JP6472808B2 - Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、医薬品の技術分野に属し、具体的には、重量平均分子量が４．５〜９ｋＤのＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン及びその薬学的に許容可能な塩、該Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン又はその薬学的に許容可能な塩を含んでなる薬物組成物、該Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン及びそれを含んでなる薬物組成物の製造方法、及び該薬物組成物を用いて得られる血栓症の治療薬及び／又は予防薬に関する。

フコシル化グリコサミノグリカン（Ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ、以下、「ＦＧＡＧ」と称する場合がある）は、棘皮動物の体壁から得られ、硫酸化フコースによって側鎖が置換されているグリコサミノグリカンの誘導体である。異なる棘皮動物又は異なる方法で得られたＦＧＡＧは、化学組成において共通点があると共に相違点もある。

由来が異なるＦＧＡＧは、共通点として、主に単糖構成がＤ−２−アセタミド−２−デオキシガラクトース（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ）、Ｄ−グルクロン酸（Ｄ−ＧｌｃＵＡ）、Ｌ−フコース（Ｌ−Ｆｕｃ）、及びこれらの硫酸エステルを含むことが挙げられる。そのうち、Ｄ−ＧｌｃＵＡとＤ−ＧａｌＮＡｃは、β−（１−３）及びβ−（１−４）グリコシド結合が交互に連結してグリコサミノグリカンの主鎖を形成し、Ｌ−Ｆｕｃが側鎖の形で主鎖に連結する構成になっている（Ｒｉｃａｒｄｏ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ，１９８８，２６３（３４）：１８１７６。 Ｋｅｎｉｃｈｉｒｏ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，１９９２，３３（３４）：４９５９）。

由来が異なるＦＧＡＧは、構造上の相違点として、主にＬ−Ｆｕｃの硫酸化度と位置が異なり、並びに主鎖の硫酸化度と位置が異なるといったことが挙げられる。現在、硫酸基を用いてＦＧＡＧのフコース側鎖を置換することが報告されているが、その多くは比較的、複雑な構成になっている。例えば、マナマコ（Ｓｔｉｃｈｏｐｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａｓ）に由来のＦＧＡＧは、主に３種類のＬ−Ｆｕｃを含み、すなわち、２，４−ジ硫酸エステル（Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ）、４−ジ硫酸エステル（Ｆｕｃ４Ｓ）及び３，４−ジ硫酸エステル（Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ）を含み，且つＦｕｃ２Ｓ４ＳがＬ−Ｆｕｃ総量の約６０％を占め、また、主鎖におけるＤ−ＧａｌＮＡｃも主に４，６−ジ硫酸エステルである（ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ）（Ｋｅｎｉｃｈｉｒｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９２，３３：４９５９）。また、ニセクロナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｌｅｕｃｏｓｐｉｌｏｔａ）に由来のＦＧＡＧについては、Ｌ−Ｆｕｃの種類が不明であるが、主鎖におけるＤ−ＧａｌＮＡｃが４−硫酸エステル基を含む（ＧａｌＮＡｃ４Ｓ）（樊絵曾ら，薬学学報，１９８３，１８（３）：２０３）。また、ブラジルナマコ（Ｌｕｄｗｉｇｏｔｈｕｒｅａ ｇｒｉｓｅａ）に由来のＦＧＡＧは、Ｌ−ＦｕｃにおけるＦｕｃ４Ｓの含有量が最も高く（〜４９％）、それ以外、Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ（〜２０％）、−３Ｓ４Ｓ（〜１７％）及び硫酸エステル基非置換のＬ−Ｆｕｃ（Ｆｕｃ０Ｓ）を含み、更に、Ｄ−ＧａｌＮＡｃ主鎖の種類としては、ＧａｌＮＡｃ６Ｓ（〜５３％）、−４Ｓ６Ｓ（〜１２％）和−４Ｓ（３１％）（ＬｕｂｏｒＢ．ｅｔａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００７，２８２：１４９８４）である。また、バイカナマコ（Ｔｈｅｌｅｎａｔａ ａｎａｎａｓ）に由来のＦＧＡＧは、Ｌ−Ｆｕｃの種類としてＦｕｃ２Ｓ４Ｓ（〜５３％）、−４Ｓ（〜２２％）、−３Ｓ（〜２５％）を含み、構成要素としてのＤ−ＧａｌＮＡｃが主にＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ（〜９５％）及び−６Ｓ（〜５％）（ＷｕＭ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍ．，２０１２，８７（１）：８６２）である。そして、メキシコナマコ（Ｉｓｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓ ｂａｄｉｏｎａｔｕｓ）に由来のＦＧＡＧは、Ｌ−Ｆｕｃが主にＦｕｃ−２Ｓ４Ｓ（〜９６％）であり、クロナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｖａｇａｂｕｎｄａ）に由来のＦＧＡＧは、Ｌ−Ｆｕｃの種類としてブラジルナマコに似ており、ノルウェーマナマコ（Ｓｔｉｃｈｏｐｕｓ ｔｒｅｍｕｌｕｓ）に由来のＦＧＡＧは、Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ（〜５３％）、−２Ｓ４Ｓ（〜２２％）及び−４Ｓ（〜２５％）を含む（Ｃｈｅｎ ＳＧ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍ．，２０１１，８３（２）：６８８）。

ナマコから得られるＦＧＡＧは、何れも高い抗凝固活性を示し（張佩文，中国薬理学と毒理学雑誌，１９８８，２（２）：９８；Ｐａｕｌｏ ＡＳ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，２７１：２３９７３）、天然由来のＦＧＡＧも血小板凝集に対する誘導活性（Ｊｉａｚｅｎｇ Ｌ．ｅｔ ａｌ，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓ，１９８８，５４（３）：４３５；単春文，薬理と臨床，１９８９，５（３）：３３）及び第ＸＩＩ因子を活性化する接触活性を示すことが知られている（Ｒｏｂｅｒｔｏ Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．，２０１０，１０３：９９４）。また、マナマコ由来のＦＧＡＧを解重合することにより得られたＤＨＧは、血小板凝集を弱める効果がある（Ｈｉｄｅｋｉ Ｎ．ｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９５，８５（６）：１５２７）。

ナマコ由来のＦＧＡＧの抗凝固活性について検討を行った結果、ＦＧＡＧが薬理作用機序においてヘパリン、デルマタン硫酸と異なり、例えば、ＦＧＡＧが第Ｘ因子活性化複合体に対して強い阻害活性を示すと共に、内因系第Ｘ因子活性化複合体による第Ｘ因子の活性化を阻害することができ、更に、ＡＴＩＩＩとＨＣＩＩに依存する抗トロンビン活性、第ＩＩａ因子を介する第ＸＩＩＩ因子の活性化フィードバックを阻害する活性（Ｈｉｄｅｋｉ Ｎ．，１９９５）、第ＸＩＩ因子の活性化を促進する活性（Ｒｏｂｅｒｔｏ Ｊ．２０１０）を示すことが実証されている。通常、薬理作用機序に特異性がないと、抗凝固薬物は副作用として出血傾向を示す場合があるため（Ｂａｕｅｒ，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００６，（１）：４５０）、薬理学標的に対するＦＧＡＧの選択性を高めるのが出血傾向の低減に有利である。

薬理学標的に対する天然由来のＦＧＡＧの選択性を高めるに当たって、その化学構造を変えることが１つの有効な手段であり、例えば、過酸化処理による天然ＦＧＡＧの解重合（欧州特許公開ＥＰ０４０８７７０号，Ｋｅｎｉｃｈｉｒｏ Ｙ，１９９２）、脱硫酸化やカルボキシ基の還元（Ｐａｕｌｏ ＡＳ ｅｔａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１，１０２：１６７）、酸処理による部分的加水分解（Ｙｕｔａｋａ Ｋａｒｉｙａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２００２，１３２：３３５。Ｐａｕｌｏ ＡＳ ｅｔａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１，１０２：１６７）等が挙げられる。現在、天然ＦＧＡＧの分子量を下げることにより、例えば、血小板凝集に対する促進活性、ＡＴＩＩＩ及びＨＣ−ＩＩに依存の抗トロンビン活性を弱化する等、その薬理特性を変えるのが一般に行われている（樊絵曾ら，生化学雑誌，１９９３，９（２）：１４６； 馬西，中華血液学雑誌，１９９０，１１（５）：２４１。Ｐａｕｌｏ ＡＳ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，２７１，２３９７３； Ｈｉｄｅｋｉ Ｎａｇａｓｅ ｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９５，８５（６）：１５２７）。しかし、単に解重合することで抗凝固特性と標的特異性を両立させた抗凝固産物を得ることは困難である。例えば、マナマコに由来のＦＧＡＧの重量平均分子量（Ｍｗ）を約９ｋＤとした場合、血小板凝集に対する促進活性を弱めることができるが（樊絵曾ら，生化学雑誌，１９９３，９（２）：１４６）、適宜な抗凝固活性を示す解重合産物のＭｗは約１２〜１５ｋＤａの範囲である（Ｎａｇａｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ，１９９７，７７（２）：３９９； Ｋａｚｕｈｉｓａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，２００３，６３：１５４８； Ｓｈｅｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００６，１０７（１０）：３８７６； 趙金華ら，ＣＮ１０１７２４０８６Ａ）。側鎖フコースの加水分解及び部分的脱硫酸化は、何れもＦＧＡＧの抗凝固活性を大きく低下させ、若しくは失活させることができる。一方、カルボキシ基の還元は抗凝固活性に目立った影響を与えないが、出血傾向が目立ち、且つ血小板活性に一定程度の影響を与える可能性がある（Ｐａｕｌｏ ＡＳ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１９９８，１０１：６４７； Ｐａｕｌｏ ＡＳ ｅｔ ａｌ．，ＴｈｒｏｍｂＲｅｓ．２００１，１０２：１６７）。

本発明者は、ナマコに由来のＦＧＡＧの抗凝固活性において構造活性相関関係に注目しつつ、ＦＧＡＧの解重合方法について鋭意検討を行い、例えば、遷移金属イオンを触媒として過酸化処理による解重合法、β−脱離処理による解重合方法、脱アセチル化・脱アミノ化による解重合方法等を確立した（趙金華ら、ＣＮ１０１７３５３３６Ｂ； ＣＮ１０３１４５８６８Ａ； ＣＮ１０３２１４５９１Ａ）。そのうち、過酸化処理による解重合法は、解重合反応の効率と反応進行に対する制御性を高めることができ、β−脱離処理による解重合方法や脱アセチル化・脱アミノ化による解重合方法は、特殊な還元性又は非還元性を有する末端糖残基を得ることができると同時に、産物の品質制御性を著しく高めることができる。更に、本発明者は、ＦＧＡＧの構成断片及び化学置換基（例えば、Ｄ−β−ＧｌｃＵＡに含まれるカルボキシ基、Ｄ−β−ＧａｌＮＡｃに含まれるアセチルアミノ基等）の構造変性法、並びに、関連構造変性体の構造活性相関関係についても鋭意検討を行った結果（劉吉開ら，ＣＮ１０２５５８３８９Ａ； 趙金華ら、ＣＮ１０２２４７４０１Ａ； Ｚｈａｏ Ｌ．ｅｔ ａｌ．ＣａｒｂｏｈｙｄｒＰｏｌｙｍ．２０１３，（９８）：１５１４； Ｌｉａｎ Ｗ．ｅｔ ａｌ．ＢＢＡ，２０１３，１８３０：４６８１）、非特異的な脱硫酸エステル基以外、これらの構造変性法が何れもＦＧＡＧの主鎖及び側鎖の硫酸エステル化度と位置を変えることではできず、つまり、ＦＧＡＧの主鎖及び側鎖の硫酸化パターンが専らその天然由来によって決められることを実証した。

以上で述べたように、由来の異なるＦＧＡＧの主鎖及び側鎖の硫酸化パターンに比較的大きな差異がある。本発明者が実験検証を行ったところ、バイカナマコに由来のＦＧＡＧの特徴として血小板促進活性が弱く（趙金華ら、ＣＮ１０１７２４０８６Ａ； Ｗｕｅｔ ａｌ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．２０１０（１２２）７１６）、一方、Ｌ−Ｆｕｃ側鎖における硫酸エステル基の置換パターンが比較的に複雑であるため（Ｍｉｎｇｙｉ Ｗ．，２０１０； Ｚｈａｏ Ｌ．，２０１３； Ｌｉａｎ Ｗ．，２０１３）、解重合産物の構造確定、化学構造の均一性分析等の質量分析が困難であることが分かった。Ｉ．ｂａｄｉｏｎａｔｕｓに由来のＦＧＡＧのＬ−Ｆｕｃ側鎖が主にＦｕｃ２Ｓ４Ｓであることが知られ（〜９６％，Ｃｈｅｎ ＳＧ，２０１１）、これはＦＧＡＧ類化合物の構造研究に有益であるが、Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓの構造とＦＧＡＧの第ＸＩＩ因子促進活性が関連性を示すため（Ｒｏｂｅｒｔｏ Ｊ．２０１０）、側鎖が主にＦｕｃ２Ｓ４ＳであるＦＧＡＧの実用化に制限がある。

ハネジナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｓｃａｂｒａ）の多糖体については既に研究報告があるが、総多糖体の製造方法と活性の初期検討（瀋鳴ら，中国海洋薬物，２００３，９１（１）：１）、酸性ムコ多糖の初期的な理化学特性分析（陳健ら，食品与発酵工業，２００６，３２（１０）：１２３）及び抽出方法の検討（鄭艾初ら，現代食品科学技術，２００７，２３（５）：６５）に限られる。本発明者は、一連のナマコに由来のＦＧＡＧについて研究検討を行い、ハネジナマコの多糖体がＦＧＡＧに限らず、更に、構造と重合度が異なる幾つかの酸性フコイダン（Ｆｕｃａｎ ｓｕｌｆａｔｅ）、及びグリコーゲン類似構造を有する中性多糖を含むことを実証した。酸性フコイダン及び中性多糖は、ＦＧＡＧに近似する分子量を有するため、既に開示されている多糖類成分がハネジナマコ由来のＦＧＡＧに限らないことが考えられる。

多糖類の化学構造解析は技術面から言って一定の難度があるため、本発明者は、糖質化学分析、酵素学分析、特殊な誘導体の製造技術及びそのスペクトル分析技術を統合的に利用してハネジナマコ由来のＦＧＡＧの化学構造を分析し、ハネジナマコ由来のＦＧＡＧが非常に特別な化学構造特徴を有し、すなわち、そのＬ−Ｆｕｃ側鎖が主にα−Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓである（全側鎖置換基の７５％以上を占める）ことを見出した。ＮＭＲスペクトル及び微細構造の解析から、ハネジナマコ由来のＦＧＡＧの繰り返し構造単位が、例えば、上述のマナマコ、ブラジルナマコ（Ｌ．ｇｒｉｓｅａ）、バイカナマコ等といった数種のナマコに由来のＦＧＡＧの繰り返し構造単位に比べて規則性があるのが確認でき、このような化学構造の規則性はその実用化に有利であると認められる。

一方、ポリリン酸、ＲＮＡ断片、エンドトキシン、過硫酸化コンドロイチン硫酸等といった様々なポリアニオン性物質は、第ＸＩＩ因子の活性化（接触活性化）を促進することができる（Ｍａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．２０１０，８（５）：８６５）。フコース側鎖の硫酸エステル化度の比較的高いＦｕｃ２Ｓ４Ｓ構造がＦＧＡＧの第ＸＩＩ因子促進活性に寄与すると報告があることから（Ｒｏｂｅｒｔｏ Ｊ．，２０１０）、Ｌ−Ｆｕｃ側鎖における硫酸エステル基の負電荷量がＦＧＡＧと第ＸＩＩ因子活性化の相互関係において極めて重要な構造特徴であると注目されつつある。しかしながら、驚くべきことに、本発明者による比較試験から、ハネジナマコ由来のＦＧＡＧ主側鎖が何れも比較的大きい負電荷量を帯びているが（その主鎖におけるβ−Ｄ−ＧａｌＮＡｃが主に４，６−ジ硫酸エステル基によって置換され、α−Ｌ−Ｆｕｃ側鎖にしても７５％以上が３，４−ジ硫酸エステル基によって置換されている）、プロトタイプと解重合産物の第ＸＩＩ因子促進活性が既知のナマコに由来のＦＧＡＧにおいて最も弱いという現象を確認した。

本発明者は、自ら開発した技術を用いて（趙金華ら、ＣＮ１０１７３５３３６Ａ； ＣＮ１０３１４５８６８Ａ； ＣＮ１０３２１４５９１Ａ）ハネジナマコ由来のＦＧＡＧの解重合誘導体を製造し、更に実験検討を行ったところ、他の数種のナマコに由来のＦＧＡＧ解重合産物に比べ、ハネジナマコ由来のＦＧＡＧの解重合産物が、例えば、Ｍｗが約５〜８ｋＤである場合に第Ｘ因子活性化複合体に対する阻害活性が最も強く、Ｍｗが約５ｋＤである場合に最も強いＨＣＩＩに依存の抗トロンビン活性を示す等、より低い分子量で（Ｍｗが約４．５〜９ｋＤ）強い抗凝固活性を示すという驚きの研究結果を得た。そして、本発明者は、グリーフェーナマコ（Ｐ．ｇｒａｅｆｆｅｉ）から側鎖が主にＬ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓであり且つ構造が類似するＦＧＡＧ類化合物を抽出精製し、前記本発明者が確立した技術を用いて解重合産物を得た後、その解重合産物がハネジナマコ由来のＦＧＡＧの解重合産物に近似した抗凝固活性、並びに、第ＸＩＩ因子と血小板にさほど影響のない特性を示すことを見出した。

単に電荷量でなく、Ｌ−Ｆｕｃ側鎖の硫酸エステル化パターンによってＦＧＡＧ及びその誘導体の薬理特性が影響されることが既に知られている。側鎖が主にＬ−Ｆｕｃ３Ｓ４ＳであるＦＧＡＧの解重合産物がより規則性のある繰り返し構造単位を有し、しかも抗凝固においてもより特異的な薬理特性を示している。

血栓症は人々とって１つの致死性病因であり、抗凝固薬物による治療が血栓症の予防と臨床治療において重要な役割を果たしている。現在、血栓症の臨床治療においてヘパリン類薬物が主に使われているが、出血リスクが高いといった欠陥を抱えている。ヘパリン類薬物による出血リスクは、広範囲に亘って凝固因子に対する影響及び血液凝固カスケードの共通経路に対する阻害作用が起因となり、第Ｘ因子活性化複合体とＨＣＩＩに依存の抗第ＩＩａ因子活性作用が抗凝固成分の出血リスクの低下に有効であると考えるようになっている。

ハネジナマコ、グリーフェーナマコ等のナマコに由来し、且つ側鎖が主にＬ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓである低分子グリコサミノグリカンは、強い抗凝固活性を示し、その抗凝固機構として第Ｘ因子活性化複合体とＨＣＩＩに依存の第ＩＩａ因子活性化に対する阻害作用が挙げられる。一方、側鎖が主にＬ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓである低分子グリコサミノグリカンは、繰り返し構造単位がより規則的であり且つ抗凝固においてもより特異的な薬理特性を示すため、血栓症の予防と臨床治療への実用化が期待されつつである。

本発明は、重量平均分子量（Ｍｗ）が４．５〜９ｋＤであるＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン及びその薬学的に許容可能な塩、前記Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン又はその薬学的に許容可能な塩を含む薬物組成物、Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン及びその薬物組成物の製造方法、並びに、前記Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン及びその薬物組成物を用いて得られる血栓症の治療薬及び／又は予防薬を提供することをその目的とする。

本発明の第１の目的は、Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物及びその薬学的に許容可能な塩を提供し、前記Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物は、下記式（Ｉ）に示す構造を有する低分子グリコサミノグリカン混合物である。
［式（Ｉ）中、環Ａは、β−Ｄ−グルクロン酸基又はそのカルボキシ基を還元して得られるβ−Ｄ−グルコシル基（β−Ｄ−ＧｌｃＵＡ又はβ−Ｄ−Ｇｌｃ）である。そのうち、Ｒ_１が−ＣＯＯ⁻、−ＣＨ_２ＯＨ、−ＣＯＲ_１０であり、Ｒ_１０が各自独立して直鎖状又は分岐状の置換又は非置換のＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ７〜Ｃ１２のアラルキル基である。
環Ｂは、置換のβ−Ｄ−２−アミノ−２−デオキシ−ガラクトシル基（β−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ）である。そのうち、Ｒ_２が−ＣＯＣＨ_３又は−Ｈであり、Ｒ_３及びＲ_４が各自独立して−Ｈ又は−ＳＯ_３ ⁻である。
環Ｃは、硫酸エステル化されるα−Ｌ−フコシル基（α−Ｌ−Ｆｕｃ）である。そのうち、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７が各自独立して−Ｈ又は−ＳＯ_３ ⁻であり、モル比でＲ_５が−Ｈ、Ｒ_６及びＲ_７が−ＳＯ_３ ⁻であるα−Ｌ−フコシル基（α−Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ）が全α−Ｌ−フコシル基において７５％以上を占める。
Ｒ_８は、下記式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）に示す構造を有する置換基である。
式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）中、環Ａは、β−Ｄ−グルクロン酸基又はそのカルボキシ基を還元して得られるβ−Ｄ−グルコシル基（β−Ｄ−ＧｌｃＵＡ又はβ−Ｄ−Ｇｌｃ）であり、環Ａ’は、夫々４−デオキシ−スレオ−ヘキサ−４−エンピラノシルウロン酸基（ΔＵＡ）であり、式中のＲ_１は、上記と同じである。
環Ｃは、α−Ｌ−フコシル基（α−Ｌ−Ｆｕｃ）であり、そのうち、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７は、上記と同じである。
Ｒ_９は、下記式（ＩＶ）、式（Ｖ）又は式（ＶＩ）に示す構造を有する置換基である。
式（ＩＶ）、（Ｖ）及び（ＶＩ）中、Ｂは、置換基を有するＤ−２−アミノ−２−デオキシ−ガラクトシル基（α／β−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ）であり、Ｂ’は、置換基を有するＤ−２−アミノ−２−デオキシ−ガラクトース−３−イルのアルデヒド基還元物であり、その糖アルコール、グリコシルアミン又はＮ−置換のグリコシルアミン誘導体であり、Ｂ”は、置換基を有する２，５−脱水タロース残基（ａｎＴａｌ）又はその糖アルコール、グリコシルアミン又はＮ−置換のグリコシルアミン誘導体である。
そのうち、Ｒ_３及びＲ_４は、上記と同じであり、Ｒ_１１は、ヒドロキシ基、アミノ基、Ｃ１〜Ｃ６のアルキルアミノ基、Ｃ７〜Ｃ１２のアリールアミノ基であり、Ｒ_１２は、カルボニル基、ジヒドロキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、Ｃ１〜Ｃ６のアルキルアミノ基、Ｃ７〜Ｃ１２のアリールアミノ基である。
Ｒ_８が式（ＩＩＩ）に示す構造である場合、Ｒ_９は、式（ＩＶ）又は式（Ｖ）に示す構造を有し、Ｒ_９が式（ＶＩ）に示す構造である場合、Ｒ_８は、式（ＩＩ）に示す構造を有する。
ｎは、２〜２０の整数であり、且つモル比でｎが４〜９である化合物が全化合物において７５％以上を占める。］

上記式（Ｉ）で表される化合物において、モル比でα−Ｌ−フコース−３，４−ジ硫酸エステル基、すなわち、α−Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換基がＬ−フコシル基全体において７５％以上を占める。

前記低分子グリコサミノグリカン混合物の重量平均分子量（Ｍｗ）は、４．５〜９ｋＤの範囲であり、且つ多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ、以下、「ＰＤＩ」とも称する）の値が１．６以下である。

本発明に係る低分子グリコサミノグリカン混合物において、好ましくは、重量平均分子量（Ｍｗ）が約４．５〜９ｋＤの範囲であり、ＰＤＩが約１〜１．６の範囲である。当業者からすれば、本発明に係る混合物が一連の重合度の異なる上記式（Ｉ）に示す化合物で構成されることを容易に理解できる。上記式（Ｉ）に示す構造から分かるように、本発明に係る低分子グリコサミノグリカン混合物は、上記式（Ｉ）の構造式において括弧で囲まれる部分、すなわち、−｛−３）−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１−４）−［Ｌ−Ｆｕｃ−（α１−３）］−Ｄ−ＧｌｃＵＡ−（β１−｝_ｎ−が特徴的な繰り返し構造単位を構成している。

構造断片を精製して検討を行った結果、ｎ≧２の場合、式（Ｉ）の化合物がＨＣＩＩに依存の抗トロンビン活性を示し、ｎが約２０以上である場合、式（Ｉ）の化合物が血小板活性を示す可能性があると確認できたため、本発明に係る低分子グリコサミノグリカン混合物を製造する際、重合度ｎが＜２、又は重合度ｎが＞２０の化合物を全部除外することとなる。好適な一実施形態において、重合度ｎが＜３、又は重合度ｎが＞１５の化合物を可能な限り全部除外してもよい。

構造断片を精製してその活性について検討を行った結果、ｎが約４〜９の整数である場合、式（Ｉ）で表される化合物が抗凝固作用において比較的良い薬理特性を示すと確認できる。通常であれば、本発明で言う低分子グリコサミノグリカン混合物の重量平均分子量及びＰＤＩ範囲において、前記混合物中のｎが４〜９の化合物が全化合物において７５％以上を占める。該比率は、通常、前記混合物を高効ゲル浸透クロマトグラフィー（ＨＰＧＰＣ）にかけて得られるクロマトグラムの積分及び同族化合物の構造単位分子量に基づいて算出することができる。

本発明に係る低分子グリコサミノグリカン混合物及びその薬学的に許容可能な塩は、通常、ナマコに由来し且つＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを化学的に解重合することで製造される。そのうち、前記ナマコに由来のＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンは、以下の特徴を有するものである。

１）前記グリコサミノグリカンは、特定のナマコから抽出したものであり、化学特徴として側鎖がフコース置換基によって置換されたグリコサミノグリカン誘導体（すなわち、フコシル化グリコサミノグリカンであり、本明細書において「ＦＧＡＧ」と称する場合がある）。

２）前記グリコサミノグリカンにおいて、単糖構成としてモル比が１：（１±０．３）：（１±０．３）範囲のＤ−グルクロン酸、Ｄ−アセチルガラクトサミン及びＬ−フコースを含む。また、Ｌ−フコシル基において、３，４−ジ硫酸エステル基−Ｌ−フコシル基（Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ）がモル比で７５％以上を占める。

３）前記グリコサミノグリカンの単糖構成としてＤ−グルクロン酸とＤ−アセチルアミノガラクトースは、それぞれβ（１−４）グリコシド結合とβ（１−３）グリコシド結合を介して交互に連結されることにより主鎖を構成し、Ｌ−フコシル基は、側鎖としてα（１−３）グリコシド結合を介して主鎖のＤ−グルクロン酸に連結される。

異なるナマコ品種に由来のフコシル化グリコサミノグリカン（ＦＧＡＧ）は、基本化学構造において一定の近似性を有するが、主鎖と側鎖の糖残基における硫酸エステル化のパターンが若干異なる可能性がある。本発明に係るＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンは、その特徴的構造として、フコース側鎖の硫酸エステル化パターンが主に３、４位の置換である。本発明者は、このような構造特性を有するＦＧＡＧが新鮮又は乾燥のハネジナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｓｃａｂｒａ）やグリーフェーナマコ（Ｐｅａｒｓｏｎｏｔｈｕｒｉａｇｒａｅｆｆｅｉ）の体壁及び／又は内臓に存在することを発見した。各地から獲られるナマコの品種が数千種に達し、現在に至るまでただそのうちの一部のナマコ品種についてそのグリコサミノグリカンをシステム的に研究検討が行われていることから、本発明で言うＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含む他のナマコ品種が存在することを否定はできない。そこで、これらのナマコ品種から抽出したＦＧＡＧも当然ながら本発明に係るＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物製造に適用可能である。

以下に示されるように、ナマコに由来のＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを用いて本発明の低分子グリコサミノグリカン混合物を製造する際、解重合法として、通常、β−脱離法、脱アミノ化による解重合法、及び過酸化による解重合法等を利用することができ、異なる解重合法及び解重合後に更に修飾することにより得られる産物は、末端構造が異なる場合がある。したがって、本発明は、更に下記式（ＶＩＩ）に示す構造を有する低分子グリコサミノグリカンの混合物を提供する。
［式（ＶＩＩ）中、構造断片Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃは、上記と同じであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_１１も上記と同じである。ｎは、３〜１５の整数であり、ｎが４〜９である化合物がモル比で全化合物において７５％以上を占める。］

式（ＶＩＩ）で表される化合物において、α−Ｌ−フコース−３，４−ジ硫酸エステル基、すなわち、α−Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ基がＬ−フコシル基全体において７５％以上を占め、且つ、
前記低分子グリコサミノグリカン混合物の重量平均分子量（Ｍｗ）は、４．５〜９ｋＤの範囲である。

本発明に係るＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物は、下記式（ＶＩＩＩ）に示す構造を有する低分子グリコサミノグリカンの混合物であってもよい。
［式（ＶＩＩＩ）中、構造断片Ａ、Ｂ、Ｂ”、Ｃは上記と同じであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_１２も上記と同じである。ｎは、３〜１５の整数であり、ｎが４〜９である化合物がモル比で全化合物において７５％以上を占める。］

上記式（ＶＩＩＩ）で表される化合物において、α−Ｌ−フコース−３，４−ジ硫酸エステル基、すなわち、α−Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ基がモル比でＬ−フコシル基全体において７５％以上を占め、且つ、前記低分子グリコサミノグリカン混合物の重量平均分子量（Ｍｗ）は、４．５〜９ｋＤの範囲である。

本発明者は、上記式（ＶＩＩＩ）で表される化合物の還元性末端Ｂ”が２，５−脱水タロース（ＡｎＴａｌ）である場合、前記ＡｎＴａｌのＣ１位置におけるカルボニル基が１分子の水を結合してジオール（ＡｎＴａｌ−ｄｉｏｌ）式の水和物になり易いことを発見し、このような水和物又はジオール式の化合物も当然のことながら本発明の範囲内に含まれる。

本発明によって提供されるＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物は、更に下記式（ＩＸ）に示す構造を有する低分子グリコサミノグリカンの混合物であってよい。
［式（ＩＸ）中、構造断片Ａ、Ｂ、Ｂ’、Ｃは上記と同じであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_１１も上記と同じである。ｎは３〜１５の整数であり、ｎが４〜９である化合物がモル比で全化合物において７５％以上を占める。］

上記式（ＩＸ）で表される化合物において、α−Ｌ−フコース−３，４−ジ硫酸エステル基、すなわち、α−Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ基がモル比でＬ−フコシル基全体において７５％以上を占め、且つ、前記低分子グリコサミノグリカン混合物の重量平均分子量（Ｍｗ）は、４．５〜９．０ｋＤの範囲である。

本発明に係る薬学的に許容可能な塩として、好ましくは、アルカリ金属及び／又はアルカリ土類金属塩である。本発明におけるＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物は、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩であることが好ましい。

本発明は、更に、本発明に係るＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物及びその薬学的に許容可能な塩の製造方法を提供し、前記製造方法は、以下の工程を含む。

工程１：新鮮又は乾燥のハネジナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｓｃａｂｒａ）又はグリーフェーナマコ（Ｐｅａｒｓｏｎｏｔｈｕｒｉａ ｇｒａｅｆｆｅｉ）等の体壁及び／又は内臓からＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含む多糖成分を抽出、精製する。ここで、ナマコ品種としてハネジナマコ又はグリーフェーナマコを使っているが、これらに制限されず、本発明の目的を達成できる前提で他の品種を使っても構わない。

本発明で言う抽出工程において、ナマコを細く切り砕き、更に粉砕又は均一にした後、水を抽出溶媒として用い、プロテアーゼ及び／又は無機塩基で処理することによりＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含む抽出液を得る。また、前記精製工程において、エタノール及び／又はアセトン沈降法を採用し、更にイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、透析法及び／又は限外濾過法を利用して完全精製及び／又は不完全精製のＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含む多糖成分を得る。

本発明において、Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含む多糖成分とは、通常、１）前記多糖成分におけるグリコサミノグリカン部分が均一した分子量を有し、つまり、ゲル濾過カラムにおいて唯一の多糖ピークを示し、且つ多分散指数が１〜１．５の範囲であり、２）該多糖成分におけるＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンの含有率が約８０％以上であることを意味する。そのうち、前記Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンとは、ｉ）ナマコに由来のグリコサミノグリカン類多糖体であり、単糖構成としてモル比が１：（１±０．３）：（１±０．３）の範囲であるＤ−グルクロン酸、Ｄ−アセチルアミノガラクトース及びＬ−フコースを含み、ｉｉ）Ｌ−フコシル基全体において、３，４−ジ硫酸エステル基−Ｌ−フコシル基がモル比で７５％以上を占めることを意味する。

本発明で言うＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンは、現在、原料がハネジナマコ及びグリーフェーナマコの体壁及び内臓に限られているが、約１２００種類に渡るナマコ（張春云ら、海洋水産物研究、２００４，２５（３）：８９）品種のうち、ＦＧＡＧの分離と精製が行われたのは数品種だけであることから、本発明で言うＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンの製造材料となるナマコ品種が上述のハネジナマコとグリーフェーナマコ両者に限らないのは明らかでもある。そこで、当業者であれば、本発明で言うＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンが他のナマコ品種から得られたとしても、本発明に係るＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物及びその薬学的に許容可能な塩の製造に適用可能であると容易に理解できる。

工程２：工程１で得られた多糖成分におけるＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを、重量平均分子量（Ｍｗ）が約４．５ｋＤ〜９ｋＤとなるように解重合し、低分子グリコサミノグリカン混合物を得る。前記解重合法は、β−脱離解重合法（方法１）、脱アセチル化・脱アミノ化による解重合法（方法２）又は過酸化による解重合法（方法３）の何れかであってもよい。

方法１（β−脱離解重合法）：前記「工程１」によって多糖成分を得た後、多糖成分中のＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンに含まれるヘキスロン酸における遊離カルボキシ基の一部を、第４級アンモニウム塩化とエステル化反応によってカルボン酸エステル基に変え、カルボン酸エステル化度が約１０％〜５０％の前記多糖のカルボン酸エステル化物を得ると共に、該処理を利用して多糖成分に含まれる非酸性多糖類の不純物成分を除去する。そして、非水溶媒、アルカリ性試薬の存在下において、得られたカルボン酸エステル化物をβ−脱離処理して目的分子量範囲の解重合産物を得た後、分子量分画によって多糖成分に残存するフコイジン類不純物を除去する。

本発明者が提出した特許出願（出願番号：ＣＮ２０１３１００９９８００．９）において、β−脱離法を利用することによりＦＧＡＧを解重合する際の一般的な処理方法が開示されている。本発明の「方法１」において、「工程１」で多糖成分を得た後に、Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンに含まれるヘキスロン酸の遊離カルボキシ基の一部をカルボン酸エステル基に変換するに先だって、前記多糖成分を第４級アンモニウム塩に変換することができる。通常、該処理は、「工程１」で得られた前記多糖成分の水溶液に塩化ベンゼトニウム等の第４級アンモニウム塩基を加えた後、遠心して４級アンモニウム塩の形で酸性多糖の沈降物を得ることにより遂行される。

ナマコから得られる多糖成分は、ＦＧＡＧの他、更にフコイダン硫酸エステル（Ｆｕｃａｎ ｓｕｌｆａｔｅ、以下において「ＦＳ」とも称する）及びグリコーゲンに類似の中性多糖類（ｎｅｕｔｒａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、以下において「ＮＰ」とも称する）を含む。一部のＦＳとＮＰがＦＧＡＧに近似する分子量範囲を示すため、ナマコ由来のＦＧＡＧを抽出精製する際、分画沈降法によって抽出物に含まれるＦＳとＮＰを完全に除去することが困難である。本発明によれば、「工程１」で得られた多糖成分を４級アンモニウム塩にする際、第４級アンモニウム塩によって中性多糖類成分を沈降できないことから、第４級アンモニウム塩の沈降物を遠心し、更に純水で洗い流すことにより、残存可能であり且つ分子量の分布が前記Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンに近似する中性多糖類を効率よく除去することができる。

前記酸性多糖類の４級アンモニウム塩沈降物を洗浄、乾燥した後、ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、以下において「ＤＭＦ」とも称する）等の非プロトン性溶媒に溶解して化学量論量のハロゲン化炭化水素と反応させることにより、ＦＧＡＧ第４級アンモニウム塩のカルボン酸エステル誘導体を得ることができる。前記ハロゲン化炭化水素における炭化水素基として、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖状又は分岐状、飽和及び／又は不飽和、置換又は非置換の脂肪族炭化水素基、置換又は非置換のＣ７〜Ｃ１２芳香族炭化水素基等が挙げられ、特に制限されない。本発明において、好適なハロゲン化炭化水素として、臭化ベンジルと塩化ベンジルである。

好ましくは、本発明の目的産物の重量平均分子量が４．５〜９．０ｋＤの範囲であり、β−脱離反応の実際反応效率を考慮すると、前記ＦＧＡＧカルボン酸エステル誘導体のエステル化度が１０％〜５０％の範囲である。前記カルボン酸エステル誘導体のエステル化度は、^１Ｈ―ＮＭＲスペクトルから算出することができる。

ＦＧＡＧカルボン酸エステル誘導体がアルカリ性の水と水含有溶媒において特に加水分解し易いため、本発明に係るＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンをβ−脱離により解重合する場合、アルカリ性試薬を含有する非水溶媒において前記カルボン酸エステル誘導体を解重合して目的産物を得る。本発明において、好適な非水溶媒としてエタノールが挙げられ、アルカリ性試薬としてナトリウムエトキシドが好ましい。

アルカリ性試薬の存在下において、ＦＧＡＧカルボン酸エステル誘導体はβ−脱離反応によって解重合されるが、ＦＳを含まないヘキスロン酸は解重合されない。その結果、多糖成分における分子量が近似するＦＧＡＧとＦＳは、β−脱離された後に分子量の範囲において大きな差異を示すこととなる。そして、ゲル濾過、限外濾過及び／又は透析処理を施すことにより解重合産物に残存するＦＳ類成分を容易に除去することができる。そのため、β−脱離反応によって目的分子量の範囲で本発明に係るＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物を得るだけではなく、更に、多糖成分に残留するＦＳ類多糖成分を効果的に除去し、本発明の目的産物の純度を高めることができる。

上述の方法で処理して得られるβ−脱離解重合反応の産物を精製し、本発明に係る低分子グリコサミノグリカン混合物とすることがきる。これらのグリコサミノグリカン混合物において、一部のグルクロン酸はカルボン酸エステルを形成し、前記カルボン酸エステルのエステル基部分は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ７〜Ｃ１２アラルキル基になっている。このようなカルボン酸エステル基含有の低分子グリコサミノグリカン混合物は、アルカリ性の水と水含有溶媒の何れかにおいてエステル基を加水分解することにより、カルボン酸エステルを含まない低分子グリコサミノグリカンを得ることができる。

更に、低分子グリコサミノグリカンに含まれるグルクロン酸基のカルボキシ基を、例えば、カルボジイミド類化合物の存在下において、水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤を用いて相応のヘキソシル基、すなわち、Ｄ−グルコシル基に還元することができる。

得られた低分子グリコサミノグリカンは、更に、還元性末端について還元処理を施してもよく、還元性末端のＤ−２−アセチルアミノ−２−デオキシ−ガラクトシル基を相応の糖アルコール、グリコシルアミン又はＮ置換のグリコシルアミンに変換することができる。多糖体及び／又はオリゴ糖の還元性末端の糖残基を相応の糖アルコール、グリコシルアミン又はＮ置換のグリコシルアミンに変換するに当たって、当業者が熟知の方法を利用することができ、例えば、アルカリ性の条件、水素化ホウ素ナトリウム又はシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いて容易に還元性糖残基を糖アルコールに還元することができる。また、炭酸水素アンモニウムとシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いて還元性末端の糖残基を相応のグリコシルアミンに還元することができる。また、有機アミンの存在下において還元性末端を還元アミノ化することでき、該反応は、有機アミンと末端糖残基のＣ１位のアルデヒド基を反応させてシッフ塩基を形成し、更に、後者を還元剤の存在下で第２級アミンに還元してＮ置換のグリコシルアミンを得ることにより遂行される。

本発明の「工程２」のβ−脱離解重合法を用いて必要とされる低分子グリコサミノグリカン混合物を得るときの反応の流れをよりよく理解できるように、以下纏めて示す。

Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含む多糖成分（ナマコ多糖の抽出物）
↓（第４級アンモニウム塩に変換し、同時に中性多糖類を除去する）
Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンの第４級アンモニウム塩を含む多糖成分
↓（カルボキシ基エステル化反応：非プロトン溶媒においてハロゲン化炭化水素と反応させる）
カルボン酸の一部がエステル化されたＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンの第４級アンモニウム塩を含む多糖成分
↓β−脱離反応（非水溶媒において強塩基で処理する）
↓精製（ゲルクロマトグラフィー、限外濾過及び／又は透析）
カルボン酸の一部がエステル化されたＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン
（オプション）↓カルボン酸エステルの加水分解（水含有溶媒において塩基で処理する）
Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン
（オプション）↓カルボキシ基の還元（水含有溶媒において、カルボジイミド／還元剤で処理する）
カルボキシ基が還元された低分子グリコサミノグリカン
（オプション）↓末端の還元（水含有溶媒、アルカリ性の条件下において還元剤で処理する）
↓又は末端の還元アミノ化（炭酸水素アンモニウム／有機アミン及び還元剤で処理する）
末端基が相応のアミノヘキシトール又はグリコシルアミン及び置換グリコシルアミンの低分子グリコサミノグリカン

方法２（脱アセチル化・脱アミノ化による解重合法）：前記脱アセチル化・脱アミノ化による解重合法（以下、「脱アセチル化・脱アミノ化解重合法」とも称する）は、硫酸ヒドラジンの存在下又は非存在下において、ヒドラジンを用いて「工程１」で得られた多糖成分を処理し、グリコサミノグリカン化合物中の約１０〜３５％のＤ−アセチルアミノガラクトシル基を脱アセチル化させ、部分的脱アセチル化物を得た後、亜硝酸で部分的脱アセチル化物を処理することにより脱アミノ化させて解重合し、還元性末端が２，５−脱水タロース残基である低分子グリコサミノグリカン混合物を得ることを含む。

本発明者が提出した別の特許出願（出願番号：ＣＮ２０１３１０１２７４４７．０）において、脱アセチル化・脱アミノ化解重合法を用いてＦＧＡＧを解重合する際の一般的な処理方法が開示されている。一般的に、「方法２」における部分的脱アセチル化反応は、「工程１」で得られるＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含む多糖成分を無水又は水含有ヒドラジンに溶かし、該多糖成分のヒドラジン溶液に更に少量の硫酸ヒドラジン又は塩酸ヒドラジンを加えて反応触媒としてもよく、若しくは直接に少量の硫酸又は塩酸を加えて反応触媒としてもよく、その後、加熱（例えば、６０℃〜１１０℃）と攪拌しながら反応させ、多糖成分中のＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンの脱アセチル化度が約１０％〜３５％に達するようにする。前記脱アセチル化反応は、窒素ガス雰囲気において行われるのが好ましい。前記Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンの脱アセチル化度は、^１Ｈ―ＮＭＲスペクトルから検出、確認することができる。

脱アセチル化産物の脱アミノ化解重合反応は、氷浴〜室温の条件下で行われ、つまり、Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンの脱アセチル化産物を含む多糖成分を水に溶解した後、亜硝酸溶液を加えて溶液のｐＨを約２〜５となるようにし、若しくはＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンの脱アセチル化産物を含む多糖成分を直接にｐＨ約２〜５の亜硝酸溶液に溶解する。通常、Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンの脱アセチル化産物を脱アミノ化することで速やかに且つ徹底に解重合することができ、５〜６０分間の反応時間で反応が完全に行われる。酸性環境におけるフコース側鎖の脱落を回避するため、通常、該反応が終了した直後に炭酸ナトリウム等のアルカリ性溶液を加えてｐＨを約８〜９に調整し、反応を中止させる。

以上で述べたように、ハネジナマコ及びグリーフェーナマコ由来の多糖体に、ＦＧＡＧ以外、更にＦＳ及びＮＰ類多糖成分を含むのが一般的である。一部のＦＳ及びＮＰがＦＧＡＧに近似する分子量範囲を有するため、ナマコ由来のＦＧＡＧを抽出精製する際、分画沈降法によって抽出物に含まれるＦＳ及びＮＰを完全に除去するのは困難である。脱アセチル化・脱アミノ化解重合法を用いてＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含む多糖成分を解重合する場合、ＦＳ及びＮＰが何れもヘキソサミンを含まないため、「方法２」の処理時に解重合反応が殆ど起こらず、方法２に従って処理した後、「工程１」で得られる多糖成分において、Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンと近似した分子量分布を有するＦＳ及びＮＰの分子量が余り変わらず、Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンの分子量のみが顕著に低下することになる。そこで、分子量分布に顕著な差異があることから、ゲルクロマトグラフィー、限外濾過及び／又は透析法を利用して多糖成分におけるＦＳ及びＮＰ類多糖成分容易に除去することができる。

同様に、低分子グリコサミノグリカンに対してカルボキシ基の還元処理を施してもよく、よって、Ｄ−グルクロン酸基をＤ−グルコシル基に還元することができる。また、還元性末端についても還元処理を施すことができ、還元性末端の２，５−脱水タロース残基を相応の糖アルコール、グリコシルアミン又はＮ置換のグリコシルアミンに変換することができる。低分子グリコサミノグリカンのカルボキシ基及び還元性末端の糖残基を還元する方法は、上記方法１のとおりである。

本発明の「工程２」の脱アセチル化・脱アミノ化解重合法を用いて必要とされる低分子グリコサミノグリカン混合物を製造するときの反応の流れを、以下に纏めて示す。

Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含むナマコ多糖体の抽出物
↓ヒドラジン分解（硫酸ヒドラジン又は塩酸ヒドラジンの何れかをヒドラジン触媒とする）
部分的脱アセチル化したＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含む多糖成分
↓脱アミノ化解重合（水含有溶媒において、亜硝酸で処理する）
↓精製（ゲルクロマトグラフィー、限外濾過及び／又は透析）
Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン
（オプション）↓末端の還元化（水含有溶媒、アルカリ性の条件下において還元剤で処理する）
↓又は末端の還元アミノ化（炭酸水素アンモニウム／有機アミン及び還元剤で処理する）
末端基がアミノヘキシトール又は相応のグリコシルアミン、置換グリコシルアミンである低分子グリコサミノグリカン

方法３（過酸化処理による解重合法）：該方法は、Ｃｕ^２＋の存在下、終濃度が３％〜１０％のＨ_２Ｏ_２を用いて「工程１」で得られた精製済みのグリコサミノグリカン混合物の水溶液を処理することにより、期待の分子量範囲を有する低分子グリコサミノグリカン混合物を得ることを含む。

過酸化処理による解重合法（以下、「過酸化解重合法」とも称する）の詳細は、本発明者の発明特許（特許公告番号：ＣＮ１０１７３５３３６Ｂ）に開示されている。「工程１」で得られるＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含む多糖成分に、ＦＧＡＧ以外、近似した分子量分布を有するＦＳ及びＮＰ類多糖成分を含んでおり、前記β−脱離解重合法及び脱アセチル化・脱アミノ化解重合法がグリコシド結合に対して選択性を示すため、ヘキスロン酸とヘキソサミンを含むＦＧＡＧを解重合することができるが、ＦＳとＮＰ類多糖を解重合することができない。一方、過酸化処理によるＦＧＡＧ、ＦＳ及びＮＰの解重合效率に差異が存在するが、何れに対しても一定の程度で解重合することができるため、解重合産物の分子量の差異によってＦＳとＮＰ類多糖成分を除去しようとする場合には一定の難度がある。そこで、産物の精製には更に陰イオン交換クロマトグラフィー等による精製が必要である。

上記と同様に、低分子グリコサミノグリカンに対してカルボキシ基の還元処理を施してもよく、よって、Ｄ−グルクロン酸基をＤ−グルコシル基に還元することができる。また、還元性末端についても還元処理を施すことができ、還元性末端のＤ−２−アセチルアミノ−２−デオキシ−ガラクトシル基を相応の糖アルコール、グリコシルアミン又はＮ置換のグリコシルアミンに変換することができる。低分子グリコサミノグリカンのカルボキシ基及び還元性末端糖残基を還元する方法は、上記方法１のとおりである。

本発明において、上記方法１〜方法３の何れかを用いて製造した解重合産物及び末端還元処理が施された解重合産物は、エタノール及び／又はアセトン沈降法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、透析法及び／又は限外濾過法等の当分野で熟知の方法を用いて精製することができ、更に、減圧乾燥及び／又は凍結乾燥してＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物の固形体を得ることができる。

また、「工程２」の方法における「方法１」は、式（ＶＩＩ）で表される低分子グリコサミノグリカン混合物の製造に、「方法２」は、式（ＶＩＩＩ）で表される低分子グリコサミノグリカン混合物の製造に、「方法３」は、式（ＩＸ）で表される低分子グリコサミノグリカン混合物の製造に夫々好適である。前記式（ＶＩＩ）、式（ＶＩＩＩ）及び式（ＩＸ）で表されるグリコサミノグリカン類化合物は、何れも本発明の式（Ｉ）で表されるＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物の範囲内に含まれる。本発明の好適な一実施形態において、「工程２」における「方法１」又は「方法２」を用いて本発明のＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物を製造する。

したがって、本発明は、更に、上記式（ＶＩＩ）で表されるＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物及びその薬学的に許容可能な塩の製造方法を提供する。該製造方法において、「工程２」の「方法１」に記載のβ−脱離法を用い、「工程１」で得られるＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含む多糖成分を解重合する。また、「方法１」におけるエステル化反応は、工程１で得られる多糖成分中のＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを第４級アンモニウム塩に変換した後、非プロトン性の溶媒系においてハロゲン化炭化水素又は芳香族ハロゲン化合物と反応させてエステル化度が約１０％〜５０％のグリコサミノグリカンカルボン酸エステル化物を得ることである。β−脱離反応において、非水溶媒は、エタノール、メタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ＣＨ_２Ｃｌ_２、ＣＨＣｌ_３、及びこれらの混合物からなる群より選ばれる１種以上であり、アルカリ性試薬は、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃ１〜Ｃ４のナトリウムアルコキシド、エチルジアミン、トリ−ｎ−ブチルアミン、４−ジメチルアミノピリジン及びこれらの混合物からなる群より選ばれる１種以上である。「方法１」により製造された解重合産物については、カルボン酸エステルの加水分解、カルボキシ基の還元処理を施してもよく、更に、末端還元処理を施すことができ、還元性末端のＤ−２−アセチルアミノ−２−デオキシ−ガラクトシル基を相応の糖アルコール、グリコシルアミン又はＮ置換のグリコシルアミンに変換することができる。前記解重合産物及び末端還元処理が施された解重合産物は、エタノール及び／又はアセトン沈降法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、透析法及び／又は限外濾過法を用いて精製した後、減圧乾燥及び／又は凍結乾燥してＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物の固形体にすることができる。

また、本発明は、更に、式（ＶＩＩＩ）で表されるＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物及びその薬学的に許容可能な塩の製造方法を提供する。該製造方法において、前記「工程２」の「方法２」に記載の脱アセチル化・脱アミノ化法を用い、「工程１」で得られるＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含む多糖成分を解重合する。また、「方法２」におけるヒドラジン処理は、前記グリコサミノグリカンの混合物を無水ヒドラジン又はヒドラジン水和物の溶液に溶解し、硫酸ヒドラジンの存在下又は非存在下において反応させることにより遂行される。「方法２」における亜硝酸処理は、氷浴〜室温の条件下において部分的脱アセチル化物をｐＨ２〜５の亜硝酸溶液に溶解し、５分間〜６０分間反応させた後、溶液をアルカリ性に調整して反応を中止することにより遂行される。「方法２」によって製造された解重合産物は、カルボキシ基を還元することでグルクロン酸基をグルコシル基に変換することができる。更に、末端還元処理により還元性末端の２，５−脱水タロース残基を相応の糖アルコール、グリコシルアミン又はＮ置換のグリコシルアミンに変換することができる。前記解重合産物及び末端還元処理が施された解重合産物については、エタノール及び／又はアセトン沈降法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、透析法及び／又は限外濾過法を用いて精製した後、減圧乾燥及び／又は凍結乾燥してＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物の固形体にすることができる。

本発明者は、品種の異なる一連のナマコに由来のＦＧＡＧを対比しながら検討を行い、構造上の差異によっては各品種に由来のＦＧＡＧが第ＸＩＩ因子及び血小板に対して異なる活性を示し、そのうち、ハネジナマコに由来のＦＧＡＧが比較的弱い活性又は最も低い活性を示すと同時に、比較的に強い抗凝固活性示すことを確認した。本発明において、各品種のナマコに由来のＦＧＡＧの抗凝固・凝固促進活性における差異が多糖体の硫酸エステル基の含有量と直接に関係せず、ハネジナマコに由来のＦＧＡＧが特殊な硫酸エステル基の置換パターンを示し、特に、Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓを特徴とする側鎖の硫酸エステル基の置換パターンを有するため、特異的な抗凝固活性を示すことを確認した。

バイカナマコに由来のＦＧＡＧ解重合産物の抗凝固活性が重量平均分子量（Ｍｗ）に影響されることが既に知られている（趙金華ら、ＣＮ１０１７２４０８６Ａ）。しかし、本発明者は、ナマコに由来の一連の分子量を有するＦＧＡＧ解重合産物の活性について比較研究を行い、その結果、重量平均分子量がハネジナマコに由来ＦＧＡＧ解重合産物の抗凝固活性に対して上記とは異なる影響を与えるという驚きの現象を発見した。

つまり、分子量が約６５ｋＤ〜約６．５ｋＤの範囲において、分子量が約１０ｋＤ以下である場合、バイカナマコＦＧＡＧ解重合産物による第Ｘ因子活性化複合体（ｆ．Ｘａｓｅ）の阻害活性が分子量の低下につれて顕著に低下し、また、分子量が約６５〜６．５ｋＤの範囲において、そのヘパリンコファクターＩＩ（ＨＣＩＩ）に依存の抗トロンビン（第ＩＩａ因子）活性がほぼ一定のレベルを維持し、分子量が約１０〜１２ｋＤである場合に少し高くなり、それ以上の分子量では逆に低下する。

また、分子量が約６５ｋＤ〜約３．５ｋＤの範囲において、ハネジナマコに由来のＦＧＡＧの解重合産物は、分子量が約５〜８ｋＤであっても第Ｘ因子活性化複合体に対して強い阻害活性を示し、一方、そのＨＣＩＩに依存の抗第ＩＩａ因子活性が分子量の減少につれて増強し、約５ｋＤの分子量で最も強い活性を示す。

バイカナマコに由来のＦＧＡＧの解重合産物と同様に、ハネジナマコに由来のＦＧＡＧの解重合産物は、人コントロール血漿の活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を倍増するときの活性が分子量の減少につれて低下するが、分子量が約１０ｋＤ未満であると、バイカナマコに由来のＦＧＡＧの解重合産物を用いてＡＰＴＴを倍増するときの薬物濃度が６μｇ／ｍＬ以上を満足する必要があり、分子量が約６ｋＤになると、ハネジナマコに由来のＦＧＡＧの解重合産物を用いてＡＰＴＴを倍増するときの薬物濃度が６μｇ／ｍＬ以下となる。

以上のことから、バイカナマコ等のナマコに由来のＦＧＡＧの解重合産物に比べ、ハネジナマコに由来のＦＧＡＧの解重合産物がより優れた抗凝固特性を示し、つまり、ナマコに由来し且つフコース側鎖が主にＦｕｃ３Ｓ４Ｓで構成されるＦＧＡＧの解重合産物がより優れた抗凝固特性を有することが分かる。主鎖構造が似ており、すなわち、バイカナマコ及びハネジナマコに由来のＦＧＡＧは、主鎖のヘキソサミンが何れもβ−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ４Ｓ６Ｓであるため、解重合産物の薬理特性がその特異的なフコース側鎖の置換パターンによって決められると考えられる。一方、グリーフェーナマコに由来のＦＧＡＧの解重合産物は、ハネジナマコに由来ＦＧＡＧに近似する構造を有するが、フコース側鎖の置換基が主にＦｕｃ３Ｓ４Ｓで構成され、ハネジナマコに由来のＦＧＡＧの解重合産物と類似した抗凝固活性を示すことから、Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ側鎖のフコシル基の構造特性がＦＧＡＧ解重合産物の抗凝固活性に直接に関連すると認められる。

血栓症は人々の健康と生活の質を大いに脅かす１つの主な致死性病因であり、抗凝固薬物を用いる治療が血栓症の予防と臨床治療において重要な役割を果たしている。現在、血栓症の臨床治療においてヘパリン類薬物が主に使われているが、出血リスクが高いという欠陥を抱えている。ヘパリン及び低分子ヘパリン系薬物は、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）に依存して第ＩＩａ因子と第Ｘ因子（ｆ．Ｘａ）を阻害する活性によってその薬理効果を発揮する。既知のこととして、第Ｘ因子活性化複合体及びＨＣＩＩに依存の抗第ＩＩａ因子活性が、抗凝固薬物の出血リスク低下に有利である。したがって、血栓症の予防と臨床治療において、ハネジナマコ等のナマコに由来し且つ側鎖が主にＦｕｃ３Ｓ４Ｓで構成されるＦＧＡＧの解重合産物が極めて重要な役割を果たすと期待されつつである。

したがって、本発明は、更に前記Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む薬物組成物を提供し、該薬物組成物は、抗凝固効果を示す有効量で前記低分子グリコサミノグリカン混合物又はその薬学的に許容可能な塩、及び賦形剤を含んでなる。

本発明に係る薬物組成物は、低分子糖類化合物を有効成分とし、経口投与で生体利用度に限界があるため、非経口投与製剤にするのが好ましく、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下注射等の方式で投与することができる。

全身投与に適した製剤として、注射用水溶液、使用直前で水溶液に調製可能な凍結乾燥粉体等を含む。したがって、本発明に係る薬物組成物として、好ましくは、注射用水溶液又は注射用凍結乾燥粉体の形態である。

本発明に係る低分子グリコサミノグリカン混合物は、良好な水溶性を示すため、水溶液を調製する際に補助溶媒及び／又は界面活性剤を添加する必要がない。溶液の浸透圧及び／又はｐＨ値を調整するために、薬用添加剤として塩化ナトリウム等の無機塩、リン酸塩等の緩衝塩を添加することができる。

使用直前で水溶液に調製可能な凍結乾燥粉体として、浸透圧及び／又はｐＨ値を調整するために薬学的に許容可能な無機塩及び／又は緩衝塩を添加する以外、更に、マンノース等の製剤成形に有利な薬用賦形剤を添加することができる。

本発明の薬物組成物において、前記低分子グリコサミノグリカン混合物の有効量とは、１回及び／又は数回連続して投与した後に被投与者の内因系凝固活性を顕著に且つ適宜に抑制することのできる量を指すものであり、一般的には、被投与者の血漿ＡＰＴＴ時間を約０．５〜１．５倍に延長することのできる量である。そのため、投与回数が１回に限る場合、製剤１単位当たりに本発明の低分子グリコサミノグリカン混合物を約２０ｍｇ〜約１００ｍｇの範囲で含むことができ、点滴静脈注射等の場合には実状況に合わせて適宜調整することも可能である。

本発明に係るＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物が抗凝固・抗血栓活性を示し、血栓症の予防と臨床治療に有望である。そのため、本発明は、更に、前記Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩の、血栓症治療薬及び／又は予防薬の製造における用途を提供し、前記血栓症は、静脈血栓塞栓、動脈血栓塞栓、虚血性心疾患又は虚血性脳血管障害を含み、特に制限されない。

本発明は、更に、前記Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカンを含む薬物組成物を用いて得られる、血栓症治療薬及び／又は予防薬を提供し、前記血栓症は、静脈血栓塞栓、動脈血栓塞栓、虚血性心疾患又は虚血性脳血管障害を含み、特に制限されない。

Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカンを含むハネジナマコ多糖成分のＨＰＧＰＣクロマトグラムである。 Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物ｄＨＳＧ−１の^１Ｈ／^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルである。 ｄＨＳＧ−１の^１Ｈ−^１Ｈ ＣＯＳＹ、ＲＯＥＳＹ及びＴＯＣＳＹスペクトル（局部）の重ね合わせ図である。 Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物ｄＨＳＧ−３の^１Ｈ／^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルである。 ｄＨＳＧ−３の^１Ｈ−^１Ｈ ＣＯＳＹ、ＲＯＥＳＹ及びＴＯＣＳＹスペクトル（局部）の重ね合わせ図である。 異なるナマコに由来の解重合物ｄＦＧＡＧの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。 異なる品種から得られるＦＧＡＧ及びｄＦＧＡＧの第ＸＩＩ因子活性に対する影響を示す図である。 一連の分子量を有するＨＳＧ及びｄＨＳＧの第Ｘ因子活性化複合体活性に対する影響を示す図である。

以下、図面を参酌しつつ、具体的な実施例を挙げて本発明を詳述する。以下の実施例は、本発明を例示したに過ぎず、本発明の範囲がこれらによって制限されない。

実施例１：Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含むハネジナマコ多糖成分（ＨＳＧ−１、ＨＳＧ−１、ＨＳＧ−３）の抽出と精製
１．１ 材料
原料として、ハネジナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｓｃａｂｒａ）乾燥品は、市販のものであった。試薬として、パパインは、８×１０^５Ｕ／ｇであり、広西南寧厖博バイオテック社製であった。ＮａＯＨ、ＫＣＯＣＨ_３、Ｈ_２Ｏ_２、エタノール等は、何れも市販の分析用試薬であった。

１．２ 抽出と精製
抽出：ハネジナマコ乾燥品１０００ｇを細かく切り砕き、丸底フラスコに入れた後、純水１０Ｌを加えて一夜浸した。そして、温度を５０℃に上げた後、パパイン５ｇを加えて均一になるまで攪拌し、５０℃で攪拌しながら６時間かけて分解消化した。そして、水酸化ナトリウム固体を加えて濃度が約０．５Ｍとなるようにし、６０℃で２時間処理した後、６Ｎの塩酸を用いてｐＨ値を６〜７に調整し、室温に冷却させてから４０００ｒｐｍ×１５分間遠心した。沈降物を捨て、得られる上澄み液にエタノールを加えて終濃度が７０％（体積比）となるようにし、４℃で静置し、遠心して沈降物（すなわち、ハネジナマコ多糖体の粗品）を回収した。

精製：得られたハネジナマコ多糖体の粗品を純水２Ｌに再溶解し、４０００ｒｐｍ×１５分間遠心して不溶物を除き、上澄み液を２ＮのＮａＯＨでｐＨ値が約９．５となるように調整し、Ｈ_２Ｏ_２を加えて終濃度が約３％（体積比）となるようにした後、５０℃で攪拌しながら２時間反応することにより脱色させた。脱色反応液に終濃度が約０．５Ｍになるように酢酸カリウムを加えた後、エタノールを加えて溶液のアルコール濃度が約４０％（体積比）となるようにし、室温で４時間静置し、４０００ｒｐｍ×１５分間遠心して沈降物を得た。得られた沈降物を純水１Ｌに再溶解し、更に酢酸カリウムを加えて終濃度が約０．５Ｍになるようにし、エタノールを加えて溶液のアルコール濃度が約４０％（体積比）となるようにし、室温で４時間静置し、４０００ｒｐｍ×１５分間遠心して沈降物を得た。得られた沈降物を２００ｍＬの８０％エタノール（体積比）２回洗浄し、減圧乾燥してＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含むハネジナマコ多糖成分１（ＨＳＧ−１）約１３．２６ｇを得た。

ハネジナマコ多糖成分１（ＨＳＧ−１）約６．０ｇを純水５００ｍＬに溶かし、Ｍｉｎｉｐｏｌｅ限外濾過装置において１００ｋＤの限外濾過カセットを用いて濾過することにより濾液を得た後、濾液を更に同じ装置において３０ｋＤの限外濾過カセットを用いて濾過し、得られた捕獲液を凍結乾燥してＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含むハネジナマコ多糖成分２（ＨＳＧ−２）約５．３３ｇを得た。

更に、ハネジナマコ多糖成分１（ＨＳＧ−１）約４．０ｇを純水５０ｍＬに溶かした後、ＤＥＡＥ−セルロースカラム（Φ：５ｃｍ、カラム用量：４００ｍＬ）に注入し、水４００ｍＬで（流速：４ｍｌ／分間）洗い流し、濃度勾配が０．５Ｍ〜２ＭのＮａＣｌ水溶液で溶出し、自動回収装置を利用して１０ｍＬ／画分で溶出液を回収した。アゾール溶液を用いる異調染色法により酸性ムコ多糖を含む画分を検出し、酸性ムコ多糖を含む画分を回収してから３０ｋＤの透析膜を用いて透析し、凍結乾燥してＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含むハネジナマコ多糖成分３（ＨＳＧ−３）約３．２５ｇを得た。

１．３ 検出と分析
１）ＨＰＧＰＣ分析：純水を用い、Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含むハネジナマコ多糖成分ＨＳＧ−１、ＨＳＧ−２及びＨＳＧ−３を５ｍｇ／ｍＬの試料溶液に調製した。ＨＰＧＰＣ分析の条件として、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００高速液体クロマトグラフ、Ｓｈｏｄｅｘ ＳＢ−８０４ＨＱ（８．０ｍｍ ＩＤ×３００ｍｍ）カラムを用い、カラム温度が３５℃であり、試料注入量が２０μＬであった。また、移動相として０．１ＭのＮａＣｌ溶液を用い、流速が０．５ｍｌ／分間であり、ＲＩＤ検出器及びＤＡＤ検出器を用いて検出を行った。

ハネジナマコ多糖成分ＨＳＧ−１、ＨＳＧ−２及びＨＳＧ−３のＨＰＧＰＣ分析結果を図１に示す。図１に示すように、ＨＳＧ−２は、保持時間（ＲＴ）が約１９分間の多糖成分（主にＦＧＡＧである）のみで、ＨＳＧ−１は、主ピーク以外、更に保持時間（ＲＴ）が約１４分間のピーク（主にＦＳである）、ＲＴが約２２分間のピーク（主にペプチド類成分である）を示した。また、主ピーク以外、ＨＳＧ−３は、ＲＴが約１４分間のピークとＲＴが約２２分間のピークが何れもＨＳＧ−１に比べて弱めになっていた。

２）分子量の測定：純水を用いてＨＳＧ−１、ＨＳＧ−２、ＨＳＧ−３、及び一連の分子量を有するＦＧＡＧ標準品（中科院昆明植物研究所製、ＨＰＬＣ−ＬＡＬＬＳ法により定量化したものである）を１０ｍｇ／ｍＬの試料溶液に調製し、各ＨＰＧＰＣクロマトグラムを利用して分子量を測定した。

ＨＰＧＰＣ分析時の条件として、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００高速液体クロマトグラフ、Ｓｈｏｄｅｘ ＳＢ−８０４ＨＱ（８．０ｍｍ ＩＤ×３００ｍｍ）カラムを用い、カラム温度が３５℃であった。試料注入量が２０μＬ、移動相が０．１ＭのＮａＣｌ溶液、流速が０．５ｍＬ／分間であり、ＲＩＤ検出器及びＤＡＤ検出器を用いて検出を行った。

ＨＰＧＰＣ分析結果から、ＨＳＧ−１、ＨＳＧ−２及びＨＳＧ−３夫々のＦＧＡＧを含む主ピークで反映される多糖成分の重量平均分子量（Ｍｗ）が約６３．２ｋＤ、６３．５ｋＤ及び６４．２ｋＤであり、数平均分子量（Ｍｎ）が約５６．５ｋＤ、５９．７ｋＤ及び５８．９ｋＤであり、多分散指数（ＰＤＩ）が夫々約１．１２、１．０６及び１．０９であるのが確認できた。この結果から、更に、ＨＳＧ−１、ＨＳＧ−２及びＨＳＧ−３の多糖成分におけるＦＧＡＧ画分（主ピーク）が良好な均質性を有することが確認できた。

３）単糖構成の分析：ＨＳＧ−１、ＨＳＧ−２及びＨＳＧ−３の単糖構成の分析において、夫々Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇｏｎ法、ｍ−ヒドロキシジフェニル法及びシステインフェノール法（張惟傑，糖複合体の生化学研究技術（第２版）、浙江大学出版社、１９９９）を用いて前記多糖成分におけるアセチルガラクトサミン、グルクロン酸及びフコースの含有量を測定した。ＨＳＧ−１、ＨＳＧ−２及びＨＳＧ−３の単糖構成の分析結果を下記表１に示す。分析結果から、３種類の単糖成分に含まれるヘキスロン酸、ヘキソサミン及びフコースのモル比が何れも１：（１±０．３）：（１±０．５）の範囲であるのが確認できた。比較的に、ＦＳ類多糖成分（ＲＴが〜１４分間である）の残留に起因してＨＳＧ−１においてフコースのモル比が比較的高くなり、一方、ＨＳＧ−２及びＨＳＧ−３においてヘキスロン酸、ヘキソサミンの含有量が比較的高く、精製による影響も大きいと認められる。

図１に示されるように、ＨＳＧ−２は、保持時間が〜１４分間のピークを殆ど含まず、Ｆｕｃの量がＧｌｃＵＡ及びＧａｌＮＡｃを上回り、ＦｕｃとＧｌｃＵＡのモル比もＨＳＧ−３より高くなっているのが確認でき、後述のように、これらの多糖成分に分子量分布がＦＧＡＧに近似するＦＳが含まれているからである。

実施例２：過酸化解重合法によるハネジナマコ多糖成分の解重合、及びＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物（ｄＨＳＧ−１）の製造
２．１ 材料
ＨＳＧ−２として、実施例１においてハネジナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｓｃａｂｒａ）乾燥品から抽出、精製したＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含む多糖成分を用い、Ｍｗが〜６３．５ｋＤ、ＰＤＩが〜１．０６であった。試薬としてＮａＣｌ、ＣＨ_３ＣＯＯＮａ、ＮａＯＨ、Ｈ_２Ｏ_２、Ｃｕ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_２等は、何れも市販の分析用クラスであった。

２．２ 製造
実施例１で得られたＨＳＧ−２を１００．３ｍｇ取って１０ｍＬの反応チューブに入れ、水３ｍＬで溶かした後に８７．２ｍｇのＮａＣｌ加えて濃度を０．５Ｍにし、２０４．１ｍｇ合酢酸ナトリウム・３水和物使酢酸ナトリウム２０４．１ｍｇを加えて濃度を０．５Ｍにし、そして、酢酸銅２．４ｍｇを加えて濃度を４．０１ｎＭにしてから１０％のＨ_２Ｏ_２を０．４ｍＬ加えた。その後、０．１ＭのＮａＯＨを用いて反応液を約ｐＨ７．５に調整し、３５℃で解重合した。４０分間置きにサンプル１０μＬを取ってアルコールで沈降させ、水で再溶解してＨＰＧＰＣを用いて反応終点を確定し、解重合反応が３時間経過した時点で反応を中止した。反応液にエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム１０ｍｇを加え、更に無水エタノール７．５ｍＬを加えて静置し、３０００ｒｐｍ×１５分間遠心し、得られた上澄みを捨て、得られた沈降物を水３ｍＬで再び溶解した後、ＯＨ⁻型のＤＥＡＥ陰イオン交換カラムとＨ^＋型の陽イオン交換カラムで精製し、酸性ムコ多糖を含む画分を回収した。該画分を０．１ＭのＮａＯＨ溶液を用いて中性に調整し、１ｋＤの透析バッグに入れて４８時間透析し、捕獲液を凍結乾燥してＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン産物１（ｄＨＳＧ−１）７５ｍｇを得た。

２．３ 検出
方法：ＨＰＧＰＣ法を用いて分子量及び分子量分布を測定した。Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇｏｎ法を用いてアセチルガラクトサミン（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ）の含有量を測定し、カルバゾール法を用いてグルクロン酸（Ｄ−ＧｌｃＵＡ）の含有量を測定し、^１Ｈ―ＮＭＲスペクトルに基づき、メチルピークの面積を積分することによりＤ−ＧａｌＮＡｃ／Ｌ−Ｆｕｃのモル比を算出した。ＮＭＲスペクトルの測定に、スイスＢｒｕｋｅｒ社のＡＶＡＮＣＥ ＡＶ ５００超伝導核磁気共鳴装置（５００ＭＨｚ）を用いた。

ＨＳＧ−２及びその過酸化解重合産物ｄＨＳＧ−１の理化学特性、及び単糖構成の分析結果を下記表２に示す。表２に示されるように、ＨＳＧ−２に比べ、ｄＨＳＧ−１の分子量が７倍以上低下した。単糖構成の分析結果から、ＨＳＧ−２及びｄＨＳＧ−１のヘキソサミン、ヘキスロン酸の構成比がほぼ一定であり、デオキシヘキソース（Ｆｕｃ）の構成比が若干低下するのが確認でき、ＦＳ類不純物量の低下によるものであると考えられる。

図２〜３に、ｄＨＳＧ−１の核磁気共鳴スペクトル（局部）を示す。図２Ａの^１Ｈ―ＮＭＲスペクトルにおいて、５．０〜５．７ｐｐｍの範囲で５．３２ｐｐｍに現れた信号ピークはα−Ｌ−Ｆｕｃ末端基によるものであった。また、^１Ｈ−^１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルから、そのＣ２、Ｃ３及びＣ４位置におけるプロトン信号は、夫々約３．９６、４．５３、４．９６ｐｐｍに位置するのが確認できた。一方、Ｃ６位置のメチル信号は、約１．２〜１．４ｐｐｍに現れ、Ｃ５位置のプロトン信号は、約４．８８ｐｐｍに現れた。未置換Ｆｕｃの関連プロトン信号に比べ、プロトン信号が低磁場側に０．６ｐｐｍ以上もシフトしたため、そのＣ３、Ｃ４位置が硫酸エステル基に置換されたと判断でき、つまり、ｄＨＳＧ−１に含まれるＦｕｃが主にα−Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓであるのが分かった。図２〜３から、更に、ｄＨＳＧ−１に少量のα−Ｌ−Ｆｕｃ４Ｓと−２Ｓ４Ｓを含むのが確認できた。^１Ｈ―ＮＭＲスペクトルにおけるα−Ｌ−Ｆｕｃ末端基の水素信号を積分することにより、ｄＨＳＧ−１に含まれるフコース側鎖において、Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ、Ｆｕｃ４Ｓ、Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓが夫々約８２％、１２％及び６％を占めるのが確認できた。

^１３Ｃ―ＮＭＲスペクトル（図２Ｂ）から、α−Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓの末端基信号が約１０２ｐｐｍ、メチル信号が約１８．６ｐｐｍに位置するのが確認でき、糖環における他の炭素信号については、^１Ｈ−^１３Ｃ ＨＳＱＣスペクトルに基づいて確定することができる。そのうち、未置換Ｆｕｃの同一位置の炭素信号に比べ、Ｃ３及びＣ４位置の炭素信号ピークが低磁場側にシフトし、これらの位置が硫酸エステル基により置換されているのが確認できた。

β−Ｄ−ＧｌｃＵＡ末端基の炭素信号が約１０５．６ｐｐｍに現れ（図２Ｂ）、ＨＳＱＣスペクトルからその末端基の水素信号が約４．４８ｐｐｍに位置し、^１Ｈ−^１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルからそのＣ２〜Ｃ５位置のプロトン信号が夫々約３．６２、３．６６、３．９４及び３．７０ｐｐｍに位置するのが確認できた。未置換α−Ｄ−ＧｌｃＵＡの同一位置のプロトン信号に比べ、Ｃ３、Ｃ２位置のプロトン信号が低磁場側に約０．３〜０．５ｐｐｍシフトし、また、^１Ｈ−^１Ｈ ＲＯＥＳＹスペクトル（図３）から、ＨＳＧに含まれるα−Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓがα１−３グリコシド結合を介してβ−Ｄ−ＧｌｃＵＡに連結されているのが確認できた。

β−Ｄ−ＧｌｃＵＡのＣ６信号とβ−Ｄ−ＧａｌＮＡｃのＣ７信号が重なり、糖環における他の^１３Ｃ信号は、^１Ｈ−^１３ＣＨＳＱＣスペクトルに基づいて確定することができる。そのＣ３信号は約８２ｐｐｍに現れ、非置換のＣ３信号に比べて低磁場側に約３〜４ｐｐｍシフトしていることから、該位置がフコース側鎖によって置換されているのが更に実証された。

β−Ｄ−ＧａｌＮＡｃの末端基^１３Ｃ信号（約１０２ｐｐｍ、図２Ｂ）及び^１Ｈ−^１３Ｃ ＨＳＱＣスペクトルに基づき、末端基のプロトン信号が約４．５８ｐｐｍに位置し、また、^１Ｈ−^１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルに基づき、そのＣ２〜Ｃ５位置のプロトン信号が夫々約４．０５、３．９２、４．７９及び４．０１ｐｐｍに位置し、Ｃ６位置のプロトン信号が約４．２３及び４．３１ｐｐｍに位置するのが確定できた。未置換β−Ｄ−ＧａｌＮＡｃの同一位置のプロトン信号に比べ、そのＣ４、Ｃ６位置におけるプロトン信号が低磁場側へ約０．５〜０．７ｐｐｍシフトしていることから、ｄＨＳＧ−１に含まれるヘキソサミンが主にβ−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓであると確定できた。β−Ｄ−ＧａｌＮＡｃのアセチル基における特徴的なメチルプロトン信号は、約２．０４ｐｐｍに現れた。

^１３Ｃ―ＮＭＲ及びＤＥＰＴ１３５スペクトルにより、Ｃ６位置のメチレン基ピークが約６９．６ｐｐｍに位置し、未置換β−Ｄ−ＧｌｃＵＡのＣ６ピークに比べて低磁場側へ約６ｐｐｍシフトしているのが確認でき、そのＣ６が硫酸エステル基により置換されているのが実証できた。β−Ｄ−ＧａｌＮＡｃの特徴的なＣ２及びＣ８信号は、約５４ｐｐｍ及び約２５ｐｐｍに位置し、アセチルガラクトサミンの構造特性と一致した結果となっているのが確認できた。Ｃ３〜Ｃ５位置の^１３Ｃ信号は、^１Ｈ−^１３Ｃ ＨＳＱＣスペクトルに基づき夫々確定でき、表３に示された通りである。一方、Ｃ７信号がβ−Ｄ−ＧｌｃＵＡのＣ６信号と重なるのが確認できた。

化学構造の解析から、ｄＨＳＧ−１は、側鎖が主にα−Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓによって置換された（約８２％）グリコサミノグリカン誘導体であり、以下の構造単位を有することが確認できた。

｛−４）−［Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ−（α１−］−３）−Ｄ−ＧｌｃＵＡ−（β１−３）−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β−｝_ｎ

化学構造の解析から、既知のＦＧＡＧ類成分に比べ、ｄＨＳＧ−１は、１）側鎖のフコシル基が主にα−Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓであり、２）主鎖のＧａｌＮＡｃに、４，６−ジ硫酸置換が存在することが特徴であると確認できた。また、文献に開示されているマナマコ、バイカナマコ、巴西ナマコに由来のＦＧＡＧに比べ、ｄＨＳＧ−１側鎖の置換基が余り変わらず（主にα−Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓである）、主鎖ヘキソサミンのＣ６位置が全て硫酸エステル基によって置換されているため（主にβ−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓである）、化学構造において良好な均一性を有すると認められる。

実施例３：脱アセチル化・脱アミノ化解重合法によるハネジナマコ多糖成分の解重合、及びＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物（ｄＨＳＧ−２）の製造
３．１ 材料
ＨＳＧ−３として、実施例１においてハネジナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｓｃａｂｒａ）乾燥品から抽出、精製したＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含む多糖成分を用い、分子量が〜６４．２ｋＤ、ＰＤＩが〜１．０９であった。試薬として、ヒドラジン水和物、硫酸ヒドラジン、無水エタノール、水素化ホウ素ナトリウム等は、市販の分析用クラスであった。

３．２ 製造
１）部分的脱アセチル化物の製造：実施例１で得られるＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含むハネジナマコ多糖成分ＨＳＧ−３ ６０ｍｇを反応チューブに入れ、触媒として硫酸ヒドラジン１４．５ｍｇを加えた後、ヒドラジン水和物１．４５ｍＬを加え、窒素ガス雰囲気、回転速度２５０ｒｐｍで攪拌しながら７０℃温度で１２時間加熱反応させた。反応終了後、反応液にエタノールを加えてエタノール終濃度が８０％（体積比）となるようにし、３０００ｒｐｍ×１５分間遠心して沈降物を得た。得られた沈降物を５ｍＬの８０％（体積比）エタノール水溶液で３回洗浄し、脱イオン水で溶解してから３．５ｋＤの透析バッグで純水に対して３日間透析を行い、捕獲液を凍結乾燥してＨＳＧ−３の部分的脱アセチル化物５３．０ｍｇを得た。^１Ｈ―ＮＭＲ分析により、産物の脱アセチル化度が約１２％であると確認できた。

２）脱アミノ化解重合産物ｄＨＳＧ−２の製造：上記工程１）で得られたＨＳＧ−３の部分的脱アセチル化物４０ｍｇを反応フラスクに仕込み、水２ｍＬを加えて溶解した後、氷浴の条件下において５．５Ｍの亜硝酸溶液（ｐＨ４）４ｍＬを加え、氷浴の条件下において１０分間反応させて解重合した。そして、０．５ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨ９〜１０に調整して反応を中止した。

３）末端基還元と産物の精製：上記工程２）で得られた反応液に、０．５ｍｏｌ／Ｌ水素化ホウ素ナトリウムを含む０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液２ｍＬを加え、５０℃で４０分間加熱して亜硝酸を用いて解重合して得られる産物のアルデヒド基を還元した。反応終了後、室温に戻し、０．５ＭのＨ_２ＳＯ_４を滴下して過剰量の水素化ホウ素ナトリウムを除去し、最後に０．５ＭのＮａＯＨ溶液を用いて反応液を中和した。その後、１．０ｋＤａの透析バッグを用いて純水に対して２４時間透析した後、捕獲液をＧ５０ゲル浸透カラムに注入し、異調染色法により検出を行い、酸性ムコ多糖を含む溶出液を回収し、凍結乾燥して脱アミノ化解重合産物ｄＨＳＧ−２を約３８．５ｍｇ得た。

３．３ 検出
検出方法は、実施例２と同様であった。ＨＰＧＰＣ分析の結果、脱アセチル化・脱アミノ化解重合した後、産物に少量の分子量が約６０ｋＤの多糖成分（ＦＳと中性グルカンを含む）が残留することが確認でき、該高分子量の画分は、Ｇ５０ゲル浸透クロマトグラフィーで除去することができる。Ｇ５０ゲル浸透クロマトグラフィーで精製したＨＳＧ−３の脱アミノ化解重合産物ｄＨＳＧ−２は、分子量が約７．８３ｋＤであり、多分散指数（ＰＤＩ）が約１．３８であった。

ｄＨＳＧ−２の単糖構成として、ＧｌｃＵＡ、ＧａｌＮＡｃ及びＦｕｃを含み、３種類の単糖の構成比がモル比で約１．００：０．８９：１．０２であった。比較的に、ｄＨＳＧ−２産物におけるＧａｌＮＡｃの含有量がｄＨＳＧ−１の場合に比べて若干低下し、^１Ｈ―ＮＭＲスペクトルにおいて約２．０２ｐｐｍに位置するＧａｌＮＡｃアセチル基のメチル信号ピークと、約１．２３〜１．３６ｐｐｍに位置するＦｕｃメチル信号ピークとの積分面積比とはほぼ一致し、また、部分的脱アセチル化処理時の脱アセチル化度ともほぼ一致した。

^１Ｈ―ＮＭＲ、^１３Ｃ―ＮＭＲ及び２Ｄ相関スペクトルから、ｄＨＳＧ−２の主^１Ｈ、^１３Ｃ信号ピーク及び２Ｄ相関スペクトルにおける主関連ピークが何れも同じであり、或いはｄＨＳＧ−１に似ているのが確認できた。しかし、ｄＨＳＧ−１とは異なり、ｄＨＳＧ−２は、２，５−脱水タリトール基（以下、「ＡｎＴｏｌ」とも称する）に帰属の炭素、水素信号を示した。

^１Ｈ−^１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルのスピンカップリング系を利用してＡｎＴｏｌに帰属する糖環水素を容易に確定でき、そのＣ１における２つの水素信号がそれぞれ約３．６８（Ｈ１）及び３．８０ｐｐｍ（Ｈ１’）に位置し、Ｃ２〜Ｃ５における水素信号がそれぞれ約４．１３（Ｈ２）、４．５４（Ｈ３）、５．０４（Ｈ４）及び４．５１ｐｐｍ（Ｈ５）に位置し、また、Ｃ６における２つの水素信号がそれぞれ約４．３５（Ｈ６）及び４．１８ｐｐｍ（Ｈ６’）に位置するのが確認できた。^１Ｈ−^１３Ｃ ＨＳＱＣスペクトルの異種核相関信号から、ＡｎＴｏｌに帰属の炭素信号を容易に確定でき、そのＣ１〜Ｃ６における信号がそれぞれ約６３．８、８３．９、７８．９、８０．４、８０．３及び約７１．０ｐｐｍに位置するのが確認できた。

非置換のＡｎＴｏｌの同一位置にある炭素、水素信号に比べ、ｄＨＳＧ−２の末端ＡｎＴｏｌのＣ４及びＣ６信号が何れも低磁場側へシフトし、４，６−ジ硫酸エステル基による置換が存在することが考えられ、つまり、前記末端ＡｎＴｏｌがＡｎＴｏｌ４Ｓ６Ｓであり、これはｄＨＳＧ−１の主鎖にβ−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ構造が含まれていることと一致し、同時に、脱アセチル化・脱アミノ化反応において硫酸エステル基がさほど影響を受けないことを実証するものであった。

^１Ｈ―ＮＭＲスペクトルにおけるα−Ｌ−Ｆｕｃ末端基の水素積分比から、ｄＨＳＧ−２のフコース側鎖がＦｕｃ３Ｓ４Ｓ、Ｆｕｃ４Ｓ、Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓを含み、そのうち、Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓが約８３％であることが確認できた。

更に、本発明で製造した末端２，５−脱水タロース（以下、「末端ＡｎＴａｌ」とも称する）が未還元の脱アセチル化・脱アミノ化解重合産物のＮＭＲスペクトルから、末端ＡｎＴａｌのＣ１位置におけるカルボニル基が１分子の水を結合してジオール（−ｄｉｏｌ）式の水和物構造になりやすいということが確認できた。

実施例４：β−脱離解重合法によるハネジナマコ多糖成分の解重合、及びＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物（ｄＨＳＧ−３）の製造
４．１ 材料
ＨＳＧ−１として、実施例１においてハネジナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｓｃａｂｒａ）乾燥品から抽出、精製したＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含む多糖成分を用い、分子量が〜６３．２ｋＤであり、ＰＤＩが１．０９であった。試薬として、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンジル、無水エタノール、硫酸、水酸化ナトリウム、金属ナトリウム等は、何れも市販の分析用クラスであった。

４．２ 製造
１）ＨＳＧ第４級アンモニウム塩の製造：ＨＳＧ−１のサンプルを２００．４ｍｇ取って脱イオン水８ｍＬに溶かし、別途で塩化ベンゼトニウム５００ｍｇを脱イオン水８ｍＬに溶かし、塩化ベンゼトニウム溶液をＨＳＧ−１溶液に１滴ずつ滴下し、その際に振とうし続けて溶液に白色の沈降物が現れることを待ち、４０００ｒｐｍ×２０分間遠心して沈降物を回収した。沈降物を水１００ｍＬで３回洗浄し、得られた沈降物を真空オーブンに入れ、常温において２４時間減圧乾燥することによりＨＳＧ−１第４級アンモニウム塩４９０ｍｇを得た。

２）ＨＳＧ−１第４級アンモニウム塩のカルボキシ基部分のベンジルエステル化産物の製造：上記工程１）で得られるＨＳＧ−１第４級アンモニウム塩４９０ｍｇを５０ｍＬ丸底フラスコに仕込み、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１３．２ｍＬを加えて溶かした後、塩化ベンジル６．６ｍＬを加え、３５℃、５００ｒｐｍ／分間の回転速度で攪拌しながら密閉環境において２時間反応させた。反応終了後、飽和塩化ナトリウム２０ｍＬ、無水エタノール１６０ｍＬを加え、更に反応液を４０００ｒｐｍ×１５分間遠心した。沈降物を飽和塩化ナトリウムの８０％エタノールで３回洗浄した。そして、得られた沈降物を脱イオン水１０ｍＬに溶かし、分画分子量が３．５ｋＤの透析バッグを用いて水道水に対して１２時間、脱イオン水に対して３６時間透析した。捕獲液を５ｍＬに減圧濃縮した後、その一部を取って凍結乾燥し、^１Ｈ―ＮＭＲ解析を行った。^１Ｈ―ＮＭＲスペクトルの分析結果から、カルボキシ基のエステル化度が２６．９％であることが確認できた。残りの透析液は、陽イオン交換樹脂（Ｈ^＋型、カラム規格：４５ｃｍ×５ｃｍ）を用いて水素型に変え、酸性ムコ多糖を含む溶出画分を回収した。導電率計を用いて計測しつつ、０．４Ｍのテトラブチルアンモニウムヒドロキシドを用いて溶出液をｐＨ８に調整し、その後、凍結乾燥してＨＳＧ−１の部分的ベンジルエステル化産物のＴＢＡ型第４級アンモニウム塩２４５．５ｍｇを得た。

３）β−脱離解重合：上記工程２）で得られるカルボキシ基ベンジルエステル化産物のＴＢＡ型第４級アンモニウム塩２４５．５ｍｇを５０ｍＬ丸底フラスコに仕込み、ＤＭＦ４．９ｍＬ及び使用直前で調製した０．０４ＭのＥｔＯＮａ／ＥｔＯＨ ４．９ｍＬを加え、温度２５℃、窒素ガス雰囲気、回転速度５００ｒｐｍ／分間の条件下で４時間攪拌しながら反応させた。反応終了後、順に反応液に飽和ＮａＣｌ溶液９．８ｍＬ、無水エタノール１００ｍＬを加え、その後に４０００ｒｐｍ×１５分間遠心し、沈降物として部分的ベンジルエステル化のＨＳＧ−１のβ消除解重合産物（ｄＨＳＧ−３−０）を回収した。

４）ベンジル基の除去：上記工程３）得られた沈降物ｄＨＳＧ−３−０に０．１ＭのＮａＯＨを１０ｍＬ加えて完全に溶解し、３５℃、１時間の条件下でアルカリ処理を施した後、１ＭのＨＣｌを用いて溶液ｐＨを中性に調整した。アルコール濃度が約８０％（体積比）になるように無水エタノールを加え、４０００ｒｐｍ×１５分間遠心して沈降物を回収し、得られた沈降物を純水に溶かした。限外濾過は、ハネジナマコのプロトタイプＦＧＡＧと分子量分布が近似し、或いは分子量分布が重なるフコイダンＦＳ及び中性多糖ＮＰ等、β−脱離解重合が不十分である多糖類成分を除去するのに有効であるため、分画分子量が３０ｋＤａの限外濾過遠心チューブを用いて濾過した。そして、分子量が３０ｋＤａ未満の濾液を１ｋＤの透析バッグに入れ、脱イオン水を用いて３６時間透析した。捕獲液を凍結乾燥し、Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物（ｄＨＳＧ−３）約１１４ｍｇを得た。

４．３ 検出
実施例２と同様に、ｄＨＳＧ−３の理化学特性及びスペクトルの分析を行った。

表４に、ＨＳＧ−１及びその解重合産物ｄＨＳＧ−３の理化学特性及び単糖構成の分析結果を示す。分析結果から、ＨＳＧ−１に比べ、ｄＨＳＧ−３の分子量が大きく低下することが確認できた。単糖構成の分析結果から、ＨＳＧ−１に比べ、ＧｌｃＵＡに対してモル比でＧａｌＮＡｃ構成比が高くなり、Ｆｕｃの構成比が低下することが確認でき、前者は一部のＧｌｃＵＡがβ−脱離を起こし、後者はＨＳＧ−１多糖成分におけるＦＳ不純物が精製過程において更に除去されたためであると考えられる。ｄＨＳＧ−３の単糖構成において、ＧａｌＮＡｃとＦｕｃのモル比は、^１Ｈ―ＮＭＲスベクトルにおいて２つの糖基に含まれるメチル信号ピークの積分比とほぼ一致する結果となった。

ＵＶ分光光度計を用いて１９０ｎｍ〜４００ｎｍの波長範囲を測定した結果、ｄＨＳＧ−３の最大吸収波長λ_ｍａｘが２３２ｎｍであることが確認でき、ΔＵＡ不飽和結合が存在する事実と一致した。

ＮＭＲスペクトルの分析から、ｄＨＳＧ−１化合物のＮＭＲスペクトルに比べ、ｄＨＳＧ−３の^１Ｈ―ＮＭＲスペクトルにおいて約５．７６及び５．８２ｐｐｍに新たな信号ピークが現れているのが確認でき、^１Ｈ―ＮＭＲ相関スペクトルに基づき、これらの信号がβ−Ｄ−ＧｌｃＵＡのβ−脱離産物である４−デオキシ−スレオ−ヘキサ−４−エンピラノシルウロン酸−１−イル（以下、「ΔＵＡ」とも称する）の４位水素に由来する特徴的信号であることが確認できた（表５、図４）。

ｄＨＳＧ−３の^１Ｈ−^１ＨＣＯＳＹスペクトル及びＴＯＣＳＹスペクトルから、ΔＵＡのＨ４、Ｈ３、Ｈ２及びＨ１プロトン信号同士がカップリングして相関性を示すことが確認できた（図５）。ＲＯＥＳＹスペクトルから、Ｌ−Ｆｕｃ側鎖がα（１−３）グリコシド結合を介してβ−Ｄ−ＧｌｃＵＡ又はΔＵＡに結合していることが確認できた（図５）。また、β−Ｄ−ＧｌｃＵＡに結合するＬ−Ｆｕｃの末端基水素信号に比べ、ΔＵＡに結合する同類Ｆｕｃの末端基信号が低磁場側に現れた（図４）。

^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて、β−Ｄ−ＧｌｃＵＡ及びβ−Ｄ−ＧａｌＮＡｃのＣ１ピークが約９７〜１０４ｐｐｍに現れ、ΔＵＡのＣ１ピークが約１０３．５ｐｐｍに現れ，Ｃ４の化学シフトが１０６．８ｐｐｍであり、Ｃ５の化学シフトが約１４８．５ｐｐｍであった（図４）。

水素スペクトル、炭素スペクトル及びその相関スペクトルから、ｄＨＳＧ−３の主要構成単糖として、Ｄ−ＧｌｃＵＡとＤ−ＧａｌＮＡｃがβ（１→３）とβ（１→４）グリコシド結合を介して互いに連結して多糖主鎖を構成し、主鎖の二糖構造単位を構成することが確認できた。ＧｌｃＵＡのＨ２、Ｈ３化学シフトに基づき、更に^１Ｈ−^１Ｈ ＲＯＥＳＹ、^１Ｈ−^１３Ｃ ＨＭＢＣを合わせて解析することにより、Ｌ−Ｆｕｃがα（１→３）グリコシド結合を介してβ−Ｄ−ＧｌｃＵＡに結合し、且つＬ−Ｆｕｃ側鎖が主にＬ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓであることが確認できた。このことから、ｄＨＳＧ−３において、非還元末端に位置するヘキスロン酸が主にΔＵＡであることが実証された。

^１Ｈ―ＮＭＲスペクトルに示されるα−Ｌ−Ｆｕｃの末端基水素の積分比に基づき、ｄＨＳＧ−３のフコース側鎖としてα−Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ、α−Ｌ−Ｆｕｃ４Ｓ、α−Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ等の構造を含み、しかも主にα−Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓで構成されているのが確認できた。α−Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓは、全フコシル基においてモル比で約８２％を占めた。

実施例５：Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物（ｄＨＳＧ−３）のカルボキシ基の還元、及び還元性カルボニル末端基の還元アミノ化
５．１ 材料
ｄＨＳＧ−３として、実施例４で得られたＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物を用い、試薬として１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）、チラミン塩酸塩、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、ＨＣｌ、ＮａＣｌ等は、何れも市販の分析用クラスであった。

５．２ 製造
１）カルボキシ基の還元誘導体の製造：３０ｍｇのｄＨＳＧ−３を取って純水５ｍＬに溶かし、０．１ＮのＨＣｌでｐＨ４．７５に調整した。５分間以内に９０ｍｇのＥＤＣを加えた後、０．１ＮのＨＣｌを用いてｐＨ４．７５に調整した。ゆっくり攪拌しながら３６０ｍｇのＮａＢＨ_４を加え、反応液を５０℃の水浴において２時間保持した。少量の酢酸を滴下して余分のＮａＢＨ_４を除去し、脱イオン水において３．５ｋＤの透析バッグを用いて透析した。捕獲液を凍結乾燥し、カルボキシ基が還元されたＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物（ｄＨＳＧ−３ａ）約２４．６ｍｇを得た（収率：７８．３％）。

２）末端還元アミノ化誘導体の製造：３０ｍｇのｄＨＳＧ−３を０．２ｍＭのリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ８．０）２．５ｍＬに溶かし、攪拌しながら順にチラミン塩酸塩２４ｍｇ、シアノ水素化ホウ素ナトリウム９ｍｇを加えた。そして、３５℃の定温水浴に５日間置いた後、９５％のエタノール７．５ｍＬを加えて３０００ｒｐｍ×１５分間遠心し、沈降物を９５％のエタノール３ｍＬで２回洗浄し、エタノールを減圧留去した。その後、沈降物を０．１％の塩化ナトリウム溶液２ｍＬに再び溶かした後、３０００ｒｐｍ×１５分間遠心して不溶物を除去し、上澄み液を３．５ｋＤの透析バッグに入れ、脱イオン水を用いて３６時間透析した（１００ｍＬ×３回）。捕獲液を凍結乾燥し、末端が還元アミノ化されたＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物（ｄＨＳＧ−３ｂ）約２０．５ｍｇを得た（収率：６８％）。

５．３ 検出
１）ｄＨＳＧ−３ａの検出：文献（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１９７８，６３：１３−２７）を参考しつつ、液体プール検出法を利用してｄＨＳＧ−３ａのＩＲ吸収スペクトルを測定した。−ＯＳＯ_３ ⁻／−ＣＯＯ⁻モル比は、電気伝導測定法（張惟傑、糖複合体の生化学研究技術（第２版）、浙江大学出版社、１９９９、ｐ４０９−４１０）を利用して測定した。測定結果から、ｄＨＳＧ−３ａのＩＲ吸収スペクトルにβ−Ｄ−ＧｌｃＵＡのカルボニル基信号が現れず、β−Ｄ−ＧｌｃＵＡが既にβ−Ｄ−Ｇｌｃに還元されているのが確認できた。電気伝導測定法を用いて測定した結果から、電気伝導率の滴定曲線に反曲点が１点に止まり、該反曲点が硫酸エステル基によるものであり、カルボキシ基による電気伝導率の反曲点が存在しないことから、ｄＨＳＧ−３のβ−Ｄ−ＧｌｃＵＡにおけるカルボキシ基が既に還元されているのが確認できた。

２）ｄＨＳＧ−３ｂの検出：実施例１と同様に、ｄＨＳＧ−３ｂの単糖構成及びＮＭＲスペクトルを測定した。測定結果から、ｄＨＳＧ−３ｂの単糖構成においてＤ−ＧａｌＮＡｃ：Ｄ−ＧｌｃＵＡ：Ｌ−Ｆｕｃがモル比で約１．００：１．０２：１．１１であり、これはｄＨＳＧ−３ｂ構造単位の理論計算結果とほぼ一致した。^１Ｈ―ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ，δ［ｐｐｍ］）は、７．２５（２’，６’Ｈ）；６．９１（３’，５’Ｈ）；５．７４（ΔＵＡ，４Ｈ），５．３２，５．２５（Ｌ−Ｆｕｃα１Ｈ）；３．３８（８’Ｈ）；２．８２（７’Ｈ）；２．０２（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ，ＣＨ_３）；１．２６〜１．３６（Ｌ−Ｆｕｃ，ＣＨ_３）であった。Ｌ−Ｆｕｃメチル基の水素とベンゼン環の水素との積分比が約１１であり、産物の還元性末端が全て還元アミノ化されたと確認できた。

実施例６：Ｆｕｃ側鎖の硫酸エステル化パターンが異なる天然ＦＧＡＧ及びその解重合産物の抗凝固活性
６．１ 材料
１）ＦＧＡＧの測定用サンプルとしてＡＪＧ、ＴＡＧ、ＩＢＧ、ＬＧＧ、ＨＳＧ及びＰＧＧを用い、実施例１で述べたＨＳＧ−２の製造方法に基づき、市販のマナマコ（Ａｐｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、バイカナマコ（Ｔｈｅｌｅｎｏｔａ ａｎａｎａｓ）、南アメリカ産のナマコ（Ｉｓｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓ ｂａｄｉｏｎｏｔｕｓ）、ブラジルナマコ（Ｌｕｄｗｉｇｏｔｈｕｒｅａ ｇｒｉｓｅａ）、ハネジナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｓｃａｂｒａ）及びグリーフェーナマコ（Ｐｅａｒｓｏｎｏｔｈｕｒｉａｇｒａｅｆｆｅｉ）乾燥品から抽出することにより製造したものであった。

２）ｄＦＧＡＧの測定用サンプルとしてｄＡＪＧ、ｄＴＡＧ、ｄＩＢＧ、ｄＬＧＧ、ｄＨＳＧ及びｄＰＧＧを用い、実施例２で述べたｄＨＳＧ−１の製造方法に基づき，ＡＪＧ、ＴＡＧ、ＩＢＧ、ＬＧＧ、ＨＳＧ及びＰＧＧを出発原料とし、過酸化解重合法を用いて解重合し、更に精製することにより製造したものであった。

３）試薬として、人コントロール血漿、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）測定キット及びプロトロンビン時間（ＰＴ）測定キットは、ドイツＴＥＣＯ社製であり、また、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ、エノキサパリンナトリウム注射液）は、サノフィ・アベンティス社製であり、プレカリクレイン（ＰＫ）、カリクレイン基質、コアグラーゼ（ＩＩａ）１００ＮＩＨＵ／ｍｇ、コアグラーゼ発色基質（ＣＳ−０１３８）２５ｍｇ／バイアル、ヘパリン補因子ＩＩ（ＨＣ−ＩＩ）１００μｇ／バイアル、及び第ＶＩＩＩ因子測定キットは、フランスＨＹＰＨＥＮ ＢｉｏＭｅｄ社製であり、第ＶＩＩＩ因子（ｆ．ＶＩＩＩ）２００ＩＵ／バイアルは、中国上海ＲＡＡＳ社製の製品を使用し、また、デルマタン硫酸（ＤＳ）はＳｉｇｍａ社製であり過硫酸化コンドロイチン硫酸（ＯＳＣＳ）は、ドイツＳｅｒｖａ Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｈｏｒｅｓｉｓ ＧｍｂＨ社の製品を使用した。測定装置として、米国ＢｉｏＴｅｋ社のＣｈｒｏｎｏｌｏｇ−７００型血小板凝集測定装置を使用した。

６．２ 方法
１）抗凝固活性の測定：上記ＦＧＡＧ、ｄＦＧＡＧ試料及び標準品用生理食塩水を用いて一連の濃度を有する測定用試料に調製し、コントロール血漿、測定キット及びＭＣ−４０００型凝固計を用い、測定キットのマニュアルに従って人コントロール血漿のＡＰＴＴ、ＰＴ時間に対する試料溶液の影響を測定した。

２）内因系第Ｘ因子活性化複合体（ｆ．Ｘａｓｅ）阻害活性の測定：一連の濃度を有するＦＧＡＧ及びｄＦＧＡＧ溶液３０μＬと、第ＶＩＩＩ因子（２ＩＵ／ｍＬ）３０μＬとを混合した後、第ＶＩＩＩ因子測定キットのマニュアルに従って順に第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子及び第Ｘａ因子の基質（ＳＸａ−１１）を加えてＯＤ_{４０５ｎｍ}を測定し、文献（Ｂｌｏｏｄ，２００６，１０７：３８７６−３８８２）に記載の方法に従って第Ｘ因子活性化複合体に対する各試料のＥＣ_５０値を算出した。

３）ＨＣＩＩに依存の抗トロンビン（第ＩＩａ因子）活性の測定：一連の濃度を有する試料溶液を９６ウェルプレートに入れ、順に３０μＬのＨＣ−ＩＩ（１μＭ）、第ＩＩａ因子（１０Ｕ／ｍＬ）及びＣＳ−０１３８（４．５ｍＭ、発色基質）を加えた後、３７℃で２分間保持し、ＯＤ_{４０５ｎｍ}を測定することにより第ＩＩａ因子に対する各試料のＥＣ_５０値を算出した。

４）第ＸＩＩ因子促進活性の測定：一連の濃度を有する試料溶液及び標準品溶液３０μＬを夫々９６ウェルプレートに入れ、順に３０μＬの第ＸＩＩ因子（２５μｇ／ｍＬ）、３０μＬのＰＫ（６２０ｎＭ）及び３０μＬの発色基質を加えた後、３７℃で１分間保持してからＯＤ４０５ｎｍを測定した。

５）血小板促進活性の測定：健康受験者から採集した血漿を用いて多血小板血漿（ＰＲＰ）和少血小板血漿（ＰＰＰ）を調製し、Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ−７００型血小板凝集計を用いて比濁法により、生理食塩水で調製した上記ＦＧＡＧ、ｄＦＧＡＧ試料溶液の血小板凝集能を測定した。

６．３ 結果
１）抗凝固活性：上記ＦＧＡＧ、ｄＦＧＡＧ及び標準品の抗凝固活性を表６に纏めて示す。

異なる品種に由来のＦＧＡＧ及びｄＦＧＡＧについて、フコース側鎖の硫酸エステル化パターン及びその構成比は、ｄＦＧＡＧの^１Ｈ―ＮＭＲスペクトル積分値に基づいて算出した（図６）。表６に示されるように、プロトタイプＦＧＡＧによって人コントロール血漿のＡＰＴＴを倍増するときの薬物濃度が約２．２〜３．３μｇ／ｍＬであり、異なる品種に由来のＦＧＡＧはＡＰＴＴ倍増活性において顕著な差を示さなかった。解重合したｄＦＧＡＧは、夫々活性差異を示し、そのうち、Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ側鎖を含むｄＩＢＧの活性が最も高く、ｄＨＳＧがｄＩＢＧに似ており、ｄＬＧＧの活性が最も弱かった。

ＦＧＡＧの第Ｘ因子活性化複合体に対するＩＣ_５０値が約１２．２〜１９．４ｎｇ／ｍＬの範囲であり、各品種に由来のＦＧＡＧを比較する場合、活性強度に明らかな差はなかった。解重合した後、ｄＡＪＧ及びｄＬＧＧがプロトタイプに比べて弱い活性を示し、他のｄＦＧＡＧは、プロトタイプに比べて何れ高い活性を示した。また、これらのｄＦＧＡＧは、第Ｘ因子活性化複合体に対して異なる阻害活性を示し、そのうち、ｄＩＢＧの活性が最も高く、ｄＩＢＧの次にｄＨＳＧの活性が比較的高く、ｄＬＧＧの活性が最も弱かった。

ＦＧＡＧにして見れば、そのＨＣＩＩに依存の抗第ＩＩａ因子活性のＩＣ_５０値が約３００〜４００ｎｇ／ｍＬの範囲であった。解重合したｄＦＧＡＧは、プロトタイプに比べて高くなり、ＩＣ_５０値が約１３０〜２５０ｎｇ／ｍＬの範囲であった。そのうち、ＨＳＧ及びｄＨＳＧの活性が最も高く、ＩＢＧ及びｄＩＢＧの活性最も弱かった。

また、Ｌ−Ｆｕｃの硫酸エステル化パターンにして見れば、ＰＧＧ／ｄＰＧＧとＨＳＧ／ｄＨＳＧがほぼ同様であった。また、ＰＧＧ／ｄＰＧＧとＨＳＧ／ｄＨＳＧの抗凝固活性及び凝固因子に対する阻害活性もほぼ同様であった。

２）第ＸＩＩ因子促進活性の測定：異なる品種に由来のＦＧＡＧ及びその解重合産物ｄＦＧＡＧの第ＸＩＩ因子促進活性を図７に示す。他のＦＧＡＧに比べ、フコース側鎖が主にＦｕｃ３Ｓ４ＳであるＨＳＧとＰＧＧは、第ＸＩＩ因子に対する促進活性が弱く、これらの解重合産物も類似した特性を示した。一方、ＨＳＧの主鎖及び側鎖における硫酸エステル基の含有量が何れもＬＧＧに比べて高くなり、ＴＡＧに比べても少し高くなり、ＡＪＧとは同じ程度であり、ＩＢＧに比べると若干低下した。また、第ＸＩＩ因子促進活性は何れも顕著に低下し、ＦＧＡＧ成分による第ＸＩＩ因子の促進作用が単にその負電荷量に依存せず、側鎖の硫酸エステル化パターンによっても影響されているのが確認できた。

３）血小板促進活性の測定：血小板活性に対するＦＧＡＧ及びｄＦＧＡＧの影響を表７に纏めて示す。

表７に示されるように、フコース側鎖が主にＦｕｃ３Ｓ４ＳであるＨＳＧ与ＰＧＧは、健康受験者の血小板促進活性が顕著に低下し、これらの解重合産物も似たような特性を示した。他のｄＦＧＡＧに比べ、ｄＩＢＧの血小板促進活性が最も高く、負電荷量が少ないｄＬＧＧの場合には一定程度の血小板促進活性を示した。これらの結果から、ＦＧＡＧ及びｄＦＧＡＧの血小板促進活性がフコース側鎖の硫酸エステル化パターンに影響されるのが確認できた。

本実施例の測定結果から、フコース側鎖が主にＦｕｃ３Ｓ４Ｓで構成されるＦＧＡＧ類成分は、抗凝固・抗血栓活性が高く、第Ｘ因子活性化複合体に対して強い阻害活性を示すと同時に、ＨＣＩＩに依存の抗第ＩＩａ因子活性を示すことで強い抗凝固活性を示すが、第ＸＩＩ因子及び血小板に対しては促進活性を示さず、或いは促進活性が比較的に弱いのが確認できた。

実施例７：異なる解重合法により得られるｄＨＳＧ産物の抗凝固活性
７．１ 材料
Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物試料として、ＨＳＧ−２（Ｍｗ： ６３．５ｋＤ、ＰＤＩ：１．０６、実施例２で製造したものである）、ｄＨＳＧ−４（Ｍｗ：１０．９ｋＤ、ＰＤＩ：１．３５、過酸化解重合法により製造したものである）、ｄＨＳＧ−５（Ｍｗ：７．５ｋＤ、ＰＤＩ：１．２８、脱アミノ化解重合法により製造し且つ末端が還元されたものである）、及びｄＨＳＧ−６（Ｍｗ：８．４ｋＤ、ＰＤＩ：１．３３、β−脱離解重合法により製造し且つ末端が還元アミノ化されたものである）を用いた。試薬及び測定装置は、実施例６と同じであった。

７．２ 方法
実施例６と同様にして測定を行った。

７．３ 結果
ｄＨＳＧ−４〜ｄＨＳＧ−６の抗凝固活性を表８に纏めて示す。

表７の結果から、ＨＳＧを異なる方法で解重合して得られる産物は何れも高い抗凝固活性、第Ｘ因子活性化複合体阻害活性及びＨＣＩＩに依存の抗トロンビン活性を示すのが分かる。そのうち、抗凝固活性は、主に内因系凝固機構を抑制することであり（例えば、ＡＰＴＴを顕著に延長する）、外因系凝固機構に対しては殆ど影響がなかった（例えば、ＰＴを延長することができない）。プロトタイプＨＳＧ−２は、凝固系の共通経路に対して影響が大きく（例えば、ＴＴを延長することができ、ＨＳＧ−２は、ＡＴＩＩＩに依存の抗トロンビン活性を示す）、一方、解重合試料は、ＴＴに対して余り影響がなかった。

実施例８：異なる分子量のｄＨＳＧの抗凝固活性
８．１ 材料
試料としてＨＳＧ−ａは、重量平均分子量が６３．６ｋＤであり、実施例１でＨＳＧ−２を製造する際の方法を利用して市販のハネジナマコ乾燥品から抽出、精製し、更にイオン交換交カラムで精製した後にＮａ^＋塩の形態に変換した。ｄＨＳＧ−１ａは、重量平均分子量が４９．０ｋＤであり、ｄＨＳＧ−２ａは、重量平均分子量が２７．８ｋＤであり、ｄＨＳＧ−３ａは、重量平均分子量が１４．９ｋＤであり、ｄＨＳＧ−４ａは、重量平均分子量が８．２４ｋＤであり、ｄＨＳＧ−５ａは、重量平均分子量が５．３０ｋＤであり、ｄＨＳＧ−６ａは、重量平均分子量が３．１２ｋＤであった。上記ｄＨＳＧ−１ａ〜ｄＨＳＧ−−６ａは、何れもＨＳＧ−ａの解重合産物であり、解重合方法として実施例１のβ−脱離解重合法を利用し、還元性末端が何れも糖アルコール基に還元された。試薬及び測定装置は、実施例６と同じであった。

８．２ 方法
実施例６と同様にして測定を行った。

８．３ 結果
ｄＨＳＧ−１ａ〜ｄＨＳＧ−６ａの抗凝固活性を表９及び図８に示す。

表９から、ＨＳＧ及びその解重合産物は、分子量が６０ｋＤ〜３ｋＤの範囲であり、質量濃度からすれば、その解重合産物の第Ｘ因子活性化複合体に対する阻害活性とＨＣＩＩに依存の抗トロンビン活性が何れも分子量低下につれて徐々に増加した後に一転して徐々に低下する傾向を示し、また、第Ｘ因子活性化複合体に対する阻害活性は、分子量が約８ｋＤである時に最も高くなり、ＨＣＩＩに依存の抗トロンビン活性は、分子量が約５ｋＤである時に最も高かった。

ＴＡＧ解重合産物の抗凝固活性と分子量との関連性については既に研究報告がなされている。ＴＡＧ解重合産物は、分子量が約１０〜１２ｋＤ以下の場合に第Ｘ因子活性化複合体に対する阻害活性が次第に低下し、分子量が約８ｋＤになるまでＨＣＩＩに依存の抗トロンビン活性がほぼ一定であり、それ以下になると次第に低下する結果を示した。したがって、分子量と抗凝固活性の関連性に注目する場合、ＨＳＧ解重合産物は低分子量でより優れた抗凝固活性を示すのが分かる。

多糖類化合物の理化学特性、薬理学活性及び安全性の観点から、ＨＳＧ、並びに構造が類似し且つ側鎖のフコシル基が主にＦｕｃ３Ｓ４ＳであるＦＧＡＧ解重合産物は、重量平均分子量が約３ｋＤ〜１０ｋＤの範囲であることが好ましく、重量平均分子量が約４．５ｋＤ〜９ｋＤの範囲であることがより好ましいと認められる。

実施例９：低分子量フコシル化グリコサミノグリカンの注射用凍結乾燥品の製造
９．１ 材料
ｄＨＳＧは、実施例４及び実施例５でｄＨＳＧ−３ａを製造する場合と同様にして製造し、重量平均分子量が〜５．５ｋＤａであり、ＰＤＩが〜１．２０であった。

９．２ 配合
下記表１０に示される割合で配合した。

９．３ 製造方法
配合量に従って低分子量フコシル化グリコサミノグリカンナトリウム塩を秤量し、注射用水を全量で添加した後、攪拌して完全に溶解させ、バッチ式の加熱加圧法で滅菌処理を施した。０．６％の薬用活性炭を加えて２０分間攪拌した後、ブフナー漏斗及び３．０μｍ精密濾過膜を用いて濾過して活性炭を取り除き、熱源物質を除去した。中間体の含有量を測定し、合格となったものを０．２２μｍの精密濾過膜で濾過した。０．５ｍＬずつ管状バイアルに分注し、開口にゴム栓を半分程度に押し付けた後、凍結乾燥機に入れ、指定の凍結乾燥曲線に従って凍結乾燥した。そして、ゴム栓を全部押し付けて凍結乾燥機から取り出した。アルミ製キャップで堅固に密封し、目視で合格したか否かを判断し、合格したもののみを包装して最終製品とした。

凍結乾燥は、以下の手順に従って行った。すなわち、試料を凍結乾燥機に投入し、内部温度を−４０℃に下げて３時間保持した。冷却トラップ内を−５０℃までに下げ、３００μｂａｒとなるまで真空引きした。昇華が始まると、１時間かけて定速で−３０℃に昇温し、２時間保持した。そして、２時間かけて定速で−２０℃に昇温した後、２００〜３００μｂａｒの真空度で８時間保持した。更に、２時間かけて−５℃に昇温し、１５０〜２００μｂａｒの真空度で２時間保持することにより乾燥処理を施した。０．５時間かけて１０℃に昇温し、８０〜１００μｂａｒの真空度で２時間保持した。最後に、０．５時間かけて４０℃に昇温し、最低真空度で４時間保持した。

Claims (14)

1. Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物及びその薬学的に許容可能な塩であって、
   前記Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓは、３，４−ジ硫酸エステル基−Ｌ−フコース−１−イルであり、
   前記置換の低分子グリコサミノグリカン混合物は、下記式（Ｉ）に示す構造を有する低分子グリコサミノグリカン混合物である、Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物及びその薬学的に許容可能な塩。
   
   ［式（Ｉ）中、環Ａは、β−Ｄ−グルクロン酸基又はβ−Ｄ−グルコシル基であり、そのうち、Ｒ_１が−ＣＯＯ⁻、−ＣＨ_２ＯＨ、−ＣＯＲ_１０であり、Ｒ_１０が各自独立して直鎖状又は分岐状の置換又は非置換のＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ７〜Ｃ１２アラルキル基である。
   環Ｂは、β−Ｄ−２−アミノ−２−デオキシ−ガラクトシル基であり、そのうち、Ｒ_２が−ＣＯＣＨ_３又は−Ｈであり、Ｒ_３及びＲ_４が各自独立して−Ｈ又は−ＳＯ_３ ⁻である。
   環Ｃは、α−Ｌ−フコシル基であり、そのうち、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７が各自独立して−Ｈ又は−ＳＯ_３ ⁻であり、モル比でＲ_５が−Ｈ、Ｒ_６及びＲ_７が−ＳＯ_３ ⁻であるα−Ｌ−フコシル基、すなわち、３，４−ジ硫酸エステル基−Ｌ−フコース−１−イルが全α−Ｌ−フコシル基において７５％以上を占める。
   Ｒ_８は、下記式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）に示す構造を有する置換基である。
   
   
   式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）中、環Ａは、β−Ｄ−グルクロン酸基又はβ−Ｄ−グルコシル基であり、環Ａ’は、４−デオキシ−スレオ−ヘキサ−４−エンピラノシルウロン酸基であり、式中のＲ_１は、上記と同じである。
   環Ｃは、α−Ｌ−フコシル基であり、そのうち、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７は、上記と同じである。
   Ｒ_９は、下記式（ＩＶ）、式（Ｖ）又は式（ＶＩ）に示す構造を有する置換基である。
   
   
   
   式（ＩＶ）、（Ｖ）及び（ＶＩ）中、環Ｂは、置換基を有するα−又はβ−Ｄ−２−アミノ−２−デオキシ−ガラクトシル基であり、Ｂ’は、置換基を有する２−アミノ−２−デオキシ−ガラクトース−３−イルのアルデヒド基還元物、すなわち、その糖アルコール、グリコシルアミン又はＮ−置換のグリコシルアミン誘導体であり、Ｂ”は、置換基を有する２，５−脱水タロース残基又はその糖アルコール、グリコシルアミン又はＮ−置換のグリコシルアミン誘導体であり、そのうち、Ｒ_３及びＲ_４は、上記と同じであり、Ｒ_１１は、ヒドロキシ基、アミノ基、Ｃ１〜Ｃ６のアルキルアミノ基、Ｃ７〜Ｃ１２のアリールアミノ基であり、Ｒ_１２は、カルボニル基、ジヒドロキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、Ｃ１〜Ｃ６のアルキルアミノ基、Ｃ７〜Ｃ１２のアリールアミノ基である。
   Ｒ_８が式（ＩＩＩ）に示す構造である場合、Ｒ_９は、式（ＩＶ）又は式（Ｖ）に示す構造を有し、Ｒ_９が式（ＶＩ）に示す構造である場合、Ｒ_８は、式（ＩＩ）に示す構造を有する。
   ｎは、２〜２０の整数であり、且つモル比でｎが４〜９である化合物が全化合物において７５％以上を占める。
   前記低分子グリコサミノグリカン混合物は、重量平均分子量（Ｍｗ）が４．５〜９ｋＤの範囲であり、多分散指数（ＰＤＩ）の値が１．６以下である。］
2. 前記混合物は、下記式（ＶＩＩ）に示す構造を有する低分子グリコサミノグリカンの混合物である、請求項１に記載のＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物及びその薬学的に許容可能な塩。
   
   ［式（ＶＩＩ）中、構造断片Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃは、請求項１と同じであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_１１も請求項１と同じである。
   ｎは、３〜１５の整数であり、且つモル比でｎが４〜９である化合物が全化合物において７５％以上を占める。
   式（ＶＩＩ）で表される化合物において、Ｌ−フコース−３，４−ジ硫酸エステル基、すなわち、α−Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ基がモル比で全α−Ｌ−フコシル基において７５％以上を占め、
   且つ、前記低分子グリコサミノグリカン混合物の重量平均分子量（Ｍｗ）は、４．５〜９ｋＤの範囲である。］
3. 前記混合物は、下記式（ＶＩＩＩ）に示す構造を有する低分子グリコサミノグリカンの混合物である、請求項１に記載のＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物及びその薬学的に許容可能な塩。
   
   ［式（ＶＩＩＩ）中、構造断片Ａ、Ｂ、Ｂ”、Ｃは、請求項１と同じであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_１２も請求項１と同じである。
   ｎは、３〜１５の整数であり、且つモル比でｎが４〜９である化合物が全化合物において７５％以上を占める
   式（ＶＩＩＩ）で表される化合物において、Ｌ−フコース−３，４−ジ硫酸エステル基、すなわち、α−Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ基がモル比で全α−Ｌ−フコシル基において７５％以上を占め、
   且つ、前記低分子グリコサミノグリカン混合物の重量平均分子量（Ｍｗ）は、４．５〜９ｋＤの範囲である。］
4. 前記混合物は、下記式（ＩＸ）に示す構造を有する低分子グリコサミノグリカンの混合物である、請求項１に記載のＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物及びその薬学的に許容可能な塩。
   
   ［式（ＩＸ）中、構造断片Ａ、Ｂ、Ｂ’、Ｃは、請求項１と同じであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_１１も請求項１と同じである。
   ｎは３〜１５の整数であり、且つモル比でｎが４〜９である化合物が全化合物において７５％以上を占める。
   式（ＸＩ）で表される化合物において、Ｌ−フコース−３，４−ジ硫酸エステル基、すなわち、α−Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ基がモル比で全α−Ｌ−フコシル基において７５％以上を占め、
   且つ、前記低分子グリコサミノグリカン混合物の重量平均分子量（Ｍｗ）は、４．５〜９ｋＤの範囲である。］
5. 前記低分子グリコサミノグリカン混合物は、ナマコに由来のＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを解重合することにより製造され、
   前記Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンは、単糖構成としてモル比が１：（１±０．３）：（１±０．３）の範囲であるＤ−グルクロン酸、Ｄ−アセチルガラクトサミン及びＬ−フコースを含み、
   α−Ｌ−フコシル基において、３，４−ジ硫酸エステル基−α−Ｌ−フコシル基がモル比で７５％以上を占める、請求項１〜４の何れか１項に記載のＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物及びその薬学的に許容可能な塩。
6. 前記ナマコに由来のＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンは、新鮮又は乾燥のハネジナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｓｃａｂｒａ）又はグリーフェーナマコ（Ｐｅａｒｓｏｎｏｔｈｕｒｉａｇｒａｅｆｆｅｉ）の体壁及び／又は内臓から抽出、精製したものである、請求項５に記載のＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物及びその薬学的に許容可能な塩。
7. 前記薬学的に許容可能な塩は、Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物のナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩である、請求項１に記載のＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物及びその薬学的に許容可能な塩。
8. 請求項１に記載のＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物及びその薬学的に許容可能な塩の製造方法であって、以下の工程１〜工程２を含み、
   工程１：新鮮又は乾燥のハネジナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｓｃａｂｒａ）又はグリーフェーナマコ（Ｐｅａｒｓｏｎｏｔｈｕｒｉａ ｇｒａｅｆｆｅｉ）からＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含む多糖成分を抽出、精製し、
   前記Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含む多糖成分は、均一した分子量を有し、つまり、ゲル濾過カラムで分析する際に唯一の多糖ピークを示し、多分散指数が１〜１．５の範囲であり、且つ、該多糖成分におけるＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンの含有率が約８０％以上であり、
   前記Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンは、フコシル化グリコサミノグリカンであり、単糖構成としてモル比が１：（１±０．３）：（１±０．３）のＤ−グルクロン酸、Ｄ−アセチルアミノガラクトース及びＬ−フコースを含み、
   また、α−Ｌ−フコシル基全体において、３，４−ジ硫酸エステル基−α−Ｌ−フコシル基がモル比で７５％以上を占め、
   工程２：工程１で得られた多糖成分におけるＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを、重量平均分子量（Ｍｗ）が約４．５ｋＤ〜９ｋＤの低分子グリコサミノグリカン混合物に解重合し、前記解重合法は、下記方法１〜３の何れかであり、
   方法１（β−脱離解重合法）：前記工程１で多糖成分を得た後、グリコサミノグリカン中の１０％〜５０％のヘキスロン酸を、第４級アンモニウム塩化とエステル化反応によってヘキスロン酸カルボン酸エステルに変換し、そして、非水溶媒、アルカリ性試薬の存在下において、得られたグリコサミノグリカンのカルボン酸エステル化物をβ−脱離処理することにより、目的の分子量範囲を有し、且つ非還元性末端が４−デオキシ−スレオ−ヘキサ−４−エンピラノシルウロン酸基である解重合産物を取得し、
   方法２（脱アセチル化・脱アミノ化解重合法）：硫酸ヒドラジンの存在下又は非存在下において、ヒドラジンを用いて前記工程１で得られた多糖成分を処理し、Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカン中の１０〜３５％のＤ−アセチルアミノガラクトシル基を脱アセチル化させ、部分的脱アセチル化物を得た後、亜硝酸で処理することにより脱アミノ化して解重合することにより、目的の分子量範囲を有し、且つ還元性末端が２，５−脱水タロース残基である低分子グリコサミノグリカンの混合物を取得し、
   方法３（過酸化処理解重合法）：銅イオンの存在下、終濃度が３％〜１０％のＨ_２Ｏ_２を用いて前記工程１で得られた多糖成分を処理し、目的の分子量範囲を有する低分子グリコサミノグリカンの混合物を取得し、
   上記方法１〜３の何れかで製造した解重合産物に対して、随意にカルボキシ基の還元処理及び／又は末端基の還元処理を施すことにより、ヘキスロン酸を相応のヘキソースに変換し、及び／又は還元性末端のＤ−２−アセチルアミノ−２−デオキシ−ガラクトシル基及び／又は２，５−脱水タロース残基を相応の糖アルコール、グリコシルアミン又はＮ置換のグリコシルアミンに変換し、
   前記解重合産物、及びカルボキシ基及び／又は末端基が還元された解重合産物を、随意に沈降法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、透析法及び／又は限外濾過法を用いて処理し、更に減圧乾燥及び／又は凍結乾燥してＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物の固形体を取得することを特徴とする、製造方法。
9. 前記工程１で得られたＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含む多糖成分を、前記工程２におけるβ−脱離解重合法を用いて解重合し、
   前記エステル化反応により、前記工程１で得られた多糖成分中のＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを第４級アンモニウム塩に変えた後、非プロトン性の溶媒系において、ハロゲン化炭化水素又は芳香族ハロゲン化合物と反応させてエステル化度が約１０％〜５０％のグリコサミノグリカンのカルボン酸エステル化物を取得し、
   そのうち、β−脱離反応で使用する非水溶媒は、エタノール、メタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ＣＨ_２Ｃｌ_２、ＣＨＣｌ_３、及びこれらの混合物からなる群より選ばれる１種以上であり、β−脱離反応で使用するアルカリ性試薬は、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃ１〜Ｃ４のナトリウムアルコキシド、エチルジアミン、トリ−ｎ−ブチルアミン、４−ジメチルアミノピリジン、及びこれらの混合物からなる群より選ばれる１種以上であることを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
10. 前記工程１で得られたＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換のグリコサミノグリカンを含む多糖成分を、前記工程２における脱アセチル化・脱アミノ化解重合法を用いて解重合し、
    前記方法２におけるヒドラジン処理は、前記グリコサミノグリカン混合物を無水ヒドラジン又はヒドラジン水和物の溶液に溶解し、硫酸ヒドラジンの存在下又は非存在下において反応することにより遂行され、
    前記方法２における亜硝酸処理は、氷浴〜室温の条件下において、部分的脱アセチル化物をｐＨ２〜５の亜硝酸溶液に溶解して５分間〜６０分間反応させた後、溶液をアルカリ性に調整して反応を中止することにより遂行されることを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
11. 請求項１に記載のＦｕｃ３Ｓ４Ｓ置換の低分子グリコサミノグリカン混合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む薬物組成物であって、
    抗凝固効果を示す有効量で前記低分子グリコサミノグリカン混合物又はその薬学的に許容可能な塩と、賦形剤及び／又は薬用添加剤とを含んでなることを特徴とする、薬物組成物。
12. 前記薬物組成物は、注射用水溶液又は注射用凍結乾燥粉体の形態である、請求項１１に記載の薬物組成物。
13. 前記薬用添加剤は、薬学的に許容可能な塩化ナトリウム、リン酸緩衝塩である、請求項１１に記載の薬物組成物。
14. 請求項１１に記載の薬物組成物を用いて得られる、血栓症の治療及び／又は予防薬。