JP6448682B2 - アルデヒドおよび対応するアルコールの微生物合成 - Google Patents

Description

本出願は、２０１１年３月１４日に提出された本発明者らの同時係属出願である米国仮特許出願第６１／４５２，５１９号明細書に対する優先権を主張するものである。本出願は、特願２０１３−５５８１２９号を原出願とする分割出願である。

本発明の分野は、後に単離されて対応するアルコールにｅｘ ｖｉｖｏで変換される１つ以上の化学物質、および特にアルデヒドを製造するための微生物の代謝制御技術である。

アルデヒドおよびその他のオキソ化学物質の世界生産量および消費量は、２００５年にはおよそ９６０万メートルトンであった。世界規模の設備稼働率は、高まる需要、生産量の増加および生産能力の合理化の結果、２００１年の７９％から２００５年の８４％へ増加した。２００１年から２００５年までに、アルデヒドや他のオキソ化学物質の世界生産能力は１．６％の平均年率で増加し、これは同一期間中に３．４％の平均年率で増加した世界消費量より低い。

最も一般的には、アルデヒドおよびその他のオキソ化学物質は、現在、原油分解から抽出された石油化学製品を使用する精油方法によって製造されている。例えば、Ｃ３−Ｃ１５アルデヒドは、合成ガスを用いたオレフィンのヒドロホルミル化によって生成され、そのように製造されたアルデヒドは、その後に対応するアルコール、酸、または他の誘導体に変換される。現在、需要が最も高いオキソ化学物質はｎ−ブチルアルデヒドであり、それに可塑剤アルコールのためのＣ６−Ｃ１３アルデヒドならびに洗剤アルコールのためのイソブチルアルデヒドおよびＣ１２−Ｃ１８アルデヒドが続く。

代謝制御微生物細胞を使用したバイオ燃料の微生物合成、および特にＣ２−Ｃ６アルコールの製造は、当該技術分野において周知である。例えば、炭水化物からの微生物エタノール製造については特許文献１（国際公開第９４／０６９２４号パンフレット）に記載されており、ＣＯ_２からのエタノール製造については特許文献２（米国特許第８，０４８，６６６号明細書）に報告されている。２−ケト酸からの代謝制御細胞（metabolically engineered cell）を用いた短鎖アルコールの製造は特許文献３（米国特許出願公開第２００９／００８１７４６号明細書）に記載されており、多数の刊行物（例、特許文献４（米国特許第７，８５１，１８８号明細書）および特許文献５（米国特許第７，９９３，８８９号明細書）、ならびに特許文献６（国際公開第２００９／０８６４２３号パンフレット）、特許文献７（国際公開第２００９／１４９２４０号パンフレット）、特許文献８（国際公開第２０１０／０６２５９７号パンフレット）、および特許文献９（国際公開第２０１０／０７５５０４号パンフレット））は代謝制御細胞からのイソブタノール製造に関するものであり、光合成活性生物を用いたＣＯ_２からのアルコール製造は特許文献１０（米国特許出願公開第２０１１／０２５０６６０明細書）に記載されている。同様の方法は、非特許文献１（Ｋｅｃｈｕｎ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．によってＰｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００８），１０５，ｎｏ．５２：２０６５３−２０６５８）にも記載されている。２−ケト酸からの代謝制御細胞を用いたＣ５−８アルコールの製造は特許文献１１（米国特許出願公開第２０１１／０２０１０８３号明細書）に記載されており、様々な炭素源からの脂肪アルデヒドの製造は特許文献１２（米国特許第８，０９７，４３９号明細書）に報告されている。本明細書で考察するこれらや他の全ての外部資料は、開示内容全体が参考として本明細書で援用される。組み込まれた参考文献における用語の定義もしくは使用が本明細書に提供したその用語の定義と矛盾する、もしくは相いれない場合は、本明細書に提供した当該用語の定義が適用され、参考文献に記載された当該用語の定義は適用されない。

残念なことに、多くのそのような方法を用いたアルコールの収率は、依然として相当低い。少なくとも所定のアルコールの収率を改良するために、内因性アルコールデヒドロゲナーゼを排除もしくは抑制することができ、および特許文献１３（国際公開第２００９／１４９２４０（Ａ１）号パンフレット）に記載された組み換えデヒドロゲナーゼと置換することができる。そのような修飾は少なくともある程度までは望ましいことが多いが、他の問題が発生する。例えば、様々なアルコールは閾値濃度を超えて該アルコールを生成する細胞にとっては毒性であり、これは全収率を制限する傾向がある。さらに、ほとんどの微生物合成されたアルコールは発酵培地と完全に混和性であり、単離するためにはかなりのエネルギーを消費する工程が必要である。さらに悪いことに、共沸混合物のための一部のアルコールは、培地から分離するのがいっそうより困難である。

国際公開第９４／０６９２４号パンフレット 米国特許第８，０４８，６６６号明細書 米国特許出願公開第２００９／００８１７４６号明細書 米国特許第７，８５１，１８８号明細書 米国特許第７，９９３，８８９号明細書 国際公開第２００９／０８６４２３号パンフレット 国際公開第２００９／１４９２４０号パンフレット 国際公開第２０１０／０６２５９７号パンフレット 国際公開第２０１０／０７５５０４号パンフレット 米国特許出願公開第２０１１／０２５０６６０明細書 米国特許出願公開第２０１１／０２０１０８３号明細書 米国特許第８，０９７，４３９号明細書 国際公開第２００９／１４９２４０（Ａ１）号パンフレット

Ｋｅｃｈｕｎ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．によってＰｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００８），１０５，ｎｏ．５２：２０６５３−２０６５８

そこで、アルデヒド、オキソ化学物質、および対応するアルコールを製造する数多くのシステムおよび方法は当該技術分野において公知であるが、幾つかの困難は依然として残っている。このため、特にそのような化学物質が微生物系を使用して製造される場合にはなお改良の必要がある。

本発明は、アルデヒドおよびアルコール化合物を混合合成プロセスを使用して製造するための装置および方法であって、代謝制御微生物細胞が炭素源を使用してアルデヒドを生成し、該アルデヒドが次に発酵培地から気相中に連続的もしくは半連続的に取り出される装置および方法に関する。特に好ましい態様では、該代謝制御微生物細胞は、アルコール生産を実質的に行わない。該アルデヒドは、次に気相から凝縮され、ｅｘ ｖｉｖｏで対応するアルコールに還元される。企図された方法は、有益にも様々な困難、特に生成物阻害および発酵培地からの該アルコールの分離に関連する様々な問題を克服する。

即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔２０〕に関するものである。
〔１〕代謝制御微生物細胞であって、 ピルビン酸デカルボキシラーゼ、又は、２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼをコードする組換え核酸、
前記ピルビン酸デカルボキシラーゼ、又は、２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼを、前記組換え核酸を有しない同じ細胞と比較して、ピルビン酸又は２−ケト酪酸のアルデヒドへの変換が増加するために有効な量で発現するために前記組換え核酸に操作可能に結合されたプロモータエレメント、
少なくとも１つのピルビン酸を酢酸に変換させる経路におけるノックアウト改変、及び、ａｄｈＥ又はｙｑｈＤの改変又は欠損、を有し、
ここで、前記改変又は欠損は、前記代謝制御微生物細胞においてアルコールデヒドロゲナーゼ活性を、前記改変又は欠損を有しない同じ細胞と比較して少なくとも７０％減少させるように減少する、微生物細胞。
〔２〕非特異的アルコールデヒドロゲナーゼの更なる改変又は更なる欠損を有する上記微生物細胞。
〔３〕前記非特異的アルコールデヒドロゲナーゼは、ｙｊｇＢによってコードされる上記微生物細胞。
〔４〕前記微生物細胞における減少した前記アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、前記改変又は欠損を有しない同じ細胞と比較して少なくとも９０％減少させる上記微生物細胞。
〔５〕前記組換え核酸は、プラスミドとして提供、又は、宿主細胞ゲノム内に統合される上記微生物細胞。
〔６〕前記組換え核酸は、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする上記微生物細胞。
〔７〕前記組換え核酸は、２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼをコードする上記微生物細胞。
〔８〕１以上のｌｅｕＡ、ｌｅｕＢ、ｌｅｕＣ、及び、ｌｅｕＤ遺伝子の発現に対する組換え核酸を更に有する上記微生物細胞。
〔９〕１以上のｉｌｖＧ、ｉｌｖＭ、ｉｌｖＣ、及び、ｉｌｖＤ遺伝子の発現に対する組換え核酸、又は、１以上のｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＣ、及び、ｉｌｖＤ遺伝子の発現に対する組換え核酸を更に有する上記微生物細胞。
〔１０〕１以上のａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、及び、ｉｌｖＤ遺伝子の発現に対する組換え核酸、又は、１以上のｉｌｖＩ、ｉｌｖＨ、ｉｌｖＣ、及び、ｉｌｖＤ遺伝子の発現に対する組換え核酸を更に有する上記微生物細胞。
〔１１〕エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）から成る群から選択される属に属する請求項１に記載の微生物細胞。
〔１２〕大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、およびサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から成る群から選択される種に属する上記微生物細胞。
〔１３〕グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン、セルロース、ヘミセルロース、グリセロール、二酸化炭素、タンパク質、およびアミノ酸から成る群から選択される炭素源を有する培地に置かれる上記微生物細胞。

〔１４〕上記微生物細胞を含む発酵培地であって、前記微生物細胞は、イソブタノール（ｇ／Ｌ）よりもイソブチルアルデヒドをより多く産生する、発酵培地。
〔１５〕イソブチルアルデヒドを、０．５ｇ／Ｌ〜４．０ｇ／Ｌの濃度で含む上記発酵培地。
〔１６〕グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン、セルロース、ヘミセルロース、グリセロール、二酸化炭素、タンパク質、およびアミノ酸から成る群から選択される炭素源を有する上記発酵培地。
〔１７〕前記発酵培地上の気相にイソブチルアルデヒドを置き換えるのに有効な量で未溶解性ガスを有する上記発酵培地。

〔１８〕アルコールを製造する方法であって、
発酵培地中で複数の微生物細胞を増殖する工程であって、前記細胞は改変を有しない同じ細胞と比較して増加した代謝活性を有するように遺伝子改変され、
前記代謝活性の増加は、組換えピルビン酸デカルボキシラーゼ又は２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼそれぞれの導入又は発現を介した、及び、ピルビン酸の酢酸へ変換する経路におけるノックアウト改変を介したピルビン酸又は２−ケト酪酸のアルデヒドへの変換の増加を特徴とし、
前記複数の微生物細胞が減少したアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するように更に遺伝子改変される工程であって、前記アルコールデヒドロゲナーゼ活性は更なる改変を有しない同じ細胞と比較して少なくとも７０％減少され、そして、前記減少したアルコールデヒドロゲナーゼ活性は、ａｄｈＥ又はｙｑｈＤの欠損、及び、任意に非特異的アルコールデヒドロゲナーゼ活性の欠損によるものであり、
前記アルデヒドを前記発酵培地から気相内へ連続的もしくは半連続的に移動させる工程、
前記アルデヒドを前記気相から凝縮させる工程、および
前記凝縮させたアルデヒドを対応するアルコールに還元させる工程、を含む方法。
〔１９〕前記微生物細胞は、
（ｉ）組み換え２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼの発現を介した２−ケト吉草酸、２−ケトカプロン酸、２−ケトヘプタン酸、２−ケトオクタノン酸、２−ケト−３−メチル吉草酸、２−ケト−４−メチルカプロン酸、２−ケト−５−メチルヘプタン酸、２−ケト−６−メチルオクタノン酸、２−ケト−イソ吉草酸、２−ケトイソカプロン酸、及び、２−ケト−５−メチルヘキサン酸の内の１つ以上の脱カルボキシル化
（ｉｉ）１以上のｉｌｖＧ、ｉｌｖＭ、ｉｌｖＣ、及び、ｉｌｖＤ遺伝子をコードする組換え核酸の発現を介した、又は、１以上のｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＣ、及び、ｉｌｖＤ遺伝子をコードする組換え核酸の発現を介した２−ケト酪酸から２−ケト−３−メチル吉草酸への分岐炭素鎖延長、
（ｉｉｉ）１以上のａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、及び、ｉｌｖＤ遺伝子をコードする組換え核酸の発現を介した、又は、１以上のｉｌｖＩ、ｉｌｖＨ、ｉｌｖＣ、及び、ｉｌｖＤ遺伝子をコードする組換え核酸の発現を介したピルビン酸から２−ケト−イソ吉草酸への分岐炭素鎖延長、又は、
（ｉｖ）１以上のｌｅｕＡ、ｌｅｕＢ、ｌｅｕＣ、及びｌｅｕＤ遺伝子をコードする組換え核酸の発現を介した直鎖炭素鎖延長、におけて増加した代謝活性を有する上記方法。
〔２０〕前記微生物細胞が、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）から成る群から選択される属に属する上記方法。

本発明の主題の一態様では、アルコールを製造する方法は、複数の微生物細胞を発酵培地（好ましくは、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン、セルロース、ヘミセルロース、グリセロール、二酸化炭素、タンパク質、脂質、および／またはアミノ酸を炭素源として有する）中で増殖させる工程であって、該細胞は非遺伝子改変細胞と比較して増加した代謝活性を有するように遺伝子改変される工程を含む。代謝活性の増加が、ピルビン酸もしくは２−ケト酪酸からアルデヒドへの変換の増加およびアルコールデヒドロゲナーゼ活性の減少であるのが特に好ましい。該細胞によって生成されるアルデヒドは、発酵培地から気相内へ連続的もしくは半連続的に取り出される。また別の工程では、アルデヒドは気相から凝縮（condense）され、さらにまた別の工程では、凝縮されたアルデヒドは対応するアルコールに還元される。

いくつかの実施形態では、代謝活性の増加は組み換えピルビン酸デカルボキシラーゼによるピルビン酸からアセトアルデヒドへの変換の増加であるが、他の実施形態での代謝活性の増加は、組み換え２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼによる２−ケト酪酸からプロパナールへの変換の増加である。加えて、またはそれに代えて、微生物細胞が、組み換え２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼによる２−ケト吉草酸、２−ケトカプロン酸、２−ケトヘプタン酸、２−ケトオクタノン酸、２−ケト−３−メチル吉草酸、２−ケト−４−メチルカプロン酸、２−ケト−５−メチルヘプタン酸、２−ケト−６−メチルオクタノン酸、２−ケト−イソ吉草酸、２−ケトイソカプロン酸、２−ケト−５−メチルヘキサン酸、もしくは２−ケト−６−メチルオクタノン酸の内の１つ以上の脱カルボキシル化における代謝活性の増加をさらに有することが好ましい。そこで、特に好ましい発酵産物には、アセトアルデヒド、プロパナール、ブタナール、および２−メチル−１−プロパナールが含まれる。

さらにまた別の企図された態様では、該微生物細胞は、２−ケト酪酸から２−ケト−３−メチル吉草酸への組み換えｉｌｖＧＭＣＤ遺伝子もしくは組み換えｉｌｖＢＮＣＤ遺伝子による分岐炭素鎖延長における代謝活性の増加、および／またはピルビン酸から２−ケト−イソ吉草酸への組み換えａｌｓＳ−ｉｌｖＣＤ遺伝子もしくは組み換えｉｌｖＩＨＣＤ遺伝子による分岐炭素鎖延長における増加した代謝活性を有する。該微生物細胞が組み換えｌｅｕＡＢＣＤ遺伝子による直鎖炭素鎖延長における代謝活性の増加をさらに有するのがさらにいっそう特に好ましい。

本発明の主題を限定する訳ではないが、微生物細胞中のアルコールデヒドロゲナーゼ活性の減少が非遺伝子改変細胞に比較して少なくとも７０％およびより典型的には少なくとも９０％減少するのが概して好ましい。

特に好ましい方法では、アルデヒドを気相内に移動させる工程は、発酵培地の撹拌、不活性ガスを用いた発酵培地の剥ぎ取り、酸素含有ガスを用いた発酵培地の剥ぎ取り、および／または該アルデヒドの結合剤への一時的結合を含む。最も典型的には、アルデヒドは、発酵培地から連続的に取り出される。このように単離されたアルデヒドは、次に対応するアルコールに、例えば、電気化学的還元、酵素的還元、および／または水素を用いた触媒による還元を用いて還元される。

適切な微生物細胞は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属から選択されよう。そこで、特に好ましい微生物細胞には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、およびサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が含まれる。

このため、および異なる観点から考えると、価値生産物（例、アルコール）がアルデヒドからｅｘ ｖｉｖｏで生成される製造プロセスにおいて使用するための代謝制御微生物細胞を製造する方法は、該微生物細胞がピルビン酸もしくは２−ケト酪酸からアルデヒドへの変換の増加を有するように遺伝子改変する工程、および該微生物細胞が実質的にアルコールを生成しないように該微生物細胞がアルコールデヒドロゲナーゼ活性の減少を有するように遺伝子改変する追加の工程を含む。さらにまた別の工程では、組み換え微生物細胞は、それによりアルデヒドから価値生産物へのｅｘ ｖｉｖｏ変換（例、アルデヒドの対応するアルコールへの還元）を可能にするよう、揮発性アルデヒドを発酵培地から剥ぎ取ることができる十分な量での該発酵培地中での該揮発性アルデヒドの生成について試験される。

特に好ましい態様では、該微生物細胞は、組み換えピルビン酸デカルボキシラーゼによるピルビン酸からアセトアルデヒドへの変換における代謝活性の増加、または組み換え２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼによる２−ケト酪酸からプロパナールへの変換における増加した代謝活性を有する。加えて、またはそれに代えて、該微生物細胞は組み換えｌｅｕＡＢＣＤ遺伝子による直鎖炭素鎖延長における代謝活性の増加、および／または組み換えｉｌｖＧＭＣＤ遺伝子もしくは組み換えｉｌｖＢＮＣＤ遺伝子による２−ケト酪酸から２−ケト−３−メチル吉草酸への分岐炭素鎖延長における、または組み換えａｌｓＳ−ｉｌｖＣＤ遺伝子もしくは組み換えｉｌｖＩＨＣＤ遺伝子によるピルビン酸から２−ケト−イソ吉草酸への分岐炭素鎖延長における増加した代謝活性を有する。

本発明の主題の様々な目的、特徴、態様および利点は、その中で同様の数字が同様の構成要素を表す添付の図面とともに、以下の好ましい実施形態についての詳細な説明からより明白になる。

（Ａ）直鎖アルデヒドを生成する代謝経路についての典型的な略図であり、（Ｂ）分岐鎖アルデヒドを生成する代謝経路についての典型的な略図である。

本発明者らは、微生物細胞を、対応するアルコールへ代謝されない、もしくはほんのわずかな程度にしかそれ以上代謝されない様々な（特に揮発性の）アルデヒドの生成を実質的に増加させるように代謝制御可能なことを見いだした。そのようなアプローチは、アルデヒドは対応するアルコールよりも典型的には有意に毒性であるため、および該アルデヒドは内因性アルコールデヒドロゲナーゼの抑制に起因していっそうより迅速に生成（および細胞内で潜在的に蓄積）されるため、特に予想外である。このように生成されたアルデヒドは次に発酵培地から気相内へ、好ましくは培地を連続法もしくは半連続法（つまり、少なくとも２つの取り出し期間を使用して発酵プロセスを通して間欠法）でストリッピングガスを用いて該培地を剥ぎ取ることによって取り出される。

本発明の主題の特に好ましい態様では、該微生物細胞は、ピルビン酸もしくは２−ケト酪酸からアルデヒドへの変換の増加、およびアルコールデヒドロゲナーゼ活性の減少を有するように遺伝子改変されている。ピルビン酸もしくは２−ケト酪酸からアルデヒドへの変換の増加は、最も典型的にはピルビン酸もしくは２−ケト酪酸からアルデヒドへの変換における反応を触媒する酵素の形成をもたらす１つ以上の遺伝子をコードする１つ以上の（例、プラスミドとして提供される、および／または宿主細胞ゲノム内に統合される）核酸構築物の存在に起因する。そこで、ほとんどの場合、変換の増加は所望のアルデヒド最終生産物をもたらす、細胞内の一連の生化学的反応を経由する代謝産物のより高いスループットに起因する。なお、当然ながら、１つ以上の内因性（非組み換え）酵素が該細胞内の該一連の生化学的反応の一部であってよい。

図１Ａは、細胞内での直鎖アルデヒドの生成を増加させるための１組の典型的な代謝制御経路を示している。この場合、アセトアルデヒドはピルビン酸から酵素ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）によって形成され、プロパナールは２−ケト酪酸（２−ＫＢ）から酵素２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ｋｉｖＤ）によって形成される。ブタナール、ペンタナール、ヘキサナール、ヘプタナールなどを含む長鎖生成物に到達するためには、代謝制御経路は、２−イソプロピルマレートシンターゼ（ｌｅｕＡ）、３−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ（ｌｅｕＢ）、３−イソプロピルマレートイソメラーゼ大サブユニット（ｌｅｕＣ）、および３−イソプロピルマレートイソメラーゼ小サブユニット（ｌｅｕＤ）をコードする遺伝子をさらに含むことができる。最も好ましくは、これらの遺伝子は、細胞内で発現するため、適切な制御下でオペロン内に配列されている。そこで、ｌｅｕＡＢＣＤおよびｋｉｖＤを発現するように組み換えられた細胞は、２−ＫＢから２−ケト吉草酸（２−ＫＶ）、２−ケトカプロン酸（２−ＫＣ）、２−ケトヘプタン酸（２−ＫＨ）、および２−ケトオクタノン酸（２−ＫＯ）への連続的鎖延長および最終脱カルボキシル化を通して描出されたように、２−ケト酪酸からブタナール、ペンタナール、ヘキサナール、ヘプタナールなどの生成に適している。

図１Ｂは、細胞内での分岐鎖アルデヒドの生成を増加させるためのまた別の１組の典型的な代謝制御経路を示している。このとき、２−ＫＢは、アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ（ｉｌｖＧ）の大サブユニット、アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ（ｉｌｖＭ）の小サブユニット、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ｉｌｖＣ）、およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｉｌｖＤ）またはアセトヒドロキシ酸シンターゼＩ（ｉｌｖＢ）の大サブユニット、アセトヒドロキシ酸シンターゼＩ（ｉｌｖＮ）の小サブユニット、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ｉｌｖＣ）、およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｉｌｖＤ）の遺伝子産物の作用によって２−Ｋｅｔ−３−メチル吉草酸（２−Ｋ−３−ＭＶ）に対して分岐される。２−Ｋ−３−ＭＶは、次にｋｉｖＤによって脱カルボキシル化されて２−メチル−１−ブタナールを形成することができる、または各々３−メチル−１−ペンタナールおよび４−メチル−１−ヘキサナール（およびより長鎖の分岐鎖生成物）を形成するためのｋｉｖＤによる脱カルボキシル化の前にｌｅｕＡＢＣＤによってコードされたタンパク質によって２−ケト−４−メチルヘキサン酸（２−Ｋ−４ＭＨ）もしくは２−ケト−５−メチルヘプタン酸（２−Ｋ−５ＭＨｐ）へ連続的に延長させることができる。出発材料がピルビン酸である場合、該ピルビン酸は最初に、２−ケトイソ吉草酸（２−ＫＩＶ）を形成するために、好ましくは機能的発現カセットａｌｓＳ−ｉｌｖＣＤ内に配列されたアセトラクテートシンターゼ（ａｌｓＳ）、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ｉｌｖＣ）、およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｉｌｖＤ）遺伝子の発現産物、またはアセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩＩ（ｉｌｖＩ）の大サブユニット、アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩＩ（ｉｌｖＨ）の小サブユニット、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ｉｌｖＣ）、およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｉｌｖＤ）遺伝子の発現産物によって最初に分岐される。２−ＫＩＶの脱カルボキシル化は２−メチル−１−プロパナールを産生するが、他方ｌｅｕＡＢＣＤの発現産物による鎖延長は２−ケトイソカプロン酸（２−ＫＩＣ）および２−ケト−５−メチルヘキサン酸（２−Ｋ−５Ｍｈｘ）ならびにより高次の産物を産生する。前述と同様、２−ＫＩＣおよび２−Ｋ−５Ｍｈｘは次に対応する３−メチル−１−ブタナールおよび４−メチル−１−ペンタナール、およびより高次の産物へ脱カルボキシル化される。

このため、本発明の主題の特に好ましい態様では、本明細書で企図された微生物細胞は、組み換えｉｌｖＧＭＣＤ遺伝子の発現もしくは組み換えｉｌｖＢＮＣＤ遺伝子の発現による２−ケト酪酸から２−ケト−３−メチル吉草酸への分岐炭素鎖延長における代謝活性の増加、および／または組み換えａｌｓＳ−ｉｌｖＣＤ遺伝子の発現もしくは組み換えｉｌｖＩＨＣＤ遺伝子の発現によるピルビン酸から２−ケト−イソ吉草酸への分岐炭素鎖延長における増加した代謝活性を有する。

いっそうさらに好ましい態様では、企図された細胞は、組み換え２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（好ましくはｋｉｖＤ）の発現による２−ケト−吉草酸、２−ケトカプロン酸、２−ケトヘプタン酸、２−ケトオクタノン酸、２−ケト−３−メチル吉草酸、２−ケト−４−メチルカプロン酸、２−ケト−５−メチルヘプタン酸、２−ケト−６−メチルオクタノン酸、２−ケト−イソ吉草酸、２−ケトイソカプロン酸、２−ケト−５−メチルヘキサン酸、もしくは２−ケト−６−メチルオクタノン酸の１つ以上の脱カルボキシル化における代謝活性の増加、および／または組み換え吉草酸デカルボキシラーゼの発現によるピルビン酸からアセトアルデヒドへの変換における代謝活性の増加、および／または組み換え２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼの発現による２−ケト酪酸からプロパナールへの変換における代謝活性の増加をさらに有する。特に好ましい態様では、細胞は、組み換えｌｅｕＡＢＣＤ遺伝子の発現による直鎖炭素鎖延長における増加した代謝活性を有するようにさらに遺伝子改変される。

なお、当然ながら、該遺伝子の全部が改変されてなくてよい、または所望の選択性、代謝回転率の上昇などを付与するために遺伝子は改変されてよい（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００８），１０５，ｎｏ．５２：２０６５３−２０６５８、国際公開第２００９／１４９２４０（Ａ１）号パンフレットを参照されたい）。代謝制御細胞の活性に適した遺伝子は当該技術分野において周知であり、本明細書に提示した教示と結び付けたそれら細胞全部の使用は適切であると見なされる。さらに、代謝制御細胞を作成する公知の方法の全ては、さらにまた本明細書で使用するのに適していると見なされる。例えば、代謝制御細胞は、当該技術分野において周知であるように、１つ以上の遺伝子、オペロンのゲノム挿入、またはプラスミドもしくはファージミドを用いたトランスフェクションによって組み換えることができる。いくつかの実施形態では、突然変異微生物も、本発明の方法において使用することができ、および必要に応じてさらに組み換え技術により組み換えることができる。

また別の特に好ましい態様では、内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、少なくとも減少させられ、より好ましくは抑制される。なお、好ましい態様では、全部もしくはほぼ全部のアルコールデヒドロゲナーゼが抑制もしくは除去される。例えば、抑制もしくは除去されたデヒドロゲナーゼには、ａｄｈＥ、ＩｄｈＡ、ｆｒｄＢ、およびｐｆｌＢが含まれる。なお、デヒドロゲナーゼ活性は、（例えば、アンチセンスＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡを介しての）ダウンレギュレーションまたはデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の崩壊、ノックダウンもしくはノックアウト突然変異の導入などを含む多数の周知の方法において抑制もしくは抑制して除去することができる。結果として、企図された遺伝子改変細胞は、変異もしくはさもなければ抑制された２つ以上のデヒドロゲナーゼを有する。

異なる観点から眺めると、このため該遺伝子改変細胞は任意の有意な量の短鎖（Ｃ６までの、直鎖もしくは分岐鎖）アルコールを生成しないことが企図されている。例えば、そのような組み換え細胞は、最も典型的には、対応するアルコールに対するアルデヒド（例えば、ブチルアルデヒド対ブタノール）のモル比で少なくとも３：１、より典型的には少なくとも４：１、および最も典型的には少なくとも５：１で、のアルデヒドで、対応するアルコールに比べて有意に多量のアルデヒドを発酵培地中へ放出する。結果、該発酵培地中の全短鎖（Ｃ６までの、直鎖もしくは分岐鎖）アルコールは、該発酵培地の１ｗｔ％（重量％）未満、より典型的には０．５ｗｔ％未満、最も典型的には０．１ｗｔ％未満となる。そこで、特に好ましい態様では、組み換え細胞は、検出可能なアルコールを生成しない（つまり、１０ｍｇ／Ｌ（発酵培地）未満）。

該組み換え微生物は、細菌、シアノバクテリア（青緑色細菌）、または真菌を含む任意の適切な微生物であってよい。しかし、非光合成活性微生物が特に好ましい。このため、いくつかの実施形態では、該微生物細胞は、エシェリキア、バシラス、コリネバクテリウム、ラルストニア、ザイモモナス、クロストリジウム、ラクトバシラス、シネココッカス、シネコシスティス、サッカロミセス、ピチア、カンジダ、ハンセヌラ、およびアスペルギルスから成る群から選択される属に属する。好ましい実施形態では、該微生物は、大腸菌、枯草菌、シネココッカス・エロンガタス、ラルストニア・ユートロファ、およびサッカロミセス・セレビジエから成る。

培養条件は、典型的には微生物の特定の選択に左右され、当業者であれば適切な培地を容易に選択することができる。他の適切な選択肢のうち、培地中の炭素源が糖、および特にグルコース、フルクトース、スクロース、デンプン、セルロース、ヘミセルロース、グリセロール、二酸化炭素、タンパク質、および／またはアミノ酸であることが一般に好ましい。しかし、数多くの代替炭素源も適切であると見なされており、典型的なまた別の炭素源には、脂質、タンパク質、ＣＯ_２、ＣＨ_４、複合有機混合物（例、バイオソリッド、食肉加工廃棄物、植物をベースとする原料）が含まれる。特定の培養条件とは無関係に、揮発性アルデヒドは該発酵培地から気相内に取り出される。より好ましくは、そのような取り出しは、細胞培養中に連続様式で実施され、取り出しは、該発酵培地の撹拌（agitation）、不活性ガスを用いた該発酵培地の剥ぎ取り、酸素含有ガスを用いた該発酵培地の剥ぎ取り、および／または該アルデヒドの結合剤への一時的結合に基づいてよい。または、アルデヒドの取り出しは、発酵後に、または半連続様式で（例えば、ストリッピングガスとの間接的接触によって）実施することもできる。

なお、その後のプロセッシングに関して、アルデヒドの凝縮は様々な様式で、好ましくは当該技術分野において周知の凝縮装置を使用して実施することができ、およびそのように凝縮させたアルデヒド生成物は従来方法を使用する１つ以上の工程においてさらに精製することができ、または対応するアルコールを生成するための還元反応において直接的に使用することができる。当該技術分野においてアルデヒドについては数多くの還元反応が公知であり、それらの全部が本明細書で使用するのに適していると見なされる。例えば、特に適した還元反応には、電気化学的還元、酵素的還元、および水素を用いた触媒還元が含まれる。

なお、このため、アルコール製造プロセスにおいて使用するための代謝制御微生物細胞を製造する方法は、ピルビン酸もしくは２−ケト酪酸からアルデヒドへの変換の増加を有するように該微生物細胞を遺伝子改変する工程、該微生物細胞が実質的にアルコール生成を行わないようにアルコールデヒドロゲナーゼ活性の減少を有するように該微生物細胞を遺伝子改変する工程、およびそれにより該アルデヒドから対応するアルコールへのｅｘ ｖｉｖｏ還元を可能にするよう、発酵培地から揮発性アルデヒドを剥ぎ取ることができる十分な量での該発酵培地中での該揮発性アルデヒドの生成について該組み換え微生物細胞を試験する工程を含む。

所望であれば、本明細書に提示した細胞をアルコールの製造に使用する必要はないが、様々なアルデヒド、および特に揮発性アルデヒドの生成に使用する必要はあることもまた企図されている。そのような場合、該細胞は上述したように遺伝子改変され、該アルデヒドの製造に適した条件下で培養される。最も典型的には、このように製造されたアルデヒドは、次に培養培地から剥ぎ取られ、販売、またはその後の使用もしくは貯蔵のために凝縮される。

なお、企図された方法、細胞およびプロセスは、該所望の化合物の前駆体がアルデヒドである場合にそのアルコール以外の所望の化合物の製造を有益にも可能にする。例えば、該遺伝子改変細胞の発酵産物がアセトアルデヒドである場合、アセトアルデヒドからｅｘ ｖｉｖｏで調製される特に好ましい生成物は、エタノールおよび酢酸である。同様に、該遺伝子改変細胞の発酵産物がプロピオンアルデヒドである場合、プロピオンアルデヒドからｅｘ ｖｉｖｏで調製される特に好ましい生成物には、ｎ−プロパノール、ｎ−プロピル酢酸、プロピオン酸、およびプロピオン酸酢酸セルロースが含まれる。同様に、該遺伝子改変細胞の発酵産物がｎ−ブチルアルデヒドである場合、ｎ−ブチルアルデヒドからｅｘ ｖｉｖｏで調製される特に好ましい生成物には、ｎ−ブタノール、２−エチルヘキサノール、ポリビニルブチラール、２−エチルヘキサン酸、メチルアミルケトン、ｎ−酪酸、ｎ−ブチル酢酸、ｎ−ブチルアクリル酸、および酢酸酪酸セルロースが含まれる。該遺伝子改変細胞の発酵産物がイソブチルアルデヒドである場合、イソブチルアルデヒドからｅｘ ｖｉｖｏで調製される特に好ましい生成物には、イソブタノール、イソ酪酸、ネオペンチルグリコール、メチルイソアミルケトン、イソブチル酢酸、イソブチルアクリル酸、２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオール、２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオール、モノイソブチレート、２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオールジイソ酪酸、およびイソ酪酸イソブチルが含まれる。

ＤＮＡ操作：実施例においてＳａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．によるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載された、当業者には周知の標準組み換えＤＮＡテクノロジーを使用した。

遺伝子ノックアウト：全遺伝子ノックアウトは、Ｐ１形質導入を用いて、適切なＫｅｉｏ収集菌株を使用して達成した（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｉｎ−ｆｒａｍｅ， ｓｉｎｇｌｅ−ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｕｔａｎｔｓ：ｔｈｅ Ｋｅｉｏ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．２：２００６．０００８（２００６））。カナマイシン耐性遺伝子は、各連続ノックアウト間においてｐＣＰ２０（Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：６６４０−６６４５（２０００））を使用して排除した。

発酵：大腸菌株は３７℃にて適切な抗生物質を含むＬＢ中で一晩培養した。翌日、一晩培養細胞は、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、４０ｇ／Ｌのグルコース、および適切な抗生物質とともに１０〜２０ｍＬのＭ９培地（水１Ｌ当たり６４ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１５ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、２．５ｇのＮａＣｌ、５ｇのＮＨ_４Ｃｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ_４、０．１ｍＭのＣａＣｌ_２、１０ｍｇのチアミン）を含有する２５０ｍＬのネジ蓋付きフラスコ内で二次培養（通例は１：１００）した。これらの培養を次に３７℃にてロータリーシェーカー（２５０ｒｐｍ）内でインキュベートした。イソブチルアルデヒドの損失を減らすために、培養液はサンプリング前に３０分かけて４℃へ冷却した。

ＧＣ分析：イソブチルアルデヒドおよびイソブタノールは、ＦＩＤ（フレームイオン化検出器）を装備したガスクロマトグラフィ（ＧＣ）によって定量した。本システムは、７８９０Ａ型ＧＣおよび７６９３型自動噴射器（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）から構成された。内径０．３２ｍｍ、０．２５μｍを備える３０ｍのＤＢ−ＦＦＡＰキャピラリーカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用した。ＧＣオーブン温度を３分間８５℃で保持し、２２５℃まで４５℃／分の勾配で上昇させ、３分間保持した。検出器および入口温度を２２５℃で保持した。水素、空気およびヘリウムガスは、各々４０ｍＬ／分、４５０ｍＬ／分、４５ｍＬ／分の流量で使用した。培養ブロスの上清は、内部標準物質としての１−ペンタノールを使用して分割噴射モード（スプリット比、１：２５）で噴射した。

イソブチルアルデヒド生成のためのプラスミドの構築：ｐＥＢ１２１：プラスミドｐＥＢ０１２１は、４つのフラグメントのＤＮＡアッセンブリによって構築した。ＰＬｌａｃＯ１プロモーター、ｐ１５Ａ複製起源、およびカナマイシン耐性のための遺伝子を含有する第１フラグメントは、ｐＺＥ２１−ＭＣＳ１の誘導体からプライマー１および２を用いて増幅させた（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ｔｉｇｈｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｕｎｉｔｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｖｉａ ｔｈｅ ＬａｃＲ／Ｏ，ｔｈｅ ＴｅｔＲ／Ｏ ａｎｄ ＡｒａＣ／Ｉ１−Ｉ２ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：１２０３−１０（１９９７））。このｐＺＥ２１−ＭＣＳ１誘導体では、ＰＬｔｅｔＯ１は、ＡａｔＩおよびＡｃｃ６５Ｉ制限部位を使用してｐＺＥ１２−ｌｕｃ（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ｔｉｇｈｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｕｎｉｔｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｖｉａ ｔｈｅ ＬａｃＲ／Ｏ，ｔｈｅ ＴｅｔＲ／Ｏ ａｎｄ ＡｒａＣ／Ｉ１−Ｉ２ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：１２０３−１０（１９９７））とのプロモーター交換の結果としてＰＬｌａｃＯ１と置換される。第２のフラグメントは、鋳型としての枯草菌ゲノムＤＮＡ由来のプライマー３および４を用いて増幅させた。第３のフラグメントは、鋳型として、大腸菌ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ １０７８９Ｄ−５）由来のプライマー５および６を用いて増幅させたｉｌｖＣを含有していた。ｉｌｖＤを含有する第４のフラグメントは、鋳型として、大腸菌ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ １０７８９Ｄ−５）由来のプライマー７および８を用いて増幅させた。

プライマー１：５’−ＡＣＧＣＧＴＧＣＴＡＧＡＧＧＣＡＴＣＡＡＡ−３’；プライマー２：５’−ＴＧＴＡＣＣＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣＧＧＴＣＡＧＴＧＣＧ−３’；プライマー３：５’−ＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＧＧＴＡＣＡＡＴＧＴＴＧＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡ−３’；プライマー４：５’−ＣＡＴＧＧＴＧＡＴＴＣＣＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＡＧＡＧＡＧＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＡ−３’；プライマー５：５’−ＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＡＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＴＴＣＡＡＴＡＣ−３’；プライマー６：５’−ＡＴＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＣＧＧＧＴＴＡＡＣＣＣＧＣＡＡＣＡＧＣＡＡＴＡＣ−３’；プライマー７：５’−ＣＣＣＧＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＣＣＴＡＡＧＴＡＣＣＧＴＴＣＣＧＣ−３’；プライマー８：５’−ＴＴＧＡＴＧＣＣＴＣＴＡＧＣＡＣＧＣＧＴＴＴＡＡＣＣＣＣＣＣＡＧＴＴＴＣＧＡＴＴ−３’。

ｐＥＢ５：プラスミドｐＥＢ０００５は、２つのフラグメントのＤＮＡアッセンブリによって構築した。該ベクターは、プライマー９および１０を用いて、ｐＺＥ１２−ｌｕｃの増幅によって増幅させた（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ｔｉｇｈｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｕｎｉｔｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｖｉａ ｔｈｅ ＬａｃＲ／Ｏ，ｔｈｅ ＴｅｔＲ／Ｏ ａｎｄ ＡｒａＣ／Ｉ１−Ｉ２ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：１２０３−１０（１９９７））。ｋｉｖｄ遺伝子は、プライマー１１および１２を用いて、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ゲノムＤＮＡから増幅させた。

プライマー９：５’−ＴＣＴＡＧＡＧＧＣＡＴＣＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＧ−３’；プライマー１０：５’−ＧＧＴＡＣＣＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣ−３’；プライマー１１：５’−ＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＧＧＴＡＣＣＡＴＧＴＡＴＡＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＴＴＡ−３’；プライマー１２：５’−ＴＴＴＴＡＴＴＴＧＡＴＧＣＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＴＴＴＡＴＴＴＴＧＴＴＣＡＧＣＡ−３’

イソブチルアルデヒド生成宿主菌株の構築：大腸菌ＢＷ２５１１３（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｒｎｅｒ ２０００）は、野生型として使用した。ＩＰＴＧ誘導を排除するために、ｌａｃＩ遺伝子を最初にノックアウトした。次に、イソブチルアルデヒド生成のために、主要アルコールデヒドロゲナーゼを連続的にノックアウトして、プラットフォーム菌株ＥＢ４（大腸菌ＢＷ２５１１３ΔｌａｃＩΔａｄｈＥΔｙｑｈＤΔｙｉａＹ）を構築した。アルコールデヒドロゲナーゼの排除は、表１に示したようにイソブタノールへの変換をブロックすることによってイソブチルアルデヒド生成を増強することができた（全菌株が２種のプラスミド、ｐＥＢ５およびｐＥＢ１２１を有している）。

残留アルコールデヒドロゲナーゼ活性の排除はイソブチルアルデヒド生成を増強した：微生物は、多数の非特異的アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有している。特に大腸菌内では、１００種を超えるアルコールデヒドロゲナーゼが酵素データベースを検索することによって見いだされた。ＥＢ４菌株からのそれらの非特異的アルコールデヒドロゲナーゼの排除は、イソブタノールへの変換を防止することによってイソブチルアルデヒドを生成するのに有益である。この実施例では、本発明者らは、この仮説を調査するため候補アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ｙｊｇＢをさらに排除した。表２に示したように、残留アルコールデヒドロゲナーゼ活性のさらなる排除は、イソブチルアルデヒド生成に有益であった。

イソブチルアルデヒド生成を増強するための競合代謝経路のためのノックアウト：イソブチルアルデヒド生成のための代謝経路は、ピルビン酸および２−ケトイソ吉草酸を含む重要な中間体を利用するために数種の競合経路を有している。それらの競合経路遺伝子をノックアウトすることによって、本発明者らのイソブチルアルデヒド生成経路に向かう代謝炭素流動を増強することができた。これを行うために、ピルビン酸を酢酸に変換させるｐｏｘＢおよび２−ケトイソ吉草酸をＬ−バリンに変換させるｉｌｖＥを選択した。表３に示したように、イソブチルアルデヒド生成をわずかに増強させることが見いだされた。しかし、これらの競合経路ノックアウトの結合により、イソブチルアルデヒド生成に及ぼす作用は、表４に示したように有意であった。

当業者には、本明細書に記載の本発明の概念から逸脱せずに、既に説明した修飾以外のはるかに多くの修飾が、可能であることは明白である。本発明の主題は、このため、添付の特許請求項の精神に記載したことを除いて制限されるべきではない。さらに、明細書および請求項を解釈する際、全ての用語は、状況に一致する最も広範囲の可能な方法で解釈すべきである。詳細には、用語「含む」および「含んでいる」は、言及された要素、成分もしくは工程が存在してよい、もしくは利用されてよい、または明示的に言及されていない他の要素、成分、もしくは工程と結合されてよいことを示す、非排他的方法で要素、成分、もしくは工程を言及していると解釈すべきである。本明細書の請求項がＡ、Ｂ．．．．およびＮから成る群から選択される何かの内の少なくとも１つについて言及する場合、該文章はＡ＋Ｎ、もしくはＢ＋Ｎなどではない群からの唯一の要素を必要とすると理解すべきである。

Claims (19)

1. 代謝制御微生物細胞であって、
   ピルビン酸デカルボキシラーゼ、又は、２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼをコードする組換え核酸、
   前記ピルビン酸デカルボキシラーゼ、又は、２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼを、前記組換え核酸を有しない同じ細胞と比較して、ピルビン酸又は２−ケト酪酸のアルデヒドへの変換が増加するために有効な量で発現するために前記組換え核酸に操作可能に結合されたプロモータエレメント、
   ｐｏｘＢのノックアウトを含むピルビン酸を酢酸に変換する経路でのノックアウト突然変異、ｉｌｖＥのノックアウトを含む２−ケトイソ吉草酸をＬ−バリンに変換する経路でのノックアウト突然変異、及び、ａｄｈＥ又はｙｑｈＤの改変又は欠損、を有し、
   ここで、前記改変又は欠損は、前記代謝制御微生物細胞においてアルコールデヒドロゲナーゼ活性を、前記改変又は欠損を有しない同じ細胞と比較して少なくとも７０％減少させるように減少するものであり、
   大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、及び、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選択される種に属する、微生物細胞。
2. 非特異的アルコールデヒドロゲナーゼの更なる改変又は更なる欠損を有する請求項１に記載の微生物細胞。
3. 前記非特異的アルコールデヒドロゲナーゼは、ｙｊｇＢによってコードされる請求項２に記載の微生物細胞。
4. 前記微生物細胞における減少した前記アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、前記改変又は欠損を有しない同じ細胞と比較して少なくとも９０％減少させる請求項１に記載の微生物細胞。
5. 前記組換え核酸は、プラスミドとして提供、又は、宿主細胞ゲノム内に統合される請求項１に記載の微生物細胞。
6. 前記組換え核酸は、前記ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする請求項１に記載の微生物細胞。
7. 前記組換え核酸は、前記２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼをコードする請求項１に記載の微生物細胞。
8. １以上のｌｅｕＡ、ｌｅｕＢ、ｌｅｕＣ、及び、ｌｅｕＤ遺伝子の発現に対する組換え核酸を更に有する請求項１に記載の微生物細胞。
9. １以上のｉｌｖＧ、ｉｌｖＭ、ｉｌｖＣ、及び、ｉｌｖＤ遺伝子の発現に対する組換え核酸、又は、１以上のｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＣ、及び、ｉｌｖＤ遺伝子の発現に対する組換え核酸を更に有する請求項１に記載の微生物細胞。
10. １以上のａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、及び、ｉｌｖＤ遺伝子の発現に対する組換え核酸、又は、１以上のｉｌｖＩ、ｉｌｖＨ、ｉｌｖＣ、及び、ｉｌｖＤ遺伝子の発現に対する組換え核酸を更に有する請求項１に記載の微生物細胞。
11. グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン、セルロース、ヘミセルロース、グリセロール、二酸化炭素、タンパク質、及びアミノ酸から成る群から選択される炭素源を有する培地に置かれる請求項１に記載の微生物細胞。
12. 請求項１に記載の微生物細胞を含む発酵培地であって、前記微生物細胞は、イソブタノール（ｇ／Ｌ）よりもイソブチルアルデヒド（ｇ／Ｌ）をより多く産生する、発酵培地。
13. イソブチルアルデヒドを、０．５ｇ／Ｌ〜４．０ｇ／Ｌの濃度で含む請求項１２に記載の発酵培地。
14. グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン、セルロース、ヘミセルロース、グリセロール、二酸化炭素、タンパク質、及びアミノ酸から成る群から選択される炭素源を有する請求項１２に記載の発酵培地。
15. 前記発酵培地上の気相にイソブチルアルデヒドを置き換えるのに有効な量で未溶解性ガスを有する、請求項１２に記載の発酵培地。
16. アルコールを製造する方法であって、
    発酵培地中で複数の微生物細胞を増殖する工程であって、前記細胞は改変を有しない同じ細胞と比較して増加した代謝活性を有するように遺伝子改変され、
    前記代謝活性の増加は、組換えピルビン酸デカルボキシラーゼ又は２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼそれぞれの導入又は発現を介した、及び、
    ｐｏｘＢのノックアウトを含むピルビン酸を酢酸に変換する経路でのノックアウト突然変異、並びに、ｉｌｖＥのノックアウトを含む２−ケトイソ吉草酸をＬ−バリンに変換する経路でのノックアウト突然変異を介したピルビン酸又は２−ケト酪酸のアルデヒドへの変換の増加を特徴とし、
    前記複数の微生物細胞が減少したアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するように更に遺伝子改変される工程であって、前記アルコールデヒドロゲナーゼ活性は更なる改変を有しない同じ細胞と比較して少なくとも７０％減少され、そして、前記減少したアルコールデヒドロゲナーゼ活性は、ａｄｈＥ及びｙｑｈＤの欠損によるものであり、
    ここで、微生物細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、及びサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選択される種に属し、
    前記アルデヒドを前記発酵培地から気相内へ連続的もしくは半連続的に移動させる工程、
    前記アルデヒドを前記気相から凝縮させる工程、及び、
    前記凝縮させたアルデヒドを対応するアルコールに還元させる工程、を含む方法。
17. 前記微生物細胞は、非特異的アルコールデヒドロゲナーゼの更なる改変又は更なる欠損を有する請求項１６に記載の方法。
18. 前記非特異的アルコールデヒドロゲナーゼは、ｙｊｇＢによってコードされる請求項１７に記載の方法。
19. 前記微生物細胞は、
    （ｉ）組み換え２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼの発現を介した２−ケト吉草酸、２−ケトカプロン酸、２−ケトヘプタン酸、２−ケトオクタノン酸、２−ケト−３−メチル吉草酸、２−ケト−４−メチルカプロン酸、２−ケト−５−メチルヘプタン酸、２−ケト−６−メチルオクタノン酸、２−ケト−イソ吉草酸、２−ケトイソカプロン酸、及び、２−ケト−５−メチルヘキサン酸の内の１つ以上の脱カルボキシル化
    （ｉｉ）１以上のｉｌｖＧ、ｉｌｖＭ、ｉｌｖＣ、及び、ｉｌｖＤ遺伝子をコードする組換え核酸の発現を介した、又は、１以上のｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＣ、及び、ｉｌｖＤ遺伝子をコードする組換え核酸の発現を介した２−ケト酪酸から２−ケト−３−メチル吉草酸への分岐炭素鎖延長、
    （ｉｉｉ）１以上のａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、及び、ｉｌｖＤ遺伝子をコードする組換え核酸の発現を介した、又は、１以上のｉｌｖＩ、ｉｌｖＨ、ｉｌｖＣ、及び、ｉｌｖＤ遺伝子をコードする組換え核酸の発現を介したピルビン酸から２−ケト−イソ吉草酸への分岐炭素鎖延長、又は、
    （ｉｖ）１以上のｌｅｕＡ、ｌｅｕＢ、ｌｅｕＣ、及びｌｅｕＤ遺伝子をコードする組換え核酸の発現を介した直鎖炭素鎖延長、において増加した代謝活性を有する請求項１６に記載の方法。

Images