CN105899220B - 改进的病毒体配制品 - Google Patents

Abstract

本发明提供了病毒体配制品，具体而言是包括病毒体的液体药物配制品。一个优选实施例是包括以下项的组合物：a)病毒体；b)KH2PO4/Na2HPO4缓冲液，其中磷酸盐浓度的范围是在约15mM和30mM之间；c)盐，其中该盐浓度高于60mM；d)二糖，其中所述组合物具有范围在6.5和8之间的pH。还披露了保存用于制备刚刚限定的组合物的病毒体的方法。

Description

改进的病毒体配制品

发明领域

本发明涉及病毒体配制品，以及用于治疗和疫苗应用的相关药物产品。具体而言，在此披露了病毒体的液体配制品，这些配制品拓宽了病毒体保持稳定的温度窗口。这通过以下方式来完成：当储存在约2℃-8℃范围或更高温度下时，保存病毒体数量以及物理和化学特性连同蛋白质成分和结构完整性，同时还防止来自意外冻结的损害并且是与非消化道给药兼容的。

发明背景

病毒体是包含掺有病毒衍生蛋白的单层磷脂膜的囊泡，这种组合允许病毒体与靶细胞融合。因此，病毒体不同于脂质体，并且被认为是非常有效的药物或疫苗递送系统。

在药物递送和疫苗研究领域中持续的挑战是产生病毒体的液体配制品，其中病毒体长期地并且在宽温度窗口内保持稳定。事实上，任何意外冻结(例如，在储存或运输过程中)都对产品完整性具有不利影响并且因此对功效具有不利影响。任何意外加热也是有害的，这造成产品不稳定和功效损失(例如，由于聚集)。对于任何可注射液体配制品，通常希望的是在宽储存温度范围(如从约2℃至约8℃)内的稳定性较长，这使得保质期较长。

病毒体颗粒的生物活性取决于颗粒的构象完整性并且取决于与其膜结合的抗原分子的性质。不像传统的有机和无机药物，病毒体颗粒是复杂的并且由许多具体的磷脂和蛋白质构建，其中小量的化学或物理应激源可以促进病毒体颗粒的降解。因此，为了确保长的保质期，病毒体制剂的稳定组成是至关重要的，但是稳定化病毒体提出了具体的挑战。病毒体可能由于物理不稳定性(包括嵌入式蛋白的变性、粒子聚集(可溶性和不溶性聚集体形成两者)或融合、解离、沉淀和吸附)连同化学不稳定性(包括例如，水解、脱酰胺作用和氧化)而失去效力。此外，作为病毒体的结构部件的脂质易于水解和氧化。任何这些降解途径都可导致生物活性降低，但是还可以潜在地导致具有增加毒性和/或改变的免疫原性的副产物或衍生物的形成。

因此，需要定制方法来找到稳健的病毒体组合物，从而确保在宽条件范围内的稳定性。缓冲液类型、pH和特化赋形剂将需要结合到独特的组合中，并且对其进行精心优化以保持病毒体在化学、物理学和生物学上是稳定的。鉴于可能变化的所有因素，找到用于配制病毒体的最佳条件面临着挑战，并且良好组合物的组成是事前不可预测的。

先前已经披露过包含脂质体的配制品。尽管脂质体从根本上来讲不同于病毒体，但是这些配制品可以被认为相关的现有技术。许多冻干的脂质体配制品在市场上存在，像(吉利德科技公司(Gilead Sciences,Inc)，圣迪马斯，加利福尼亚州)、

(Ben Venue实验室公司，贝德福德，俄亥俄州)、Myocet、

(诺华制药公司(Novartis Pharma AG)，巴塞尔，瑞士)和LEP-ETU(易用型脂质体包埋的紫杉醇；NeoPharm公司，莱克布拉夫(Lake Bluff)，伊利诺伊州；弗雷埃罗(Freixeiro)等人；默尼耶(Meunier)等人)，并且它们是相当稳定的，然而它们是昂贵的，并且在给药之前需要耗时的操作，容易出错。因此，可以在2℃-8℃之间或≤-65℃下储存的液体组合物将是病毒体的优选产品形式。具体而言，所述组合物是否将允许病毒体对在运输或储存它的过程中的意外冻结有抗力。

在现有技术中，已经描述了仅仅几个研究单糖或二糖在脂质体液体配制品中的使用的实例。有趣的是，发现此类单糖或二糖的作用是有害的，因为它们导致冻融损害的急剧增加(兴查(Hincha)等人)或在2℃-8℃储存过程中降低稳定性(弗雷埃罗(Freixeiro)等人)。

先前已经披露了病毒体的液体配制品，并且其已经在市售产品中使用了许多年，如

V和

在它们不能在冷冻后保留病毒体的稳定性的意义上而言，所述配制品在这里显示是次优的。尽管事实上这些配制品已经上市许多年，但是制造公司没有设法使得病毒体配制品对意外冻结事件或长期低温储存(即，≤-65℃)有抗力。

能够防止来自意外冻结对病毒体结构和抗原含量的损害，同时确保在2℃-8℃储存过程中的最佳稳定性的配制品的鉴定仍是挑战，并且将带来减少成本并促进所述配制品的临床应用的巨大优势。

因此，在本领域需要找到在储存或运输过程中意外冻结时保留病毒体稳定性的液体配制品。在长期储存过程中，这些改进的配制品将保存所包含病毒体的数量和质量。此外，配制品应当适用于非消化道给药，应当是耐受性良好的并且应当优选具有简单的组成。本发明的目的是提供此类病毒体配制品。

发明概述

我们已经发现并在此描述了当意外冻结时保留病毒体稳定性的组合物，与之前披露的组合物(或配制品)相比，通过保存病毒体的数量和质量从而改进了病毒体稳定性。出人意料地，具有范围在6.5和8之间的pH的组合KH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液连同二糖的组合产生了在冻结后保存病毒体数量和质量的突出组合物，与本领域中已知的其他组合物相比，随其改进了整体病毒体稳定性。

因此，本发明涉及用于稳定病毒体的组合物(或配制品)，以及可以例如用于治疗和疫苗应用的相关药物产品。

根据本发明的组合物包括a)病毒体在b)pH范围在6.5和8之间的组合KH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液中，其中磷酸盐浓度的范围是在15mM和30mM之间，c)浓度高于60mM的盐；并且进一步包括d)二糖。

本发明的病毒体配制品易于在2℃至8℃或≤-65℃下长期储存，持续超过6个月、1年、1.5年、2年或更久。优选地，根据本发明的组合物包括总抗原浓度在约20μg/mL和300μg/mL之间的病毒体。

在一个优选实施例中，二糖的浓度范围是在2％(w/w)和10％(w/w)之间。该二糖优选地选自下组：海藻糖和蔗糖。

在根据本发明的一个实施例中，海藻糖是优选的二糖。海藻糖优选以范围在2％(w/w)和10％(w/w)之间的浓度存在。

在根据本发明的又另一个实施例中，蔗糖是优选的二糖。蔗糖优选以范围在约2％(w/w)和10％(w/w)之间的浓度存在。

在根据本发明的一个优选实施例中，该组合物具有范围在约6.5和8之间的pH；包括KH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液，其中磷酸盐浓度的范围是在15mM和30mM之间；该组合物还包括浓度高于60mM的盐；并且进一步包括浓度范围在2％(w/w)和10％(w/w)之间的二糖。

在根据本发明的一个优选实施例中，该组合物具有范围在约6.5和8之间的pH；包括KH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液，其中磷酸盐浓度的范围是在15mM和30mM之间；该组合物还包括浓度高于60mM的盐并且进一步包括浓度范围在2％(w/w)和10％(w/w)之间的选自下组的二糖：海藻糖和蔗糖。

在根据本发明的一个优选实施例中，该组合物具有范围在约7和7.8之间的pH。

在根据本发明的一个优选实施例中，该组合物具有范围在约7和7.8之间的pH；包括KH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液，其中磷酸盐浓度的范围是在15mM和30mM之间；该组合物还包括浓度高于60mM的盐并且进一步包括浓度范围在2％(w/w)和10％(w/w)之间的选自下组的二糖：海藻糖和蔗糖。

在根据本发明的又另一个优选的实施例中，该组合物具有约7.5的pH；包括KH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液，其中磷酸盐浓度的范围是在15mM和30mM之间；该组合物还包括浓度高于60mM的盐；并且进一步包括浓度范围在3％(w/w)和5％(w/w)之间的海藻糖或蔗糖。

在一个优选实施例中，根据本发明的组合物包括浓度范围在约60mM和85mM之间的盐。在另一个优选实施例中，所述盐是NaCl。

在另一个优选实施例中，根据本发明的组合物是脂质组合物。

在一个实施例中，根据本发明的组合物包含于小瓶中。在另一个实施例中，这些组合物包含于袋中。在又另一个实施例中，这些组合物包含于(预填充的)注射器或药筒中。

本发明还涉及一种保存病毒体的方法，该方法包括制备根据本发明的组合物。

在又另一个实施例中，本发明涉及一种保存病毒体的方法，该方法包括制备如在此描述的组合物并且在范围2℃和8℃之间的温度下储存所述组合物。在某些实施例中，所述组合物储存超过6个月、1年、1.5年、2年或更久。

在其他实施例中，本发明涉及一种保存病毒体的方法，该方法包括制备如在此描述的组合物并且在范围-15℃和-30℃之间的温度下储存所述组合物。

在其他实施例中，本发明涉及一种保存病毒体的方法，该方法包括制备如在此描述的组合物并且在范围-80℃和-65℃之间的温度下储存所述组合物。

在宽温度范围中提高的长期稳定性使得在此披露的病毒体组合物(或配制品)的保质期延长，允许在约1-2年期间内储存和最终向宿主给予这些组合物，并且活性单价抗原浓度的损失是可接受的(即，在2℃-8℃下，就HA浓度而论，损失不超过27％)。此外，本发明的组合物在暴露于升高的温度、冻融循环或长低温储存(即，≤-65℃)过程中显示出稳定性。

附图说明

图1(A和B)。在一次冻融循环的前后，针对流感(A/加利福尼亚)衍生的病毒体测量了平均直径大小和HA浓度。

图2(A和B)。将流感(A/加利福尼亚)衍生的病毒体在5℃±3℃下储存12周。在t＝0、t＝4和t＝12周时，测量平均直径大小和HA浓度。

图3(A和B)。在一次冻融循环的前后，针对流感(B/布里斯班)衍生的病毒体测量了平均直径大小和HA浓度。

图4(A和B)。将流感(B/布里斯班)衍生的病毒体在5℃±3℃下储存12周。在t＝0、t＝4、t＝12和t＝24周时测量平均直径大小，并且在t＝0、t＝4和t＝12周时测量HA浓度。

图5(A和B)。在一次冻融循环的前后，针对流感(A/维多利亚)衍生的病毒体测量了平均直径大小和HA浓度。

图6(A和B)。将流感(A/维多利亚)衍生的病毒体在5℃±3℃下储存12周。在t＝0和t＝4周时测量平均直径大小，并且在t＝0、t＝4和t＝12周时测量HA浓度。

图7(A、B和C)。在所测试的不同配制品中，通过测量随着温度的病毒体大小变化所获得的温度依赖性曲线，用以鉴定衍生自三种不同流感株的病毒体的聚集起始温度和整体大小变化。

图8测量随着盐浓度的细胞衍生的A/维多利亚病毒体大小变化的滴定曲线，用以鉴定当盐浓度降低时的聚集起始和整体大小变化。

图9(A和B)。在一次冻融循环的前后，针对细胞培养的A/加利福尼亚衍生的病毒体测量了平均直径大小和HA浓度。

图10(A和B)。将细胞培养的A/加利福尼亚衍生的病毒体在5℃±3℃下储存12周，并且在t＝0、t＝4和t＝12周时测量平均直径大小和HA浓度。

图11(A和B)。在一次冻融循环的前后，针对细胞培养的B/布里斯班衍生的病毒体测量了平均直径大小和HA浓度。

图12(A和B)。将细胞培养的B/布里斯班衍生的病毒体在5℃±3℃下储存4周，并且在t＝0、t＝4和t＝12周时测量平均直径大小和HA浓度。

图13(A和B)。在一次冻融循环的前后，针对A/维多利亚衍生的病毒体测量了平均直径大小和HA浓度。

图14(A和B)。将A/维多利亚衍生的病毒体在5℃±3℃下储存12周，并且在t＝0、t＝4和t＝12周时测量平均直径大小和HA浓度。

图15(A、B、C和D)。在一次冻融循环的前后，针对混合的三价病毒体测量了平均直径大小和HA浓度。

图16(A、B、C和D)。将混合的三价病毒体在5℃±3℃下储存12周，并且在t＝0、t＝4和t＝12周时测量平均直径大小和HA浓度。

图17(A、B、C和D)。将混合的三价病毒体在<-65℃下储存12周，并且在t＝0和t＝12周时测量平均直径大小和HA浓度。

发明详述

本发明的配制品包括至少一种病毒体。病毒体是药物或疫苗递送机构，其由掺入病毒衍生蛋白的单层磷脂膜囊组成，以允许病毒体与靶细胞融合。病毒体不能复制而是单纯的融合活性囊泡。

病毒体是包含来自病毒的蛋白的重构磷脂(PL)膜，像来自流感病毒的血球凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)。HA和NA抗原优选源于流感株，例如但不限于A/加利福尼亚株、B/布里斯班株或A/维多利亚株。在一个优选实施例中，在本发明中使用的流感病毒株选自下组：A/加利福尼亚株、B/布里斯班株和A/维多利亚株。

在本发明的组合物(或配制品)中的病毒体可以衍生自流感病毒，或衍生自其他包膜病毒，例如但不限于以下科：黄病毒科(例如，登革病毒、丙型肝炎病毒HEV、日本脑炎病毒、黄热病毒、西尼罗病毒)、痘病毒科 (即，牛痘病毒、猴痘病毒、痘苗病毒、天花病毒)、逆转录病毒科(即，免疫缺陷病毒HIV/SIV)、副粘病毒科(即，麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流行性感冒病毒、偏肺病毒、呼吸道合胞体病毒RSV)和正粘病毒科(即，流感病毒)。由于病毒体并不包含病毒遗传材料(例如，病毒RNA或DNA)，因此它们本质上是非复制型的，这使得它们可安全地向动物和人类以免疫原性组合物(例如，作为疫苗)的形式、或作为佐剂、或作为具有或没有靶向配体的药物(蛋白)递送囊泡来给予。因此，病毒体在疫苗接种领域中一直是特别有用的，在该领域中希望的是刺激对与具体的疾病或障碍相关的一种或多种抗原的免疫应答。在这类情况下，一种抗原(或多种抗原)典型地被封装或嵌入在病毒体中或与病毒体结合，然后该病毒体递送此抗原或这些抗原至待接种的受试者的宿主免疫系统。

因此，病毒体代表一种具有佐剂特性的、创新的、广泛适用的，并且在领域中的应用前景超越了常规疫苗的载体系统。病毒体被认为是非常有效的并且广泛使用的药物或疫苗递送系统。

病毒体通常使用两种不同方法之一从溶解的病毒部分产生，一种方法涉及在重构病毒体膜之前向溶解的病毒部分添加外源性脂质(如在例如US 2009/0263470、US 2009/0087453中所描述的)，并且另一种方法是基于不添加外源性脂质的情况下重构病毒膜(例如，如在US 7,901,920中所描述的)。病毒体的构建在本领域中是被充分理解的，并且涉及使用以下标准技术，如在例如思特曼(Stegmann)等人、米什勒(Mishler)等人和赫尔佐克(Herzog)等人中所描述的那些。给药方式可以是但不限于：肌肉内、皮内和鼻内。

如在此使用的术语“稳定性”是指病毒体颗粒抵抗在配制品中降解的倾向，从而保留它在其所预期有效的时间段内的生物效应。

如果病毒体(除其他外)就数量(即，就HA浓度而论损失不超过27％)和生物活性而论显示出最小损失，并且没有展示大量的蛋白质修饰，那么它在组合物或药物配制品中“保留其物理稳定性”。此外，经肉眼检查时，应当观察不到聚集、解离、沉淀的迹象，颜色和/或澄清度的改变。

除非另有说明，如在本申请中使用的“约”意指±10％。

“药学上可接受的赋形剂”意指与活性分子(如病毒体)组合用于制备适合或适宜剂型的任何惰性物质。“药学上可接受的赋形剂”是在所用剂量和浓度下对接受者无毒并且与包括病毒体制剂的组合物的其他成分相容的赋形剂。药学上可接受的赋形剂的实例是由食品与药品管理局(FDA)批准的冷冻保护剂、非离子型洗涤剂、缓冲液、盐、自由基氧化抑制剂。

术语“副产物”包括所不希望的产物，其降低或减小活性病毒体在给定配制品中的比例。典型的副产物包括病毒体聚集体。这些聚集体是具有大于病毒体粒度的可溶性或不溶性复合物。除病毒体聚集体以外，病毒体降解产物可以包括例如非结构化的病毒体、蛋白质聚集体或沉淀的材料。

如在此使用的改进病毒体稳定性的组合物(可互换地命名为配制品)(又名为“稳定配制品”)是这样一种组合物，其中组合物中的病毒体当储存时基本上保留了其物理和/或化学完整性和/或生物活性。可以通过确定不同特征来评估稳定性，如在一段时间内并且在某些储存条件下，在病毒体配制品中所包含的一种或多种蛋白质的浓度、脂质含量、效力和/或组合物中病毒体的其他质量方面。具体而言，平均粒度可以被测量作为病毒体聚集状态的指示，并且应当在约50nm和300nm之间，理想的是在100nm和250nm之间。病毒体组合物的特征可以在升高的温度下或在其他应激条件下进行测量，例如，配制品可以经受在25℃下的孵育或经受冻融循环和搅拌，以便研究不同配制品对保质期的影响。决定稳定性的所述特征可以通过选自下组的方法中的至少一种来确定，该组由以下各项组成：肉眼检查、单向辐射状免疫扩散(SRID)法和泽塔粒度仪(Zeta sizer)测量或其他适用方法。

单向辐射状免疫扩散法(SRID)

单向辐射状免疫扩散法(如在伍德(Wood)等人1977中所描述的)使得定量和定性确定病毒体样品中的HA。将这些抗原在洗涤剂(Zwittergent 3-14洗涤剂，VWR)中溶解，以允许其在包含株特异性抗体的琼脂凝胶中扩散。抗原和抗体将结合，并且当抗原过量存在时，形成小的且可溶的抗原-抗体复合物。由于扩散进入凝胶，大量抗体将结合直到达到平衡，并且形成不溶性沉淀环。在圆的外缘处不溶性抗原-抗体复合物的数量随着时间而增加，并且因此圆的直径随着时间而增加。圆的直径的平方(和面积)与抗原的初始浓度成正比，并且与凝胶中的抗体浓度成反比。测量直径大小并且将其与标准曲线比较，将给出样品中活性抗原的浓度。

作为内部对照，已经使用了适当株的失活卵衍生的流感病毒。将每个内部对照相对于国际标准进行校正。

使用Immulab软件测量沉淀环直径(以mm计)，或可替代地，它们可以用Scale放大镜10X通过眼睛测量。

将国际标准制剂以适当浓度溶解于PBSA中，并且添加10％Zwittergent，以具有1％的终浓度。在30min孵育(用于使Zwittergent与这些样品反应)后，可以通过连续稀释获得标准曲线。将样品在PBSA中进行预稀释，并且以1％的终浓度添加Zwittergent。在30分钟孵育后，进行连续稀释以获得待测的不同样品浓度。

为了制备用于测定的琼脂糖凝胶，必须融化琼脂溶液，并且然后冷却至60℃。必须添加适量的血清(取决于株并且根据NIBSC证书)，并且需要将溶液转入凝胶室中。在凝胶形成后，通过裁切圆筒获得这些孔。

测试程序：

将样品一式两份地吸移在孔中，然后将这些样品在恒湿箱中孵育18-24小时。然后将凝胶用蒸馏水冲洗，并且然后在染色溶液中浸泡15min。在那之后，将凝胶在脱色溶液中浸泡4分钟，干燥12小时，并且然后准备好评估。在凝胶的扫描图像上用Immulab软件进行评估。将圆直径的测量值转移到Combistats软件用于定量。

泽塔粒度仪测量

用马尔文(Malvern)的Z-粒度仪纳米ZS测量病毒体直径平均大小，以便检查在应激条件和储存时病毒体的质量。将未稀释的样品装载到Z-粒度仪比色皿中并且直接用氦-氖激光(λ＝633nm)和173°前向检测器进行测量。

该仪器在限定的流体中基于布朗运动测量颗粒的固有性质：既不需要内部对照也不需要标准曲线。应用累积分析拟合(如通过国际标准ISO13321:1996所定义的)测量平均直径。

在马尔文Z-粒度仪ZS上进行温度分析，以使温度从35℃渐变至75℃，建立以下仪表指令同时用如以上所描述的相同参数测量粒度。

针对细胞培养的A/维多利亚病毒体，在马尔文Z-粒度仪ZS上进行NaCl滴定，以将盐NaCl浓度从130mM稀释到33mM，建立以下仪表指令同时用如以上所描述的相同参数测量粒度。

本发明涉及稳定病毒体的配制品，并且涉及相关的药物产品，优选地用于基因疗法和/或疫苗应用。包含在此披露的组合物的优选稳定病毒体是以下液体组合物，其储存在约2℃-8℃范围内时显示出改进的病毒体稳定性和对意外冻结或加热的抗力同时还与非消化道给药兼容。然而，这些配制品还可以储存在较低温度下，例如，-20℃或更低、-40℃或更低、-65℃或更低、-80℃或更低。它们还可能在高于8℃，例如25℃或甚至更高的温度下是更稳定的。能够稳定病毒体的这些组合物包括组合KH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液，和作为稳定剂的二糖，该二糖提高了病毒体的热稳定性。所述缓冲液的pH在6.5和8之间。

在根据本发明的一个优选实施例中，该组合物具有范围在约6.5和8之间的pH；包括KH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液，其中磷酸盐浓度的范围是在15mM和30mM之间；包括浓度高于60mM的盐并且进一步包括浓度范围在2％(w/w)和10％(w/w)之间的二糖。

本发明的组合物为不同浓度程度的病毒体提供了稳定性，并且可以向多种脊椎动物生物体给予，优选哺乳动物并且尤其是人类。本发明的稳定配制品是基于病毒体的组合物，例如，其可以作为疫苗向之前未曾感染的个体给予，该疫苗能针对例如流感提供预防性优势。

本发明的一个优选方面是包含病毒体的组合物，其显示出在此描述的提高的稳定性特征，其中病毒体嵌入的HA浓度在从约25μg/mL至约300μg/mL的范围内。一个更优选的范围是从约25μg/mL至约100μg/mL，并且特别优选的HA浓度是从约30μg/m至40μg/mL。可以将本发明的配制品的预防性组合物以足以预防对应的障碍的量向个体给予。人类给予的有效量可以根据多种因素(如个体的病症、体重、性别和年龄)而变化。其他因素包括给药方式。

根据本发明的组合物包括a)病毒体在b)pH范围在6.5和8之间的组合KH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液中，其中磷酸盐浓度的范围是在15mM和30mM之间，c)浓度高于60mM的盐；并且进一步包括d)二糖。出乎意料地，所述组合已经被证明是一种用于保存病毒体数量和质量的突出组合物。

在一个优选实施例中，在KH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液中的磷酸盐浓度的范围是在约15mM和30mM之间，例如在约15mM和25mM之间，例如约20mM。

在这些配制品中的另一种必要成分是二糖，其促进在大的温度范围内和长时间储存期的病毒体稳定。在一个优选实施例中，二糖的浓度范围是在约2％(w/w)至10％(w/w)之间，例如在约3％(w/w)至8％(w/w)之间，例如在约3％(w/w)至5％(w/w)之间，例如约4％(w/w)，例如约3％(w/w)。

本发明配制品中的二糖优选地选自下组：海藻糖和蔗糖。

在一个优选实施例中，将根据本发明的组合物用KH₂PO₄/Na₂HPO₄进行缓冲，至范围在6.5和8之间的pH，并且包括海藻糖或蔗糖作为二糖。优选地，在所述组合物中的海藻糖或蔗糖的浓度范围是在约2％(w/w)至10％(w/w)之间，例如在约3％(w/w)至8％(w/w)之间，例如在约3％(w/w)至5％(w/w)，例如约4％(w/w)。

在本发明的一个优选实施例中，将该组合物用包括20mM磷酸盐的KH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液进行缓冲，至范围在7和7.8之间的pH，并且包括浓度范围在约2％(w/w)至6％(w/w)之间的海藻糖或蔗糖。

在本发明的一个优选实施例中，将该组合物用包括20mM磷酸盐的KH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液进行缓冲，至约7.5的pH；并且海藻糖或蔗糖以约4％(w/w)的浓度存在。

在本发明的一个优选实施例中，将该组合物用包括20mM磷酸盐的KH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液进行缓冲，至约7.5的pH；并且海藻糖以约4％(w/w)的浓度存在。

在此显示出包含来自细胞衍生的A/维多利亚Flu株的抗原的病毒体需要最低浓度的60mM NaCl来保持病毒体大小在可接受范围(300mM)内，表明应当将65mM的最低NaCl浓度添加至最终组合物中以增加病毒体稳定性。

因此，在根据本发明的组合物中的盐浓度优选应当超过60mM。在一个优选实施例中，盐浓度范围是例如在60mM和85mM之间，例如在65mM和75mM之间，例如在65mM和70mM，例如约65mM。

该盐量足以达到配制品的等渗性。在一个优选实施例中，所述盐是NaCl。本领域中已知的其他类型的盐同样适合于根据本发明的配制品。技术人员应知道选择哪些盐。

鉴于以上讨论，本发明涉及包含病毒体的组合物，其可以例如用于基因疗法和/或基因疫苗接种应用，其显示出改进的稳定性特性并且其至少包含pH在6.5和8之间的KH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液，其中磷酸盐浓度的范围是在15mM和30mM之间；二糖；并且进一步包括浓度在60mM和85mM之间的盐。

本发明的一个具体实施例涉及包含病毒体的这样一种组合物，将该组合物用KH₂PO₄/Na₂HPO₄进行缓冲至从约pH 6.5至pH 8的范围；包括浓度范围在2％(w/w)和10％(w/w)之间的二糖；并且进一步包括浓度在60mM和85mM之间的盐。

本发明的一个具体实施例涉及这样一种病毒体组合物，将该组合物用KH₂PO₄/Na₂HPO₄进行缓冲至从约pH 7至pH 7.8的范围，其中磷酸盐浓度的范围是在15mM和30mM之间；包括浓度范围在2％(w/w)和10％(w/w)之间的选自下组的二糖：海藻糖和蔗糖；并且进一步包括浓度在60mM和85mM之间的盐。

在本发明的一个优选实施例中，将该组合物用KH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液进行缓冲至约7.5的pH，其中磷酸盐浓度是20mM；并且海藻糖或蔗糖以约4％(w/w)的浓度存在，并且进一步包括浓度在60mM和85mM之间的NaCl。此外，可以使用以上提及的因素的组合。

在本发明的一个优选实施例中，将该组合物用KH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液进行缓冲至约7.5的pH，其中磷酸盐浓度是20mM；海藻糖或蔗糖以约4％(w/w)的浓度存在；并且NaCl以65mM的浓度存在。

在本发明的另一个优选的实施例中，将该组合物用KH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液进行缓冲至约7.5的pH，其中磷酸盐浓度是20mM；海藻糖以约4％(w/w)的浓度存在；并且NaCl以65mM的浓度存在。此外，可以使用以上提及的因素的组合。

在一个实施例中，根据本发明的组合物包含于小瓶中，像例如DIN 2R I型硼硅玻璃小瓶。在另一个实施例中，这些配制品包含于袋中。包含本发明配制品的袋可以包括由例如乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(EVA)或乙基乙烯醇(EVOH)制成的层。在本发明的又另一个实施例中，这些配制品包含于注射器中，像例如玻璃、聚丙烯或聚碳酸酯预填充的注射器。

可以通过本领域中已知的任何手段(如非消化道或鼻内途径)将在此描述的病毒体配制品向脊椎动物宿主(优选哺乳动物宿主并且尤其是人类接受者)给予。

根据在此披露的配制品，本发明还涉及保存病毒体的方法，这些方法包括制备如在此披露的包含病毒体的配制品，此类配制品在低于-65℃以及在约2℃-8℃范围内并且可能更高温度下储存时产生改进的病毒体稳定性，同时还与非消化道给药(尤其是向人类的非消化道给药)兼容。

因此，本发明的另一方面涉及保存病毒体的方法，这些方法包括制备如在此披露的组合物，并且在范围在2℃和8℃之间的温度下储存所述组合物。

提供以下实例，用以说明本发明，然而并不限制本发明。

实例

实例1

实验设计和方法学。

已经在对照组合物中制备了各自包括来自不同流感株的HA分子的三种不同流感衍生的病毒体制剂，并且在8个实验配制品(表1)中用“CogentμSCALE TFF系统”UF/DF仪器(密理博公司(Millipore))进行重新缓冲。将洗脱物进行过滤灭菌(0.22μm)并且等分在玻璃小瓶(每小瓶3mL)中。对照组合物是当前市售的

V组合物，该组合物被50mMKH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲至7.4的pH；并且该组合物包括浓度约82mM的NaCl。

随后，小瓶经受1次冻融(F/T)循环或者在5℃±3℃下孵育用于稳定性研究(在一个月和三个月过程中)，这两者都模拟实时条件。将小瓶与其对应的对照一起以等分储存在5℃±3℃下，直到一式两份地进行样品分析。通过以下项分析样品：如以上在说明书中所描述的，用于HA定量的单向辐射状免疫扩散(SRID)，以及用于病毒体颗粒直径测量的Z-粒度仪纳米(ZS)。

表1.针对此项研究选择的配制品列表。

结果和结论。

在一次冻融循环的前后，针对A/加利福尼亚衍生的病毒体测量了平均直径大小和HA浓度(图1)。在一次冻融循环后观察到，对照组合物就直径大小(图1A)和HA浓度(图1B)二者而言都是对病毒体稳定性有害的。

出乎意料地，针对所测试的实验配制品，就平均直径大小而言，观察到了优异的性能，并且当添加单糖或二糖时，尤其是在pH 7.0下观察到了明确的增值(图1A)。事实上，在这些配制品中，通过动态光散射测量病毒体大小无显著变化。在冻融后，就HA浓度变化而言，针对所测试的实验配制品观察到了良好的稳定性曲线(图1B)。

将A/加利福尼亚衍生的病毒体在5℃±3℃下储存12周，并且在t＝0、t＝4和t＝12周时测量平均直径大小和HA浓度(图2)。针对所分析的所有配制品，就病毒体大小而言，随着时间观察到无显著变化(图2A)。针对所测试的对照组合物和实验配制品，观察到了HA浓度变化随着时间的相同趋势(图2B)。

在一次冻融循环的前后，针对B/布里斯班衍生的病毒体测量了平均直径大小和HA浓度(图3)。在一次冻融循环后观察到，对照组合物就直径大小(图3A)和HA浓度(图3B)二者而言都是对病毒体稳定性有害的。

出乎意料地，针对所测试的替代性配制品，就平均大小(图3A)和HA浓度(图3B)二者而言都观察到了优异的性能：在冻融后，测量病毒体直径大小或HA浓度没有显著变化。当添加单糖或二糖时，观察到了在冻融后防止直径大小变化的明确增值。

将B/布里斯班衍生的病毒体在5℃±3℃下储存24周，并且在t＝0、t＝4、t＝12和t＝24周时测量平均直径大小，并且在t＝0、t＝4和t＝12周时测量HA浓度(图4)。针对所分析的所有配制品，就病毒体直径大小而言(图4A)和就HA而言(图4B)，随着时间观察到无显著变化。总之，此数据表明实验配制品与对照配制品的良好可比性。

在一次冻融循环的前后，针对A/维多利亚衍生的病毒体测量了平均直径大小和HA浓度(图5)。对照组合物在确保此应激源后的稳定性(特别是就HA浓度而言)方面显然是次优的。针对所测试的所有实验配制品(除无糖的磷酸盐(pH 7.0)之外)，就平均大小而言，观察到了良好性能(图5A)：经动态光散射测量到病毒体直径大小没有显著变化。出乎意料地，针对包括单糖或二糖的所有实验配制品，就在冻融后HA浓度变化而言，观察到了优异的性能(图5B)。将A/维多利亚衍生的病毒体在5℃±3℃下储存12周，并且在t＝0和t＝4周时测量平均直径大小，并且在t＝0、t＝4和t＝12周时测量HA浓度(图6)。针对所分析的所有实验配制品(除无糖的磷酸盐(pH 7.0)之外)，就病毒体大小而言(图6A)和就HA浓度而言(图6B)，随着时间观察到无显著变化，显示出单糖或二糖对此缓冲液的增值。总之，此数据表明替代性配制品与对照配制品的良好可比性。

冻融实验(图1、3和5)显示，根据本发明的配制品令人惊讶地是非常适合来保护病毒体免受偶然冻结事件之害的，并且从而为病毒体提供更多的稳定性。

总之，这些稳定性研究(在5℃±3℃下12周)(其中测量了平均直径大小和HA浓度(图2、4和6))显示出实验配制品和对照配制品之间的良好可比性，该对照配制品是这样一种组合物，其许多年来已经被证明是稳健且有效的，并且目前仍在市场上用于保存病毒体。

结合如以上所描述获得的所有数据并且在统计分析后，已经明确地证实变量的特定组合为病毒体提供最佳稳定性。针对病毒体稳定性，被证明是最稳健的组合物是这样一种缓冲的组合物，该组合物包括pH 7.5的20mM Na₂HPO₄/KH₂PO₄并且进一步包括8％海藻糖。

实例2

实验设计和方法学。

在所测试的不同配制品中，通过测量随着温度的病毒体直径大小变化来获得温度曲线，用以鉴定当温度上升时聚集起始和整体大小变化。用Z-粒度仪ZS(马尔文)获得从35℃至75℃的温度渐变，并且每3℃直接在同一比色皿测量病毒体大小。

结果和结论。

在图7(A、B和C)中显示出温度依赖性曲线，该曲线指示出，在所测试的不同配制品中的病毒体聚集起始温度和整体大小变化。针对所分析的所有三种株，对照组合物对于确保在加速的温度应激后的热稳定性而言是次优的。事实上，针对所有株，在52℃和62℃之间的温度范围内，病毒体直径大小急剧增加(达到超过300nm)。针对B/布里斯班(图7B)，所测试的几乎所有的新配制品都提高了起始温度，并且包含海藻糖的组合物(pH 7.5)对高温下达到的最大尺寸具有正效应，即最大直径大小并未代替300nm。

针对A/加利福尼亚(图7A)和A/维多利亚(图7C)，起始温度的增加没那么明显，然而所测试的所有新配制品都出人意料地显示出在减小病毒体直径大小增加方面的清楚的正效应。

此实验的最终结果确认了在实例1中所获得的结果，表明用pH 7.5的20mMNa₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲的并且进一步包括8％海藻糖的组合物是增加病毒体稳定性的最有希望的组合。

实例3

实验设计和方法学。

在细胞培养的A/维多利亚衍生的病毒体上进行滴定曲线，测量随着盐浓度的病毒体大小变化，用以鉴定当盐浓度降低时的聚集起始和整体大小变化。在Z-粒度仪ZS(马尔文)中进行从130mM至33mM的盐(NaCl)浓度渐变，并且以降低的NaCl浓度在同一比色皿中测量病毒体大小十九次。

结果和结论。

在图8中显示出A/维多利亚病毒体的NaCl浓度依赖性曲线(该曲线指示出在某一NaCl浓度下病毒体聚集开始)和整体大小变化。

通过自动稀释包含pH 7.5的20mM Na₂HPO₄/KH₂PO₄和130mM NaCl的组合物，使NaCl浓度从130mM降至33mM。在低于65mM的NaCl浓度中，A/维多利亚病毒体直径大小急剧增加(达到超过300nm)。在添加8％海藻糖的类似实验中观察到了相同效应(数据未显示)。

此实验的最终结果显示出，针对细胞衍生的A/维多利亚株，需要最低浓度的65mMNaCl来保持病毒体大小在可接受范围(300mM)内，表明应当将65mM的最低NaCl浓度添加至最终组合物中以增加病毒体稳定性。

实例4

实验设计和方法学。

已经在对照配制品中制备了各自包括来自不同流感株的HA分子的三种不同流感衍生的病毒体制剂，并且在2个实验配制品(表2)中用“CogentμSCALE TFF系统”UF/DF仪器(密理博公司)进行重新缓冲。还将用相同系统重新缓冲对照组合物，以排除缓冲液更换作用。

表2.所使用的实验缓冲液的组成。

将洗脱物进行过滤灭菌(0.22μm)并且等分在玻璃小瓶(每小瓶3mL)中或者合并成三价产品，并且然后等分在玻璃小瓶中。所述三价产品(又简称为“三价体”)是三种不同病毒体的混合物，每种病毒体包含来自不同流感株的抗原。在本实验中，三价体包含三种不同病毒体，这些病毒体具有来自以下项之一的流感抗原：A/维多利亚株、B/布里斯班株或A/加利福尼亚株。

对照组合物是当前市售的

V组合物之一，该组合物被50mM KH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲至7.4的pH；并且该组合物包括浓度约82mM的NaCl。随后，小瓶经受1次冻融(F/T)循环或者在5℃±3℃下孵育用于稳定性研究(在一个月和三个月过程中)，这两者都模拟实时条件。将小瓶与其对应的对照一起以等分储存在5℃±3℃下，直到一式三份地进行样品分析。通过以下项分析样品：如以上所描述的，用于HA定量的单向辐射状免疫扩散(SRID)，以及用于病毒体颗粒直径测量的Z-粒度仪纳米(ZS)。

结果和结论。

在一次冻融循环的前后，针对细胞衍生的A/加利福尼亚病毒体测量了平均直径大小和HA浓度(图9)。在一次冻融循环后观察到，对照配制品就直径大小(图9A)和HA浓度(图9B)二者而言都是对病毒体稳定性有害的。

出乎意料地，针对所测试的实验配制品(缓冲液T和缓冲液S)，就平均直径大小而言观察到了优异的性能，并且当添加二糖时观察到了明确的增值(图9A)。事实上，在这些配制品中，通过动态光散射测量病毒体大小无显著变化。在冻融后，就HA浓度变化而言，针对所测试的实验配制品观察到了非常良好的稳定性曲线(图9B)。

将A/加利福尼亚细胞衍生的病毒体在5℃±3℃下储存12周，并且在t＝0、t＝4和t＝12周时测量平均直径大小和HA浓度(图10)。

针对所分析的所有配制品，就病毒体大小而言，随着时间观察到无显著变化(图10A)。针对所测试的对照组合物和实验配制品，观察到了HA浓度变化随着时间的相同趋势(图10B)。

在一次冻融循环的前后，针对B/布里斯班衍生的病毒体测量了平均直径大小和HA浓度(图11)。在一次冻融循环后观察到，对照配制品就直径大小(图11A)和HA浓度(图11B)二者而言都是对病毒体稳定性有害的。

出乎意料地，针对所测试的替代性配制品(缓冲液T和缓冲液S)，就平均大小(图11A)和HA浓度(图11B)二者而言都观察到了优异的性能：在冻融后，测量病毒体直径大小或HA浓度没有显著差异。当添加二糖时，观察到了在冻融后防止直径大小变化的明确增值。

将B/布里斯班衍生的病毒体在5℃±3℃下储存12周，并且在t＝0、t＝4和t＝12周时测量平均直径大小，并且在t＝0、t＝4和t＝12周时测量HA 浓度(图12)。针对所分析的所有配制品，就病毒体直径大小而言(图12A)和就HA而言(图12B)，随着时间观察到无显著变化。总之，此数据表明实验配制品与对照组合物的良好可比性(图12)。

在一次冻融循环的前后，针对A/维多利亚衍生的病毒体测量了平均直径大小和HA浓度(图13)。对照组合物在确保此应激源后的稳定性(特别是就大小变化而言)方面显然是次优的。针对所测试的两种实验配制品，就平均大小而言，观察到了良好性能(图13A)：经动态光散射测量到病毒体直径大小没有显著变化。出乎意料地，针对包括二糖的实验配制品(缓冲液T和S)，就在冻融后HA浓度变化而言，观察到了优异的性能(图13B)。

将A/维多利亚衍生的病毒体在5℃±3℃下储存12周，并且在t＝0、t＝4和t＝12周时测量平均直径大小和HA浓度(图14)。针对所分析的实验配制品，就病毒体大小而言(图14A)和就HA浓度而言(图14B)，随着时间观察到了无显著变化，显示出二糖对此缓冲液的增值。

在一次冻融循环的前后，针对病毒体的三价混合物测量了平均直径大小和HA浓度(图15)。对照组合物在确保此应激源后的稳定性(就HA浓度和大小二者而言)方面显然是次优的。针对所测试的两种实验配制品，就平均大小而言，观察到了良好性能(图15A)：经动态光散射测量到病毒体直径大小没有显著变化。出乎意料地，针对包括二糖的实验配制品，就在冻融后HA浓度变化而言，观察到了优异的性能(图15B、15C、15D)。

将三价病毒体在5℃±3℃下储存12周，并且在t＝0、t＝4和t＝12周时测量平均直径大小和HA浓度(图16)。针对所分析的实验配制品，就病毒体大小而言(图16A)和就HA浓度而言(图16B、16C和16D)，随着时间观察到了无显著变化，显示出二糖对此缓冲液的增值。

总之，此数据表明替代性配制品与对照配制品的良好可比性。冻融实验(图9、11、13和15)显示，根据本发明的配制品令人惊讶地是非常适合来保护病毒体免受意外冻结事件之害的，并且从而为病毒体提供更多的稳定性。

总之，这些稳定性研究(在5℃±3℃下12周)(其中测量平均直径大小和HA浓度(图10、12、14和16))显示出实验配制品和对照配制品之间的良好可比性，该对照配制品是这样一种组合物，其许多年来已经被证明是稳健且有效的，并且目前仍在市场上用于保存病毒体。

结合如以上所描述获得的所有数据并且在统计分析后，已经明确地证实变量的特定组合为病毒体提供最佳稳定性。针对病毒体稳定性，被证明是最稳健的组合物是这样一种缓冲的组合物，该组合物包括pH 7.5的20mM Na₂HPO₄/KH₂PO₄、75mM NaCl并且进一步包括4％海藻糖。

实例5

实验设计和方法学。

已经在对照配制品中制备了各自包括来自不同流感株的HA分子的三种不同流感衍生的病毒体制剂，并且在2个实验配制品(如在表1中所披露的)中用“CogentμSCALE TFF系统”UF/DF仪器(密理博公司)进行重新缓冲。还将用相同系统重新缓冲对照组合物，以排除缓冲液更换作用。

将洗脱物进行过滤灭菌(0.22μm)并且合并成三价产品并且然后等分在玻璃小瓶(每小瓶3mL)中。对照组合物是当前市售的

V组合物之一，该组合物被50mMKH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲至7.4的pH；并且该组合物包括浓度约82mM的NaCl。随后，将小瓶在<-65℃下孵育，用于稳定性研究(在12周期间)。将小瓶与其对应的对照一起以等分储存在<-65℃下，直到一式三份地进行样品分析。通过以下项分析样品：如以上在测定描述中所描述的，用于HA定量的单向辐射状免疫扩散(SRID)，以及用于病毒体颗粒直径测量的Z-粒度仪纳米(ZS)。

结果和结论。

将三价病毒体在<-65℃下储存12周，并且在t＝0和t＝12周时测量平均直径大小和HA浓度(图17)。

在所测试的新配制品中，就病毒体大小而言，随着时间观察到无显著变化(图17A)。所测试的新配制品能够在<-65℃下将病毒体稳定12周，同时针对对照样品(当前配制品)观察到病毒体大小的明显增加。

针对包含在三价组合物中的三种株的每者(图17B、17C和17D)，在<-65℃储存下，在t＝0和t＝12周时测量HA浓度。针对所测试的两种新配制品，与对照(当前配制品)相比，尤其是针对B/布里斯班和A/加利福尼亚观察到了明显的改进。在对照配制品中，在<-65℃下储存12周后这两种株的HA浓度急剧下降，然而如果在所测试的两种新配制品中配制这些病毒体，那么HA浓度将基本上保持恒定。

结合如以上所描述获得的数据并且在统计分析后，已经明确地证实变量的特定组合为病毒体在<-65℃下储存过程中提供最佳稳定性。针对在<-65℃下储存后的病毒体稳定性，被证明是最稳健的组合物是这样一种缓冲的组合物，该组合物包括pH 7.5的20mMNa₂HPO₄/KH₂PO₄、75mM NaCl并且进一步包括4％海藻糖。

参考文献

弗雷埃罗(Freixeiro)等人，“基于重组孔蛋白复合物，脂蛋白体作为对抗脑膜炎奈瑟菌的疫苗的运载体的稳定性研究(Study of the stability of proteoliposomes asvehicles for vaccines against Neisseria meningitidis based on recombinantporin complexes)”，国际药学杂志(Int J Pharm.)2013年2月25日；443(1-2):1-8.doi:10.1016/j.ijpharm.2012.12.046.电子版，2013年1月7日。

赫尔佐克(Herzog)等人，“Inflexal V-含有病毒体佐剂的流感疫苗的十一年(Eleven years of Inflexal V-a virosomal adjuvanted influenza vaccine)”，疫苗(Vaccine)，2009年7月16日；27(33):4381-7.doi:10.1016/j.vaccine.2009.05.029.电子版，2009年5月29日。

兴查(Hincha)等人，“在包含脂质体的叶绿体糖脂中海藻糖增加了冻融损伤(Trehalose Increases Freeze-Thaw Damage in Liposomes Containing ChloroplastGlycolipids)”，低温生物学(Cryobiology)1998年5月；36(3):245-9。

默尼耶(Meunier)F等人，“两性霉素B脂质体(AmBisome)：来自II/III期临床试验的安全性数据(Liposomal amphotericin B(AmBisome):safety data from a phase II/III clinical trial.)”，抗菌化学疗法杂志(J Antimicrob Chemother)，1991；28增刊B:83-91。

米什勒(Mishler)等人，“

V，一种三价病毒体亚单位流感疫苗：生产(

V a trivalent virosome subunit influenza vaccine:production)”，疫苗(Vaccine)20(2002)B17-B23。

思特曼(Stegmann)等人，“流感病毒包膜的功能重构(Functionalreconstitution of influenza virus envelopes)”，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J)，1987年9月；6(9):2651-9。

伍德(Wood)等人，“用于流感血球凝集素抗原的测定的改进的单向辐射状免疫扩散技术：用于失活的全病毒和亚单位疫苗的效力确定的应用(An improved single-radial-immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutininantigen:application for potency determinations of inactivated whole virus andsubunit vaccines)”，生物标准化杂志(J Biol Stand)，1977；5(3):237-47。

Claims (8)

1.一种液体组合物，包括：

a)病毒体；

b)KH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液，其中磷酸盐浓度的范围是在15mM和30mM之间；

c)NaCl盐，其中该盐浓度的范围是在65mM和85mM之间；

d)海藻糖，其中该海藻糖浓度的范围是在2％(w/w)和10％(w/w)之间，其中所述组合物具有范围在6.5和8之间的pH。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物具有范围在7和7.8之间的pH。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物具有7.5的pH；并且包括浓度范围在3％(w/w)和5％(w/w)之间的海藻糖。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述NaCl盐浓度的范围是在65mM和75mM之间。

5.一种保存病毒体的方法，该方法包括制备根据权利要求1-4中任一项所述的组合物。

6.根据权利要求5所述的保存病毒体的方法，该方法进一步包括在范围在2℃和8℃之间的温度下储存所述组合物。

7.根据权利要求5所述的保存病毒体的方法，该方法进一步包括在范围在-80℃和-65℃之间的温度下储存所述组合物。

8.根据权利要求5所述的保存病毒体的方法，该方法进一步包括在范围在-15℃和-30℃之间的温度下储存所述组合物。

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