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CN102247401A - 低分子量糖基化硫酸软骨素及其在抗hiv-1药物制备中的用途 - Google Patents

低分子量糖基化硫酸软骨素及其在抗hiv-1药物制备中的用途 Download PDF

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CN102247401A
CN102247401A CN2011101148604A CN201110114860A CN102247401A CN 102247401 A CN102247401 A CN 102247401A CN 2011101148604 A CN2011101148604 A CN 2011101148604A CN 201110114860 A CN201110114860 A CN 201110114860A CN 102247401 A CN102247401 A CN 102247401A
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CN
China
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lgc
hiv
gcs
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product
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CN2011101148604A
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English (en)
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赵金华
刘吉开
郑永唐
吴明一
黄宁
李姿
何江波
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Kunming Institute of Botany of CAS
Kunming Institute of Zoology of CAS
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Kunming Institute of Botany of CAS
Kunming Institute of Zoology of CAS
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Abstract

本发明公开了一种低分子量糖基化硫酸软骨素，其重均分子量为3000～15000Da，单糖组成为乙酰氨基半乳糖(D-GalNAc)、葡萄糖醛酸(D-GlcUA)、岩藻糖(L-Fuc)、或其硫酸酯(-OSO3 -表示)，D-GalNAc∶D-GlcUA∶L-Fuc∶-OSO3 -的摩尔比例约为1∶(1±0.3)∶(1±0.3)∶(3.5±0.5)。所述低分子量糖基化硫酸软骨素具有强效抗HIV-1病毒活性，为gp120侵入抑制剂，可用于预防和/或治疗艾滋病。本发明还提供制备所述低分子量糖基化硫酸软骨素及其药用组合物制剂的方法，采用过氧化物法解聚糖基化硫酸软骨素以获得低分子量产物，然后通过凝胶分离或超滤方法除去产物中的低分子和/或高分子杂质成分。所述低分子量糖基化硫酸软骨素及其药用组合物可制备成注射剂、冻干粉针或栓剂。

Description

低分子量糖基化硫酸软骨素及其在抗HIV-1药物制备中的用途
技术领域
本发明涉及一种低分子量糖基化硫酸软骨素(Low molecular weightGlycosylated Chondroitin sulfate，LGC)及其制备方法、含LGC的药用组合物及其在预防和/或治疗艾滋病药物制备中的用途。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV-1)感染所致获得性免疫缺陷综合症(aquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是严重危害人类生命健康的重大疾病。联合国艾滋病规划署2010年11月23日发布报告称估计全球共有3330万人感染艾滋病毒，自1981年6月首次确认艾滋病以来共有2500万人死亡。在中国，截至2009年底，估计现有74万成人与儿童感染艾滋病病毒，4.8万为2009年新增感染。这些患者中，估计有10.5万为艾滋病病例，2.6万在2009年死于艾滋病相关病因。艾滋病的临床治疗除了对并发症治疗、抗感染治疗、免疫调节治疗外，其最主要的有效治疗方法是高效抗病毒治疗。资料显示，自1996年联合抗逆转录病毒疗法(HAART，至少三种核苷类/非核苷类抗逆转录病毒药物及蛋白酶抑制剂联用)问世至2006年以来，艾滋病人从确诊之日起的平均存活时间已从0.26年增加到13.3年。尽管艾滋病的治疗已取得巨大进步，但仍存在难以治愈、治疗无应答、耐药性出现、毒副作用显著等缺陷。目前，由于治疗无应答或耐药性产生等原因，HAART治疗对约30％的艾滋病患者无效。
为使HAART治疗无效的患者能够得到有效的药物治疗，临床迫切需要新型抗HIV-1药物，其所述新型抗HIV-1应当与抗逆转录病毒药物及蛋白酶抑制剂的药理学作用靶点不同。
糖基化硫酸软骨素(Glycosylated chondroitin sulfate，GCs)是一种存在岩藻糖侧链取代的糖胺聚糖类似物，其多糖主链类似硫酸软骨素，由己糖醛酸、氨基己糖构成的二糖结构单元顺次连接形成，主链及侧链糖羟基均可存在硫酸酯化基团。天然GCs主要来源于棘皮动物体壁或内脏，其具有[→4)D-GlcUA(β1→3)D-GalNAc(1→]的主链结构单元，其侧链硫酸岩藻糖则以(α1→3)糖苷键连接于D-GlcUA(J Biol Chem，1988，263(34)：18176-83和J Biol Chem，1991，266(21)：13530-6)。天然GCs具有显著抗凝血活性，其特点是具有强效抑制内源性因子X酶(internal factor tenase，f.Xase)活性，并存在显著的HCII依赖的抗凝血酶(f.IIa)活性。如中国专利公开号CN101735336A公开了制备低聚岩藻糖化糖胺聚糖的方法，其是通过在水相介质中用第四周期过渡金属离子催化的过氧化物解聚法解聚岩藻糖化糖胺聚糖制备得到，该制备方法反应条件温和、重现性和稳定性好、裂解选择性高，产物质量均一可控。获得的低聚岩藻糖化糖胺聚糖以GalNAc作为还原性末端的聚糖分子数不低于80％，重均分子量为约6,000Da～20,000Da，PDI为1.0～2.0。
由此可见，研究低分子量糖基化硫酸软骨素(LGC)及其制备方法、含LGC的药用组合物及其在预防和/或治疗艾滋病药物制备中的用途，具有重大意义。
发明内容
本发明目的首先是提供一种低分子量糖基化硫酸软骨素(LGC)及其药学上可接受的盐在抗1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)药物制备中的用途，其中所述LGC是具有式(I)结构的同系糖胺聚糖衍生物的混合物，
Figure BDA0000059256630000021
式(I)中：
D-GlcUA-β1-，为β-D-葡萄糖醛酸-1-基；
D-GalNAc-β1-，为β-D-N-乙酰氨基半乳糖-1-基；
L-Fuc-α1-，为α-L-岩藻糖-1-基；
R1为-H或D-GalNAc-β1-；
R3、R5、R5、R6、R7相互独立地为-H或-SO3 -；
R2可以是-OH、-4-O-D-GlcUA，也可以是式(II)或(III)所示基团：
Figure BDA0000059256630000031
其中，R’为L-Fuc-α1-取代基团，且L-Fuc-α1-上存在同式(1)结构的硫酸酯基；
R”为-4-[L-Fuc(α1-3)]D-GlcUA-β1-基团，其L-Fuc-α1-上存在同式(1)结构的硫酸酯基，
R3、R4同上文定义。
以摩尔比计，所述LGC所含D-GlcUA、D-GalNAc、L-Fuc三种单糖残基与所含-OSO3 -基的比例范围为1∶(1±0.3)∶(1±0.3)∶(3.5±0.5)；
n是均值为约3～17的整数；
所述LGC的重均分子量范围为3000～15000Da。
本发明之LGC的分子量可采用高效凝胶色谱法(HPLPC)检测。从抗HIV-1活性强度以及避免血液学影响考虑，以重均分子量计，本发明选择的低分子量糖基化硫酸软骨素的分子量范围为约3,000～15,000Da(即式(I)所示同系物的n的均值约3～17)，优选分子量范围为约5,000～8,000Da(式(I)所示同系物的n的均值约5～9)。
本发明之LGC的多分散指数(PDI，重均/数均分子量之比，Mw/Mn)一般介于1.0至1.8之间；优选的LGC的PDI介于1.1至1.5之间。
本发明之LGC可以是其药学上可接受的碱金属、碱土金属等的盐，类似地，所述LGC也可以是使其与碱性有机基团的形成的酯。本发明优选的LGC的药学上可接受的盐为LGC的钠盐、钾盐或钙盐。
本发明所述LGC是棘皮动物门海参纲动物体壁提取的GCs的解聚产物以及所述GCs解聚产物的末端被还原酪氨基化的产物。
本发明研究发现，所述LGC具有强效抗HIV-1活性，其抑制HIV-1实验株、临床分离株感染人淋巴细胞的IC50值可至约10～100nmol/L，而在该药效浓度下，所述LGC不存在显著的抗凝活性。
本发明进一步研究发现，所述LGC为HIV-1侵入抑制剂，此与临床所需新靶点抗HIV-1的药物需求相一致；本发明通过生物分子相互作用检测证明，所述LGC的药理学作用靶点为HIV-1外膜糖蛋白gp120；采用可溶性CD4(sCD4)以及CD4i单抗14b进行相互作用检测证明，所述LGC的显著特点是其结合糖蛋白gp120保守区CD4i。CD4是介导HIV-1粘附的CD4+细胞膜表面受体，CD4i是gp120-CD4结合诱导暴露的部位，暴露该部位的gp120可进一步结合CD4+细胞膜表面共受体CCR5或CXCR4，并导致HIV-1糖蛋白gp41进入细胞膜，gp41重排折叠致使病毒外膜与CD4+细胞膜融合，由此最终实现HIV-1侵入步骤。
显然阻断CD4i可阻断HIV-1侵入CD4+细胞。由于CD4i的高度保守性，针对CD4i的HIV-1侵入抑制剂有利于避免耐药性产生。目前，以CD4i为靶标的HIV-1疫苗及HIV-1侵入抑制剂已成为艾滋病治疗药物研制的重点方向，因此本发明之LGC作为抗耐药的HIV-1侵入抑制剂具有重要的应用价值。
当R2可以是-OH或-4-O-D-GlcUA基团时，本发明所述LGC仅在近红外区存在紫外吸收，不利于建立基于UV检测技术的分析检测方法。为下文叙述方便，本说明书将此类LGC同系物称为LGC-1。显然，LGC-1存在还原性糖基末端的-D-GlcUA或-D-GalNAc。
当R2是式(II)或(III)所示基团时，本发明所述LGC存在约280nm处的紫外吸收，本说明书将此类LGC同系物称为LGC-2。显然，LGC-2是对应的LGC-1还原性糖基末端被还原氨基化的产物。当本发明之式(I)结构的LGC中含有一定量的LGC-2时，由于存在280nm处的紫外吸收，容易建立分光光度法检测方法，这些方法对于建立可靠、准确的质量控制、药代动力学分析技术等具有重要意义。一般来说，当LGC-2占全部LGC的30％以上时，适合质量控制、药代动力学分析需要的检测方法即可容易建立。
本发明所述R2为-OH或-4-O-D-GlcUA的LGC-1实际上是棘皮动物门海参纲动物体壁提取的GCs的解聚产物；所述R2为式(II)或(III)基团的LGC-2实际上是所述GCs解聚产物经末端还原氨基化所得的产物。
本发明的研究结果显示，GCs解聚产物(LGC-1)经部分或全部末端还原氨基化处理后(LGC-2或含LGC-2)，其抗HIV-1活性接近并略强于对应的GCs解聚产物。为此，所述GCs解聚产物及其部分或全部末端还原氨基化产物均可用于制备抗HIV-1药物，并由此包括在本发明范围之内。
本发明进一步目的是提供一种低分子量糖基化硫酸软骨素(LGC)及其药学上可接受的盐，所述LGC是上文定义的式(I)结构的同系糖胺聚糖衍生物混合物，其中，以摩尔百分比计，R2为式(II)或(III)基团的LGC-2占全部式(I)化合物的30％～100％。
本发明进一步目的还提供一种低分子量糖基化硫酸软骨素(LGC)及其药学上可接受的盐，所述LGC是上文定义的式(I)结构的同系糖胺聚糖衍生物的混合物，其中，R2为式(II)或(III)基团的LGC-2，即R2不为-OH或-4-O-D-GlcUA。
本发明的更进一步目的是提供所述低分子量糖基化硫酸软骨素(LGC)的制备方法。所述LGC的制备方法是从海参纲动物体壁提取获得GCs，继而采用金属离子催化的过氧化物解聚法解聚获得GCs解聚产物(LGC-1)，所得LGC-1可选择进行进一步的还原氨基化反应，以获得全部或部分末端酪胺基化的LGC产物(LGC-2或含LGC-2)。
所述制备方法可包括但不限于以下步骤：
步骤1：从棘皮动物门海参纲动物体壁中提取获得酸性粘多糖，即糖基化硫酸软骨素(GCs)。
从海参纲动物体壁中提取GCs可参考本领域内的已知方法进行，一般包括但不限于以下步骤：脱脂、碱和/或酶处理获得提取液，低级醇和/或酮沉淀获得粗糖提取物，所得粗糖提取物复溶后可以选择进行去蛋白处理(等电点法、蛋白变性剂沉淀法等)、脱色处理(氧化法等)、去小分子杂质(超滤透析、凝胶过滤等)，纯化(凝胶色谱和/或离子色谱法)等，所得纯化产物还可以选择采用离子交换法等获得特定类型的金属离子盐(如钠盐、钾盐、钙盐等)，最后通过减压干燥和/或冷冻干燥法获得GCs终产物。
步骤2：过氧化解聚步骤(1)所得的GCs以获得其解聚产物LGC-1。
由于GCs化学结构的特殊性，酶法解聚、亚硝酸解聚、酸碱解聚等常用的糖胺聚糖解聚方法均难以应用于GCs解聚。目前，GCs的解聚方法主要是过氧化物解聚法。为避免解聚过程对GCs特征结构的影响，本发明优选的LGC-1制备方法是金属离子催化的过氧化物解聚法，该方法除了降低结构单元的聚合度外(式(I)中的n的数值降低)，基本不影响解聚产物的单糖组成、重复结构单元特性，不影响侧链岩藻糖取代基及硫酸酯基等特征化学官能团，即不影响式(I)结构通式。
具体地说，本发明优选的GCs解聚法是将步骤1所得GCs配成质量分数为0.05～10％的水溶液，向所得GCs溶液中加入至质量分数0.01～0.1％的金属离子催化剂(金属离子盐：GCs)，加入质量分数约0.5～5％过氧化物(过氧化物：GCs)，反应在约20～60℃下进行。待解聚产物分子量(以Mw和/或Mn计)至所需分子量范围时，加催化剂螯合剂终止反应后或直接加入低级醇/酮使产物沉淀。收集沉淀并复溶后，凝胶色谱法、离子交换色谱法或超滤透析法纯化，所得产物可选择通过离子交换法获得对应的碱金属离子盐。由此获得GCs解聚产物LGC-1。
一般来说，以本发明方法制备的LGC-1中，根据产物NMR检测谱图计算，以摩尔百分比计，R2为-OH的化合物可占LGC-1总量的85％以上。
步骤2所述解聚方法中，本发明优选的过氧化物为过氧化氢；优选的金属离子催化剂为二价铜离子(盐)。
本发明所述LGC-1的制备方法中，反应物GCs的解聚速度稳定，产物分子量分布窄，所得产物易于分离纯化，能大量生产高纯度的LGC产物。
步骤3：步骤2所得GCs解聚产物LGC-1可以选择进行末端还原氨基化处理，以获得含有R2为式(II)或(III)基团的LGC-2。
本发明中，所述LGC-1末端还原氨基化步骤是：将GCs解聚产物溶解于pH7～9的缓冲液中，依次加入化学计量的酪胺和氰基硼氢化钠，常温或加热反应。反应完毕后，分离纯化反应产物，并将其转化为所需的碱金属离子盐。下图以末端-D-GalNAc为例说明其还原氨基化过程：
Figure BDA0000059256630000071
所述步骤(3)反应产物的分离纯化是指纯化产物中，以摩尔比计，R2为式(II)或(III)基团的式(I)化合物通常占全部式(I)化合物的30％以上。
由于本发明之LGC具有强效抗HIV-1活性，本发明进一步目的是提供含LGC的药物组合物，所述药物组合物中含有有效剂量的本发明LGC或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的赋形剂。
本发明中，含LGC的药物组合物可以是系统给药制剂，也可以是局部给药制剂。
系统给药制剂中，LGC的药物组合物可以是适合静脉给药、皮下和/或肌肉内注射给药制剂，也可以是呼吸道给药制剂。这些制剂中，优选的药物组合物剂型为注射用水溶液、注射用冻干粉针剂、以及适合呼吸道给药的经口或鼻腔喷雾剂等。系统给药的药物组合物中，根据本发明LGC抗HIV-1活性及其注射给药的生物利用度，其单剂量制剂中的LGC含量可以为约5～150mg。
局部给药制剂中，药用组合物剂型可选择栓剂、凝胶剂、软膏剂、擦剂等。这些药用制剂中的活性成分LGC含量可有本领技术人员根据局部用药时的有效药物浓度决定。
由于本发明之LGC抗HIV-1的机制靶点不同于现有临床用药，因此可以与现有临床用药联合使用，包括与现有抗HIV-1药物间隔时间顺次给药，也可以与这些药物同时给药，或者与现有抗HIV-1药物共同组成药物组合物制剂。
本发明之低分子量糖基化硫酸软骨素(LGC)具有强效抗HIV-1活性，可以作为抗HIV-1药物用于治疗和预防艾滋病。
本发明的积极效果综述：本发明首先发现，所述强效抗HIV-1活性的LGC，其抑制HIV-1实验株、临床分离株及耐药株感染人淋巴细胞的IC50值可至约10～100nmol/L，而在该药效浓度下，其LGC基本不存在抗凝活性。进一步研究发现，所述LGC为HIV-1侵入抑制剂，此与临床所需新靶点抗HIV-1的药物需求相一致。此外，本发明还发现，作为HIV-1侵入抑制剂，所述LGC的特点是结合HIV-1外膜糖蛋白gp120保守区CD4i，由于CD4i的高度保守性，针对CD4i的HIV-1疫苗及HIV-1侵入抑制剂已成为艾滋病治疗药物研制的重点方向，因此，本发明之LGC对于研制抗耐药的HIV-1侵入抑制剂具有重要的应用价值。
附图说明
图1为梅花参来源的GCs及其低分子量产物LGC的HPGPC图谱。
图2为LGC-1A 1H NMR检测图谱。
图3为LGC-1A 13C NMR检测图谱。
图4为LGC-1A DEPT135°检测图谱。
图5为LGC-1A 1H-1H COSY检测图谱。
图6为LGC-1A 1H-13C HSQC检测图谱。
图7为LGC对HIV-1诱导的合胞体形成的抑制作用数据图，显示LGC对HIV-1诱导的合胞体形成的抑制作用。
图8为LGC对C8166的毒性作用数据图，显示LGC对C8166的毒性作用。
图9为表面等离子共振法(SPR)检测LGC-gp120相互作用数据图，显示表面等离子共振法(SPR)检测LGC-gp120相互作用。
具体实施方式
以下实施例是对本发明内容的详细说明，所述实施例不构成对本发明范围的限制。
【实施例1】低分子量糖基化硫酸软骨素(LGC)的制备
1.1材料：
梅花参(Thelenota ananas Jaeger)，市售品，去内脏干燥体壁；
H2O2，CH3COONa·3H2O，NaCl，NaOH，Cu(CH3COO)2·H2O等所用试剂：均为市售分析纯试剂。
1.2方法：
(1)糖基化硫酸软骨素(GCs)制备：取棘皮动物梅花参干燥体壁，按文献方法(J Biol Chem，1991，266(21)：13530-6)制备获得GCs，得率0.75％，纯度98％(HPGPC，面积归一化法)，重均分子量(Mw)，65,820。
(2)低分子量糖基化硫酸软骨素(LGC)制备：取步骤(1)所得GCs 5.0g加入圆底烧瓶中，加180ml蒸馏水使之溶解，35℃水浴保温，匀速搅拌中加入1％氯化铜溶液(5ml)，并在60min内滴加15％的H2O2 10ml，反应过程中用1N的NaOH溶液控制pH值范围为7.2～7.8。连续搅拌反应1小时后，向反应液中加入400mg乙二胺四乙酸二钠盐终止反应，随后，冰水冷却，加入浓度为95％(v/v)乙醇540ml，离心得沉淀。
将所得沉淀以100ml 80％乙醇洗涤两遍后，加150ml水使之溶解，经001×7型阳离子树脂交换成钠盐，然后以截留分子量3500Da的透析膜透析6小时，截留产物浓缩，冷冻干燥，得到解聚样品LGC-1A 4.02g，得率为80.4％。
(3)梅花参来源的GCs及其解聚产物LGC-1A理化参数、单糖组成及结构分析用波谱检测：高效凝胶色谱法(HPGPC)检测分子量及分布；电导法检测-OSO3 -/-COO-摩尔比；旋光度按照中国药典(2005版)二部附录VI E方法进行测定；特性黏数应用乌式粘度计测定。
Elson-Morgon法检测乙酰氨基半乳糖(D-GalNAc)含量，咔唑法检测葡萄糖醛酸(D-GlcUA)含量(张惟杰，糖复合物生化研究技术(第二版)，浙江：浙江大学出版社，1999，19-20)；1H NMR甲基峰积分面积计算D-GalNAc/L-Fuc摩尔比。瑞士Bruker公司AVANCE AV 400超导核磁共振谱仪(400MHz)检测NMR谱图(检测条件，溶剂D2O，99.9Atom％D(Norell公司)；内标，trimethylsilyl-propionic acid(TSP-d4)；温度45℃)。
GCs及其解聚产物LGC-1A的HPGPC检测谱图见附图1，理化参数、单糖组成检测结果见表1；1H/13C NMR及其相关谱的检测谱图见附图2～6，1H/13CNMR谱图数据的信号归属见表2。
表1检测结果显示，与GCs相比，LGC-1A分子量和特性粘度显著降低，而单糖组成保持稳定(约1∶1∶1∶3.5)。
表1.梅花参来源的GCs及LGC-1A的理化参数、单糖组成检测结果
Figure BDA0000059256630000101
表2所示1H/13C NMR谱图数据的信号归属显示，GCs、LGC-1A的特征化学结构基本一致。以下以LGC-1A为例简述其信号归属与结构解析。
1H NMR中，5.2～5.7ppm呈现三组较强的信号峰，此为不同类型硫酸酯化的α-岩藻糖端基氢信号，其中约5.6、5.3ppm信号分别对应Fuc2S4S和Fuc4S端基氢。带有明显肩峰的5.35ppm峰为Fuc3S和Fuc4S端基氢信号的叠加；约5.18ppm处信号为主链游离末端的α-端基氢信号。主链β-端基氢信号出现在约4.4～4.6ppm处。Fuc甲基质子信号出现在约1.0～1.3ppm处；GalNAc乙酰基质子出现在约1.9～2.0ppm。硫酸酯基取代位的糖环氢出现在约4.6～5.0ppm，而约3.6～4.6ppm信号则为非硫酸酯基取代位的糖环氢的叠加。
由1H-1H COSY谱可见，GlcUA的H2和H3信号峰位置均＞3.6ppm，相对于硫酸软骨素类化合物GlcUA的对应信号(3.35～3.55ppm)向低场位移约0.3～0.4ppm，表明该位置存在侧链取代，且为糖环取代而非硫酸酯化取代。1H-1HTOCSY谱清楚显示GlcUA进一步质子信号间的耦合相关；谱图还清楚显示了Fuc端基氢和H3之间的耦合。1H-1H NOESY谱则分别显示了各Fuc端基氢与GlcUA的H3、GlcUA端基氢与GalNAc的H3以及GalNAc端基氢与GlcUA的H4之间的耦合，表明单糖之间的连接关系：GlcUA与GalNAc分别以β(1→3)和β(1→4)糖苷键相互连接形成主链，Fuc则以α(1→3)糖苷键连接于GlcUA。
13C-NMR谱中，GlcUA与GalNAc的C1峰出现在约102～106ppm，表明其桥头氢的β-构型；相对高场处(约101～99ppm)的Fuc的C1信号与其桥头氢α-构型相符。GlcUA羧基中的羰基碳(C6)与GalNAc乙酰氨基中的羰基碳(C7)出现在几乎相同的位置(～177ppm)；Fuc甲基碳信号出现在约18～19ppm；GalNAc乙酰氨基中的甲基碳信号则出现在约25ppm附近。GalNAc4S6S的C2信号出现在约54ppm，表明其脱氧与乙酰氨基取代的特征；较弱的GalNAc4S C2信号出现于55ppm。
DEPT90°谱图显示了～177ppm羰基碳季碳以及约18和25ppm处的甲基碳的伯碳性质。DEPT135°谱图可见GalNAc4S6S仲碳(C6，CH2)信号出现在70.1ppm，不存在6-位硫酸酯基的GalNAc4S仲碳信号则出现在64.0ppm。根据两种C6信号强度计算，GalNAc4S仅占GalNAc总量的约5％，此结果接近于按照C2信号强度所计算的比例。
HMBC谱中可见Fuc之C1与GlcUAH3之间的耦合，GlcUAC1与GalNAcH-3之间的耦合；GalNAc C1与GlcUAH4之间的耦合；从该谱图中可辨识Fuc、GlcUA、GalNAc桥头氢与GlcUAC3、GalNAc C3及GlcUAC3之间的耦合，由此进一步确认THG组成单糖之间的连接关系。
综合THG-1氢谱、碳谱及其相关谱可见，本品三种组成单糖中，GlcUA与GalNAc通过β(1→3)和β(1→4)糖苷键相互连接组成聚糖主链，由此组成主链二糖结构单元。显然，THG主链结构类似硫酸软骨素，其氨基己糖主要为GalNAc4S6S，仅约5％的氨基己糖无6-位硫酸酯基取代(GalNAc4S)。根据GlcUA的H2、H3化学位移并结合1H-1H NOESY、1H-13C HM C可以判断，Fuc以α(1→3)糖苷键连接于GlcUA。几乎所有GlcUA均存在侧链岩藻糖基取代，而THG中GlcUA、Fuc单糖比例接近1∶1，因此THG主链的每个二糖结构单元均存在一个侧链岩藻糖取代基。
表2.梅花参来源的GCs及LGC-1A的1H/13CNMR检测数据(δ[ppm])
Figure BDA0000059256630000121
【实施例2】系列分子量LGC-1的制备
2.1材料：
梅花参来源的GCs，同实施例1所述方法制备。
H2O2，CH3COONa·3H2O，NaCl，NaOH，Cu(CH3COO)2·H2O等所用试剂：均为市售分析纯试剂。
2.2方法：
(1)系列分子量LGC-1样品制备：梅花参来源的GCs四份各5g，采用实施例1步骤(2)所述方法解聚，但终止反应的时间点分别为90，120，360，420min。由此制备获得的LGC-1产物分别编号为：LGC-1B、LGC-1C、LGC-1D和LGC-1E。所述解聚反应的得率均大于70％。
(2)LGC-1产物检测：HPGPC检测分子量及分布；电导法检测-OSO3 -/-COO-摩尔比；旋光度按照中国药典(2005版)二部附录VI E方法进行测定；特性黏数应用乌式粘度计测定。
2.3结果：
2.2所述步骤(2)所得产物LGC-1B～E的检测结果见下表3。检测结果显示，梅花参来源的GCs经过氧化氢解聚法解聚获得产物LGC-1的收率较高，分子量分布较窄，电导率法检测结果显示硫酸酯基没有显著变化，特征粘度随分子量降低而降低。
表3.梅花参来源的GCs及其解聚产物LGC的
分子量及其分布、旋光度和特性黏数等理化数据检测
Figure BDA0000059256630000141
【实施例3】LGC-1A的末端还原氨基化
3.1材料：
LGC-1A：实施例1制备解聚GCs产物。
盐酸酪胺、氰基硼氢化钠：均为市售分析纯试剂。
3.2方法：
(1)LGC-1A的末端还原氨基化：GCs解聚产物LGC-1A 1000mg溶解于35ml0.2mM磷酸缓冲液(PBS，pH 8.0)中，搅拌中分别加入过量的800mg酪胺和300mg氰基硼氢化钠，35℃恒温水浴中反应约100hr。反应完毕后，加95％乙醇105ml，离心得沉淀，所得沉淀以95％乙醇30ml洗涤两遍后，以35ml 0.1％NaCl复溶所得沉淀，离心去不溶物，上清液上Seph adexTM G-100柱，0.1％NaCl洗脱，UV检测器检测收集存在λ280nm光吸收的洗脱流份，所得流份冻干获得LGC-2A 652mg。
(2)产物理化及波谱检测：HPGPC检测分子量及分布；电导法检测-OSO3 -/-COO-摩尔比；Elson-Morgon法检测乙酰氨基半乳糖(D-GalNAc)含量，咔唑法检测葡萄糖醛酸(D-GlcUA)含量，1HNMR甲基峰积分面积计算D-GalNAc/L-Fuc摩尔比(同实施例1)。AVANCE AV 400超导核磁共振谱仪检测NMR谱图(溶剂D2O，内标TSP-d4，温度45℃)。
3.3结果
以LGC-1A投料量计，LGC-2A产物得率约65％；
产物组分检测结果显示，D-GalNAc∶D-GlcUA∶L-Fuc∶-OSO3 -为约1.00∶1.13∶1.00∶3.80，Mw约14380，PDI约1.42，此与LGC-1A结构单元聚合度约15的理论计算结果基本一致；
1H MR(D2O，δ[ppm])：7.25(2’，6’H)；6.91(3’，5’H)；5.65，5.36，5.28(L-Fucα1H)；3.38(8’H)；2.82(7’H)；2.02(D-GalNAc，CH3)；1.30～1.32(L-Fuc，CH3)。L-Fuc甲基氢与苯环氢积分比约10.5，表明所得产物还原性末端均被还原酪氨化。
【实施例4】LGC-1B～1E的末端还原氨基化
4.1材料
LGC-1：实施例2制备的LGC-1B、LGC-1C、LGC-1D和LGC-1E。
盐酸酪胺、氰基硼氢化钠：均为市售分析纯试剂。
4.2方法
取LGC-1A、1C、1D和1E各500mg分别溶解于20ml 0.2mM磷酸缓冲液(PBS，pH 8.0)中，搅拌中分别加入过量的400mg酪胺和150mg氰基硼氢化钠，35℃恒温水浴中反应约60h。反应完毕后，离心取上清液，分别加95％乙醇80ml，离心得沉淀，所得沉淀以95％乙醇15ml洗涤两遍后，以20ml蒸馏水复溶所得沉淀，离心去不溶物，上清液冻干，分别获得LGC-2B、2C、2D和2E各468、452、410和422mg。
4.3结果
以LGC-1B～1E计，LGC-2B～2E产物得率约84％～93％；
根据LGC-1B～1D数均分子量及AVANCE AV 400超导核磁共振谱仪检测1H NMR谱图显示的L-Fuc甲基氢与苯环氢积分比计算，LGC-2B、2C、2D和2E还原性末端被还原酪氨化的比例分别为约52％，43％，37％和32％。
【实施例5】低分子量糖基化硫酸软骨素LGC-1A的抗HIV-1活性
5.1材料与试剂
(1)检测样品实施例1制备的LGC-1A(Mw 13820Da)溶于注射用水中，配制成浓度为25mg/ml储存溶液，4℃下保存。
(2)试剂MTT(3-(4，5)-dimethylthiahiazo-2-y1)-2，5-diphenyltetrazoliumbromide、SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)、DMSO(Dimethyl sulfoxide)等试剂为市售，分析纯。标准兔血浆，兔贫血小板血浆，广州蕊特生物科技有限公司；APTT检测试剂盒(鞣花酸)，上海太阳生物技术有限公司产品，批号090327。
(3)细胞和病毒C8166、HIV-1IIIB/2802/2840/9495和HIV-1-2CBL-20/ROD等均由英国Medical Research council，AIDS Reagent Project惠赠。按常规方法制备HIV-1IIIB，滴定并计算出病毒的TCID50。病毒储存液分装后，置-70℃保存。细胞和病毒均按常规方法冻存和复苏。
5.2方法
(1)LGC-1A对C8166的细胞毒性检测：C8166细胞悬液(4×105/ml)100μl与100μl系列浓度的LGC-1A混合，37℃下5％CO2培养三天，MTT法检测细胞毒性。570/630nm ELx800ELISA Reader酶标仪测定OD值，计算CC50(50％Cytotoxic concentration，即引起一半细胞死亡的药物浓度)。
(2)LGC-1A对HIV-1诱导C8166病变的抑制活性检测：将C8166细胞悬液(8×105/ml)50μl与100μl不同浓度的LGC-1A混合，加入50μl HIV-1稀释上清，M.O.I.为0.0091，同时设置空白对照孔，37℃下5％CO2培养三天，倒置显微镜下一百倍率五个视野下计数合胞体。计算LGC抑制HIV-1诱导C8166病变的EC50(50％Effective Concentration，即抑制一半合胞体形成的LGC-1A浓度)。结合上文(1)所得CC50值，计算选择性指数(CC50/EC50值，Therapeutic Index，TI)。
(3)LGC-1A对HIV-2诱导C8166病变的抑制活性检测：同上文(2)所述方法检测LGC-1A对HIV-2诱导C8166病变的抑制活性。
(4)LGC-1A对凝血功能影响：活化部分凝血活酶时间(APTT)法检测LGC-1A对凝血功能影响。取LGC-1A适量，生理盐水配置成浓度为25μg/ml的待测样品溶液。取配制好的待测样品溶液20μl，加入180μl标准人血浆，立即混匀后，按照APTT检测试剂盒(鞣花酸)所附说明书方法，在BICO-双通道血凝仪(Minivolt公司，意大利)上检测有效抗HIV-1药物浓度下的LGC对凝血功能的影响。
(5)SPR法检测LGC-1A与gp120相互作用：LGC与gp120相互作用通过表面等离子体共振技术SPR的方法来检测(BIAcore 3000biosensor system)，将CM-5芯片活化后将gp120固定在CM-5芯片表面，将不同浓度的样品用缓冲液HBS-EP稀释。将稀释好的样品放在样品架上，设定加样流速为10μl/min，选择inject方式进样。结束后通过BIAcore 3000软件分析系统进行动力学常数。
5.3结果
(1)LGC-1A抗病毒活性：附图7、8和表4中结果显示，LGC-1A为强效抑制HIV-1的新结构活性成分，其抗HIV-1的IC50低至约9.4nM(0.13μg/ml)；根据配制最高浓度药物(25mg/ml)未见显著的细胞毒性(参见本发明的附图8)，其治疗指数可达15万以上；对HIV-1-2的抑制活性则较弱。
表4LFC-1A抗HIV活性检测结果
Figure BDA0000059256630000171
(2)LGC-1A对凝血功能的影响：表5结果显示，对于LGC-1A在有效抗HIV-1病毒剂量(0.1～8μg/ml)下，没有发现显著的APTT延长活性。
表5LFC-1A抗凝血活性检测结果
  LFC-1A(μg/ml)   0   0.1   1   4   8
  APTT(s)   23.2   23.2   23.6   24.9   25.1
(3)LGC-1A抗HIV-1活性的作用靶点：SPR检测结果显示，LGC-1A可以高亲和力结合gp120，对CD4则没有显著的结合；可溶性CD4(sCD4)结合gp120后，LGC-1A结合CD4i的亲和力进一步增强，表明LGC-1A可以结合CD4诱导暴露的pg120保守区CD4i。由于CD4i具有高度保守性，结合该区域的gp120抑制剂可以有效避免病毒DNA突变所致的耐药性产生(见附图9)。
【实施例6】系列分子量LGC-1和LGC-2抗HIV-1活性检测
6.1材料：
LGC-1A，1B，1C，1D，1E及LGC-2A，2B，2C，2D，2E系列分子量LGC样品，实施例1～4所得产物；其它试剂同实施例5之5.1(3)。
6.2方法：
检测LGC系列样品对HIV-1IIIB实验株诱导C8166细胞病变的抑制活性及其细胞毒性，其检测方法同实施例5之5.2。
6.3结果：
实验结果见表6。实验结果显示，在本实验条件下，LGC-1和LGC-2系列样品对C8166细胞的毒性较小，其CC50均大于约25mg/ml；体外抗HIV-1的活性较强，其IC50值在约8.3nM(LGC-2A)至30.8nM(LGC-1E)之间；治疗指数较高，均大于15000。
此外，该实验结果还显示，(1)比较LGC-1系列和LGC-2系列样品的抗HIV-1活性可见，其抗HIV-1活性随平均分子量提高而增强；(2)LGC-1系列和LGC-2系列样品之间的抗HIV-1活性比较可见，LGC-2样品活性较相应的LGC-1样品活性略强。
由于LGC样品对凝血系统的影响随分子量降低而减弱，因此本发明说明书指出其优选的LGC分子量(Mw)为约5000～8000。
表6.系列分子量LGC的体外抗HIV-1活性
Figure BDA0000059256630000181
【实施例7】不同种属来源的LGC制备及其抗HIV-1活性检测
7.1材料
刺参(Stichopus japonicus)、玉足海参(Holothuria leucospilota)干燥体壁，市售品。
7.2刺参、玉足海参来源的LGC制备
同实施例1方法(1)和(2)制备刺参和玉足海参来源的LGC，并分别简称为LGC-st和LGC-hl。
7.3理化及抗HIV-1活性检测
理化检测结果显示，LGC-st和LGC-hl的分子量分别为8650Da和8595Da；1H、13C NMR及其相关谱分析显示，LGC-st和LGC-hl具有类似实施例1所述LGC-1A的糖基化硫酸软骨素类化合物的基本结构特征，但各组成单糖残基上的硫酸酯基的位置和数量存在差异，LGC-st和LGC-1A主链中的D-GalNAc主要为D-GalNAc4S6S，而LGC-hl结构中存在一定量的D-GalNAc4S；与LGC-st和LGC-hl不同，侧链岩藻糖取代基类型除了L-Fuc2S4S和L-Fuc4S外，LGC-1A还含有L-Fuc3S侧链，而缺乏L-Fuc3S4S侧链。
抗HIV-1活性检测结果显示，LGC-st与其分子量相当的LGC-1C活性强度近似，而略强于分子量也近似的LGC-hl。
表7LGC的不同化学结构特征对抗HIV-1活性的影响
Figure BDA0000059256630000191
+：存在所述类型的侧链基团；-：不存在或较少存在所述类型的侧链基团
【实施例8】低分子量糖基化硫酸软骨素的冻干制品
8.1材料
实施例7所得玉足海参来源的低分子量糖基化硫酸软骨素(LGC-hl)，其重均分子量9500Da。
8.2处方
  原辅料名称   用量
  LGC-hl   50g
  注射用水   500ml
  共制成   1000支
8.3制备工艺
称取处方量的玉足海参低分子量糖基化硫酸软骨素加注射用水至全量，搅拌使溶解完全。加入0.6％的药用活性炭，搅拌20min；使用布氏漏斗及3.0μm微孔滤膜脱炭过滤。测中间体含量。合格后用0.22μm的微孔滤膜过滤；灌装于管制西林瓶中，每瓶0.5ml，灌装过程监测装量，半压塞，置冷冻干燥箱内，按设定的冻干曲线进行冻干，压塞，出箱，轧盖，目检合格，得成品。
冻干过程：将样品进箱，降隔板温至-40℃，保持3h；冷阱降至-50℃，开始抽真空至300μbar。开始升华：1h匀速升温至-30℃，保持2h；2h匀速升温至-20℃，保持8h，真空保持200～300μbar；再进行干燥：2h升温至-5℃，保持2h，真空保持150～200μbar；0.5h升温至10℃，保持2h，真空保持80～100μbar；0.5h升温至40℃，保持4h，真空抽至最低。
【实施例9】低分子糖基化硫酸软骨素的阴道栓剂
9.1材料
梅花参来源的低分子量糖基化硫酸软骨素(实施例3所得LGC-2A)，其重均分子量14380Da。羟苯乙酯和甘油明胶等试剂为市售，药用级别。
9.2处方
  原辅料名称   用量
  LGC-2A   100g
  注射用水   400ml
  羟苯乙酯   2.0g
  甘油明胶加至   4000g
  共制成   1000枚
9.3制备方法
取低分子量糖基化硫酸软骨素加注射用水溶解，加入羟苯乙酯搅拌溶解，再加适量甘油搅匀，缓缓加入明胶甘油基质中，充分搅拌，保温55℃，灌模，每枚重4g。
【实施例10】低分子糖基化硫酸软骨素的凝胶剂
10.1材料
刺参来源的低分子量糖基化硫酸软骨素(实施例4所得LGC-2C)，其重均分子量9250Da。交联型聚丙烯酸钠、聚乙二醇400、苯扎溴铵和甘油等试剂为市售，药用级别。
10.2处方
 原辅料名称   用量
 LGC-2C   10.0g
 交联型聚丙烯酸钠(SDB-L-400)   10.0g
 聚乙二醇400(PEG-400)   80.0g
 苯扎溴铵   10.0ml
 甘油   100.0g
 蒸馏水加至   1000g
10.3制备方法
取低分子量糖基化硫酸软骨素加蒸馏水溶解，称取PEG-400、甘油置烧杯中微热至完全溶解，加入低分子量糖基化硫酸软骨素溶液混匀，SDB-L-400加入700ml水于研钵中研匀后，将基质与PEG-400、甘油、低分子量糖基化硫酸软骨素混匀，加水至1000g，灌装即得。

Claims (15)

1.一种低分子量糖基化硫酸软骨素及其药学上可接受的盐在抗1型人类免疫缺陷病毒药物制备中的用途，其特征在于：所述的LGC是具有式(I)结构的同系糖胺聚糖衍生物的混合物，
Figure FDA0000059256620000011
式(I)中：
D-GlcUA-β1-，为β-D-葡萄糖醛酸-1-基；
D-GalNAc-β1-，为β-D-N-乙酰氨基半乳糖-1-基；
L-Fuc-α1-，为α-L-岩藻糖-1-基；
R1为-H或D-GalNAc-β1-；
R3、R4、R5、R6、R7相互独立地为-H或-SO3 -；
R2为-OH、-4-O-D-GlcUA、或者是式(II)或(III)所示基团：
其中，R’为L-Fuc-α1-取代基团，且L-Fuc-α1-上存在同式(1)结构的硫酸酯基；R”为-4-[L-Fuc(α1-3)]D-GlcUA-β1-基团，其L-Fuc-α1-上存在同式(1)结构的硫酸酯基，R3、R4同上述定义；
以摩尔比计，所述LGC所含D-GlcUA、D-GalNAc、L-Fuc三种单糖残基与所含-OSO3 -基的比例范围为1∶(1±0.3)∶(1±0.3)∶(3.5±0.5)；
n是均值为约3～17的整数；
所述LGC的重均分子量范围为3000～15000Da。
2.如权利要求1所述LGC及其药学上可接受的盐在抗HIV-1药物制备中的用途，其特征在于，所述LGC是具有式(I)结构的同系糖胺聚糖衍生物的混合物，其中含有限定比例的R2为式(II)或(III)基团的式(I)化合物。
3.如权利要求2所述LGC及其药学上可接受的盐在抗HIV-1药物制备中的用途，其特征在于，所述限定比例是指，以摩尔百分比计，R2为式(II)或(III)基团的式(I)化合物占全部式(I)化合物的30％～100％。
4.如权利要求1至3所述LGC及其药学上可接受的盐在抗HIV-1药物制备中的用途，其特征在于，所述LGC为棘皮动物门海参纲动物体壁提取的糖基化硫酸软骨素的解聚产物和/或所述解聚产物还原端被全部或部分还原酪氨基化的产物。
5.一种低分子量糖基化硫酸软骨素及其药学上可接受的盐，所述LGC是权利要求1定义的式(I)结构的同系糖胺聚糖衍生物的混合物，并且，以摩尔百分比计，R2为式(II)或(III)基团的式(I)化合物占全部式(I)化合物的30％～100％。
6.如权利要求5所述的LGC及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述式(I)结构的同系糖胺聚糖衍生物的混合物中，R2为式(II)或(III)基团。
7.如权利要求5至6所述的所述的LGC及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述LGC重均分子量(Mw)范围为5000～8000Da。
8.如权利要求5至7所述的低分子量糖基化硫酸软骨素及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述LGC为棘皮动物门海参纲动物体壁提取的糖基化硫酸软骨素的解聚产物和/或所述解聚产物还原端被全部或部分还原酪氨基化的产物。
9.如权利要求1至8所述的所述的LGC及其药学上可接受的盐的制备方法，包括如下步骤：
(1)从棘皮动物门海参纲动物体壁中提取获得酸性粘多糖，即原型糖基化硫酸软骨素GCs；
(2)过氧化解聚步骤(1)所得GCs，收集和纯化所需分子量范围的GCs解聚产物，将所得解聚产物进一步转化为所需的碱金属离子盐，由此得到权利要求1所述LGC；
(3)步骤(2)所述GCs解聚产物任选进行末端糖基的还原氨基化，其方法是，所述GCs解聚产物在氰基硼氢化钠存在下与化学计量的酪胺反应，获得权利要求4～5所述的还原端被全部或部分还原酪氨基化的产物。
10.如权利要求9所述LGC制备方法，其特征在于：所述的步骤(2)所述过氧化解聚方法是：将海参纲动物体壁来源的GCs配成质量分数为0.05％～10％的水溶液，向所得水溶液中加入过氧化物GCs至质量分数0.05％～5％，加入用作催化剂的过渡金属离子盐GCs至质量分数0.01％～1％，在20～60℃下反应至GCs被解聚到所需分子量范围；向反应液中加乙醇或丙酮使解聚产物沉淀，沉淀重新溶解后，超滤膜透析和/或过凝胶柱层析法除去小分杂质，离子交换法将所得产物进一步转化为所需的碱金属离子盐。
11.如权利要求9所述LGC制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)所述GCs解聚产物的末端还原氨基化的方法是：将步骤(2)所得GCs解聚产物溶解于pH 7～9的缓冲液中，依次加入化学计量的酪胺和氰基硼氢化钠，常温或加热反应。反应完毕后，分离纯化反应产物，并将其转化为所需的碱金属离子盐。
12.如权利要求11所述LGC制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)的反应产物的分离纯化是指纯化产物中，以摩尔比计，R2为式(II)或(III)基团的式(I)化合物占全部式(I)化合物的30％～100％。
13.一种抗HIV-1的药物组合物，所述药物组合物含有有效抗HIV-1剂量的权利要求1～7所述LGC或其药学上可接受的盐，以及药用赋形剂。
14.如权利要求13所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为注射用水溶液、注射用冻干粉针剂或局部给药用栓剂、软膏剂或凝胶剂。
15.如权利要求10至11所述药物组合物用作艾滋病预防和/或治疗药物。
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