JP6469698B2 - ビロソーム製剤の改良 - Google Patents

Description

本発明は、治療およびワクチンの用途で使用されるビロソーム製剤および関連する医薬製品に関する。具体的には、本明細書中ではビロソームが安定した状態に留まるように温度範囲を広げたビロソームの液体製剤を開示する。これは、ビロソームの量ならびに物理的および化学的特性と、約２〜８℃の範囲またはそれ以上で貯蔵した場合にタンパク質性成分および構造的完全性とを維持し、一方でまた偶発的な凍結に由来する損傷を防ぎ、かつ非経口投与に適合させることによって行われる。

ビロソームは、ウィルス由来のタンパク質を組み込んだ単ラメラのリン脂質膜を含む小胞であり、その組合せによりビロソームの標的細胞との融合が可能になる。したがってビロソームはリポソームとは異なり、きわめて効果的な薬物またはワクチン送達システムであると考えられる。

薬物送達およびワクチンの研究の分野における現在継続中の課題は、長期間にわたってかつ広い温度範囲内で安定した状態に留まるビロソームの液体製剤を作り出すことである。実際には、いずれの偶発的な凍結（例えば貯蔵または輸送の間の）も、製品の完全性、したがって有効性に有害な影響を与える。いずれの偶発的な加熱もまた有害であり、製品の不安定性および有効性の喪失（例えば凝集に原因する）を引き起こす。より長い有効期間につながる広い貯蔵温度範囲内、例えば約２℃〜約８℃のより長期の安定性が、いずれの注射可能な液体製剤にとっても一般に望ましい。

ビロソーム粒子の生物活性は、粒子の立体配座の完全性に、またその膜と関係のある抗原分子の質に左右される。伝統的な有機および無機薬物とは異なり、ビロソーム粒子は複雑であり、かつ多くの特殊なリン脂質およびタンパク質から構築され、軽微な化学的または物理的ストレッサーがビロソーム粒子の劣化の一因となる可能性がある。したがってビロソーム調合物の安定な組成は、長い有効期間を確実にするために極めて重要であるが、ビロソームの安定化は特有の課題を提起する。ビロソームは、埋包されたタンパク質の変性、粒子の凝集（可溶性および不溶性の両方の凝集塊の形成）または融合、解離、沈殿、および吸着を含めた物理的不安定性の結果として、また、例えば加水分解、脱アミド化、および酸化を含めた化学的不安定性の結果として有効性を失うことがある。さらにビロソームの構造成分である脂質は、加水分解および酸化の影響を受けやすい。これらの劣化経路のいずれも、低い生物活性の原因となる可能性があるが、潜在的にはまた、毒性を増加させるかつ／または免疫原性を変える副生物または誘導体の形成を引き起こす可能性もある。

したがって広範囲の条件に対して安定性を確保するビロソームの頑強な組成物を見出すための個々の必要性に合わせた取組みを必要とする。ビロソームを化学的に、物理的に、かつ生物学的に安定に保つためには、緩衝剤の種類、ｐＨ、および特殊化された医薬品添加剤を独特の組合せで組み合わせること、および細心の注意を払って最適化することが必要になる。変えることができるすべての因子を考慮すると、ビロソームを製剤化するための最適な条件を見出すことは課題を抱えており、良好な組成物の組成は先験的に予測できない。

リポソームを含む製剤は以前に開示されている。リポソームはビロソームとは基本的に異なるが、それらの製剤は関連のある従来技術と考えることができる。ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｍａｓ，ＣＡ）、Ａｍｐｈｏｔｅｃ（登録商標）（Ｂｅｎ Ｖｅｎｕｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＯＨ）、Ｍｙｏｃｅｔ，Ｖｉｓｕｄｙｎｅ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、およびＬＥＰ−ＥＴＵ（使いやすいリポソーム封入パクリタクセル；ＮｅｏＰｈａｒｍ，Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ Ｂｌｕｆｆ，ＩＬ；Ｆｒｅｉｘｅｉｒｏら；Ｍｅｕｎｉｅｒら）などの多くの凍結乾燥リポソーム製剤が市場に存在しており、これらはかなり安定であるが、それらは高価であり、かつ投与前に、間違いやすく時間のかかる操作を必要とする。したがって２〜８℃の間で、または≦−６５℃で貯蔵することができる液体組成物は、ビロソームにとって好ましい形態である。具体的には上記組成物が、輸送の間または貯蔵の間の偶発的な凍結にビロソームが耐えられるようにする場合である。

従来の技術では、リポソーム液体製剤における単糖または二糖の使用を研究したほんのわずかな例が示されているに過ぎない。興味深いことに、そのような単糖または二糖は、凍結−解凍の損傷の劇的な増加につながる（Ｈｉｎｃｈａら）または２〜８℃での貯蔵の間の安定性の低下を引き起こす（Ｆｒｅｉｘｅｉｒｏら）ので、それらの影響は有害であることが分かっている。

ビロソームの液体製剤は以前に開示されており、Ｉｎｆｌｅｘａｌ（登録商標）ＶおよびＥｐａｘａｌ（登録商標）などの市販品において長年使用されている。上記製剤は、それらが凍結後にビロソームの安定性を維持することができないという意味で本明細書中では次善最適のものとして示した。これらの製剤が長年市場に存在してきたにもかかわらず、製造会社は偶発的な凍結の事態または長期低温貯蔵（すなわち≦−６５℃）に耐えるビロソーム製剤を製造していない。

２〜８℃での貯蔵の間の最適な安定性を確保すると同時に、偶発的な凍結によるビロソーム構造および抗原内容物の損傷を防ぐことができる製剤を特定することは、依然として課題のまま留まっており、またこれはコストを低減しかつ上記製剤の臨床応用を容易にするという大きな利点につながるはずである。

したがって当該技術分野には、貯蔵または輸送の間に偶発的に凍結された場合に、ビロソームの安定性を維持する液体製剤を見出すというニーズが存在する。これらの改良された製剤は、長期間にわたる貯蔵の間の含有ビロソームの量および質を維持するはずである。さらにこの製剤は、非経口投与に適するべきであり、良好な耐容性を示すべきであり、また好ましくは単純な組成を有するべきである。本発明の目的は、ビロソームのそのような製剤を提供することである。

本発明者らは、偶発的に凍結された場合にビロソームの安定性を維持し、それによってビロソームの量および質を維持することにより、以前に開示された組成物（または製剤）と比較してビロソームの安定性を向上させる組成物を見出し、本明細書中で述べている。驚くべきことに、６．５〜８の間のｐＨ範囲を有する複合ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液を二糖と組み合わせることにより、凍結された後のビロソームの量および質を維持し、それにより当該技術分野で知られている他の組成物と比較して総体的なビロソームの安定性を向上させる卓越した組成物がもたらされた。

したがって本発明は、ビロソームを安定化させるための組成物（または製剤）および、例えば治療用途およびワクチン用途に使用することができる関連した医薬製品に関する。

本発明による組成物は、（ａ）ビロソーム、（ｂ）（ａ）を緩衝する６．５〜８の間のｐＨ範囲にある複合ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液（ただしリン酸濃度は１５ｍＭ〜３０ｍＭの間の範囲にある）、および（ｃ）６０ｍＭを超える濃度の塩を含み、さらに（ｄ）二糖を含む。

本発明のビロソーム製剤は、６ヶ月を超える、１年間、１．５年間、２年間、またはそれ以上の２℃〜８℃、または≦−６５℃での長期貯蔵に耐えられる。好ましくは本発明によるこの組成物は、約２０μｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬの間の総抗原濃度のビロソームを含む。

好ましい実施形態では二糖の濃度は、２％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の間の範囲である。二糖は、好ましくはトレハロースおよびスクロースからなる群から選択される。

本発明による一実施形態ではトレハロースが好ましい二糖である。トレハロースは、好ましくは２％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の間の範囲の濃度で存在する。

本発明によるさらに別の実施形態ではスクロースが好ましい二糖である。スクロースは、好ましくは約２％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の間の範囲の濃度で存在する。

本発明による好ましい実施形態では組成物は、約６．５〜８の間のｐＨ範囲を有し、ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液（ただしリン酸濃度は１５ｍＭ〜３０ｍＭの間の範囲にある）を含み、この組成物はまた、６０ｍＭを超える濃度の塩を含み、かつさらに２％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の間の範囲の濃度で二糖を含む。

本発明による好ましい実施形態では組成物は、約６．５〜８の間のｐＨ範囲を有し、ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液（ただしリン酸濃度は１５ｍＭ〜３０ｍＭの間の範囲にある）を含み、この組成物はまた、６０ｍＭを超える濃度の塩を含み、さらにトレハロースおよびスクロースからなる群から選択される二糖を２％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の間の範囲の濃度で含む。

本発明による好ましい実施形態では組成物は、約７〜７．８の間の範囲のｐＨを有する。

本発明による好ましい実施形態では組成物は、約７〜７．８の間のｐＨ範囲を有し、ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液（ただしリン酸濃度は１５ｍＭ〜３０ｍＭの間の範囲にある）を含み、この組成物はまた、６０ｍＭを超える濃度の塩を含み、さらにトレハロースおよびスクロースからなる群から選択される二糖を２％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の間の範囲の濃度で含む。

本発明によるさらに別の好ましい実施形態では組成物は、約７．５のｐＨを有し、ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液（ただしリン酸濃度は１５ｍＭ〜３０ｍＭの間の範囲にある）を含み、この組成物はまた、６０ｍＭを超える濃度の塩を含み、かつさらにトレハロースまたはスクロースを３％（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）の間の範囲の濃度で含む。

好ましい実施形態では本発明による組成物は、塩を約６０〜８５ｍＭの間の濃度で含む。別の好ましい実施形態では上記塩はＮａＣｌである。

別の好ましい実施形態では本発明による組成物は、液体組成物である。

一実施形態では本発明による組成物は、ガラス瓶に入れられる。別の実施形態では組成物は、袋に入れられる。さらに別の実施形態では組成物は、（予め充填される）シリンジまたはカートリッジに入れられる。

本発明はまた、本発明による組成物を調製することを含む、ビロソームの保存方法に関する。

さらに別の実施形態では本発明は、本明細書中で述べる組成物を調製することと、上記組成物を２℃〜８℃の間の範囲にある温度で貯蔵することとを含む、ビロソームの保存方法に関する。幾つかの実施形態では上記組成物は、６ヶ月を超える、１年間、１．５年間、２年間、またはそれ以上貯蔵される。

他の実施形態では本発明は、本明細書中で述べる組成物を調製することと、上記組成物を−１５℃〜−３０℃の間の範囲にある温度で貯蔵することとを含む、ビロソームの保存方法に関する。

他の実施形態では本発明は、本明細書中で述べる組成物を調製することと、上記組成物を−８０℃〜−６５℃の間の範囲にある温度で貯蔵することとを含む、ビロソームの保存方法に関する。

広い温度範囲に対する長期安定性の強化は、本明細書中で開示するビロソーム組成物（または製剤）の長期の保存期間をもたらし、活性な一価抗原の濃度の許容できる損失（すなわち、ＨＡ濃度に関して２〜８℃において２７％以下の損失）で、約１〜２年の期間のあいだそれらの組成物の貯蔵および最終的には宿主投与を可能にする。これに加えて本発明の組成物は、高温、凍結／解凍サイクル、または長期低温貯蔵（すなわち≦−６５℃）への曝露の間の安定性を示す。

１回の凍結／解凍サイクルの前および後のインフルエンザ（Ａ／カリフォルニア）由来のビロソームについて測定した平均直径サイズ。 １回の凍結／解凍サイクルの前および後のインフルエンザ（Ａ／カリフォルニア）由来のビロソームについて測定したＨＡ濃度。 ５±３℃で１２週間貯蔵したインフルエンザ（Ａ／カリフォルニア）由来のビロソーム。平均直径サイズはｔ＝０、ｔ＝４、およびｔ＝１２週間の時点で測定した。 ５±３℃で１２週間貯蔵したインフルエンザ（Ａ／カリフォルニア）由来のビロソーム。ＨＡ濃度はｔ＝０、ｔ＝４、およびｔ＝１２週間の時点で測定した。 １回の凍結／解凍サイクルの前および後のインフルエンザ（Ｂ／ブリスベン）由来のビロソームについて測定した平均直径サイズ。 １回の凍結／解凍サイクルの前および後のインフルエンザ（Ｂ／ブリスベン）由来のビロソームについて測定したＨＡ濃度。 ５±３℃で１２週間貯蔵したインフルエンザ（Ａ／ブリスベン）由来のビロソーム。平均直径サイズはｔ＝０、ｔ＝４、ｔ＝１２、およびｔ＝２４週間の時点で測定した。 ５±３℃で１２週間貯蔵したインフルエンザ（Ａ／ブリスベン）由来のビロソーム。ＨＡ濃度はｔ＝０、ｔ＝４、およびｔ＝１２の時点で測定した。 １回の凍結／解凍サイクルの前および後のインフルエンザ（Ａ／ヴィクトリア）由来のビロソームについて測定した平均直径サイズ。 １回の凍結／解凍サイクルの前および後のインフルエンザ（Ａ／ヴィクトリア）由来のビロソームについて測定したＨＡ濃度。 ５±３℃で１２週間貯蔵したインフルエンザ（Ａ／ヴィクトリア）由来のビロソーム。平均直径サイズはｔ＝０およびｔ＝４週間の時点で測定した。 ５±３℃で１２週間貯蔵したインフルエンザ（Ａ／ヴィクトリア）由来のビロソーム。ＨＡ濃度はｔ＝０、ｔ＝４、およびｔ＝１２週間の時点で測定した。 試験された様々な製剤における３種類の異なるインフルエンザ株由来のビロソームの凝集開始温度および全体的サイズ変化を特定するための、温度に対するビロソームサイズの変化を測定することによって得られた温度依存性プロフィール。 試験された様々な製剤における３種類の異なるインフルエンザ株由来のビロソームの凝集開始温度および全体的サイズ変化を特定するための、温度に対するビロソームサイズの変化を測定することによって得られた温度依存性プロフィール。 試験された様々な製剤における３種類の異なるインフルエンザ株由来のビロソームの凝集開始温度および全体的サイズ変化を特定するための、温度に対するビロソームサイズの変化を測定することによって得られた温度依存性プロフィール。 塩濃度低下時の凝集開始温度および全体的サイズ変化を特定するための、塩濃度に対する細胞由来のＡ／ヴィクトリアのビロソームのサイズの変化を測定した滴定プロフィール。 細胞培養Ａ／カリフォルニア由来のビロソームについて１回の凍結／解凍サイクルの前および後に測定した平均直径サイズ。 細胞培養Ａ／カリフォルニア由来のビロソームについて１回の凍結／解凍サイクルの前および後に測定したＨＡ濃度。 ５±３℃で１２週間貯蔵した細胞培養Ａ／カリフォルニア由来のビロソーム。平均直径サイズはｔ＝０、ｔ＝４、およびｔ＝１２週間の時点で測定した。 ５±３℃で１２週間貯蔵した細胞培養Ａ／カリフォルニア由来のビロソーム。ＨＡ濃度はｔ＝０、ｔ＝４、およびｔ＝１２週間の時点で測定した。 細胞培養Ｂ／ブリスベン由来のビロソームについて１回の凍結／解凍サイクルの前および後に測定した平均直径サイズ。 細胞培養Ｂ／ブリスベン由来のビロソームについて１回の凍結／解凍サイクルの前および後に測定したＨＡ濃度。 ５±３℃で４週間貯蔵した細胞培養Ｂ／ブリスベン由来のビロソーム。平均直径サイズはｔ＝０、ｔ＝４、およびｔ＝１２週間の時点で測定した。 ５±３℃で４週間貯蔵した細胞培養Ｂ／ブリスベン由来のビロソーム。ＨＡ濃度はｔ＝０、ｔ＝４、およびｔ＝１２週間の時点で測定した。 Ａ／ヴィクトリア由来のビロソームについて１回の凍結／解凍サイクルの前および後に測定した平均直径サイズ。 Ａ／ヴィクトリア由来のビロソームについて１回の凍結／解凍サイクルの前および後に測定したＨＡ濃度。 ５±３℃で１２週間貯蔵したＡ／ヴィクトリア由来のビロソーム。平均直径サイズはｔ＝０、ｔ＝４、およびｔ＝１２週間の時点で測定した。 ５±３℃で１２週間貯蔵したＡ／ヴィクトリア由来のビロソーム。ＨＡ濃度はｔ＝０、ｔ＝４、およびｔ＝１２週間の時点で測定した。 三価のブレンドビロソームについて１回の凍結／解凍サイクルの前および後に測定した平均直径サイズ。 三価のブレンドビロソームについて１回の凍結／解凍サイクルの前および後に測定したＨＡ濃度。 三価のブレンドビロソームについて１回の凍結／解凍サイクルの前および後に測定したＨＡ濃度。 三価のブレンドビロソームについて１回の凍結／解凍サイクルの前および後に測定したＨＡ濃度。 ５±３℃で１２週間貯蔵した三価のブレンドビロソーム。平均直径サイズはｔ＝０、ｔ＝４、およびｔ＝１２週間の時点で測定した。 ５±３℃で１２週間貯蔵した三価のブレンドビロソーム。ＨＡ濃度はｔ＝０、ｔ＝４、およびｔ＝１２週間の時点で測定した。 ５±３℃で１２週間貯蔵した三価のブレンドビロソーム。ＨＡ濃度はｔ＝０、ｔ＝４、およびｔ＝１２週間の時点で測定した。 ５±３℃で１２週間貯蔵した三価のブレンドビロソーム。平均直径サイズはｔ＝０、ｔ＝４、およびｔ＝１２週間の時点で測定した。 ＜−６５℃で１２週間貯蔵した三価のブレンドビロソーム。平均直径サイズはｔ＝０およびｔ＝１２週間の時点で測定した。 ＜−６５℃で１２週間貯蔵した三価のブレンドビロソーム。ＨＡ濃度はｔ＝０およびｔ＝１２週間の時点で測定した。 ＜−６５℃で１２週間貯蔵した三価のブレンドビロソーム。ＨＡ濃度はｔ＝０およびｔ＝１２週間の時点で測定した。 ＜−６５℃で１２週間貯蔵した三価のブレンドビロソーム。ＨＡ濃度はｔ＝０およびｔ＝１２週間の時点で測定した。

本発明の製剤は、少なくとも１種類のビロソームを含む。ビロソームは、そのビロソームに標的細胞と融合させるウィルス由来のタンパク質を組み込んだ単ラメラのリン脂質膜の小胞からなる薬物またはウィルス送達機構である。ビロソームは複製することができないが、純粋な融合活性の小胞である。

ビロソームは、インフルエンザウィルス由来の赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）のようなウィルス由来のタンパク質を含有する再構成リン脂質（ＰＬ）膜である。そのＨＡおよびＮＡ抗原は、好ましくはインフルエンザ株、例えばこれらに限定されないがＡ／カリフォルニア株、Ｂ／ブリスベン株、またはＡ／ヴィクトリア株に由来する。好ましい実施形態では本発明で使用されるインフルエンザ株は、Ａ／カリフォルニア株、Ｂ／ブリスベン株、およびＡ／ヴィクトリア株の群から選択される。

本発明の組成物（または製剤）におけるビロソームは、これらインフルエンザウィルスから、または他のエンベロープウィルス、例えばこれらに限定されないが、フラビウィルス科（ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、デング熱ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルスＨＥＶ、日本脳炎ウィルス、黄熱病ウィルス、ウェストナイルウィルス）、ポックスウィルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）（すなわち、牛痘ウィルス、サル痘ウィルス、天然痘ウィルス、痘瘡ウィルス）、レトロウィルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（すなわち、免疫不全ウィルスＨＩＶ／ＳＩＶ）、パラミクソウィルス科（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（すなわち、麻疹ウィルス、流行性耳下腺炎ウィルス、パラインフルエンザウィルス、メタニューモウィルス、呼吸器多核体ウィルスＲＳＶ）、およびオルソミクソウィルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（すなわちインフルエンザウィルス）から得ることができる。ビロソームはウィルス性ゲノム物質（例えばウィルス性ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含有しないので、生来それらは非複製性であり、それにより、標的指向リガンドの有無のかかわらずビロソームを免疫原性組成物の形態（例えばワクチンとして）での、またはアジュバントとしての、または薬物（タンパク質）送達用の小胞としての動物およびヒトへの投与にとって安全となる。したがってビロソームは、特定の疾患または障害と関係のある１つの抗原または複数の抗原への免疫応答を活性化させることが望ましいワクチン接種の分野では特に有用であった。このような場合、１つの抗原（または複数の抗原）を、一般にはビロソーム中にカプセル封入するか、または埋包し、あるいはビロソームと結合させ、次いでこの１つの抗原または複数の抗原をワクチン接種される被験者の宿主免疫系に送達する。

したがってこのビロソームは、従来のワクチンの域を超える分野において用途が予想されるアジュバント特性を有する革新的で広く応用できる担体システムを意味する。ビロソームはきわめて効率的でかつ広く使用される薬物またはワクチン送達システムであると考えられる。

ビロソームは、一般には可溶化したウィルスのフラクションから２つの異なる手法のいずれかを使用して生産される。一方の手法は、ビロソーム膜の再構成の前に、可溶化したウィルスのフラクションに外因性の脂質を加えることを伴い（例えば、米国特許出願公開第２００９／０２６３４７０号明細書および米国特許出願公開第２００９／００８７４５３号明細書に記載されているような）、またもう一方の手法は、外因性の脂質を加えないウィルス膜の再構成に基づいている（例えば、米国特許第７，９０１，９２０号明細書に記載されているような）。ビロソームの構築については当該技術分野でよく理解されており、標準的な技術、例えばＳｔｅｇｍａｎｎら、Ｍｉｓｈｌｅｒら、およびＨｅｒｚｏｇらが述べている技術の使用を伴う。投与の様式は、これに限定されないが、筋内、皮内、および鼻腔内であることができる。

本明細書中で使用される用語「安定性」とは、製剤中でビロソーム粒子が劣化に抵抗し、それによってその予想される効用の時間的尺度に関してその生物学的効果を維持する傾向を指す。

ビロソームは、とりわけそれが量（すなわち、ＨＡ濃度に関して２７％以下の損失）および生物学的活性に関して最小限の損失を示し、かつ主要なタンパク質の変化を少しも示さない場合、組成物または医薬製剤中で「その物理的安定性を保持する」。これに加えて、目視検査で凝集、解離、沈殿、変色、および／または透明度変化の徴候が見られるべきでない。

本出願中で使用される「約」とは、別段の指定がない限り±１０％を意味する。

「薬学的に許容できる医薬品添加剤」とは、飲みやすいまたは使いやすい剤形を調製するためにビロソームなどの活性分子と組み合わせられる任意の不活性物質を意味する。「薬学的に許容できる医薬品添加剤」は、使用される用量および濃度で受容者に非毒性であり、かつビロソーム調合物を含む組成物の他の成分と共存できる医薬品添加剤である。薬学的に許容できる医薬品添加剤の例は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可された凍結防止剤、非イオン界面活性剤、緩衝剤、塩、フリーラジカル酸化阻害剤である。

用語「副生物」には、所与の製剤中の活性ビロソームの比率を損なうまたは減少させる望ましくない生成物が挙げられる。典型的な副生物には、ビロソーム凝集塊が挙げられる。それらは、ビロソームよりも大きい粒径を有する可溶性または不溶性の複合体である。ビロソーム凝集塊に加えて、ビロソームの分解生成物には、例えば不定形ビロソーム、タンパク質凝集塊、または沈殿物質を挙げることができる。

ビロソームの安定性を向上させる組成物（製剤と同義で呼ばれる）は、本明細書中で使用されるように「安定製剤」とも呼ばれ、その中のビロソームが貯蔵時にそれらの物理的かつ／または化学的完全性、および／または生物学的活性を本質的に保持する組成物である。安定性は、ある期間にわたる、またある種の貯蔵条件下におけるビロソーム製剤中に含有されるタンパク質の濃度、脂質含量、有効性、および／または組成物中のビロソームの他の質的側面などの様々な特性を測定することによって評価することができる。具体的には平均粒径はビロソームの凝集状態の目安として測定することができ、それは約５０〜３００ｎｍの間、理想的には１００〜２５０ｎｍの間にあるべきである。ビロソーム組成物の特性を、高温においてまたは他のストレスを加えた条件下で測定することができ、例えば保管期間に与える様々な製剤の効果を調べるために製剤を２５℃でインキュベートにかけることも、また凍結／解凍サイクルおよび撹拌にかけることもできる。安定性を決める上記特性は、目視検査、一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）、およびＺｅｔａ ｓｉｚｅｒ測定または他の利用可能な方法からなる群から選択される方法のうちの少なくとも一つによって求めることができる。

一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）
Ｗｏｏｄら（１９７７年）に記載されている一元放射免疫拡散法は、ビロソーム試料中のＨＡの定量的かつ定性的測定に結びつく。抗原を界面活性剤（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４界面活性剤、ＶＷＲ）中で可溶化して、株特異的抗体を含有する寒天ゲル中でのそれらの拡散を可能にする。抗原が過剰に存在する場合には抗原と抗体が結合し、小さくかつ可溶性の抗原−抗体複合体を形成することになる。ゲル中への拡散のせいで、平衡に達し不溶性沈降輪が形成されるまで、より多数の抗体が結合することになる。円の外縁における不溶性の抗原−抗体複合体の量は徐々に増加し、したがって円の直径は徐々に大きくなる。円の直径の二乗（また面積）は、抗原の最初の濃度に正比例し、かつゲル中の抗体濃度に反比例する。直径サイズを測定し、それを検量線と比較することにより、試料中の活性抗原の濃度が得られることになる。

内部対照として、適切な株の不活化した卵由来インフルエンザウィルスを使用した。各内部対照を国際規格に対して較正した。

沈降輪の直径（単位ｍｍ）を、Ｉｍｍｕｌａｂソフトウェアを使用して測定する。または別法ではそれらは１０倍の拡大鏡により肉眼で測定することもできる。

国際規格調製品を適切な濃度でＰＢＳＡ中に溶解し、１％の最終濃度になるように１０％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔを加える。３０分間のインキュベート（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔが試料と反応する）の後、検量線を段階希釈により得ることができる。試料をＰＢＳＡ中で予備希釈し、１％の最終濃度でＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔを加える。３０分間のインキュベート後に段階希釈を行って、試験される異なる試料濃度を得る。

アッセイに使用するアガロースゲルを準備するには寒天溶液を融解し、次いで６０℃に冷却しなければならない。適切な量の血清（株によって決まり、ＮＩＢＳＣ証明書による）を加えなければならず、またその溶液をゲルチャンバーに移す必要がある。ゲル形成後、カッティングシリンダーによりウェルを得る。

試験手順：
試料をピペットでとり２つ組でウェルに入れ、次いで湿潤チャンバー中で１８〜２４時間インキュベートする。次いでゲルを蒸留水で洗浄し、次いで染色液に１５分間浸漬する。ゲルを脱色液に４分間浸漬した後、１２時間乾燥し、次いで評価の準備ができる。評価は、ゲルのスキャン画像上でＩｍｍｕｌａｂソフトウェアにより行う。円の直径の測定値は定量化のためにＣｏｍｂｉｓｔａｓソフトウェアに送られる。

Ｚｅｔａ ｓｉｚｅｒ測定
ストレスを加えた条件下および貯蔵時のビロソームの品質を調べるために、Ｍａｌｖｅｒｎ’ｓ Ｚ−ｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ ＺＳによりビロソームの直径平均サイズを測定する。希釈されていない試料をＺ−ｓｉｚｅのキュベットに装填し、Ｈｅ−Ｎｅ Ｌａｓｅｒ（λ＝６３３ｎｍ）および１７３°前方検出器を用いて直接に測定する。

この計器は、規定流体中のブラウン運動に基づいて粒子の固有特性を測定し、内部対照も検量線も必要としない。平均直径は、キュムラント解析フィット（国際規格ＩＳＯ１３３２１：１９９６によって規定されている）を適用して測定される。

温度プロフィール分析を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚ−ｓｉｚｅｒ ＺＳ上で３５℃から７５℃まで温度に傾斜をつけて行った。これは計器の取扱説明書に従って組み立てられ、上記と同じパラメータを用いて粒径を測定しながら行った。

細胞培養したＡ／ヴィクトリアのビロソームのＮａＣｌ滴定を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚ−ｓｉｚｅｒ ＺＳ上でＮａＣｌ塩濃度を１３０ｍＭから３３ｍＭまで希釈して行った。これは計器の取扱説明書に従って組み立てられ、上記と同じパラメータを用いて粒径を測定しながら行った。

本発明は、ビロソームを安定させる製剤に関し、また関連する医薬製品、好ましくは遺伝子治療および／またはワクチン用途に使用される医薬製品に関する。本明細書中で開示される組成物を含有する、好ましい安定化されたビロソームは、約２〜８℃の範囲で貯蔵した場合のビロソームの安定性の向上と、偶発的な凍結または加熱に対する抵抗性とを示し、一方ではまた非経口投与に適合する液体組成物である。しかしながらこれらの製剤はまた低温で、例えば−２０℃以下、−４０℃以下、−６５℃以下、−８０℃以下で貯蔵することができる。これらはまた、８℃を超える温度で、例えば２５℃またはさらに高い温度で安定であることができる。ビロソームを安定化することができるこれらの組成物は、ビロソームの熱安定性を高める安定剤として複合ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液および二糖を含む。上記緩衝液のｐＨは、６．５〜８の間にある。

本発明による好ましい実施形態では組成物は、６．５〜８の間の範囲のｐＨを有し、ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液（ただし、リン酸濃度は１５ｍＭ〜３０ｍＭの間の範囲にある）を含み、６０ｍＭを超える濃度で塩を含み、かつさらに２％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の間の範囲の濃度で二糖を含む。

本発明の組成物は、様々な程度の濃度のビロソームに安定性を与え、かつ様々な脊椎生物、好ましくは哺乳動物、特にヒトに投与することができる。本発明の安定化された製剤はビロソームを基剤とする組成物であり、例えばインフルエンザに対する予防的利点を与えることができるワクチンとして、感染既往歴のない個体に投与することができる。

本発明の好ましい態様は、約２５μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬの範囲のビロソーム埋包ＨＡ濃度を有する本明細書中で述べた高い安定性特性を示すビロソーム含有組成物である。より好ましい範囲は、約２５μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬであり、特に好ましいＨＡ濃度は約３０〜４０μｇ／ｍＬである。本発明の製剤の予防用組成物は、個体にその個別の疾患を予防するのに十分な量で投与することができる。ヒトに投与するための有効な量は、個体の状態、体重、性別、および年齢などの様々な因子に応じて変えることができる。他の因子には、投与の様式が挙げられる。

本発明による組成物は、（ａ）ビロソーム、（ｂ）（ａ）を緩衝する６．５〜８の間のｐＨ範囲にある複合ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液（ただしリン酸濃度は１５ｍＭ〜３０ｍＭの間の範囲にある）、および（ｃ）６０ｍＭを超える濃度の塩を含み、さらに（ｄ）二糖を含む。予想外に上記組合せは、ビロソームの量および質の保存のための卓越した組成物であることが分かった。

好ましい実施形態ではＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液中のリン酸濃度は、約１５ｍＭ〜３０ｍＭの間、例えば約１５ｍＭ〜２５ｍＭの間の範囲にあり、例えば約２０ｍＭである。

広い温度範囲にわたる、かつ長期の貯蔵期間に対するビロソーム安定化に貢献する、これらの製剤中の別の不可欠の成分は二糖である。好ましい実施形態では二糖の濃度は、約２％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の間、例えば約３％（ｗ／ｗ）〜８％（ｗ／ｗ）の間、例えば約３％（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）の間の範囲にあり、例えば約４％（ｗ／ｗ）、例えば約３％（ｗ／ｗ）である。

本発明の製剤中の二糖は、好ましくはトレハロースおよびスクロースの群から選択される。

好ましい実施形態では本発明による組成物は、ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４により６．５〜８の間の範囲にあるｐＨに緩衝され、かつ二糖としてトレハロースまたはスクロースを含む。好ましくは上記組成物中のトレハロースまたはスクロースの濃度は、約２％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の間、例えば約３％（ｗ／ｗ）〜８％（ｗ／ｗ）の間、例えば約３％（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）の間の範囲にあり、例えば約４％（ｗ／ｗ）である。

本発明の好ましい実施形態では組成物は、２０ｍＭリン酸を含むＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液により７〜７．８の間の範囲のｐＨに緩衝され、かつトレハロースまたはスクロースを約２％（ｗ／ｗ）〜６％（ｗ／ｗ）の間の範囲の濃度で含む。

本発明の好ましい実施形態では組成物は、２０ｍＭリン酸を含むＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液により約７．５のｐＨに緩衝され、かつトレハロースまたはスクロースが約４％（ｗ／ｗ）の濃度で存在する。

本発明の好ましい実施形態では組成物は、２０ｍＭリン酸を含むＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液により約７．５のｐＨに緩衝され、かつトレハロースが約４％（ｗ／ｗ）の濃度で存在する。

細胞から得られたＡ／ヴィクトリアのインフルエンザ株由来の抗原を含有するビロソームは、許容範囲（３００ｍＭ）内でビロソームサイズを維持するためには最低限６０ｍＭの濃度のＮａＣｌを必要とすることが本明細書で示される。これはビロソームの安定性を増すためには６５ｍＭの最低限のＮａＣｌ濃度が、最終組成物に加えられるべきであることを示唆する。

したがって本発明による組成物中の塩濃度は、好ましくは６０ｍＭを超えるべきである。好ましい実施形態では塩濃度は、例えば６０〜８５ｍＭの間、例えば６５ｍＭ〜７５ｍＭの間、例えば６５〜７０ｍＭの間の範囲にあり、例えば約６５ｍＭである。

この量の塩は、製剤の等張力に達するには十分であるはずである。好ましい実施形態では上記塩はＮａＣｌである。当該技術分野で知られている他の種類の塩も同様に本発明による製剤に適している。当業者であればどの塩を選択すべきかが分かるはずである。

上記考察に照らして本発明は、例えば遺伝子治療および／または遺伝子ワクチンの用途に使用することができるビロソームを含有する組成物に関し、それらは安定性特性の向上を示し、かつ６．５〜８の間のｐＨのＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液（リン酸濃度は、１５〜３０ｍＭの間の範囲にある）および二糖を少なくとも含有し、さらに６０〜８５ｍＭの間の濃度で塩を含む。

本発明の特定の実施形態は、ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４により約ｐＨ６．５〜ｐＨ８の間の範囲に緩衝されるビロソームと、２％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の間の範囲にある濃度の二糖とを含有し、塩を６０〜８５ｍＭの間の濃度でさらに含むそのような組成物に関する。

本発明の特定の実施形態は、ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４（リン酸濃度は、１５〜３０ｍＭの間の範囲にある）により約ｐＨ７〜ｐＨ７．８の範囲に緩衝され、トレハロースおよびスクロースの群から選択される二糖（濃度は、２％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の間の範囲にある）を含有し、塩を６０〜８５ｍＭの間の濃度でさらに含むそのようなビロソーム組成物に関する。

本発明の好ましい実施形態では組成物は、ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液（リン酸濃度は２０ｍＭである）により約７．５のｐＨに緩衝され、かつトレハロースまたはスクロースが約４％（ｗ／ｗ）の濃度で存在し、さらにＮａＣｌを６０〜８５ｍＭの間の濃度で含む。これに加えて前述の因子の組合せを使用することができる。

本発明の好ましい実施形態では組成物は、ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液（リン酸濃度は２０ｍＭである）により約７．５のｐＨに緩衝され、トレハロースまたはスクロースが約４％（ｗ／ｗ）の濃度で存在し、かつＮａＣｌが６５ｍＭの濃度で存在する。

本発明の別の好ましい実施形態では組成物は、ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液（リン酸濃度は２０ｍＭである）により約７．５のｐＨに緩衝され、トレハロースが約４％（ｗ／ｗ）の濃度で存在し、かつＮａＣｌが６５ｍＭの濃度で存在する。これに加えて前述の因子の組合せを使用することができる。

一実施形態では本発明による組成物はガラス瓶、例えばＤＩＮ ２ＲタイプＩのホウケイ酸ガラスの瓶に入れられる。別の実施形態では製剤は袋に入れられる。本発明の製剤を入れる袋は、例えばエチレン酢酸ビニルコポリマー（ＥＶＡ）またはエチルビニルアルコール（ＥＶＯＨ）から作られる層を含むことができる。本発明のさらに別の実施形態では製剤は、例えばガラス、ポリプロピレン、またはポリカーボネートの予め充填されるシリンジなどのシリンジに入れられる。

本明細書中で述べるビロソーム製剤は、脊椎動物の宿主（好ましくは哺乳動物の宿主、特にヒト受容体）に、非経口または鼻腔経路などの当該技術分野で知られている任意の手段によって投与することができる。

本明細書中で開示される製剤に従って、本発明はまた、本明細書中で開示されるビロソーム含有製剤、すなわち−６５℃未満で、また約２〜８℃の範囲で、また場合によってはより高い温度で貯蔵された場合のビロソーム安定性の向上をもたらし、一方でまた非経口投与、特にヒトに対する非経口投与に適合するそのような製剤を調製することを含むビロソームの保存方法に関する。

したがって本発明の別の態様は、本明細書中で開示される組成物を調製し、上記組成物を２℃〜８℃の間の範囲の温度で貯蔵することを含むビロソームの保存方法に関する。

下記の実施例は本発明を例示するために提供されるが、本発明をこれらに限定するものではない。

実施例１
実験の設計および方法論
異なるインフルエンザ株由来のＨＡ分子をそれぞれ含む、３種類の異なるインフルエンザ由来のビロソーム調合物を１つの対照組成物に調製し、「Ｃｏｇｅｎｔ μＳＣＡＬＥ ＴＦＦシステム」ＵＦ／ＤＦインストルメント（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて再緩衝して８種類の実験的製剤（表１）にした。溶出液を濾過滅菌（０．２２μｍ）し、等分してガラス瓶に入れた（１瓶につき３ｍＬ）。この対照組成物は、５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４で７．４のｐＨに緩衝され、かつ約８２ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む現在市販されているＩｎｆｌｅｘａｌ（登録商標）Ｖ組成物である。

続いてその瓶を１サイクルの凍結／解凍（Ｆ／Ｔ）にかけるか、または安定性の研究のために５±３℃でインキュベート（１ヶ月および３ヶ月の間）した。これらは、両方とも実時間条件をシミュレートしている。試料の分析が２回繰り返して行われるまで、瓶を分割量のそれらのそれぞれの対照と一緒に５±３℃で貯蔵した。試料を、発明を実施するための形態の項において前述したＨＡ定量化のための一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）およびビロソーム粒径測定のためのＺ−ｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ（ＺＳ）によって分析した。

結果および結論
Ａ／カリフォルニア由来のビロソームについて平均直径サイズおよびＨＡ濃度を１回の凍結／解凍サイクルの前および後に測定した（図１）。１回の凍結／解凍サイクル後、対照組成物は、直径サイズ（図１Ａ）およびＨＡ濃度（図１Ｂ）の両方に関してビロソームの安定性にとって不利であることが観察された。

予想外に、試験された実験的製剤については平均直径サイズに関して優れた性能が観察され、また単糖または二糖を、特にｐＨ７．０で加えた場合、明らかな追加の値が観察された（図１Ａ）。実際にこれらの製剤ではビロソームサイズの顕著な変化は動的光散乱法により測定されなかった。試験された実験的製剤については凍結／解凍後のＨＡ濃度の変化に関して良好な安定性プロフィールが観察された（図１Ｂ）。

Ａ／カリフォルニア由来のビロソームを５±３℃で１２週間貯蔵し、平均直径サイズおよびＨＡ濃度をｔ＝０、ｔ＝４、およびｔ＝１２週間の時点で測定した（図２）。分析したすべての製剤についてビロソームサイズに関して経時的に顕著な変化は観察されなかった（図２Ａ）。対照組成物および試験された実験的製剤について経時的なＨＡ濃度の変化の同じ傾向が観察された（図２Ｂ）。

Ｂ／ブリスベン由来のビロソームについて平均直径サイズおよびＨＡ濃度を１回の凍結／解凍サイクルの前および後に測定した（図３）。１回の凍結／解凍サイクル後、対照組成物は、直径サイズ（図３Ａ）およびＨＡ濃度（図３Ｂ）の両方に関してビロソームの安定性にとって不利であることが観察された。

予想外に、試験された代替製剤については平均サイズ（図３Ａ）およびＨＡ濃度（図３Ｂ）の両方に関して優れた性能が観察され、また凍結／解凍後、ビロソーム直径またはＨＡ濃度の顕著な変化は観察されなかった。単糖または二糖を加えた場合、凍結／解凍後の直径サイズの変化を防止する点で明らかな追加の値が観察された。

Ｂ／ブリスベン由来のビロソームを５±３℃で２４週間貯蔵し、平均直径サイズをｔ＝０、ｔ＝４、ｔ＝１２、およびｔ＝２４週間の時点で測定し、またＨＡ濃度をｔ＝０、ｔ＝４、およびｔ＝１２の時点で測定した（図４）。分析したすべての製剤についてビロソーム直径サイズに関して（図４Ａ）、またＨＡ濃度に関して（図４Ｂ）経時的に顕著な変化は観察されなかった。総合するとこのデータは、これら実験製剤と対照製剤の良好な互換性を示唆する。

Ａ／ヴィクトリア由来のビロソームについて平均直径サイズおよびＨＡ濃度を１回の凍結／解凍サイクルの前および後に測定した（図５）。対照組成物は、このストレッサー後の安定性を確保する点で、具体的にはＨＡ濃度に関して明らかに次善最適であった。試験したすべての実験的製剤（糖を含まないリン酸ｐＨ７．０を除く）の平均サイズに関して良好な性能が観察された（図５Ａ）。ビロソーム直径サイズの顕著な変化は動的光散乱法により測定されなかった。予想外に、単糖または二糖を含むすべての実験的製剤については凍結／解凍後のＨＡ濃度の変化に関して優れた性能が観察された（図５Ｂ）。Ａ／ヴィクトリア由来のビロソームを５±３℃で１２週間貯蔵し、平均直径サイズをｔ＝０およびｔ＝４週間の時点で測定し、またＨＡ濃度をｔ＝０、ｔ＝４、およびｔ＝１２週間の時点で測定した（図６）。糖を含まないリン酸ｐＨ７．０を除いて、分析されたすべての実験的製剤についてはビロソームサイズに関して（図６Ａ）、またＨＡ濃度に関して（図６Ｂ）経時的に顕著な変化は観察されず、これは単糖または二糖がこの緩衝液に価値を加えることを示す。総合するとこのデータは、この代替製剤と対照製剤の良好な互換性を示唆する。

凍結／解凍実験（図１、３、および５）は、驚くべきことに本発明による製剤が偶発的な凍結の事態からビロソームを守るのにきわめて適しており、それによってビロソームにより大きな安定性を与えることを示している。

すべてのことを総合すると、平均直径サイズおよびＨＡ濃度を測定した安定性の研究（５±３℃で１２週間）（図２、４、および６）は、実験的製剤と、すでに何年にもわたって堅牢でかつ効果的であることが証明されており、ビロソームの保存のために市場で現在まだ使用されている組成物である対照製剤との良好な互換性を示す。

上記で得られた、統計的解析後のすべてのデータを組み合わせることにより、変数の特定の組合せがビロソームに最善の安定性を与えることをはっきりと実証した。ビロソームの安定性にとって最も堅牢であることが判明した組成物は、２０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４を７．５のｐＨで含み、さらに８％トレハロースを含む緩衝された組成物であった。

実施例２
実験の設計および方法論
試験された様々な製剤の温度上昇時の凝集開始および全体的サイズの変化を特定するために、温度に対するビロソーム直径サイズの変化を測定することによって温度プロフィールを得た。３５℃から７５℃までの温度の傾斜をＺ−ｓｉｚｅｒ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて得て、ビロソームサイズをその同じキュベット中で３℃おきに直接に測定した。

結果および結論
試験された様々な製剤におけるビロソームの凝集開始温度および全体的サイズ変化を表す温度依存性プロフィールを図７（Ａ、Ｂ、およびＣ）に示す。分析された３種類の株のすべてについて対照組成物は、加速温度ストレス後の熱安定性を確保するための次善最適であった。実際にすべての株についてビロソームの直径サイズは、５２℃〜６２℃の間の温度範囲において劇的に増大（３００ｎｍを超えるまで）した。Ｂ／ブリスベン（図７Ｂ）の場合、試験された新規製剤のほとんどすべてが開始温度を上昇させ、ｐＨ７．５のトレハロース含有組成物は、最大サイズに与えるプラス効果を高温で到達させた。すなわち最大直径サイズは３００ｎｍに取って代わらなかった。

Ａ／カリフォルニア（図７Ａ）およびＡ／ヴィクトリア（図７Ｃ）の場合、開始温度の上昇はそれほど顕著ではないが、試験された新規製剤のすべては、驚くべきことにビロソームの直径サイズの増大を緩和させる点で明白なプラス効果を示した。

この実験の最終の結論は、７．５のｐＨの２０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４で緩衝され、さらに８％トレハロースを含む組成物が、ビロソームの安定性を増すための最も有望な組合せであることを示唆する実施例１で得られた結果を確認した。

実施例３
実験の設計および方法論
塩濃度低減時の凝集開始および全体的サイズの変化を特定するために、塩濃度に対するビロソームサイズの変化を測定する滴定プロファイル分析を細胞培養したＡ／ヴィクトリア由来のビロソーム上で行った。１３０ｍＭから３３ｍＭまでの塩（ＮａＣｌ）濃度の傾斜をＺ−ｓｉｚｅｒ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）中で実施し、ビロソームサイズを同じキュベット中でＮａＣｌ濃度を減少して１９回測定した。

結果および結論
Ａ／ヴィクトリアのビロソームの、或る一定のＮａＣｌ濃度におけるビロソームの凝集開始と、全体的サイズ変化とを表すＮａＣｌ濃度依存性プロフィールを図８に示す。

７．５のｐＨの２０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４および１３０ｍＭ ＮａＣｌを含有する組成物を自動的に希釈することによって、ＮａＣｌ濃度を１３０ｍＭから３３ｍＭまで下げた。Ａ／ヴィクトリアのビロソームの直径サイズは、６５ｍＭ未満のＮａＣｌ濃度では劇的に増大（３００ｎｍを超えるまで）した。同じ効果は、似た実験（８％トレハロースを加える）においても観察された（データは示さない）。

この実験の最終の結論は、細胞由来のＡ／ヴィクトリア株の場合、許容範囲（３００ｍＭ）内でビロソームサイズを維持するためには６５ｍＭ ＮａＣｌの最低限濃度を必要とすることを示し、これはビロソームの安定性を増すためには６５ｍＭの最低限ＮａＣｌ濃度が最終組成物に加えられるべきであることを示唆する。

実施例４
実験の設計および方法論
異なるインフルエンザ株由来のＨＡ分子をそれぞれ含む、３種類の異なるインフルエンザ由来のビロソーム調合物を１つの対照組成物に調製し、「Ｃｏｇｅｎｔ μＳＣＡＬＥ ＴＦＦシステム」ＵＦ／ＤＦインストルメント（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて再緩衝して２種類の実験的製剤（表２）にした。この対照製剤はまた、緩衝液交換の影響を排除するために同じシステムで再緩衝された。

溶出液を濾過滅菌（０．２２μｍ）し、等分してガラス瓶に入れる（１瓶につき３ｍＬ）か、またはプールして三価生成物にし、次いで等分してガラス瓶に入れた。上記三価生成物（略称を「三価」ともいう）は、異なるインフルエンザ株由来の抗原をそれぞれ含有する３種類の異なるビロソームの混合物である。この実験において三価は、Ａ／ヴィクトリア株、Ｂ／ブリスベン株、またはＡ／カリフォルニア株のいずれかに由来するインフルエンザ抗原を有する３種類の異なるビロソームを含有する。

この対照組成物は、現在市販されているＩｎｆｌｅｘａｌ（登録商標）Ｖ組成物のうちの一つであり、５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４で７．４のｐＨに緩衝され、かつ約８２ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む。続いて瓶を、１サイクルの凍結／解凍（Ｆ／Ｔ）にかけるか、または安定性の研究のために５±３℃でインキュベート（１ヶ月および３ヶ月の間）した。これらは、両方とも実時間条件をシミュレートしている。試料の分析が３回繰り返して行われるまで、瓶を分割量のそれらのそれぞれの対照と一緒に５±３℃で貯蔵した。試料を、前述のＨＡ定量化のための一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）およびビロソーム粒径測定のためのＺ−ｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ（ＺＳ）を用いて分析した。

結果および結論
細胞由来のＡ／カリフォルニアのビロソームについて平均直径サイズおよびＨＡ濃度を１回の凍結／解凍サイクルの前および後に測定した（図９）。１回の凍結／解凍サイクル後、対照組成物は、直径サイズ（図９Ａ）およびＨＡ濃度（図９Ｂ）の両方に関してビロソームの安定性にとって不利であることが観察された。

予想外に、試験された実験的製剤（緩衝液Ｔおよび緩衝液Ｓ）については、平均直径サイズに関して優れた性能が観察され、また二糖を加えた場合、明らかな追加の値が観察された（図９Ａ）。実際にこれらの製剤ではビロソームサイズの顕著な変化は動的光散乱法により測定されなかった。試験された実験的製剤ついては凍結／解凍後のＨＡ濃度の変化に関してきわめて良好な安定性プロフィールが観察された（図９Ｂ）。

Ａ／カリフォルニア細胞由来のビロソームを５±３℃で１２週間貯蔵し、平均直径サイズおよびＨＡ濃度をｔ＝０、ｔ＝４、およびｔ＝１２週間の時点で測定した（図１０）。分析したすべての製剤についてはビロソームサイズに関して経時的に顕著な変化は観察されなかった（図１０Ａ）。対照組成物および試験された実験的製剤について経時的なＨＡ濃度変化の同じ傾向が観察された（図１０Ｂ）。

Ｂ／ブリスベン由来のビロソームについて平均直径サイズおよびＨＡ濃度を１回の凍結／解凍サイクルの前および後に測定した（図１１）。１回の凍結／解凍サイクル後、対照組成物は、直径サイズ（図１１Ａ）およびＨＡ濃度（図１１Ｂ）の両方に関してビロソームの安定性にとって不利であることが観察された。

予想外に、試験された代替製剤（緩衝液Ｔおよび緩衝液Ｓ）の場合、平均サイズ（図１１Ａ）に関して、またＨＡ濃度（図１１Ｂ）に関して両方で優れた性能が観察され、凍結／解凍後にビロソーム直径サイズもＨＡ濃度も顕著な変化は測定されなかった。二糖を加えた場合、凍結／解凍後の直径サイズの変化を防止する点で明らかな追加の値が観察された。

Ｂ／ブリスベン由来のビロソームを５±３℃で１２週間貯蔵し、平均直径サイズをｔ＝０、ｔ＝４、およびｔ＝１２週間の時点で測定し、またＨＡ濃度をｔ＝０、ｔ＝４、およびｔ＝１２週間の時点で測定した（図１２）。分析したすべての製剤についてビロソームの直径サイズ（図１２Ａ）に関して、またＨＡ濃度（図１２Ｂ）に関して経時的に顕著な変化は観察されなかった。総合するとこのデータは、この代替製剤と対照製剤の良好な互換性を示唆する（図１２）。

Ａ／ヴィクトリア由来のビロソームについて平均直径サイズおよびＨＡ濃度を１回の凍結／解凍サイクルの前および後に測定した（図１３）。対照組成物は、このストレッサー後の安定性を確保する点で、具体的にはサイズ変化に関して明らかに次善最適であった。試験された両方の実験的製剤については平均サイズに関して良好な性能が観察され（図１３Ａ）、ビロソームの直径サイズの顕著な変化は動的光散乱法により測定されなかった。予想外に、二糖を含む実験的製剤（緩衝液Ｔおよび緩衝液Ｓ）の場合、凍結／解凍後のＨＡ濃度に関して優れた性能が観察された（図１３Ｂ）。

Ａ／ヴィクトリア由来のビロソームを５±３℃で１２週間貯蔵し、平均直径サイズおよびＨＡ濃度をｔ＝０、ｔ＝４、およびｔ＝１２週間の時点で測定した（図１４）。分析された実験的製剤についてはビロソームサイズ（図１４Ａ）に関して、またＨＡ濃度（図１４Ｂ）に関して経時的に顕著な変化は観察されず、これは二糖がこの緩衝液に価値を加えたこと示す。

ビロソームの三価混合物について平均直径サイズおよびＨＡ濃度を１回の凍結／解凍サイクルの前および後に測定した（図１５）。対照組成物は、ＨＡ濃度およびサイズの両方に関してこのストレッサー後の安定性を確保する点で明らかに次善最適であった。試験された両方の実験的製剤については平均サイズに関して良好な性能が観察され（図１５Ａ）、ビロソームの直径サイズの顕著な変化は動的光散乱法により測定されなかった。予想外に、二糖を含む実験的製剤の場合、凍結／解凍後のＨＡ濃度の変化に関して優れた性能が観察された（図１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｄ）。

三価ビロソームを５±３℃で１２週間貯蔵し、平均直径サイズおよびＨＡ濃度をｔ＝０、ｔ＝４、およびｔ＝１２週間の時点で測定した（図１６）。分析された実験的製剤についてはビロソームサイズ（図１６Ａ）に関して、またＨＡ濃度（図１６Ｂ、１６Ｃ、１６Ｄ）に関して経時的に顕著な変化は観察されず、これは二糖がこの緩衝液に価値を加えたことを示す。

総合するとこのデータは、これら代替製剤と対照製剤の良好な互換性を示唆する。この凍結／解凍実験（図９、１１、１３、および１５）は、本発明による製剤が、驚くべきことに偶発的な凍結の事態からビロソームを守るのにきわめて適しており、それによってビロソームにより大きな安定性を与えることを示している。

すべてのことを総合すると、平均直径サイズおよびＨＡ濃度を測定した安定性の研究（５±３℃で１２週間）（図１０、１２、１４、および１６）は、実験的製剤と、すでに何年にもわたって堅牢でかつ効果的であることが証明されており、ビロソームの保存のために市場で現在まだ使用されている組成物である対照製剤との良好な互換性を示す。

上記で得られた、統計的解析後のすべてのデータを組み合わせると、特定の変数の組合せがビロソームの最善の安定性をもたらすことをはっきりと実証した。ビロソームの安定性にとって最も堅牢であることが判明した組成物は、７．５のｐＨの２０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４および７５ｍＭのＮａＣｌを含み、さらに４％トレハロースを含む緩衝された組成物であった。

実施例５
実験の設計および方法論
異なるインフルエンザ株由来のＨＡ分子をそれぞれ含む、３種類の異なるインフルエンザ由来のビロソーム調合物を１つの対照組成物に調製し、「Ｃｏｇｅｎｔ μＳＣＡＬＥ ＴＦＦシステム」ＵＦ／ＤＦインストルメント（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて再緩衝して２種類の実験的製剤（表１に開示されているような）にした。この対照製剤はまた、緩衝液交換の影響を排除するために同じシステムで再緩衝された。

溶出液を濾過滅菌（０．２２μｍ）し、プールして三価生成物にし、次いで等分してガラス瓶に入れた（１瓶に付き３ｍＬ）。この対照組成物は現在市販されているＩｎｆｌｅｘａｌ（登録商標）Ｖ組成物のうちの一つであり、５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４で７．４のｐＨに緩衝され、かつ約８２ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む。続いて瓶を、安定性の研究のために＜−６５℃でインキュベート（１２週間の間）した。試料の分析が３回繰り返して行われるまでは、瓶を分割量のそれらのそれぞれの対照と一緒に＜−６５℃で貯蔵した。試料を、アッセイの説明において前述したようなＨＡ定量化のための一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）およびビロソーム粒径測定のためのＺ−ｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ（ＺＳ）を用いて分析した。

結果および結論
三価ビロソームを＜−６５℃で１２週間貯蔵し、平均直径サイズおよびＨＡ濃度をｔ＝０およびｔ＝１２週間の時点で測定した（図１７）。

試験した新規製剤中のビロソームサイズに関しては経時的に顕著な変化は観察されなかった（図１７Ａ）。試験した新規製剤は＜−６５℃で１２週間のあいだビロソームを安定化させることができ、一方、対照試料（現行の製剤）についてはビロソームサイズの明らかな増大が観察された。

三価組成物（図１７Ｂ、１７Ｃ、および１７Ｄ）中に含まれる３種類の株のそれぞれについてＨＡ濃度を＜−６５℃でｔ＝０よびｔ＝１２週間貯蔵の時点で測定した。対照（現行の製剤）と比較して試験した２種類の新規製剤については、特にＢ／ブリスベンおよびＡ／カリフォルニアについては明らかな改善が観察された。それらの２種類の株のＨＡ濃度は、対照製剤では＜−６５℃で１２週間の貯蔵の後に劇的に低下するが、それらビロソームをこれら試験した２種類の新規製剤に製剤化した場合には本質的に一定に保たれる。

上記で得られた、統計的解析後のすべてのデータを組み合わせると、特定の変数の組合せが＜−６５℃で貯蔵の間のビロソームの最善の安定性をもたらすことをはっきりと実証した。＜−６５℃での貯蔵後のビロソームの安定性にとって最も堅牢であることが判明した組成物は、７．５のｐＨの２０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４および７５ｍＭ ＮａＣｌを含み、さらに４％トレハロースを含む緩衝された組成物であった。

参考文献
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また、本発明は以下を提供する。
［１］
ａ）ビロソームと、
ｂ）ＫＨ _２ ＰＯ _４ ／Ｎａ _２ ＨＰＯ _４ 緩衝液であって、前記リン酸の濃度が約１５ｍＭ〜３０ｍＭの間の範囲にある、緩衝液と、
ｃ）塩であって、前記塩の濃度が６０ｍＭを超える、塩と、
ｄ）二糖と
を含む組成物であって、６．５〜８の間の範囲のｐＨを有する、組成物。
［２］
前記二糖の濃度が、約２％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の間の範囲にある、［１］に記載の組成物。
［３］
前記二糖が、トレハロースおよびスクロースの群から選択される、［１］または［２］に記載の組成物。
［４］
前記二糖がトレハロースである、［３］に記載の組成物。
［５］
前記二糖がスクロースである、［３］に記載の組成物。
［６］
前記組成物が、約７〜７．８の範囲のｐＨを有する、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の組成物。
［７］
前記組成物が、約７．５のｐＨを有し、かつトレハロースまたはスクロースを３％（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）の間の範囲の濃度で含む、［１］に記載の組成物。
［８］
塩を６０ｍＭ〜８５ｍＭの間の範囲の濃度でさらに含む、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の組成物。
［９］
前記塩がＮａＣｌである、［８］に記載の組成物。
［１０］
前記組成物が液体組成物である、［１］〜［９］のいずれか一項に記載の組成物。
［１１］
［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の組成物を調製することを含む、ビロソームの保存方法。
［１２］
［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の組成物を調製することおよび前記組成物を２℃〜８℃の間の範囲の温度で貯蔵することを含む、ビロソームの保存方法。
［１３］
［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の組成物を調製することおよび前記組成物を−８０℃〜−６５℃の間の範囲の温度で貯蔵することを含む、ビロソームの保存方法。
［１４］
［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の組成物を調製することおよび前記組成物を−１５℃〜−３０℃の間の範囲の温度で貯蔵することを含む、ビロソームの保存方法。

Claims (8)

1. ａ）インフルエンザウィルス由来の赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含むビロソームと、
   ｂ）ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液であって、前記リン酸の濃度が１５ｍＭ〜３０ｍＭの間の範囲にある、緩衝液と、
   ｃ）ＮａＣｌであって、前記ＮａＣｌの濃度が６０ｍＭ〜１３０ｍＭの間の範囲にある、ＮａＣｌと、
   ｄ）トレハロースであって、前記トレハロースの濃度が２％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の間の範囲にある、トレハロースと
   を含む組成物であって、６．５〜８の間の範囲のｐＨを有する、液体組成物。
2. 前記組成物が、７〜７．８の範囲のｐＨを有する、請求項１に記載の組成物。
3. 前記組成物が、７．５のｐＨを有し、かつトレハロースを３％（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）の間の範囲の濃度で含む、請求項１に記載の組成物。
4. ＮａＣｌの濃度が６０ｍＭ〜８５ｍＭの間の範囲にある、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物を調製することを含む、ビロソームの保存方法。
6. 前記組成物を２℃〜８℃の間の範囲の温度で貯蔵することをさらに含む、請求項５に記載のビロソームの保存方法。
7. 前記組成物を−８０℃〜−６５℃の間の範囲の温度で貯蔵することをさらに含む、請求項５に記載のビロソームの保存方法。
8. 前記組成物を−１５℃〜−３０℃の間の範囲の温度で貯蔵することをさらに含む、請求項５に記載のビロソームの保存方法。