JP6553267B1 - クマリンの測定方法及びクマリンの自動測定装置 - Google Patents

Abstract

【課題】拘束時間の短縮を図り、多くの試料の測定効率を良好とするクマリンの測定方法及びクマリンの自動測定装置を提供する。【解決手段】クマリンの自動測定装置１は、分光蛍光光度計１０と、試料導入部１００とを備える。分光蛍光光度計１０は、光度計部２０と、光度計部２０内に配置され、光度計部２０をコントロールし試料を分析するデータ処理部３０と、入出力を行う操作部４０とを備える。試料導入部１００は、試料が収納された複数の試験管１０１を配置するサンプルラック１０２と、シリンジ１０３と、貯留タンク１０４と、ポンプ１１０と、廃液タンク１２０とを備えている。シリンジ１０３を用いて試験管１０１内の試料を採取し、流路１３０に、純水と、少なくともアルカリ溶液を含有するコンディショニング溶液とを流して流路１３０を洗浄する。【選択図】図１

Description

本発明は、クマリンの測定方法及びクマリンの自動測定装置に関する。

軽油には、軽油引取税がかかるが、周辺油種（Ａ重油、灯油）には軽油引取税はかからないことから、自動車用課税軽油に周辺油種を混入させることで、軽油引取税相当分を脱税する行為がなされている。この行為を未然に防止するために、通産省資源エネルギー庁は軽油周辺油種にクマリンを添加することとして、「軽油周辺油種への識別剤添加実施要綱」及び「軽油周辺油種への識別剤添加実施細則」を定めている。灯油とＡ重油には、軽油識別剤としてクマリンが規定濃度添加されており、軽油中のクマリン混入率が分析されている。クマリンは、アルカリ加水分解されることで、シス−ｏ−ヒドロキシケイヒ酸となり、これを紫外線にて異性化することで生じるトランス−ｏ−ヒドロキシケイヒ酸からの蛍光を測定することで灯油やＡ重油の混入率を判別することができる。

都道府県では、軽油の抜き取り検査を実施しており、軽油中にクマリンが検出されたならば、不正軽油の疑いがあり指導処置がとられることになる。クマリンの検出方法として、試験管内で前処理を行い、その試験管のまま蛍光光度計にて定量分析する簡易定量法（Ａ法）（特許文献１及び非特許文献１）と、分液ロートなどのガラス器具を用い、前処理した試料をセルに分注して定量分析する定量法（Ｂ法）（非特許文献２）が知られている。Ｂ法はガラス器具を用いることから煩雑であり、試薬を多量に使用するため、試験管内で前処理を行い、セルに分注することなく試験管のまま蛍光光度計にて定量分析するＡ法が開発された。

石油製品に含まれるクマリンは、非特許文献１の石油学会規格「石油製品-クマリンの求め方-蛍光光度法」にて軽油識別剤クマリンの分析法が制定されている。Ａ法は試験管のまま蛍光光度計にて定量分析することが可能であるため、Ｂ法と比較して大幅な省力化がなされた。

Ａ法は、試料を試験管中で希釈剤のｎ−ドデカンで希釈し、これにアルカリ液とアルコール液を加えて振とう、攪拌、その後、静置することで、試料中に含まれるクマリンが水溶液（アルカリ層）に加水分解されるとともに抽出される。抽出液が含まれるアルカリ層を３６０ｎｍの紫外線を照射することで、クマリンが蛍光を発するトランス体に異性化される。効率的に紫外線の異性化を実施するために、照射強度が規定され、複数の試験管を設置可能な紫外線照射機を用いた予備照射がなされる。その後、この試験管を蛍光光度計に設置し、最下層のアルカリ層に対し、３６０ｎｍの紫外線で最終的な異性化を行い、クマリン特有の５００ｎｍの蛍光強度を測定、クマリン添加油の混入率をあらかじめ測定した検量線より定量値を得る。

特開平１０−３８８７８号公報

社団法人石油学会 石油学会規格 石油製品―クマリンの求め方―蛍光光度法 ＪＰ−５Ｓ−７１−２０１０ 平成２２年１２月２４日発行 （株）日立製作所 テクニカルデータ ＦＬシートＮｏ．３５

特許文献１及び非特許文献１に記載されたＡ法であるが、１本ずつ試験管を蛍光光度計に設置して測定するため、試料が多数ある場合には拘束時間が試料件数に比例して所要する。例えば、１００検体の測定に際し、前処理から測定の工程で約４時間程度所要される。その間、前処理から測定に付きっきりになるため、約４時間程度拘束される。また、紫外線照射機を用いた予備照射で前処理の効率化を図っているが、この時、複数本をまとめて照射するため、検体ごとの照射のムラが生じる可能性がある。また、測定までの保管時間は最初の検体では短く、後の検体では長くなるため、保管されている時間においても、室内の紫外線でわずかに異性化が進んだり、異性化後の分解が生じたりする。異性化されることで蛍光を発する化学形態となることから、紫外線照射のばらつきは、蛍光強度すなわち定量値のばらつきに繋がるという課題がある。

一方、非特許文献２にて開示されているＢ法を元にした自動化法については、従来のＢ法と比較して試料量の低減や拘束時間の短縮化がなされている。１サイクル（標準試料（４検体）と未知試料５検体）の拘束時間は５分程度であるが、全処理には２時間３０分と大幅に時間が所要される。未知試料は８時間で２５検体程度しか測定できない。一般的にクマリンは、灯油及びＡ重油の製造時に添加したクマリンが１ｍｇ／Ｌ（混入率１００％相当）±１５％の範囲で添加されているかどうかの濃度確認、軽油引取税の脱税防止に伴う軽油の抜き取り検査の目的で測定される。このとき、製造時の添加確認は高濃度で比較的検出は容易であるが、軽油の抜き取り検査場合、混入率が数%を下回る低濃度の測定となる。

非特許文献２の方法の場合、フローセルに導入する試料量を確保するためにクマリンが抽出されている最下層のアルカリ層を別の試験管に分取し、２ｍＬに希釈する必要がある。オートサンプラーの分取の精度や希釈することでの蛍光強度の低下の影響から、低濃度域での測定に不向きであるという点が懸念される。また、このシステムでは洗浄液にｎ−ドデカンを用いている。フローセルに導入される試料は、アルカリ溶液を純水で希釈した水系であるが、洗浄液は有機系のｎ−ドデカンであり、水への溶解度が低い。そのため、クマリンから加水分解・異性化されたトランス−ｏ−ヒドロキシケイヒ酸が十分に洗浄されないことや、フローセル内部でｎ−ドデカンに対して水が排出されにくくなり、水泡が生じることが懸念される。洗浄不足は低濃度での測定値の誤差、水泡は蛍光強度の正確さに影響が生じる恐れがあるという課題がある。少ない拘束時間でかつ効率良く多数の試料の測定をするための分析手法が望まれる。

本発明は、拘束時間の短縮を図り、多くの試料の測定効率を良好とするクマリンの測定方法及びクマリンの自動測定装置を提供することを目的とする。

本発明のクマリンの測定方法は、クマリンを含む試料に励起光を照射して放出された蛍光を測定し、励起波長に対する蛍光強度を示す励起スペクトルを取得する分光蛍光光度計を用いて、前記試料に含まれるクマリンの量を測定する方法であって、シリンジを用いて試験管内の前記試料を採取し、当該試料を所定の流路に流して前記励起光を照射し、前記シリンジを用いて前記流路に、純水と、少なくともアルカリ溶液を含有するコンディショニング溶液とを流して当該流路を洗浄する。

本発明のクマリンの測定方法の一態様として例えば、さらに界面活性剤溶液と、少なくともアルコールを含有するブランク溶液を前記流路に流す。

本発明のクマリンの測定方法の一態様として例えば、前記ブランク溶液がさらにドデカンを含有する。

本発明のクマリンの測定方法の一態様として例えば、前記コンディショニング溶液が、前記アルカリ溶液に加えて界面活性剤溶液と、少なくともアルコールを含有するブランク溶液とを含有する合成コンディショニング溶液であり、前記純水と、前記合成コンディショニング溶液のみによって前記流路を洗浄する。

本発明のクマリンの測定方法の一態様として例えば、前記試料を試験管に入れた後に当該試験管の開口に穴付きキャップを取り付け、前記穴付きキャップの穴を塞ぐとともに当該穴付きキャップを押さえつける穴付きキャップ押さえ機構を取り付け、前記穴付きキャップ押さえ機構を取り付けた試験管を振とう機を用いて振とうし、前記振とう機から前記試験管を取り外し、前記穴付きキャップ押さえ機構を前記試験管から取り外し、前記シリンジを用いて前記試験管から前記試料を採取する。

本発明のクマリンの自動測定装置は、試料に含まれるクマリンの量を測定するクマリンの自動測定装置であって、前記試料に励起光を照射して放出された蛍光を測定し、励起波長に対する蛍光強度を示す励起スペクトルを取得する分光蛍光光度計と、試験管内の試料を採取し、採取した前記試料に励起光を照射可能な領域を通過する所定の流路に流すためのシリンジと、純水と、少なくともアルカリ溶液を含有するコンディショニング溶液を貯留する少なくとも二つの貯留タンクと、を備え、前記シリンジは、前記二つの貯留タンクから前記純水と前記コンディショニング溶液を採取して前記流路に流す。

本発明のクマリンの自動測定装置の一態様として例えば、界面活性剤溶液と、少なくともアルコールを含有するブランク溶液を貯留する他の二つの貯留タンクを更に備え、前記シリンジは、前記他の二つの貯留タンクから前記界面活性剤溶液と前記ブランク溶液を採取して前記流路に流す。

本発明のクマリンの自動測定装置の一態様として例えば、前記試料を試験管に入れた後に当該試験管の開口に取り付けられる穴付きキャップと、前記穴付きキャップの穴を塞ぐとともに当該穴付きキャップを押さえつける穴付きキャップ押さえ機構と、前記穴付きキャップ押さえ機構を取り付けた試験管を振とうする振とう機と、を更に備え、前記振とう機から前記試験管を取り外し、前記穴付きキャップ押さえ機構を前記試験管から取り外した後、前記シリンジが前記試験管から前記試料を採取する。

本発明のクマリンの測定方法及びクマリンの自動測定装置は、石油製品中のクマリンの測定において、作業者の拘束時間を短縮し、多くの試料の測定を効率よく実施することが可能となる。また、測定後、流路を洗浄するため、各試料に対応した測定が正確に行われる。そして、アルカリ溶液により流路内のクマリンを除去して余分なメモリーを排除することが可能となる。さらに、シリンジを用いているためシリンジ内も洗浄され、各試料に対応した測定がより正確となる。また、クマリンの自動測定装置において、貯留タンクを備えることにより自動洗浄が容易となる。そして、純水による洗浄とコンディショニング溶液の洗浄により、流路内に付着したクマリンを除去でき、精度の良い自動測定が可能となる。

本発明に係るクマリンの自動測定装置の一実施形態を示す構成ブロック図。 試験管のキャップを示す模式図で、（ａ）振とう機で振とうしている状態、（ｂ）密封キャップ、（ｃ）穴付きキャップと穴付きキャップ押さえ機構、（ｄ）穴付きキャップに穴付きキャップ押さえ機構を取り付けた状態を示す。 振とう後の試験管内の状態と試料の測定の概要を示す模式図。 本発明に係るクマリンの自動測定の第１手順の一例を示すフローチャート図。 励起スリットによる異性化時間の変化を示すグラフ。 本発明に係るクマリンの自動測定の第２手順の一例を示すフローチャート図。 フローセル内の洗浄開始からの経過時間による蛍光強度を示す洗浄時間の検討用グラフ。 本発明に係るクマリンの自動測定装置により、クマリン１ｐｐｍにおける再現性とキャリーオーバーの測定結果を示し、（ａ）測定結果グラフ、（ｂ）３回測定の値。 クマリンの各濃度における測定結果を示し、（ａ）蛍光スペクトルグラフ、（ｂ）（ａ）のグラフに基づく検量線グラフ。 作業者の拘束時間と測定の全所要時間を算出した結果を示す表、（ａ）本発明に係るクマリンの自動測定装置を用いた場合、（ｂ）Ａ法を用いた場合。

以下、本発明に係るクマリンの測定方法及びクマリンの自動測定装置の好適な実施形態を、図１〜図１０に基づいて詳述する。

図１は、本発明に係るクマリンの測定に用いられるクマリンの自動測定装置の一実施形態を示す構成ブロック図である。図１を用いてクマリンの自動測定装置の構成を詳述する。

クマリンの自動測定装置１は、クマリンを含む試料に励起光を照射して放出された蛍光を測定し、励起波長に対する蛍光強度を示す励起スペクトルを取得する分光蛍光光度計１０と、クマリンを含む試料を配置する試料導入部１００とを備える。分光蛍光光度計１０は、光度計部２０と、光度計部２０内に配置され、光度計部２０をコントロールし試料を分析するデータ処理部３０と、入出力を行う操作部４０とを備える。

光度計部２０は、光源２１と、光源２１の連続光から分光して励起光を生成する励起側分光器２２と、励起側分光器２２からの光を分光するビームスプリッタ２３と、ビームスプリッタ２３で分光された一部の光の強度を測定するモニタ検知器２４と、試料から放出された蛍光を単色光に分光する蛍光側分光器２５と、単色の蛍光の電気信号を検知する検知器（蛍光検知器）２６と、励起側分光器２２の回折格子を駆動する励起側パルスモータ２７と、蛍光側分光器２５の回折格子を駆動する蛍光側パルスモータ２８とを備える。さらに光度計部２０は、測定対象の試料を一時的に収納するフローセル（試料容器）５０を有する試料セル部５１を備えている。ビームスプリッタ２３からの励起光がフローセル５０に入射し、試料から放出された蛍光が蛍光側分光器２５に入射する。試料セル部５１は、ビームスプリッタ２３からの励起光が、適切に試料容器５０に入射可能なように、その位置が調整可能であってもよい。

データ処理部３０は、コンピュータ３１と、コンピュータ３１内に配置される中央処理部３２と、試料からの蛍光をデジタル変換するＡ／Ｄ変換器３３を備える。また、操作部４０は、操作者が、コンピュータ３１の処理に必要な入力信号を入力する操作パネル４１と、コンピュータ３１により処理された各種分析結果を表示する表示装置４２と、操作パネル４１及び表示装置４２とコンピュータ３１とを連結するインターフェース４３とを備える。

操作者が操作パネル４１により入力した測定条件に応じて、コンピュータ３１が励起側パルスモータ２７に信号を出力し、励起側パルスモータ２７が駆動して励起側分光器２２が目的の波長位置に設定される。また、同じく測定条件に応じて、コンピュータ３１が蛍光側パルスモータ２８に信号を出力し、蛍光側パルスモータ２８が駆動して蛍光側分光器２５が目的の波長位置に設定される。励起側分光器２２、蛍光側分光器２５は、所定のスリット幅を持つ回折格子やプリズムなどの光学素子を有しており、励起側パルスモータ２７、蛍光側パルスモータ２８を動力とし、ギヤやカム等の駆動系部品を介して光学素子を回転運動させることでスペクトル走査が可能となる。

励起スペクトルは、フローセル５０内の試料に対し、励起光の励起波長を変化させた際の蛍光強度を測定することにより得られるスペクトルである。励起側分光器２２が励起波長を測定開始波長から測定終了波長まで変化させ、各波長の励起光を試料に照射する。その時の固定波長に設定されている蛍光側分光器２５を経て特定波長の蛍光の変化を検知器２６が検出し、Ａ／Ｄ変換器３３を介してコンピュータ３１に信号強度として取り込まれる。コンピュータ３１（中央処理部３２）が、この信号強度を解析処理し、表示装置４２が表示可能なスペクトルを生成する。

試料の測定方法は以下の手順で行われる。光源２１からの連続光を励起側分光器２２で励起光として分光し、ビームスプリッタ２３を経てフローセル５０に導入された試料に照射される。この時、ビームスプリッタ２３で一部の分光された励起光は、モニタ検知器２４にて光量を測定し光源の変動の補正がなされている。試料から放出された蛍光は、蛍光側分光器２５にて単色光に分光され、検知器２６にて光を検出しＡ／Ｄ変換器３３を経てデータ処理部３０に信号強度として取り込まれ、表示装置４２にて測定結果が表示される。

中央処理部３２の指令によって、励起側パルスモータ２７が駆動することで、目的の波長位置に励起側分光器２２がセットされる。また、蛍光側分光器２５は、中央処理部３２の指令によって蛍光側パルスモータ２８が駆動することで、目的の波長位置にセットされる。励起側分光器２２や蛍光側分光器２５については、回折格子やプリズムなどの光学素子が用いられており、励起側パルスモータ２７や蛍光側パルスモータ２８を動力とし、ギヤとカムによって、それらを回転運動させることで任意の波長の測定を可能としている。

クマリン測定の際は、測定試料に対し、固定波長の３６０ｎｍの励起光を照射し、指定された５００ｎｍの蛍光波長の強度、または、蛍光側分光器２５にて、測定開始波長から測定終了波長まで変化させ波長毎の蛍光の変化を検知器２６で検出し、Ａ／Ｄ変換器３３を経てデータ処理部３０に信号強度として取り込まれ、表示装置４２にて測定結果が蛍光波長と蛍光強度の２次元の蛍光スペクトルから５００ｎｍの蛍光波長における強度を読み取る。

試料導入部１００は、試料が収納された複数の試験管１０１を配置するサンプルラック１０２と、試験管１０１内の試料を抽出するシリンジ１０３と、貯留タンク１０４と、ポンプ１１０と、廃液タンク１２０とを備えている。また、シリンジ１０３、ポンプ１１０、フローセル５０及び廃液タンク１２０は、それぞれ流路１３０で連結されている。

貯留タンク１０４は、流路１３０を洗浄するための洗浄液が貯留されている。本実施形態において、貯留タンク１０４には、第１タンク１０４ａ、第２タンク１０４ｂ、第３タンク１０４ｃ、第４タンク１０４ｄの４つのタンクが配置されているが、タンクの数等に限定しない。

測定後、ポンプ１１０が駆動してフローセル５０内の試料が廃液タンク１２０に送液される。そして、シリンジ１０３が貯留タンク１０４に移動して、貯留されている洗浄液を吸引して流路１３０を洗浄し、次の試料の測定に移る。例えば、第１タンク１０４ａの純水で流路１３０を大まかに洗浄し、第２タンク１０４ｂのアルカリ溶液でクマリンを溶かし、第３タンク１０４ｃの界面活性剤溶液でコンディショニングを行い、第４タンク１０４ｄのブランク溶液でコンディショニングを行う。即ち、シリンジ１０３を用いて流路１３０に、純粋と少なくともアルカリ溶液を含有するコンディショニング溶液とを流して当該流路１３０及びフローセル５０を洗浄する。

試料導入部１００は、一般的にオートサンプラーと称されている。シリンジ１０３が任意の試験管１０１の位置に移動し、サンプルラック１０２に設置された試験管１０１内の試料は、ポンプ１１０が駆動することで吸引される。ポンプ１１０は、例えば、しごきポンプ、シリンジポンプ等である。しごきポンプの場合、本実施形態において、ポンプ１１０はフローセル５０の前段に設置されているが、フローセル５０の後段に設置しても良い。

図２は、試験管のキャップを示す模式図で、（ａ）は振とう機で振とうしている状態、（ｂ）は密封キャップ、（ｃ）は穴付きキャップと穴付きキャップ押さえ機構、（ｄ）は穴付きキャップに穴付きキャップ押さえ機構を取り付けた状態を示す。図２に基づいて試験管とキャップの関係を説明する。

試料が収納された各試験管１０１は、サンプルラック１０２に設置される前、振とう機２００で撹拌が行われる。一般的な振とう機２００の場合、試験管１０１を密栓する必要があるため、試験管１０１の開口にキャップ２０１を取り付ける。キャップ２０１は、密封キャップ２０１ａ（図２（ｂ）参照）と、穴２１０を有する穴付きキャップ２０１ｂ（図２（ｃ）参照）とが選択されるが、試料導入部１００ではシリンジ１０３で試験管１０１上部より試料を採取するため、穴付きキャップ２０１ｂを使用する。

穴付きキャップ２０１ｂの穴２１０部分に切れ込み構造を持たせることで、シリンジ１０３外壁に付いた試料溶液や他の層の溶液がふき取り効果が得られ、クロスコンタミネーションのリスクを低下させることができる。

振とう機２００の振とう時に穴付きキャップ２０１ｂを使用する場合、穴付きキャップ押さえ機構２０２を振とう機２００の試験管ホルダー２０３に搭載することで、穴付きキャップ２０１ｂのまま振とう作業を実施することが可能となる。穴付きキャップ押さえ機構２０２は、穴付きキャップ２０１ｂの穴２１０と同一サイズの樹脂製（凸型）の押さえ部品２０４を有している。

穴付きキャップ押さえ機構２０２は、穴付きキャップ２０１ｂの穴２１０を塞ぐとともに当該穴付きキャップ２０１ｂを押さえつける役目をしている。押さえ部品２０４は支柱に装着され、バネやねじ込みにて試験管１０１の方向に力が加わる構造をしており、振とうによって試験管１０１内部の試料溶液が漏れないよう、十分な力で保持することが可能である。尚、図２（ａ）は、穴付きキャップ２０１ｂに穴付きキャップ押さえ機構２０２を設置した状態で振とう機２００による振とうを示している。

Ａ法に従い、試験管１０１内に試薬を分注し、振とう機２００での振とう後、各試験管１０１は、サンプルラック１０２内に静置される。静置された試験管１０１内の試料は、図３に示されるように３層の液層に分かれる。下層部より、アルカリ層１０５ａ、アルコール層１０５ｂ、ドデカン層１０５ｃとなる。ポンプ１１０を駆動させ、シリンジ１０３により最下層のアルカリ層１０５ａを吸引し、流路１３０を介して試料をフローセル５０に導入する。

図４は、本発明に係るクマリンの自動測定の第１手順の一例を示すフローチャート図である。図４に基づき、クマリンの第１の測定方法を説明する。

まず、Ａ法の前処理方法に従い、試験管１０１に試薬を規定量分取する（Ｓ１）。この時、あらかじめ、検量線溶液（例えば、０％、１０％、４０％、８０％）および未知試料をまとめて分取すると良い。次に、試験管１０１に密封キャップ２０１ａを装着して試験管１０１を密封する（Ｓ２）。そして、試験管１０１を密封後、振とう機２００で試験管１０１を振とうさせる（Ｓ３）。

次に、試料導入部１００ではシリンジ１０３で試験管１０１上部より試料を吸引するため、密封キャップ２０１ａを穴付きキャップ２０１ｂに交換する（Ｓ４）。次に、これらの試験管１０１及び貯留タンク１０４をサンプルラック１０２に設置する（Ｓ５）。

そして、システムを起動し、作業者はシステムの測定準備の条件設定を行う（Ｓ１０）。例えば、測定の予定本数、サンプルの名称、分光蛍光光度計１０の条件の設定などである。ここまでが作業者が行う作業であり、拘束される時間である。

システムが起動されると、流路１３０及びフローセル５０の洗浄であるコンディショニングが行われる（Ｓ１１）。クマリンから加水分解、異性化されたトランス−ｏ−ヒドロキシケイヒ酸ないしシリンジの壁に付着した軽油や灯油などが抽出されたドデカン層や有機物が抽出されたアルコール層の成分は、流路１３０や流路１３０の接合部、フローセル５０の壁面などに付着して、バックグラウンドの上昇を引き起こす可能性がある。測定と測定の合間の短期的には問題なくても、翌日や長期間休止後にシステム再起動した際、これらが溶出されメモリーとなってバックグラウンドの蛍光強度が上昇する。そこで、測定前のコンディショニングで仮に上記のメモリーが生じた際にも、コンディショニングをすることでメモリーを取り除き、バックグラウンドを正常な状態に引き下げることが可能である。

コンディショニングの後、シリンジ１０３はサンプルラック１０２内の指定された試験管１０１に移動し、試料の最下層部のアルカリ層１０５ａの位置まで降下し、ポンプ１１０が駆動してアルカリ層１０５ａを吸引して試料を採取し（Ｓ１２）、フローセル５０に試料を導入する。

フローセル５０内の試料は、紫外線３６０ｎｍの励起光照射により異性化される（Ｓ１３）。図５の励起光照射による異性化時間の変化を示すグラフから、励起側スリット幅が決まっていれば蛍光強度がピークになる（図５では横軸１２７秒）までの時間が決まることが理解できる。すなわち異性化が１００％まで達する時間は、クマリンの濃度に関わらず一定のため、特定のスリット幅に対して励起光を照射する時間は一義的に決定できる。異性化は、分光蛍光光度計１０の光源２１の強度によって時間が変わる。特に光源２１の強度は、励起側スリット幅（照射量）に左右されるため、目的のスリットに合わせ、蛍光強度の時間変化を測定することで異性化の時間を決定すると良い。なお、励起側のスリット幅が広すぎるとクマリンから加水分解、異性化されたトランス−ｏ−ヒドロキシケイヒ酸は分解されていくので留意が必要である。

異性化後の蛍光強度を取得する（Ｓ１４）。あらかじめ異性化時間を取得し、全てのシーケンスで同じ異性化時間を適用しても良いし、異性化中にこの蛍光強度の時間変化を取得し、強度が最大となったタイミングで蛍光強度の取得またはスペクトルの測定を開始しても良い。蛍光強度を取得した後、ポンプ１１０が駆動してフローセル５０内の試料を廃液タンク１２０に廃棄する（Ｓ１５）。その後、貯留タンク１０４内の第１タンク１０４ａの純水にて流路１３０及びフローセル５０内を洗浄する（Ｓ１６）。Ｓ１２〜Ｓ１６までのステップを試験管１０１の予定測定本数まで繰り返す（Ｓ２０でＮｏ）。予定本数が終了すると（Ｓ２０でＹｅｓ）、Ｓ１１と同じ内容でコンディショニングを実施する（Ｓ１７）。測定後のコンディショニングはメモリーを抑制するために効果的である。そして、流路１３０の洗浄を行い（Ｓ１８）、当該洗浄工程が終了するとシステムの終了となる（Ｓ１９）。

図６は、本発明に係るクマリンの自動測定の第２手順の一例を示すフローチャート図である。図６に基づき、クマリンの第２の測定方法を説明する。第２の測定方法と第１の測定方法の異なる点は、密封キャップ２０１ａを装着しないことであり、作業者の手順および拘束時間が相違する。

まず、Ａ法の前処理方法に従い、試験管１０１に試薬を規定量分取する（Ｓ１）。この時、あらかじめ、検量線溶液（例えば、０％、１０％、４０％、８０％）および未知試料をまとめて分取すると良い。次に、試料の入った試験管１０１に穴付きキャップ２０１ｂを装着し、穴付きキャップ２０１ｂの穴２１０を穴付きキャップ押さえ機構２０２で押さえて試験管１０１を密封する（Ｓ２２）。試験管１０１を密封後、振とう機２００で試験管１０１を振とうさせる（Ｓ３）。振とう後、振とう機２００から試験管１０１を取り外し、穴付きキャップ押さえ機構２０２を試験管１０１から取り外す。

次に、これらの試験管１０１及び貯留タンク１０４をサンプルラック１０２に設置する（Ｓ５）。そして、第１の自動測定手順同様システムを起動し（Ｓ１０）、自動分析装置にて測定を行う。システム起動（Ｓ１０）からの手順は、クマリンの第１の測定方法と同一であるため説明を省略する。

ここでコンディショニングに用いるコンディショニング溶液とコンディショニングの手順について詳述する。

クマリンから加水分解、異性化されたトランス−ｏ−ヒドロキシケイヒ酸はアルカリ溶液に易溶である。ドデカンには不溶であるため、ドデカンを洗浄液に用いることは本来好ましくない。軽油や灯油などが抽出されたドデカン層や有機物が抽出されたアルコール層の成分は、界面活性剤に易溶である。また、ブランク溶液のアルカリ層は、アルコールとドデカンがわずかに溶解しており、実際に試料が溶解している系になるので流路１３０の最終的なコンディショニングに用いることが理想である。

これらを考慮し、これまでの実験より、第１タンク１０４ａには純水、第２タンク１０４ｂにはアルカリ溶液、第３タンク１０４ｃには界面活性剤溶液、第４タンク１０４ｄにはブランク溶液の各洗浄液が貯留してあることが望ましい。貯留は、測定前に行うことが望ましい。

第１タンク１０４ａの純水は流路１３０の洗浄用であり、物理的に大まかな洗浄の作用がある。

第２タンク１０４ｂのアルカリ溶液は、コンディショニング溶液用であり、流路１３０内のクマリンを溶かす作用がある。例えば、１Ｌ（リットル）の純水中に水酸化ナトリウム１００ｇ、硝酸ナトリウム２００ｇを含有する。

第３タンク１０４ｃの界面活性剤溶液は、コンディショニング溶液用であり、主に流路１３０内の有機物を取り除く作用がある。例えば、１Ｌの純水中に、高級アニオン系界面活性剤１％以下（例えば、アルキルベンゼンスルホン酸、アルコールエーテル硫酸塩）、非イオン系界面活性剤１％以下（例えば、アルコールエトキシレート）、水酸化カリウム０．５〜２．０％を含有する。これを５〜１０倍希釈して使用する。

第４タンク１０４ｄのブランク溶液は、コンディショニング溶液用であり、流路１３０内の洗浄において共洗い的な作用がある。例えば、１Ｌの洗浄液（アルカリ溶液）に、アルコール液８０ｇ以下（１−ブタノールとエタノールが４：３の比率で含有）、ドデカン１ｇ／Ｌ以下を含有する。温度によって分離することがあるため、下層のアルカリ溶液を用いる。このアルカリ溶液には、アルコールおよびドデカンが飽和状態で含まれることとなる。

コンディショニングの順番としては、第１タンク１０４ａの純水にて流路１３０洗浄をした後、第２タンク１０４ｂ、第３タンク１０４ｃ、第４タンク１０４ｄのそれぞれの洗浄液で順番に流路１３０内の溶液が十分に入れ替わるまで行うことが望ましい。止むを得ない理由で洗浄の順番が変わっても構わないが、最終的に実際に試料が溶解している系と同じ状態でコンディショニングを終了したほうが次の測定への影響が最小限となるため、第４タンク１０４ｄの洗浄液を最後にすると良い。洗浄時間はポンプ１１０の送液速度、配管体積にもよるが、図７に示すように洗浄液を導入に併せて蛍光強度を観測し、十分蛍光強度が下がる時間を適用しても良い。

コンディショニングに複数の洗浄液を使用するため煩雑でありコンディショニング時間も所要する。そのため、合成コンディショニング溶液として第２タンク１０４ｂの洗浄液に単一のコンディショニング溶液を用いても良い。合成コンディショニング溶液は、ブランク溶液に界面活性剤を５〜１０％の濃度になるように調整した洗浄液が望ましい。この合成コンディショニング溶液は、ブランク溶液であるドデカンとアルコール溶液、アルカリ溶液の３種類の溶媒と界面活性剤から構成され、その最下層のアルカリ溶液部分のみを使用する。この調整は煩雑であるため、さらに簡易的に行いたい場合は、アルカリ系の界面活性剤をアルコール溶液に５〜１０％の濃度になるように調整することで代用も可能である。そして、流路１３０を洗浄する場合、アルカリ溶液に加えて界面活性剤溶液と、少なくともアルコールを含有するブランク溶液とを含有するコンディショニング溶液と、純粋のみで行うことにより、洗浄のステップを簡略化することができる。

図８は、本発明に係るクマリンの自動測定装置１により、クマリン１ｐｐｍにおける再現性とキャリーオーバーの測定結果を示し、（ａ）は測定結果グラフ（上側がクマリン、下側がブランク）、（ｂ）は３回測定の値である。キャリーオーバーがないとは、３回測定しても汚れが持ち越されることがないことを意味する。また、３回の測定は、流路１３０にクマリン１ｐｐｍとブランク溶液を流し、フローセル５０内における相対強度を交互に測定した。即ち、（ｂ）表のＮｏ．１−１〜３−２の順で測定している。

測定の結果、クマリン１ｐｐｍは、最大強度と最低強度の差が１．６８であり良好な結果であった。フローセル５０内では常に均一の照射条件及び照射時間で紫外線照射される。Ａ法で懸念される紫外線照射条件及び時間のばらつきの影響を受けないため、良好な再現性が得られている。また、ブランク溶液についても全くぶれがなく良好な結果であった。

図９は、クマリンの各濃度における測定結果を示し、（ａ）は蛍光スペクトルを示すグラフ、（ｂ）は（ａ）のグラフに基づく検量線グラフである。（ａ）のグラフにおける四つのスペクトルのそれぞれの％が（ｂ）のグラフの横軸に対応し、（ａ）のそれぞれのスペクトルのピークの強度が（ｂ）のグラフの縦軸に対応する。各グラフは、自動測定装置１にて測定した０％、１０％、４０％、８０％及び１２０％のクマリン標準液の蛍光スペクトルおよび検量線を示している。

検量線は決定係数（Ｒ２）０．９９９９６（１に近いほどよい）と良好な結果が得られていることが分かる。この検量線と図８で測定したブランクの測定再現性より求めた検出限界（３σ）は、クマリン分として０．００６％、定量限界（１０σ）は０．０２％であった。本発明のクマリンの自動測定装置１は、低濃度領域も安定して測定できることが分かる。

図１０に図４示したクマリンの第１の測定方法により算出した作業者（オペレーター）の拘束時間と測定の全所要時間を算出した結果を示す。比較のため、Ａ法においても作業者の拘束時間と測定の全所要時間を算出した（図１０（ｂ））。Ａ法は全ての工程で作業者が作業する必要があるため、拘束時間と所要時間な同じ時間となる。

試験管１０１の処理件数を１００本とした場合、Ａ法は拘束時間（所要時間）２４７分（約４時間）であった。一方、本発明のクマリンの自動測定装置１における拘束時間は１２７分（約２時間）であった。およそ５０％の省力化が計られた。フローセル５０への試料の導入や洗浄があることから全体の所要時間は１．５倍の３７７分となるが、作業者が拘束される時間が大幅に減少される。また、クマリンの第２の測定方法の方が、拘束時間はより短くなる。以上により、本発明のクマリンの自動測定装置１及びクマリンの測定方法を適用することで、石油製品中に含まれるクマリン測定において、従来課題とされていた点について、作業者の少ない拘束時間でかつ効率良く多数の試料の測定が可能となった。

尚、本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、適宜、変形、改良、等が可能である。その他、上述した実施形態における各構成要素の材質、形状、寸法、数値、形態、数、配置箇所、等は本発明を達成できるものであれば任意であり、限定されない。

本発明に係るクマリンの測定方法及びクマリンの自動測定装置は、作業者の少ない拘束時間でかつ効率良く多数の試料の測定を望む分野に適用可能である。

１ クマリンの自動測定装置
１０ 分光蛍光光度計
２０ 光度計部
２１ 光源
２２ 励起側分光器
２３ ビームスプリッタ
２４ モニタ検知器
２５ 蛍光側分光器
２６ 検知器
３０ データ処理部
３１ コンピュータ
３２ 中央処理部
４０ 操作部
５０ フローセル
５１ 試料セル部
１００ 試料導入部
１０１ 試験管
１０２ サンプルラック
１０３ シリンジ
１０４ 貯留タンク
１０４ａ〜１０４ｄ 第１タンク〜第４タンク
１１０ ポンプ
１２０ 廃液タンク
１３０ 流路
２００ 振とう機
２０１ キャップ
２０１ａ 密封キャップ
２０１ｂ 穴付きキャップ
２０２ 穴付きキャップ押さえ機構

Claims (8)

1. クマリンを含む試料に励起光を照射して放出された蛍光を測定し、励起波長に対する蛍光強度を示す励起スペクトルを取得する分光蛍光光度計を用いて、前記試料に含まれるクマリンの量を測定する方法であって、
   シリンジを用いて試験管内の前記試料を採取し、当該試料を所定の流路に流して前記励起光を照射し、
   前記シリンジを用いて前記流路に、純水と、少なくともアルカリ溶液を含有するコンディショニング溶液とを流して当該流路を洗浄する、
   クマリンの測定方法。
2. 請求項１に記載のクマリンの測定方法であって、
   さらに界面活性剤溶液と、少なくともアルコールを含有するブランク溶液を前記流路に流す、クマリンの測定方法。
3. 請求項２に記載のクマリンの測定方法であって、
   前記ブランク溶液がさらにドデカンを含有する、クマリンの測定方法。
4. 請求項１に記載のクマリンの測定方法であって、
   前記コンディショニング溶液が、前記アルカリ溶液に加えて界面活性剤溶液と、少なくともアルコールを含有するブランク溶液とを含有する合成コンディショニング溶液であり、
   前記純水と、前記合成コンディショニング溶液のみによって前記流路を洗浄する、
   クマリンの測定方法。
5. 請求項１に記載のクマリンの測定方法であって、
   前記試料を試験管に入れた後に当該試験管の開口に穴付きキャップを取り付け、
   前記穴付きキャップの穴を塞ぐとともに当該穴付きキャップを押さえつける穴付きキャップ押さえ機構を取り付け、
   前記穴付きキャップ押さえ機構を取り付けた試験管を振とう機を用いて振とうし、
   前記振とう機から前記試験管を取り外し、
   前記穴付きキャップ押さえ機構を前記試験管から取り外し、
   前記シリンジを用いて前記試験管から前記試料を採取する、
   クマリンの測定方法。
6. 試料に含まれるクマリンの量を測定するクマリンの自動測定装置であって、
   前記試料に励起光を照射して放出された蛍光を測定し、励起波長に対する蛍光強度を示す励起スペクトルを取得する分光蛍光光度計と、
   試験管内の試料を採取し、採取した前記試料に励起光を照射可能な領域を通過する所定の流路に流すためのシリンジと、
   純水と、少なくともアルカリ溶液を含有するコンディショニング溶液を貯留する少なくとも二つの貯留タンクと、を備え、
   前記シリンジは、前記二つの貯留タンクから前記純水と前記コンディショニング溶液を採取して前記流路に流す、
   クマリンの自動測定装置。
7. 請求項６に記載のクマリンの自動測定装置であって、
   界面活性剤溶液と、少なくともアルコールを含有するブランク溶液を貯留する他の二つの貯留タンクを更に備え、
   前記シリンジは、前記他の二つの貯留タンクから前記界面活性剤溶液と前記ブランク溶液を採取して前記流路に流す、クマリンの自動測定装置。
8. 請求項６または７に記載のクマリンの自動測定装置であって、
   前記試料を試験管に入れた後に当該試験管の開口に取り付けられる穴付きキャップと、
   前記穴付きキャップの穴を塞ぐとともに当該穴付きキャップを押さえつける穴付きキャップ押さえ機構と、
   前記穴付きキャップ押さえ機構を取り付けた試験管を振とうする振とう機と、を更に備え、
   前記振とう機から前記試験管を取り外し、前記穴付きキャップ押さえ機構を前記試験管から取り外した後、前記シリンジが前記試験管から前記試料を採取する、
   クマリンの自動測定装置。

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