明1042]
前記組成物がＴＧＦβおよびＮＦκＢシグナル伝達の抑制を介して炎症を減少させる、本発明1040の方法。
[本発明1043]
細胞増殖もしくは細胞遊走の1もしくは複数を増加させること、または、対象におけるアポトーシスもしくはＤＮＡ損傷の1もしくは複数を防止することのうちの1または複数を含む、対象における疾患または障害を予防または処置する方法であって、
本発明1021、1024、または1039のいずれかの医薬組成物の治療上有効量を前記対象に与えることを含み、細胞増殖もしくは細胞遊走の1もしくは複数を増加させること、または、アポトーシスもしくはＤＮＡ損傷の1もしくは複数を防止することのうちの1または複数が、前記疾患または障害の予防または処置に有用である、方法。
[本発明1044]
前記疾患または障害が慢性創傷、急性創傷、または粘膜炎の1または複数を含む、本発明1043の方法。
[本発明1045]
前記慢性創傷が糖尿病性潰瘍、圧迫潰瘍、静脈性潰瘍、または口腔潰瘍の1または複数を含む、本発明1044の方法。
[本発明1046]
急性創傷が外傷誘発性創傷、手術性創傷、または瘢痕の1または複数を含む、本発明1044の方法。
[本発明1047]
前記粘膜炎が放射線誘発粘膜炎または化学療法誘発粘膜炎の1または複数を含む、本発明1044の方法。
[本発明1048]
前記粘膜炎が口腔粘膜炎または消化管粘膜炎の1または複数を含む、本発明1044の方法。
本発明の他の目的、特徴および利点は、下記の詳細な説明によって明かとなる。しかしながら、本発明の詳細な説明、特異的な実施例および好適な実施例は例示として行われるものであって、この詳細な説明によって当業者に明らかになる各種の変更や修正は、本発明の精神および範囲内にあることを理解しなくてはならない。
以下の図面は、本明細書の一部をなし、本技術の特定の実施形態を示すために含まれる。実施形態は、これらの図面の１つまたは複数を、本明細書中に示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することにより、理解され得る。
Ｋ５．Ｓｍａｄ７マウスが放射線誘発口腔粘膜炎に対して耐性であったことを示すデータの例示的な実施形態を提供する。非照射のおよび照射を受けた（照射開始後９日目）野生型（ＷＴ）およびＫ５．Ｓｍａｄ７の舌でのＨ＆Ｅ染色の例示的な実施形態を提供する。ＷＴマウス由来の舌の画像にある縦方向の線は、潰瘍境界線を強調し、画像にある点線は上皮と間質との境界線を示す（スケールバー、５０μｍ）。点線は、基底膜を強調する。スケールバー：全てのパネルで５０μｍである。 Ｋ５．Ｓｍａｄ７マウスが放射線誘発口腔粘膜炎に対して耐性であったことを示すデータの例示的な実施形態を提供する。舌潰瘍の大きさ（平均±ｓ．ｅ．ｍ）の定量化のグラフ表示を提供する。８Ｇｙｘ３照射において、ＷＴマウスがｎ＝８およびＫ５．Ｓｍａｄ７マウスがｎ＝７であり；１８Ｇｙ照射において、ＷＴマウスがｎ＝５およびＫ５．Ｓｍａｄ７マウスがｎ＝４であり；２２−Ｇｙ照射において、ＷＴおよびＫ５．Ｓｍａｄ７マウスが１群あたりｎ＝５である。データを平均±ｓ．ｅ．ｍとして表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 Ｋ５．Ｓｍａｄ７マウスが放射線誘発口腔粘膜炎に対して耐性であったことを示すデータの例示的な実施形態を提供する。Ｈ＆Ｅ染色（左側）およびＣＤ４５染色（右側）を用いて視覚化した、ヒトの舌の咽頭室後方（上側）および放射線誘発舌粘膜炎（下側）の例示的な実施形態を提供する。実線は潰瘍境界線を示し、点線は基底膜を示す（スケールバー、２５μｍ）。点線は、基底膜を強調する。スケールバー：全てのパネルで５０μｍである。 Ｋ５．Ｓｍａｄ７マウスが放射線誘発口腔粘膜炎に対して耐性であったことを示すデータの例示的な実施形態を提供する。ＷＴマウス由来の潰瘍に隣接した照射切片およびＫ５．Ｓｍａｄ７マウス由来の障害領域（ＰＩ、ヨウ化プロピジウム）におけるＣＤ４５免疫染色、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、およびＴＵＮＥＬアッセイの例示的な実施形態を提供する。点線は、基底膜を示す（スケールバー、２５μｍ）。点線は、基底膜を強調する。スケールバー：全てのパネルで２５μｍである。 Ｋ５．Ｓｍａｄ７マウスが放射線誘発口腔粘膜炎に対して耐性であったことを示すデータの例示的な実施形態を提供する。図１Ｄの染色の定量化のグラフ表示を提供する（１群あたりｎ＝３または４）。データを平均±ｓ．ｄ．として表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 Ｋ５．Ｓｍａｄ７マウスが放射線誘発口腔粘膜炎に対して耐性であったことを示すデータの例示的な実施形態を提供する。図１Ｄの染色の定量化のグラフ表示を提供する（１群あたりｎ＝３または４）。データを平均±ｓ．ｄ．として表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＮＳ、両側スチューデントｔ検定では有意差は認められなかった。 Ｋ５．Ｓｍａｄ７マウスが放射線誘発口腔粘膜炎に対して耐性であったことを示すデータの例示的な実施形態を提供する。図１Ｄの染色の定量化のグラフ表示を提供する（１群あたりｎ＝３または４）。データを平均±ｓ．ｄ．として表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 Ｓｍａｄ７によって減弱される分子異常を示しているデータの例示的な実施形態を提供する。ＮＦ−κＢｐ５０、ＴＧＦ−β１、およびｐＳｍａｄ２の免疫染色の例示的な実施形態を提供する。野生型（ＷＴ）の照射舌切片を潰瘍に隣接させ、Ｋ５.Ｓｍａｄ７の切片を障害領域から得た。ヒト試料は、非照射口腔粘膜および放射線誘発粘膜炎から得た。点線は、上皮と間質との境界線を線引きする。スケールバーは、全てのパネルで２５μｍである。 Ｓｍａｄ７によって減弱される分子異常を示しているデータの例示的な実施形態を提供する。（図２Ａ）に示すＮＦ−κＢｐ５０およびｐＳｍａｄ２の免疫染色の定量化のグラフ表示を提供する。データを平均±ｓ．ｄ．として表し、両側スチューデントｔ検定を用いて、Ｐ値を求めた。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＮＳ、有意性無し。 Ｓｍａｄ７によって減弱される分子異常を示しているデータの例示的な実施形態を提供する。ＴＧＦ−β１のｑＲＴ−ＰＣＲの例示的な実施形態を提供する（Keratin 5により正規化）、０日目に１群あたりｎ＝６、７日目および９日目にｎ＝４、ならびに１０日目にｎ＝７）。データを平均±ｓ．ｄ．として表し、両側スチューデントｔ検定を用いて、Ｐ値を求めた。＊Ｐ＜０．０５。 Ｓｍａｄ７によって減弱される分子異常を示しているデータの例示的な実施形態を提供する。ヒト口腔ケラチノサイト遊走（図８の画像を参照）の定量化のグラフ表示を提供する。スクランブル、スクランブルｓｉＲＮＡ。１群あたりｎ＝３。データを平均±ｓ．ｄ．として表し、両側スチューデントｔ検定を用いて、Ｐ値を求めた。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 Ｓｍａｄ７によって減弱される分子異常を示しているデータの例示的な実施形態を提供する。Ｓｍａｄ７ノックダウンの７２時間後に、Ｓｍａｄ７およびＲａｃ１についてのｓｉＳｍａｄ７−１およびｓｉＳｍａｄ７−２のノックダウン効率のウェスタン分析の例示的な実施形態を提供する。Ｍ、分子マーカー。 Ｓｍａｄ７によって減弱される分子異常を示しているデータの例示的な実施形態を提供する。全ておよび活性化された（ＧＴＰ結合）Ｒａｃ１タンパク質のウェスタン分析の例示的な実施形態を提供する。Ｍ：分子マーカー。 Ｓｍａｄ７によって減弱される分子異常を示しているデータの例示的な実施形態を提供する。Ｓｍａｄ７媒介ケラチノサイト遊走に対するＲａｃ１ノックダウンの効果の定量化を示すグラフを提供する（図９Ａのノックダウン効率と図９Ｄの画像とを参照）。１群あたりｎ＝３。データを平均±ｓ．ｄ．として表し、両側スチューデントｔ検定を用いて、Ｐ値を求めた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 Ｒａｃ１プロモーターのＳＢＥに対する個々のＳｍａｄおよびＣｔＢＰ１の結合を抑制することによって、Ｓｍａｄ７増加Ｒａｃ１発現を示すデータの例示的な実施形態を提供する。野生型（ＷＴ）およびＳｍａｄ７トランスジェニックケラチノサイトに含まれるＲａｃ１ｍＲＮＡの定量化を示すグラフを提供する。１群あたりｎ＝４。データを平均±ｓ．ｄとして表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊Ｐ＜０．０５。 Ｒａｃ１プロモーターのＳＢＥに対する個々のＳｍａｄおよびＣｔＢＰ１の結合を抑制することによって、Ｓｍａｄ７増加Ｒａｃ１発現を示すデータの例示的な実施形態を提供する。ＷＴおよびＳｍａｄ７ケラチノサイトにおけるＧＴＰ−Ｒａｃ１および総Ｒａｃ１のウェスタン分析の例示的な実施形態を提供する。ＷＴおよびＳｍａｄ７ケラチノサイトのＳｍａｄ７タンパク質レベルを、Ｓｍａｄ７に対する抗体を用いたチューブリンウェスタンブロットによって決定した（図１０Ａ〜Ｂの追加のウェスタンブロットおよび定量化を参照）。 Ｒａｃ１プロモーターのＳＢＥに対する個々のＳｍａｄおよびＣｔＢＰ１の結合を抑制することによって、Ｓｍａｄ７増加Ｒａｃ１発現を示すデータの例示的な実施形態を提供する。ヒトケラチノサイトの個々のＳｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、またはＳｍａｄ４をノックダウンした後のＲａｃ１タンパク質レベルのウェスタン分析の例示的な実施形態を提供する（Ｓｍａｄノックダウン効率については図１０Ｃ〜１０Ｅを参照）。 Ｒａｃ１プロモーターのＳＢＥに対する個々のＳｍａｄおよびＣｔＢＰ１の結合を抑制することによって、Ｓｍａｄ７増加Ｒａｃ１発現を示すデータの例示的な実施形態を提供する。ＷＴおよびＳｍａｄ７トランスジェニックケラチノサイトのＲａｃ１プロモーターの−１．５ｋｂＳＢＥ部位に対するＳｍａｄ−２、−３、−４、および−７の結合についてのＣｈＩＰアッセイの例示的な実施形態を提供する。 Ｒａｃ１プロモーターのＳＢＥに対する個々のＳｍａｄおよびＣｔＢＰ１の結合を抑制することによって、Ｓｍａｄ７増加Ｒａｃ１発現を示すデータの例示的な実施形態を提供する。マウスケラチノサイトにおけるＲａｃ１ルシフェラーゼレポーターアッセイを示すグラフを提供する。スクランブル、スクランブルｓｉＲＮＡ。ｎ＝６。データを平均±ｓ．ｄとして表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊Ｐ＜０．０５。 Ｒａｃ１プロモーターのＳＢＥに対する個々のＳｍａｄおよびＣｔＢＰ１の結合を抑制することによって、Ｓｍａｄ７増加Ｒａｃ１発現を示すデータの例示的な実施形態を提供する。ＷＴまたはＳｍａｄ７トランスジェニックケラチノサイトにおいてＳＢＥまたは変異型（ｍｕｔ）ＳＢＥを含むＲａｃ１ルシフェラーゼレポーターの活性の定量を示すグラフを提供する。ｎ＝６。データを平均±ｓ．ｄとして表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 Ｒａｃ１プロモーターのＳＢＥに対する個々のＳｍａｄおよびＣｔＢＰ１の結合を抑制することによって、Ｓｍａｄ７増加Ｒａｃ１発現を示すデータの例示的な実施形態を提供する。ＷＴまたはＫ５.Ｓｍａｄ７ケラチノサイトにおけるＲａｃ１プロモーターのＳＢＥ−１．５Ｋｂ部位に対するＣｔＢＰ１結合についてのＣｈＩＰアッセイの画像の例示的な実施形態を提供する。 Ｒａｃ１プロモーターのＳＢＥに対する個々のＳｍａｄおよびＣｔＢＰ１の結合を抑制することによって、Ｓｍａｄ７増加Ｒａｃ１発現を示すデータの例示的な実施形態を提供する。ＷＴおよびＳｍａｄ７トランスジェニックケラチノサイトにおいて、図３Ｇに示すＳＢＥに対するＣｔＢＰ１結合についてのＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ定量を示すグラフを提供する。ｎ＝４。データを平均±ｓ．ｄとして表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊＊Ｐ＜０．０１。 ケラチノサイト遊走の阻害に貢献するＣｔＢＰ１関連Ｒａｃ１抑制を示すデータの例示的な実施形態を提供する。ヒト口腔ケラチノサイトにおけるＣｔＢＰ１ノックダウン後のＲａｃ１タンパク質についてのウェスタン分析の例示的な実施形態を提供する。 ケラチノサイト遊走の阻害に貢献するＣｔＢＰ１関連Ｒａｃ１抑制を示すデータの例示的な実施形態を提供する。ＳＢＥ含有Ｒａｃ１ ｌｕｃレポーター活性の定量を示すグラフを提供する。ｎ＝６。データを平均±s.dとして表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ケラチノサイト遊走の阻害に貢献するＣｔＢＰ１関連Ｒａｃ１抑制を示すデータの例示的な実施形態を提供する。ヒト口腔ケラチノサイト遊走に対するＣｔＢＰ１ノックダウンの効果の定量を示すグラフを提供する。１群あたりｎ＝３。データを平均±s.dとして表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ケラチノサイト遊走の阻害に貢献するＣｔＢＰ１関連Ｒａｃ１抑制を示すデータの例示的な実施形態を提供する。ＣｔＢＰ１の免疫染色の例示的な実施形態を提供する。照射切片を潰瘍（ＷＴ）または障害領域（Ｋ５.Ｓｍａｄ７）に隣接させた。点線は基底膜を示す。スケールバーは、全てのパネルで５０μｍである。 ケラチノサイト遊走の阻害に貢献するＣｔＢＰ１関連Ｒａｃ１抑制を示すデータの例示的な実施形態を提供する。ヒト試料の非照射口腔粘膜および放射線誘発粘膜炎におけるＣｔＢＰ１の免疫染色の例示的な実施形態を提供する。点線は基底膜を示す。スケールバーは、両パネルとも５０μｍである。 ケラチノサイト遊走の阻害に貢献するＣｔＢＰ１関連Ｒａｃ１抑制を示すデータの例示的な実施形態を提供する。図４Ｄ〜ＥにおけるＣｔＢＰ１核陽性細胞の定量を示すグラフを提供する。１群あたりｎ＝３または４。データを平均±s.dとして表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ケラチノサイト遊走の阻害に貢献するＣｔＢＰ１関連Ｒａｃ１抑制を示すデータの例示的な実施形態を提供する。ＣｔＢＰ１のｑＲＴ−ＰＣＲの定量を示すグラフを提供する（Keratin K5により正規化）。０日目に１群あたりｎ＝６、７日目および９日目にｎ＝４、ならびに１０日目にｎ＝７。データを平均±s.dとして表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 経口Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７投与がマウスの放射線誘発口腔粘膜炎を予防したことを示すデータの例示的な実施形態を提供する。８Ｇｙｘ３照射の開始後、９日目での口腔粘膜炎潰瘍の大きさの定量を示すグラフを提供する。ビヒクル＝生理的食塩水または５０％グリセロール/ＰＢＳ。データを平均±ｓ．ｅ．ｍとして表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 経口Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７投与がマウスの放射線誘発口腔粘膜炎を予防したことを示すデータの例示的な実施形態を提供する。８Ｇｙｘ３照射の開始から９日目における病理学的変化の例示的な実施形態を提供する。ビヒクル＝生理的食塩水または５０％グリセロール／ＰＢＳ。スケールバーは、Ｈ＆Ｅパネルについては５０μｍ、残りのパネルについては２５μｍ。点線は上皮と間質との境界線を線引きし、実線は潰瘍境界線を強調する。 経口Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７投与がマウスの放射線誘発口腔粘膜炎を予防したことを示すデータの例示的な実施形態を提供する。図５Ｂに示す免疫染色の定量を示すグラフを提供する。１群あたりｎ＝３または４。データを平均±ｓ．ｄ．として表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 経口Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７投与がマウスの放射線誘発口腔粘膜炎を予防したことを示すデータの例示的な実施形態を提供する。図５Ｂに示す免疫染色の定量を示すグラフを提供する。１群あたりｎ＝３または４。データを平均±ｓ．ｄ．として表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＮＳ、有意差無し。 経口Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７投与がマウスの放射線誘発口腔粘膜炎を予防したことを示すデータの例示的な実施形態を提供する。図５Ｂに示す免疫染色の定量を示すグラフを提供する。１群あたりｎ＝３または４。データを平均±ｓ．ｄ．として表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＮＳ、有意差無し。 経口Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７投与がマウスの放射線誘発口腔粘膜炎を予防したことを示すデータの例示的な実施形態を提供する。図５Ｂに示す免疫染色の定量を示すグラフを提供する。１群あたりｎ＝３または４。データを平均±ｓ．ｄ．として表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＮＳ、有意差無し。 経口Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７投与がマウスの放射線誘発口腔粘膜炎を予防したことを示すデータの例示的な実施形態を提供する。図５Ｂに示す免疫染色の定量を示すグラフを提供する。１群あたりｎ＝３または４。データを平均±ｓ．ｄ．として表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊＊Ｐ＜０．０１。ＮＳ、有意差無し。 口腔粘膜炎に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置を示すデータの例示的な実施形態を示す。８Ｇｙｘ３照射の開始後、１０日目に測定した潰瘍の大きさの定量を示すグラフを提供する。グリセロール＝５０％グリセロール／ＰＢＳ。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表され、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＮＳ、有意差無し。 口腔粘膜炎に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置を示すデータの例示的な実施形態を示す。口腔粘膜のＨ＆Ｅ染色の例示的な実施形態を提供する。上側パネル：パリフェルミン処置粘膜に開放性潰瘍あり、Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７処置粘膜に開放性潰瘍なし。下側パネル：パリフェルミン処置粘膜とＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置粘膜との間における上皮の厚さの比較。点線は、基底膜を線引きする。縦方向の線は、潰瘍境界線を強調する。スケールバーは、全てのパネルで５０μｍである。 口腔粘膜炎に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置を示すデータの例示的な実施形態を示す。潰瘍が治癒した後の２０Ｇｙ誘発口腔粘膜炎におけるＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置の免疫染色の例示的な実施形態を提供する。Ｖ５免疫染色は、口腔上皮（切片は障害領域から離れている）のＴａｔ−Ｓｍａｄ７を視覚化する。Ｋ１４免疫染色を対比染色として用いた。点線は、基底膜を線引きする。スケールバーは、全てのパネルで２５μｍである。 口腔粘膜炎に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置を示すデータの例示的な実施形態を示す。８Ｇｙｘ３照射開始後１０日目のＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置マウス舌のＲａｃ１ウェスタン分析の例示的な実施形態を提供する。 口腔粘膜炎に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置を示すデータの例示的な実施形態を示す。処置後４８時間のＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置正常ヒト口腔ケラチノサイトに対するＲａｃ１ウェスタン分析の例示的な実施形態を提供する。 口腔粘膜炎に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置を示すデータの例示的な実施形態を示す。ヒト口腔ケラチノサイト遊走に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置の効果の例示的な実施形態を提供する（ＮＯＫ−ＳＩ、図１３Ａの画像を参照）。１群あたりｎ＝４。データは、平均±ｓ．ｄ．として表され、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 口腔粘膜炎に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置を示すデータの例示的な実施形態を示す。Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７処置の有無によるＮＯＫ−ＳＩケラチノサイトならびにＳＣＣ株（Ｃａｌ２７およびＭＳＫ９２１）の生存曲線の定量を示すグラフである。各照射線量につき１群あたりｎ＝４。データは、平均±ｓ．ｄ．として表され、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊Ｐ＜０．０５。 Ｋ５.Ｓｍａｄ７口腔粘膜組織が放射線誘発口腔粘膜炎耐性であったことを示すデータの例示的な実施形態を提供する。Ｓｍａｄ７ウェスタンブロットの例示的な実施形態を提供する：非照射野生型（ＷＴ）舌では検出不能で、照射後にわずかに検出可能であった。Ｋ５.Ｓｍａｄ７舌は、照射前後で比較可能なＳｍａｄ７タンパク質レベルを有する。Ｍ：分子マーカー。 Ｋ５.Ｓｍａｄ７口腔粘膜組織が放射線誘発口腔粘膜炎耐性であったことを示すデータの例示的な実施形態を提供する。Ｓｍａｄ７免疫染色の例示的な実施形態を提供する。一部の照射上皮細胞の核が肥大していることに留意すべきである。点線は、上皮と間質との境界線を線引きする。スケールバーは、すべてのパネルについて５０μｍである。 Ｋ５.Ｓｍａｄ７口腔粘膜組織が放射線誘発口腔粘膜炎耐性であったことを示すデータの例示的な実施形態を提供する。Ｋ５.Ｓｍａｄ７マウスにおける口腔粘膜炎誘発病的状態の発生率減少の定量を示すグラフを提供する。フィッシャーの正確確率アッセイを用いてp値を計算する。＊＊Ｐ＝０．００７。 Ｋ５.Ｓｍａｄ７口腔粘膜組織が放射線誘発口腔粘膜炎耐性であったことを示すデータの例示的な実施形態を提供する。ＷＴ口腔粘膜炎と比較して、好中球（Ｌｙ−６Ｇ）、マクロファージ（ＢＭ８）、および活性化Ｔ細胞（ＣＤ４）の浸潤減少を示すＫ５.Ｓｍａｄ７舌の免疫染色の例示的な実施形態を提供する。点線は、上皮と間質との境界線を線引きする。スケールバーは、すべてのパネルについて５０μｍである。 Ｋ５.Ｓｍａｄ７口腔粘膜組織が放射線誘発口腔粘膜炎耐性であったことを示すデータの例示的な実施形態を提供する。照射前後のＷＴ口腔粘膜とＫ５.Ｓｍａｄ７口腔粘膜との間でｐＳｍａｄ１／５／８核陽性細胞（緑色）の有意な差がないことを示す免疫染色の例示的な実施形態を提供する。ケラチン（Ｋ１４）免疫染色（赤色）は、上皮区画を強調する。照射上皮細胞の核が肥大していることに留意すべきである。スケールバーは、すべてのパネルについて５０μｍである。 自然発生的に不死化されたヒト口腔上皮細胞（ＮＯＫ−ＳＩ）の遊走はＳｍａｄ７をノックダウンすることにより遅れたがＴＧＦ−β１をノックダウンすることにより加速されたことを示すデータの、例示的な実施形態を提供する。細胞遊走の典型的な画像の例示的な実施形態を提供する。点線の対は、掻創を線引きする。Ｓｍａｄ７ノックダウンの細胞遊走および効率の定量は、図２Ｄおよび図２Ｅ（上記）に示される。スクランブル、スクランブルｓｉＲＮＡ。 自然発生的に不死化されたヒト口腔上皮細胞（ＮＯＫ−ＳＩ）の遊走はＳｍａｄ７をノックダウンすることにより遅れたがＴＧＦ−β１をノックダウンすることにより加速されたことを示すデータの、例示的な実施形態を提供する。細胞遊走の典型的な画像の例示的な実施形態を提供する。点線の対は、掻創を線引きする。Ｓｍａｄ７ノックダウンの細胞遊走および効率の定量は、図２Ｄおよび図２Ｅ（上記）に示される。スクランブル、スクランブルｓｉＲＮＡ。 自然発生的に不死化されたヒト口腔上皮細胞（ＮＯＫ−ＳＩ）の遊走はＳｍａｄ７をノックダウンすることにより遅れたがＴＧＦ−β１をノックダウンすることにより加速されたことを示すデータの、例示的な実施形態を提供する。３回の別々の実験からのＴＧＦ−β１ノックダウン後の細胞遊走の定量を示すグラフを提供する。データを平均±s.dとして表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。ＮＳ、有意差無し。 自然発生的に不死化されたヒト口腔上皮細胞（ＮＯＫ−ＳＩ）の遊走はＳｍａｄ７をノックダウンすることにより遅れたがＴＧＦ−β１をノックダウンすることにより加速されたことを示すデータの、例示的な実施形態を提供する。ＴＧＦ−β１ノックダウン効率を示すｑＲＴ−ＰＣＲを示すグラフを提供する。データを平均±s.dとして表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊Ｐ＜０．０５。 Ｒａｃ１をノックダウンすることで野生型（ＷＴ）およびＳｍａｄ７トランスジェニックケラチノサイトの増殖および遊走が減少したことを示すデータの例示的な実施形態を提供する。Ｒａｃ１ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲａｃ１−１、ｓｉＲａｃ１−２）トランスフェクションの４８時間後にＲａｃ１のウェスタンブロット分析の例示的な実施形態を提供する。対照、スクランブルｓｉＲＮＡ。 Ｒａｃ１をノックダウンすることで野生型（ＷＴ）およびＳｍａｄ７トランスジェニックケラチノサイトの増殖および遊走が減少したことを示すデータの例示的な実施形態を提供する。Ｒａｃ１ノックダウン有りまたは無しでのＢｒｄＵ取り込みアッセイにおいてＷＴおよびＳｍａｄ７培養細胞のうちのＢｒｄＵ標識細胞の割合を示すグラフを提供する。３回の別々の実験からのデータを平均±ｓ．ｄ．として表した。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 Ｒａｃ１をノックダウンすることで野生型（ＷＴ）およびＳｍａｄ７トランスジェニックケラチノサイトの増殖および遊走が減少したことを示すデータの例示的な実施形態を提供する。（図９Ｂ）に存在するＢｒｄＵ陽性細胞の典型的な免疫蛍光法の例示的な実施形態を提供する。ケラチン１４（Ｋ１４、赤色）に対する抗体を対比染色に用いた。 Ｒａｃ１をノックダウンすることで野生型（ＷＴ）およびＳｍａｄ７トランスジェニックケラチノサイトの増殖および遊走が減少したことを示すデータの例示的な実施形態を提供する。Ｒａｃ１ノックダウン後のＳｍａｄ７トランスジェニックおよびＷＴケラチノサイトのインビトロ細胞遊走アッセイの例示的な実施形態を提供する。点線の対は、掻創を線引きする。細胞の定量を図２Ｇに示す。 Ｒａｃ１プロモーターのＳＢＥに対するＳｍａｄおよびＣｔＢＰ１の結合を抑制することによるＳｍａｄ７増加Ｒａｃ１発現を示すデータの例示的な実施形態を提供する。Ｓｍａｄ７トランスジェニックケラチノサイトのＧＴＰ−Ｒａｃ１および総Ｒａｃ１のウェスタンブロット分析の例示的な実施形態を提供する。追加の試料を図３Ｂに示す。Ｍ：分子マーカー。 Ｒａｃ１プロモーターのＳＢＥに対するＳｍａｄおよびＣｔＢＰ１の結合を抑制することによるＳｍａｄ７増加Ｒａｃ１発現を示すデータの例示的な実施形態を提供する。図１０Ａおよび図３Ｂに示すＷＴおよびＫ５．Ｓｍａｄ７ケラチノサイトのＧＴＰ−Ｒａｃ１、総Ｒａｃ１、およびＳｍａｄ７の定量を示すグラフを提供する。ＷＴケラチノサイトのタンパク質レベルについての各ブロットを「１」として正規化した。データを平均±ｓ．ｄ．として表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 Ｒａｃ１プロモーターのＳＢＥに対するＳｍａｄおよびＣｔＢＰ１の結合を抑制することによるＳｍａｄ７増加Ｒａｃ１発現を示すデータの例示的な実施形態を提供する。ＮＯＫ−ＳＩ細胞でのＳｍａｄ２ノックダウンのウェスタンブロット分析の例示的な実施形態を提供する。Ｒａｃ１発現に対するその効果を図３Ｃに示す。Ｍ：分子マーカー。ＧＡＰＤＨ、同じブロットの再探索による内部タンパク質対照。 Ｒａｃ１プロモーターのＳＢＥに対するＳｍａｄおよびＣｔＢＰ１の結合を抑制することによるＳｍａｄ７増加Ｒａｃ１発現を示すデータの例示的な実施形態を提供する。ＮＯＫ−ＳＩ細胞でのＳｍａｄ３ノックダウンのウェスタンブロット分析の例示的な実施形態を提供する。Ｒａｃ１発現に対するその効果を図３Ｃに示す。Ｍ：分子マーカー。ＧＡＰＤＨ、同じブロットの再探索による内部タンパク質対照。 Ｒａｃ１プロモーターのＳＢＥに対するＳｍａｄおよびＣｔＢＰ１の結合を抑制することによるＳｍａｄ７増加Ｒａｃ１発現を示すデータの例示的な実施形態を提供する。ＮＯＫ−ＳＩ細胞でのＳｍａｄ４ノックダウンのウェスタンブロット分析の例示的な実施形態を提供する。Ｒａｃ１発現に対するその効果を図３Ｃに示す。Ｍ：分子マーカー。ＧＡＰＤＨ、同じブロットの再探索による内部タンパク質対照。 Ｒａｃ１プロモーターのＳＢＥに対するＳｍａｄおよびＣｔＢＰ１の結合を抑制することによるＳｍａｄ７増加Ｒａｃ１発現を示すデータの例示的な実施形態を提供する。ＣｔＢＰ１ノックダウンがＮＯＫ−ＳＩ細胞遊走を促進することを示す例示的な実施形態を提供する。点線の対は、掻創を線引きする。ＣｔＢＰ１ノックダウンの細胞遊走および効率の定量を図４Ａおよび図４Ｃに示す。 Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７およびＴａｔ−Ｃｒｅタンパク質の精製および特徴づけを示すデータの例示的な実施形態を提供する。Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７タンパク質の例示的な実施形態を示す模式図である。記載順にそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９および１０１を開示する。 Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７およびＴａｔ−Ｃｒｅタンパク質の精製および特徴づけを示すデータの例示的な実施形態を提供する。精製Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７タンパク質のウェスタンブロットの例示的な実施形態を提供する。 Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７およびＴａｔ−Ｃｒｅタンパク質の精製および特徴づけを示すデータの例示的な実施形態を提供する。ケラチノサイトにおけるＴａｔ−Ｓｍａｄ７タンパク質導入の免疫染色の例示的な実施形態を提供する。左側および中央のパネル：Ｖ５抗体を用いたＴａｔ−Ｓｍａｄ７染色（緑色）、Ｋ１４抗体により対比染色（赤色）。細胞は、導入５分後に核内に、導入１２時間後に核内および細胞質内に、Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７を示した。右側のパネル：Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７はＳｍａｄ２リン酸化を抑止した（ｐＳｍａｄ２、緑色）。Ｖ５（赤色）対比染色は、Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７導入細胞を視覚化する。 Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７およびＴａｔ−Ｃｒｅタンパク質の精製および特徴づけを示すデータの例示的な実施形態を提供する。Ｖ５抗体染色がＴａｔ−Ｓｍａｄ７局所適用の１２時間後に、頬粘膜でのＴａｔ−Ｓｍａｄ７ 導入を検出することを示す、免疫染色の例示的な実施形態を提供する。Ｋ１４抗体を対比染色に用いた。スケールバー、両パネルとも５０μｍである。 Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７およびＴａｔ−Ｃｒｅタンパク質の精製および特徴づけを示すデータの例示的な実施形態を提供する。図１１Ａに示す同一のＴａｔおよびＶ５タグを有する精製Ｔａｔ−Ｃｒｅタンパク質のウェスタンブロットの例示的な実施形態を提供する。 Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７およびＴａｔ−Ｃｒｅタンパク質の精製および特徴づけを示すデータの例示的な実施形態を提供する。Ｔａｔ−Ｃｒｅの活性を示すアガロースゲルの例示的な実施形態を提供する。Ｔａｔ−Ｃｒｅは、７６５０ｂｐベクターｐＬＬ３．７から１，４６０ｂｐのフロックスド（floxed）フラグメントを切り出す。 Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７およびＴａｔ−Ｃｒｅタンパク質の精製および特徴づけを示すデータの例示的な実施形態を提供する。Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７タンパク質予防的処置が２０Ｇｙ放射線誘発口腔潰瘍を減少させたことを示すグラフを提供する。データを平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す。両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 口腔粘膜炎に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置の効果を示すデータの例示的な実施形態を提供する。Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７（毎日０．８μｇ、６日目から９日目）処置口腔粘膜における潰瘍の大きさの減少についての定量を示すグラフを提供する。試料を１０日目に回収した。１群あたりｎ＝８。データを平均±ｓ．ｅ．ｍで表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 口腔粘膜炎に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置の効果を示すデータの例示的な実施形態を提供する。図１２Ａからの試料に対する分子マーカーの免疫染色の例示的な実施形態を提供する。スケールバーは、上側の２つのパネルで５０μｍであり、他のパネルで２５μｍである。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）およびＫ１４を対比染色として用いた。 口腔粘膜炎に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置の効果を示すデータの例示的な実施形態を提供する。図１２Ｃに示す免疫染色の定量を示すグラフである。３〜４つの試料を使用した。データを平均±ｓ．ｄで表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊Ｐ＜０．０５。 口腔粘膜炎に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置の効果を示すデータの例示的な実施形態を提供する。図１２Ｃに示す免疫染色の定量を示すグラフである。３〜４つの試料を使用した。データを平均±ｓ．ｄで表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 口腔粘膜炎に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置の効果を示すデータの例示的な実施形態を提供する。図１２Ｃに示す免疫染色の定量を示すグラフである。３〜４つの試料を使用した。データを平均±ｓ．ｄで表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 口腔粘膜炎に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置の効果を示すデータの例示的な実施形態を提供する。図１２Ｃに示す免疫染色の定量を示すグラフである。３〜４つの試料を使用した。データを平均±ｓ．ｄで表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 口腔粘膜炎に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置の効果を示すデータの例示的な実施形態を提供する。図１２Ｃに示す免疫染色の定量を示すグラフである。３〜４つの試料を使用した。データを平均±ｓ．ｄで表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 口腔粘膜炎に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置の効果を示すデータの例示的な実施形態を提供する。ルシフェラーゼアッセイの定量を示すグラフである。Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７処置は、マウスケラチノサイトにおいて、ＳＢＥを有するＲａｃ１プロモーターの活性を高めるが、変異型ＳＢＥを有するものでは高めない。データを平均±ｓ．ｄで表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＮＳ、有意差無し。 口腔粘膜炎に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置の効果を示すデータの例示的な実施形態を提供する。Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７処理マウスケラチノサイトにおいてマウスＲａｃ１プロモーターのＳＢＥに対するＣｔＢＰ１結合のＣｈＩＰアッセイの例示的な実施形態を提供する。 ヒトケラチノサイトおよび腫瘍細胞株の遊走に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処理の効果を示すデータの例示的な実施形態を提供する。Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７がＮＯＫ−ＳＩ細胞遊走を加速することを示す例示的な実施形態を提供する。４つの別々の実験からの定量を図６Ｆ（上記）に示す。点線の対は、初期創傷を線引きする。 ヒトケラチノサイトおよび腫瘍細胞株の遊走に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処理の効果を示すデータの例示的な実施形態を提供する。減衰放射線誘発ｐＳｍａｄ２およびＮＦ−κＢｐ５０核局在化を示すＮＯＫ−ＳＩ細胞におけるＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置の免疫染色の例示的な実施形態を提供する。 ヒトケラチノサイトおよび腫瘍細胞株の遊走に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処理の効果を示すデータの例示的な実施形態を提供する。Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７処置２時間後のＭＳＫ９２１細胞のＶ５染色を示す例示的な実施形態を提供する。Ｋ１４染色を対比染色として用いた。 ヒトケラチノサイトおよび腫瘍細胞株の遊走に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処理の効果を示すデータの例示的な実施形態を提供する。Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７処置後６０時間のＭＳＫ９２１におけるＲａｃ１ウェスタン分析の例示的な実施形態を提供する。Ｍ：分子マーカー。 ヒトケラチノサイトおよび腫瘍細胞株の遊走に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処理の効果を示すデータの例示的な実施形態を提供する。３回の別々の実験からのＭＳＫ９２１細胞遊走の定量を示すグラフを提供する。データを平均±ｓ．ｄ．で表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。ＮＳ、有意差無し。 ヒトケラチノサイトおよび腫瘍細胞株の遊走に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処理の効果を示すデータの例示的な実施形態を提供する。Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７およびＰＢＳにより処理された典型的なＭＳＫ９２１細胞遊走を示す例示的な実験を提供する。実線の対は、初期創傷を線引きする。点線は、遊走細胞の最前部を強調する。 ヒトケラチノサイトおよび腫瘍細胞株の遊走に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処理の効果を示すデータの例示的な実施形態を提供する。３回の別々の実験からのＣａｌ２７細胞遊走の定量を示すグラフを提供する。データを平均±ｓ．ｄ．で表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。ＮＳ、有意差無し。 ヒトケラチノサイトおよび腫瘍細胞株の遊走に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７処理の効果を示すデータの例示的な実施形態を提供する。図１３Ｇに関する典型的な画像を示す例示的な実施形態を提供する。実線の対は、初期創傷を線引きする。点線は、遊走細胞の最前部を強調する。 口腔粘膜炎のＳｍａｄ７媒介防護および治癒の潜在的機序の概要を説明する模式図を示す。放射線がどのようにＮＦ−κＢを活性化させ、ＴＧＦ−β１およびＣｔＢＰ１を増加させるかを説明する模式図を示す。ＮＦ−κＢおよびＴＧＦ−β１は、炎症を誘発する。ＴＧＦ−β１は、アポトーシス、成長停止を誘発するとともに、Ｓｍａｄ−２、−３、および−４を活性化し、それらがＲａｃ１プロモーターにＣｔＢＰ１を動員してＲａｃ１転写を抑制することで再上皮形成の鈍化をもたらす。 口腔粘膜炎のＳｍａｄ７媒介防護および治癒の潜在的機序の概要を説明する模式図を示す。Ｓｍａｄ７がどのように、ＮＦ−κＢとＴＧＦ−β１とによって誘発された炎症を妨げて、ＴＧＦ−β１によって誘発されたアポトーシスおよび成長停止を妨げるかということを説明する模式図を表す。Ｓｍａｄ７は、ＴＧＦ−β１媒介Ｓｍａｄ活性化（リン酸化）を防止することまたはＲａｃ１プロモーターと結合する際にシグナル伝達Ｓｍａｄ／ＣｔＢＰ１転写抑制複合体と競合することのいずれかによって、Ｒａｃ１転写抑制を軽減する。Ｓｍａｄ７によって誘発されるＲａｃ１の増加は、再上皮形成の間、ケラチノサイト遊走に寄与する。 タンパク質パートナー、潜在的標的効果、および潜在的生理作用に関連したＳｍａｄ７ドメインを説明する模式図である。 図１６Ａ〜Ｂは、マウス創傷治癒モデルで創傷治癒を加速するトランケートＳｍａｄ７タンパク質の能力を示すグラフである。図１６Ａは、完全長Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７と対照（ＰＢＳ）と比較した、経時的な平均創傷治癒率に対するＣ末端トランケート（２５９〜４２６ａａ）Ｔａｔ−Ｃ−Ｓｍａｄ７の効果を示すグラフである。各々の群についてｎ＝３。図１６Ｂは、完全長Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７と対照（ＰＢＳ）と比較した、経時的な平均創傷治癒率に対するＴａｔ−Ｎ−Ｓｍａｄ７（１〜２５８ａａ）の効果を示すグラフである。各々の群についてｎ＝６。データを平均±ｓ．ｄとして表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊ｐ＜０．０５ 対照（ＰＢＳ）と比較、＃ｐ＜０．０５ Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７と比較。 図１７Ａ〜Ｃは、Ｓｍａｄ７が障害性創傷治癒モデルで創傷治癒を加速することを示す写真およびグラフである。図１７Ａは、１３日間にわたってＰＢＳまたはＴａｔ−Ｓｍａｄ７で処置した糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）マウスにおける創傷の肉眼的外観を示すデジタル写真である。図１７Ｂは、ＲＥＧＲＡＮＥＸ（登録商標）および対照（ＰＢＳ）と比較した、経時的な平均創傷治癒率に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７の効果を示すグラフである。各々の群についてｎ＝６。データを平均±ｓ．ｄとして表し、両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を求めた。＊ｐ＜０．０５ 対照（ＰＢＳ）と比較。図１７Ｃは、創傷後８日目で採取した創傷試料の組織学的比較である。対照（ＰＢＳ）ｄｂ／ｄｂマウス（上側パネル）の画像中の垂直方向の点線は、創傷境界を強調する。
詳細な説明
本明細書中にさらに説明されるように、開示は、Ｓｍａｄ７タンパク質ならびにその生物活性フラグメントおよび誘導体と、そのようなタンパク質をコードする核酸と、そのような核酸を含むベクターと、そのようなベクター、核酸、および／またはタンパク質を包含する細胞とを提供し、それらすべてが薬物の処方と、１または複数の疾患または障害の処置および／または予防とに、用いられる。１または複数の疾患または障害の処置および／または予防に有用な、Ｓｍａｄ７タンパク質ならびにその生物活性フラグメントおよび誘導体を製造およびスクリーニングするための方法も提供する。Ｓｍａｄ７への暴露に関連した１または複数のマーカーを用いて処置に対する応答を予測および／または評価する方法も提供する。そのようなマーカーとして、限定されるものではないが、細胞遊走用のＲａｃ１、炎症用のＮＦ−κＢ、ならびに成長停止および炎症用のＴＧＦ−βを挙げることができる。
Ｓｍａｄ７で処置可能な疾患および障害として、細胞増殖の減少、細胞遊走の減少、細胞死の増加、過度の炎症、および／またはＤＮＡの損傷のうちの１または複数を含む疾患および障害を挙げることができる。Ｓｍａｄ７で処置可能な疾患および障害として、限定されるものではないが、増殖を増加させること、細胞死を減らすか抑制すること、過度の炎症を減らすこと、DNA 損傷を予防すること、および／または細胞遊走を増加させることなどのうちの１または複数の活性を有するＳｍａｄ７タンパク質ならびにその生物活性フラグメントおよび誘導体によって処置される疾患および障害を、挙げることができる。そのような疾患および／または障害は、限定されるものではないが、急性（例えば、外科手術、格闘、外傷による）および慢性創傷（例えば、糖尿病性、褥瘡性、静脈性の潰瘍）、瘢痕、線維症、および異常治癒、粘膜炎（例えば、口腔および／または胃腸）、口内炎、直腸炎、自己免疫疾患（例えば、乾癬、関節炎）、ならびに癌を挙げることができる。
広範囲なアポトーシスとケラチノサイト増殖鈍化による上皮剥離を克服することは、口腔粘膜炎の予防および処置にとって、重要である。Ｓｍａｄ７の増殖促進効果および抗アポトーシス効果は、上皮細胞に対して強力な成長抑制物質およびアポトーシス誘導物質であるＴＧＦ−β１を増加させた場合、正常な口腔粘膜よりも口腔粘膜炎でより明確であった。
理論に束縛されることを望まないが、Ｒａｃ１活性化の増大が、創傷閉鎖におけるＳｍａｄ７媒介ケラチノサイト遊走の主な原因であると考えられる。Ｓｍａｄ非依存的メカニズムを介した癌細胞におけるＲｈｏ／Ｒａｃ活性化においてＴＧＦ−βシグナル伝達が果たす役割が実証された（Dernyck et al, Nature 415:577-584, 2003）ことを考慮すると、この発見は予想外である。
口腔粘膜炎の間、Ｓｍａｄシグナル伝達の増加（ｐＳｍａｄ２の増加により明らか）とＳｍａｄ転写コリプレッサーＣｔＢＰ１により、Ｓｍａｄ依存的なＲａｃ１抑制がＳｍａｄ非依存的なＲａｃ１活性化（存在するならば）を克服すると考えられる。この抑制がＳｍａｄ７によって部分的に抑止されると、Ｒａｃ１活性化に媒介されるケラチノサイト遊走が可能になる。しかしながら、口腔癌細胞では、シグナル伝達Ｓｍａｄが無くなるか不活性化され、または、他の機序が独立にＲａｃ１を活性化する。その結果、Ｓｍａｄ７が媒介するＲａｃ１抑制の抑止は、もはや起こらないと思われる。
Ｒａｃ１活性化もケラチノサイト増殖に寄与したにもかかわらず、部分的にＲａｃ１をノックダウンすることだけでＳｍａｄ７の増殖促進効果が減弱された。したがって、増殖に対するＲａｃ１の貢献は制限されているように見え、ＴＧＦ−β１によって誘発された成長停止を妨げることは、放射線誘発成長阻害効果を解決する上で必要である。
過度の炎症を弱めることは、口腔粘膜炎治癒のための微小環境を作り出す。ＴＧＦ−βおよびＮＦ−κＢの両方のシグナル伝達に対するＳｍａｄ７の拮抗作用は、Ｓｍａｄ７を、ＮＦ−κＢのみを標的とする他の薬剤よりも、より効果的な抗炎症性分子とする。炎症性細胞がＴＧＦ−βとＮＦ−κＢをさらに活性化するサイトカインを産生するので、照射後のＫ５．Ｓｍａｄ７またはＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置口腔粘膜で見られたＴＧＦ−βおよびＮＦ−κＢのシグナル伝達の減少は、これら２つの経路に対するＳｍａｄ７の直接的な拮抗作用と浸潤白血球からの炎症性サイトカインの減少による結果とを反映している。しかしながら、Ｓｍａｄ７は、ＮＦ−κＢまたはＴＧＦ−βのシグナル伝達を、それらの正常な生理学的条件よりも下に減らすことはなかった。このようなＮＦ−κＢまたはＴＧＦ−βのシグナル伝達の不完全な遮断は、いずれかの経路の完全な喪失が過度の炎症を誘発し得ることから、口腔粘膜炎治癒にとってはおそらく有益だろう。
癌患者の口腔粘膜炎を処置するために増殖因子を用いる上で最初に障害になることは、癌細胞増殖を促進する潜在的リスクである。ヒト口腔癌の大部分は、腫瘍上皮細胞でのＴＧＦ−βシグナル伝達を失う。したがって、Ｓｍａｄ７による抗Ｓｍａｄ関連細胞増殖および遊走は、癌細胞に影響がない。ＴＧＦ−βシグナル伝達が損なわれていない腫瘍では、他の腫瘍形成経路の活性化が、ＴＧＦ−βによって誘発される腫瘍抑制効果を上回る場合もある。これらの２つのシナリオによって、変異型または完全なＴＧＦ−βシグナル伝達コンポーネントを有する口腔癌細胞での増殖および遊走のＳｍａｄ７による増加が観察されない理由が説明され得る。
さらに、ＴＧＦ−βシグナル伝達は、ＴＧＦ−βによって誘発された腫瘍抑制の消失の後に、主にＳｍａｄ非依存的な機序を通して腫瘍浸潤を促進する。したがって、癌細胞においてＳｍａｄ７によりＴＧＦ−βシグナル伝達を妨げることはＴＧＦ−β媒介腫瘍促進効果を抑止することができ、そのことは進行癌の臨床治験で目下使用されているＴＧＦ−β抑制因子に類似的にふるまう。さらに、Ｓｍａｄ７の強力な抗炎症効果は、腫瘍進行のリスクを減らすことが可能である。したがって、長期のＳｍａｄ７適用は、癌治療でも有効であると考えられる。
Ｋ５．Ｓｍａｄ７マウスでは自然発生腫瘍形成は、観察されなかった。Ｓｍａｄ７が分泌タンパク質ではないことから口腔粘膜炎処置における局所かつ短期のＳｍａｄ７タンパク質送達は、全身作用をほとんど持つべきではない。口腔上皮に癌細胞が含まれない骨髄移植患者において、Ｓｍａｄ７局所適用は、口腔粘膜炎の予防と処置に適し得る。
あらゆる理論に束縛されることを望まないが、Ｓｍａｄ７媒介口腔粘膜炎治癒は１または複数の分子によって媒介される複数の病原性プロセスを標的とした結果と思われる（例えば、図１４Ａ〜Ｂを参照）。これらの分子（例えば、ＴＧＦ−β、ＮＦ−κＢ、ＣｔＢＰ１、Ｒａｃ１）の１または複数が患者の口腔粘膜炎の予測および治療応答マーカーとして有用であると考えられる。
Ａ．核酸、ベクター、および宿主細胞
本開示は、別の実施形態において、Ｓｍａｄ７をコードする遺伝子も提供する。野生型Ｓｍａｄ７遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、８８）および種々のコドン最適化バージョン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、２１、２３、２４、２６、２８、３０、３２〜３４、３６、３８、３９、８７、８９、９１、９３、９６、９７、９９、および１００）に加えて、本技術が本明細書中に開示されている特定の核酸に限定されるものではないことが、明白でなければならない。後述するように、「Ｓｍａｄ７遺伝子」は種々の異なる塩基を含んでもよく、その場合であっても、本明細書中に開示されたヒト遺伝子とは機能的に区別がつかず、かつ場合によっては構造的に同一である、対応するポリペプチドを産生する。
１．Ｓｍａｄ７をコードする核酸
本技術による核酸は、Ｓｍａｄ７遺伝子全体、トランケート部分、および／またはＳｍａｄ７のフラグメントを示してもよく、それは、Ｓｍａｄ７に関連した１または複数の活性、例えば、限定されるものではないが、増殖を増加させること、細胞死を減らすか抑制すること、過度の炎症を減らすこと、ＤＮＡ損傷を防ぐこと、および／または細胞遊走を増加させること、さらに、そのような処置が本明細書中でのさらなる検討に有用である１または複数の疾患または障害を処置または予防すること、を有するポリペプチドを発現する。そのような活性は、１または複数のアッセイを用いて評価され得る。このようなアッセイには、限定されるものではないが、マウスにおいて、Ｓｍａｄ２のリン酸化および／またはＮＦ−κＢ ｐ５０サブユニットの核転座を阻害、細胞増殖を増加、アポトーシスおよび／または放射線誘発ＤＮＡ損傷を減少、炎症および／または血管新生を減少、口腔粘膜炎、手術性創傷、糖尿病創傷、および／または慢性炎症に伴う創傷の治癒を促進する能力が含まれる。核酸は、ゲノムＤＮＡ（すなわち、特定の生物のゲノムから直接クローニングされたもの）に由来してもよい。しかしながら、特定の実施形態において、核酸は相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含むであろう。ｃＤＮＡプラス本来の介在配列または別の遺伝子に由来するイントロンも提供される。そのような設計分子を、しばしば、「ミニ遺伝子」という。すくなくとも、本技術のこれらの核酸および他の核酸は、分子量基準、例えば、ゲル電気泳動法の分子量基準として、使用されてもよい。
用語「ｃＤＮＡ」は、テンプレートとしてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を用いて調製されるＤＮＡを指すことが意図されている。ｃＤＮＡを用いることの利点は、ゲノムＤＮＡや、ゲノムＲＮＡ、非処理ＲＮＡ、または部分的処理ＲＮＡのテンプレートから重合されたＤＮＡとは対照的に、ｃＤＮＡには、対応するタンパク質のコード配列が主に含まれることである。完全または部分的ゲノム配列が好ましい場合、例えば、非コード領域が最適な発現に必要とされる場合、または、イントロンなどの非コード領域がアンチセンス戦略において標的とされる場合がある。
この出願で使用されるように、「Ｓｍａｄ７をコードする核酸」は、細胞内の全核酸を伴わずに単離されている核酸のことを指してもよく、および／または、Ｓｍａｄ７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを指してもよい。本明細書中に使用されるように、「細胞内の全核酸を伴わずに単離」という用語は、核酸分子が、おおよそ、または、少なくとも、標準的な生化学技術、限定されるものではないが、例えばアガロースゲル電気泳動法を用いて決定される他の細胞核酸分子の、約７５％純、８０％純、８５％純、９０％純、９５％純、９６％純、９７％純、９８％純、９９％純、または１００％純であることをいう。本明細書中に使用されるように、「細胞内の全タンパク質を伴わずに単離」という言葉は、タンパク質分子が、おおよそ、または、少なくとも、標準的な生化学技術、限定されるものではないが、例えばウェスタンブロットを用いて決定される他の細胞核酸分子の、約７５％純、８０％純、８５％純、９０％純、９５％純、９６％純、９７％純、９８％純、９９％純、または１００％純であることをいう。特定の実施形態において、本技術は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、２１、２３、２４、２６、２８、３０、３２〜３４、３６、３８、３９、８７、８９、９１、９３、９６、９７、９９、および１００のいずれか１つに本質的に記載、および／または、含まれる、核酸配列に関する。
単離核酸分子は、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）または化学合成を用いて作られてもよい。単離核酸分子として、天然の核酸分子およびそのホモログが挙げられ、限定されるものではないが、天然の対立遺伝子変異体と改変核酸分子とが含まれ、この改変核酸分子では、そのような改変で所望の効果（例えば、非ヒト発現系のＳｍａｄ７タンパク質の産生）が得られるように、ヌクレオチドの挿入、欠失、置換、および／または逆位がなされている。
「１または複数の核酸配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、２１、２３、２４、２６、２８、３０、３２〜３４、３６、３８、３９、８７、８９、９１、９３、９６、９７、９９、および１００）に本質的に記載された」という用語は、核酸配列が、１または複数の核酸配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、２１、２３、２４、２６、２８、３０、３２〜３４、３６、３８、３９、８７、８９、９１、９３、９６、９７、９９、および１００）の、少なくとも一部分、および、場合によっては、該配列の全体に実質的に対応することを意味する。いくつかの実施形態では、核酸配列の少なくとも一部分に実質的に対応する配列は、本明細書中に記載された配列の１または複数のおよそ／または少なくともおよそ５０の核酸、７５の核酸、１５０の核酸、２００の核酸、２５０の核酸、３００の核酸、３５０の核酸、４００の核酸、４５０の核酸、５００の核酸、５５０の核酸、６００の核酸、６５０の核酸、７００の核酸、７５０の核酸、８００の核酸、９００の核酸、１０００の核酸、１１００の核酸、１２００の核酸、または１２５０の核酸に、対応し得る。いくつかの実施形態では、核酸配列の少なくとも一部分に実質的に対応する配列は、本明細書中に記載された配列の１または複数の、約５０〜１２５０の核酸、７５〜１２５０の核酸、１５０〜１２５０の核酸、２００〜１２５０の核酸、２５０〜１２５０の核酸、３００〜１２５０の核酸、３５０〜〜１２５０の核酸、４００〜〜１２５０の核酸、４５０〜１２５０の核酸、５００〜１２５０の核酸、５５０〜１２５０の核酸、６００〜１２５０の核酸、６５０〜１２５０の核酸、７００〜１２５０の核酸、７５０〜１２５０の核酸、８００〜１２５０の核酸、９００〜１２５０の核酸、１０００〜１２５０の核酸、１１００〜１２５０の核酸、１２００〜１２５０の核酸、少なくとも約５０〜７５の核酸、７５〜１５０の核酸、７５〜２００の核酸、７５〜２５０の核酸、７５〜３００の核酸、７５〜３５０の核酸、７５〜４００の核酸、７５〜４５０の核酸、７５〜５００の核酸、７５〜５５０の核酸、７５〜６００の核酸、７５〜６５０の核酸、７５〜７００の核酸、７５〜７５０の核酸、７５〜８００の核酸、７５〜９００の核酸、７５〜１０００の核酸、７５〜１１００の核酸、７５〜１２００の核酸、または７５〜１２５０の核酸、あるいは１２５０の核酸の範囲の周辺に、対応し得る。
いくつかの実施形態において、少なくとも一部の核酸配列に実質的に対応する配列は、核酸配列のその部分に、同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも一部の核酸配列に実質的に対応する配列または核酸配列の全体は、１または複数の機能的に同等のコドンを含む可能性がある。「機能的に同等のコドン」という用語は、本明細書中で使用されて、同じアミノ酸をコードする１または複数のコドン、例えばアルギニンまたはセリンの６つのコドンのことをいい、いくつかの実施形態では、以下の頁で議論されるような生物学的に同等のアミノ酸をコードするコドンのことをいう。「生物学的に同等の」アミノ酸という用語は、本明細書中では、ヒトＳｍａｄ７野生型タンパク質のアミノ酸配列に存在するアミノ酸から変更された場合に、本明細書に記載されたＳｍａｄ７の生物活性、例えば、限定されるものではないが、増殖を増加させること、細胞死を減らすか抑制すること、過度の炎症を減らすこと、ＤＮＡ損傷を防ぐこと、および／または細胞遊走を増加させること、ならびに、処置または予防を、そのような処置が本明細書中でさらに議論されるように有用であると思われる１または複数の疾患または障害に対して行うことのうちの１または複数（あるいは、いくつかの実施形態では、任意）を変えない、１または複数のアミノ酸のことをいう。
いくつかの実施形態では、遺伝コードの縮重を可能にすることで、コドン最適化核酸配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、２１、２３、２４、２６、２８、３０、３２〜３４、３６、３８、３９、８７、８９、９１、９３、９６、９７、９９、および１００）のいずれか１つのヌクレオチドと同一であるヌクレオチドの約または少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および／または９９％を有する配列は、実質的に対応する核酸配列であると考えられる。核酸配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、２１、２３、２４、２６、２８、３０、３２〜３４、３６、３８、３９、８７、８９、９１、９３、９６、９７、９９、および１００）のいずれか１つに記載の配列と本質的に同一の配列は、様々な標準条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、２１、２３、２４、２６、２８、３０、３２〜３４、３６、３８、３９、８７、８９、９１、９３、９６、９７、９９、および１００のコンポーネントを含む核酸セグメントとハイブリダイズ可能である配列としても、機能的に定義され得る。
高い選択性を必要としている用途にとって、ハイブリッドを形成するべく比較的高いストリンジェンシー条件を使用することが概して望まれる。例えば、相対的に低い塩および／または高い温度の条件、例えば約５０℃〜約７０℃の温度で約０．０２Ｍ〜約０．１０ＭのＮａＣｌによって提供される条件。そのようなストリジェンシー条件は、プローブまたはプライマーとテンプレートまたは標的鎖との間のミスマッチを、たとえあったとしてもほとんど許容せず、特定の遺伝子の単離または特定のｍＲＮＡ転写物の検出に特に適しているであろう。ホルムアミド量の増加を加えることで条件をよりストリジェンシーの高いものとすることができると、一般に理解される。
特定の用途にとって、より低いストリンジェンシー条件が好ましいことが、理解される。このような条件下では、ハイブリダイズしている鎖の配列が完全には相補的ではなく１または複数の位置でミスマッチが起こるとしても、ハイブリダイゼーションが生ずる場合がある。塩濃度の上昇および／または温度の低下によって、条件をよりストリンジェンシーの低いものとしてもよい。例えば、中程度のストリジェンシー条件は、約３７℃〜約５５℃の温度で約０．１〜０．２５ＭのＮａＣｌにより、提供され、一方で、低ストリンジェンシー条件は、約２０℃〜約５５℃の温度範囲で約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩により、提供され得る。所望の結果に応じて、ハイブリダイゼーション条件に容易に手を加えることができる。
別の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、例えば、約２０℃〜約３７℃の温度で、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭジチオスレイトールの条件下で、達成され得る。利用される他のハイブリダイゼーション条件は、約４０℃〜約７２℃の温度で、約１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むこともできる。
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の相同性の割合を決定するために、比較を最適化することを目的として、配列をアライメントさせる（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列とのアライメントを最適化するために第１のアミノ酸または核酸配列の配列にギャップを導入する）。続いて、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較することができる。第２の配列の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドで第１の配列にある位置が占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間での相同性の割合は、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である（％同一性＝同一位置の数／位置（例えば、重複位置）の全数×１００）。いくつかの実施形態では、それら２つの配列は同一の長さである。
２つの配列間の相同性の割合を決定するために、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877にあるように修正されたKarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムを用いることができる。そのようなアルゴリズムは、Altschul et al. (1990) J. Mol Biol. 215:403-410のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴに取り込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２により実行し、本明細書中に記載または開示された核酸分子に対するホモログを得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３により実行する。比較目的のためにギャップ付きアライメントを得るために、ギャップ付きＢＬＡＳＴを、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されているように、利用してもよい。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各々のプログラムのデフォルトパラメーター（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）が使用される。さらに詳しくは、National Center for Biotechnology Informationのウェブサイトを参照せよ（ncbi.nlm.nih.govのワールドワイドウェブ上）。本明細書中に記載された方法での使用に適したタンパク質は、本明細書中に記載された任意のタンパク質のアミノ酸配列と比較して、１〜１５の間のアミノ酸変化（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15のアミノ酸の置換、欠失、または付加）を有するタンパク質も含む。別の実施形態では、改変アミノ酸配列は、本明細書中に記載された任意のタンパク質阻害因子のアミノ酸配列と、少なくとも７５％同一、例えば、７７％、８０％、８２％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。そのような配列変異タンパク質は、改変アミノ酸配列が本明細書中に記載された組成物および方法で機能するのに十分な生物活性を保持している限り、本明細書中に記載された方法に適している。場合によっては、保存的アミノ酸置換が利用される。アミノ酸間の例示的な保存的置換は、以下の群、すなわち、（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（３）セリンおよびスレオニン、（４）アスパルテートおよびグルタミン酸塩、（５）グルタミンおよびアスパラギン、ならびに（６）リシン、アルギニン、およびヒスチジンの各々の中で行われる。ＢＬＯＳＵＭ６２テーブルは、タンパク質配列セグメントの約２，０００の局所多重アライメントから誘導されるアミノ酸置換マトリックスであり、関連タンパク質の５００基を超える高度保存領域を表す（Henikoff et al. (1992), Proc. Natl Acad. Sci. USA、89:10915-10919）。ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度は、いくつかの実施形態では本明細書中に記載または開示したアミノ酸配列の中に導入される保存的アミノ酸置換を定義するために、使用され得る。（上記のように）化学的性質のみに基づいてアミノ酸置換の設計が可能ではあるが、用語「保存的アミノ酸置換」は、好ましくは、−１を超えるＢＬＯＳＵＭ６２値により表される置換のことをいう。例えば、アミノ酸置換は、この置換が０、１、２、または３のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴づけられる場合、保存的である。この系によれば、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１、２，または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって、特徴づけられ、一方、より好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも２（例えば、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴づけられる。
本技術のＤＮＡセグメントには、上記したように、生物学的に機能が等価なＳｍａｄ７タンパク質およびペプチドをコードするものが含まれる。そのようなセグメントは、核酸配列およびそれによってコードされるタンパク質内で自然に生じることが知られているコドン冗長性およびアミノ酸機能的等価性の結果として、生じ得る。あるいは、機能的に等価なタンパク質またはペプチドは、組換えＤＮＡ技術の適用により作り出されてもよく、ここでタンパク質構造の変化は、交換されたアミノ酸の特性の考慮に基づいて操作されてもよい。人によって設計される変化は、他に記載されたように、部位特異的突然変異誘発技術の適用を介して導入可能であり、または、ランダムに導入されて、所望の機能について後でスクリーニングされてもよい。
より詳細に後述するように、Ｓｍａｄ７核酸配列は、選択可能な宿主生物（例えば非ヒト）内での発現に最適化されてきた。上述したように、遺伝コードは縮退されるので、しばしば、１つのアミノ酸が２またはそれ以上のヌクレオチドコドンによってコードされる場合がある。したがって、多重核酸配列は１つのアミノ酸配列をコードし得る。このアミノ酸配列は同一のタンパク質を作るが、核酸自体は互いに異なり、異なった特性を持つことができる。本明細書中に述べたように、コドン使用頻度の選択に係る一態様は、（限定されるものではないが）外来細胞内でタンパク質（細菌または酵母内でヒトタンパク質）を発現する能力またはそのような細胞内での発現レベルであり得る。精製、試験、およびインビトロアッセイでの使用にとって十分なタンパク質を得るために、動物細胞において、そして最終的に臨床開発において、非ヒト系での十分なタンパク質発現が必要である。
ＡＧＧ（１．７％コドン使用頻度；９残基）、ＡＧＡ（２．８％コドン使用頻度；２残基）、ＣＧＡ（３．５％コドン使用頻度；４残基）、またはＣＧＧ（５．４％コドン使用頻度；８残基）の１または複数によってコードされるヒトＳｍａｄ７タンパク質配列にある一連の２３個のアルギニンアミノ酸が同定されており、ヒト以外の出所、例えば、限定されるものではないが、細菌および／または酵母からの効率的なタンパク質発現を有するためには、この１または複数の、場合によっては全てのアルギニンコドンがＣＧＴ（２０．６％コドン使用頻度）に改変されるべきであると判定されている。したがって、いくつかの実施形態では、Ｓｍａｄ７コドン最適化核酸配列は、ＣＧＴに変えられている、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、または２３個の、アルギニンのコドンを含む。いくつかの実施形態では、Ｓｍａｄ７コドン最適化核酸配列は、核酸配列位置の７〜９位、４３〜４５位、１６９〜１７１位、４０３〜４０５位、４９０〜４９２位、５２６〜５２８位、５２６〜５２８位、８２３〜８２５位、１０５７〜１０５９位、１６〜１８位、１３６〜１３８位、１９９〜２０１位、５９８〜６００位、３１〜３３位、１１２〜１１４位、３１６〜３１８位、７７２〜７７４位、９４０〜９４２位、９７３〜９７５位、１１３５〜１１３７位、１２７６〜１２７８位、６３７〜６３９位、または８１４〜８１６位にある、１または複数あるいは全てのアルギニンコドンがＣＧＴに変えられなければならない。
ＴＣＣまたはＴＣＧ（９％）によってコードされる、ヒトＳｍａｄ７タンパク質配列にある一連の３３個のセリン残基が同定されており、ヒト以外の出所、例えば、限定されるものではないが、細菌および／または酵母からの効率的なタンパク質発現および精製にとって、１または複数の、場合によっては全てのセリンコドンがＡＧＣ（１５％コドン使用頻度）に改変されることが有益であり得ると判定されている。したがって、いくつかの実施形態では、Ｓｍａｄ７コドン最適化核酸配列は、（ＡＧＣ）に変えられている、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、または３３個の、セリンのコドンを含む。いくつかの実施形態では、Ｓｍａｄ７コドン最適化核酸配列は、核酸配列位置の１９〜２１位、４６〜４８位、１３３〜１３５位、２９２〜２９４位、３４９〜３５１位、４５１〜４５３位、４５４〜４５６位、４６０〜４６２位、５１１〜５１３位、５１４〜５１６位、５４４〜５４６位、５９５〜５９７位、６１６〜６１８位、６３４〜６３６位、６９１〜６９３位、６９４〜６９６位、７３９〜７４１位、７４５〜７４７位、７７５〜７７７位、８４７〜８４９位、９０７〜９０９位、９１９〜９２１位、９４３〜９４５位、１００６〜１００８位、１００９〜１１０１位、１０３０〜１０３２位、１０５４〜１０５６位、１０９３〜１０９５位、１１２６〜１１２８位、１１９２〜１１９４位、１２３７〜１２３９位、１２４０〜１２４２位、１２７３〜１２７５位にある、１または複数あるいは全てのセリンコドンを含む。これらのうち、２３個のコドン（１９〜２１、２９２〜２９４、３４９〜３５１、４５１〜４５３、４５４〜４５６、４６０〜４６２、５１１〜５１３、５１４〜５１６、５４４〜５４６、６１６〜６１８、６３４〜６３６、６９１〜６９３、６９４〜６９６、７３９〜７４１、７４５〜７４７、７７５〜７７７、８４７〜８４９、９０７〜９０９、９１９〜９２１、１００９〜１１０１、１０３０〜１０３２、１０５４〜１０５６、１０９３〜１０９５）を、代わりとなり得る読み取り枠を導入することなしに、変更することができる。
ＣＡＣ（９．６％コドン使用頻度）によってコードされる、ヒトＳｍａｄ７タンパク質配列にある、一連の１２個のヒスチジン残基も同定されており、それは、ヒト以外の出所、例えば、限定されるものではないが、細菌および／または酵母からの効率的なタンパク質発現および精製にとって、１または複数の、場合によっては全てのセリンコドンがＣＡＴ（必要に応じて、１２．６％利用まで）に改変されることが有益であり得ると判定されている。したがって、いくつかの実施形態では、Ｓｍａｄ７コドン最適化核酸配列は、（ＣＡＴ）に変えられている、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、または１２個の、ヒスチジンのコドンを含む。いくつかの実施形態では、Ｓｍａｄ７コドン最適化核酸配列は、核酸配列位置の１４２〜１４４位、２１４〜２１６位、２１７〜２１９位、２２０〜２２２位、２２６〜２２８位、２８９〜２９１位、５８９〜５９１位、７７８〜７８０位、１０７２〜１０７４位、１１４７〜１１４９にある、１または複数あるいは全てのセリンコドンを含む。これらのうち、４個のコドン（２１７〜２１９位、２２０〜２２２位、５８９〜５９１位、７７８〜７８０位のヌクレオチド）を、代わりとなり得る読み取り枠を導入することなしに、変更することができる。
いくつかの実施形態では、１または複数のコドン最適化核酸は、少なくとも１つおよび最大で２２個の任意の整数の、ＣＧＴに改変されたそのアルギニンコドン、少なくとも１つおよび最大で２８個の任意の整数の、ＡＧＣに改変されたそのセリンコドン（任意に、導入読み取り枠により改変可能である）、あるいは、少なくとも１つおよび最大で１２個の任意の整数の、ＣＡＴに改変されたそのヒスチジンコドン（任意に、導入読み取り枠により改変可能である）の、１または複数を含んでもよい。いくつかの実施形態では、１または複数のコドン最適化核酸は、少なくとも１つおよび最大で２２個の任意の整数の、ＣＧＴに改変されたそのアルギニンコドン、少なくとも１つおよび最大で２８個の任意の整数の、ＡＧＣに改変されたそのセリンコドン（任意に、導入読み取り枠により改変可能である）、ならびに、少なくとも１つおよび最大で１２個の任意の整数の、CATに改変されたそのヒスチジンコドン（任意に、導入読み取り枠により改変可能である）を、含んでもよい。いくつかの実施形態では、１または複数のコドン最適化核酸は、ＣＧＴに改変されたそのアルギニンコドン２２個、ＡＧＣに改変されたそのセリンコドン(任意に、導入読み取り枠により改変可能である)２８個、およびＣＡＴに改変されたそのヒスチジンコドン１２個を、含んでもよい。いくつかの実施形態では、１または複数のコドン最適化核酸は、さらに、Ｌｅｕ２１６（ＣＴＧ）のコドンを形成するべくＭｅｔ２１６（ＡＴＧ）のコドン内のヌクレオチド置換を有してもよい。
いくつかの実施形態では、１または複数のコドン最適化核酸は、ヒトＳｍａｄ７野生型ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、８８）に対して約６５％〜７５％、約６５％〜６８％、約６８％〜７５％、または約６８％〜７１％の相同性を有してもよく、１または複数のコドン最適化核酸は、ヒトＳｍａｄ７野生型ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、８８）に対して約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、または７５％の相同性を有してもよい。いくつかの実施形態では、１または複数のコドン最適化核酸は、さらに、Ｌｅｕ２１６（ＣＴＧ）のコドンを形成するべくＭｅｔ２１６（ＡＴＧ）のコドン内のヌクレオチド置換を有してもよい。
翻訳機構（例えば、限定されるものではないが、細菌または酵母など）によって代替の読み取り枠として認識される可能性があるメチオニンコドン（Ｍｅｔ２１６；ＡＴＧ）が、識別されている。理論に束縛されることを意図するものではないが、第２の潜在的な読み取り枠の存在がＳｍａｄ７タンパク質の発現を減少させ得ると考えられている。いくつかの実施形態では、１または複数のＳｍａｄ７核酸配列が、Ｍｅｔ２１６（ＡＴＧ）がＬｅｕ２１６（ＣＴＧ）に改変されているヒトＳｍａｄ７タンパク質をコードするように、ヌクレオチド位置（６４６〜６４８）で改変されている。
Ｓｍａｄ７タンパク質の様々なトランケートされた形態およびフラグメントが完全長ヒトＳｍａｄ７の活性の１つまたは複数を保つことも発見されており、そのような活性は、例えば、限定されるものではないが、増殖を増加させること、細胞死を減らすか抑制すること、過度の炎症を減らすこと、ＤＮＡ損傷を防ぐこと、および／または細胞遊走を増加させること、さらには、処置または予防を、そのような処置が本明細書中でさらに議論されるように有用であると思われる１または複数の疾患または障害に対して行うこと、である。そのような活性を、１または複数のアッセイを用いて評価することができる。そのようなアッセイとして、限定されるものではないが、マウスにおいて、Ｓｍａｄ２のリン酸化および／またはＮＦ−κＢ ｐ５０サブユニットの核転座を阻害、細胞増殖を増加、アポトーシスおよび／または放射線誘発ＤＮＡ損傷を減少、炎症および／または血管新生を減少、口腔粘膜炎、手術性創傷、糖尿病創傷、および／または慢性炎症に伴う創傷の治癒を促進する能力が含まれる。
さらに、Ｓｍａｄ７タンパク質の様々なトランケートされた形態およびフラグメントは、完全長ヒトＳｍａｄ７の１または複数の活性のサブセットのみを、保持する。例えば、Ｓｍａｄ７のＣ末端ＭＨ２ドメインは、主に、Ｓｍａｄ７の抗炎症効果を媒介し得る。この抗炎症効果を有するＳｍａｄ７ペプチドは、慢性炎症関連症状、例えば、限定されるものではないが、数ある中でも、口腔粘膜炎、口内炎、関節炎、および乾癬の処置を、十分に、かつ任意に改善し得る。Ｎ末端ＮＨ１ドメインは、主に、細胞遊走の媒介ならびに／あるいはＴＧＦ−β誘導増殖抑制および／または線維化反応の阻害を行い得る。この細胞遊走および増殖機能を有するＳｍａｄ７ペプチドは、過度の炎症を伴わない治癒の増進に十分であり、かつ任意に改善となり得る。この形態の処置から恩恵を受けると思われる創傷の種類として、数ある中でも、限定されるものではないが、手術性創傷、線維性瘢痕、および糖尿病創傷、欠損治癒、および／または 瘢痕が挙げられる。
いくつかの実施形態では、核酸分子（上記および本明細書中に記載されたように、任意にコドン最適化核酸分子）がＳｍａｄ７タンパク質（任意に、Ｌｅｕ２１６を含む）のフラグメントまたはトランケートされた形態をコードする。いくつかの実施形態では、これらのＳｍａｄ７タンパク質のフラグメントまたはトランケートされた形態は、１または複数あるいは全ての完全長ヒトＳｍａｄ７の活性タンパク質を保持する。いくつかの実施形態では、そのようなトランケートされた核酸配列がＳｍａｄ７タンパク質のＮ末端部分をコードする。いくつかの実施形態では、そのようなトランケートされた核酸配列がＳｍａｄ７タンパク質のＣ末端部分をコードする。いくつかの実施形態では、そのようなトランケートされた核酸配列（ヌクレオチド位置４〜７７４）がヒトＳｍａｄ７タンパク質のアミノ酸２〜２５８をコードする。いくつかの実施形態では、そのようなトランケートされた核酸配列（ヌクレオチド位置７７５〜１２７８）がヒトＳｍａｄ７タンパク質のアミノ酸２５９〜４２６をコードする。いくつかの実施形態では、核酸配列（ヌクレオチド位置６１０〜７７４）のそのようなフラグメントがヒトＳｍａｄ７タンパク質のアミノ酸２０４〜２５８をコードする。
核酸分子に関連して本明細書中で使用される「トランケートされた」という用語は、対応するタンパク質の本来のＮ末端をコードするヌクレオチド配列（開裂リーダー配列の有無にかかわらず）を含むがＣ末端コード部分から始まる１または複数のヌクレオチドが欠けている分子、または、対応するタンパク質のＣ末端をコードするヌクレオチド配列（開裂リーダー配列の有無にかかわらず）を含むがＮ末端コード部分から始まる１または複数のヌクレオチドが欠けている分子のことをいう。いくつかの実施形態では、一方または他方の末端からの少なくとも約２５、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、または少なくとも約３５０、あるいは少なくとも約４００個のアミノ酸をコードするヌクレオチドが欠けている分子が、とりわけ提供される。同様に、「トランケートされた」という用語は、トランケートされた核酸分子によってコードされたタンパク質分子に関連して使用され得る。いくつかの実施形態では、「トランケートされた」分子は、生物活性があり、本明細書中に記載されたＳｍａｄ７活性の１または複数を有する（または有するポリペプチドをコードする）。
核酸分子に関連して本明細書で使用される「フラグメント」という用語は、完全長配列の連続した残基を含むが、この完全長配列の一部の５'および／または３'配列が欠けている分子のことをいう。いくつかの実施形態では、「フラグメント」には本明細書中に記載された完全長配列の１または複数の部分を含む。いくつかの実施形態では、「フラグメント」は、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかをコードする配列を含まず、内側のフラグメントに限られている。いくつかの実施形態では、「フラグメント」は、本明細書中に記載されたＳｍａｄ７活性の１または複数を有する、生物活性のあるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、核酸フラグメントは、少なくともおおよそ２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０個のアミノ酸を有するタンパク質をコードし得る。同様に、「フラグメント」は、Ｓｍａｄ７核酸フラグメントによってコードされるタンパク質に関連しても用いられ得る。
本明細書中に使用される「Ｎ末端部分」という用語は、タンパク質のＮ末端を含むがＣ末端から内側残基までの全ての配列が欠けている、対応のタンパク質のフラグメントのことをいう。
本明細書中に使用される「Ｃ末端部分」という用語は、タンパク質のＣ末端を含むがＮ末端から内側残基までの全ての配列が欠けている、対応のタンパク質のフラグメントのことをいう。
理論に束縛されることを意図するものではないが、Ｓｍａｄ７タンパク質活性は、細胞の細胞質および核の両方での相互作用の結果であろうと、一般に考えられている。とりわけこの理由により、Ｓｍａｄ７タンパク質は治療的役割に関して候補にはならないと一般に信じられていた。しかし、タンパク質治療薬としてＳｍａｄ７の開発を推進し、Ｓｍａｄ７核酸配列（例えば、Ｓｍａｄ７をコードする本明細書中に記載された核酸配列であって、ヒト野生型およびコドン最適化配列、完全長および生物活性フラグメントまたはトランケートされた部分の両方を含む）とインフレームのタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードするべくＳｍａｄ７核酸配列を改変する決定がなされた。いくつかの実施形態ではＰＴＤがＳｍａｄ７核酸配列の３'末端に位置し、いくつかの実施形態では、ＰＴＤがＳｍａｄ７核酸配列の５'末端に位置している。いくつかの実施形態において、ＰＴＤとＳｍａｄ７核酸配列とを接続する１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸をコードするリンカー配列がある。
いくつかの実施形態では、ＰＴＤ核酸配列はＴａｔ核酸配列である。
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をコードする
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、
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をコードする
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、または
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をコードする
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。
いくつかの実施形態では、核酸配列は、さらに、１または複数のエピトープタグまたは精製タグをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、エピトープタグはＶ５である。いくつかの実施形態では、精製タグはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）または６−ヒスチジン（Ｈ６）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）の１または複数である。
核酸分子に関して本明細書中で使用される「エピトープタグ」という用語は、抗体またはフラグメントの可変領域が認識および結合するペプチド配列をコードするヌクレオチドのことをいう。いくつかの実施形態では、エピトープタグは、天然タンパク質の一部ではない。いくつかの実施形態では、エピトープタグは、除去可能である。いくつかの実施形態では、エピトープタグは、タンパク質の天然生物活性にとって内因性のものではない。エピトープタグの例として、限定されるものではないが、Ｖ５が挙げられる。
核酸分子に関して本明細書中で使用される「精製タグ」という用語は、タンパク質の精製を促進するがタンパク質の生物活性には概ね必要ではないペプチド配列をコードするヌクレオチドのことをいう。いくつかの実施形態では、タンパク質精製後に精製タグを除去することが可能である。精製タグの例として、限定されるものではないが、ＧＳＴおよびＨ−６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）が挙げられる。
２．クローニング、遺伝子導入、および発現用のベクター
いくつかの実施形態では、Ｓｍａｄ７ポリペプチド産物を発現ベクターを用いて発現させ、これを次に、様々な用途のために精製することができる。別の実施形態では、発現ベクターを遺伝子治療に用いる。発現は、適当なシグナルがベクターに設けられることを必要とし、それは様々な調節エレメント、例えば、宿主細胞で目的の遺伝子の発現を駆動する哺乳動物源由来のエンハンサー/プロモーターを含む。宿主細胞でのメッセンジャーＲＮＡ安定性および翻訳性を最適化するように設計されたエレメントも定義される。産物を発現する永久かつ安定的な細胞クローンを確立するための、いくつかの優位な薬物選択マーカーを使用するための条件も提供され、これはそのまま、薬物選択マーカーの発現とポリペプチドの発現を連結させる要素となる。
この出願全体を通して、「発現コンストラクト」という用語は、核酸コード配列の一部または全部が転写されることができる遺伝子産物をコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝子コンストラクトを包含することを、意図している。この転写産物をタンパク質に翻訳してもよいが、必要なことではない。いくつかの実施形態において、発現には、遺伝子の転写と遺伝子産物へのｍＲＮＡの翻訳との両方が含まれる。他の実施形態において、発現は、目的の遺伝子をコードする核酸の転写のみを含む。
「ベクター」という用語は、核酸配列が複製され得る細胞への導入のために核酸配列が挿入され得る担体核酸分子のことをいう。核酸配列は、「外因性」であり得、このことは、ベクターが導入される細胞に対してそれが外来であることを意味するか、または、該配列は細胞内の配列と相同であるが該配列が通常見られない宿主細胞核酸中の位置にあることを意味している。ベクターとして、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、ならびに人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が挙げられる。当業者は、例えば、両方とも本明細書に参照により援用される、Sambrook et al., Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Lab Press、1989)と、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Wiley、1994)とに記載された標準的な組換え技術を通して、ベクターを構築するのに十分な知識を備えているだろう。
「発現ベクター」という用語は、転写されることができる遺伝子産物の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含むベクターのことをいう。いくつかの例では、次いでＲＮＡ分子が、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の例では、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの生成において、これらの配列は翻訳されない。発現ベクターは、様々な「制御配列」を含むことができ、この制御配列は、特定の宿主生物内での作動可能に連結したコード配列の転写または潜在的には翻訳に必要な核酸配列のことを指し、プロモーターおよびエンハンサーが含まれる。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能、例えば、転写終了シグナルおよびポリアデニル化部位の働きをする核酸配列を含んでもよい。
効率よく細胞に感染または侵入する、宿主ゲノムに組み込まれる、およびウイルス遺伝子を安定的に発現するという特定のウイルスベクターの能力は、いくつかの異なるウイルスベクター系の開発および適用をもたらした。Robbins et al., Pharmacol. Ther. 80:35-47 (1998)。ウイルス系は、現在、エクスビボおよびインビボの遺伝子導入のためのベクターとして使用されている。例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、およびアデノ随伴ウイルスベクターは、癌、嚢胞性線維症、ゴーシェ病、腎臓病、関節炎などの疾患の処置について、現在評価されている。Robbins et al., Pharmacol. Ther. 80:35-47 (1998); Imaiら、Nephrologie 19:379-402 (1998); 米国特許第5,670,488号。特定の遺伝子治療用途に応じて、様々なウイルスベクターが特定の利点および不利な点を示す。
本技術とともに使用されるオルガネラ、細胞、組織、または生物の形質転換用の核酸送達のための適当な非ウイルス方法は、実質的には、本明細書中に記載されているように、または、当業者に知られているように、核酸（例えば、ＤＮＡ）をオルガネラ、細胞、組織、または器官に導入することができる任意の方法を含むと考えられる。そのような方法として、限定されるものではないが、例えば、マイクロインジェクション（Harland and Weintraub, 1985; 米国特許第5,789,215号、本明細書に参照により援用）を含むインジェクション（米国特許第5,994,624号、同第5,981,274号、同第5,945,100号、同第5,780,448号、同第5,736,524号、同第5,702,932号、同第5,656,610号、同第5,589,466号、および同第5,580,859号、各々を本明細書に参照により援用）によって、エレクトロポレーション（米国特許第5,384,253号、本明細書に参照により援用））によって、リン酸カルシウム沈殿（Graham et al., Virology 52:456-467 (1973); Chen, et al., Mol. Cell Biol. 7:2745-2752 (1987）によって、DEAEデキストランとそれに続くポリエチレングリコール（Gopal, Mol. Cell Biol. 5:1188-1190 (1985)）とを用いることによって、ダイレクトソニックローディング（Fechheimer et al., PNAS 84：8463-8467 (1987)）によって、リポソーム媒介トランスフェクション（Nicolau et al., Biochim. Biophys. Acta 721:185-190 (1982）; Fraley et al., PNAS 76:3348-3352 (1979); Nicolau et al., Methods Enzymol. 149: 157-176 (1987); Wong et al., Gene 10:87-94 (1980); Kaneda et al., J. Biol. Chem. 264:12126-12129 (1989); Kato et al., J. Biol. Chem. 266:3361-3364 (1991)）によって、微粒子銃（PCT出願番号第WO 94/09699号および同第95/06128号; 米国特許第5,610,042号、同第5,322,783号、同第5,563,055号、同第5,550,318号、同第5,538,877号、および同第5,538,880号、各々を本明細書に参照により援用）によって、炭化けい素繊維による撹拌によって（Kaepplerら、Plant Cell Rep. 9:415-418 (1990); 米国特許第5,302,523号および同第5,464,765号、各々を本明細書に参照により援用）によって、またはプロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換（Omirulleh, et al., Plant Mol. Biol. 21:415-428 (1993); 米国特許第4,684,611号および同第4,952,500号、各々を本明細書に参照により援用）によって、乾燥/抑制媒介ＤＮＡ取込み（Potrykusら、Mol. Gen. Genet. 199:169-177 (1985)）によって、ＤＮＡを直接送達することが挙げられる。これらのような技術の適用を通して、オルガネラ(複数可)、細胞(複数可)、組織(複数可)、または生物(複数可)は、安定して、または、一時的に、形質転換され得る。
３．発現系
上述の組成物の少なくとも一部または全てを含む数多くの発現系が存在する。原核生物および／または真核生物をベースとした系を、本技術とともに使用して、核酸配列、またはその関連するポリペプチド、タンパク質、およびペプチドを作ることができる。多くのそのような系が市販されており、広く利用可能である。
昆虫細胞/バキュロウイルス系は、異種核酸セグメントの高レベルのタンパク質発現を生じることができ、例えば米国特許第5,871,986 号および同第4,879,236号（両方とも本明細書に参照により援用）に記載され、かつInvitrogen（登録商標）からMAXBAC（登録商標）2.0の名のもとで、CLONTECH（登録商標）からBACPACK（商標）バキュロウイルス発現系の名のもとで、購入することができる。
発現系の他の例には、STRATAGENE(登録商標）のCOMPLETE CONTROL（商標）誘導性哺乳類発現系が含まれ、この発現系は、合成エクジソン誘導受容体、またはそのｐＥＴ発現系、大腸菌（E.coli）発現系を伴う。誘導性発現系の別の例は、Invitrogen（登録商標）から入手可能であり、これは完全長CMVプロモーターを用いる誘導性哺乳類発現系であるＴ−ＲＥＸ（商標）（テトラサイクリン調節発現）系を包含する。Invitrogen（登録商標）は、Pichia methanolica 発現系と呼ばれる酵母発現系も提供し、この系はメチロトローフ酵母Pichia methanolicaにおける組換えタンパク質の高レベル生産用に設計されている。当業者は、核酸配列またはその関連するポリペプチド、タンパク質、あるいはペプチドを生産するために発現コンストラクトなどのベクターをどのように発現させるかを理解している。
哺乳類細胞初代培養を様々なやり方で調製することが可能である。インビトロかつ発現コンストラクトと接触されている状態で細胞を生存可能に保つためには、細胞が正確な比率の酸素および二酸化炭素および栄養素との接触を保つが微生物汚染から保護されていることを確実にする必要がある。細胞培養技術は十分に実証されている。
前述の１つの実施形態は、タンパク産生用の細胞を不死化するために遺伝子導入の使用を伴う。目的のタンパク質の遺伝子を上記のように、適当な宿主細胞に導入し、それに続いて適当な条件下で細胞を培養してもよい。このようなやり方で、実質的に任意のポリペプチドの遺伝子を使用することが可能である。組換え発現ベクターとそれに含まれるエレメントは、前述している。あるいは、生じるタンパク質は、問題の細胞によって正常に合成された内因性タンパク質であってもよい。
有用な哺乳類宿主細胞系の例は、Ｖｅｒｏ細胞およびＨｅＬａ細胞、ならびに、チャイニーズハムスター卵巣細胞、Ｗ１３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞、２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＲＩＮ細胞、およびＭＤＣＫ細胞の細胞系である。さらに、宿主細胞として、挿入配列の発現を調整するか、所望のやり方で遺伝子産物を改変および処理するものを選択してもよい。そのようなタンパク質産物の改変（例えば、グリコシル化）およびプロセッシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要であると思われる。様々な宿主細胞が、翻訳後プロセッシングおよびタンパク質改変にとって特徴的かつ具体的な機能を有する。発現した外来タンパク質の改変およびプロセッシングを保証するべく、適当な細胞系または宿主系を選択することができる。
いくつかの選択系を使用することが可能であり、限定されるものではないが、それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ、またはａｐｒｔ−細胞における、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれる。また、 への耐性を与えるｄｈｆｒ、ミコフェノール酸への耐性を与えるｇｐｔ、アミノグリコシドＧ４１８への耐性を与えるｎｅｏ、およびハイグロマイシンへの耐性を与えるｈｙｇｒｏを選択するための基礎として代謝拮抗物質耐性を用いることができる。
本明細書中で使用されるように、用語「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養」は、互いに可換なものとして使うことができる。これらの用語の全てがそれらの子孫も含み、これは任意または全ての後に続く世代である。全ての子孫が計画的または偶然な突然変異により同一ではないものと理解される。異種の核酸配列を表す文脈では、「宿主細胞」は原核または真核細胞のことをいい、ベクターの複製および／またはベクターによってコードされた異種遺伝子の発現を行うことができる任意の形質転換可能な生物を含む。宿主細胞をベクターのレシピエントとして使用することができる（そして使用されてきた）。宿主細胞は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスのことをいう「形質移入された」または「形質導入された」ものであってもよい。形質導入細胞は、初代対象細胞およびその子孫を含む。
宿主細胞は、所望の結果がベクターの複製であるかベクターがコードする核酸配列の一部または全ての発現であるかに応じて、原核生物または真核生物（例えば、細菌または酵母）に由来するものであってもよい。多数の細胞系および培養を宿主細胞として利用可能であり、それらは、生きた培養物および遺伝物質のアーカイブとしての役割を果たす組織であるAmerican Type Culture Collection（ATCC）を通して得ることができる（atcc.org）。適当な宿主は、ベクター主鎖と所望の結果に基づいて当業者により決定され得る。例えば、プラスミドまたはコスミドを、多くのベクターを複製させるために、原核宿主細胞に導入することができる。ベクター複製および／または発現の宿主細胞として使用される細菌細胞として、ＤＨ５α、ＪＭ１０９、およびＫＣ８、さらには、SURE（登録商標）コンピテント細胞および SOLOPACK（登録商標）Gold Cells (STRATAGENE(登録商標）、La Jolla)などの多くの市販の細菌宿主が挙げられる。あるいは、大腸菌（E.coli）ＬＥ３９２などの細菌細胞をファージウイルスの宿主細胞として使うことができよう。
ベクターの複製および／または発現用の宿主細胞の例として、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、２９３、Ｃｏｓ、ＣＨＯ、Ｓａｏｓ、およびＰＣ１２が挙げられる。様々な細胞型および生物に由来する多くの宿主が利用可能であり、当業者に知られている。同様に、ウイルスベクターは、真核宿主細胞または原核宿主細胞のいずれか、より詳しくはベクターの複製または発現を許容するものと同時に使用され得る。
いくつかのベクターは、原核細胞および真核細胞の両方で複製および／または発現することを可能にする制御配列を使用することが可能である。当業者は、上記した宿主細胞をインキュベートして維持するとともにベクターの複製を可能にする条件を、さらに理解するだろう。また、理解されて知られているのは、ベクターによってコードされた核酸およびその関連するポリペプチド、タンパク質、またはペプチドの生産と同様に、ベクターの大規模生産を可能にする技術および条件である。
Ｂ．Ｓｍａｄ７タンパク質およびタンパク質フラグメント
デカペンタプレジックホモログ７（Ｓｍａｄ７）に対する上位要素は、以前に、（ａ）シグナル伝達ＳｍａｄのＴＧＦ−β受容体媒介リン酸化と核転座の遮断、（ｂ）特定のユビキチンプロテアソーム経路を介したＴＧＦ−β受容体とシグナル伝達Ｓｍａｄの分解増加、および（ｃ）Ｓｍａｄ結合エレメント（ＳＢＥ）に対する結合のためのシグナル伝達Ｓｍａｄの抑制を含むいくつかのメカニズムによって、ＴＧＦ−βシグナル伝達のアンタゴニストとして同定された。Ｓｍａｄ７はまた、ＮＦ−κＢのような他のシグナル伝達経路と拮抗する。
Ｓｍａｄ７タンパク質は、上述のＳＭＡＤ７遺伝子によってコードされる。多くの他のＴＧＦ−βファミリーのように、Ｓｍａｄ７は細胞シグナル伝達に関係している。それは、ＴＧＦ−β１型受容体拮抗薬である。それは、該受容体に関連しているＴＧＦ−β１とアクチビンを阻害し、Ｓｍａｄ２へのアクセスを阻害する。それは抑制Ｓｍａｄ（Ｉ−ＳＭＡＤ）であり、ＳＭＵＲＦ２によって増進される。Ｓｍａｄ７は、筋分化も増進する。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」が、本明細書中では互いに可換なものとして使用され、アミノ酸残基のポリマーのことをいう。これらの用語は、天然のアミノ酸と、１または複数のアミノ酸残基が非天然のアミノ酸、例えばアミノ酸アナログであるアミノ酸ポリマーとに適用される。本明細書中で使用されるように、これらの用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、それにはアミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結される完全長タンパク質が含まれる。
一実施形態では、本技術は、Ｓｍａｄ７タンパク質組成物に関連する。Ｓｍａｄ７分子全体に加えて、本技術は、Ｓｍａｄ７に関連した１または複数の活性、例えば、限定されるものではないが、増殖を増加させること、細胞死を減らすか抑制すること、過度の炎症を減らすこと、ＤＮＡ損傷を防ぐこと、および／または 細胞遊走を増加させること、さらには、処置または予防を、そのような処置が本明細書中でさらに議論されるように有用であると思われる１または複数の疾患または障害に対して行うことを保持する、ポリペプチドのトランケートされた部分およびフラグメントにも関連する。そのような活性を１または複数のアッセイを用いて評価することができ、アッセイには、限定されるものではないが、マウスにおける、Ｓｍａｄ２のリン酸化および／または ＮＦ−κＢｐ５０サブユニットの核転座を阻害する、細胞増殖を増加する、アポトーシスおよび／または放射線誘発ＤＮＡ損傷を減らす、炎症および／または脈管形成を減らす、口腔粘膜炎、手術性創傷、糖尿病創傷、糖尿病創傷、および／または慢性炎症に関連した創傷の治癒を促進する能力の活性化が含まれる。
タンパク質フラグメントは、コード領域内の翻訳停止部位の遺伝子操作によって、生成可能である（後述）。あるいは、プロテアーゼとして知られているタンパク質分解酵素によりＳｍａｄ７分子を処理することで、様々なＮ末端、Ｃ末端、および内部フラグメントを作ることができる。これらのフラグメントを、沈殿（例えば、硫酸アンモニウム）、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー（免疫親和性クロマトグラフィー）、または様々なサイズ分離（沈降、ゲル電気泳動、ゲル濾過）などの公知の方法に従って生成可能である。
本明細書中に使用されるように、本実施形態の単離されたタンパク質またはポリペプチドへの言及には、完全長タンパク質、融合タンパク質、キメラタンパク質、あるいはそのようなタンパク質の任意のフラグメント(トランケートされた形態、部分）またはホモログが含まれる。より詳しくは、単離タンパク質は、本来の環境（人為的操作を受けている）から取り出されたタンパク質（ポリペプチドまたはペプチドを含む）であり、限定されるものではないが、精製タンパク質、部分精製タンパク質、組換えにより作られたタンパク質、脂質と複合化されたタンパク質、可溶性タンパク質、合成されたタンパク質、および他のタンパク質を伴う単離タンパク質を含むことができる。このため、「単離」は、タンパク質が精製された程度を反映しない。好ましくは、単離タンパク質は、組換えによって生産される。
Ｓｍａｄ７の変異体も提供され、これらは、置換、挿入、または欠失変異体であり得る。欠失変異体は、天然タンパク質の、活性に必須ではない１または複数の残基を欠いており、上記および本明細書中に記載のトランケーション変異体を含む。置換変異体は、概して、タンパク質内の１または複数の部位での１つのアミノ酸の別のものへの交換を含み、かつ、他の機能または特性を喪失することなく、タンパク質分解性開裂および／または翻訳および／または転写（タンパク質発現）に対する安定性などの、ポリペプチドの１または複数の特性を改変するように設計され得る。好ましくは、このような種類の置換は保存的である。すなわち、１つのアミノ酸が類似の形状および変化の１つにより置き換えられる。保存的置換は、当該技術分野で周知であり、例えば、各々のアミノ酸が変化しまたは異なるアミノ酸と置換され得ることが含まれる。置換変異体を作る際に、疎水性指標、親水性、荷電、および大きさは、通常考慮される。
具体的には、企図されたＳｍａｄ７の欠失変異体は、トランケーションおよびフラグメントを含むもので、例えば、Ｃ末端配列を持たないがＮ末端配列を持つポリペプチド、Ｎ末端配列を持たないがＣ末端配列を持つポリペプチド、あるいはＮ末端配列もＣ末端配列も持たないが内部配列を持つポリペプチド、が含まれる。具体的には、企図されたＳｍａｄ７ポリペプチドトランケーションまたはフラグメントは、限定されるものではないが、天然のヒトＳｍａｄ７タンパク質範囲に対応するアミノ酸残基２〜２５８、２５９〜４２６、２０４〜２５８を含む分子が含まれる。
タンパク質配列に関連して本明細書中に使用される「トランケートされた」という用語は、対応するタンパク質(開裂リーダー配列の有無にかかわらず)の本来のＮ末端を含むが、Ｃ末端から始まる１または複数のアミノ酸が欠けている分子、あるいは、対応するタンパク質(開裂リーダー配列の有無にかかわらず)の本来のＣ末端を含むが、Ｎ末端から始まる１または複数のアミノ酸が欠けている分子のことをいう。いくつかの実施形態では、少なくとも約２５、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、または少なくとも約３５０、あるいは少なくとも約４００個のアミノ酸が一方または他方の末端から欠けている分子が、とりわけ提供される。いくつかの実施形態では、「トランケートされた」分子は、生物活性があり、本明細書中に記載された１または複数のＳｍａｄ７活性を有する。
ポリペプチド配列に関連して本明細書中で使用される「フラグメント」という用語は、完全長配列の連続した残基を含むが、この完全長配列のＮ末端および／またはＣ末端側のいくつかの残基が欠けている分子のことをいう。いくつかの実施形態では、「フラグメント」は、本明細書中に記載された完全長配列の１または複数の部分を含む。いくつかの実施形態では、「フラグメント」は、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかをコードする配列を含まないが、内部フラグメントをコードする配列のみを含む。いくつかの実施形態では、「フラグメント」は、本明細書中に記載されたＳｍａｄ７活性の１または複数を有する、生物活性のあるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリペプチドフラグメントは、少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０個のアミノ酸を有する。
変異体の特化した種類が融合タンパクである。概して、この分子は天然分子の全てまたは実質的に一部分を有し、これが、ＮまたはＣ末端で第２のポリペプチドの全てまたは一部分に連結している。しかしながら、いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、本開示全体にわたって説明されるフラグメントおよび／またはトランケートされた（Ｎ末端、Ｃ末端）Ｓｍａｄ７タンパク質のいずれか１つを含んでもよい。例えば、融合は、異種宿主でのタンパク質の組換え発現を可能にするために、他の種由来のリーダー配列を用いてもよい。別の有用な融合は、任意の機能的に活性なドメインの付加を含み、このドメインは、限定されるのものではないが、例えば、抗体エピトープおよび／または精製タグ
Figure 0006576251
である。融合の別のタイプは、活性化または不活性化リガンドの標的として作用し得るドメインを付着することで、対象にひとたび送達された際に融合タンパク質の制御を可能にする。そのようなドメインは、例えば、ステロイドリガンド結合（例えば、ＥＲ、ＰＲ、ＧＲ）を含み、これは、４−ヒドロキシルタモキシフェンまたはＲＵ４８６などの小分子によって活性化されることができ、該分子は、該ステロイドリガンド結合ドメインを独自に活性化でき、かつ／または、天然には存在せず、したがって該小分子の存在によりＳｍａｄ７機能を完全に制御することが可能である。
本技術における特に有用である融合タンパク質の別の特定の形態は、細胞送達ドメインまたは細胞形質導入領域とも呼ばれる、タンパク質導入領域（ＰＴＤ）を含む融合である。そのようなドメインは、当該技術分野において説明されており、通常、短い両親媒性またはカチオン性ペプチドおよびペプチド誘導体を特徴とし、しばしば、複数のリジンおよびアルギニン残基を含む（Fischer, Med. Res. Rev. 27:755-795 (2007)）。いくつかの実施形態において、ＰＴＤはＨＩＶ
Figure 0006576251
、あるいは代替的に、ＨＳＶ ＶＰ１６の１または複数の変異体である。Ｔａｔのほかの形態を用いることが可能である。いくつかの実施形態において、リンカーを、１または複数のＰＴＤとＳＭａｄ７とを接続するために用いてもよい。いくつかの実施形態において、ＰＴＤ（任意にＴａｔ）が、インフレームで、本開示の全体にわたって記載されているＳｍａｄ７の完全長、フラグメント、および／またはトランケートされた（Ｎ末端、Ｃ末端）タンパク質のいずれか１つのＮ末端および／またはＣ末端に、融合または連結される。本技術によって提供されるＰＴＤの他の例を、表１に示す。
（表１）タンパク質導入ドメイン
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特定の実施形態において、本技術は、１または複数の残基が変えられたＳｍａｄ７の配列変異体を提供する。例えば、一実施形態において、ヒトＳｍａｄ７配列の２１６位にあるメチオニン残基がロイシン残基に改変されている（ＡＴＧからＣＴＧへ）。
Ｃ．処置の方法
Ｓｍａｄ７で処置可能な疾患および障害として、細胞増殖の減少、細胞遊走の減少、細胞死の増加、過度の炎症、および／またはＤＮＡ損傷のうちの１または複数を含むものが挙げられる。Ｓｍａｄ７関連疾患および障害としては、限定されるものではないが、増殖を増加させること、細胞死を減らすか抑制すること、過度の炎症を減らすこと、ＤＮＡ損傷を防ぐこと、および／または細胞遊走を増加させることを含む１または複数の活性を有するＳｍａｄ７タンパク質ならびにその生物活性フラグメントおよび誘導体による処置が役立つものが挙げられる。そのような疾患および／または障害として、限定されるものではないが、急性（例えば、外科手術、格闘、外傷による）および慢性創傷（例えば、糖尿病性、褥瘡性、静脈性の潰瘍）、瘢痕、線維症、および異常治癒、粘膜炎（例えば、口腔および／または胃腸）、口内炎、直腸炎、自己免疫疾患（例えば、乾癬、関節炎）、ならびに癌が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載した疾患および／または障害の１または複数を、そのような処置を必要としている対象に対して、本開示に記載した１または複数のＳｍａｄ７タンパク質（例えば、完全長または生物活性のあるトランケートされたもの（例えば、Ｎ末端またはＣ末端）、あるいはそのフラグメント）を治療上有効量与えることによって、予防、処置、および／または改善することが可能である。いくつかの実施形態では、１または複数のＳｍａｄ７タンパク質は、ＰＴＤドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、１または複数のＳｍａｄ７タンパク質は、Ｌｅｕ２１６を有する。いくつかの実施形態では、Ｓｍａｄ７タンパク質は、１または複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物の一部をなす。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載した疾患および／または障害の１または複数が、そのような処置を必要としている対象に対して、本開示に記載した１または複数のＳｍａｄ７タンパク質（例えば、完全長または生物活性のあるトランケートされたもの（例えば、Ｎ末端またはＣ末端）、あるいはそのフラグメント）をコードする１または複数の核酸分子を治療上有効量与えることによって、予防、処置、および／または改善することが可能である。いくつかの実施形態では、１または複数の核酸分子は、コドン最適化ヌクレオチド配列および／またはＬｅｕ２１６をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、１または複数のＳｍａｄ７核酸分子は、発現ベクターを含むコンストラクトで対象に与えられる。いくつかの実施形態では、Ｓｍａｄ７核酸分子（任意に、発現ベクターの一部分）は、１または複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物の一部をなす。
本明細書中に使用される「対象」または「患者」という用語は、本明細書中に記載された処置の１または複数を用いる処置および／または予防を必要としているヒトまたは非ヒト動物のことをいう。いくつかの実施形態では、非ヒト動物として、サル、マウス、ラット、およびウサギなどの実験動物、イヌおよびネコなどの家庭内ペット、ならびにウマ、ブタ、ヤギ、およびヒツジなどの家畜が挙げられる。
１．慢性創傷
慢性創傷は、大多数の創傷のように順序正しい段階を踏んで予測可能な時間内に癒える、ということはない創傷であり、3ヵ月以内に治癒しない創傷は、慢性的であるとしばしばみなされる。慢性創傷は、創傷治癒の段階の１または複数で引き止められるようである。例えば、慢性創傷はしばしば、あまりにも長い間、炎症期に残る。急性創傷において、コラーゲンなどの分子の産生と破壊との間には、正確なバランスがある。慢性創傷において、このバランスは失われて、破壊があまりにも大きな役割を担う。
本明細書中の他の場所でより詳細に説明されるように、ＰＴＤ−Ｓｍａｄ７は、マウスの皮膚モデルおよび粘膜モデルで創傷治癒を増強することが示された。ＰＴＤ−Ｓｍａｄ７の適用は、局所経路で効果的であり、このことは創傷処置にとって望ましい。理論に束縛されることを意図するものではないが、ＰＴＤ−Ｓｍａｄ７が複数の経路を介して慢性創傷を処置または改善するべく作用すると考えられ、このような経路として、炎症を減少させること、細胞増殖を増加すること (例えば、ケラチノサイト)、細胞遊走を増加させること (例えば、ケラチノサイト)、または 線維症を減少させること (例えば、コラーゲンの調節を介して）のうちの１または複数を挙げることが可能である。
慢性創傷は決して治癒する可能性がないか、または何年もかかる可能性がある。これらの創傷は、患者に重篤な精神的および肉体的ストレスを生じさせるとともに、患者および医療制度全体に著しい経済的負担をかける。急性創傷と慢性創傷は、創傷治癒タイプの範囲の両端にあり、異なる速度での治癒へ進む。大多数の慢性創傷は、3つのカテゴリーに分類され得る。すなわち、静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、および圧迫潰瘍である。これらのカテゴリーに分類されない少数の創傷は、原因（例えば放射線障害または虚血）に起因する場合がある。
静脈および動脈潰瘍。通常脚に起こる静脈性潰瘍は、慢性創傷の約70%〜90%を占めて、大部分は年輩者に影響を及ぼす。それは、静脈に存在して血液の逆流を防ぐ弁の不適当な機能によって生ずる静脈高血圧によると考えられる。虚血は、機能不全から生じ、再灌流障害と組み合わさることで、創傷を導く組織損傷を引き起こす。
糖尿病潰瘍。慢性創傷の別の主な原因である糖尿病は、有病率が増加している。糖尿病は、慢性潰瘍により、一般集団よりも１5%高い切断のリスクを有する。糖尿病によって神経障害が生じ、それにより痛覚および疼痛の認知が抑えられる。したがって、患者は下腿と足に対する小さい創傷に最初、気がつかない場合があり、そのため、感染または損傷繰り返しを防止できない場合がある。さらに、糖尿病によって免疫低下および小血管の損傷が生じ、組織の十分な酸素投与が妨げられ、このことにより慢性創傷が生じ得る。圧力も、糖尿病潰瘍の形成に一役担う。
圧迫潰瘍。もう一つの主要なタイプの慢性創傷は、一般に圧力がかかる身体部分、例えば踵、肩甲骨、および仙骨などの動きを抑制する麻痺などの症状のある人々に通常起こる、圧迫潰瘍である。圧迫潰瘍は、組織への圧迫が毛細管内の圧力よりも大きく、それによりこの領域への血流が制限される場合に生ずる、虚血に起因する。皮膚よりも多くの酸素と栄養分とを必要とする筋肉組織は、長期間にわたる圧力から受ける最悪な影響を示す。他の慢性潰瘍と同様に、再灌流障害は組織に損傷を与える。
慢性創傷は、表皮および真皮のみに影響を及ぼし得るか、または筋膜にまで及ぶ組織に影響を及ぼし得る。慢性創傷は、本来、急性創傷を引き起こすのと同じもの、例えば手術または偶発的な外傷によって、形成され得る。あるいは、全身感染の結果として、脈管、免疫、もしくは神経の不全、または腫瘍形成もしくは代謝疾患などの共存症を形成し得る。理論に束縛されることを意図するものではないが、損傷が慢性的になる理由は、損傷に対処する体の能力が、例えば反復される外傷、持続的な圧力、虚血、または疾患などの因子によって、押さえ込まれることである。慢性創傷をもたらす主な要因のいくつかは、虚血、再灌流障害、および細菌コロニー形成を含むが、これに限定されるものではない。
虚血。虚血は、特に（通常そうであるように）それが反復して起こる場合または患者の高齢期と組み合わさった場合、創傷の形成および持続における重要な要素である。虚血は、組織に炎症を引き起こさせ、細胞に、インターロイキン、ケモカイン、ロイコトリエン、および補体因子などの好中球を引きつける因子を生じさせる。
病原体と戦う間、好中球は細胞に損傷を与える炎症性サイトカインと酵素も放出する。それらの重要な機能の１つは、細菌を殺菌するために活性酸素種（ＲＯＳ）を生じることであり、そのためミエロペルオキシダーゼと呼ばれる酵素を使用する。好中球および他の白血球によって生成される酵素およびＲＯＳは、細胞に損傷を与えて、ＤＮＡ、脂質、タンパク質、ＥＣＭ、および治癒を促進するサイトカインに損害を与えることによって、細胞増殖および創傷閉鎖を妨げる。好中球は、急性損傷の場合よりも長期にわたって慢性創傷に残存し、慢性創傷がより高いレベルの炎症性サイトカインおよびＲＯＳを有するという事実に寄与する。慢性創傷からの創傷液がプロテアーゼおよびＲＯＳを過剰に持つので、その液体自体が、細胞成長を阻害して、ＥＣＭの増殖因子およびタンパク質を分解することによって、治癒を阻害する可能性がある。
細菌コロニー形成。創傷環境にあるより多くの酸素によって白血球がＲＯＳを生じて細菌を殺すので、組織酸素化が不十分な患者、例えば外科手術中に低体温症に罹患した患者は、感染のリスクが高い。細菌の存在に対する宿主の免疫応答は、炎症を長引かせて治癒を遅らせ、組織にダメージを与える。感染は、慢性創傷だけでなく、壊疽、感染した肢の喪失、および患者の死亡にもつながり得る。
虚血のように、細菌コロニー形成および感染は、より大きな数の好中球を創傷部位に侵入させることによって、組織に損傷を与える。慢性創傷を有する患者は、抗生物質に対する耐性を持つ細菌を生じさせる時間を持ち得る。さらに、薬剤耐性菌株、例えばメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に感染している患者は、よりいっそう慢性的な創傷を呈する。
増殖因子とタンパク質分解酵素。慢性創傷は、エラスターゼとマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）などのタンパク質分解酵素のレベルはより高いが血小板由来増殖因子およびケラチノサイト増殖因子などの増殖因子の濃度はより低いという点でも、急性創傷と性質が異なる。
増殖因子（ＧＦ）が適時な創傷治癒に不可避であることから、不十分なＧＦレベルは慢性創傷形成の重要な要素であり得る。慢性創傷において、増殖因子の形成および放出が妨げられる場合があり、そのような因子が隔離されて代謝的な役割を遂行できない場合または細胞もしくは細菌のプロテアーゼによって過剰に分解される場合がある。
糖尿病性および静脈性の潰瘍などの慢性創傷は、線維芽細胞の障害によっても生じ、十分なECMタンパク質を産生して、ケラチノサイトにより創傷を上皮化する。線維芽細胞遺伝子発現は、急性創傷と慢性創傷で異なる。
すべての創傷が適切に治癒されるには特定のレベルのエラスターゼとプロテアーゼとが必要であるにもかかわらず、あまりにも高い濃度は有害である。創傷部の白血球は、エラスターゼを放出し、それが炎症を増加させて、組織、プロテオグリカン、およびコラーゲンを破壊し、さらに、増殖因子、フィブロネクチン、およびプロテアーゼを阻害する因子に悪影響を及ぼす。エラスターゼの活性は、慢性創傷に見られる最も豊富なタンパク質であるヒト血清アルブミンによって、増加する。しかしながら、アルブミンが不十分である慢性創傷は特に治癒する可能性が低いので、創傷の該タンパク質レベルを調整することが慢性創傷を治癒させるのに役立つと今後証明されるであろう。
白血球によって放出される過剰なマトリックスメタロプロテイナーゼは、創傷が慢性的になる原因になり得る。MMPは、ECM分子、増殖因子、およびプロテアーゼ阻害因子を壊すので、分解を増やす一方で構造を縮小させ、これにより、産生と分解との間のデリケートな妥協点のバランスを崩してしまう。
口腔潰瘍。口腔内潰瘍（口腔潰瘍または粘膜潰瘍とも称される）は、口腔の粘膜に生じる潰瘍である。より簡潔に言えば、口腔内潰瘍は口内のただれすなわち露出した病変である。口腔内潰瘍は、かなり一般的なもので、多くの疾患に関連して、かつ多くの異なる機序によって起こるが、通常、深刻な基礎原因がない。口腔潰瘍化の2つの最も一般的な原因は、局所外傷（例えば、歯の詰め物の鋭い縁で擦られる）とアフタ性口内炎（「口内びらん」）であり、これは、大多数が未知の理由による口腔潰瘍の再発形成によって特徴づけられる状態である。 唇上または口周囲の皮膚上の潰瘍が一般的な用語である口腔潰瘍化に含まれると考えられることもある（例えば、口唇疱疹、すなわち口辺ヘルペスに起因する水疱の破裂が残す潰瘍）。口の中の潰瘍によって、多くの場合、痛みと不快感が起き、治癒が生じている間にその人の食べ物の好みが変わる可能性がある（例えば、酸性または辛い食品および飲料を避ける）。それらは、単独で起こる場合があり、あるいは、多数の潰瘍が同時に起こる場合がある（潰瘍の「集団」）。一旦形成されると、潰瘍は炎症および／または二次感染によって維持される可能性がある。まれに、何週間もの間治癒しない口腔内潰瘍は、口腔癌の徴候である場合がある。他の原因は、熱傷、化学損傷、または感染を含む。
粘膜潰瘍は、より詳しくは粘膜に生じる潰瘍である。潰瘍は、上皮結合組織辺縁を貫通した組織欠損であり、その基底は粘膜下組織の深いレベル、またはさらに、筋肉もしくは骨膜の中にある。潰瘍は、びらんまたは表皮剥離よりも深い上皮の破損であり、上皮と粘膜固有層への損傷を含む。びらんは、上皮の表面の破損であり、その下にある粘膜固有層に対する損傷はほとんどない。粘液性びらんは、特に粘膜に生じるびらんである。表皮または粘膜の表面の上皮細胞だけが失われ、病変は基底膜の深さに達する可能性がある。びらんは、瘢痕化なしで治癒する。表皮剥離は、びらんより深いが潰瘍より浅い上皮の破損を説明するのにしばしば用いられる用語である。この種の病変は、乳頭間突起にはほとんど関係なく、そして、露出した毛細血管ループに起因する点状出血（小さなピンヘッドスポット）を示す。
２．急性創傷／外傷
身体的外傷とは、足の切断など、重篤かつ身体に変化をもたらす身体的損傷である。鈍器外傷は、鈍器からまたはそれにより加えられた衝撃または他の力に起因する身体的外傷の一種であり、一方、穿通性外傷は、皮膚または組織に物体が突き通る身体的外傷の種類である。外傷は、事故などの計画されていないもの、または、外科手術の場合の計画されたものとしても、記述され得る。両方とも、軽度から重度の組織損傷、失血、および／またはショックによって特徴づけられることができ、両方とも敗血症を含む二次的な感染をもたらす場合がある。本技術は、前処理（医療処置の場合）および外傷性損傷が起こった後の処置を含む、外傷性障害の処置を提供する。
本明細書中のほかのところで述べられるように（そして簡単に上記したように）、ＰＴＤ−Ｓｍａｄ７は、マウス皮膚モデルと粘膜モデルとで創傷治癒を増強するということが知られている。ＰＴＤ−Ｓｍａｄ７の適用は局所経路を介すると効果的であった。このことは、創傷処置にとって望ましい。理論に束縛されることを意図するものではないが、ＰＴＤ−Ｓｍａｄ７は、数多くあるなかで、炎症を減少させること、細胞増殖（例えば、ケラチノサイト）を増加させること、細胞遊走（例えば、ケラチノサイト）を増加させること、または線維症（例えば、コラーゲンの調節を通して）を減少させることの１または複数を含み得る複数の経路を介して、創傷を処置または改善するように作用し得ると考えられている。以下に簡単に述べられるように、炎症の減少は、任意に、脈管形成およびコラーゲン産生の減少、ならびに／または、白血球浸潤の減少（それは、白血球によって通常放出される脈管形成性および線維形成誘導性であるサイトカインおよびケモカインの減少をもたらす）を介して、創傷治癒促進に著しく寄与し得る。Ｓｍａｄ７による一時的治療により、創傷治癒に必要とされる初期脈管形成およびコラーゲン産生が可能になる一方で、長期の脈管形成とコラーゲン産生を防ぐことが可能である。これらの変化によって、潜在的に創傷間質再造形が加速され、未解決の炎症またはコラーゲン生産過剰による過剰な瘢痕が防止されよう。手術的処置（ならびに日常的な損傷）にとって、特に瘢痕の可能性が問題となる箇所で、Ｓｍａｄ７による治療は有益であると思われる。
外科手術。外科手術は、患者に対する手術の手動技術および器械技術を、疾患または損傷などの病態を調査および／または処置するために、身体の機能または外見の改善を促すために、あるいはいくつかの他の理由のために、使用する。さらに以下で定義されるように、本技術は外科手術から生じている外傷に対処することができる。
一般に、手技が患者の組織の切断または以前より継続している創傷の閉鎖を伴うとき、その手技は外科的であるとみなされる。このような説明に必ずしも該当するというわけではない他の手技、例えば血管形成または内視鏡検査は、一般的な外科的処置またはセッティングを含む場合、例えば、無菌環境、麻酔、消毒的な条件、典型的外科器械、および縫合またはステープリングを伴う場合、外科手術と考えられる場合もある。外科手術のすべての形態は、侵襲性手技と考えられ、いわゆる非侵襲性外科手術とは、切除術（例えば、角膜のレーザアブレーション）または放射線外科手技（例えば、腫瘍の照射）のことをいう。外科手術は、数分から数時間かかり得る。
外科的処置は、緊急性、手技の種類、関係する体組織、侵襲性の程度、および特殊な器具使用で一般に分類される。待期的手術は、非致命的な状態を直すために行われ、患者の要請に応じて実施され、外科医と手術施設の空き状況とに影響される。救急手術は、生命、四肢、または機能を保つために迅速に行われなければならない外科手術である。診査手術は、診断を補助するか、確認するために実施される。治療的外科手術は、既に診断された症状を処置する。
切断は、身体部位、通常、四肢または指の切断が含まれる。再移植は、切断された部位を再び取り付けることを伴う。再建手術は、体の損傷、切断、または変形した部分の再建を伴う。美容手術は、それ以外は正常な構造の外観を改善するためになされる。切除術は、患者から器官、組織、または他の身体部位を切断することである。移植手術は、別のヒト（または動物）からのものを患者に挿入することによって行われる、器官または身体の部位の置換である。生きているヒトまたは動物から器官または部位を移植用に取り出すことも、一種の外科手術である。
外科手術が1つの臓器系または構造に対して実施される場合、それは器官、臓器系、または関係する組織によって分類可能である。例として、心臓外科手術（心臓に対して実施）、胃腸外科手術（消化管とその付属器の範囲内で実施）、ならびに整形外科手術（骨および／または筋肉に対して実施）が挙げられる。
腹腔鏡手術または血管形成の場合のように、低侵襲手術は、体腔または構造内に小型化された器具を挿入するために、外側に比較的小さな切開部（複数可）を必要とする。対照的に、開腹手技は、目的の領域に到達するために大きな切開部を必要とする。レーザー手術は、組織を切開するために、小刀または類似の外科器械の代わりにレーザー装置の使用を必要とする。マイクロサージェリーは、小さい構造を見るために、外科医用の手術用顕微鏡の使用を必要とする。ロボット外科手術は、外科医の指導のもと装置を制御するべく、手術ロボット（例えばDa VinciまたはZeus手術システム）を使用する。
３．自己免疫/炎症性疾患
本技術は、種々の自己免疫および／または炎症性疾患の症状、例えば、脊椎関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、腸炎性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸疾患、炎症性腸疾患、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、家族性地中海熱、筋萎縮性側索硬化症、シェーグレン症候群、初期の関節炎、ウイルス性関節炎、多発性硬化症、または乾癬の処置を、企図する。これらの疾患の診断および処置は、文献において十分に実証されている。
一般に、自己免疫疾患は、身体に通常存在し、通常の免疫応答の対象ではない物質および組織に対する、身体の過敏性免疫応答に関連する。自己免疫疾患は８０種類以上があり、そのいくつかは、類似の症状を呈し、さらに、類似の基礎原因から生ずる場合がある。自己免疫疾患の典型的な徴候は炎症であり、それは本明細書中に開示されているようにＳｍａｄ７（任意にＰＴＤ−Ｓｍａｄ７）組成物による処置の対象になる。
４．化学療法、放射線療法、およびサイトカイン療法の毒性
癌患者において、化学療法、放射線、およびサイトカインを含む癌治療の様々な形態は、毒性を伴い、これは時として重篤である。本技術は、この毒性を本技術の医薬組成物を用いて減少させることで、患者の身体部位の不快感を減らすとともに、高用量での治療ができるようにすることを、目指している。
この開示の全体を通じて詳細に述べられるように、マウスモデルにおいてＰＴＤ−Ｓｍａｄ７が口腔粘膜炎を治癒させかつ防ぐことが明らかになった。直接比較において、ＰＴＤ−Ｓｍａｄ７が既存の口腔粘膜炎予防薬であるパリフェルミンよりも効果的であることが示された。
世界的に6番目に最も頻度の高い癌である口腔癌は、頭頸部癌の亜型であり、口腔に位置するあらゆる癌組織の増殖を含む。それは、口腔組織のいずれかに由来する原発病巣として、遠隔起源からの転移によって、または、鼻腔などの解剖学的隣接構造から広がることによって、生じ得る。あるいは、口腔癌は口の組織のいずれかから生じる場合があり、変化に富む組織型、すなわち奇形腫、大唾液腺または小唾液腺に由来する腺癌、扁桃または他のリンパ組織に由来するリンパ腫、あるいは口腔粘膜の色素産生細胞に由来する黒色腫であり得る。数種類の口腔癌があるが、およそ９０％は扁平上皮癌であり、口および唇の内側を覆う組織から生じる。口腔または口の癌は、最も多くの場合、舌を侵す。それは、口腔底、頬内壁、歯肉（歯茎）、唇、または口蓋（口の頂部）に生ずる場合もある。大部分の口腔癌は顕微鏡下で非常に類似しているように見え、扁平上皮癌と呼ばれている。これらは悪性で、急速に広がる傾向がある。
口腔癌患者の８０％以上は放射線治療で処置され、これらの人たちの少なくとも７５％が口腔粘膜炎を発症する。口腔粘膜炎は、慢性の口腔潰瘍化である。この疾患は、臓器移植のため（移植の拒絶を排除するために）に放射線処置を受けている患者とルーチンの化学療法を受けている患者を含むがこれに限られない、すべての癌型の放射線治療患者に、しばしば起こる。重篤な口腔粘膜炎はかなりの痛みを伴い、食物／液体の摂取量が損なわれ、それゆえに、多くの場合、癌治療で最も重篤な合併症である。口腔粘膜炎は、頭頸部領域に対する放射線療法および化学療法で可能な最大量を決定する主要な要因である。それは、癌治療を著しく困難にして入院を延ばし、生活の質を減少させ、経費を上昇させる。
現在のところ、重篤な口腔粘膜炎を効果的に処置する確立された治療法はない。現在まで、ヒトケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）の組換えタンパク質であるパリフェルミン（KEPIVANCE（登録商標））が、骨髄移植患者の重篤な口腔粘膜炎に対する静脈注射（ｉ．ｖ．）用の唯一のＦＤＡ認可薬であり、癌患者におけるその使用は決定されないままである。それは、口腔粘膜炎の予防にも使用される。それ故、この薬が利用可能なのは、リスク集団のわずか４％である。これはまた、静脈（ｉ．ｖ．）投与経路のために、医療従事者を必要とする。可能性のある他の治療法には、粘着性のある２％リドカインリンス、または重曹および生理食塩水の溶液、またはカクテル溶液、例えばＢＡＸ（リドカイン、ジフェンヒラミン、ソルビトール、およびMYLANTA（登録商標））などの、局所的なリンスが含まれる。他の研究用または粘膜保護用のアジュバント療法として、限定されるものではないが、ベータカロチン、トコフェロール、レーザー照射、口腔粘膜への硝酸銀の予防的塗布、ミソプロストール、ロイコボリン、全身性ＫＧＦ、ペントキシフィリン、アロプリノールうがい薬、全身性スクラルファート、グルコン酸クロルヘキシジンと寒冷療法が挙げられる。
化学療法および放射線によって誘発される腸粘膜炎は、急速に分裂する腸上皮細胞の急性死の結果として生ずる炎症症状である。単独または薬もしくは放射線との併用で充実性腫瘍の処置に使用される大部分の化学療法薬は、多数の腸上皮細胞の死をもたらす。引き続いて起こる粘膜炎の臨床症状は、悪心嘔吐、重篤な下痢、急性体重減少、および消耗などの消化器症状を含む。これは、多くの癌患者の化学療法を行う際の制限因子の１つに、急速になっている。化学療法薬、放射線、またはそれらの組合せから腸上皮細胞を保護するＴａｔ−Ｓｍａｄ７の能力は、癌治療の望ましくない副作用を有意に減少させ、既存のツールを用いて疾患を処置するためのより積極的な方法を可能にする。
骨髄不全症候群は、造血幹細胞コンパートメントが損なわれて正常細胞型を生ずるのに失敗する場合に発症する一群の症状である。骨髄不全は、遺伝した遺伝学的異常の結果として、毒素、化学物質、またはウイルスなどの有害物質への暴露の結果として、起こる。後天性骨髄不全の発現をもたらし得る環境的要因の性質および独自性は、まだ完全に理解されていないが、マスタードガス、電離放射線、および感染因子（例えば内臓リーシュマニア症またはアフリカトリパノソーマ症）に晒された軍人の間で、いくつかの因子が後天性骨髄不全の発現との関連性があった。骨髄不全症候群の管理のための最善のアプローチは、残存している十分な数の常在性骨髄ＨＳＣがこれらのストレスから免れることができて、造血コンパートメントに再び住みつくように促すことができない限り、依然として、造血幹細胞（ＨＳＣ）の移植である。ここで述べられるように、Ｓｍａｄ ７の調節は、骨髄不全と一致した臨床徴候を示す患者に残っている常在ＨＳＣを周到に保護することを可能にしなければならない。
５．癌
ＴＧＦ−βおよびＮＦ−κＢの活性化が癌浸潤および転移を促進させるということは、知られている。現在、ＴＧＦ−β阻害因子は、転移性癌を処置することに関して臨床試験中であり、ＮＦ−κＢ阻害因子が癌予防で使用されている。ＴＧＦ−βおよびＮＦ−κＢのシグナル伝達を遮断することに対して示されたＳｍａｄ７の効果は、これが、これらの２つの経路のうちのわずか１つを阻害する他の阻害因子よりもさらに強い抗癌／抗転移剤である可能性を示す。Ｓｍａｄ７は、脈管形成と線維発生とを妨げることが示されており、したがって、それは、腫瘍が血液供給および／または間質を発達させることを必要とする状況において、特に有用であると思われる。
癌は、脳、肺、肝臓、脾臓、腎臓、リンパ節、小腸、膵臓、血球、結腸、胃、胸部、子宮内膜、前立腺、睾丸、頸部、子宮、卵巣、皮膚、頭頸部、食道、骨髄、および血液の癌からなる群から選択され得る。癌は、転移性または原発性、再発性、あるいは多薬剤耐性であり得る。いくつかの実施形態において、癌は充実性腫瘍（器官腫瘍）である。充実性腫瘍は、臓器系で増殖し、身体のどこにでも生じ得る細胞の塊のことをいう。２種類の充実性腫瘍には、器官の内側または外側にある上皮組織に生ずる上皮性腫瘍（癌腫）と、結合組織、例えば、限定されるものではないが、筋肉、腱、脂肪、神経、および身体の構造および器官を支持し、取り巻き、または接続する他の結合組織に生じる肉腫（結合織腫瘍）とが、含まれる。いくつかの実施形態において、癌は、液性腫瘍、または血液、骨髄もしくはリンパ節の癌である。これらの腫瘍には、白血病、リンパ腫、および骨髄腫が含まれるが、これらに限定されるものではない。
６．瘢痕、線維症、および異常治癒
再上皮形成の促進（例えば、細胞増殖を増加すること、および／または、細胞遊走を増加させることを介して）に加えて、創傷間質に対するＳｍａｄ７効果は、中でも、炎症、脈管形成またはコラーゲン産生を減少させることの１または複数を含む。理論に束縛されることを意図するものではないが、これらの効果は、ＮＦ−κＢシグナル伝達の減少（ｐ５０の減少で立証）とＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害（ｐＳｍａｄ２の減少で立証）を介して、媒介され得る。その結果、炎症の減少は、任意に、脈管形成およびコラーゲン産生の減少、ならびに／または、白血球浸潤の減少（それは、白血球によって通常放出される脈管形成性および線維形成誘導性であるサイトカインおよびケモカインの減少をもたらす）を介して、創傷治癒促進に著しく寄与し得る。Ｓｍａｄ７による一時的処置は、長期の脈管形成およびコラーゲン産生を防ぐ一方で、創傷治癒にとって必要な初期脈管形成およびコラーゲン産生を可能にし得る。これらの変化は、潜在的に創傷間質再造形を加速することができて、未解決の炎症またはコラーゲン生産過剰に起因する過剰な瘢痕を予防すると思われる。
７．口内炎
口内炎は口の構造のいずれかの粘液ライニングの炎症であり、それは頬部、歯茎、舌、唇、咽頭、口蓋、または口底を含む場合がある。炎症は、例えば口腔清掃不良、食事のタンパク欠乏、十分に適合していない義歯による、または、熱い食物または飲物に起因した口熱傷、有毒植物に起因する、口自体の状態によって、あるいは、全身に影響を及ぼす状態、例えば薬物、アレルギー反応、放射線治療、または感染症によって、引き起こされ得る。重篤な鉄欠乏性貧血は、口内炎をもたらし得る。鉄は、細胞複製および修復のための転写要素のアップレギュレーションに必須である。鉄の欠乏は、これらの要素の遺伝学的ダウンレギュレーションを生じ得るので、上皮細胞の修復および再生が、特に口および唇において、無効になり得る。この状態は、ビタミンＢ２（リボフラビン）、Ｂ３（ナイアシン）、Ｂ６（ピリドキシン）、Ｂ９（葉酸）、またはＢ１２（コバラミン）の欠乏を持つ人々でも、一般的である。歯肉（歯茎）の炎症も伴う時、それは口内炎と呼ばれている。それは、リボフラビン欠乏症（リボフラビン欠乏症）または好中球減少で見られる場合もある。
唇の角が過敏になったり亀裂が生じたりすることは、口角びらん症または口角炎と呼ばれる。小児において、口角びらん症は、繰り返して唇をなめることが頻繁な原因である。成人において、それは潜在的な鉄欠乏性貧血の徴候、またはビタミンＢ（例えば、Ｂ２−リボフラビン、Ｂ９−葉酸、もしくはＢ１２コバラミン）の欠乏であり、そのことは、質の悪い食生活または栄養失調（例えば、セリアック病）の証拠になり得る。また、口角炎は、患者の顎が、安静時に、無歯性または歯牙摩耗により、完全な／無影響の歯列が存在する場合よりも上顎と下顎とが近接して静止するようになる、「過蓋咬合（overclosed）」状態にあることに、起因し得る。このことによって、唾液により湿り気が保たれて感染にとっては好ましい皮膚のひだが、口角の周りに生じる。感染の大部分はカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）または類似の種による。処置は、通常局所ナイスタチンまたは類似の抗真菌剤の投与を必要とする。別の処置は、歯科治療（例えば、義歯または咬合調整）により顎関係を修正することである。
遊走性の口内炎は、口腔粘膜の広い領域が薄い白い縁に囲まれている輪状で萎縮性の赤い病変に影響を受けている状態である。これは、地図状舌状態の比較的まれな形態であり、遊走性の口内炎と対照的に、それは、舌粘膜の背面および側面のみに限定される。
８．直腸炎
直腸炎は、肛門に至る大腸の下端部である直腸ライニングの炎症である。直腸炎で、直腸粘膜と呼ばれる直腸ライニングの炎症は、不快であり、時々痛みを伴う。他の症状の中でも、その症状は出血または直腸からの粘液分泌物をもたらす場合がある。直腸炎のいくつかの原因として、限定されるものではないが、肛門性交中に伝染するもの（例えば、淋疾、クラミジア、梅毒、およびヘルペス）などの性感染病（ＳＴＤ）と、食品由来細菌（例えば、サルモネラおよび赤痢菌）などによる非ＳＴＤ感染症と、肛門性交または直腸への物体または物質の挿入（例えば、浣腸による化学物質）による肛門直腸外傷と、結腸および直腸の内側ライニングで潰瘍（例えば、ただれ）を引き起こし得る、潰瘍大腸炎およびクローン病または他の炎症性腸疾患と、直腸出血に至る可能性がある、特に骨盤領域（例えば、直腸、卵巣、または前立腺癌）の、放射線治療と、有害な細菌（例えば、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile））に疾患を引き起こさせる、片利共生細菌の喪失をもたらす抗生物質とが挙げられる。
９．製剤および投与経路
臨床応用が企図される場合、意図された適用に適した形状で医薬組成物（タンパク質、発現ベクター、ウイルスストック、タンパク質および薬）を調製することが必要である。通常、これは、発熱物質、およびヒトまたは動物に有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを必要とする。
ＰＴＤ−Ｓｍａｄ７（およびトランケートされた変異体）は、動物モデルで使用される前に、徹底的に精製された。ＰＴＤ−Ｓｍａｄ７（およびトランケートされたバージョン）は、グリセロールとＰＢＳとの混合物を用いた局所および経粘膜適用を目的として調製された。
ベクターが安定になるように、かつ標的細胞による取り込みが可能になるように、適当な塩類および緩衝液を使用することが、一般に望まれる。組換え細胞が患者に導入される場合に、緩衝液も使用される。本技術の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散された、細胞にとって有効な量のベクターを、含む。そのような組成物も、接種材料と呼ばれる。「薬学的にまたは薬理学的に許容される」という言い回しは、動物またはヒトに投与された際に有害反応、アレルギー反応、または他の副作用を生じない分子的実体および組成物のことをいう。本明細書中に使用される「薬学的に許容される担体」には、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌物質、抗真菌剤、等張性薬剤、および吸収遅延剤のいずれかおよびすべてが包含される。このような媒体及び薬剤を薬学的に活性な物質に使用することは、当該技術分野において周知である。いかなる慣用の媒体および薬剤も本技術のベクターまたは細胞と不適合でない限りは、治療用組成物に使用することが企図されている。補助活性成分も、組成物に包含することができる。
本技術の活性組成物は、典型的な製剤を含んでもよい。本技術によるこれらの組成物の投与は、経路が標的組織に利用可能である限り、任意の一般的な経路を介して行われる。そのような投与経路として、経口投与（静脈、筋肉内の、皮下、皮内、関節内、滑液包内、鞘内、動脈内、心臓内、皮下、眼窩内、包内、脊椎内、間質内、および経皮を含む）、経鼻、経頬、経尿道、経直腸、経膣、経粘膜、経皮、および局所（皮膚、頬、および舌下）を挙げることが可能である。あるいは、投与は同所、皮内で、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内注射によるものであってもよい。そのような組成物は、通常、上記された薬学的に許容される組成物として、投与される。特に関心対象となるのは、直接腫瘍内投与、腫瘍の灌流、または、例えば、局所的もしくは部位的な脈管構造もしくはリンパ系における、あるいは切除された腫瘍床における、腫瘍に対する局所的または部位的な投与である。投与は、鼻噴霧、外科的インプラント、外科的体内ペイント、注入ポンプを介して、または、カテーテル、ステント、バルーン、もしくは他の送達装置を介して、行い得る。最も有用な、および／または有益な投与様式は、特にレシピエントの状態と処置している疾患とに応じて、変化し得る。
遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての有効化合物の溶液は、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と水中で適当に混合されて調製され得る。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれら混合物中、および油中で分散液を調製することもできる。通常の貯蔵及び使用の条件下で、これらの調製物は微生物の増殖を防ぐための保存剤を含む。
注射用途に適した薬学的形態として、滅菌水溶液または分散液、および、滅菌注射用溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末があげられる。すべての場合において、形態は無菌でなければならず、かつ容易に注射器に流入できる程度に流体でなければならない。それは、製造および貯蔵の条件下に安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して、保護されていなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グルリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、およびその他）、それらの適当な混合物、ならびに植物油を含む、溶媒または分散媒であり得る。適する流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とする粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、保持し得る。微生物作用の防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの種々の抗細菌剤および抗菌類剤によって、なされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長期間にわたる吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中で使用することによって、行うことができる。
滅菌注射液は、必要量の活性化合物を、前述の様々な他の成分を含む適当な溶媒に取り込み、その後、必要に応じてろ過滅菌して調製される。一般的には、分散液は、様々な滅菌された活性化合物を、基礎分散媒と前述の所望の他の成分のうちの必要とされるものとを含む滅菌ビヒクルに取り込むことにより、調製される。滅菌注射液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、あらかじめろ過滅菌した溶液から活性成分およびいずれかの所望の追加成分の粉末を得る真空乾燥法及び凍結乾燥法である。
本明細書中で使用される「薬学的に許容される担体」には、分散媒、コーティング、抗菌剤、および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、およびその他のいずれか、または、すべてが含まれる。医薬活性物質にそのような媒体および薬剤を用いることは、当該技術分野において周知である。いかなる従来の媒体および作用物質も活性成分と不適合でない限りは、治療用組成物に使用することが企図される。補助活性成分は、組成物に包含される。
本技術の組成物は、中性のまたは塩の形態で処方されてもよい。薬学的に許容される塩類は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）を含み、塩酸またはリン酸などの無機酸、あるいは、酢酸、酒石酸、マンデル酸、およびその他のような有機酸により、形成される。遊離のカルボキシル基と共に形成される塩もまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から、誘導され得る。
製剤は、種々の剤形で容易に投与される。投薬量のある程度の変動は、処置されている対象の状態によって、必然的に起こる。投与に対して責任がある人は、いずれにしても、個々の対象のために適当な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与のために、製剤は、 FDA OfficeのBiologics規格によって、必要に応じて、滅菌、発熱原性、一般安全性、および純度標準を満たさなければならない。
経口投薬のために、本技術のポリペプチドが、賦形剤とともに取り込まれてもよく、摂取不可なうがい薬および歯みがき剤の形態で使用されてもよい。当業者に既知の、例えばコーティング、時間遅延、徐放、その他を含む、実質的に任意の丸薬またはカプセルを、本技術とともに使用し得ると、考えられる。うがい薬は、ホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）などの適当な溶媒に必要量の活性成分を取り入れて調製され得る。あるいは、活性成分を、ホウ酸ナトリウム、グリセリン、および炭酸水素カリウムを含む消毒洗浄液に取り込ませてもよい。活性成分を、ゲル類、ペースト、クリーム、粉末、およびスラリーを含む歯みがき剤に分散させてもよい。活性成分は、治療上有効量で、水、結合剤、研磨材、香味物質、発泡剤、および湿潤剤を含み得るペースト歯みがき剤に、添加可能である。
経口投薬にふさわしい医薬組成物は、例えば錠剤、カプセル、カプレット、およびウエハー（急速溶解性または泡立ち作用を含む）などの様々な形態をとってもよく、各々が所定量の活性薬剤を含む。また、組成物は、粉体または顆粒、水溶液または非水溶液中の溶液または懸濁液、あるいは液体エマルジョン（水中油型または油中水型）としての形態であってもよい。活性薬剤はまた、ボーラス、舐剤、またはペーストとしても送達され得る。上記の剤形の製剤の方法が通常、当該技術分野で知られており、任意のそのような方法が、組成物の送達での使用のための各々の剤形の調製に適していると、一般に理解される。
一実施形態では、活性薬剤化合物は、薬学的に許容されるビヒクル（例えば、不活性希釈剤または食用の担体）と組み合わせて経口投与され得る。経口組成物は、硬質または軟質シェルゼラチンカプセルに入れてもよく、あるいは錠剤に取り込まれてもよく、あるいは患者の食事の食物に直接取り込まれてもよい。組成物と製剤との割合を変化させてもよい。しかし、そのような治療的に有効な組成物中の物質の量は、好ましくは、有効投与量レベルが得られる量である。
活性薬剤化合物を含んでいる硬カプセルは、生理学的に分解可能な組成物（例えばゼラチン）を使用して作られてもよい。そのような硬カプセルは該化合物を含み、例えば、不活性固体希釈剤（例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはカオリン）を含んでいる添加成分を、さらに含んでもよい。該化合物を含む軟ゼラチンカプセルは、生理学的に分解可能な組成物（例えばゼラチン）を使用して作られてもよい。そのような軟カプセル剤は、該化合物を含み、これを、水または油媒体（例えば落花生油、流動パラフィン、またはオリーブ油）と混ぜ合わせてもよい。
舌下錠は、非常に急速に溶解するように設計されている。そのような組成物の例は、酒石酸エルゴタミン、イソソルビドジニトレート、およびイソプロテレノールＨＣＬを含む。これらの錠剤の組成物は、本剤に加えて、様々な可溶性賦形剤、例えば乳糖、粉末状のショ糖、ブドウ糖、およびマンニトールを含む。本技術の固形剤形は、必要に応じて、被覆されてもよい。適当な被覆材料の例として、限定されるものではないが、セルロースポリマー（例えば、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート）、ポリビニルアセテートフタレート、アクリル酸ポリマー、および共重合体、ならびにメタクリル樹脂（商品名EUDRAGIT（登録商標）で市販されているもの）、ゼイン、シェラック、ならびに多糖類が挙げられる。
医薬製剤の粉末状および顆粒状の組成物は、既知の方法を使用して調製されてもよい。そのような組成物が直接患者に投与されてもよく、あるいは、例えば、錠剤を形成するため、カプセルを充填するため、あるいは、水性または油性のビヒクルを添加することで水性または油性の懸濁液または溶液を調製するための、さらなる剤形の調製に用いられてもよい。これらの組成物の各々は、１または複数の添加剤、例えば分散剤、湿潤剤、懸濁化剤、および防腐剤を、さらに含んでもよい。さらなる添加剤（例えば、充填剤、甘味料、調味料または着色料）もこれらの組成物に含ませてもよい。
経口投薬に適した医薬組成物の液体組成物を調製し、包装し、および、液体形態、または、使用前に水もしくは他の適当なビヒクルで再構成することを意図した乾燥製品形態で販売してもよい。
本明細書中に記載された１または複数の活性薬剤化合物を含有する錠剤は、当業者に容易に知られる任意の標準的なプロセスによって、例えば圧縮または成形によって、必要に応じて１または複数のアジュバントまたはアクセサリ成分とともに、製造され得る。錠剤は、必要に応じてコーティングまたはスコアリングされてもよく、活性薬剤の徐放または制御放出を提供するように製剤化されてもよい。
例えばコーティングの塗布によって、固形剤形は、活性薬剤の遅延放出を提供するように製剤化されてもよい。遅延放出コーティングは当該技術分野で公知であり、それを含んでいる剤形は任意の既知の適当な方法により調製されてもよい。そのような方法は、固形剤形（例えば、錠剤またはカプレット）の調製後、遅延放出コーティング組成物が塗布されることを、一般に含む。塗布は、例えば、エアレス吹付け、流動浸漬塗装、糖衣器の使用、またはその他の方法によってなし得る。遅延放出コーティングとして使用する材料は、事実上、セルロース系材料（例えば、セルロースブチレートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、およびカルボキシメチルエチルセルロース）、ならびに、アクリル酸、メタクリル酸、およびそれらのエステルのポリマーの共重合体などの、重合体であり得る。
本技術による固形剤形はまた、徐放性であっても（すなわち、長期間にわたって活性薬剤を放出しても）よく、さらに、遅延放出であっても、そうでなくてもよい。徐放性組成物は、当該技術分野で知られており、徐々に分解可能または加水分解可能な材料、例えば、不溶性プラスチック、親水性ポリマー、または脂肪族化合物のマトリックス内に、薬物を分散することによって、一般に調製される。あるいは、固形剤形はそのような材料で被覆されてもよい。
非経口投与用の組成物は、抗酸化物質、緩衝剤、静菌薬、および溶質などの追加の薬剤をさらに含み得る水性および非水性の滅菌注射溶液を含み、それは、意図されたレシピエントの血液と等張である。組成物は、懸濁化剤および粘稠化剤を含有する水性および非水性の滅菌懸濁液を含んでよい。非経口投与用のそのような組成物は、例えば密閉アンプルおよびバイアルなどの単位投与量または複数回投与量の容器で提供されてもよく、使用直前に、無菌液体担体、例えば水（注射用）の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で貯蔵され得る。即席注射溶液および懸濁液を、既に記載した種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から、調製してもよい。
直腸送達のための組成物は、肛門坐剤、クリーム、軟膏、および液体を含む。坐剤は、通常、当該技術分野で一般に知られている担体、例えばポリエチレングリコールと併用される活性薬剤として、提供されてもよい。そのような剤形は、急速に崩壊、または、長期にわたって崩壊するように、設計されてよく、崩壊を完了する時間は、短時間（例えば約10分）から長期間（例えば約6時間）にわたることができる。
局所組成物は、体表面に活性薬剤を送達するために適したかつ当該技術分野で容易に知られる任意の形態であってもよく、経皮、頬側、および舌下が含まれる。局所組成物の典型的な例として、軟膏、クリーム、ゲル、ペースト、および溶液が挙げられる。口内投与用の組成物には、ロゼンジが含まれる。
これらの実施形態に従って、経口（局所、粘膜および／または皮膚）送達材料として、本明細書中に開示されている状態の処置および／または予防のための、クリーム、膏薬、軟膏剤、パッチ、リポソーム、ナノパーティクル、微粒子、徐放性の製剤、ならびに、対象の口腔、粘膜、および／または皮膚への送達用の当該技術分野で知られている他の材料も、挙げることができる。特定の実施形態では、生分解性の経口（局所、粘膜および／または皮膚）パッチ送達系またはゼラチン材料の使用に関係する。これらの組成物は、液状製剤またはこれらの組成物の処方により処置される薬学的に許容される送達系であり得るとともに、アクチベーター/インデューサーも含むことができる。
本技術の方法での使用のための組成物は、経皮的に投与されてもよく、ここで、活性薬剤が積層構造（一般に「パッチ」と呼ばれる）に組み込まれる。この積層構造は、長期間にわたってレシピエントの表皮に密着して残存するのに適している。概して、そのようなパッチは、単層の「薬物含有接着剤（drug-in-adhesive）」パッチとして、または、多層のパッチとして用いられる。ここで、活性薬剤は、接着剤層とは離れた層に含まれる。どちらのタイプのパッチも、裏層およびレシピエントの皮膚に付着する前に取り除かれるライナを概ね含む。また、経皮的薬物送達パッチは、半透膜と接着剤層とによってレシピエントの皮膚から離れている裏層の下にあるリザーバーから構成されてもよい。経皮的薬物送達は、受動拡散、エレクトロトランスポート、またはイオン導入を介して、生じてもよい。
特定の実施形態において、本明細書中で企図されるパッチは、徐々に溶解するパッチまたは徐放性のパッチであってもよい。これらの実施形態によれば、ゆっくり溶解するパッチは、アルギン酸塩パッチであり得る。特定の例において、パッチは蛍光剤のような検出可能な指標染料または薬剤を含んでもよい。他の実施形態において、タグ（例えば、検出可能なタグ、例えばビオチンまたは蛍光性のタグが付けられた薬剤）は、対象に送達した後に分子を検出するために処置分子と結合することができる。特定の実施形態において、本明細書中で企図される１または複数の経口送達パッチまたは他の処置は、医療専門家によって評価されるように対象の要求に応じて、１日に３回、１日に２回、１日に１回、１日おき、週に１回などで、投与してもよい。本明細書中で企図されるパッチは、経口生分解性パッチ、または、分解性または非分解性の外用パッチであってもよい。本明細書中で企図されるパッチは、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ〜５ｍｍの大きさ、または必要に応じてそれ以上の大きさであってもよい。加えて、例えば、皮膚パッチは、乾癬を患っている対象での使用のために本明細書中で企図される。乾癬および慢性創傷を処置する際に、ビヒクル（例えばグリセロール、カルボキシメチルセルロース）を使用して、Ｓｍａｄ７を局所送達することができる。それは、送達用の経皮系（例えば、３Ｍから商業的に入手可能）を使用することもできる。病変への皮下注射（生理食塩水またはＰＢＳ中）を用いることもできる。
いくつかの実施形態において、本明細書中で述べられるように、組成物が化合物の投与を達成するという条件で、組成物は短期性、即効性、急速消失性、制御放出性、徐放性、遅延放出性、およびパルス放出性の組成物を含んでもよい。全体が本明細書中に援用されるRemington's Pharmaceutical Sciences (18th ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990)を参照のこと。
特定の実施形態において、本明細書中で開示される化合物および組成物は、医用機器を介して送達され得る。そのような送達は、通常、挿入可能または移植可能な医用機器を介することができ、例えば、限定されるものではないが、ステント、カテーテル、バルーンカテーテル、シャント、またはコイルが挙げられる。１つの実施形態において、本技術は、本明細書に記載された化合物または組成物により表面が被覆されている、ステントなどの医用機器を提供する。この技術の医用機器は、本明細書に開示したようなものなどの疾患または状態の経過を処置、予防、またはさもなければそれらに影響を及ぼすための、いかなる用途にも使用され得る。
当該技術分野で知られているあらゆる分子生物学、細胞生物学、または生化学の技術が本明細書中に提供される処置の生成および／または検証に用いられ得ると考えられる。加えて、タンパク質化学技術は、本明細書中で開発されるモデル系（例えば、マウスモデル系）での処置の有用性を評価するために企図される。
１０．併用療法
多くの医学分野で、しばしば「併用療法」と呼ばれる複数の治療法により疾患を処置することは、一般的である。本明細書中に記載された疾患（例えば、炎症性疾患および癌）の多くも例外ではない。いくつかの実施形態において、本技術の方法および組成物を用いて炎症性疾患を処置するために、標的細胞、器官、または対象をＳｍａｄ７タンパク質、発現コンストラクトまたはアクチベーターと、および少なくとも１種類の他の療法と接触させることが考えられる。これらの治療法は、１または複数の疾患パラメーターの減少を達成するのに有効な合計量で、提供される。このプロセスは、細胞／対象を両方の薬剤／療法に同時に、例えば両方の薬剤を含む単一組成物または薬理学的製剤を用いて、または、細胞／対象を２つの異なる組成物または製剤に同時に接触させることによって、接触させることを伴ってもよく、ここで一方の組成物がＳｍａｄ７薬剤を含み、他方が他の薬剤を含む。
あるいは、Ｓｍａｄ７薬剤は、数分間から数週間の範囲の間隔で、他の治療に先行しても、後続してもよい。治療が有利な複合効果を細胞／対象に対して及ぼし続けることが可能であるように、有効な期間が各送達時間の間で期限切れにならないことが、通常保証されるであろう。このような場合には、細胞を両方の治療法に、互いの約１２〜２４時間以内に、互いの約６〜１２時間以内に、または、単に約１２時間の遅延時間で、接触させることが意図される。いくつかの状況では、しかしながら、有意に治療期間を延長することが望ましい場合があり、ここではそれぞれの投与の間で、数日（２、３、４、５、６または７）から数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８）が経過する。
また、Ｓｍａｄ７薬剤または他の治療のいずれかを複数回投与することが求められると、考えられる。以下に説明されるように、様々な組合せを用いることが可能であり、Ｓｍａｄ７薬剤が「Ａ」であり、他の治療法が「Ｂ」である。
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他の併用が提供される。炎症性疾患に対する併用療法での使用に適している他の薬剤として、ステロイド、糖質コルチコイド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ；ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２阻害薬を含む）、アスピリン、イブプロフェン、およびナプロキセンが挙げられる。鎮痛薬は抗炎症薬を一般的に連想させるが、これは抗炎症効果を持たない。一例は、パラセタモールであり、米国ではアセトアミノフェンと呼ばれ、Tylenolという製品名で販売された。ＣＯＸ酵素を阻害することで痛みと炎症とを少なくするＮＳＡＩＤＳとは対照的に、パラセタモールはエンドカンナビノイドの再取り込みを遮断することが最近になって示されており、これにより痛みのみを減らし、このことが、炎症に対して最小限の影響しか有さない理由をおそらく説明している。併用して使用するための特定の薬剤は、抗ＴＧＦ−β抗体である。
当業者は、Remington's Pharmaceutical Sciences、第15版、第３３章、特に頁６２４〜６５２、１９９０年に注目する。投薬量のある程度の変動は、処置されている対象の状態によって、必然的に起こる。投与に対して責任がある人は、いずれにしても、個々の対象のために適当な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与のために、製剤は、 FDA OfficeのBiologics規格によって、必要に応じて、滅菌、発熱原性、一般安全性、および純度標準を満たさなければならない。
また、前述の治療法のいずれかが炎症を処置する際に単独で役立つ可能性があると指摘されなければならない。
上記のように、本技術は、特定の抗癌治療に起因する、または癌の処置のための、ＤＮＡ損傷および／または炎症の処置に対して、特定の関連性がある。したがって、より具体的には、本技術は、癌治療との併用として適用され得る。このプロセスは、細胞、器官、または患者を、同時に薬剤／治療と接触させることを伴い、それには、細胞、組織、または患者を両方の薬剤を含む単一の組成物または薬理学的製剤と、あるいは、２つの異なる組成物または製剤と同時に接触させることが含まれ、一方の組成物がＳｍａｄ７薬剤を含み、他方が他の薬剤を含む。あるいは、上記のチャートに類似して、組成物を異なる時間で送達することができ、一方または両方の薬剤の反復投与が含まれる。
併用療法の使用に適している薬剤または因子は、細胞に適用されるとDNA損傷を誘発する任意の化学物質または処置方法を含む。そのような薬剤および因子は、DNA損傷を誘発する放射線および波、例えば照射、マイクロ波、電子放出、およびその他を含む。「化学療法薬」または「遺伝子毒性薬剤」ともいう種々の化学物質は、本明細書中で開示される併用処置方法で有用であることを意図している。本技術によって癌を処置する際に、発現コンストラクトに加えて薬剤を腫瘍細胞に接触させることが考えられる。これは、局在性腫瘍部位を放射線で治療することによって達成され得る。あるいは、腫瘍細胞は、対象に医薬組成物の治療上有効量を投与することで、薬剤と接触され得る。
様々な種類の化学療法薬は、本技術のペプチドと併用させての使用に提供される。例えば、タモキシフェン、4-ヒドロキシタモキシフェン（Afimoxfene）、フェソロデックス、ラロキシフェン、バゼドキシフェン、クロミフェン、フェマレル（Femarelle）、ラソフォキシフェン、オルメロキシフェン、およびトレミフェンなどの選択的なエストロゲン受容体拮抗薬（「SERM」）である。
使用が企図される化学療法薬は、例えば、カンプトテシン、アクチノマイシンD、マイトマイシンＣを含む。また、本技術は、放射線ベースまたは実際の化合物のいずれかの１または複数のDNA損傷剤の併用も含み、例えばシスプラチンとＸ線の使用またはエトポシドとシスプラチンの使用であってよい。薬剤は、上記したように、それとＭＵＣ１ペプチドとを組み合わせることによる、複合治療用組成物、またはキットとして、調製かつ使用されてもよい。
熱ショックタンパク質90（Heat shock protein 90）は、多くの真核細胞で見つかる調節タンパク質である。ＨＳＰ９０阻害因子は、癌の処置に役立つことが示された。そのような阻害因子として、ゲルダナマイシン、１７−（アリルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン、ＰＵ−Ｈ７１、およびリファブチンが挙げられる。
直接ＤＮＡを架橋するか、または付加生成物を形成する薬剤も、想定される。シスプラチンおよび他のＤＮＡアルキル化剤も使用されてもよい。シスプラチンは、合計３クールで３週ごとに５日間、２０ｍｇ／ｍ２の臨床適用で使用される有効用量で、癌を処置するために広く使われていた。シスプラチンは経口吸収されないので、静脈内に、皮下、腫瘍内、または腹膜内注入を介して送達されなければならない。
ＤＮＡにも損害を与える薬剤は、ＤＮＡ複製、有糸分裂、および染色体分離を邪魔する化合物を含む。そのような化学療法化合物として、アドリアマイシン（別名ドキソルビシン、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシンなど）が挙げられる。これらの化合物は、新生物の処置のための臨床設定で幅広く使われており、ボーラス注入により投与され、ドキソルビシンの場合は２１日間隔、２５〜７５ｍｇ／ｍ２の範囲の用量で静注、エトポシドの場合は３５〜５０ｍｇ／ｍ２の用量で静注または静注の用量を倍にして経口投与される。また、微小管阻害因子（例えばタキサン類）も企図される。これらの分子はイチイ属植物によって作られるジテルペンであり、パクリタキセルおよびドセタキセルを含む。
イレッサなどの上皮成長因子受容体阻害因子、ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳類標的）は、ＦＫ５０６結合タンパク質１２−ラパマイシン結合タンパク質１（ＦＲＡＰ１）として知られており、細胞成長、細胞増殖、細胞運動、細胞生存、タンパク質合成、および転写を調節するセリン／トレオニン・プロテインキナーゼである。ラパマイシンとそのアナログ（「ラプログ」）は、本技術に従って癌治療との併用用に提供される。
本明細書中で特許請求されるペプチドによるもう一つの可能性がある併用療法は、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子アルファ）であり、これは、全身性炎症に関与するサイトカインであり、かつ急性期反応を刺激する一群のサイトカインのメンバーでもある。ＴＮＦの当初の役割は、免疫細胞の調節である。また、ＴＮＦは、アポトーシス性細胞死の誘発、炎症の誘発、ならびに腫瘍形成およびウイルス複製の阻害を行うことも可能である。
核酸前駆体およびサブユニットの合成および正確さを破壊する薬剤も、ＤＮＡ損傷をもたらす。このように、多くの核酸前駆物質が開発された。特に役立つのは、広範囲にわたる試験を受けて直ちに利用可能な薬剤である。このように、５フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの薬剤が新生物組織によって優先的に使われ、この薬剤が新生物細胞のターゲッティングに特に有用となる。かなり有毒であるにもかかわらず、５−ＦＵは広範囲にわたるキャリアに適用でき、局所投与が含まれるが、一般に使用されている静脈内投与の用量範囲は、３〜１５ｍｇ／ｋｇ／日である。
ＤＮＡ損傷を引き起こすとともに広範囲に使われている他の因子には、γ線、Ｘ線、および／または腫瘍細胞に対する放射性同位元素の直接送達として一般に知られているものが含まれる。ＤＮＡ損傷因子の他の形態は、マイクロ波とＵＶ照射なども企図される。これらの因子の全てが、広範囲の損傷ＤＮＡを生じ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体のアセンブリおよびメインテナンスに影響を及ぼす可能性が高い。Ｘ線の照射量は、長期間（３〜４週間）にわたる１日線量の５０〜２００レントゲンから単回照射量の２０００〜６０００レントゲンまでの範囲である。放射性同位元素の用量は、幅広く変動し、同位元素の半減期、照射される放射線の強度および種類、ならびに新生細胞による取り込みに依存する。
当業者は、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１５版、第３３章、特に頁６２４〜６５２に注目する。投薬量のある程度の変動は、処置されている対象の状態によって、必然的に起こる。投与に対して責任がある人は、いずれにしても、個々の対象のために適当な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与のために、製剤は、 FDA OfficeのBiologics規格によって、必要に応じて、滅菌、発熱原性、一般安全性、および純度標準を満たさなければならない。
Ｓｍａｄ７療法を化学および放射線療法と併用することに加えて、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、および外科手術との併用も考えられる。具体的には、AVASTIN（登録商標）、ERBITUX（登録商標）、GLEEVEC（登録商標）、HERCEPTIN（登録商標）、およびRITUXAN（登録商標）、などの標的療法を用いることが可能である。
他の実施形態において、口腔粘膜炎という状況のなかで、Ｓｍａｄ７の役割および機序を評価するために、「遺伝子スイッチ」トランスジェニックマウスモデルが、特に口腔上皮でのＳｍａｄ７導入遺伝子発現のレベルおよび期間の制御を可能にするために開発された。これらの実施形態に従って、これらのモデルは、他の遺伝子または下流分子について口腔上皮および口腔粘膜に対するそれらの効果を試験するために、用いられ得る。このように、これらのモデルは、限定されるものではないが、口腔創傷治癒生物学のさらなる分析と口腔創傷を治癒するための治療的なアプローチの試験に、使用することができる。これらの研究で特定される分子Ｓｍａｄ７標的は、口腔粘膜炎を罹患している対象に、さらなる治療標的を提供することができる。本明細書中で開発されるモデルおよびリソースは、Ｓｍａｄ７過剰発現に関連するバイオマーカーおよび治療標的を同定するための分析研究用の独特なツールを提供することができ、さらには、制御、例えば、Ｓｍａｄ７によってオンになるまたはＳｍａｄ７によって結合される下流分子を、ＴＧＦ−β活性とＮＦ−κＢ活性とによって悪化する、例えば、口腔粘膜炎、乾癬、および他の症状を処置するための、さらなる治療標的として同定することができる。
Ｄ．キット
特定の実施形態において、本明細書中に提供されるキットは、本明細書中に示される症状、例えば、限定されるものではないが、口腔粘膜炎、乾癬、または創傷治癒を有する患者を処置するための上述の組成物を含み得る。キットは、本技術に係る治療用Ｓｍａｄ７組成物が入った１または複数の容器を含むことができる。いずれのキットも概ね、少なくとも１本のバイアル、試験管、フラスコ、ビン、シリンジ、または他の容器を含み、その中に、組成物が好ましくは、および／または、適切に等分されてもよい。また、本明細書中のキットは、本明細書中に定める状態の一因となる生物学的標的を評価するためのキットも含み得る。
Ｅ．反応を予測または評価する方法
Ｓｍａｄ７への暴露と関連した１または複数のマーカーの発現のレベルを評価することを用いて、Ｓｍａｄ７による処置に対する応答を予測および／または評価するための方法も、提供される。そのようなマーカーとして、限定されるものではないが、細胞移動用のＲａｃ１、炎症用のＮＦ−κＢ、ならびに成長停止および炎症用のＴＧＦ−βを含む。実施例で検討されるように、Ｓｍａｄ７活性に関連した１または複数のマーカーのレベルの検出および／または変更の方法が当該技術分野で提供および／または公知である。いくつかの実施形態では、Ｓｍａｄ７マーカーの１または複数が対象内で発現するレベルを評価することが可能であり、検出されたレベルに基づいて、Ｓｍａｄ７による処置を行うこと（または処置の継続または中断）あるいは代わりの処置を使用することを決定することが可能である。
本明細書中で使用される「の検出」という用語は、ある反復可能かつ制御されたレベルで、マーカーの有無を測定する能力のことをいう。概して、検出は、試験系に固有のノイズ（または検出限界）が含まれ得るバックグラウンド値よりも上で実施される。このように、例えば、アッセイに関連した検出の「下限」があり、検出されるためには、変化が特定の限界レベルを上回る必要があると考えられる。そのような限度の決定は、周知の技術である。
いくつかの実施形態において、検出は対照と比較して実施され、これは、限定されるものではないが、正常対象由来の、および／または、対象に存在する疾患または障害をもたない（同一または異なる対象の）比較可能な正常組織（または試験した対象の特定の組織）由来のデータとの比較を含み得る。いくつかの実施形態において、比較は、患者において様々な時間間隔（および／または位置）で検出されるレベルの間であってもよい。いくつかの実施形態において、検出はバックグラウンドまたは対照レベルと比較して統計的に有意な必要がある。有意性を評価する能力は、周知の技術であり、実施例で例証される。
本明細書中に用いられる「レベルの変化」は、対照またはバックグラウンドのレベルおよびまたは、以前の検出されたレベルからの、検出可能な変化のことをいう。いくつかの実施形態において、変化は別のレベルと比較した増加であり、いくつかの実施形態において、変化は別のレベルと比較した減少である。いくつかの実施形態において、検出可能な変化（増加または減少）は、統計的に有意である。いくつかの実施形態において、そのような変化は、少なくとも約５％、１０％、２５％、５０％、１００％、２００％、５００％、またはより大きな変化、および／または、約５〜１０％、１０〜２５％、１０〜５０％、２５〜５０％、５０〜７５％、５０〜１００％、１００〜１５０％、１００〜２００％、２００〜３００％、３００〜５００％、もしくは５００〜１０００％変化として、定量的に評価され得る。
Ｆ．付加的生物活性フラグメントをスクリーニングするための方法
別の態様では、Ｓｍａｄ７の付加的生物活性フラグメント（限定されるものではないが、トランケーション）をスクリーニングするための方法が企図される。いくつかの実施形態では、生物活性は本明細書に記載された方法の１つを用いて評価されてもよく、以下の実施例５および８に記載されている方法が含まれる。評価されることができる生物活性のいくつかには、限定されるものではないが、細胞増殖を高めること、細胞死を減らすか抑制すること、過度の炎症を減らすこと、ＤＮＡ損傷を防ぐこと、および／または 細胞遊走を増加させること、ならびに、処置が本明細書中でさらに議論されるように有用であると思われる１または複数の疾患または障害に対して動物モデルの処置または予防を行うこと、が含まれる。そのような活性は、限定されるものではないが、以下を含む１または複数のアッセイを用いて評価され得る：マウスおよび他のラボモデルにおいて、Ｓｍａｄ２のリン酸化および／またはＮＦ−κＢ ｐ５０サブユニットの核転座を妨げる能力、細胞増殖を増加させる能力と、アポトーシスおよび／または放射線誘発ＤＮＡ損傷を減らす能力と、炎症および／または血管新生を減らす能力と、口腔粘膜炎、手術性創傷、糖尿病創傷および／または慢性炎症を伴う創傷で治癒を促進する能力。いくつかの具体例は、限定されるものではないが、アポトーシスの免疫蛍光アッセイ（ＩＦ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、およびＴＵＮＥＬアッセイを含む。
いくつかの実施形態において、生物活性フラグメントは、本明細書中に記載された活性の１または複数を含むべく選択されるものである。いくつかの実施形態では、生物活性フラグメントは、本明細書中に記載された活性のわずかまたは主に１つ、わずかまたは主に２つ、わずかまたは主に３つ、わずかまたは主に４つ、あるいはわずかまたは主に５つを含むべく選択されるものである。いくつかの実施形態では、生物活性フラグメントは、本明細書中に記載された活性のわずかまたは主に１つ、わずかまたは主に２つ、わずかまたは主に３つ、わずかまたは主に４つ、あるいはわずかまたは主に５つを含むべく選択されるものである。いくつかの実施形態において、生物活性フラグメントは、本明細書中に記載された活性のうち特定のサブセットを除外するべく、選択される。例えば、増殖および遊走の増加は、糖尿病性創傷を処置する上で十分であると思われるが、慢性炎症性創傷には抗炎症性が必要である。アポトーシスおよびＤＮＡ損傷活性の減少は、口腔粘膜炎を処置する上で必要であるが、手術性創傷の処置には必要ではない。
本明細書中で使用される「主に含む」という用語は、「主に」とみなされた活性が、完全長の天然タンパク質で観察されるのとほぼ同一または増加したレベルのままである一方で、他の生物活性はあるレベルのままであってもよいが完全長フラグメントと比較して減少している、フラグメントをいう。同様に、本明細書中で使用される「主に除外する」という用語は、特定の生物活性はあるレベルのままであってもよいが該レベルは完全長フラグメントと比較して減少（任意で有意におよび／または統計学的に有意に減少）している一方で、他の生物活性の１または複数は、完全長の天然タンパク質で観察されるレベルとほぼ同一または増加したレベルのままである、フラグメントをいう。
生物活性フラグメントの選択を伴ういくつかの実施形態では、方法は、１または複数の生物活性の発現のレベルの変化を評価することを含み、それには、選択されたフラグメントの１または複数の活性の増加および減少が完全長タンパク質で観察された活性を基準とした変化として評価されることが、含まれる。いくつかの実施形態では、１または複数の生物活性は、他の活性が増加または減少、あるいは除去されている可能性もある（例えば、そのようなフラグメントが、議論した活性の１または複数を欠いている）一方で、完全長フラグメントで観察されるものと同様のままであるように選択されている。いくつかの実施形態では、別のレベルと比較した変化が増加であり、いくつかの実施形態では、別のレベルと比較した変化が減少である。いくつかの実施形態では、検出可能な変化（増加または減少）は、統計的に有意である。いくつかの実施形態において、そのような変化は、少なくとも約５％、１０％、２５％、５０％、１００％、２００％、５００％、またはより大きな変化、および／または、約５〜１０％、１０〜２５％、１０〜５０％、２５〜５０％、５０〜７５％、５０〜１００％、１００〜１５０％、１００〜２００％、２００〜３００％、３００〜５００％、もしくは５００〜１０００％変化として、定量的に評価され得る。いくつかの実施形態では、「同様のまま」は、完全長タンパク質の活性からいくらか変化があることがまだ観察され得るが、そのような変化は、例えば、約１％、２％、５％、１０％、または２０％変化またはそれ以下に制限され得る。
非限定的な例において、目的のフラグメントは、Ｓｍａｄ７の抗炎症効果を主に媒介するものを含み得る。この抗炎症性の機能があるＳｍａｄ７ペプチドは、限定されるものではないが、数あるなかでも、口腔粘膜炎、口内炎、および乾癬などの慢性炎症関連症状の処置に十分であり、かつ任意で、そのような処置の改善にもなり得る。別の非限定的な例では、目的のフラグメントは、細胞遊走ならびに／または、ＴＧＦ−β誘発増殖停止および／もしくは線維化反応の遮断を主に媒介するものを、含み得る。この細胞遊走および増殖の機能を有するＳｍａｄ７ペプチドは、過剰な炎症を伴わない治癒の増強十分であり、かつ任意でそのような増強の改善であり得る。この形態の処置から利益が得られるかもしれない創傷の種類には、限定されるものではないが、手術性創傷、線維症瘢痕、および糖尿病創傷、不完全な治癒、および／または瘢痕が含まれる。
Ｇ．Ｓｍａｄ７タンパク質を生産するための方法
別の態様において、Ｓｍａｄ７タンパク質を生産するための方法は、本明細書中に記載されたＳｍａｄ７変異体、フラグメント、トランケート、融合タンパク質（例えば、ＰＴＤ−Ｓｍａｄ７）が企図される。本発明者らは、核酸コドンの最適化を伴う研究、開発、または商業化に十分なレベルおよび純度で、Ｓｍａｄ７タンパク質を生産する方法を発見した。その結果、本明細書中（例えば、実施例内）に記載されたコドン最適化Ｓｍａｄ７核酸分子および分子の１または複数の使用が含まれるＳｍａｄ７を生産するための方法がはっきりと企図される。
以下の実施例は、様々な実施形態を例証するべく、挙げられる。当業者は、以下の実施例に開示された技術が、特許請求された方法、組成物、および装置を具体化する際に十分に機能することがわかった技術を表すことを、理解するべきである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みて、本技術の精神および範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態に多くの変更を加えることができること、さらに同様の結果または類似の結果も得られることを、理解すべきである。
実施例１：Ｋ５．Ｓｍａｄ７マウスは、口腔粘膜炎に対して抵抗力がある
ヒトＳｍａｄ７タンパク質をケラチノサイトで発現するトランスジェニックマウスモデル（Ｋ５．Ｓｍａｄ７）を、以前の記述通りに作った（Han et al., Dev. Cell, 11:301-312, 2006）。口腔上皮での導入遺伝子発現が確認された（図７Ａ〜Ｂ）。マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６の遺伝学的背景で交配させ、８〜１０週齢のオスおよびメスのトランスジェニックマウスと野生型の同腹仔とを研究に用いた。これらのマウスでは、治癒改善が皮膚切除創傷（Han et al., Am. J. Pathol., 179:1768-1779, 2011）と放射線誘発粘膜炎とで見られた。
Ｋ５．Ｓｍａｄ７マウスと野生型の同腹仔とを頭蓋照射に曝して、マウスの口腔粘膜炎を誘発するのに必要な生物学的等価線量（ＢＥＤ）を決定した。８Ｇｙｘ３（ＢＥＤ＝４３．２）（クリニックでの少分割放射線療法に関連したレジメン）が口腔粘膜炎を誘発するのに最小限の線量であったと決定した（図１Ａ〜Ｂ）。Ｓｍａｄ７効果の作用強度を評価するために、それらを頭蓋照射の単一の線量についても調べ、口腔粘膜炎重症度が１８Ｇｙ（ＢＥＤ＝５０．４）と２２Ｇｙ（ＢＥＤ＝７０．４）との間のＢＥＤ値と相関していることがわかった（図１Ａ〜Ｂ、図７Ｃ）。照射開始後の９日目までに、野生型マウスは口腔潰瘍を発症した（図１Ａ〜Ｂ）。
照射前のＫ５．Ｓｍａｄ７口腔粘膜は、野生型マウスと類似した形態を有していたが、 放射線誘発粘膜炎に対して抵抗力を示した（図１Ａ〜Ｂ）。組織学的分析により、ヒトの場合（図１Ｃ）と同様に野生型マウスが口腔粘膜炎を発症（図１Ａ）したことが明らかになった。中国の昆明医科大学第一付属病院（First Affiliated Hospital of Kunming Medical University）は、匿名保管された組織パラフィン切片を提供し、ヒト対象を適用外として研究を承認した。口腔粘膜炎病変は、放射線治療を受けた再発性口腔癌に隣接した舌、頬、または口腔咽頭粘膜に由来した。非照射口腔粘膜切片は、嚢胞（粘液嚢腫）に隣接して、外科的に取り出された睡眠無呼吸口腔組織および舌生検に由来した。
Ｋ５．Ｓｍａｄ７口腔上皮は、概して、照射線量依存的損傷を示した。すなわち、８Ｇｙｘ３照射後では上皮の菲薄化および舌乳頭の平坦化を示し、ならびに１８Ｇｙおよび２２Ｇｙ照射後ではよりいっそう損傷を受けた（不良または肥大化）上皮細胞を示した（図１Ａ）。ヒト口腔粘膜炎病変の白血球浸潤の増加（図１Ｃ）と矛盾することなく、野生型マウスの病変は、好中球、マクロファージ、および白血球（図７Ｄ）からなる多数の浸潤白血球（図１Ｄ〜Ｅ）を包含し、すべてがＫ５．Ｓｍａｄ７口腔粘膜で実質的に減少した（図１Ｄ〜Ｅおよび７Ｄ）。
急性相でヒトの口腔粘膜炎の病態を捕らえることが難しいので、潰瘍が実際に形成された時の増殖およびアポトーシスを評価するべく、マウスモデルが利用された。以前の報告と同様に、増殖細胞は照射を受けた野生型口腔上皮では乏しかったが、照射を受けたＫ５．Ｓｍａｄ７口腔上皮（図１Ｄおよび１Ｆ）では、より多く見られた。反対に、アポトーシス細胞は、野生型マウス（図１Ｄおよび１Ｇ）と比較して、照射を受けたＫ５．Ｓｍａｄ７口腔粘膜で有意に減少した。
予想されるように、核ＮＦ−κＢ ｐ５０サブユニットを有する細胞は非照射の野生型口腔粘膜（図２Ａ〜Ｂ）と比較して口腔粘膜炎で有意に増加した。興味深いことには、活性シグナル伝達メディエーター（リン酸化（ｐ）Ｓｍａｄ２）と一緒のＴＧＦ−β１（内臓の免疫抑制剤ではあるが、口腔粘膜では炎症誘発性）もまた、野生型マウスで、非照射の口腔粘膜と比較して経口粘膜炎において増加した（図２Ａ〜Ｂ）。類似の変化は、ヒト経口粘膜炎病変（図２Ａ〜Ｂ）でも検出された。
照射を受けたＫ５．Ｓｍａｄ７口腔上皮は、核ＮＦ−κＢ ｐ５０およびｐＳｍａｄ２に陽性の細胞を有意に減少させても、大量のＴＧＦ−β１タンパク質を有した（図２Ａ〜Ｂ）。照射を受けた野生型口腔粘膜のＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡは、９日目と１０日目とに有意に増加した（図２Ｃ）。Ｋ５．Ｓｍａｄ７粘膜のＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡレベルは、初期の時点に野生型粘膜と類似していたが、１０日目で正常に戻った（図２Ｃ）。あらゆる理論に束縛されることを望まないにもかかわらず、これらのデータは、ＴＧＦ−β１転写はＳｍａｄ７によって抑制されないが、Ｋ５．Ｓｍａｄ７粘膜でのより急速なその低下が治癒促進の結果であることを示唆する。
活性ＢＭＰシグナル伝達のマーカーであるリン酸−Ｓｍａｄ１／５／８は、照射の前後に、Ｓｍａｄ７の影響を受けなかった（図７Ｅ）。この結果は、ＴＧＦ−βシグナル伝達を優先的に阻害するＳｍａｄ７の能力と一致している。
実施例２：Ｒａｃ１は、Ｓｍａｄ７によって媒介されるケラチノサイト移動に関与する
Ｓｍａｄ７がヒト口腔ケラチノサイトにおける治癒の一因となるかどうか決定するために、Ｓｍａｄ７が、自然発生的に不死化したヒト口腔ケラチノサイト（ＮＯＫ−ＳＩ）においてノックダウンされ、Ｓｍａｄ−７ノックダウンは創傷後にケラチノサイト遊走を鈍化させた（図２Ｄおよび図８Ａ）。反対に、ＴＧＦ−β１をノックダウンすることはケラチノサイト遊走を加速し（図８Ｂ〜８Ｄ）、ＴＧＦ−β１またはＳｍａｄ３を欠損しているマウスで見られる創傷治癒促進と矛盾しなかった。
Ｓｍａｄ７媒介ケラチノサイト遊走に関連した分子機序を見つけるために、口腔創傷治癒に欠くことのできないタンパク質であるＲａｃ１を調べた。Ｒａｃ１は、Ｓｍａｄ７ノックダウン後に減少した（図２Ｅ）。口腔粘膜炎におけるＴＧＦ−β１過剰発現がＳｍａｄ非依存機序を介してＲａｃ１を活性化させると予想した。しかしながら、Ｒａｃ１タンパク質全体が照射後に２倍になったにもかかわらず、活性化Ｒａｃ１タンパク質は野生型の舌では顕著な変化はなかった（図２Ｆ）。
Ｋ５．Ｓｍａｄ７口腔粘膜では、全Ｒａｃ１および活性Ｒａｃ１は、野生型口腔粘膜と比較して、それぞれ４倍および８倍まで、顕著に増加した（図２Ｆ）。Ｓｍａｄ７誘発Ｒａｃ１活性化の機能的有意性を決定するために、野生型およびＳｍａｄ７トランスジェニック新生仔皮膚から単離した初代ケラチノサイトにおいて、Ｒａｃ１をノックダウンし、細胞増殖および遊走についてのアッセイを行った。Ｒａｃ１ノックダウンは、野生型およびＳｍａｄ７のケラチノサイトで穏やかな増殖の減少を示した（図９Ａ〜９Ｃ）。しかし、Ｓｍａｄ７誘発誘発遊走がほぼ完全に抑制された（図２Ｇおよび図９Ｄ）。このことは、Ｒａｃ１の増加がＳｍａｄ７媒介細胞遊走に寄与することを示唆した。
Ｓｍａｄ７トランスジェニックケラチノサイトのＲａｃ１ｍＲＮＡレベルの増加が全Ｒａｃ１および活性Ｒａｃ１タンパク質レベルと相関することが観察された（図３Ａ〜Ｂおよび図１０Ａ〜Ｂ）。このことは、Ｓｍａｄ７ケラチノサイトでのＲａｃ１活性化の増加が、少なくとも部分的に、Ｒａｃ１転写産物の増加の結果であることを示唆した。さらに、ＮＯＫ−ＳＩ細胞における個々のＳｍａｄのノックダウン（図１０Ｃ〜１０Ｅ）の後に、Ｒａｃ１タンパク質が約３倍に増加した(図３Ｃ）。これらのデータは、正常Ｓｍａｄシグナル伝達がＲａｃ１転写を抑制することを示唆する。
マウスＲａｃ１プロモーター（コード配列の−２．１Ｋｂおよび−１．５Ｋｂ上流）の、ヒトＲａｃ１プロモーターの類似領域にある２つの推定Ｓｍａｄ結合エレメント（ＳＢＥ）の間で、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）は、−１．５Ｋｂ部位（図３Ｄ）に結合するＳｍａｄ−２、−３、−４、および−７を特定したが、野生型ケラチノサイトの−２．１ｋｂ部位は特定せず、Ｓｍａｄ７トランスジェニックケラチノサイトではＳｍａｄ−２、−３、および−４の結合が著しく減少した(図３Ｄ）。
ＳＢＥ含有Ｒａｃ１−Ｌｕｃコンストラクトを用いたルシフェラーゼレポーターアッセイは、野生型ケラチノサイトのＳｍａｄ７のノックダウンがルシフェラーゼ活性を著しく減少させることを示す（図３Ｅ）。これとは反対に、Ｓｍａｄ７トランスジェニック細胞は野生型細胞と比較してルシフェラーゼ活性を増加させ、ＳＢＥを変異させることでこの増加を減衰させた（図３Ｆ）。このように、ＳＢＥと結合しているＳｍａｄ７は、Ｒａｃ１抑制を取り消すべくシグナル伝達Ｓｍａｄを駆逐するのに必要に見える。
既知のＳｍａｄ転写コリプレッサーのなかでも、ＣｔＢＰ１が野生型ケラチノサイトのＲａｃ１プロモーターＳＢＥ−１．５Ｋｂ部位と結合したこと（図３Ｇ）、および、Ｓｍａｄ７導入遺伝子発現がＳＢＥへのＣｔＢＰ１の結合を著しく減少させたこと（図３Ｇ〜Ｈ）が示された。ＣｔＢＰ１がＮＯＫ−ＳＩ細胞でノックダウンされた場合、Ｒａｃ１タンパク質およびＲａｃ１−Ｌｕｃ活性が、スクランブルされたｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたケラチノサイトに比べて増加した（図４Ａ〜Ｂ）。このことは、ＳＢＥ−１．５Ｋｂと結合しているＣｔＢＰ１がＲａｃ１発現を抑制することを示唆した。さらに、ＮＯＫ−ＳＩ細胞でＣｔＢＰ１をノックダウンすることは、それらの遊走を増加させた（図４Ｃおよび図１０Ｆ）。
放射線誘発口腔粘膜炎のＣｔＢＰ１タンパク質の試験に基づいて、ＣｔＢＰ１が非照射のマウスおよびヒトの口腔粘膜でかろうじて検出可能であることが判明した（図４Ｄ〜４Ｆ）。しかしながら、ＣｔＢＰ１陽性の細胞は、ヒト口腔粘膜炎と同様に野生型およびＫ５．Ｓｍａｄ７マウスの照射口腔粘膜で著しく増加した（図４Ｄ〜４Ｆ）。その上、照射を受けた野生型口腔粘膜のＣｔＢＰ１ ｍＲＮＡは、９日目と１０日目とに、著しく増加した（図４Ｇ）。Ｋ５．Ｓｍａｄ７粘膜のＣｔＢＰ１ ｍＲＮＡレベルは、初期の時点に野生型粘膜と類似していたが、１０日目までに正常まで減少した（図４Ｇ）。これらの結果は、Ｓｍａｄ７はＣｔＢＰ１ ｍＲＮＡを減少させないが、その代わりに、ＳＢＥ結合部位からＳｍａｄ／ＣｔＢＰ１複合体を退けることによって、Ｒａｃ１プロモーターに対するＣｔＢＰ１の結合を阻害することを示している。さらに、Ｋ５．Ｓｍａｄ７粘膜のより急速なＣｔＢＰ１減少は、治癒のマーカーとして用いられる。
実施例３：Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７は、放射線誘発口腔粘膜炎を軽減する
Ｓｍａｄ７導入遺伝子が口腔粘膜炎の複数の病理学的プロセスを妨害する能力を有することから、限局性のＳｍａｄ７送達が口腔粘膜炎の予防および処置に用いられ得るかどうか、迅速な調査が求められた。Ｓｍａｄ７が核タンパクであるので、唾液がタンパク質を洗い落とす前に、局所Ｓｍａｄ７送達によってＳｍａｄ７を急速に細胞に入れることが必要である。したがって、タンパク質が迅速に細胞膜を透過して核に入れるのを可能にするＮ末端Ｔａｔ−タグを有する組換えヒトＳｍａｄ７タンパク質を作製した。Ｖ５エピトープは、Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７の細胞透過を追跡するべく、Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７タンパク質のＣ末端端部に加えられた（図１１Ａ〜１１Ｄ）。
Ｓｍａｄ２リン酸化を妨げるその能力を使用して、Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７の生物活性を調べた（図１１Ｃ）。対照（図１１Ｅ〜Ｆ）と同じタグを有するＴａｔ−Ｃｒｅ組換えタンパク質を作り、Ｃ末端６ＸＨｉｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）をコードする配列を含むｐＥＴ１０１−Ｔｏｐｏタンパク質発現ベクター（Invitrogen）にクローニングした。Ｔａｔ−ＣｒｅによりＢＬ−２１ ＳＴＡＲ（商標）大腸菌（E. coli）（Invitrogen）を形質転換させてＴａｔ−Ｃｒｅタンパク質を産生させ、Ｎｉ−ＮＴＡカラムで精製した。
両タンパク質の純度および大きさは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を使用して調べた。Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７をマウス初代ケラチノサイトに加えて、インビトロでのＴａｔ−Ｓｍａｄ７タンパク質の形質導入および活性を評価した。スライドを５分間、冷メタノールで固定し、Ｖ５およびｐＳｍａｄ２の染色を行った。Ｔａｔ−Ｃｒｅ活性は、７，６５０ｂｐベクターｐＬＬ３．７（Addgene）からの１，４６０ｂｐフロックスフラグメントを消化することによって調べた。インビボでの処置のために、３０μＬの５０％グリセロール／ＰＢＳをビヒクル対照として、かつＴａｔ−Ｃｒｅを非無関係（non-irrelevant）なタンパク質対照として、使用した。Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７またはＴａｔ−Ｃｒｅ（３０μＬの５０％グリセロール／ＰＢＳにおいて、用量およびレジメンを各々の図において特定）をマウス口腔に局所適用し、マウスが経口摂取するのを１時間制限した。
口腔粘膜炎予防のために、Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７とＴａｔ−Ｃｒｅ（５０％グリセロール／ＰＢＳ中）とを８〜１０週齢のＣ３Ｈメス（Jackson Laboratory）またはＣ５７ＢＬ／６マウスの口腔に、照射２４時間前から開始し照射開始後８日目まで、毎日、局所適用した。処理した組織を９日目に調べた。マウス舌を収集し、１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、そして５μｍの切片に切断した。組織学的変化を分析し、Ｈ＆Ｅ染色スライドを使用して潰瘍を測定した。追加のグループに対して、照射に先だって３日間毎日、そして最後の照射量の２４時間後３日間にわたって毎日、臨床レジメン（すなわち、６．２５ｍｇｋｇ−１（ｉ．ｐ．））でパリフェルミン処置を施した。
Ｔａｔ−Ｃｒｅは、ビヒクル対照（図５Ａ〜Ｂ）と比較して、効果を示さなかった。Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７処置は、パリフェルミン（図５Ａ）と類似した潰瘍形成に対する予防的効果を示した。分割放射線照射（図１１Ｇ）よりも大きい口腔潰瘍を誘発した単回線量２０Ｇｙ（ＢＥＤ＝６０）が与えられた動物で使用された場合に、Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７の用量依存効果はより明らかだった。顕微鏡によって、パリフェルミン処置およびＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置の口腔粘膜はどちらも、大多数の症例で、開放性潰瘍化を防止した（図５Ｂ）。パリフェルミン処置粘膜は、Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７処置粘膜と比べて、より多くのケラチノサイトが下方増殖を示したが、より多くの損傷ケラチノサイトも示した（凝縮または炭様の核、膨潤単核または多核細胞、および角化層内の粉々にされた核粒子）（図５Ｂ）。免疫染色で、パリフェルミンがＴａｔ−Ｓｍａｄ７よりも著しく増殖を増加させることが分かった。Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７はアポトーシス、白血球浸潤、核ｐＳｍａｄ２およびＮＦ−κＢ ｐ５０を減少させたが、パリフェルミンは減少させなかった（図５Ｂ〜５Ｇ）。
既存の口腔粘膜炎の処置にＴａｔ−Ｓｍａｄ７を用いることができるかどうかを調べるために、マウスを分割（８Ｇｙｘ３）頭蓋照射に曝し、Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７（局所）またはパリフェルミン（６．２５ｍｇ・ｋｇ−１、ｉ．ｐ．）を照射開始後（粘膜損傷が明白だった場合）６日目から９日目まで毎日適用した。処置した組織は、１０日目に調べた。現行のプロトコールがマウスの口腔粘膜炎を減少させた時点よりも早くパリフェルミンの照射後投与を開始するにもかかわらず、現行のプロトコールによるパリフェルミン投与は、全ての口腔粘膜に対するその過剰増殖効果（図６Ｂ）と関係なく、潰瘍閉鎖を加速しなかった（図６Ａ）。パリフェルミンは口腔粘膜炎を予防することは認められているが、口腔粘膜炎を処置することは認められていないため、これは驚くべきでことではない。
分割線量照射および単回線量照射の両方の後、Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７処置口腔粘膜炎は、潰瘍サイズおよび病理学的変化が減少した（図６Ａ〜Ｂおよび図１２Ａ〜１２Ｇ）。潰瘍から離れたところでは、Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７処置口腔粘膜は、パリフェルミン処置口腔粘膜よりも、より少ない過形成とより多くの分化上皮とを示した（図６Ｂ）。分割放射線照射よりも治癒が遅くなる２０Ｇｙ単回線量照射により、創傷閉鎖後の回復に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７の効果がより明らかになった。ビヒクル処置潰瘍がちょうど再上皮化した時、Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７処置粘膜は正常な形態にほぼ回復していた（図６Ｃ）。
Ｋ５．Ｓｍａｄ７マウスにおける観察と矛盾することなく、Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７は、Ｒａｃ１プロモーター作用を増加させるとともに、マウスＲａｃ１プロモーター（図１２Ｇおよび１２Ｉ）のＳＢＥに対するＣｔＢＰ１の結合を減少させ、さらに、マウス口腔粘膜炎およびヒト口腔ケラチノサイト（図６Ｄ〜Ｅ）でＲａｃ１タンパク質を増加させた。
掻創傷の後のＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置ヒト口腔ケラチノサイトは、創傷閉鎖を加速した（図６Ｆおよび図１３Ａ）。さらに、照射を受けたヒト口腔ケラチノサイトは核ｐＳｍａｄ２およびＮＦ−κＢ ｐ５０を増加させ、このような増加はＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置（図１３Ｂ）によって減衰した。対照的に、Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７は効率的に口腔癌細胞を透過した（図１３Ｃ）ものの、癌細胞では既に豊富であるＲａｃ１タンパク質レベルをさらに上昇させることはなかった（図１３Ｄ）。この結果は、正常ケラチノサイトよりも速い癌細胞の遊走（図６Ｆおよび図１３Ａ、１３Ｅ〜１３Ｈ）と、ＴＧＦ−βシグナル伝達成分の遺伝損失を含まないＭＳＫ９２１および突然変異したＳｍａｄ４を持つＣａｌ２７という２つの口腔癌細胞系における遊走に対するＴａｔ−Ｓｍａｄ７の効果の欠如（図１３Ｅ〜１３Ｈ）とを、説明することができた。
コロニー定量法は、ヒト口腔ケラチノサイトの残存が放射線の有無にかかわらずＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置によってわずかに増加したことを示す（図６Ｇ）。照射後の生存の減少が正常細胞より癌細胞で顕著であるという認識と矛盾することなく、ＳＣＣ細胞は、照射後の細胞生存の実質的な減少を示した。Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７による処置は、放射線の有無にかかわらず、ＳＣＣ細胞で生存に影響を及ぼさなかった（図６Ｇ）。
実施例４：細胞透過性Ｓｍａｄ７タンパク質の設計
療法として効果的にするために、ＳＭＡＤ７は効率的に細胞を透過可能であることが求められると仮定した。これを達成するために、Ｓｍａｄ７配列を改変してタンパク質形質導入ドメインを含むようにした。
ＨＩＶ由来のＴａｔ配列を選択し、タンパク質形質導入ドメインとしてＳｍａｄ７による試験を行った。Ｓｍａｄ７およびＳｍａｄ７フラグメントとの融合タンパク質で使われたＴａｔのヌクレオチドおよびタンパク質配列は、Cardarelli et al., Traffic Apr 9(4):528-39 (2008).に由来する。Ｔａｔヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、以下に提供される。
Figure 0006576251
以下に示すように、Ｓｍａｄ７の５'末端と３'末端のいずれかでヒトＳｍａｄ７相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）とインフレームで直接連結したＴａｔを有する融合タンパク質を調製した。
Figure 0006576251
５′Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７コンストラクトに３′Ｖ５タグ配列を含ませ、ｐＧＥＸ−６ｐ−１タンパク質発現ベクター（New England Biolabs）にクローニングして、GST-Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７ 融合タンパク質を作った。Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７遺伝子によりＢＬ−２１Ｓｔａｒ大腸菌（Escherichia coli）(Invitrogen) を形質転換させてＴａｔ−Ｓｍａｄ７タンパク質を産生させた。このタンパク質を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合からの酵素的開裂（高精度酵素（Precision enzyme）、GE Life Sciences）によるグルタチオンカラム精製および溶出によって、精製した。
ＰＴＤ−Ｓｍａｄ７融合タンパク質を生成する一方で、３′末端のＶ５タグを含ませて、Ｖ５抗体を用いた免疫染色によりＴａｔ−Ｓｍａｄ７の細胞透過をモニタリングした。適当である場合、このエピトープタグは、クリニックでの使用のために除去することができる（例えば、Ｖ５タグがない状態での配列の再クローニングによって）。
また、タンパク質精製のための６−ヒスチジン（６−Ｈ）タグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）を有するＰＴＤ−Ｓｍａｄ７融合タンパク質（Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７−Ｖ５−６Ｈ）（「６Ｈ」はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０として開示）も作成した。これを以下に示す。Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７−Ｖ５−６Ｈ（「６Ｈ」はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０として開示）は、以下のヌクレオチド配列を持つ。すなわち、１〜５３はｐＥＴ−ＴＯＰＯの５′配列を含み、５４〜１３６５はＴａｔ−Ｓｍａｄ７を含み、１３６６〜１４９７はＶ５エピトープ含有３′ｐＥＴ−ＴＯＰＯおよび６ｘＨｉｓタグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）（Ｖ５は１３９３〜１４３４を含み、Ｈｉｓタグは１４４４〜１４６１、そして終止は１４６２〜１４６４を含む）。
タンパク質産生のためにコドンが最適化されてｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴｏｐｏベクターにクローニングされたＴａｔ−ヒトＳｍａｄ７を、以下に示す。
Figure 0006576251
Figure 0006576251
Figure 0006576251
Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７−ｖ５とＳｍａｄ７とのタンパク質配列の比較を以下に提供する。Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７におけるＳｍａｄ７の最初のアミノ酸は、Ｍではない（Ｓｍａｄ７とは異なる）。なぜなら、Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７は、Ｔａｔおよび／またはＧＳＴとインフレームになってＧＳＴ融合タンパク質を形成するように、設計されている。次に、Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７は精製後、ＧＳＴ融合タンパク質から切断される。大文字のヌクレオチドは、Ｖ５タグを特定する。下線が引かれたイタリック文字は、任意のｐＥＴ１０１−Ｔｏｐｏ主鎖ベクターに由来するアミノ酸を示す。
以下にＴａｔ−Ｓｍａｄ７−ｖ５とＳｍａｄ７との比較を示す。
Figure 0006576251
実施例５：ＰＴＤ−Ｓｍａｄ７タンパク質活性の追加アッセイ
アポトーシスに関する免疫蛍光抗体法（ＩＦ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、およびＴＵＮＥＬアッセイ。ＩＦおよびＩＨＣは、以前の記載のとおりに実行した（Han, G., Li, F., Ten Dijke, P. & Wang, X.J. Temporal smad7 transgene induction in mouse epidermis accelerates skin wound healing. Am J Pathol 179, 1768-1779 （2011））。使用した一次抗体は、Ｋ１４（１：４００、Fitzgerald、20R-CP200）に対するモルモット抗体、ＣＤ４（１：２０、BD Bioscience、550278）に対するラット抗体、Ｌｙ−６Ｇ（１：２０、BD Bioscience、550291）、ＢＭ８（Ｆ４／８０に対する抗体、１：２０、Invitrogen、MF48000）、ＢｒｄＵ（BD Bioscience、347583）に対するＦＩＴＣ標識抗体、マウス試料用のＣＤ４５（１：５０、BD Bioscience、550539）に対するラット抗体、ヒト試料用のＣＤ４５（１：５０、Abcam、Ab781）に対するマウス抗体、ＴＧＦ−β１（１：５０、R&D、AF-101-NＡ）に対するニワトリ抗体、ＣｔＢＰ１（１：１００、Millipore、07-306）に対するウサギ抗体、ＮＦ−κＢ ｐ５０（１：２００、Santa Cruz Biotechnology、SC-7178）に対するウサギ抗体、ＰＣＮＡ（１：２００、Santa Cruz Biotechnology、SC-7907）に対するウサギ抗体、ｐＳｍａｄ２（１：１００、Cell Signaling Technology、3101）に対するウサギ抗体、およびＶ５（１：５００、Invitrogen、460705）に対するマウス抗体であった。ＩＦに関して、異なる種のＩｇＧに対する二次抗体は、Alexa Fluor（登録商標）594（赤色）または488（緑色）コンジュゲート （全てに対して１：２００、Invitrogen）であった。ＩＨＣに関しては、異なる種に対する二次ビオチン化抗体ＩｇＧ（1:300、Vector Labs）を使用し、 Vectastain ABCキット（Vector Labs）を用いて発色させた。末端デオキシヌクレオチド転移酵素ウリジンニック末端標識（TUNEL、G3250）キット（Promega）をホルマリン固定組織切片に用いて、アポトーシス細胞を検出した。インビボＢｒｄＵ標識は、安楽死の１時間前に、０．１２５ｍｇ・ｇ−１のＢｒｄＵを腹腔内（i.p）注射することによって行った。ＰＣＮＡまたはＢｒｄＵの定量は、上皮細胞全てを含む上皮の長さ１ｍｍあたりの細胞数（cells mm-1）、ＴＵＮＥＬまたはＣＤ４５陽性細胞の定量は、筋肉層の上の上皮層および間質全てを含む上皮の長さ１ｍｍあたりの細胞数（cells mm-1）、核ｐＳｍａｄ２またはＮＦ−κＢ ｐ５０陽性細胞は、陽性細胞数/全残存上皮細胞 （すなわち、照射によって誘発された脱落上皮細胞を除く）とした。スライドの連続的なフィールドを使用して、MetaMorphソフトにより、ＢｒｄＵ標識細胞を計数した。
細胞培養。Ｓｍａｄ７トランスジェニックおよび野生型の初代ケラチノサイトは、以前の記載のとおり、新生仔マウス皮膚から調製し（Han, G., Li, F., Ten Dijke, P. & Wang, X.J. Temporal smad7 transgene induction in mouse epidermis accelerates skin wound healing. Am J Pathol 179, 1768-1779 (2011)）、ＰＣＴ培地（CELLnTEC）で培養した。健常ボランティアの歯肉組織に由来する自然発生的に不死化されたヒト口腔ケラチノサイト（ＮＯＫ−ＳＩ）をケラチノサイト合成培地で培養して維持した（Castilho, R.M., et al. Rac1 is required for epithelial stem cell function during dermal and oral mucosal wound healing but not for tissue homeostasis in mice. PloS one 5, e10503 (2010)）。口腔癌細胞Ｃａｌ２７（ATCC）およびＭＳＫ９２１は、１０％ウシ胎児血清添加ダルベッコ改変イーグル培地で培養した（D. Rabenの研究室、University of Colorado Cancer Center Tissue Culture Coreによってフィンガープリント）（GIBCO（登録商標）、Invitrogen）。照射細胞でＴａｔ−Ｓｍａｄ７の効果を評価するために、上記のヒト細胞系をチャンバースライド（BD Bioscience、354108）で培養し、３Ｇｙで照射し、さらに照射直後に、Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７（１μｇ・ｍＬ−１）を培地に添加した。ｐＳｍａｄ２、ＮＦ−κＢ ｐ５０、およびＶ５の免疫染色のためのＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置から４時間後に、細胞を１００％冷メタノールで固定した。
ｓｉＲＮＡによるトランスフェクション。培養ケラチノサイトが７０％コンフルエントに達したら、LIPOFECTAMINE（登録商標）2000 （Invitrogen）を用いて１００ｎＭの標的ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡ（Dharmacon）をトランスフェクションした。トランスフェクション４８〜７２時間後に細胞を収集し、ウェスタン分析にかけてノックダウン効率を決定した。遊走アッセイのために、細胞を播種した際にｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。本研究に含まれる標的ｓｉＲＮＡは、以下の通りである。すなわち、マウスｓｉＲａｃ１−１（Invitrogen、MSS237708）およびｓｉＲａｃ１−２（IDT、MMC.RNAI.N009007.12.3）；ヒトｓｉＳｍａｄ２（Dharmacon、L-003561-00-0005）、ｓｉＳｍａｄ３（Invitrogen、HSS106252）、およびｓｉＳｍａｄ４（Invitrogen、HSS118066）；ヒトｓｉＣｔＢＰ１−１およびｓｉＣｔＢＰ１−２；ヒトｓｉＳｍａｄ７−１およびｓｉＳｍａｄ７−２；ヒトＴＧＦ−β１（Dharmacon、J-012562-08-0005）；マウスｓｉＳｍａｄ７である。
インビトロケラチノサイト増殖アッセイ。インビトロケラチノサイト増殖は野生型およびＳｍａｄ７トランスジェニックのケラチノサイトのＢｒｄＵ取り込みによって決定した。７０％コンフルエントの細胞をＲａｃ１ ｓｉＲＮＡでトランスフェクションして、２４時間後に通常の培地に変えた。インサイツ細胞増殖キット（Roche Applied Science）を用いてインビトロＢｒｄＵ標識および検出を実施し、さらにMetaMorphソフトウェアを用いてＢｒｄＵ標識細胞を計数した。
インビトロ細胞遊走アッセイ。細胞が１００％コンフルエントに達したら、細胞を１０μｇ・ｍＬ−１のマイトマイシンＣ（Sigma）で2時間処理して細胞増殖を抑制し、Fisherbrand ピペットチップにより掻創を生じさせた。細胞遊走を毎日撮影した。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの24〜36時間後に細胞がコンフルエントに達したとき、Ｉｍａｇｅ−Ｊソフトウェアを使用して、遊走細胞が占める創傷部として細胞遊走を記録した。Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７処置のために、掻創傷の後に１μｇ・ｍＬ−１のＴａｔ−Ｓｍａｄ７タンパク質またはビヒクル対照（PBS）を含む培地に細胞を曝し、遊走細胞が完全に掻創を覆うまで、新しく加えられるＴａｔ−Ｓｍａｄ７を伴って1日おきに培地を変えた。
細胞生存アッセイ。細胞生存アッセイを、僅かな改変を加えた上で以前の記載のとおりに実施した（Munshi, A., Hobbs, M. & Meyn, R.E. Clonogenic cell survival assay. Methods in molecular medicine 110, 21-28 (2005))。手短に言うと、細胞を１２ウェルプレートに播種し、非照射用ウェルには５００細胞・ウェル−１とし、照射線量にとともに最高１，５００細胞・ウェル−１まで増加させた。細胞の播種２４時間後に、細胞に対して照射を行った。照射細胞および非照射細胞の培地に対して、Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７を１μｇ・ｍＬ−１で添加し、またはＴａｔ−Ｓｍａｄ７を溶解に用いた同量のＰＢＳ（対照）を添加した。新たに添加されたＴａｔ−Ｓｍａｄ７またはＰＢＳによる培地の交換を１日おきに、１０〜１４日間にわたって行った。クローンをメタノールで固定し、０．５％クリスタルバイオレット溶液（２５％メタノール含有）で染色して計数し、さらに、実験ごとに４つのウェルの平均を算出した。各細胞系に対して、２〜３回の別々の実験を実施した。相対的な生存率を以前の記載のとおりに、すなわち照射線量ごとの絶対生存率（コロニー数／全播種細胞）を非照射細胞の絶対生存率で除算して、算出した。
ウェスタン分析。タンパク質抽出およびウェスタン分析を以前の記載のとおりに実施した（Li, A.G., Lu, S.L., Zhang, M.X., Deng, C. & Wang, X.J. Smad3 knockout mice exhibit a resistance to skin chemical carcinogenesis. Cancer Res 64, 7836-7845 (2004)）。本研究で用いた抗体は、Ｓｍａｄ７に対するウサギ抗体（1:500）、Ｓｍａｄ２（1:300、Zymed、51-1300）およびＳｍａｄ４（1:300、Epitomics、1676-1）に対するウサギ抗体、Ｓｍａｄ３に対するウサギ抗体（1:300、Cell Signaling Technology、9513）、Ｒａｃ１に対するマウス抗体（1:500、BD Biosciences、610651）、ＣｔＢＰ１に対するウサギ抗体（1:500、Millipore、 07-306）、チューブリンに対するマウス抗体（1:3000、シグマ、T5168）、ＧＡＰＤＨに対するマウス抗体（1:5000、Abcam、Ab8245）、ならびにアクチンに対するヤギ抗体（1:1000、サンタクルスBiotechnology、SC1616）を含んだ。グレースケール像は、ODYSSEY（登録商標）v.1.2ソフトウェア（LI-COR Biosciences）を使用して得られた。
Ｒａｃ１活性化アッセイ。活性ＧＴＰ結合Ｒａｃ１を、Rａｃ1活性化用のBIOCHEM（商標）キット（Cytoskeleton Inc、BK035）を使用して試験した。野生型およびＳｍａｄ７トランスジェニックのケラチノサイトを１５ｃｍの直径組織培養平板で培養し、提供された溶解緩衝剤を使用してタンパク質溶解産物を調製した。Ｒａｃ１活性のアッセイには、１ｍｇの細胞ライセートを用いた。全Ｒａｃ１およびＳｍａｄ７タンパク質のアッセイには、５０μｇのライセートを用いた。マウス舌でＧＴＰ結合性のＲａｃ１を測定するために、舌の半分を液体窒素中で粉砕して粉体にし、溶解緩衝液に溶解してタンパク質を抽出し、ＧＴＰ結合Ｒａｃ１を１試料あたり２ｍｇタンパク質ライセートでアッセイを行い、全Ｒａｃ１タンパク質ウェスタンブロットに５０μｇのタンパク質ライセートをロードした。
ＣｈＩＰアッセイ。ＣｈＩＰアッセイは、ＣｈＩＰ−ＩＴ発現キット（Active Motive、53009）を使用して、以前の記載のとおり実施した（Hoot, K.E., et al. HGF upregulation contributes to angiogenesis in mice with keratinocyte-specific Smad2 deletion. J Clin Invest 120, 3606-3616 (2010); Hoot, K.E., et al.. Keratinocyte-specific Smad2 ablation results in increased epithelial-mesenchymal transition during skin cancer formation and progression. Owens, et al., J.Clin.Invest 118, 2722-2732 (2008). Smad4-dependent desmoglein-4 expression contributes to hair follicle integrity. Owens, et al., Dev. Biol. 322:156-166 (2008）。ＤＮＡタンパク質複合体をマウス一次ケラチノサイトから分離した。ＣｈＩＰ用に、６．３μｇの剪断クロマチンは、Ｇタンパク質磁気ビーズと、Ｓｍａｄ２（Cell Signaling Technology、3122）、Ｓｍａｄ３（Cell Signaling Technology、9523）、Ｓｍａｄ４（Cell Signaling Technology、9515）に対するウサギ抗体、Ｓｍａｄ７に対する抗体（Santa Cruz Biotechnology、SC-11392）、ＣｔＢＰ１（Millipore）または陰性対照ウサギＩｇＧ（Santa Cruz Biotechnology、SC-2027）の各々の２μｇとを、インキュベートした。タンパク質−ＤＮＡ複合体からの溶出ＤＮＡをＰＣＲ分析に用いた。Ｒａｃ１プロモーターに結合するＣｔＢＰ１をゲル像のＣｈＩＰバンド強度によって、または、Power SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems）を使用した定量的ＰＣＲによって、野生型およびＳｍａｄ７トランスジェニックのケラチノサイトにおいて比較した。プライマー使用して、Ｒａｃ１ ＳＢＥ−１．５Ｋｂプロモーター域を増幅した。
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Ｒａｃ１プロモータールシフェラーゼリポーターコンストラクト、部位特異的突然変異誘発、およびルシフェラーゼアッセイ。ＳＢＥ−１．５ｋｂ部位を包含するＲａｃ１プロモーターの−１６７１ｂｐから−７８９ｂｐの８８３ｂｐフラグメントを、５′ＸｈｏＩおよび３′ＨｉｎｄＩＩＩタグプライマーを用いて野生型マウスＤＮＡから増幅した。このＲａｃ１プロモーターフラグメントをｐＧＬ４．２６ベクター（Promega）にクローニングし、Ｒａｃ１プロモーターｐＧＬ４．２６ルシフェラーゼレポーター（Ｒａｃ１−Ｌｕｃ）コンストラクトを作成した。部位特異的突然変異誘発として、ＳＢＥ配列５′−ＴＧＴＣＴＧＴＧＣＴ−３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）を５′−ＴＧＡＴＡＧＡＧＣＴ−３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）に変異させた。Ｒａｃ１−ＬｕｃおよびｐＧＬ４．７４（１：２０）を、Ｓｍａｄ７ ｓｉＲＮＡ、ＣｔＢＰ１ ｓｉＲＮＡ、またはスクランブルｓｉＲＮＡとともに、マウス一次ケラチノサイトまたはＴａｔ−Ｓｍａｄ７処理（１μｇ・ｍＬ−１）されたマウス一次ケラチノサイトに対して、Lipofectamine 2000（Invitrogen）を用いて、同時トランスフェクションした。細胞ライセートを回収し、ＤＵＡＬ−ＬＵＣＩＦＥＲＡＳＥ（登録商標）レポーターアッセイキット（Promega）を製造元の指示に従って用いて、ルシフェラーゼアッセイを、トランスフェクションまたはＴａｔ−Ｓｍａｄ７処理の後、４８時間実行した。Ｒａｃ１−ルシフェラーゼ活性はGlomax装置（Promega）で測定し、Renilla活性に対するホタル活性のレシオによって表された。Rac1プロモータ配列の増幅に用いたプライマーは、以下の通りであった。
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統計的分析。分子分析および口腔粘膜炎潰瘍サイズにおける統計学的差は、スチューデントｔ検定を使用して分析し、すべてのデータを、平均±ｓ．ｄ．で表し、例外として潰瘍サイズは平均±ｓ．ｅ．ｍ．によって表した。口腔粘膜炎発生率は、フィッシャーの正確確率検定によって分析した。
実施例６：Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母におけるＳｍａｄ７タンパク質産生のためのコドン最適化
多くの哺乳類のタンパク質がヌクレオチド配列を改変することなく細菌で産生されるが、分析は、Ｓｍａｄ７ヌクレオチド配列が細菌でタンパク質発現可能になるには改変が必要であることを示した。
Ｓｍａｄ７ ｃＤＮＡ哺乳類コドン分析は、以下のヌクレオチドによってコードされる９つの関連アルギニンアミノ酸を用いる。７〜９、４３〜４５、１６９〜１７１、４０３〜４０５、４９０〜４９２、５２６〜５２８、５２６〜５２８、８２３〜８２５、１０５７〜１０５９は、レアコドン（ＡＧＧ、コドン使用頻度１．７％）である。これらのコドンは細菌のレアコドンであるので、それらが細菌でタンパク質翻訳および／または産生を停止または減少させることが可能であると期待される。レアなアルギニンコドンによって遺伝暗号が指定されているアミノ酸は、３位、１５位、５７位、１３５位、１６４位、１６９位、１７６位、２７５位、および３５３位にアルギニンを含む例示のヒトＳｍａｄ７タンパク質であり、それらは下記に太字で示される。さらに、以下のアルギニンコドンも、低頻度で使用される。ＣＧＡ（コドン使用頻度３．５％）：ヌクレオチド１６〜１８、１３６〜１３８、１９９〜２０１、５９８〜６００、それらは６位、４６位、６７位、２００位でアルギニンをコードする。ＣＧＧ（コドン使用頻度５．４％）：ヌクレオチド３１〜３３、１１２〜１１４、３１６〜３１８、７７２〜７７４、９４０〜９４２、９７３〜９７５、１１３５〜１１３７、１２７６〜１２７８、それらは１１位、３８位、１０６位、２５８位、３１４位、３２５位、３７９位、４２６位でアルギニンをコードする。ＡＧＡ（コドン使用頻度２．８％）：ヌクレオチド６３７〜６３９、８１４〜８１６、それらは２１３位、２７２位でアルギニンをコードする。これらのアルギニン残基は、下記の太い大文字のＲで強調されるとともに、それらはコドン最適化核酸配列（コドン使用頻度２０．６％）の少なくとも１つでＣＧＣに変えられる。
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この分析に基づいて、Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母でＴａｔ−Ｓｍａｄ７タンパク質産生の増加を可能にすると考えられるコドンに対してＳｍａｄ７ヌクレオチド配列を最適化することを決定した。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって作られた最適化核酸コドン配列を以下に示す。手短に言うと、配列は以下の組成を有する。ヌクレオチド１〜６は、ＢａｍＨＩのための制限認識部位を含む。ヌクレオチド７〜３６は、Ｔａｔ配列を含む。ヌクレオチド３７〜１３１４は、コドン最適化ヒトＳｍａｄ７ ｃＤＮＡを含む。ヌクレオチド１３４２〜１３８３は、Ｖ５エピトープを含む。ヌクレオチド１３８４〜１３８６は、終止コドンである。さらに、ヌクレオチド１３８７〜１３９２は、ＳａｌＩの制限認識部位を含む。この配列において、ＡＴＧは、ＧＳＴが使われるために除かれる。全ての設計された配列を、「Codon-Usage Database」に基づいてＥ．ｃｏｌｉコドンに変換した。初期最適化Ｓｍａｄ７配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）を以下に示す。
Figure 0006576251
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Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７−Ｖ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）とヒトＳｍａｄ７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）ｃＤＮＡとの間のヌクレオチド配列比較を以下に示す。ヒトＳｍａｄ７とコドン最適化Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７−Ｖ５とは、６８％のコドン相同性を共有する。ヒトＳｍａｄ７とコドン最適化Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７とは、７１％のコドン相同性を共有する。ヒトＳｍａｄ７とコドン最適化Ｓｍａｄ７とは、７３％のコドン相同性を共有する。
Figure 0006576251
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この最適化において、可能ならば、Ｓｍａｄ７のアミノ酸配列を保存するように望まれることから、別のオープンリーディングフレームを形成する可能性があるＭｅｔ２１６に変更を加えなかった。将来のコドン最適化においては、インビトロおよびインビボで機能に影響を与えることなくタンパク質産生を改善するべく、Ｍｅｔ２１６をＬｅｕ２１６に変異させる。
実施例７：トランケートＳｍａｄ７タンパク質の産生
Ｓｍａｄ７は、限定されるものではないが、細胞増殖を高めること、細胞遊走を高めること、ＤＮＡ損傷を減らすこと、細胞アポトーシスを減らすこと、および炎症を減らすことの１または複数が含まれる、インビボでの活性をいくつか含むと、考えられる。これらのプロセスに対するＳｍａｄ７の効果は、ＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害、ＮＦ−κＢシグナル伝達の阻害、ＣｔＢＰ１活性の阻害、ならびに／あるいはＲａｃ１発現および／または活性の増加の１または複数に起因する。Ｐｔｄ−Ｓｍａｄ７のより小さい機能ドメインが治療効果を提供するのに十分である場合があると考えられる（図１５参照）。加えて、結果として生じるより短いタンパク質配列は、タンパク質産生を強化すると思われる。さらに、部分的Ｓｍａｄ７配列を含む異なるトランケートＴａｔ−Ｓｍａｄ７タンパク質が異なる処置に有用である場合があると考えられる。
例えば、Ｓｍａｄ７のＣ末端ＭＨ２ドメイン（Ｓｍａｄ７タンパク質の約半分の長さ（例えば、２０８〜４２６ａａ））がＳｍａｄ７の抗炎症効果を主に媒介し得ると考えられる（Hong et al., Nat Immunology, 8, 504-513, 2007）。この抗炎症性の機能を有するＳｍａｄ７ペプチドは、数ある中で、限定されるものではないが、口腔粘膜炎、口内炎、および乾癬などの慢性炎症に関連する状態の処置に十分であり、かつ任意で、そのような処置の改善にもなり得る。
Ｓｍａｄ７のＮ末端ＭＨ１ドメイン＋リンカー領域（このタンパク質の約半分、例えば２〜２０８ａａ）は、活性ＭＡＰＫとして知られており、ＴＧＦ−βレセプターを分解するユビキチンＥ３リガーゼであるＳｍｕｒｆに結合する（Aragon, et al., Structure 20:1726-1736 (2012)）。それが主に細胞遊走の媒介ならびに／あるいはＴＧＦ−β誘導増殖および／または線維化反応の阻害を行い得ると考えられる。この細胞遊走と増殖機能とがあるSmad7ペプチドは、過剰な炎症を伴わない治癒を強化する上で十分であり、必要に応じて、そのような治癒の改善になり得る。この形態の処置から恩恵を受けると思われる創傷の種類として、数ある中でも、手術性創傷、線維性瘢痕、および糖尿病創傷、欠損治癒、および／または瘢痕が挙げられる。
トランケートＳｍａｄ７ Ｎ末端およびＣ末端ＰＴＤ融合タンパク質を設計した。Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７−Ｃ末端コドン最適化ヌクレオチドおよびタンパク質配列の一例を以下に示す。核酸配列において、ヌクレオチド１〜６はＢａｍＨＩの制限認識部位を含む。ヌクレオチド７〜３６は、Ｔａｔ ＰＴＤ配列を含む。ヌクレオチド３７〜８１０は、ヒトＳｍａｄ７のＣ末端アミノ酸２５８〜４２６に最適化されたコドンを含む。ヌクレオチド５６８〜６０９は、Ｖ５エピトープ配列を含む。ヌクレオチド６１０〜６１２は、終止配列を含む。さらに、ヌクレオチド６１３〜６１８は、ＳａｌＩの制限認識部位を含む。
Figure 0006576251
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核酸配列において、ヌクレオチド１〜６はＢａｍＨＩの制限認識部位を含む。ヌクレオチド７〜３６は、Ｔａｔ ＰＴＤ配列を含む。ヌクレオチド３７〜８１０は、ヒトＳｍａｄ７のＮ末端アミノ酸１〜２５８に最適化されたコドンを含む。ヌクレオチド８１１〜８５２は、Ｖ５エピトープ配列（太字で表した対応のアミノ酸配列）を含む。ヌクレオチド８５３〜８５５は、終止配列を含む。さらに、ヌクレオチド８５６〜８６１は、ＳａｌＩの制限認識部位を含む。ＡＴＧは、ＧＳＴとの融合を可能にするために取り除かれる。
Figure 0006576251
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実施例８：トランケートＳｍａｄ７タンパク質の試験
他のアッセイの中でも特に、上記の完全長Ｓｍａｄ７を調べるために、インビトロおよびインビボでのアッセイを使用してトランケートＳｍａｄ７タンパク質の活性を調べた。そのようなアッセイには、限定されるものではないが、マウスにおいて、Ｓｍａｄ２のリン酸化および／またはＮＦ−κＢ ｐ５０サブユニットの核転座を妨げる能力と、細胞増殖を増加させる能力と、アポトーシスおよび／または放射線誘発ＤＮＡ損傷を減らす能力と、炎症および／または血管新生を減らす能力と、口腔粘膜炎、手術性創傷、糖尿病創傷および／または慢性炎症を伴う創傷で治癒を促進する能力と、が含まれる。
創傷治癒アッセイにおいて、野生型マウスに6mmのパンチ生検を実施し、その後、C末端またはＮ末端Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７を日々局所適用した。総創傷閉鎖を測定することによって、上記の両方のトランケートＳｍａｄ７タンパク質（例えば、Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７ C末端タンパク質およびN末端タンパク質）が、完全長Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７と類似の創傷治癒の促進を有することが見い出された。
実施例９：トランケートＳｍａｄ７タンパク質は、創傷治癒を加速する
創傷治癒を加速するトランケートＳｍａｄ７タンパク質の能力を、野生型マウスで試験した。図１６Ａは、マウス創傷治癒モデルに対するＣ末端トランケート（２５９〜４２６ａａ）Ｔａｔ−Ｃ−Ｓｍａｄ７の効果を示す。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを麻酔して、６ｍｍ皮膚パンチ生検により背面を傷つけ、一日おきに、ＰＢＳ（対照，マウス３匹、創傷４箇所／マウス）、全長Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７（０．４μｇ／１０μＬ ＰＢＳ／創傷、マウス３匹、創傷４箇所／マウス）またはＴａｔ−Ｃ−Ｓｍａｄ７（０．４μｇ／１０μＬ／創傷ＰＢＳ、マウス３匹、創傷４箇所／マウス、全部で１２箇所の創傷を処理）の局所適用による処置を行った。創傷後１、２、４、および５日目で創傷部をＣａｎｏｎデジタルカメラで撮影し、正規化のために写真内部の６ｍｍの円を用いてＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアによる画像分析を行って、創傷面積を測定した。さらに、平均％残存創傷面積を処置群ごとに算出した。創傷治癒を加速するＴａｔ−Ｃ−Ｓｍａｄ７の能力は、完全長Ｓｍａｄ７のそれと類似していた（図１６Ａ）。
図１６Ｂは、創傷治癒に対するＮ末端トランケート（１〜２５８ａａ）Ｔａｔ−Ｎ−Ｓｍａｄ７の効果を示す。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを麻酔して、６ｍｍ皮膚パンチ生検により皮膚を傷つけ、一日おきに、ＰＢＳ（対照，マウス６匹、創傷４箇所／マウス）、全長Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７（０．４μｇ／１０μＬ ＰＢＳ、マウス６匹、創傷４箇所／マウス）またはＴａｔ−Ｎ−Ｓｍａｄ７（０．４μｇ／１０μＬ ＰＢＳ、マウス６匹、創傷４箇所／マウス）の局所適用による処置を行った。創傷後１、２、および４日目で、正規化のために写真内部の６ｍｍの円を用いてＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアによる画像分析を行い、創傷面積を測定した。さらに、平均％残存創傷面積を処置群ごとに算出した。対照と２日後にＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置されたマウスとの間に有意な創傷治癒の差があり、後者は治癒がより早かった（図１６Ｂ、ｐ＜０．０５）。Ｔａｔ−Ｎ−Ｓｍａｄ７を陰性対照として調べたが、わずか１日後でも対照マウスと比べて著しい創傷治癒の加速が予想外にも促され、また、２日後の完全長Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７処置マウスに比べて著しい創傷治癒の加速が予想外にも促された（図１６Ｂ、ｐ＜０．０５）。Ｔａｔ−Ｃｒｅは、対照処置（データ示さず）と比較して、創傷閉鎖に影響を及ぼさなかった。
これらの結果は、完全長Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７およびトランケートＴａｔ−Ｓｍａｄ７タンパク質（Ｔａｔ−Ｃ−Ｓｍａｄ７およびＴａｔ−Ｎ−Ｓｍａｄ７）が創傷治癒を促進することを証明する。さらに、これらの結果は、特定のトランケートＴａｔ−Ｓｍａｄ７タンパク質が完全長Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７よりも、創傷治癒を加速することに効果的なことを証明する。
したがって、トランケートＴａｔ−Ｓｍａｄ７タンパク質を含んでいる組成物は、処置している創傷で有用であり、また創傷治癒を加速する際に有用である。
実施例１０：Ｓｍａｄ７は、十分に機能を果たさない創傷治癒モデルで創傷治癒を加速する
糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）マウスは、実施例９に記載されたように、６ｍｍ皮膚パンチ生検により背部を傷つけられ、創傷が完全には痂皮によって覆われていない８日目前の創傷に対して、ＰＢＳ（対照、マウス６匹、創傷４箇所／マウス）、完全長Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７（０．４μｇ／１０μＬ ＰＢＳ、マウス６匹、創傷４箇所／マウス）、またはＲＥＧＲＡＮＥＸ（登録商標）クリーム（綿スワブによるスメア、マウス６匹、創傷４箇所／マウス）を、１日おきに、局所適用することによって、処置された。１０日目後に、痂皮と創傷周囲との間のギャップに処置を局所適用して、堅い痂皮と傷つけられていない角質層とからなるバリアを回避した。組換えヒト血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を含むＲＥＧＲＡＮＥＸ（登録商標）は、糖尿病性潰瘍への局所投与について承認されている。
創傷後１、２、４、６、８、９、１０、１１、１２、および１３日目に、創傷閉鎖を視覚的に評価をした（図１７Ａ）。各時点で、創傷をＣａｎｏｎデジタルカメラで撮影した。８日目後に、対照と比較してＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置マウスにおいて視覚的に顕著な改善が創傷にあった（図１７Ａ）。
創傷後１、２、３、４、７，９、および１１日目で、正規化のために写真内部の６ｍｍの円を用いてＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアによる画像分析法を行うことで、創傷の大きさを測定した。さらに、平均％残存創傷面積を処置群ごとに算出した。創傷治癒を加速するＴａｔ−Ｓｍａｄ７の能力は、ＲＥＧＲＡＮＥＸ（登録商標）のそれと類似していた（図１７Ｂ）。７日目に、画像分析の結果は、対照と比べて、創傷閉鎖がＴａｔ−Ｓｍａｄ７処置マウスで有意に加速されたことを示した（図１７Ｂ、ｐ＜０．０５）。これらの結果は、ＲＥＧＲＡＮＥＸ（登録商標）で達成されるものと類似した。
創傷８日目の試料から得たホルマリン固定パラフィン背側創傷切片（１ｍｍ）を、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色した。創傷８日目試料の組織学的比較は、対照に比べて、Ｓｍａｄ７処理ｄｂ／ｄｂマウスで再上皮形成が完了して創傷閉鎖が加速されることを明らかにした（図１７Ｃ）。
全体として、これらの結果は、Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７が治癒不十分な糖尿病性創傷での創傷閉鎖を加速するのに有用であること、およびREGRANEX（登録商標）による処置の代わりを提供することを示している。
実施例１１：Ｓｍａｄ７タンパク質産生のための付加的なコドン最適化
Ｓｍａｄ７核酸分子は、タンパク質産生を増加させるように選択される付加的なヌクレオチドの変更で設計される。例えば、アミノ酸ＳｅｒおよびＨｉｓをコードするコドンの利用が操作される。上記の実施例におけるコドン最適化ヒトＳｍａｄ７では、Ｓｅｒコドン（ＴＣＣまたはＴＣＧ）は約９％のコドン使用頻度のアミノ酸頻度を有する。ＳｅｒのコドンをＡＧＣに変えることで、Ｓｍａｄ７タンパク質の産生が増加すると考えられる。なぜなら少なくとも一部には、これによってコドン使用頻度を任意で１５％まで高めることができるからである。Ｓｍａｄ７タンパク質には３３個のＳｅｒアミノ酸がある（ヌクレオチドの位置19-21、46-48、133-135、292-294、349-351、451-453、454-456、460-462、511-513、514-516、544-546、595-597、616-618、634-636、691-693、694-696、739-741、745-747、775-777、847-849、907-909、919-921、943-945、1006-1008、1009-1101、1030-1032、1054-1056、1093-1095、1126-1128、1192-1194、1237-1239、1240-1242、1273-1275;対応するセリンアミノ酸の位置7、16、45、98、117、151、152、154、171、172、182、199、206、212、231、232、247、249、259、283、303、307、315、336、337、344、352、365、376、398、413、414、425）。これらのうち、23個（ヌクレオチド19-21、292-294、349-351、451-453、454-456、460-462、511-513、514-516、544-546、616-618、634-636、691-693、694-696、739-741、745-747、775-777、847-849、907-909、919-921、1009-1101、1030-1032、1054-1056、1093-1095;対応するセリンアミノ酸の位置7、98、117、151、152、154、171、172、182、206、212、231、232、247、249、259、283、303、307、337、344、352、365 ）を、潜在的に代わりになり得るオープンリーディングフレームを導入することなしに、変えることができる。
同様に、上記の例のコドン最適化ヒトＳｍａｄ７において、Ｈｉｓコドン（ＣＡＣ）は、コドン使用頻度が９．６％である。ＨｉｓコドンをＣＡＴ（必要に応じて１２．６％使用頻度）に変えることがＳｍａｄ７タンパク質産生を増加させると考えられる。Ｓｍａｄ７タンパク質では１２個のＨｉｓがある（ヌクレオチド142-144、214-216、217-219、220-222、226-228、289-291、589-591、778-780、1072-1074、1147-1149; 対応するヒスチジンアミノ酸の位置48、72、73、74、76、97、170、196、197、260、358、383）。これらのうち、４つ（ヌクレオチド217-219. 220-222、589-591、778-780、ヒスチジン残基73、76、197、260）を、潜在的に代わりになり得るオープンリーディングフレームを導入することなしに、変えることができる。
加えて、野生型ヒトＳｍａｄ７は、アミノ酸２１６として、Ｍｅｔアミノ酸を含む（Ｍｅｔ２１６）。これは、例えば、細菌性機構による代わりのオープンリーディングフレームとして認識され得るものであって、タンパク質産生を減少させることが可能である。Ｍｅｔ２１６をＬｅｕ２１６（ＡＴＧをＣＴＧ）に変えることにより（このアミノ酸は、生化学的性質がＭｅｔに最も近く、タンパク質の三次元構造を変えるとは思われない）、タンパク質産生を増加させる。
最初のコドン最適化Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７−Ｖ５とさらなる変化との間の比較を以下に示す。
上の鎖：Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７−Ｖ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）；下の鎖：最適化されたＳｅｒ、ＨｉｓおよびＭ２１６Ｌ変異の後（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）。
Figure 0006576251
すべてのこれらの変化を含む核酸配列とそれらの対応するアミノ酸配列とを以下に示す。アミノ酸配列は、太字で示されるＶ５エピトープを含み、ｐＥＴ１０１−Ｔｏｐｏ主鎖はイタリックとアンダーラインによって示す。Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７Ｍ２１６Ｌ完全最適化完全長ヌクレオチドおよびタンパク質配列を以下に示す。
Figure 0006576251
Figure 0006576251
Figure 0006576251
最適化されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、種々のＮ末端およびＣ末端Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７フラグメントを作るのにも用いられる。代表的な例を以下に示す。
Ｔａｔ−Ｎ−Ｓｍａｄ７−Ｖ５最大最適化ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。タンパク質配列はＶ５エピトープを含み、それは太い大文字で示されている。
Figure 0006576251
Figure 0006576251
Ｔａｔ−Ｃ−Ｓｍａｄ７−Ｖ５最大最適化ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。
タンパク質配列は、Ｖ５エピトープ（太い大文字で示される）とｐＥＴ１０１−Ｔｏｐｏ主鎖（下線が引かれたイタリックで示される）とを含む。
Figure 0006576251
Figure 0006576251
上記の最適化の前後の比較を以下に示す。Ｃ末端最適化（上の鎖）（アライメントは、記載順にそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４および２４を開示する）：
Figure 0006576251
Ｎ末端最適化（上の鎖）（アライメントは、記載順にそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２および２６を開示する）：
Figure 0006576251
さらに、他のコドン最適化核酸もまた、１または複数の発現系においてＳｍａｄ７タンパク質を産生するそれらの能力に関連している。そのような配列の別の例を以下に示す。
最適化プログラムによって最適化されるＴａｔ−Ｓｍａｄ７Ｍ７２１６Ｌ−Ｖ５：
Figure 0006576251
Figure 0006576251
Figure 0006576251
Figure 0006576251
ヌクレオチド配列：
１〜６：ＢａｍＨＩ；７−３６：Ｔａｔ；３７〜１３１４：コドン最適化ヒトＳｍａｄ７；１３１５〜１３５６：Ｖ５；１３７〜１３５９：終止；１３６０〜１３６５ ＳａｌＩ
ＡＴＧは、ＧＳＴが使用されるために除去される。６８２ＡＴＧからＣＴＧ（Ｍ２１６からＬ）
Figure 0006576251
Figure 0006576251
実施例４に記載されたＴａｔ−Ｓｍａｄ７Ｍ７２１６Ｌ−Ｖ５との配列比較（アライメントは、記載順にそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６および３０を開示する）：
Figure 0006576251
下記の配列を使用するタンパク質産生は、哺乳類発現ベクター（例えば、ｐＣＭＶ−６−Ｅｎｔｒｙ）をＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞にトランスフェクションさせることによって実施される。
ｐＣＭＶ６−Ｅｎｔｒｙプラスミドにクローニングされた最適化ＧＳＴ−Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７−ｍｙｃ−ヌクレオチド配列：
Figure 0006576251
Figure 0006576251
全配列（ＮｏｔＩ部位まで）は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔのＯＰＴＩＭＵＭＧＥＮＥ（商標）プログラムを用いて、哺乳類発現に最適化されたコドンである。
１７９０〜１７９２：ＧＡＴをＧＡＣに変えて（Ａｓｐを維持）、オルターナティブＯＲＦ（強調表示）を避ける。
１〜８２：ｐＣＭＶ６−Ｅｎｔｒｙ内のクローニング部位＋ｋｏｚａｃ配列
８３〜７７７：ＧＳＴ＋高精度酵素部位；７７６〜８０５：Ｔａｔ；
８０６〜２０８６：完全長ヒトＳｍａｄ７
２０８７〜２１０７：ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ
２１０８〜２１８２：ｐＣＭＶ６−Ｅｎｔｒｙ由来のｍｙｃ−ｆｌａｇ
太字下線：ユニークＮｏｔＩ部位
上記のヌクレオチド配列は、本来のヒトＳｍａｄ７に７９％相同性である。
Figure 0006576251
Figure 0006576251
Figure 0006576251
上記ヌクレオチド配列由来の最適化ＧＳＴ−Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７−ｍｙｃ−ｆｌａｇタンパク質配列：
Figure 0006576251
１〜２２９：ＧＳＴ＋高精度部位
２３２〜６６８ Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７
６７１〜６９９：制限部位＋ｍｙｃ−Ｆｌａｇ
ｐＣＭＶ６−Ｅｎｔｒｙプラスミドにクローニングされた最適化ＧＳＴ−Ｔａｔ−Ｎ−Ｓｍａｄ７−ｍｙｃ−ｆｌａｇヌクレオチド配列：
Figure 0006576251
全配列（ＮｏｔＩ部位まで）は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔのＯＰＴＩＭＵＭＧＥＮＥ（商標）プログラムを用いて、哺乳類発現に最適化されたコドンである。
１〜５０：ｐＣＭＶ６−Ｅｎｔｒｙ内のクローニング部位＋ｋｏｚａｃ配列
５１〜７４３：ＧＳＴ＋高精度酵素部位
７４４〜７７３−：Ｔａｔ；
７７４〜１５４９−：Ｎ末端１〜２５８ａａをコードするヒトＳｍａｄ７
１５５０〜１５６３：ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、太字下線：ユニークＮｏｔＩ部位
１５６４〜１６３７：ｐＣＭＶ６−Ｅｎｔｒｙ由来のｍｙｃ−ｆｌａｇ
上記ヌクレオチド配列由来の最適化ＧＳＴ−Ｔａｔ−Ｎ−Ｓｍａｄ７−ｍｙｃ−ｆｌａｇタンパク質配列：
Figure 0006576251
１〜２４１：ＧＳＴ−Ｔａｔ
２４４〜５００：Ｎ−Ｓｍａｄ７ ２−２５８
５０１〜５２８：制限部位＋ｍｙｃ−Ｆｌａｇ
ｐＣＭＶ６−Ｅｎｔｒｙプラスミドにクローニングされた最適化ＧＳＴ−Ｔａｔ−Ｃ−Ｓｍａｄ７−ｍｙｃ−ｆｌａｇヌクレオチド配列：
Figure 0006576251
全配列（ＮｏｔＩ部位まで）は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔのＯＰＴＩＭＵＭＧＥＮＥ（商標）プログラムを用いて、哺乳類発現に最適化されたコドンである。
１〜５０：ｐＣＭＶ６−Ｅｎｔｒｙ内のクローニング部位＋ｋｏｚａｃ配列
５１〜７４３：ＧＳＴ＋高精度酵素部位
７４４〜７７３：Ｔａｔ
７７４〜１２７４：Ｃ末端 Ｓｍａｄ７
１２７５：Ｍｌｕ
１２８３：ＮｏｔＩ
１２７５〜１３７０：ｍｌｕＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ｍｙｃ＋ｆｌａｇ
上記ヌクレオチド配列由来の最適化ＧＳＴ−Ｔａｔ−Ｃ−Ｓｍａｄ７−ｍｙｃ−ｆｌａｇタンパク質配列：
Figure 0006576251
１〜２４１：ＧＳＴ＋高精度＋Ｔａｔ
２４２〜４０９：ｃ−Ｓｍａｄ７（２５９〜４２６ａａ）
４１０〜４４０：Ｍｌｕ＋Ｎｏｔ＋ｍｙｃ＋ｆｌａｇ：制限部位＋ｍｙｃ−Ｆｌａｇ
Ｓｍａｄ７構造に基づいて、ＰＹドメイン（２０３〜２１７ａａ）を含むリンカー（２０３〜２５８ａａ）は、ＴＧＦ−β誘発性炎症の阻止または増殖阻害による治療効果を有することが予想される(図１５）。
Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７−リンカーペプチド（２０３〜２５８ａａ）のアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 0006576251
１〜１０：Ｔａｔ
細菌産物内の上記ペプチドのコドン最適化ヌクレオチド配列を以下に示す。
Figure 0006576251
１〜３０：Ｔａｔ
３１〜１９８：Ｓｍａｄ７リンカー
１９９〜２４９：Ｖ５
哺乳類細胞産物内の上記ペプチドのコドン最適化ヌクレオチド配列を以下に示す。
Figure 0006576251
１〜３０：哺乳類コドン最適化Ｔａｔ
３１〜１９８：Ｓｍａｄ７リンカー
１９９〜２８５：ＮｏｔＩ、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ
Ｔａｔ−Ｓｍａｄ７−ＰＹペプチド（２０３〜２１７ａａ）のアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 0006576251
１〜１０：Ｔａｔ
細菌産物内の上記ペプチドのコドン最適化ヌクレオチド配列を以下に示す。
Figure 0006576251
１〜３０：Ｔａｔ
３１〜７５：Ｓｍａｄ７−ＰＹ
７６〜１２６：Ｖ５
哺乳類細胞産物内の上記ペプチドのコドン最適化ヌクレオチド配列を以下に示す。
Figure 0006576251
１〜３０：哺乳類コドン最適化Ｔａｔ
３１〜７５：Ｓｍａｄ７ ＰＹ
７６〜１６２：ＮｏｔＩ、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ
本技術の前述の説明は、例示および説明のために提示されている。前述は、本技術を本明細書中で開示される１つの形態または複数の形態に制限することを意図していない。本技術の説明は、1つまたは複数の実施形態および特定の変形および変更の記述を含んでいるが、その他の変形および変更が、例えば、本開示を理解した後では、当業者の技術および知識の範囲内であり得るように、本発明の技術の範囲内である。それは、許容される範囲内で、特許請求の範囲に記載されたものの代替の、交換可能なおよび/もしくは等価な構造、機能、範囲、またはステップを含む他の実施形態を含む権利を、そのような代替の、交換可能なおよび/もしくは等価な構造、機能、範囲、またはステップが本明細書中に開示されているかどうかにかかわりなく取得することを目的とするもので、公的にあらゆる特許性のある内容を献呈することを意図しているものではない。

Claims (12)

  1. タンパク質導入ドメインおよびＳｍａｄ７ドメインを含む、医薬として使用するための融合タンパク質であって、融合タンパク質のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示され、前記Ｓｍａｄ７ドメインが、ＴＧＦ−β阻害に関連しない１または複数のＳｍａｄ７の生物学的活性を有する、融合タンパク質。
  2. Ｓｍａｄ７ドメインが２またはそれ以上のＳｍａｄ７の生物学的活性を有し、その少なくとも１つがＴＧＦ−β阻害に関連しない活性である、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. １または複数の生物学的活性が細胞遊走の媒介、放射線誘発ＤＮＡ損傷の減少、および線維化反応の阻害からなる群より選択される、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
  4. タンパク質導入ドメインおよびＳｍａｄ７ドメインを含む、医薬として使用するための融合タンパク質であって、融合タンパク質のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示され、前記Ｓｍａｄ７ドメインが、ＴＧＦ−β阻害に関連しない１または複数のＳｍａｄ７の生物学的活性を有する、融合タンパク質。
  5. Ｓｍａｄ７ドメインが２またはそれ以上のＳｍａｄ７の生物学的活性を有し、その少なくとも１つがＴＧＦ−β阻害に関連しない活性である、請求項４に記載の融合タンパク質。
  6. １または複数の生物学的活性が上皮細胞遊走の増加、アポトーシスの減少、放射線誘発ＤＮＡ損傷の減少、炎症の減少、および脈管形成の減少からなる群より選択される、請求項４または５に記載の融合タンパク質。
  7. タンパク質導入ドメインおよびＳｍａｄ７ドメインを含む、医薬として使用するための融合タンパク質であって、融合タンパク質のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８に示され、前記Ｓｍａｄ７ドメインが、ＴＧＦ−β阻害に関連しない１または複数のＳｍａｄ７の生物学的活性を有する、融合タンパク質。
  8. Ｓｍａｄ７ドメインが２またはそれ以上のＳｍａｄ７の生物学的活性を有し、その少なくとも１つがＴＧＦ−β阻害に関連しない活性である、請求項７に記載の融合タンパク質。
  9. １または複数の生物学的活性が細胞生存の促進および抗炎症からなる群より選択される、請求項７または８に記載の融合タンパク質。
  10. 放射線療法または化学療法により誘発される口腔粘膜炎または組織損傷の治療または予防において使用するための、請求項１〜９のいずれかに記載の融合タンパク質。
  11. 自己免疫疾患、乾癬、または皮膚炎の治療または予防において使用するための、請求項１〜９のいずれかに記載の融合タンパク質。
  12. 創傷、異常な創傷治癒、瘢痕、または線維症の治療または予防において使用するための、請求項１〜９のいずれかに記載の融合タンパク質。
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