JP6563193B2 - Ｄｃｐｌａのエステル、およびそれを用いた処置の方法 - Google Patents

Description

本出願は、２０１１年１１月１３日出願の、米国仮特許出願第６１／５５９，１１７号の優先権を主張するものであり、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。

［開示の分野］
本開示は、８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）シクロプロピル］−オクタン酸（「ＤＣＰＬＡ」）のエステルに関する。本開示は、組成物、キット、およびエステルを用いた処置のための方法にさらに関する。

［開示の背景］
プロテインキナーゼＣは、プロテインキナーゼ酵素の最大のファミリーの１つであり、様々なアイソフォームから構成される。従来のアイソフォームにはα、βＩ、βＩＩ、γが含まれ、新規なアイソフォームにはδ、ε、η、θが含まれ、非定型的なアイソフォームにはξ、およびι／λが含まれる。

ＰＫＣ酵素は主にサイトゾル性であるが、活性化すると膜に転位する。ＰＫＣは、活性化および転位した後は、アンカータンパク質ＲＡＣＫ１によって、膜中に繋留される。例えば、Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎら、（１９９１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８８、３９９７〜４０００；Ｎｉｓｈｉｚｕｋａ，Ｙ．（１９９５）ＦＡＳＥＢ Ｊ ９、４８４−４９６；Ｓｋｌａｎら、（２００６）Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、７８、１１７〜１３４を参照されたい。ＲＡＣＫ１は、ＰＫＣを、リン酸化のための対応する基質に局在化させ、よってＰＫＣを機能的に活性にし、生理学的に関連付ける。

活性化したＰＫＣは、様々な生物学的経路に関与する。例えば、ＰＫＣはＥＬＡＶ ｍＲＮＡ安定化タンパク質およびｃＡＭＰ応答エレメント結合（「ＣＲＥＢ」）タンパク質を活性化する。ＰＫＣのアイソフォームも、アミロイド前駆タンパク質（「ＡＰＰ」）のプロセシングおよびアミロイドの蓄積において調節的役割を果たす。例えば、ＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−εは、非アミロイド形成性経路によってＡＰＰのプロセシングを調節し、これら酵素が低減するとＡβの合成および蓄積の増大をもたらし得ることが示唆される。それゆえ、ＰＫＣアクチベーターは可溶性Ａβのレベルを低減し、可溶性ＡＰＰ−αのレベルを増大することができ得る。ＰＫＣアクチベーターは、アミロイドプラークおよび神経原線維変化を低減または除去することもでき得る。

ＰＫＣアクチベーターは、様々な疾患および状態の予防および処置に関連している。例えば、ＰＫＣアクチベーターは、神経変性疾患および状態、神経情動性疾患および障害、認知障害、ならびに神経またはシナプスの喪失に付随する疾患および状態の予防および処置を可能にし得る。実際、ＰＫＣアクチベーターは、シナプス形成を誘発することが見出されている。さらに、ＰＫＣアクチベーターは、例えば、長期記憶を含めた記憶および学習における改善に関連している。

一例において、ＰＫＣアクチベーターは、アルツハイマー病（「ＡＤ」）の動物モデルにおける神経保護活性を実証している。Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９２、８９：７１８４〜７１８８を参照されたい。ＡＤは、記憶、認知、論理的思考、判断、および情意安定性の進行性の低下によって臨床的に特徴付けられ、徐々に深刻な精神衰退をもたらし、最終的には死をもたらす、神経変性障害である。

病理学的に、ＡＤは、β−およびγ−セクレターゼによるアミロイド前駆タンパク質（「ＡＰＰ」）のタンパク分解性の切断によって生成される４ｋＤａのペプチドである、凝集したβ−アミロイド（「Ａβ」）の蓄積に付随する。Ａβのオリゴマーは最も毒性であると考えられている一方、原線維性Ａβは概ね不活性である。モノマーのＡβは正常患者において見出され、機能は未だ決定されていない。

ＰＫＣアクチベーターは、Ａβのレベルを低減し、ＡＤトランスジェニックマウスの生存を延長することができる。Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：７１８４〜７１８８を参照されたい。ＰＫＣ−εは、Ａβ生成を抑制するのに最も効果的であることが示されている。Ｚｈｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２００１、２８５：９９７〜１００６を参照されたい。したがって、アイソフォーム特異的ＰＫＣアクチベーターは、潜在的な抗ＡＤ薬として、極めて望ましい。

ＡＤにおける最初期の持続的な細胞病理学的変化は、シナプスの喪失である。Ｓｃｈｅｆｆ ら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ、２００６、２７：１３７２〜１３８４、およびＭａｒｃｅｌｌｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００８、５８５：１０９〜１１８を参照されたい。実際、シナプスの喪失は、ＡＤ患者における認知症の程度に緊密に相関する、脳における唯一の病理学的知見であると思われる。Ｔｅｒｒｙら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１９９１、３０：５７２〜５８０を参照されたい。Ａβがシナプスの喪失に関与することを、証拠は示唆している。

他の疾患および状態が、シナプスの喪失および／またはＡβに付随する。脳傷害に罹患しているヒトは、例えば、ＡＰＰ、およびＡＰＰのタンパク分解性生成物であるＡβの合成および発現の増大を示す。Ｚｏｈａら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ、２０１１、４１：３２９〜３３７；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｌａｎｃｅｔ、１９９１、１４２２〜１４２３；Ｇｅｎｔｌｅｍａｎら、ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ、１９９７、８：１５１９〜１５２２；Ｉｗａｔａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２００２、６１：１０５６〜１０６８を参照されたい。動物モデルにおいて、ＰＫＣアクチベーターであるブリオスタチン−１は、外傷性脳傷害誘発性の学習および記憶の欠損から保護することが示された。Ｚｏｈａｒら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ、２０１１、４１：３２９〜３３７を参照されたい。

さらに、脳卒中の形態には、Ａβによって引き起こされるもの、例えば、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）に付随するものがある。米国出願公開第２０１０／００２２６４５ Ａ１号を参照されたい。この障害は、ＡＤにおいて見出されるのと同じＡβ沈着が、脳の軟膜の壁および表在性の大脳皮質の血管に蓄積する、一形態の血管障害である。アミロイド沈着はこれらの血管を不全にする素因となり、出血性脳卒中の危険性を増大する。ＣＡＡは、一過性虚血発作、くも膜下出血、ダウン症候群、照射後壊死、多発性硬化症、白質脳症、海綿状脳症、および拳闘家認知症にも関連する。

ＰＫＣ−αとＰＫＣ−εの両方が、シナプス形成、すなわちシナプスの形成にとって重要である。シナプス前の神経線維にＰＫＣ−εが非常に大量にあることは、神経突起の伸長、シナプスの形成、および神経伝達物質の放出における役割を示唆する。Ｓｈｉｒａｉら、ＦＥＢＳ、２００８、２９：１４４５〜１４５３を参照されたい。ＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−εを活性化する非毒性の薬物は、非病理学的条件下のシナプス形成を促進し、実際に病理学的条件下でシナプス喪失を予防することができる。Ｎｅｌｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２００９、３４：１３６〜１４５；Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００７、１０４：１９５７１〜１９５７６；Ｓｕｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００８、１０５：１３６２０〜１３６２５；Ｓｕｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００９、１０６：１４６７６〜１４６８０を参照されたい。

例えば、ＰＫＣアクチベーターは、脳卒中の動物モデルにおける神経保護活性を実証している。Ｓｕｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００５、５１２：４３〜５１を参照されたい。ＰＫＣのいくつかのアイソフォームは、脳卒中後の虚血および再灌流の損傷を媒介する上で中心的役割を果たす。実験的脳卒中モデル、マウス遺伝学、ならびに選択的ペプチドインヒビターおよびアクチベーターでの試験は、ＰＫＣ−εは虚血抵抗性の誘発に関与し、損傷を予防することを実証する一方で、ＰＫＣ−δおよびＰＫＣ−γは傷害に関係する。Ｔａｋａｙｏｓｈｉら、Ｓｔｒｏｋｅ、２００７、３８（２）：３７５〜３８０；およびＢｒｉｇｈｔら、Ｓｔｒｏｋｅ、２００５；３６：２７８１を参照されたい。ブリオスタチン−１での虚血後／低酸素の処置は、シナプス形成、神経栄養活性、ならびに空間学習および記憶における虚血誘発性欠損を効果的に救出する。Ｓｕｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、２００８、１０５（３６）：１３６２０〜１３６２５を参照されたい。

ＰＫＣの活性化は学習および記憶の増強において決定的な役割を有し、ＰＫＣアクチベーターは記憶および学習を増大することが示されている。Ｓｕｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００５、５１２：４３〜５１；Ａｌｋｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、２００５、１０２：１６４３２〜１６４３７を参照されたい。例えば、ブリオスタチンは、齧歯動物、ウサギ、および無脊椎動物において学習の速度を増大する。Ｓｕｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００５、５１２：４３〜５１；Ｗａｎｇら、Ｂｅｈａｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００８、１９：２４５〜２５６；およびＫｕｚｉｒｉａｎら、Ｂｉｏｌ．Ｂｕｌｌ．、２００６、２１０：２０１〜２１４を参照されたい。さらに、長期連合記憶に対するブリオスタチン誘発性シナプス形成は、ＰＫＣ活性化によって調節されることが示された。Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００７、１０４：１９５７１〜１９５７６。

ＰＫＣ活性化は、様々な他の状態に付随している。例えば、ＰＫＣアクチベーターは、うつ病の動物モデルにおける神経保護活性を実証している。Ｓｕｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００５、５１２：４３〜５１を参照されたい。ＰＫＣアクチベーターは、パーキンソン病、双極性障害、ならびに統合失調症、精神遅滞（および関連疾患、例えば、自閉症）の予防および処置にも関連する。

ＰＫＣアクチベーターは、複数のアイソフォームのＰＫＣに対して作用する、広範囲のアクチベーターであり得、またはある種のアイソフォームに対して選択的であり得る。全てのタイプのＰＫＣアクチベーターが興味の対象となる一方で、選択的ＰＫＣアクチベーターは、様々なアイソフォームが、様々な、ときには反対の機能を遂行するため、独特な利点をもたらし得る。例えば、ＰＫＣ−δおよびＰＫＣ−θはカスパーゼアポトーシス経路の構成成分であることから、アポトーシス促進性の機能を有するとしばしばみなされる。ＰＫＣ−εは、これとは対照的に、反対の役割を有し、ＰＫＣ−εが活性化されると増殖および細胞の生存が促進され、アポトーシスが阻害される。Ｎｅｌｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００９、３４（３）：１３６〜１４５を参照されたい。

様々な異なるＰＫＣアクチベーターが知られている。ブリオスタチンは、例えば、ＰＫＣ１，２−ジアシルグリセロール（「ＤＡＧ」）結合部位を、極めて高い親和性で競合し、短い活性化期間およびその後に長期間の下方制御を生成する大環状ラクトンである。他のＰＫＣアクチベーターには、ホルボールエステル、ナフタレンスルホンアミド、および酸化脂質が含まれる。

多価不飽和脂肪酸（「ＰＵＦＡ」）、例えば、アラキドン酸および２−ヒドロキシ−９−シス−オクタデカン酸（すなわち、ミネルバル（ｍｉｎｅｒｖａｌ））も、知られているＰＫＣアクチベーターである。ＰＵＦＡは、神経系の不可欠な構成成分であるという点で、興味深い分子である。ＰＵＦＡは、膜の流動性を増大し、高度に生理活性の生成物に速やかに酸化し、様々な炎症およびホルモン効果を生成することが知られている。さらに、ＰＵＦＡは低分子量であり、血液脳関門を越えることができる。さらに、ＰＵＦＡは酸および塩基に対して安定であり、そのため経口投与に対して潜在的に有効である。その一方で、ＰＵＦＡは、身体内で速やかに分解および代謝される。

ＰＵＦＡ同様、ＰＵＦＡのある種の誘導体がＰＫＣアクチベーターであることが示されている。例えば、ある種のシクロプロパン化ＰＵＦＡ、例えば、ＤＣＰＬＡ（すなわち、リノール酸誘導体）、ＡＡ−ＣＰ４メチルエステル（すなわち、アラキドン酸誘導体）、ＤＨＡ−ＣＰ６メチルエステル（すなわち、ドコサヘキサエン酸誘導体）、およびＥＰＡ−ＣＰ５メチルエステル（すなわち、エイコサペンタエン酸誘導体）は、ＰＫＣ−εを選択的に活性化することができ得る。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００９、２８４（５０）：３４５１４〜３４５２１を参照されたい。米国特許出願公開第２０１０／００２２６４５ Ａ１号も参照されたい。

［開示の概要］
本開示は、８−［２−（２−ペンチルシクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（「ＤＣＰＬＡ」）のエステル、およびその組成物を含む。一態様において、ＤＣＰＬＡのエステルは、アルキルエステル、ベンジルおよび芳香族エステル、脂肪アルコールエステル、脂肪酸エステル、シクロプロパン化脂肪アルコールエステル、シクロプロパン化脂肪酸エステル、ジアシルグリセロールエステル、ホスファチジルセリンエステル、コレステリルエステル、ならびにマクロライドエステルから選択される。

本開示は、学習を改善するため、記憶を改善するため、β−アミロイドレベルを低減するため、シナプス喪失またはシナプス損傷に付随する疾患を予防または処置するため、神経変性障害および状態を予防または処置するため、うつ病を予防または処置するため、脳卒中を予防または処置するため、ならびに脳傷害を予防または処置するための方法をさらに含み、これらの方法は、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルを、それを必要とする対象に投与することを含む。

本開示の別の一側面は、学習を改善するため、記憶を改善するため、β−アミロイドレベルを低減するため、シナプス喪失またはシナプス損傷に付随する疾患を予防または処置するため、神経変性障害および状態を予防または処置するため、うつ病を予防または処置するため、脳卒中を予防または処置するため、ならびに脳傷害を予防または処置するための方法において用いるためのＤＣＰＬＡのエステルを含む。

ＤＣＰＬＡおよびＤＨＡ−ＣＰ６と比べた、ＤＣＰＬＡ−メチルエステルによるＰＫＣの活性化（各炭素−炭素二重結合がシクロプロパン基で置きかえられている、ドコサヘキサエン酸）。 ＤＣＰＬＡ−イソプロピルエステルおよびＤＣＰＬＡ−シクロプロパン化オレイルエステルのＰＫＣ活性化および選択性。 ＤＣＰＬＡ−エチルエステル、ＤＣＰＬＡ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、およびＤＣＰＬＡレチニルエステルのＰＫＣ活性化および選択性。 コレステリルリノレエートと比べたＤＣＰＬＡ−コレステロールエステルのＰＫＣ活性化および選択性。 様々なＡβ集合体の神経毒性効果。ＡＳＰＤ、ＡＤＤＬ、ＯＡβ＜１０００ｋＤａろ液、およびモノマーのＡβを、本明細書の実施例のセクションに記載した通りに調製し、２０時間後の一次ラット海馬ニューロン培養物に対するこれらの毒性を、ＭＴＴアッセイを用いて決定した。ＡＳＰＤは１００ｋＤａろ液からの保持物を表し、ＯＡβはろ液を表す。 ＰＫＣアクチベーター（ブリオスタチン−１、ＤＣＰＬＡ、およびＤＣＰＬＡ−ＭＥ）による、ＡＳＰＤ誘発性毒性からの神経保護。５０ｎＭ ＡＳＰＤ処理した培養一次ラット海馬ニューロン（図６Ａ）およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（図６Ｂ）中、ＰＫＣアクチベーター（ブリオスタチン−１、ＤＣＰＬＡ、およびＤＣＰＬＡ−ＭＥ）処理後の細胞の生存率を、ここに記載する通りＭＴＴアッセイによって測定した。ＰＫＣ−ε転位インヒビターペプチド［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］で処理した後ＤＣＰＬＡ−ＭＥで処理したニューロンおよび細胞の生存率も測定した。ＰＫＣアクチベーターの中で、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）が、ＡＳＰＤから最も保護的であったことが見出された。データを、平均値±ＳＥＭとして表す（スチューデントのｔ検定^*．ｐ＜０．０５；^**，ｐ＜０．００５および^***，ｐ＜０．０００５、ｎ＝６）。 ＰＫＣアクチベーター（ブリオスタチン−１、ＤＣＰＬＡ、およびＤＣＰＬＡ−ＭＥ）による、ＡＳＰＤ誘発性毒性からの神経保護。５０ｎＭ ＡＳＰＤ処理した培養一次ラット海馬ニューロン（図６Ａ）およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（図６Ｂ）中、ＰＫＣアクチベーター（ブリオスタチン−１、ＤＣＰＬＡ、およびＤＣＰＬＡ−ＭＥ）処理後の細胞の生存率を、ここに記載する通りＭＴＴアッセイによって測定した。ＰＫＣ−ε転位インヒビターペプチド［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］で処理した後ＤＣＰＬＡ−ＭＥで処理したニューロンおよび細胞の生存率も測定した。ＰＫＣアクチベーターの中で、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）が、ＡＳＰＤから最も保護的であったことが見出された。データを、平均値±ＳＥＭとして表す（スチューデントのｔ検定^*．ｐ＜０．０５；^**，ｐ＜０．００５および^***，ｐ＜０．０００５、ｎ＝６）。 ＡＳＰＤ処理はＰＫＣ−ε発現を低減する。実施例セクションに記載する通り、培養一次ラット海馬ニューロン中のＰＫＣ−εレベルを免疫蛍光（ｎ＝６）およびウエスタンブロット（ｎ＝３）によって測定した。細胞染色用に、２０時間ＡＳＰＤ処理した細胞を洗浄し、固定し、透過処理した。次いで、細胞を免疫染色し、共焦点顕微鏡において画像化した。共焦点画像分析とウエスタンブロットの両方が、ＡＳＰＤ処理後、ＰＫＣ−εレベルにおける有意な低減を示した。「Ｍ」は分子量マーカーであり、「Ｃ」は対照である。 ＡＳＰＤおよびＡＤＤＬ処理後のＰＫＣ−εの膜への転位。モノマーＡβ、ＡＤＤＬ、およびＡＳＰＤで処理した、対照（「Ｃ」）およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫を膜およびサイトゾル分画に分離し、ウエスタンブロットを行った。ＰＫＣ−ε活性化を、膜に存在する全ＰＫＣ−εのパーセント値として測定した。データを平均値±ＳＥＭとして表す。（スチューデントのｔ検定^**，ｐ＜０．００５および^***，ｐ＜０．０００５）。「Ｍ」は分子量マーカーであり、「Ｃ」は対照である。 ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＡＳＰＤ誘発性のＰＫＣ−ε喪失を防ぐ。一次ニューロンを、ＡＳＰＤおよび／またはＤＣＰＬＡ−ＭＥで処理した（図８Ａ）。データを、標準化したＰＫＣ−ε値の平均値±ＳＥＭとして表す。ウエスタンブロット分析を：１００ｎＭ ＤＣＰＬＡ−ＭＥで処理した一次ニューロン（図８Ｂ）；５μＭ ＰＫＣ−εインヒビター［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］の存在および非存在下でＤＣＰＬＡ−ＭＥで処理した、５０ｎＭ ＡＳＰＤ−処理した一次ニューロン（図８Ｃ）；ならびに対照および処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＰＫＣ−ε活性化（図８Ｄ）に対して行った。ＰＫＣ−ε発現を、βアクチンに対して標準化した。データを、３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭとして表す（スチューデントのｔ検定^*．ｐ＜０．０５；^**，ｐ＜０．００５および^***，ｐ＜０．０００５）。図８Ｄにおいて、「可溶性」は、ＰＫＣ−εがサイトゾル中に残存することを表し、「粒子状」はＰＫＣ−εが膜に存在することを表す。ＰＫＣ活性化を、膜に存在する全ＰＫＣ−εのパーセント値として測定した。 ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＡＳＰＤ誘発性のＰＫＣ−ε喪失を防ぐ。一次ニューロンを、ＡＳＰＤおよび／またはＤＣＰＬＡ−ＭＥで処理した（図８Ａ）。データを、標準化したＰＫＣ−ε値の平均値±ＳＥＭとして表す。ウエスタンブロット分析を：１００ｎＭ ＤＣＰＬＡ−ＭＥで処理した一次ニューロン（図８Ｂ）；５μＭ ＰＫＣ−εインヒビター［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］の存在および非存在下でＤＣＰＬＡ−ＭＥで処理した、５０ｎＭ ＡＳＰＤ−処理した一次ニューロン（図８Ｃ）；ならびに対照および処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＰＫＣ−ε活性化（図８Ｄ）に対して行った。ＰＫＣ−ε発現を、βアクチンに対して標準化した。データを、３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭとして表す（スチューデントのｔ検定^*．ｐ＜０．０５；^**，ｐ＜０．００５および^***，ｐ＜０．０００５）。図８Ｄにおいて、「可溶性」は、ＰＫＣ−εがサイトゾル中に残存することを表し、「粒子状」はＰＫＣ−εが膜に存在することを表す。ＰＫＣ活性化を、膜に存在する全ＰＫＣ−εのパーセント値として測定した。 ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＡＳＰＤ誘発性のＰＫＣ−ε喪失を防ぐ。一次ニューロンを、ＡＳＰＤおよび／またはＤＣＰＬＡ−ＭＥで処理した（図８Ａ）。データを、標準化したＰＫＣ−ε値の平均値±ＳＥＭとして表す。ウエスタンブロット分析を：１００ｎＭ ＤＣＰＬＡ−ＭＥで処理した一次ニューロン（図８Ｂ）；５μＭ ＰＫＣ−εインヒビター［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］の存在および非存在下でＤＣＰＬＡ−ＭＥで処理した、５０ｎＭ ＡＳＰＤ−処理した一次ニューロン（図８Ｃ）；ならびに対照および処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＰＫＣ−ε活性化（図８Ｄ）に対して行った。ＰＫＣ−ε発現を、βアクチンに対して標準化した。データを、３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭとして表す（スチューデントのｔ検定^*．ｐ＜０．０５；^**，ｐ＜０．００５および^***，ｐ＜０．０００５）。図８Ｄにおいて、「可溶性」は、ＰＫＣ−εがサイトゾル中に残存することを表し、「粒子状」はＰＫＣ−εが膜に存在することを表す。ＰＫＣ活性化を、膜に存在する全ＰＫＣ−εのパーセント値として測定した。 ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＡＳＰＤ誘発性のＰＫＣ−ε喪失を防ぐ。一次ニューロンを、ＡＳＰＤおよび／またはＤＣＰＬＡ−ＭＥで処理した（図８Ａ）。データを、標準化したＰＫＣ−ε値の平均値±ＳＥＭとして表す。ウエスタンブロット分析を：１００ｎＭ ＤＣＰＬＡ−ＭＥで処理した一次ニューロン（図８Ｂ）；５μＭ ＰＫＣ−εインヒビター［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］の存在および非存在下でＤＣＰＬＡ−ＭＥで処理した、５０ｎＭ ＡＳＰＤ−処理した一次ニューロン（図８Ｃ）；ならびに対照および処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＰＫＣ−ε活性化（図８Ｄ）に対して行った。ＰＫＣ−ε発現を、βアクチンに対して標準化した。データを、３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭとして表す（スチューデントのｔ検定^*．ｐ＜０．０５；^**，ｐ＜０．００５および^***，ｐ＜０．０００５）。図８Ｄにおいて、「可溶性」は、ＰＫＣ−εがサイトゾル中に残存することを表し、「粒子状」はＰＫＣ−εが膜に存在することを表す。ＰＫＣ活性化を、膜に存在する全ＰＫＣ−εのパーセント値として測定した。 ＡＳＰＤはシナプスの喪失を誘発した。ラット海馬一次ニューロンの共焦点画像を、図９Ａに示す。４番目のカラムは、最初の３つのカラムを併合した画像である。平均蛍光強度を算出し、対照のパーセント値として表した（ｎ＝６）。ＰＳＤ−９５（図９Ｂ）およびシナプトフィジン（図９Ｃ）の発現レベルの図による表現を示す。値を、平均値±ＳＥＭとして表す（スチューデントのｔ検定^*．ｐ＜０．０５および^**，ｐ＜０．００５^***）。 ＡＳＰＤはシナプスの喪失を誘発した。ラット海馬一次ニューロンの共焦点画像を、図９Ａに示す。４番目のカラムは、最初の３つのカラムを併合した画像である。平均蛍光強度を算出し、対照のパーセント値として表した（ｎ＝６）。ＰＳＤ−９５（図９Ｂ）およびシナプトフィジン（図９Ｃ）の発現レベルの図による表現を示す。値を、平均値±ＳＥＭとして表す（スチューデントのｔ検定^*．ｐ＜０．０５および^**，ｐ＜０．００５^***）。 ＡＳＰＤはシナプスの喪失を誘発した。ラット海馬一次ニューロンの共焦点画像を、図９Ａに示す。４番目のカラムは、最初の３つのカラムを併合した画像である。平均蛍光強度を算出し、対照のパーセント値として表した（ｎ＝６）。ＰＳＤ−９５（図９Ｂ）およびシナプトフィジン（図９Ｃ）の発現レベルの図による表現を示す。値を、平均値±ＳＥＭとして表す（スチューデントのｔ検定^*．ｐ＜０．０５および^**，ｐ＜０．００５^***）。 ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＡＳＰＤ誘発性のシナプス喪失から保護する。ラット海馬一次ニューロンの共焦点画像を図１０Ａに示す。第１の「併合」のカラムは先の２つのカラム、すなわち核およびＭＡＰ−２に対して染色した細胞の併合である。第２の「併合」のカラムは、先の３つのカラム、すなわち、核、ＰＳＤ−９５、およびシナプトフィジンに対して染色した細胞の併合である。平均蛍光強度を算出し、対照のパーセント値として表した（ｎ＝６）。ＡＳＰＤ処理は染色した神経突起の突起における顕著な低減を示し、ＤＣＰＬＡ−ＭＥはシナプスの喪失から保護した。 図１０Ｂに、ＭＡＰ−２、ＰＳＤ−９５、およびシナプトフィジンの発現の、図による表現を示す。図１０Ｃは、対照、ＡＳＰＤ、ＡＳＰＤ＋ＤＣＰＬＡ−ＭＥ、およびＰＫＣ−εインヒビター［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］＋ＡＳＰＤ＋ＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理一次ラット海馬ニューロンにおける、シナプトフィジン発現のウエスタンブロット分析である。値を、平均値±ＳＥＭとして表す（スチューデントのｔ検定^*．ｐ＜０．０５^**，ｐ＜０．００５および^***，ｐ＜０．０００５）。 図１０Ｂに、ＭＡＰ−２、ＰＳＤ−９５、およびシナプトフィジンの発現の、図による表現を示す。図１０Ｃは、対照、ＡＳＰＤ、ＡＳＰＤ＋ＤＣＰＬＡ−ＭＥ、およびＰＫＣ−εインヒビター［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］＋ＡＳＰＤ＋ＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理一次ラット海馬ニューロンにおける、シナプトフィジン発現のウエスタンブロット分析である。値を、平均値±ＳＥＭとして表す（スチューデントのｔ検定^*．ｐ＜０．０５^**，ｐ＜０．００５および^***，ｐ＜０．０００５）。 ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＡＳＰＤ処理した一次ニューロンにおいてＧＳＫ−３βを不活性化する。ビヒクル（対照）、ＡＳＰＤ（５０ｎＭ）、ＡＳＰＤ（５０ｎｍ）＋ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）、およびＡＳＰＤ（５０ｎｍ）＋ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）＋ＰＫＣ−εインヒビター（５μＭ）［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］で処理したラット海馬ニューロンからの、ホスホＧＳＫ−３β（Ｓｅｒ−９）および全ＧＳＫ−３βタンパク質のウエスタンブロット分析。ホスホＧＳＫ−３β発現を、全ＧＳＫ−３β発現に対して標準化した。ＡＳＰＤ処理はＧＳＫ−３βを活性化し、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理はＧＳＫ−３βを不活性化した。データを、平均値±ＳＥＭとして表す（スチューデントのｔ検定^*．ｐ＜０．０５および^**，ｐ＜０．００５、ｎ＝３）。 ＤＣＰＬＡ−ＭＥの皮質ニューロンに対する効果。左：一次ヒト皮質ニューロンにおけるフラクタル次元。右：２１２×２１２μｍ視野における、シナプス／細胞。「ＤＣＰ」はＤＣＰＬＡメチルエステルである。（^*ｐ＜０．０３）。 ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、学習において用量依存的な改善を表す。ＤＣＰＬＡ−ＭＥを、例１６において記載する通り、５．３ｍｇ／ｋｇまたは１６．０ｍｇ／ｋｇの何れかをラットに投与した。水迷路空間学習試験において効果を評価し、対照群と比較した。 ＤＣＰＬＡ−ＭＥは記憶における用量依存的な改善を表す。ＤＣＰＬＡ−ＭＥを、例１６において記載する通り、５．３または１６．０ｍｇ／ｋｇの何れかをラットに投与した。データを、標的の四分円比（quadrant ratio）を用いて分析した。 ＤＣＰＬＡ−ＭＥは記憶における用量依存的な改善を表す。ＤＣＰＬＡ−ＭＥを、例１６において記載する通り、５．３または１６．０ｍｇ／ｋｇの何れかをラットに投与した。データを、標的の四分円比（quadrant ratio）を用いて分析した。 ＤＣＰＬＡ−ＭＥは記憶における用量依存的な改善を表す。ＤＣＰＬＡ−ＭＥを、例１６において記載する通り、５．３または１６．０ｍｇ／ｋｇの何れかをラットに投与した。データを、標的の四分円比（quadrant ratio）を用いて分析した。 ＤＣＰＬＡ−ＭＥは記憶における用量依存的な改善を表す。ＤＣＰＬＡ−ＭＥを、例１６において記載する通り、５．３または１６．０ｍｇ／ｋｇの何れかをラットに投与した。データを、標的の四分円比（quadrant ratio）を用いて分析した。 ＤＣＰＬＥ−ＭＥは、ラット一次ニューロンにおける樹状突起の分岐を増大する。７日齢のラット海馬ニューロンの培養物を、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）で４８時間処理した。図１５Ａ−ＭＡＰ−２、シナプトフィジン、およびＤＡＰＩに対して染色した、ラット海馬ニューロンを示す共焦点顕微鏡写真。 ＤＣＰＬＥ−ＭＥは、ラット一次ニューロンにおける樹状突起の分岐を増大する。７日齢のラット海馬ニューロンの培養物を、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）で４８時間処理した。図１５Ｂ−ニューロン１個あたりの樹状突起の分岐数の、図による表現。ＤＣＰＬＡ−ＭＥによるＰＫＣεの活性化により、樹状突起の分岐は２倍増大する。データは、平均値±ＳＥとして表される。^*は対照に関する有意性を表す（^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．００５、および^***ｐ＜０．０００５）。 ＤＣＰＬＥ−ＭＥは、ラット一次ニューロンにおける樹状突起の分岐を増大する。７日齢のラット海馬ニューロンの培養物を、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）で４８時間処理した。図１５Ｃ−８個のランダムな共焦点画像２２５μｍ²から算出した、ＭＡＰ−２またはシナプトフィジンに対する平均蛍光強度。データは、平均値±ＳＥとして表される。^*は対照に関する有意性を表す（^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．００５、および^***ｐ＜０．０００５）。 ＰＫＣ−ε活性化はヒト一次ニューロンの変性を防ぐ。一次ヒトニューロンを、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）またはブリオスタチン１（０．２７ｎＭ）の何れかで４０日間処理した。新鮮な薬物を３日毎に添加し、培地の５０％を交換した。図１６Ａ−４０日齢の、非処理（「対照」）、ブリオスタチン１、およびＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理したニューロンの画像。 ＰＫＣ−ε活性化はヒト一次ニューロンの変性を防ぐ。一次ヒトニューロンを、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）またはブリオスタチン１（０．２７ｎＭ）の何れかで４０日間処理した。新鮮な薬物を３日毎に添加し、培地の５０％を交換した。図１６Ｂ−経時的に、３つの２０×視野（５０８μｍ²）から計数した、神経突起陽性細胞の数。ＤＣＰＬＡ−ＭＥおよびブリオスタチン１処理は、少なくとも４０日間、細胞の生存を安定化した。非処理細胞の生存率は２０日後に低下した。 ＰＫＣ−ε活性化はヒト一次ニューロンの変性を防ぐ。一次ヒトニューロンを、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）またはブリオスタチン１（０．２７ｎＭ）の何れかで４０日間処理した。新鮮な薬物を３日毎に添加し、培地の５０％を交換した。図１６Ｃ、図１６Ｄ−１日のニューロンと比べた、４０日齢のニューロンにおけるＰＫＣ−εの免疫ブロット分析。ＤＣＰＬＡ−ＭＥはＰＫＣ−εを保護する。 ＰＫＣ−ε活性化はヒト一次ニューロンの変性を防ぐ。一次ヒトニューロンを、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）またはブリオスタチン１（０．２７ｎＭ）の何れかで４０日間処理した。新鮮な薬物を３日毎に添加し、培地の５０％を交換した。図１６Ｃ、図１６Ｄ−１日のニューロンと比べた、４０日齢のニューロンにおけるＰＫＣ−εの免疫ブロット分析。ＤＣＰＬＡ−ＭＥはＰＫＣ−εを保護する。データを平均値±ＳＥとして表し、^*は１日目のニューロンに関する有意性を表し、＃は非処理の４０日または３０日のニューロンに関する有意性を表す。（^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．００５および^***ｐ＜０．０００５）。 ＰＫＣ−ε活性化はヒト一次ニューロンの変性を防ぐ。一次ヒトニューロンを、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）またはブリオスタチン１（０．２７ｎＭ）の何れかで４０日間処理した。新鮮な薬物を３日毎に添加し、培地の５０％を交換した。図１６Ｅ−ブリオスタチンまたはＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理４０日後の、ＰＳＤ−９５およびシナプトフィジンの免疫ブロット分析。 ＰＫＣ−ε活性化はヒト一次ニューロンの変性を防ぐ。一次ヒトニューロンを、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）またはブリオスタチン１（０．２７ｎＭ）の何れかで４０日間処理した。新鮮な薬物を３日毎に添加し、培地の５０％を交換した。図１６Ｆ、図１６Ｇ−ウエスタンブロットから算出した、ＰＳＤ−９５およびシナプトフィジンの免疫染色。染色は、ＤＣＰＬＡ−ＭＥおよびブリオスタチン１処理した細胞において有意に高い。データを平均値±ＳＥとして表し、^*は１日目のニューロンに関する有意性を表し、＃は非処理の４０日または３０日のニューロンに関する有意性を表す。（^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．００５および^***ｐ＜０．０００５）。 ＰＫＣ−ε活性化はヒト一次ニューロンの変性を防ぐ。一次ヒトニューロンを、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）またはブリオスタチン１（０．２７ｎＭ）の何れかで４０日間処理した。新鮮な薬物を３日毎に添加し、培地の５０％を交換した。図１６Ｆ、図１６Ｇ−ウエスタンブロットから算出した、ＰＳＤ−９５およびシナプトフィジンの免疫染色。染色は、ＤＣＰＬＡ−ＭＥおよびブリオスタチン１処理した細胞において有意に高い。データを平均値±ＳＥとして表し、^*は１日目のニューロンに関する有意性を表し、＃は非処理の４０日または３０日のニューロンに関する有意性を表す。（^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．００５および^***ｐ＜０．０００５）。 ＰＫＣ−ε活性化はヒト一次ニューロンの変性を防ぐ。一次ヒトニューロンを、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）またはブリオスタチン１（０．２７ｎＭ）の何れかで４０日間処理した。新鮮な薬物を３日毎に添加し、培地の５０％を交換した。図１６Ｈ−３０日齢のニューロンの共焦点画像。ＤＣＰＬＡ−ＭＥおよびブリオスタチン１は、点状におけるＰＳＤ−９５およびシナプトフィジンの共局在した染色を増大し、シナプスの数の増大を指摘するものであった。挿入は、典型的なシナプスを示す、拡大領域を示す。 ＰＫＣ−ε活性化はヒト一次ニューロンの変性を防ぐ。一次ヒトニューロンを、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）またはブリオスタチン１（０．２７ｎＭ）の何れかで４０日間処理した。新鮮な薬物を３日毎に添加し、培地の５０％を交換した。図１６Ｉ−細胞１個あたりのシナプスの数は、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理した細胞において増大した。データを平均値±ＳＥとして表し、^*は１日目のニューロンに関する有意性を表し、＃は非処理の４０日または３０日のニューロンに関する有意性を表す。（^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．００５および^***ｐ＜０．０００５）。

発明の詳細な説明

定義
ここで用いる、単数形の「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈による他の指示がなされなければ、複数の指示対象を含む。

ここで用いる、「プロテインキナーゼＣアクチベーター」または「ＰＫＣアクチベーター」は、プロテインキナーゼＣに結合することにより、プロテインキナーゼＣによって触媒される反応の速度を増大する物質を意味する。ここで用いる、「選択的活性化」は、１つのＰＫＣアイソザイム、例えばＰＫＣ−εを、別のＰＫＣアイソザイムよりも大きな検出可能な程度に活性化することを意味する。

ここで用いる、「脂肪酸」の語は、炭化水素鎖からなり、遊離酸、酸性塩、またはエステルで終わる化合物を意味する。特定しない場合は、「脂肪酸」の語は、３つの形態を全て包含することを意味する。当業者には、ある種の表現が交換可能であることが理解される。例えば、「ＤＣＰＬＡのメチルエステル」は、「ＤＣＰＬＡメチルエステル」と同じであり、これは「メチルエステル型のＤＣＰＬＡ」と同じである。

脂肪酸は、飽和または不飽和、分枝または非分枝、および天然に存在しても、または合成であってもよい。リノール酸が脂肪酸の一例である（下記に遊離酸の形態を示す）。

「不飽和脂肪酸」は、炭化水素鎖内に少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含有している脂肪酸である。各二重結合は、シスまたはトランス型であってよい。

「一不飽和脂肪酸」または「ＭＵＦＡ」は、炭素−炭素二重結合を１個含有している。オレイン酸が一不飽和脂肪酸の一例である。「多価不飽和脂肪酸」または「ＰＵＦＡ」は、１個を超える炭素−炭素二重結合を含有している。リノール酸が多価不飽和脂肪酸の一例である。

「シクロプロパン化一不飽和脂肪酸」または「シクロプロパン化ＭＵＦＡ」の語は、炭素−炭素二重結合がシクロプロピル基によって置きかえられている化合物を意味する。シクロプロパン基は、シスまたはトランス配置であってよい。別段の指摘がなければ、シクロプロパン基はシス配置であることを理解されたい。シクロプロパン化ＭＵＦＡの一例は、８−（２−オクチルシクロプロピル）オクタン酸である（下記に遊離酸形態を示す）。

「シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸」または「シクロプロパン化ＰＵＦＡ」の語は、多価不飽和脂肪酸における少なくとも１個の炭素−炭素二重結合がシクロプロピル基によって置きかえられている化合物を意味する。シクロプロピル基は、シスまたはトランス配置であってもよい。別段の指示がなければ、シクロプロピル基はシス配置であることを理解されたい。シクロプロパン化ＰＵＦＡの一例は、８−［２−（２−ペンチルシクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（「ＤＣＰＬＡ」）である（下記に遊離酸形態を示す）。

ＤＣＰＬＡのエステルは、当技術分野において知られている技術にしたがって調製することができる。例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００９、２８４（５０）：３４５１４〜３４５２１を参照されたい。例えば、リノール酸は、メタノールおよびピリジン中、ＳＯＣｌ₂を用いてエステル化することができる。次いで、その後のエステルを、修飾シモンズ−スミス反応を用いて、クロロヨードメタンおよびジエチル亜鉛でシクロプロパン化することができる。

リノール酸およびそのエステルは、一般に市販されている。あるいは、酸およびエステルを、天然の供給源（例えば、植物油）から単離してもよく、または合成（例えば、化学反応によって）してもよい。リノール酸のエステル化は、知られている方法にしたがって行うことができる。例えば、リノール酸は、酸の存在下、アルコールとエステル化することができる。

［態様］
本開示は、８−［２−（２−ペンチルシクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（「ＤＣＰＬＡ」）のエステル、ならびに組成物、キット、およびエステルを用いた処置のための方法を含む。一態様において、ＤＣＰＬＡのエステルは、アルキルエステル、ベンジルおよび芳香族エステル、脂肪アルコールエステル、脂肪酸エステル、シクロプロパン化脂肪アルコールエステル、シクロプロパン化脂肪酸エステル、ジアシルグリセロールエステル、ホスファチジルセリンエステル、コレステリルエステル、ならびにマクロライドエステルから選択される。

ある種のシクロプロパン化多価不飽和脂肪酸（「ＰＵＦＡ」）がＰＫＣを活性化することが見出されているが、ＤＣＰＬＡのエステルの活性は評価されていなかった。例えば、多数の参考文献がＤＣＰＬＡのメチルエステル（「ＤＣＰＬＡ−ＭＥ」）の合成を報告しているが、対象の最終化合物であるＤＣＰＬＡの合成における単なる中間体として軽視していた。例えば、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００３、１３：１０３７〜１０４０；米国特許出願公開第２００５／００７５３９３ Ａ１号；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００９、２８４（５０）：３４５１４〜３４５２１；および米国特許出願公開第２０１０／００２２６４５ Ａ１号を参照されたい。実際、他のシクロプロパン化ＰＵＦＡのエステルは合成および試験されていたが、当技術分野において、ＤＣＰＬＡのエステルの潜在的な利点は評価されなかった。例えば、米国特許出願公開第２０１０／００２２６４５ Ａ１号を参照されたい。

本開示は、ＤＣＰＬＡのエステルは、ＰＫＣ、特にＰＫＣ−εを活性化し得るという発見も含むものである。ＤＣＰＬＡのエステルは、対応する酸形態（すなわち、ＤＣＰＬＡ）よりも選択的であり、かつ／またはより強力なＰＫＣアクチベーターでさえあり得る。加えて、ＤＣＰＬＡのエステルは、他のシクロプロパン化ＰＵＦＡのエステルよりも選択的であり、かつ／または強力なＰＫＣアクチベーターであり得る。さらに、ＤＣＰＬＡのエステルは、ＰＫＣアイソフォーム、例えば、ＰＫＣ−δの最小の下方制御を示し得る。ＤＣＰＬＡのエステルは、血液脳関門を越えることもでき得る。その上、ＤＣＰＬＡのエステルは、トリアシルグリセロール中への組み入れを回避し、それゆえより長い排出半減期を示し得る。ＤＣＰＬＡのエステルは、他のＰＫＣアクチベーターに比べて持続的なＰＫＣ活性化も示し得る。さらに、ＤＣＰＬＡのエステルは、他のＰＫＣアクチベーター、例えば、ＤＣＰＬＡよりもはるかに大きなＰＫＣ−εに対する親和性を有し得る。

本開示は、ＤＣＰＬＡのアルキルエステルにも関する。例えば、アルキル基は、メチル、エチル、プロピル（例えば、イソプロピル）、およびブチル（例えば、ｔｅｒｔ−ブチル）であってもよい。メチルエステル形態のＤＣＰＬＡ（「ＤＣＰＬＡ−ＭＥ」）を下記に示す。

ＤＣＰＬＡアルキルエステルのアルキル基は、直鎖状、分枝状、および／または環状であってもよい。アルキル基は、飽和または不飽和であってもよい。アルキル基が不飽和環状アルキル基である場合、環状アルキル基は芳香族であってもよい。一態様において、ＤＣＰＬＡアルキルエステルは、ＤＣＰＬＡおよび分枝状アルキルアルコールに由来する。別の一態様において、ＤＣＰＬＡアルキルエステルは、ＤＣＰＬＡおよび環状アルキルアルコールに由来する。分枝状および環状のアルキルアルコールの例には、下記に示す化合物が含まれる。

別の一態様において、本開示は、ＤＣＰＬＡおよびベンジルアルコールに由来するＤＣＰＬＡベンジルエステル（下記に示す不飽和ベンジルアルコールエステル）を含む。本開示はさらに、ＤＣＰＬＡおよび芳香族アルコール、例えば、抗酸化剤として用いられるフェノール、およびプロ学習（pro-learning）能力を有する天然フェノールに由来するＤＣＰＬＡ芳香族エステルを含む。いくつかの特定の例には、エストラジオール、ブチル化ヒドロキシトルエン、レスベラトロール、ポリヒドロキシ化芳香族化合物、およびクルクミンが含まれる。

本開示は、ＤＣＰＬＡおよび脂肪アルコール（すなわち、脂肪酸をアルコール形態に還元したもの）に由来する、ＤＣＰＬＡ脂肪アルコールエステルも含む。脂肪アルコールは、飽和、一不飽和（ＭＵＦＡアルコール）、または多価不飽和（ＰＵＦＡアルコール）であってよい。ＤＣＰＬＡおよび脂肪アルコールのエステルの２つの例は、ＤＣＰＬＡ−オレイルエステルおよびＤＣＰＬＡ−レチニルエステル（下記に示す）である。

それからＤＣＰＬＡエステルが構成されてもよい脂肪アルコールの他の例には、リノレンアルコール、ドコサヘキサエンアルコール、エイコサペンタエンアルコール、およびリノールアルコールが含まれる。それからＤＣＰＬＡエステルが構成されてもよい脂肪アルコールのなおさらなる例には、下記に示すものが含まれる。それからＤＣＰＬＡエステルが構成されてもよい脂肪アルコールにおける二重結合の立体化学は、下記に表す脂肪アルコールにおける二重結合を含めて、シスまたはトランスであってもよい。

一態様において、本開示のＤＣＰＬＡエステルは、ＤＣＰＬＡ脂肪酸エステルである。この場合、脂肪酸を脂肪アルコールに還元するよりむしろ、ＤＣＰＬＡをアルコールに還元し、脂肪酸とエステル化する。脂肪酸は、飽和、一不飽和（ＭＵＦＡ）、または多価不飽和（ＰＵＦＡ）であってもよい。このタイプのＤＣＰＬＡエステルの一例として、レチノイン酸−ＤＣＰＬＡアルコールエステル（下記に示す）

がある。

本開示は、ＤＣＰＬＡおよびシクロプロパン化脂肪アルコールに由来する、ＤＣＰＬＡシクロプロパン化脂肪アルコールエステルをさらに含む。シクロプロパン化脂肪アルコールは、飽和、一不飽和（ＭＵＦＡアルコール）、または多価不飽和（ＰＵＦＡアルコール）であってもよい。シクロプロパン化ＰＵＦＡアルコールは、１個以上の炭素−炭素二重結合がシクロプロパン化されていてもよい。それにＤＣＰＬＡシクロプロパン化脂肪アルコールエステルが由来するシクロプロパン化脂肪アルコールは、シスまたはトランス配置であってもよい。一態様において、シクロプロパン化脂肪アルコールはシス配置である。

ＤＣＰＬＡシクロプロパン化ＭＵＦＡアルコールエステルの一例は、ＤＣＰＬＡ−オレイルアルコールエステルである（下記に示す）。ＤＣＰＬＡシクロプロパン化ＰＵＦＡアルコールエステルの一例は、ＤＣＰＬＡ−シクロプロパン化ドコサヘキサエンアルコールエステルである。下記に示す例において、ドコサヘキサエンアルコールの各炭素−炭素二重結合はシクロプロパン化されている。それにＤＣＰＬＡエステルが由来してもよいシクロプロパン化脂肪アルコール他の例には、リノールアルコール、リノレンアルコール、およびエイコサペンタエンアルコールが含まれる。シクロプロパン化リノールアルコール（炭素−炭素二重結合が全てシクロプロパン化されている）にエステルが由来する場合、化合物はＤＣＰＬＡ−ＤＣＰＬＡエステル（下記に示す）

である。

それにＤＣＰＬＡエステルが由来していてもよいシクロプロパン化脂肪アルコールの他の例は、下記に示すものを含む。下記のシクロプロパン化脂肪アルコールはトランス配置において描かれているが、対応するシス化合物は、それにＤＣＰＬＡエステルが由来していてもよいシクロプロパン化脂肪アルコールのさらなる例である。

一態様において、本開示のＤＣＰＬＡエステルは、ＤＣＰＬＡシクロプロパン化脂肪酸エステルである。この場合、ＤＣＰＬＡはアルコールに還元されており、シクロプロパン化脂肪酸でエステル化されている。シクロプロパン化脂肪酸は、飽和、一不飽和（シクロプロパン化ＭＵＦＡ）、または多価不飽和（シクロプロパン化ＰＵＦＡ）であってもよい。シクロプロパン化脂肪酸は、シスまたはトランス配置であってもよい。一態様において、シクロプロパン化脂肪酸はシス配置である。

本開示は、ＤＣＰＬＡジアシルグリセロールエステルも含む。例えば、１−パルミトイル−２−オレオイル−グリセロールのＤＣＰＬＡエステル（下記に示す）。

別の一側面において、本開示は、ＤＣＰＬＡのホスファチジルエステルを含む。例えば、エステルはＤＣＰＬＡ−ホスファチジルセリン（下記に示す）であってもよく、式中、Ｒ基は任意の脂肪酸鎖である。一態様において、Ｒ基は、オレイン、パルミチン、アラキドン、およびドコサヘキサエンの脂肪酸鎖から選択される。

本開示の別の一側面において、ＤＣＰＬＡのエステルは、ＤＣＰＬＡコレステリルエステルである（下記に示す）。一態様において、エステルはＤＣＰＬＡコレステロール誘導体エステルである。例えば、コレステリル基における炭素−炭素二重結合は水素付加されていてもよい。別の一態様において、立体化学は、天然に存在するコレステリル分子のものである。

本開示は、ＤＣＰＬＡのマクロライドエステルも含む。例えば、ＤＣＰＬＡのエステルはブリオスタチンエステルであってもよい。ＤＣＰＬＡ−ブリオスタチンエステルの２つの異なる例を下記に示す。

一態様において、ＤＣＰＬＡのマクロライドエステルは、ブリオログエステルである。ブリオログ（すなわち、ブリオスタチンの類似体）は、ブリオスタチンと同じ様式で、ＤＣＰＬＡでエステル化されていてもよい。ブリオスタチン類似体は、例えば、米国特許第６，６２４，１８９号および第７，２５６，２８６号に記載されている。米国特許出願第１３／１７８，８２１号も参照されたい。

本開示は、ＤＣＰＬＡのエステルを１つ以上含む組成物をさらに含む。ここに記載する医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野において知られている任意の適切な方法によって調製されてもよい。一般に、このような調製方法には、有効成分を担体または１つ以上の他の副成分と会合させ、次いで、必要または望ましい場合には、生成物を所望の単一もしくは複数の投薬単位に形作り、または包装することが含まれる。

ここに提供する医薬組成物の記載は、ヒトに倫理的に投与するのに適する医薬組成物に主に対するものであるが、当業者であれば、このような組成物は全種類の動物に投与するのに一般的に適することが理解される。ヒトに投与するのに適する医薬組成物の修飾、または組成物を様々な動物に投与するのに適するようにする修飾は、十分に理解されており、獣医薬理学の通常の技術者であれば、あるとすれば通常の実験だけで、このような修飾をデザインし、行うことができる。本開示の医薬組成物の投与が企図される対象には、それだけには限定されないが、ヒトおよび他の霊長動物、ならびに他の哺乳動物が含まれる。

一態様において、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルは、投与のために薬学的に許容される担体と調合されてもよい。薬学的に許容される担体には、それだけには限定されないが、以下の１つ以上：賦形剤、表面活性剤、分散剤、不活性な希釈剤、造粒および崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、着色剤、保存剤、生理学的に分解可能な組成物、例えばゼラチン；水性のビヒクルおよび溶媒、油性のビヒクルおよび溶媒、懸濁剤、分散剤または湿潤剤、乳化剤、粘滑剤（demulcent）、バッファー、塩、増粘剤、フィラー、乳化剤、抗酸化剤、抗生物質、抗真菌剤、安定化剤、ならびに薬学的に許容されるポリマー性または疎水性の材料が含まれる。本開示の医薬組成物に含まれてもよい他のさらなる成分は、当技術分野において一般に知られており、例えば、両方とも参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎａｒｏ，ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８５、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０ｔｈ Ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、２０００において記載されていてもよい。

一態様において、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルは、薬学的に許容される担体と調合されてもよく、担体は疎水性の担体である。疎水性の担体には、包接複合体、分散剤（例えば、ミセル、マイクロエマルジョン、およびエマルジョン）、ならびにリポソームが含まれる。例示の疎水性の担体には、包接複合体、ミセル、およびリポソームが含まれる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ ｅｄ．、ｅｄ．Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ ２００３を参照されたい。ＤＣＰＬＡのエステルは、例えば、担体全体の、重量で、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％として、疎水性担体中に組み入れられてもよい。さらに、他の化合物が、例えば、製剤を安定化するために、疎水性の担体または溶液の何れかにおいて含まれていてもよい。

ここに開示する組成物は、経口、非経口、経粘膜、鼻腔内、吸入、または経皮の経路を含めた、任意の適切な経路によって投与してもよい。非経口の経路には、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、くも膜下腔内、および頭蓋内投与が含まれる。適切な投与経路を、血液脳関門の横断を許すように選択してもよい。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．（２００１）ｖｏｌ．４２、ｐｐ．６７８〜６８５を参照されたい。

一態様において、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルは、固形経口剤形において調合されてもよい。経口投与用に、組成物は、薬学的に許容される担体、例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、フィラー（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、もしくはリン酸水素カルシウム）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、もしくはシリカ）、崩壊剤（例えば、バレイショデンプン、もしくはデンプングリコール酸ナトリウム）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）と一緒に慣例的な手段によって調製されている、錠剤またはカプセル剤の形態をとってもよい。錠剤は、当技術分野において一般的に知られている方法によってコーティングされてもよい。

別の一態様において、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルは、経口投与用の液体調製物中に調合される。このような調製物は、例えば、溶液剤、シロップ剤、もしくは懸濁剤の形態をとってもよく、またはこれらは使用前に水もしくは他の適切なビヒクルとともに構成するための乾燥生成物として提示されてもよい。このような液体調製物は、薬学的に許容される担体、例えば、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用脂肪）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分留した植物油）、および保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、またはソルビン酸）とともに慣例的な手段によって調製されてもよい。調製物は、緩衝塩、香味剤、着色剤、および甘味剤も適宜含んでいてもよい。

本開示の別の一態様において、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルは、非経口投与、例えば、ボーラス注射または持続注入用に調合されてもよい。注射用の製剤は、単位剤形、例えば、アンプルにおいて、またはマルチドーズ容器において、保存剤を添加して提示されてもよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の、懸濁剤、溶液剤、分散剤、または乳剤などの形態をとってもよく、製剤用薬剤（formulatory agent）、例えば、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤を含んでいてもよい。

別の一態様において、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルは、デポー調製物として調合されてもよい。このような持続性製剤は、埋め込みによって（例えば、皮下的に、もしくは筋肉内に）、または筋肉内注射によって投与されてもよい。例えば、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルは、適切なポリマー性の、もしくは疎水性の材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）、もしくはイオン交換樹脂と、または難溶性誘導体として、例えば、やや難溶性の塩などとして調合されてもよい。

別の一態様において、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルは、小胞、例えば、ミセル、リポソーム、または人工の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子において送達されてもよい。例えば、米国特許第７，６８２，６２７号を参照されたい。

一態様において、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルは、学習を改善するため、記憶を改善するため、β−アミロイドレベルを低減するため、シナプス喪失またはシナプス損傷に付随する疾患を予防または処置するため、神経変性障害または状態を予防または処置するため、うつ病を予防または処置するため、脳卒中を予防または処置するため、あるいは脳傷害を予防または処置するために有効な量において、組成物中に存在する。

さらなる一態様において、投与するための用量は、約１ｍｇから約１０ｇまで、例えば、約５ｍｇから約５ｇまで、約５０ｍｇから約２ｇまで、約１００ｍｇから約１．５ｇまで、約１５０ｍｇから約１ｇまで、または約２５０ｍｇから約５００ｍｇの、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルを送達するように適切に調製されてもよい。

一態様において、ＤＣＰＬＡの１つ以上のエステルは、最終製剤の重量で、約０．０１％から約１００％まで、約０．１％から約９０％まで、約０．１％から約６０％まで、約０．１％から約３０％まで、または約１％から約１０％までの範囲の量において組成物中に存在してもよい。別の一態様において、ＤＣＰＬＡの１つ以上のエステルは、約０．０１％から約１００％まで、約０．１％から約９５％まで、約１％から約９０％まで、約５％から約８５％まで、約１０％から約８０％まで、および約２５％から約７５％までの範囲の量において組成物中に存在してもよい。

本開示は、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルの医薬組成物を調製および投与するために利用してもよいキットを含む。

キットは、ここに記載する医薬組成物を投与するための装置、例えば、シリンジを含んでいてもよい。一態様において、キットは、１つ以上のバイアル、シリンジ、ニードルを含んでいてもよい。別の一態様において、キットは、アンプル、カートリッジ、またはＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルの組成物を貯蔵および／もしくは引き続き混合するためのボトルまたは他のこのような容器を含んでいてもよい。別の一態様において、装置、シリンジ、アンプル、カートリッジ、ボトル、またはここに開示するＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルの組成物を貯蔵および／もしくは引き続き混合するための他のこのような容器は、１つを超えるチャンバーを有していてもよく、または有していなくてもよい。

なお別の一態様において、ここに開示するＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルの組成物は、１つ以上の目盛り付された容器（例えば、シリンジ、もしくはシリンジ（複数）、または容積を測定するのに有用である他の装置）中に貯蔵されてもよい。

さらなる一態様において、キットは、同じもしくは別々のアンプル、バイアル、シリンジ、カートリッジ、ボトル、または他のこのような容器内に貯蔵されている、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルの医薬組成物を含んでいてもよい。キットはまた、さらなるバッファー、ニードル、無針注射器、滅菌パッド、またはスワブを含んでいてもよい。

キットはまた、１つ以上の麻酔薬、例えば、局所麻酔薬も含んでいてよい。一態様において、麻酔薬は、使用準備済の製剤、例えば、注射用製剤（任意に、１つ以上の予めローディングされたシリンジ中）、またはここに開示するＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルの組成物が投与されようとする領域に局所適用してもよい製剤中にある。

麻酔薬の局所製剤は、パッド、スワブ、ペーパータオル（towelette）、使い捨てナプキン、布、パッチ、包帯、ガーゼ、綿球、Ｑ−ｔｉｐ（商標）、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、パスタ剤、液剤、または任意の他の局所的に適用される製剤に適用される麻酔薬の形態であってもよい。本開示とともに用いるための麻酔薬は、それだけには限定されないが、例えば、リドカイン、マーカイン、コカイン、およびキシロカインを含んでいてもよい。

キットは、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルの医薬組成物の使用、およびＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルの製剤を混合し、希釈し、または合わせるための手順に関する指示書を含んでいてもよい。指示書は、混合後であるが投与前に、所望のｐＨもしくはｐＨの範囲、ならびに／または所望の特定の活性および／もしくはタンパク質濃度を得るために、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルの製剤を適切に希釈するための指示も含んでいてもよい。指示書は投薬情報をやはり含んでいてもよい。指示書は、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルの開示される医薬組成物で処置するための対象を選択するための方法に対する材料も含んでいてもよい。

本開示は、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルの、方法および／または使用を含む。例えば、本開示は、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、学習を改善するための方法を提供する。別の一態様において、本開示は、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、記憶を改善するための方法を含む。

さらに別の一態様において、本開示は、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、β−アミロイドレベルを低減するための方法を提供する。本開示は、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、シナプス喪失またはシナプス損傷に付随する疾患を予防または処置するための方法をさらに含む。

本開示は、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、神経変性障害および状態、うつ病、脳卒中、精神遅滞、および脳傷害から選択される少なくとも１つの疾患または状態を予防または処置するための方法をさらに含む。神経変性障害は、例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病であってもよい。神経変性障害または状態は、例えば、少なくとも１つの神経毒性化学物質、例えば、重金属に曝露することによって引き起こされてもよい。脳傷害は、外傷性脳傷害または照射によって誘発される脳傷害であってもよい。

本開示のさらなる一側面は、学習を改善するため、記憶を改善するため、β−アミロイドレベルを低減するため、シナプス喪失またはシナプス損傷に付随する疾患を予防または処置するため、神経変性障害および状態を予防または処置するため、うつ病を予防または処置するため、脳卒中を予防または処置するため、ならびに脳傷害を予防または処置するための、薬物の調製における、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルの使用である。

本開示の別の一側面は、学習の改善、記憶の改善、β−アミロイドレベルの低減、シナプス喪失またはシナプス損傷に付随する疾患の予防または処置、神経変性障害および状態の予防または処置、うつ病の予防または処置、脳卒中の予防または処置、および脳傷害の予防または処置において使用するためのＤＣＰＬＡのエステルを含む。

ＤＣＰＬＡのエステルは、慣例的な方法、例えば、経口、非経口、経粘膜、鼻腔内、吸入、または経皮投与により投与してもよい。非経口投与には、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、くも膜下腔内、および頭蓋内投与が含まれる。

一態様において、ＤＣＰＬＡの少なくとも１つのエステルは、学習を改善するため、記憶を改善するため、β−アミロイドレベルを低減するため、シナプス喪失またはシナプス損傷に付随する疾患を予防または処置するため、神経変性障害および状態を予防または処置するため、うつ病を予防または処置するため、脳卒中を予防または処置するため、ならびに脳傷害を予防または処置するために有効な量において、組成物中に存在する。

［実施例］
本明細書で用いる数字は全て、全ての場合において、「約」の語によって修飾されることを理解されたい。

合成手順
ＤＣＰＬＡおよびＤＣＰＬＡメチルエステルの合成
ＤＣＰ−ＬＡおよびＤＣＰＬＡ−ＭＥを、以前に記載されている方法にしたがって合成した。Ｎｅｌｓｏｎら、（２００９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７４、３４５１４〜３４５２１を参照されたい。簡潔に述べると、リノール酸メチルエステル（市販されている）を、クロロヨードメタンおよびジエチル亜鉛を用い、改変シモンズ−スミス反応を用いてシクロプロパン化した。Ｔａｎａｋａら、（２００３）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ、１３：１０３７〜１０４０；Ｆｕｒｕｋａｗａら、（１９６７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、２４：５３〜５８；およびＤｅｎｍａｒｋら、（１９９１）Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ、５６：６９７４〜６９８１を参照されたい。

装置は全て６０℃で１時間焼き、装置を通して乾燥窒素を通過させながら火力乾燥した。撹拌子および温度プローブを入れた１００ｍｌ三頸丸底フラスコをドライアイス混合物で囲み、２５ｍｌジクロロメタン中リノール酸メチルエステル１．２５ｇ（４．２４ｍｍｏｌ）を満たし、Ｎ₂気泡を通した。ヘキサン中１Ｍジエチル亜鉛溶液（５１ｍｌ、５４．９４ｍｍｏｌ）、長さ２０インチ（６１ｃｍ）の２０ゲージニードルを用いて嫌気的に加え、溶液を−５℃に冷却した。絶えず撹拌しながら、クロロヨードメタン（ＣｌＣＨ₂Ｉ、８．０２ｍｌ、１０９．８８ｍｍｏｌ）を、１滴／秒で滴下添加した。反応混合物を２℃未満に維持するのに必要である場合は、添加速度を遅くした。反応の間、反応混合物は濁り、不溶性の白色亜鉛生成物が生成した。フラスコを密閉し、混合物をさらに１時間反応させ、次いで２時間かけて徐々に室温に戻した。

フード中で爆発性残渣が形成するのを防ぐために、ジエチル亜鉛は蒸発除去しなかった。混合物を、撹拌しながら水１００ｍｌ中にゆっくりと注いで、過剰のジエチル亜鉛を分解した。エタンを放出させた。混合物を、ガラス遠心管中５０００ｒｐｍで遠心分離し、上層の水層を廃棄した。白色沈殿物をＣＨ₂Ｃｌ₂で抽出し、有機相と合わせた。有機相を水で洗浄し、遠心分離した。生成物を、ヘキサン＋１％酢酸エチルを用いてＳｉｌｉｃａ Ｇｅｌ Ｇ ＴＬＣによって分析し、ｎ−ヘキサン中増大濃度の１〜１０％酢酸エチルを用いてシリカゲル上クロマトグラフィーによって精製し、窒素下で蒸発させ、無色油状のＤＣＰＬＡメチルエステルが残った。シモンズ−スミス反応により、出発材料の立体化学が保存される。

ＤＣＰＬＡを得るために、ＤＣＰＬＡメチルエステル０．１５ｇを１Ｎ ＬｉＯＨ １ｍｌおよびジオキサン１ｍｌ中に溶解した。ジオキサンおよびメタノールを、混合物が均一になるまで加え、溶液を一夜から３日、６０℃で撹拌した。生成物はＣＨ₂Ｃｌ₂中に抽出され、遠心分離された。水層および白色界面を水で再抽出し、白色層が形成しなくなるまで洗浄した。生成物をＮ₂下で蒸発させ、シリカゲル上クロマトグラフィーによって精製した。無色油状の生成物を、ｎ−ヘキサン中２０％ＥｔＯＡｃ中、溶出した。この純度を、１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン中ＴＬＣにより、移動相として９５％アセトニトリルを用いて、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣにより、２０５ｎｍでＵＶ検出してチェックした。

Ｈ³−ＤＣＰＬＡ−ＭＥの合成：３Ｈ−リノール酸のメチル化：リノール酸［９，１０，１２，１３］³Ｈ（１２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を、２ｍｌＲｅａｃｔｉＶｉａｌ中で蒸発乾固した。チオニルクロリド（０．５ｍｌ）を直ちに加え、密封したバイアルを６０℃で一夜、インキュベートした。メタノール（１ｍｌ）を加え、混合物を蒸発させ、ジクロロメタン中に溶解させた。

シクロプロパン化：シモンズ−スミスシクロプロパン化を、上記に記載した通りＣｌＣＨ₂Ｉを用いて行い、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ生成物をＣＨ₂Ｃｌ₂中に抽出し、カラムクロマトグラフィーによって精製した。放射性の脂質分画を合わせ、蒸発させ、放射性分解を防ぐために１００μｌＥｔＯＨ中に貯蔵した。

カラムクロマトグラフィー：粗いフリットを有するガラスカラム（内径２２ｍｍ×長さ２００ｍｍ、または内径３６ｍｍ×長さ２００ｍｍ）に、１３０〜２７０メッシュ、６０オングストローム、孔体積０．７４ｃｍ³／ｇのシリカゲルを充填した。試料を適用し、ヘキサン５０ｍｌで洗浄した。極性を徐々に増大した溶媒（ヘキサン、その後ヘキサン中増大濃度の酢酸エチル、次いでエタノール）５０ｍｌを連続して加えることにより、生成物を溶出した。生成物を含む分画を、窒素下で蒸発させた。

薄層クロマトグラフィー：ＴＬＣを、蛍光指示薬を含む５×２０ｃｍシリカゲルＧ ＴＬＣプレート上で行った。溶媒は、ヘキサン＋１％酢酸エチルであった。検出は、ＵＶ吸収、Ｉ₂および炭化での着色検出（１０％Ｈ₂ＳＯ₄を噴霧し、その後加熱）によるものであった。

ＤＨＡ−ＣＰ６の合成：３−（２−（（２−（（２−（（２−（（２−（（２−エチル−シクロプロピル）メチル）−シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）プロパン酸（「ＤＨＡ−ＣＰ６」）を、ドコサヘキサエン酸メチルエステル（市販されている）をリノール酸メチルエステルの代わりに用いたこと以外は、ＤＣＰＬＡの調製に対する上記の手順にしたがって調製した。Ｎｅｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００９、２７４、３４５１４〜３４５２１を参照されたい。

ＤＣＰＬＡエチルエステルの合成：リノール酸メチル（２ｇ）を、無水エタノール（２０ｍｌ）、ＫＯＨ（０．２ｇ）、およびモレキュラーシーブ４ｇと、撹拌しながら６０℃で２０分間、インキュベートした。反応混合物を酢酸で中和し、リノール酸エチル生成物を酢酸エチルで抽出した。リノール酸エチルを、シモンズ−スミス反応を用いて、上記に記載した通りにシクロプロパン化してＤＣＰＬＡ−エチルエステルを生成した。反応は全て、窒素雰囲気下で行った。

ＤＣＰＬＡ−イソプロピルエステルの合成：リノール酸イソプロピル（市販されている）を、コンデンサーを付けた５０ｍｌ丸底フラスコ中、リノール酸メチル（３ｇ）を、イソプロパノール（２０ｍｌ）および水酸化リチウム（１ｇ）と一緒に２時間還流することにより調製した。生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。得られたリノール酸イソプロピルを、次いで、上記に記載したシモンズ−スミス反応にかけてＤＣＰＬＡ−イソプロピルエステルを産生した。

ＤＣＰＬＡ−イソプロピルエステルの代替的合成：リノール酸メチル（２ｇ）を、窒素雰囲気化、密閉ボトル中６０℃で、モレキュラーシーブ４ｇ上、イソプロパノール（２０ｍｌ）およびＫＯＨ（０．２ｇ）と反応させることにより、エステル交換した。２０分後、混合物を酢酸で中和し、リノール酸イソプロピル生成物を酢酸エチル中に抽出した。得られたリノール酸イソプロピルを、次いで、上記に記載したシモンズ−スミス反応にかけてＤＣＰＬＡ−イソプロピルエステルを生成した。

ＤＣＰＬＡ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルの合成：ＤＣＰＬＡ（１００ｍｇ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド ジ−ｔｅｒｔ−ブチルアセタール（０．２５ｍｌ）を、６０℃で数日間、トルエン（０．４ｍｌ）とインキュベートした。得られたＤＣＰＬＡ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルをヘキサンで抽出し、フラッシュクロマトグラフィー（１０％ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）により精製した。

ＤＣＰＬＡ−シクロプロパン化オレイルエステルの合成：リノール酸オレイルを、ＣＨ₂Ｃｌ₂（２０ｍｌ）および濃Ｈ₂ＳＯ₄（１０μｌ）中、リノール酸（１ｇ）およびオレイルアルコール（１ｍｌ）を一夜還流することにより調製した。生成物はかすかに桃色であり、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。得られたリノール酸オレイルを、上記に記載したシモンズ−スミス手順にかけて、ＤＣＰＬＡ−オレイルエステルを産生した。

ＤＣＰＬＡ−レチニルエステルの合成：ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（５０ｍｇ）およびレチノール（５０ｍｇ）を蒸発乾固した。ヘキサン（１ｍｌ）を、カンジダアンタークティカ（Candida antarctica）（０．２ｇ）からのリパーゼアクリル酸ビーズ（lipase acrylic bead）と一緒に加え、混合物を、光線から保護して、６０℃で一夜インキュベートした。生成物を、ヘキサン５０：酢酸エチル５：アセトン５を用いて薄層クロマトグラフィーによって精製した。

ＤＣＰＬＡ−コレステリルエステルおよびコレステリルリノレエートの合成：ＤＣＰＬＡ（１ｇ）、コレステロール（１ｇ）、ＣＨ₂Ｃｌ₂（２０ｍｌ）、および濃Ｈ₂ＳＯ₄（１μｌ）を合わせ、一夜還流した。生成物をリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０、５ｍｌ）で洗浄し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製してＤＣＰＬＡ−コレステリルエステルを得た。リノール酸（１ｇ）、コレステロール（１ｇ）、ＣＨ₂Ｃｌ₂（２０ｍｌ）、および濃Ｈ₂ＳＯ₄（２０μｌ）を合わせ、一夜還流した。生成物をリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０、５ｍｌ）で洗浄し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製してコレステリルリノレエートを得た。

ＤＣＰＬＡ−コレステリルエステルの代替の合成：ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（０．１ｇ）、コレステロール（０．１ｇ）、ヘキサン（１０ｍｌ）、およびカンジダアンタークティカのリパーゼアクリル酸ビーズ（１ｇ）を合わせ、６０℃で一夜、インキュベートしてもよい。生成物をリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０、５ｍｌ）で洗浄してもよく、フラッシュクロマトグラフィーによって精製してＤＣＰＬＡ−コレステリルエステルを得てもよい。

ＤＣＰＬＡ−ブリオスタチンエステルの合成：ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１ｍｇ）およびブリオスタチン−１（１ｍｇ）を蒸発乾固してもよい。ヘキサン（１ｍｌ）を、カンジダアンタークティカからのリパーゼアクリル酸ビーズ（０．２ｇ）をと一緒に加えてもよく、混合物を６０℃で一夜、インキュベートしてもよい。生成物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製してもよい。

一般的手順
材料−細胞培養培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ（Ｆ１２Ｋ、ニューロベーサル、およびＢ２７）およびＫ．Ｄ．Ｍｅｄｉｃａｌ、ＵＳＡ（ＭＥＭ）から入手した。Ａβ_1〜42は、Ａｎａｓｐｅｃ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から購入した。ブリオスタチン１は、Ｂｉｏｍｏｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＵＳＡから購入した。一次抗体（ＰＫＣ−ε、β−アクチン、ＲＡＣＫ１、シナプトフィジン、ＭＡＰ−２、およびＰＳＤ−９５）は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ、ＵＳＡから入手し、ホスホ−ＧＳＫ−３β（Ｓｅｒ９）およびＧＳＫ−３βはＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡから、β−チューブリンはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡから購入した。二次抗体は全て、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡから購入した。ＰＫＣ−ε転位インヒビター［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］およびビスインドリルマレイミドＩ（Ｇｏ ６８５０）は、ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡから調達した。他の試薬は全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。

細胞培養−１８日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット胎仔の脳からのラット海馬ニューロン（ＮｅｕｒｏＰｕｒｅ、Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ、ＵＳＡ）を、０．５ｍＭグルタミンおよび２５μＭグルタメート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有しているＢ−２７を補ったニューロベーサル培地中、ポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をコーティングした２４ウエルプレート上にプレーティングした。神経細胞を、３７℃に維持したインキュベーター中で１４日間、５％ＣＯ2下で増殖させた。ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞（ＡＴＣＣ）を、４５％Ｆ１２Ｋ、４５％最小イーグル培地、１０％ウシ胎仔血清中で培養した。

分化させるために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、２％血清を含有する培地中に維持し、１０μＭオールトランスレチノイン酸（ＲＡ）で７２時間処理した。その後、細胞を、０．２７ｎＭブリオスタチン１で７２時間、処理した。培地を３日毎に交換し、新たにＲＡを補った。

様々なＡβオリゴマーの調製−アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）およびＡβモノマーを、Ｈｏｓｈｉ，Ｍ．、ら、（２００３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１００、６３７０〜６３７５、およびＮｏｇｕｃｈｉ，Ａ．、ら、（２００９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２８４、３２８９５〜３２９０５にしたがって調製した。簡潔に述べると、Ａβ_1〜42を、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール中に溶解し、４℃で一夜、次いで３７℃で３時間、インキュベートした。次いで、溶解したＡβ_1〜42を、１．５ｍｌポリプロピレン遠心管中、１本あたり４０ｎｍｏｌの濃度で凍結乾燥した。ＡＳＰＤを調製するために、凍結乾燥したＡβを、５０μＭ未満の濃度でＣａ²⁺またはＭｇ²⁺を含まないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に溶解し、４℃で１４時間、回転させた。インキュベート後、Ａβ溶液を、１００ｋＤａ分子量カットオフフィルタ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて精製し、高分子量分画を蓄えて最も毒性のＡＳＰＤを得た。Ａβ由来拡散性リガンド（ＡＤＤＬ）を先に記載されている通りに生成した。Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５：６４４８〜６４５３を参照されたい。簡潔に述べると、Ａβ_1〜42を、ジメチルスルホキシド中５ｍＭで可溶化し、Ｆ１２ｋ培地中１００μＭに希釈し、４℃で２４時間インキュベートした。溶液を４℃で１０分間、１４０００×ｇで遠心分離し、上清をＡＤＤＬとして用いた。

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）−調製したＡＳＰＤおよびＡＤＤＬをＳＥＣによって分離して、集合体の分子量を推定した。ＴＳＫｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ ＳＷ２０００カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ）に接続したＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いてＳＥＣを行った。高分子量と低分子量両方のタンパク質を用いて分子量の較正を行った。Ａβ集合体を、０．１Ｍ Ｎａ₂ＰＯ₄および０．１Ｍ Ｎａ₂ＳＯ₄を含み、Ｈ₃ＰＯ₄でｐＨ６．６５に調節したバッファーで、０．１ｍｌ／分で分離し、吸光度を２８０ｎｍでモニタリングした。

生存率アッセイ−細胞の生存率をＭＴＴアッセイによって測定した。ＭＴＴ（すなわち、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）は、生存細胞中でのみ活性であるコハク酸デヒドロゲナーゼによってホルマザンに切断されるテトラゾリウム塩である。ホルマザンを可溶化した後、色素の量を、マイクロプレートリーダーで６３０ｎｍの基準とともに５７０ｎｍで定量することができる。ＭＴＴアッセイ用に、１８日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット胎仔の脳からの一次ラット海馬ニューロンまたはＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞５×１０^４を、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングした２４ウエルプレートの各ウエル上にプレーティングした。処理後、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、１ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ溶液（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）２００μｌと、３７℃で２時間、インキュベートした。次いで、ＭＴＴ溶液を除去し、細胞を、０．０４Ｍ ＨＣｌおよび１６０ｍＭ ＮａＯＨを含む２００μｌイソプロパノールで１０分間、溶解した。最後に、５７０ｎｍおよび６３０ｎｍで数値を読み取った。試料は全て３回ずつ行い、データは対照のパーセント値として表した。

ＰＫＣアッセイ−ＤＣＰＬＡ−ＭＥによるＰＫＣの活性化を測定するために、組換えＰＫＣ−α、ＰＫＣ−ε、およびＰＫＣ−δの活性化を評価した。ＤＣＰＬＡ−ＭＥ誘発性の活性化を、先に記載した通り、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびホスファチジルセリン（ＰＳ）の非存在下で測定した。Ｎｅｌｓｏｎ、Ｔ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００９、２８４：３４５１４〜３４５２１、およびＫａｎｎｏ、Ｔ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２００９、２２１：１８３〜１８８を参照されたい。個々の酵素を、１０μＭヒストン、４．８９ｍＭ ＣａＣｌ₂、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．８ｍＭ ＥＤＴＡ、４ｍＭ ＥＧＴＡ、４％グリセロール、８μｇ／ｍｌアプロチニン、８μｇ／ｍｌロイペプチン、２ｍＭベンズアミジン、および０．５μＣｉの［γ−³²Ｐ］ＡＴＰの存在下、３７℃で１５分間インキュベートした。精製したＰＫＣ−α、ＰＫＣ−ε、およびＰＫＣ−δを、室温で５分間、ＤＣＰＬＡ−ＭＥとプレインキュベートした。［³²Ｐ］−リンタンパク質の形成を、ホスホセルロース上への吸着によって測定した。

免疫蛍光および共焦点顕微鏡法−細胞を、２個のチャンバースライド（Ｎｕｎｃ、ＵＳＡ）中、低密度で増殖させた。免疫蛍光染色用に、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで４分間固定した。固定後、細胞をブロックし、１×ＰＢＳ中５％血清および０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘで３０分間、透過処理した。細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、１：１００希釈の一次抗体と１時間、インキュベートした。インキュベーション後、スライドを再び、１×ＰＢＳ中で３回洗浄し、１：４００希釈のＦＩＴＣ抗マウスＩｇＧおよびローダミン抗ウサギＩｇＧと１時間インキュベートした。細胞をさらに洗浄し、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２’−フェニルインドール二塩酸塩）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）で処理して核を染色した。最後に、スライドを洗浄し、Ｐｒｏ Ｌｏｎｇ Ｇｏｌｄアンチフェードマウンティング溶液（antifade mounting solution）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中マウンティングし、ＬＳＭ ７１０ Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）下、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、およびローダミンに対して、それぞれ、励起３５０ｎｍ、４９０ｎｍ、および５４０ｎｍ、ならびに発光４７０ｎｍ、５２５ｎｍ、および６２５ｎｍで観察した。各チャンネルにおける平均蛍光強度（ＭＦＩ）に対して、６３×油浸レンズ倍率で、別個の６視野を分析した。

細胞溶解およびウエスタンブロット分析−細胞を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＦ、および２０μＭロイペプチンを含むホモジナイズバッファー中で収集し、超音波により溶解した。ホモジネートを４℃で１５分間、１０００００×ｇで遠心分離してサイトゾル分画（上清）および膜（ペレット）を得た。ペレットを、超音波によってホモジナイズバッファー中に再懸濁した。一次ニューロンからホールセルタンパク質を単離するために、ホモジナイズバッファーは１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有していた。タンパク質濃度を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキット（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）を用いて測定した。定量後、各試料からのタンパク質２０μｇを、４〜２０％勾配Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけた。次いで、分離したタンパク質をニトロセルロース膜に移した。膜を、室温で１５分間、５％ＢＳＡでブロックし、４℃で一夜、一次抗体とインキュベートした。インキュベート後、これをＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ緩衝食塩水−Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、１：１００００希釈の、アルカリホスファターゼコンジュゲートした２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）と、４５分間、さらにインキュベートした。膜を、最後にＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１ステップのＮＢＴ−ＢＣＩＰ基質（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）を用いて展開した。ブロットを、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＲＴ−ＥＣＬ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）において画像化し、デンシトメトリー定量を、ＩＭＡＬソフトウエア（Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍｏｒｇａｎｔｏｗｎ、ＷＶ）を用いて行った。転位アッセイに対して、ＰＫＣ活性化を、膜における全タンパク質のパーセント値として表した（膜／サイトゾル＋膜）。

逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）−ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて、製造元のプロトコールにしたがって、細胞から単離した。簡潔に述べると、全ＲＮＡ５μｇを、オリゴ（ｄＴ）およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて、５０℃で１時間、逆転写した。ｃＤＮＡ生成物２μｌをＰＫＣ−εに対するプライマー（フォワードプライマー−ＴＧＧＣＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴＴＡＣＴＣＣ、リバースプライマー−ＧＣＴＧＡＣＴＴＧＧＡＴＣＧＧＴＣＧＴＣＴＴ（Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ））およびβ−アクチン（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いて、標準のＰＣＲプロトコールにしたがって３０サイクル、アニーリング温度５５℃を用いて増幅した。ＰＣＲ単位複製配列を、Ｅ−Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）において分析した。ゲルを、Ｆｕｊｉ Ｉｍａｇｅゲルスキャナー（ＦＬＡ−９０００、Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）を用いて記録し、デンシトメトリー定量を、ＩＭＡＬソフトウエア（Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍｏｒｇａｎｔｏｗｎ、ＷＶ）を用いて画像化した。データを、３回の独立した実験に対して、β−チューブリンのＯＤに対するＰＫＣ−εのＯＤ（吸光度）の標準化した比率として表した。

統計学的分析−実験は全て３回以上ずつ行った。データは平均値±ＳＥとして表す。統計学的分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウエアを用いてスチューデントのｔ検定によって行い、ｐ＜０．０５を統計学的に有意とみなした。

例１：ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＤＣＰＬＡおよびＤＨＡ−ＣＰ６よりＰＫＣδに対する阻害効果が劣っている。（Ａ）培養細胞中全ＰＫＣ活性の測定−培養培地を除去した後、細胞を０．２ｍｌホモジナイズバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＦ、１μｇ／ｍｌロイペプチン、および０．１ｍＭ ＰＭＳＦ）中に掻き取り、細胞培養プレート中、Ｍａｒｓｏｎｉｘマイクロプローブ超音波処理器（５秒、１０Ｗ）において超音波処理することにより直ちにホモジナイズした。超音波処理後、直ちにアリコートを０．５ｍｌ遠心管に移し、−８０℃で凍結させた。

（Ｂ）ＰＫＣ活性化の測定−ＰＫＣを測定するために、細胞ホモジネートまたは精製したＰＫＣアイソザイム１０μｌを、１０μＭヒストン、４．８９ｍＭ ＣａＣｌ₂、１．２μｇ／μｌホスファチジル−Ｌ−セリン、０．１８μｇ／μｌ １，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．８ｍＭ ＥＤＴＡ、４ｍＭ ＥＧＴＡ、４％グリセロール、８μｇ／ｍｌアプロチニン、８μｇ／ｍｌロイペプチン、および２ｍＭベンズアミジンの存在下、３７℃で１５分間インキュベートした。［γ３２Ｐ］ＡＴＰ（０．５μＣｉ）を加え、以前に記載されている通り、ホスホセルロース上への吸着によって、３２Ｐ−リンタンパク質の形成を測定した。Ｎｅｌｓｏｎら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９５、６５： ２３５０〜２３５７を参照されたい。

（Ｃ）ＰＫＣアクチベーターによるＰＫＣアイソザイムの活性化の測定−各化合物のＰＫＣ活性を、ジアシルグリセロールおよびホスファチジル−Ｌ−セリンの非存在下で測定し、ＰＫＣ−δおよびＰＫＣ−εを、Ｋａｎｎｏら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、２００６、４７：１１４６〜１１５６によって記載されている通り、ＥＧＴＡおよびＣａＣｌ₂添加の非存在下で測定した。高濃度のＣａ²⁺はＰＫＣホスファチジルセリン結合部位と相互作用し、活性化を妨害することから、低濃度のＣａ²⁺が必要とされる。試料を１回超凍結−溶解するとＰＫＣ活性および活性化の度合いを大幅に低減することが見出されたため、試料の１回超の凍結−溶解を避けた。これらのＰＫＣアイソザイムの特異性を決定するために、化合物を、精製したアイソフォームのＰＫＣと５分間プレインキュベートし、ＰＫＣ活性を放射測定した。

ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＰＫＣ−ε（ＰＫＣ−αまたはＰＫＣ−δではなく）を活性化することが見出された。図１は、ＤＣＰＬＡ−ＭＥが０．１および１μＭで最大の活性を生成し、ＰＫＣ−εに比較的特異的であることを示すものである。実際、ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、同濃度のＰＫＣ−αまたはＰＫＣ−δの何れかに対して大きな効果がなかった。ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＰＫＣ−εを０．０１〜１０μＭの範囲において５０％を超えて活性化し、１００ｎＭおよび１μＭ濃度で最大活性であった。このピークでは、ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＰＫＣ−εを、対照の１９０％まで、活性化した。

さらに、ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＤＨＡ−ＣＰ６およびＤＣＰＬＡよりも、ＰＫＣ−δに対する阻害効果が劣っている。ジアシルグリセロール部位（例えば、ホルボールエステル）に結合するＰＫＣアクチベーターによりＰＫＣ−δが下方制御されると腫瘍促進効果がもたらされ得るので、これは重要な利点であり得る。さらに、ＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−δは、一般にアンタゴニスト効果を有することから、ＰＫＣ−δの阻害は、薬物の有効性に寄与し得るため、望ましいことがある。一般に、ＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−δは、多くの経路においてアンタゴニスト活性を有する。そのようなわけで、ＰＫＣ−εを活性化し、一方でＰＫＣ−δの活性化を最小にし、下方制御するのは、望ましいことがある。

例２：ＤＣＰＬＡ−イソプロピルエステルおよびＤＣＰＬＡ−シクロプロパン化オレイルエステルによるＰＫＣの活性化。例１の手順にしたがって、ＤＣＰＬＡ−イソプロピルエステルおよびＤＣＰＬＡ−シクロプロパン化オレイルエステルの、活性化およびＰＫＣアイソフォーム特異性を測定した（図２）。ＤＣＰＬＡ−イソプロピルエステルは、ＰＫＣ−αとＰＫＣ−εの両方を対照の最大４０％活性化し、ＰＫＣ−δをほんのわずかに活性化した。最大の活性化は１０ｎＭで見られた。ＤＣＰＬＡ−シクロプロパン化オレイルエステルはＰＫＣ−εに相対的に特異的であり、対照の１４０％の活性化を示した。最大の活性化は１０ｎＭで見られた。

例３：ＤＣＰＬＡ−エチルエステル、ＤＣＰＬＡ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、およびＤＣＰＬＡ−レチニルエステルのＰＫＣ活性化。ＤＣＰＬＡ−エチルエステルの、活性化およびＰＫＣアイソザイム特異性を、例１（Ｂ）および（Ｃ）における手順にしたがって測定したが、精製したアイソザイム９ｎｇを用い、室温で５分間プレインキュベートしたことが異なった（図３）。ＤＣＰＬＡ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルおよびＤＣＰＬＡ−レチニルエステルによるＰＫＣ−εの活性化を、ＤＣＰＬＡ−エチルエステルと同様に測定した（図３）。

例４：ＤＣＰＬＡ−コレステリルエステルはコレステリルリノレエートよりも大幅にＰＫＣ−εを活性化する。例１における手順にしたがって、ＤＣＰＬＡ−コレステリルエステルおよびコレステリルリノレエートの、活性化およびＰＫＣアイソザイム特異性を測定した（図４）。ＤＣＰＬＡ−コレステリルエステルは、ＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−δを、二相性の様式で、対照の最高１３０％活性化する。ＰＫＣ−αは全濃度で阻害された。このエステルは、ＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−δに対してとりわけ高い親和性を示した。最大活性は０．０１ｎＭで見られ、これは知られているＰＫＣアクチベーターであるブリオスタチン−１よりも１８倍強力である。コレステリルリノレエートは、対照的に、ＰＫＣ−εの活性化を殆どまたは全く生成せず、ＰＫＣ−αを２０％だけ活性化した。

例５：選択されたＤＣＰＬＡエステルのＥＣ₅₀値、特異性、および活性化。選択された数のＤＣＰＬＡエステルのＥＣ₅₀値、ＰＫＣ特異性、および活性化を決定した（表１を参照されたい）。ＥＣ₅₀値は、最大活性化の５０％を活性化する最小濃度を測定することによって決定した。一般的に、ＥＣ₅₀値が低い薬物ほど強力であると考えられている。表１において見ることができる通り、ＤＣＰＬＡのエステルは、対応する酸であるＤＣＰＬＡよりもはるかに低いＥＣ₅₀値を示す。ＤＣＰＬＡの様々なエステルによるＰＫＣの特異性および活性化を、ＰＫＣアイソザイムの活性化の測定値から決定した。

様々なＤＣＰＬＡの活性化データを全体的に考慮すると、ＤＣＰＬＡエステルは２つのグループに分けられると思われる：一般的に１００〜１０００ｎＭでＰＫＣ−εを活性化する低親和性アクチベーター（例えば、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、レチニルエステル、およびシクロプロパン化オレイルエステル）、ならびに一般的に０．１〜１ｎＭでＰＫＣ−εを活性化する、高親和性アクチベーター（例えば、ＤＣＰＬＡ−イソプロピルエステルおよびコレステリルエステル）。化合物は一般的に二相性の応答を示し、ＰＫＣ−εを低濃度で活性化し、ＰＫＣ−εおよび他のアイソフォームを高濃度で阻害した。

ＤＣＰＬＡエステル（例えば、ＤＣＰＬＡ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルおよびコレステリルエステル）には二峰性の活性化を示したものもあり、活性化対濃度のプロットにおけるＰＫＣ活性化に２つの別個のレベルがあることを表しており、ＰＫＣ−εは親和性の異なる２つのホスファチジルセリン結合部位を所有し得ることを示唆している。

例６：ＤＣＰＬＡ−ＭＥはホスファチジルセリン（Ｃ２）結合部位に結合する。ＤＣＰＬＡ−ＭＥの結合部位を決定するために、³Ｈ−ＤＣＰＬＡ−ＭＥを、既知のＣ１およびＣ２競合物の非存在および存在下、ラット脳切片とインキュベートした。より具体的に、ラット脳切片をホルムアルデヒドで固定し、スライスし、（１）³Ｈ−ＤＣＰＬＡ−ＭＥ単独、（２）³Ｈ−ＤＣＰＬＡ−ＭＥおよびＤＣＰＬＡ；（３）³Ｈ−ＤＣＰＬＡ−ＭＥおよびホルボールエステル；または（４）³Ｈ−ＤＣＰＬＡ−ＭＥおよびブリオスタチン１とインキュベートした。インキュベート後、切片を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４中、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、および０．１％ウシ血清アルブミンで作製したバッファーで洗浄し、乾燥させ、フィルム−オートラジオグラフィーで分析した。

表２は、ＤＣＰＬＡ−ＭＥがＤＣＰ−ＬＡと同じ部位に結合することを示しており、結合は高濃度のジアシルグリセロール（Ｃ１−結合部位）アゴニストによってほんのわずかに阻害されることから、Ｋａｎｎｏら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、２００６、４７：１１４６〜１１５６によって同定された結合部位はホスファチジルセリン（Ｃ２）部位であり、Ｃ１ＡまたはＣ１Ｂではないことが裏づけられる。

例７：ＡＳＰＤおよびＡＤＤＬの生成およびサイズ決定。合成ＡＳＰＤおよびＡＤＤＬを、上記の一般的手順セクションに記載した通りに調製した。１００ｋＤａ保持物（すなわち、ＡＳＰＤ）およびＡＤＤＬのサイズをＳＥＣによって確認した。これらＡＳＰＤのサイズは、ＳＥＣにかけたサイズ標準物質と比べた場合、およそ１７５ｋＤａであることが見出され、一方ＡＤＤＬは１８、１６、および８ｋＤａにピークを示した。

例８：様々なＡβ_1〜42オリゴマーの神経毒性効果（ＡＳＰＤ、ＡＳＰＤの１００ｋＤａ未満のろ液、およびＡＤＤＬ）。様々なサイズのオリゴマーの神経毒性効果を評価するために、ラット一次海馬ニューロンを、可変濃度のこれらＡβ_1〜42種と、２０時間処理した。処理した細胞の生存率を、上記のＭＴＴアッセイを用いて、非処理細胞と比べた。

図５に示す通り、１μＭ濃度のＡβモノマーはニューロンの生存率に影響を及ぼさず（９７．６％±１．３）、一方１μＭ ＡＤＤＬ（モノマーを平均６．５個含む）はニューロンを有意に死滅させた（５０．９８±３．８％、ｐ＝０．００１３）。ＡＳＰＤ（モノマーを平均３９個含む）は、５０ｎＭで生存率における有意な低下を引き起こした（５７．１±４．９％、ｐ＝０．００２８）。ＯＡβ＜１００ｋＤａろ液（モノマーを平均１２個含む）は、５０ｎＭで有意に細胞毒性であったが、インタクトのＡＳＰＤより毒性は低かった。さらに、ＡＳＰＤは２ｎＭ、５ｎＭ、および１０ｎＭの極めて低濃度で生存率の有意な喪失を引き起こし得ることが見出された（表３）。

データは、ＡＳＰＤが最も毒性のオリゴマー種であり、５０ｎＭのＡＳＰＤは、１μＭＡＤＤＬまたは１μＭ＜１００ｋＤａのＡＳＰＤのろ液（ＯＡβ）によって引き起こされる傷害に等しい傷害を引き起こすことを示唆している。モノマーに関して言うと、ＡＳＰＤは、ＡＤＤＬよりも６倍毒性であり、Ａβモノマーより１０倍毒性である。

さらなる実験は全て、別段の指摘がなければ、５０ｎＭ濃度のＡＳＰＤを用いた。

例９：ブリオスタチン−１、ＤＣＰＬＡ、およびＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＡＳＰＤ誘導性の神経毒性から保護する。ＰＫＣアクチベーターは、ＴＡＣＥ（腫瘍壊死因子−α変換酵素）、およびＡβ分解酵素、例えば、エンドセリン変換酵素、インスリン分解酵素、もしくはネプリライシンをおそらく活性化することにより、またはシナプス形成を刺激することにより、Ａβからの神経保護をもたらすことが報告されている。

ブリオスタチン−１、ＤＣＰＬＡ、およびＤＣＰＬＡ−ＭＥを、ＡＳＰＤ誘発性細胞毒性に対して試験して、これらの神経保護効果を決定した。試験したＰＫＣ−εアクチベーターは、一次ニューロンにおいて、ＡＳＰＤでの２０時間処理から神経保護した（図６Ａ）。５０ｎＭ ＡＳＰＤで処理した一次ニューロンは、５７．６±１．６％の生存率を示した。ブリオスタチン−１（０．２７ｎＭ）、ＤＣＰＬＡ（１０μＭ）、およびＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）処理により、生存率は、それぞれ７３．２３±３．６％（ｐ＝０．００８３、ｎ＝６）、８１．４３±２．７６％（ｐ＝０．０００９、ｎ＝６）、および８９．１６±２．２７％（ｐ＝０．０００２、ｎ＝６）に回復した。細胞にＤＣＰＬＡ−ＭＥを加えると、ＰＫＣ−ε転位インヒビターペプチド［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］がＤＣＰＬＡ−ＭＥの保護効果を阻止し、Ａβに対する神経保護はＰＫＣ−ε活性化により媒介されることが示唆された。

ＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理した細胞は、ＤＣＰＬＡ処理およびブリオスタチン−１処理した細胞よりも、８％および１６％生存可能であった。データは、ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＤＣＰＬＡおよびブリオスタチン−１に比べてより良好な神経保護をもたらすことを示す。

ＡＳＰＤおよびＤＣＰＬＡ−ＭＥの、分化したヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対する効果も試験した（図６Ｂ）。ＡＳＰＤ処理細胞において、生存率は、非処理細胞に比べて７７．１５±０．４９％（ｐ＜０．０００１、ｎ＝６）であった。ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をＡＳＰＤから保護し、生存率を９３．８±０．５７％に回復した（ｐ＜０．０００１、ｎ＝６）。

例１０：ＡＳＰＤ処理はＰＫＣ−εを低減した。ＰＫＣ−εには神経保護効果があることが報告されており、シナプス構造を維持／回復することが知られている。例えば、Ｎｅｌｓｏｎ、Ｔ．Ｊ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２００９、３４：１３６〜１４５；Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎ、Ｊ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０１１、３１：６３０〜６４３；Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎ、Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００７、１０４：１９５７１〜１９５７６；およびＳｕｎ、Ｍ．Ｋ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２０１０、１２７：６６〜７７を参照されたい。ゆえに、ＡＳＰＤがＰＫＣ−εに対して阻害作用を有するか否かを評価するために、ＡＳＰＤ処理後のＰＫＣ−εレベルを測定した。

ＡＳＰＤ処理は、一次ニューロンにおいて、ＰＫＣ−ε免疫蛍光レベルを、対照に比べて６０．８１±５．８５％に低減し（ｐ＝０．０００８、ｎ＝６）（図７Ａ）、これはウエスタンブロットによってさらに確認された。β−アクチンを含めた他の対照タンパク質は、ＡＳＰＤによる影響を受けなかった。これは、Ａβ多量体の毒性効果は、一部にはＰＫＣの低減により媒介され得ることを示唆している。

ＡＳＰＤのＰＫＣ−ε活性化に対する効果を、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞における膜への酵素の転位を測定することによって分析した（図７Ｂ）。ＡＳＰＤはＰＫＣ−εの膜転位を３０％低減し（６９．９８±３．２７％、ｐ＝０．０００６、ｎ＝３）、一方２０倍高濃度のＡＤＤＬはＰＫＣ−εを２０％だけ低減した（８０．８２±４．０２５％、ｐ＝０．００５８、ｎ＝３）。Ａβ_1〜42モノマーは、１μＭでは転位に影響を及ぼさなかった。これは、低濃度のＡＳＰＤは、上流のシグナル伝達経路に干渉することによりＰＫＣ−εを標的とし、ＰＫＣ−εの分解および活性の低減をもたらすことを指摘している。ＤＣＰＬＡ−ＭＥの添加は、ＰＫＣ−εの転位を正常に回復した（図８Ｄ）。

例１１：ＤＣＰＬＡ−ＭＥはＰＫＣ−εの活性化を誘発し、神経保護をもたらす。基本のＰＫＣ−εレベルおよび酵素の活性化は、神経毒性を誘発したＡβオリゴマーによる影響を受け、それをＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理することで細胞が生存する助けとなった。ＤＣＰＬＡ−ＭＥの、ＰＫＣ−εタンパク質レベルおよび活性化に対する効果を次に評価した。

一次ニューロンを、ＡＳＰＤおよび／またはＤＣＰＬＡ−ＭＥで処理した。ＰＫＣ−εのｍＲＮＡを、上記に記載した通り、ＲＴ−ＰＣＲにより定量した。対照、および処理した培養一次ラット海馬ニューロンから調製したＲＮＡを単離し、逆転写した。個々のｃＤＮＡを、ＰＫＣ−εおよびβ−アクチンに対して増幅した。ＰＫＣ−ε発現を、β−アクチンに対して標準化した。

一次ニューロンにおいて、ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、対照とＡＳＰＤ処理した細胞の両方においてＰＫＣ−ε転写物レベルを増大し（図８Ａ）、一方ＡＳＰＤ単独はＰＫＣ−εのｍＲＮＡを有意に変更しなかった。ＤＣＰＬＡ−ＭＥも、ＰＫＣ−εタンパク質レベルを正常に回復させた（図８Ｂ）。この保護は、５μＭ ＰＫＣ−ε転位インヒビター［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］によって完全に阻止された（図８Ｃ）。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞において、ＡＳＰＤはＰＫＣ−ε転位を４６％低減した。ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＰＫＣ−ε転位を正常に回復させた（図８Ｄ）。

例１２：ＡＳＰＤはシナプス損傷を引き起こした。ＡＳＰＤによって引き起こされる、一次海馬ニューロンに対するシナプス損傷を推定するために、シナプトフィジン（シナプス前マーカー）およびＰＳＤ−９５（シナプス後マーカー）の発現を、免疫蛍光染色によって測定した。チャンバースライド上で増殖させた細胞を、ビヒクル（対照）、Ａβモノマー（１μＭ）、ＡＤＤＬ（１μＭ）、およびＡＳＰＤ（５０ｎＭ）で処理した。２０時間のインキュベート期間後、細胞を、核、ＰＳＤ−９５、およびシナプトフィジンに対して染色した。発現レベルを、非処理細胞に比べた平均蛍光強度におけるパーセント値の変化として算出した。

対照に比べて、５０ｎＭ ＡＳＰＤはシナプトフィジン強度における４０％の低減を引き起こし（６２．４５±６．７４％、ｐ＝０．００７１）、１μＭ ＡＤＤＬは２５％の低減を引き起こした（７５．６４±４．８４％、ｐ＝０．０３３）（図９Ａおよび９Ｃ）。ＰＳＤ−９５発現も、ＡＳＰＤ処理細胞において４２％（±１０％）低減した（図Ａおよび９Ｂ）。１μＭ濃度のＡβ_1〜42モノマーは、シナプトフィジンまたはＰＳＤ−９５の発現を変更しなかった。これは、ＡＳＰＤは、ナノモル濃度でもシナプスの完全性を破壊することを指摘するものである。

例１３：ＤＣＰＬＡ−ＭＥはニューロンをＡＳＰＤ誘発性シナプス喪失から保護する。処理および非処理の一次ニューロンを、ＭＡＰ−２、シナプトフィジン、およびＰＳＤ−９５に対して免疫染色して、シナプスの完全性を決定した。チャンバースライド上で増殖させた細胞を、ビヒクル（対照）、５０ｎＭ ＡＳＰＤ、５０ｎＭ ＡＳＰＤ＋１００ｎＭ ＤＣＰＬＡ−ＭＥ、および５０ｎＭ ＡＳＰＤ＋１００ｎＭ ＤＣＰＬＡ−ＭＥ＋５μＭ ＰＫＣ−ε転位インヒビター［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］で処理した。ＰＫＣ−εインヒビターを加えた３０分後に、ＡＳＰＤおよびＤＣＰＬＡ−ＭＥを加えた。２０時間のインキュベート期間後、細胞を、上記に記載した通り、ＭＡＰ−２、ＰＳＤ−９５、およびシナプトフィジンに対して染色した。

ＰＳＤ−９５およびシナプトフィジンの神経突起の染色はＡＳＰＤ処理後に低減したが、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理は神経突起分岐におけるその染色を増大したことが見出された（図１０Ａ）。

ＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理は、ＡＳＰＤ処理細胞におけるＭＡＰ−２の発現（平均蛍光強度）を４０．７±６．２％から６８．８７±２．０％（ｐ＝０．０００７、ｎ＝５）に、シナプトフィジンを６３．３±３．８％から８７．４８±３．７５％（ｐ＝０．０００５、ｎ＝５）に、ＰＳＤ−９５を６７．６３±７．２４％から９９．２±１１．３％（ｐ＝０．０２、ｎ＝５）に増大した（図１０Ｂ）。これらの結果は、ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＡＳＰＤ細胞を細胞死から保護するだけでなく、シナプスネットワークにおけるシナプトフィジン、ＰＳＤ−９５、およびＭＡＰ−２の発現の増大によるシナプス損傷も防いだことを示唆する。シナプトフィジンの発現はウエスタンブロットによって確認され、ＡＳＰＤは発現を２６％低減し（７３．３０％±３．３１９、ｐ＝０．００３５，ｎ＝３）、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理により発現が対照と同様に維持されたことが示された（図１０Ｃ）。

例１４：ＤＣＰＬＡ−ＭＥはＡＳＰＤ処理一次ニューロンにおいてＧＳＫ−３βを不活化した。抗ホスホ−Ｓｅｒ−９のウエスタンブロットにおけるシグナルの増大によって証明された通り、ＡＳＰＤ処理細胞をＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理することにより、ＧＳＫ−３βのＳｅｒ−９残基のリン酸化は正常レベルまで回復した（図１１）。ＧＳＫ−３βは、過剰リン酸化されたタウタンパク質の生成における主要な酵素であり、Ｓｅｒ−９残基のリン酸化はＧＳＫ−３βの阻害を引き起こすので、ＰＫＣによる、Ｓｅｒ−９のＧＳＫ−３βのリン酸化の増大は、ＤＣＰＬＡ−ＭＥの保護効果をやはり増強し得る。

例１５：ＤＣＰＬＡ−ＭＥはヒト皮質ニューロンにおいてシナプス形成をもたらす。ＰＫＣ−ε活性化の効果を調べるために、無血清人工培地中、培養ヒトニューロンを、５０％の培地を置きかえて、３日毎に添加した１００ｎＭ ＤＣＰＬＡ−ＭＥに、４０日間曝露した。より具体的に、ヒト一次皮質ニューロンを、神経細胞増殖サプリメント（neuronal growth supplement）（ＮＧＳ）（Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌカタログ番号＃１５６２）を含んでいる、神経細胞用培地（Neuronal Medium）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌカタログ番号＃１５２１）中で増殖させた。

ＮＧＳの組成−５００ｍｌボトルのＮＭにＮＧＳを補充する場合、サプリメント成分１ミリリットルあたりの最終濃度は、１００ｕｇＢＳＡ、２．５ｕｇ／ｍＬカタラーゼ、１ｕｇ／ｍＬグルタチオン（還元型）、４ｕｇ／ｍＬインスリン、０．００２６ｕＭ Ｔ３、２ｕｇ／ｍＬ Ｌ−カルニチン、１６ｕＭエタノールアミン、１５ｕｇ／ｍＬガラクトース、１６．１ｕｇ／ｍＬプトレシン、０．０１４３５ｕｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム、０．０２ｕｇ／ｍＬコルチコステロン、０．０２ｕＭプロゲステロン、３．５ｎＭリノール酸、１ｕｇ／ｍＬリノレン酸、０．２ｕＭリポイクアコド（Lipoic Acod）、０．０１ｕｇ／ｍＬレチニル酢酸、０．１ｕｇ／ｍＬ Ｄ，Ｌ−アルファ−酢酸トコフェロール、および０．１％エタノールである。

細胞を、ポリ−ｌ−リジン（０．００１％）コーティングしたプレート上、１００００超の細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングした。培地の半分を、３日毎に新たな培地によって置きかえた。ＤＣＰＬＡ−ＭＥを、１００％エタノール中に溶解し、１００ｎＭの最終濃度で添加した。培地交換の間、３日毎に、新鮮なＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）を加えた。実験を４０日間続けた。

ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ニューロンの生存を、２０日から、４０日を超えて増大した。ＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理した神経突起陽性細胞は、非処理群の１３０±８に比べて、３６０±４５個／視野であった。ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、シナプスを示す、シナプトフィジンおよびＰＳＤ−９５の共局在する点状の数を、対照の２３０％に増大し（図１２）、ＰＫＣ−εの活性化はヒトニューロンにおけるシナプス形成を誘発し得ることが指摘された。フラクタル次元の１．２７±０．０２から１．４０±０．０３の増大によって証明される通り、神経突起の分岐も増大した（ｐ＝０．０３）（図１２）。ＰＫＣ−εの活性化により、ヒトニューロンにおけるネットワークの連結性および複雑性における著名な成長が産生される。このように、ＤＣＰＬＡエステル、例えば、ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、様々な神経学的障害における顕著な治療的利点を提供し得る。

例１６：ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、感覚運動能力または動機づけに影響を及ぼさずに、用量依存的に学習および記憶保持を改善する。水迷路空間学習および記憶タスク（訓練試行２回／日を４日間）を用いて、経口ＤＣＰＬＡ−ＭＥの、ラットにおける学習および記憶に対する効果を評価した。可視プラットホーム試験（visible platform test）を、実験が終わった後に行って、処置が感覚運動性活動および回避動機づけの変更をもたらし得たか否かを評価した。

成年オスＷｉｓｔａｒラット（２００〜２５０ｇ）を、温度制御した部屋（２０〜２４℃）に一週間収容し、餌および水を自由に摂取させ、１２時間の明／暗周期を維持した。ラットをペントバルビタールナトリウムで麻酔し（６０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ）、低位装置（Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｔｕｊｕｎｇａ、ＣＡ）中に配置した。ラットの核心体温をモニタリングし、加温光およびパッドで一定（３８±０．５℃）に維持した。ステンレススチール製ガイドカニューレ２個を、無菌条件下、座標（前〜後０．５ｍｍ、側面１．５ｍｍ、水平３．２ｍｍ）に位置付けた先端部とともに配置した。外科手術の終わりに、好適な麻酔下、ラットに、乳酸／リンゲル溶液中バナミン（banamine）（１ｍｇ／ｋｇ）およびケトプロフェン（５ｍｇ／ｋｇ）を投与（ｓ．ｃ．）した。任意のさらなる実験の前に、７日の回復期間をおいた。

実験初日、全てのラットを異なる群に無作為に割り当て、１．５（直径）×０．６ｍ（深さ）のプール（２２±１℃）中で２分間泳がせた。翌日、ラットを、連続４日間の、１日あたり２つの試行において訓練した。各訓練試行は最高２分間続き、その間、ラットは、固定された位置に水面下１ｃｍに浸水して配置された隠れたプラットホームを見つけることにより、水から回避することを学習した。ラットの進路決定（navigation）をビデオカメラによって追跡した。ラットがプールを横切ってプラットホームまで泳ぐ、回避の潜伏期および経路を記録した。最後の訓練試行の２４時間後、プラットホームを除去した後に、四分円試験（１分）を行った。

ＤＣＰＬＡ−ＭＥを、５．３または１６．０ｍｇ／ｋｇの何れかで投与した（胃内、２回／週、合計８用量、水迷路タスク前に最初の６用量、ならびに訓練１日目および３日目の第２の試行０．５時間後に第７および第８用量）。図１３に示す通り、試行にわたって回避潜伏期が短くなることにより証明される通り、全部のラットが水迷路タスクを学習した。（Ｆ７、１９１＝１９．７２４、ｐ＜０．００１）。群間で有意差が存在し（Ｆ２，１９１＝７．７１７、ｐ＜０．００１）、用量１６．０ｍｇ／ｋｇと対照群との間に有意差が存在し（Ｆ１，１２７＝１３．３８９、ｐ＜０．００１）、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ投与時に学習成績が改善したことが指摘された。学習成績はＤＣＰＬＡ−ＭＥ用量５．３ｍｇ／ｋｇと対照群の間で改善したが、改善は有意レベルに到達しなかった（Ｆ１、１２７＝０．６５７、ｐ＞０．０５）。

記憶保持試験において、全てのラットが標的の四分円の好みを示した（図１４）。データを、標的の四分円比を用いて分析した（プローブ試験の間、標的の四分円の距離を、非標的の四分円値の平均によって除す、図１４Ｄ）。データは、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ用量１６．０ｍｇ／ｋｇと対照群の間に、標的の四分円比における有意差を示すが（Ｆ１、１５＝４．９８１、ｐ＞０．０５、示さず）、用量５．３ｍｇ／ｋｇと対照群の間には有意差はない（Ｆ１、１５＝０．３９７、ｐ＞０．０５）。

実験の終わりに、ラットを可視プラットホーム試験においてさらに試験して、処置が感覚運動性活動および回避動機付けの変更をもたらし得たかどうかを評価した。この試験において群間に有意差はなく(Ｆ３、３１＝１．１２７、ｐ＞０．０５、示さず）、経口ＤＣＰＬＡ−ＭＥ処置は、ラットの感覚運動性能力および回避に対する動機づけに影響を及ぼさなかったことを指摘していた。

例１７：ＤＣＰＬＡ−ＭＥは樹状突起の分岐を増大する。一次ニューロンの発達に対するＤＣＰＬＡ−ＭＥの効果を調査した。７日齢ラット海馬ニューロンを、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）で４８時間処理した。免疫蛍光法および共焦点顕微鏡法−細胞を、４つのチャンバースライド（Ｎｕｎｃ、ＵＳＡ）中、低密度で増殖させた。免疫蛍光法の染色用に、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで４分間固定した。固定後、細胞を、１×ＰＢＳ中、５％血清および０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で３０分間、ブロックおよび透過処理した。細胞を、１×ＰＢＳで３回洗浄し、１：１００希釈の一次抗体と１時間インキュベートした。インキュベート後、スライドを、１×ＰＢＳ中で再び３回洗浄し、１：４００希釈のＦＩＴＣ抗ウサギＩｇＧおよびローダミン抗マウスＩｇＧと１時間インキュベートした。細胞を、さらに洗浄し、Ｐｒｏ Ｌｏｎｇ Ｇｏｌｄアンチフェードマウンティング溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中、マウンティングした。染色した細胞を、ＬＳＭ ７１０ Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）下、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、およびローダミンに対してそれぞれ、励起３５０ｎｍ、４９０ｎｍ、および５４０ｎｍ、ならびに発光４７０ｎｍ、５２５ｎｍ、および６２５ｎｍで観察した。各チャンネルにおける平均蛍光強度（ＭＦＩ）に対して、２０×または６３×の油浸レンズ倍率で別個の６視野を分析した。共存の相関をＺＥＮソフトウエア（Ｚｅｉｓｓ）により生成した。

フラクタル次元の測定により、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１．４０±０．０３）で処理した細胞における樹状突起の分岐の有意な増大が示された（図１５Ｂ）。シナプトフィジン染色はＤＣＰＬＡ−ＭＥにより増大し、シナプス小胞のプールにおける増大が示唆された（図１５Ｃ）。

例１８：ＤＣＰＬＡ−ＭＥによるＰＫＣ−ε特異的活性化は、一次ヒトニューロンを経時的に変性から保護する。推奨される方法にしたがい、ヒト一次ニューロン（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）を解凍し、ポリ−Ｌ−リジンコーティングしたプレート上に１００００細胞／ｃｍ²の密度でプレーティングし、神経細胞用培地中に維持した。（ＤＭＥＭ＋高グルコース＋神経細胞増殖サプリメント、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）。一次ヒトニューロンを、次いで、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）またはブリオスタチン−１（０．２７ｎＭ）の何れかで、４０日間処理した。３日毎に新鮮な薬物を加え、５０％の培地を交換した。

ＤＣＰＬＡ−ＭＥまたはブリオスタチン−１の何れかで処理した細胞は、神経突起の分岐および連結を有する良好な生存を示した（図１６Ａ）。非処理細胞は２０日後に変性を示したが、処理した細胞は少なくとも４０日間健全であった（図１６Ｂ）。ＰＫＣ−ε、ＰＳＤ−９５、およびシナプトフィジンの発現レベルは、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理細胞において、対照またはブリオスタチン−１処理細胞に比べて有意に高かった（図１６Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧ）。

ＰＳＤ−９５およびシナプトフィジンの点状の共局在は、シナプスの指標として受け入れられる。例えば、Ｂａｒｋｅｒら、（２００８）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２８、８１５０〜８１６０；Ｉｐｐｏｌｉｔｏら、（２０１０）Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ、１６（４５）、２２７０を参照されたい。図７Ｈは、シナプスの数がＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理細胞において有意に増大したことを示し、ＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−ε活性化はシナプス形成およびシナプスの維持を増強することを示唆するものである。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
メチルエステルではないという条件での、８−［２−（２−ペンチルシクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（ＤＣＰＬＡ）のエステル。
［２］
アルキルエステル、ベンジルエステル、芳香族エステル、脂肪アルコールエステル、脂肪酸エステル、シクロプロパン化脂肪アルコールエステル、シクロプロパン化脂肪酸エステル、ジアシルグリセロールエステル、ホスファチジルセリンエステル、コレステロールエステル、およびマクロライドエステルから選択される、［１］に記載のエステル。
［３］
エチル８−（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）オクタノエート（ＤＣＰＬＡ−エチルエステル）、
イソプロピル８−（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）オクタノエート（ＤＣＰＬＡ−イソプロピルエステル）、
ｔｅｒｔ−ブチル８−（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）オクタノエート（ＤＣＰＬＡ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル）、
ベンジル８−（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）オクタノエート（ＤＣＰＬＡ−ベンジルアルコールエステル）、
８−（２−オクチルシクロプロピル）オクチル８−（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）オクタノエート（ＤＣＰＬＡ−シクロプロパン化オレイルエステル）、
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエン−１−イル８−（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）−メチル）シクロプロピル）オクタノエート（ＤＣＰＬＡ−レチニルエステル）、
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−８−（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）オクチル３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエノエート（レチノイン酸−ＤＣＰＬＡアルコールエステル）、
（８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）−１０，１３−ジメチル−１７−（（Ｒ）−６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル８−（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）−メチル）シクロプロピル）オクタノエート（ＤＣＰＬＡ−コレステリルエステル）、
（２Ｚ，２’Ｅ）−ジメチル２，２’−（（１Ｓ，３Ｓ，７Ｒ，１１Ｓ，１２Ｓ，１５Ｓ，１７Ｒ，２１Ｒ，２５Ｓ，Ｅ）−２５−アセトキシ−１，１１，２１−トリヒドロキシ−１０，１０，２６，２６−テトラメチル−１２−（（２Ｅ，４Ｅ）−オクタ−２，４−ジエノイルオキシ）−１９−オキソ−１７−（（１Ｒ）−１−（（８−（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）オクタノイル）オキシ）エチル）−１８，２７，２８，２９−テトラオキサテトラシクロ［２１．３．１．１３，７．１１１，１５］ノナコサ−８−エン−５，１３−ジイリデン）ジアセテート、および
（２Ｚ，２’Ｅ）−ジメチル２，２’−（（１Ｓ，３Ｓ，７Ｒ，１１Ｓ，１２Ｓ，１５Ｓ，１７Ｒ，２１Ｒ，２５Ｓ，Ｅ）−１，１１，２１−トリヒドロキシ−１０，１０，２６，２６−テトラメチル−１２−（（２Ｅ，４Ｅ）−オクタ−２，４−ジエノイルオキシ）−１９−オキソ−２５−（（８−（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）メチル）−シクロプロピル）オクタノイル）オキシ）−１７−（１−（（８−（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）メチル）−シクロプロピル）オクタノイル）オキシ）エチル）−１８，２７，２８，２９−テトラオキサテトラシクロ［２１．３．１．１ ^3,7 ．１ ^11,15 ］ノナコサ−８−エン−５，１３−ジイリデン）ジアセテート
から選択される、［１］に記載のエステル。
［４］
８−［２−（２−ペンチルシクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（ＤＣＰＬＡ）の少なくとも１つのエステル、および薬学的に許容される担体を含む組成物。
［５］
前記エステルが、アルキルエステル、ベンジルエステル、芳香族エステル、脂肪アルコールエステル、脂肪酸エステル、シクロプロパン化脂肪アルコールエステル、シクロプロパン化脂肪酸エステル、ジアシルグリセロールエステル、ホスファチジルセリンエステル、コレステリルエステル、およびマクロライドエステルから選択される、［４］に記載の組成物。
［６］
前記エステルが、メチルエステル、エチルエステル、イソプロピルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、オレイルエステル、レチニルエステル、シクロプロパン化オレイルエステル、コレステリルエステル、ブリオスタチン１エステル、および１−パルミトイル−２−オレオイル−グリセロールエステルから選択される、［４］に記載の組成物。
［７］
前記エステルが、メチルエステル、イソプロピルエステル、コレステリルエステル、およびシクロプロパン化オレイルエステルから選択される、［４］に記載の組成物。
［８］
前記エステルがメチルエステルである、［４］に記載の組成物。
［９］
前記エステルが、学習を改善するため、記憶を改善するため、β−アミロイドレベルを低減するため、シナプス喪失またはシナプス損傷に付随する疾患を予防または処置するため、神経変性障害および状態を予防または処置するため、うつ病を予防または処置するため、脳卒中を予防または処置するため、精神遅滞を処置するため、ならびに脳傷害を予防または処置するために有効な量において存在する、［４］〜［８］の何れかに記載の組成物。
［１０］
経口または静脈内の投与に適する、［４］〜［９］の何れかに記載の組成物。
［１１］
８−［２−（２−ペンチルシクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（ＤＣＰＬＡ）の少なくとも１つのエステルの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、学習を改善するための方法。
［１２］
８−［２−（２−ペンチルシクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（ＤＣＰＬＡ）の少なくとも１つのエステルの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、記憶を改善するための方法。
［１３］
８−［２−（２−ペンチルシクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（ＤＣＰＬＡ）の少なくとも１つのエステルの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、β−アミロイドレベルを低減するための方法。
［１４］
８−［２−（２−ペンチルシクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（ＤＣＰＬＡ）の少なくとも１つのエステルの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、シナプス喪失またはシナプス損傷に付随する疾患を予防または処置するための方法。
［１５］
少なくとも１つの疾患または状態を予防または処置するための方法であって、８−［２−（２−ペンチルシクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（ＤＣＰＬＡ）の少なくとも１つのエステルの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含み、前記少なくとも１つの疾患または状態が、神経変性障害および状態、うつ病、脳卒中、および脳傷害から選択される方法。
［１６］
前記神経変性障害がアルツハイマー病から選択される、［１５］に記載の方法。
［１７］
前記神経変性障害または状態が、少なくとも１つの神経毒性化学物質への曝露によって引き起こされる、［１５］に記載の方法。
［１８］
前記少なくとも１つの神経毒性化学物質が重金属である、［１７］に記載の方法。
［１９］
前記状態が脳卒中である、［１５］に記載の方法。
［２０］
前記状態が脳傷害である、［１５］に記載の方法。
［２１］
前記脳傷害が、外傷性脳傷害または照射によって誘発される脳傷害である、［２０］に記載の方法。
［２２］
前記エステルが、アルキルエステル、ベンジルエステル、芳香族エステル、脂肪アルコールエステル、脂肪酸エステル、シクロプロパン化脂肪アルコールエステル、シクロプロパン化脂肪酸エステル、ジアシルグリセロールエステル、ホスファチジルセリンエステル、コレステロールエステル、およびマクロライドエステルから選択される、［１１］〜［２１］の何れかに記載の方法。
［２３］
前記エステルが、メチルエステル、エチルエステル、イソプロピルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、オレイルエステル、レチニルエステル、シクロプロパン化オレイルエステル、コレステリルエステル、ブリオスタチン１エステル、および１−パルミトイル−２−オレオイル−グリセロールエステルから選択される、［１１］〜［２１］の何れかに記載の方法。
［２４］
前記エステルが、メチルエステル、イソプロピルエステル、コレステリルエステル、およびシクロプロパン化オレイルエステルから選択される、［１１］〜［２１］の何れかに記載の方法。
［２５］
前記エステルがメチルエステルである、［１１］〜［２１］の何れかに記載の方法。

Claims (15)

1. ８−［２−（２−ペンチルシクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（ＤＣＰＬＡ）のエステルであって、ここで、エステルは、
   イソプロピル８−（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）オクタノエート（ＤＣＰＬＡ−イソプロピルエステル）、
   ｔｅｒｔ−ブチル８−（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）オクタノエート（ＤＣＰＬＡ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル）、
   ８−（２−オクチルシクロプロピル）オクチル−８−（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）オクタノエート（ＤＣＰＬＡ−シクロプロパン化オレイルエステル）、
   （２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエン−１−イル８−（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）−メチル）シクロプロピル）オクタノエート（ＤＣＰＬＡ−レチニルエステル）、
   （８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）−１０，１３−ジメチル−１７−（（Ｒ）−６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル８−（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）−メチル）シクロプロピル）オクタノエート（ＤＣＰＬＡ−コレステリルエステル）
   から選択されるエステル。
2. 請求項１に記載の少なくとも１つのエステル、および薬学的に許容される担体を含む組成物であって、ここで、前記エステルが、学習を改善するため、記憶を改善するため、β−アミロイドレベルを低減するため、シナプス喪失またはシナプス損傷に付随する疾患を予防または処置するため、神経変性障害および状態を予防または処置するため、うつ病を予防または処置するため、脳卒中を予防または処置するため、精神遅滞を処置するため、ならびに脳傷害を予防または処置するために有効な量において存在する、組成物。
3. 経口または静脈内の投与に適する、請求項２記載の組成物。
4. それを必要とする患者の学習を改善するための医薬の製造のための請求項２に記載の組成物の使用。
5. それを必要とする患者の記憶を改善するための医薬の製造のための請求項２に記載の組成物の使用。
6. それを必要とする患者のβ−アミロイドレベルを低減するための医薬の製造のための請求項２に記載の組成物の使用。
7. それを必要とする患者のシナプス喪失またはシナプス損傷に付随する疾患を予防または処置するための医薬の製造のための請求項２に記載の組成物の使用。
8. それを必要とする患者の少なくとも１つの疾患または状態を予防または処置するための医薬の製造のための請求項２に記載の組成物の使用であって、前記少なくとも１つの疾患または状態が、神経変性障害および状態、うつ病、脳卒中、および脳傷害から選択される使用。
9. 前記神経変性障害がアルツハイマー病である、請求項８に記載の使用。
10. 前記神経変性障害または状態が、少なくとも１つの神経毒性化学物質への曝露によって引き起こされる、請求項８に記載の使用。
11. 前記少なくとも１つの神経毒性化学物質が重金属である、請求項１０に記載の使用。
12. 前記状態が脳卒中である、請求項８に記載の使用。
13. 前記状態が脳傷害である、請求項８に記載の使用。
14. 前記脳傷害が、外傷性脳傷害または照射によって誘発される脳傷害である、請求項１３に記載の使用。
15. 前記エステルが、
    イソプロピル８−（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）オクタノエート（ＤＣＰＬＡ−イソプロピルエステル）、
    ｔｅｒｔ−ブチル８−（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）オクタノエート（ＤＣＰＬＡ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル）、
    ８−（２−オクチルシクロプロピル）オクチル−８−（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）オクタノエート（ＤＣＰＬＡ−シクロプロパン化オレイルエステル）、
    （２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエン−１−イル８−（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）−メチル）シクロプロピル）オクタノエート（ＤＣＰＬＡ−レチニルエステル）、
    （８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）−１０，１３−ジメチル−１７−（（Ｒ）−６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル８−（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）−メチル）シクロプロピル）オクタノエート（ＤＣＰＬＡ−コレステリルエステル）
    である、請求項４〜１４の何れかに記載の使用。