JP6440037B2 - 試料を撮像する方法 - Google Patents

Description

本発明は試料を撮像する方法に関する。

試料中の１個の分子の動きを追跡する既知の方法によれば、分子は光子を放射させるための光によって励起され、分子から放射された光子は、試料を撮像する２次元検出器を使用して検出されるそれから分子の現在の位置が、検出器によって検出された光子の空間的分布から求められる。検出器の適切な画素密度を使用して、分子の現在の位置を、回折限界を超える空間解像度つまり精度の光子の空間分布から求めることができる。しかし、多数の光子が分子の各位置で、つまり分子がその位置を変える前に検出されることが、回折限界を超える空間精度での粒子の追跡の前提条件である。これは、分子の位置を求める場合に、分子によって比較的多数の光子が放射される期間全体でこの位置が変化しない場合に限って、より多くの光子によって空間精度が増大するためである

空間精度は、分子から放射される光子が２次元検出器によって検出される位置の分布の強度の中心から求められる分子の位置を中心とした円の半径Ａｒによって与えられる。分子の真の位置はこの円の中に位置している。半径Δｒは
Δｒ＝ＦＷＨＭ／Ｎ^１／２ （１）
で与えられ、検出された光子の数Ｎ及び回折パターンの半値幅ＦＷＨＭに依存している。

１個の分子の動きを追跡する既知の方法では大きな数Ｎの光子が試料内の分子の各位置で必要なため、分子は、非常にストレスを受け、その結果、分子をブリーチングする可能性が高まる。ブリーチングの過程で、分子は、ブリーチング後に分子によって光子が放射されなくなるように化学的に変化する。光化学ブリーチング以外にも、光子を放射するように集中的に及び／または多数が励起されている分子が準安定暗状態に移行する可能性もある。準安定暗状態から、分子がいくらかの時間の後で戻ることもある。しかし、準安定暗状態では、分子は分子を連続して追跡するために必要な光子を一切放射しない。

その結果、既知の方法で使用するのに適しているのは、いくつかの分子、つまり、いくつかのいわゆる蛍光染料つまり蛍光体だけである。多くの蛍光体はブリーチが早過ぎて、蛍光体の移動または蛍光体でマーキングされている分子の移動は、長期間または試料内で定められる長距離、追跡することができない。

前述の方法において、分子の位置は、分子によって放射された光子が２次元検出器によって検出された位置の分布から求められる。このアプローチは、局在化と呼ばれる。光子放射分子の空間位置を求める場合に高解像度または精度を達成する他のアプローチはいわゆるＳＴＥＤまたはＲＥＳＯＬＦＴ蛍光顕微鏡法である。ここで、試料中の分子が効果的に励起されて光子を放射する空間的領域は、回折限界よりも小さくなる。したがって、試料から放射させる光子は、光子が検出された位置と検出された光子の数とは無関係に大きさを減少させたこの特定の空間領域に帰することができる。実際に、分子を効果的に励起する領域を減少させることは、蛍光禁止光の１個または複数のコヒーレントビームの干渉パターンが重畳している集中した光ビームを照射することによって達成される。この干渉パターンは、実質的にゼロ強度の点を、励起光ビームの焦点領域に有している。蛍光禁止光のビームの高絶対強度のために、蛍光禁止光の強度は、試料内での分子による光子の放射が実質的にゼロ強度の点以外の実質的にあらゆる箇所で禁止されるように、実質的にゼロ強度の点以外のあらゆる箇所で飽和強度Ｉｓを超えている。これは、以下の式で与えられる空間解像度つまり精度によって達成される。
Δｒ＝λ／（ｎｓｉｎα（１＋Ｉ／Ｉｓ）^１／２） （２）
ここで、Ｉは試料内の干渉パターンの最大強度である。

ＳＴＥＤ顕微鏡法では、蛍光阻止は、誘導放射によって達成される。ＲＥＳＯＬＦＴ蛍光顕微鏡法では、蛍光阻止は、一時的に分子を配座状態または分子が蛍光を放射することができない他の種類の状態に移動させることによって達成される。ＳＴＥＤ蛍光顕微鏡法において、蛍光阻止光の高絶対強度が必要であるため、蛍光体をブリーチする危険性が比較的高い。ＲＥＳＯＬＦＴ蛍光顕微鏡法については、蛍光阻止光は比較的低い強度で十分である。しかし、このアプローチは、配座状態または蛍光体が蛍光を発することができない他の種類の状態に切り換え可能な特別な蛍光体を使用してのみ適用可能である。

一般に、ＳＴＥＤまたはＲＥＳＯＬＦ蛍光顕微鏡法のようなアプローチは、粒子が蛍光を放射するように効果的に励起される空間的に狭い領域で追跡されるので、試料中の粒子の動きを追跡するのに適している。この場合、空間的に狭い領域内に粒子がある基準は、追跡されている粒子によって放射される光子の最大割合になるであろう。このアプローチによる追跡に必要な光子の数は、粒子の連続的な局在化に必要な数よりも少ないが、長い距離に渡る動きの追跡に適している粒子やマーカーの数が顕著に増加することはない。そのうえ、ＳＴＥＤおよびＲＥＳＯＬＦＴ蛍光顕微鏡法において、励起光及び蛍光を阻止する光を発光するためにさまざまな光ビームを照射しなければならない。通常、これには追加の努力が必要であるが、それは様々な光ビームは様々な波長を有しており、様々な光ビームは空間的に注意深く揃えなければならないからである

特許文献１から、いわゆる減衰全反射法に基づいている光学系を試料内で粒子の移動を追跡するのに適用できることが知られている。（特許文献１）によれば、試料は、粒子が光子を放射するように駆動する光を受ける。試料を照明する光の強度分布は、一様ではなく、空間的に変調されているので、粒子の動きによって、放射された光子の数がそれぞれ変動する。したがって、強度分布の変調を考慮して、粒子の動きを、放射された光子の検出された変動つまり、検出器信号の変調から求めることができる。しかし、光強度が一定の経路に沿った粒子の動きは追跡できない。さらに、光を受けないまたはまれにしか受けない粒子は全く追跡できない。したがって、粒子が頻繁に光に曝されることは、特許文献１から知られる光学系を使用して試料内の粒子の移動を追跡するのに必須である。そのため、粒子や粒子をマーキングするマーカーをブリーチする危険性は効果的に減少せず、受け入れなければならない。

試料内で１個の分子の動きを追跡する方法は、特許文献２から知られている独立請求項１の前庭部の特徴を有している。

ドイツ特許出願公開明細書第２５４６９５２号 ＰＣＴ特許出願公開明細書第２０１３／０７２２７３号

試料内を移動している粒子に基づいて試料を撮像する方法が必要である。

本発明は試料を撮像する方法に関する。この方法は、（ｉ）第１の成分の光を発光し、（ｉｉ）第１の成分の光を受けたときに光子を放射するように駆動される粒子のグループから粒子を選択し、（ｉｉｉ）空間的に限定されている最小値を有している光強度分布を実現するように第１の成分の光を形成し、（ｉｖ）粒子が光強度分布の空間的に限定されている最小値に位置するように光強度分布を試料に照射し、（ｖ）粒子によって放射される光子を検出し、光強度分布の最小値を使用して、粒子の移動を追跡し、そのために、（ｖｉ）粒子によって放射される光子の割合が最小のままになるように光強度分布を試料に対して移動させ、（ｖｉｉ）試料中の光強度分布の最小値の実際の位置を試料中の粒子の実際の位置として追跡し、（ｖｉｉｉ）試料の複数の部分の各々について、粒子の滞在時間を求め、（ｉｘ）滞在時間の分布を試料にわたってマッピングするステップを有する。

開示の有利なさらなる発展は、請求項、明細書、および図面から生じる。本明細書で言及する特徴及び複数の特徴の組み合わせの利点は、例としての役割を有しているだけであって、これらの利点を達成するために、開示による実施形態を必要とせずに、代替でまたは累積的に使用してもよい。含まれている請求項によって定められているような保護の範囲を変更することなく、以下の内容が元出願及び特許の開示に対して適用される。さらなる特徴は、図面、特に、互いに対する複数の構成要素の図示されている構成及び寸法だけでなく相対的な配置及び動作上の関連から得られるかもしれない。開示の様々な実施形態の特徴の組み合わせ、または請求項の選択されている参照とは無関係な様々な請求項の特徴の組み合わせも可能であって、本明細書において動機付けられている。これは、別個の図面に図示されている、またはそれらを説明するときに言及される特徴にも関連している。これらの特徴も、さまざまな請求項の特徴と組み合わされてもよい。さらに、開示のさらなる実施形態が、請求項で言及された全ての特徴を有していないことも可能である。独立請求項で言及された全ての特徴さえ有していないかもしれない。

以下では、開示を図面に示されている好ましい実施形態の例を参照してさらに説明する。

図１は、本開示の方法の実施形態を実行する本開示の装置の実施形態の例を示しており、装置は１個の光源、点検出器、及びカメラを有している。 図２は、本開示の方法の他の実施形態を実行する本開示の装置の実施形態の他の例を示しており、装置は１個の光源及びカメラを有している。 図３は、粒子を駆動して光子を放射するための強度分布の最小値の領域にある粒子を示している。 図４は、線プロフィルに沿った位置に依存している図３の強度分布の強度及び、さらに図３の粒子によって放射された光子の結果の割合を示している。 図５は、図３の位置から出た粒子の移動後の状態を示している。 強度分布が粒子の移動に追従した後の状態を示している。 本開示の方法のさらなる実施形態を実行する本開示のさらなる装置の実施形態のさらなる例を示しており、装置は白色光源及びセレクタを有している１個の光源及び３個の隣接している点検出器を有している。 図８は、本開示の方法のまたさらなる実施形態を実行する本開示の装置の実施形態のまたさらなる例を示しており、装置は２個の光源及び４個の隣接している点検出器を有している。 図９は焦点面を通るｘ方向断面内の光強度分布及び光強度分布を囲んでいるスイッチオフ信号強度分布を示している。 図１０は、図９の強度分布に起因する効果的な点像分布関数ｈｅｆｆを示している

本発明によって試料内の移動が追跡される粒子は、単独の分子、共に移動する分子のグループ、複合体、量子ドット、反射する金の粒子などであってもよい。

光を受けている粒子による光子の放射の元になる過程は、蛍光かもしれない。しまし、光の散乱など光子の放射の基礎として多くの他の過程を使用してもよい。

光子の放射の原因となるそれぞれの過程は、追跡される粒子自体の性質またはマーカー、特に追跡される粒子をマーキングする染料に関連しているかもしれない。本発明の方法において、試料に照射される光強度分布は、空間的に限定されている最小値を特徴としている。ＳＴＥＤやＲＥＳＯＬＦＴ蛍光顕微鏡法で使用される蛍光阻止光の場合のように、この強度分布は、空間的に限定されている最小値が干渉パターンの実質的にゼロ強度の点である１個または２個以上のコヒーレント光ビームの干渉パターンによって形成されてもよい。したがって、最小値は、小さい空間寸法を備えている。特に、最小値の空間寸法は、回折限界よりも小さいかもしれない。

しかし、ＳＴＥＤ及びＬＥＳＯＬＦＴ蛍光顕微鏡法とは対照的に、この特定の強度分布を示している光は、蛍光阻止のためには使用されない。その代わりに、計測信号として検出される光子の放射のために追跡される粒子を駆動するのに使用される。さらに、試料は、強度分布の最小値を使用して走査されないが、粒子から放射され、その後検出される光子の割合が最小となるように強度分布は試料に対してのみ連続して移動する。光子の最小化されたまたは最小の割合は、粒子が光分布の最小値の位置に依然として位置している意味している。逆に、光子の増加している割合は、粒子が光強度分布の最小値を離れようとしており、最小値の位置が粒子の移動を追跡するように再調整されなければならないことを意味している。

本発明の方法において、光子またはその検出の位置は、試料中の粒子の実際の位置を求めるためには使用されない。したがって、各位置を高い精度で求めるために試料中の粒子の各位置について多数の光子を得る必要はない。その代わりに、試料中の光強度分布の最小値の実際の位置を試料中の粒子の実際の位置と考える。

適切な条件下では、粒子の移動は、回折限界よりも際だって低い空間的な精度で追跡可能である。最小値の小さい寸法及び光強度分布の移動の高精度以外に、これらの適切な条件には、最小値の外側の光強度の十分に急激な増加及び光子の増加率に対する最小値の位置の十分に速い再調整が含まれる。

本発明の方法においては粒子が多くの光子を放射することは必要ではないので、粒子をブリーチする危険性は大きく減少する。したがって、ブリーチされやすい粒子でさえも、より長い期間または試料中の粒子によって定められるより長い距離、追跡可能である。さらに、ＳＴＥＤまたはＲＥＳＯＬＦＴ蛍光顕微鏡法に基づく方法とは対照的に、試料は、最小値を有する強度分布に曝されるだけである。したがって、光を、空間的にもその波長に関しても、他のビームに揃える必要はない。そのため、本発明の方法を適用するための光学的設定は、ＳＴＥＤやＲＥＳＯＬＦＴ蛍光顕微鏡のそれに比べて、際だって複雑さが減少する。

ＳＴＥＤおよびＲＥＳＯＬＦＴ蛍光顕微鏡法に対する他の違いもある。本発明の方法において、最小値を有する光強度分布は、光が低強度で既に光子を放射していれば、小さい絶対強度を有するだけでよい。特に、回折限界未満の空間精度を達成するために、光子の放射のための励起の飽和がゼロ点の外側で達成される必要はない。その代わりに、多くの場合、ゼロ点との距離が増加するにつれて、励起が連続して増加することが好ましい。最後になるが、追跡される粒子によって放射される光子の数が最小になり、したがってそのブリーチングのおそれも最小になることが本発明の特徴である。

検出器によって検出される光子の割合を連続的に最小にするために、試料に相対的に、つまり試料に対して強度分布を移動つまり偏向させることは、試行錯誤のアプローチに基づいていてもよい。つまり強度分布は、少しずつ試すことに基づいて移動してもよい。移動によって、放射される光子の割合に相似している検出される光子の割合が減少すると、強度分布を同じ方向にさらに移動させる。逆の場合、つまり移動によって検出される光子の割合が増加すると、強度分布を他の方向、たとえば逆の方向に移動させる。「追跡アルゴリズム」及び「ファジー論理」いうキーワードで示されるような様々な適切なアルゴリズム及び実施態様が当業者には知られている。

ＳＥＴＥＤまたはＲＥＳＯＬＦＴ蛍光顕微鏡法から、蛍光阻止光の光強度分布を形成する様々な技法が知られており、たとえば、参照によって開示全体が本明細書に援用されるＫｌａｒ他、ＰＮＡＳ ９７（２０００）、Ｗｅｓｔｐｈａｌ他、Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．９４（２００５）、およびＤｏｎｎｅｒｔ他、ＰＮＡＳ １０３（２００３）を参照のこと。これらうちの任意の技法を、追跡される粒子を駆動して光子を放射させる光強度分布を構成する本発明の方法において使用することもできる。ほんのいくつかの例を挙げると、最小値を有している光強度分布を形成するために、空間光変調器、対向しているレンズを使用した４パイ配置等を採用してもよい。

試料に対して最小値を有している光強度布を移動させるつまり偏向させるために、ＳＴＥＤ及びＲＥＳＯＬＦＴ蛍光顕微鏡法で知られているスキャナを適用してもよいたとえば、そのようなスキャナは、音響光学的または電気光学的な偏向器、回転ミラー、光ビームに対して試料が調整される圧電アクチュエータ、または対物レンズを作動させ、光ビームが試料に対して調整される圧電アクチュエータを有している。

光強度分布を偏向させる代わりに、またはそれに加えて、試料に対して最小値を有している光強度分布を移動させることは、最小値を特徴としている光強度分布に対して試料をシフトすることによって達成されてもよい。試料に対する最小値を有している光強度分布の移動には、光強度分布の最小値と試料との間の相対的な移動だけが必要である。特に、試料に対する最小値を有している光強度分布のｘ及びｙ方向への移動は、光強度分布を偏らせることによって達成されてもよく、試料に対する最小値を有している光強度分布のｚ方向への移動は、試料をシフトすることによって達成されてもよい。ｚ方向は、光強度分布が試料に照射される試料の表面が主に広がっている平面に直交している方向であってもよく、ｘ及びｙ方向は、この主な延長方向の平面に沿ってつまり平行に延びていてもよい。

本発明の方法によれば、光強度分布の最小値は、空間的に１次元、２次元、または３次元に限定されていてもよい、つまり、最少値は、平面に沿って、直線に沿って、または点の周囲に延びていてもよい。粒子の移動の追跡のために、それから強度分布が、試料に対して、最小値が限定されている次元の全ての方向に移動つまり偏向される。最小値が限定されていない方向への移動によって、粒子によって放射される光子の割合が減少することはなく、したがって効果的に使用できないかもしれない。これは、粒子のこの方向の移動は追跡できないことも意味している。その結果、この方向は、この方向への粒子の移動が想定されないように向いていることが好ましい。多くの場合、粒子の試料内の移動は、ともかくも特定の構造に沿っている方向に制限される。２次元の試料の場合、第３の次元の方向への粒子の移動は、原則的に省略される。

最小値を有している強度分布は、空間的に限定されている最小値が実質的にゼロ強度の点である１個または２個以上のコヒーレント部分光ビームの干渉パターンとして形成されてもよいことを既に言及している。干渉パターンは、たとえば、波面を変調することによって１個のコヒーレントビームまたは複数の重なっているコヒーレント光ビームから形成されてもよい。

本発明の方法の一実施形態において、１個のコヒーレントビームの波面の変調は、光強度分布の１次元的または２次元的にのみ限定されている最小値が、様々な空間次元において交互に空間的に限定されるように動的に変更される。たとえば、位相関係が、第１の位相関係の場合に最小値が、ｘ−ｙ平面内の輪によって限定され、第２の位相関係の場合に最小値がｚ方向で限定されるように第１及び第２の位相関係の間で変化してもよい。最小値をｘ及びｙ方向またはｚ方向のいずれかに限定する適切な光強度分布及びコヒーレント光ビームの波面の対応する変調は、参照によって開示全体が本明細書に援用される、Ｊ．Ｋｅｌｌｅｒ他、”Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｆｏｒ ＲＥＳＯＬＦＴ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡法用の効率的な蛍光阻止パターン）”、Ｏｐｔｉｃｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ ３３６１、Ｖｏｌ．１５、Ｎｏ．６（２００７）、およびＢ．Ｈａｒｋｅ他、ＮａｎｏＬｅｔｔｅｒｓ、８、１３０９（２００８）に記載されている。Ｊ．Ｋｅｌｌｅｒ他およびＢ．Ｈａｒｋｅ他はそれらのパターンを蛍光阻止に使用している。しかし、同じパターンを、粒子が光子を放射するように駆動する光の光強度分布用の本発明の方法において使用してもよい。本発明のこの実施形態の他の変形例において、さまざまな連続している位相関係は、様々な方向に向いている直線または平面のような最小値となってもよい。これらの最小値は、回転ストライプと記載され、空間的な交差部分として点または線を有していてもよい。そのような位相の関係が高速に切り換えられ、また粒子から放射される光子の割合の最小値の位置が各位相関係に対して個別にまたは位相関係の変化全体にわたって特定される場合、試料内の粒子の移動を全ての３次元方向に追跡することができる。

本発明の方法において、光は、波長が異なっている光成分からなっていてもよい。さらに、光は様々な粒子のグループに属している様々な粒子を追跡できるように可変波長であってもよいこれらの場合全てにおいて、光強度分布が、空間的に限定されている最小値の空間位置が光の波長と共に変化しないように形成されていることが有利である。

本発明の方法において、粒子によって放射された光子を２次元検出器アレイによって検出する必要はない。その代わりに、光子の検出には点検出器を使用すれば十分であって、それは追跡が主にこれらの光子の割合に依存するからである。試料内の粒子の現在の位置は、試料に対する最小値を有している強度分布の現在の位置から求められることになる。この位置は、試料に対して強度分布を移動させるこれらの装置の位置、たとえば強度分布を移動させるスキャナの現在位置から決定されてもよい。試料に対する強度分布の位置は、たとえば、粒子によって放射される光子を、試料を撮像するカメラを使用して検出し、カメラ上のこれらの光子からなる光強度分布の画像を評価することによって直接求めてもよい。局在化の原理によれば、このようにして求めることによって、回折限界を超えた位置精度を達成することもできる。

さらに、試料を撮像するカメラを使用して、空間的に光を構築することなく、粒子を駆動して光子を放射させる光で試料を照明することによって粒子の初期位置を求めてもよい。光子を放射し、別個に追跡できない２個またはそれ以上の粒子を求める場合、たとえば、最小値に隣接している光強度分布の最大値内に存在しているような高い光強度を意図的に照射することによって、光化学的に余分な粒子をブリーチすることができる。混乱を引き起こす粒子のそのようなブリーチは、検出される光子の増加率が移動した追跡される粒子のせいではなく、追跡される粒子の経路を横切る同様な種類の他の粒子のせいである場合にも適用可能である。この他の粒子は、たとえば、カメラを通して、光の強度分布の最小値からさらに遠くに放射された比較的多数の光子によって認識されてもよい。

試料を撮像するカメラは、粒子から放射された光子がカメラを使用して検出された位置からの粒子の移動の方向を求めるために使用されてもよい。これを求めるために、粒子の局在化を実施することも可能で、局在化は、光の強度分布の最小値から外れたときの粒子によって放射された光子に基づいている。しかし、ここでは高い精度で局在化を実施する必要はない。したがって、粒子が多くの光子を放射する必要なく、それは、放射された光子が、粒子に追従するために光の強度分布の最小値を移動させなければならない方向を求めるために使用されるだけだからである。しかし、放射された光子は、粒子の追跡における所望の空間精度を達成するためには必要ない。その代わりに、空間精度は、粒子によって放射される光子の割合の以降の最小化及び、したがって、光強度分布の最小値の形態および／または配置によって達成される。この最小化は、光強度分布の空間的に限定されている最小値の再調整のための試行錯誤手順に基づいていてもよい。

しかし、光子によって放射された光子が検出された位置を元に粒子の移動の方向を求めるために完全なカメラを使用する必要はない。そのような決定のための十分な情報も、１次元で粒子を追跡するための少なくとも２個の隣接している点検出器または、２次元または３次元で粒子を追跡するための少なくとも３個の隣接している点検出器を使用すれば入手可能である。同様の概念は、たとえばレーザービームの位置を求める既知の４象限フォトダイオードにおいて使用される。さらに、全体が参照により本開示に援用されるＳ．Ｊ．Ｓａｈｌ他、Ｆａｓｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｒａｃｋｉｇｎ ｍａｐｓ ｎａｎｏｓｃａｌｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｉｎｅ Ｌｐｉｄｓ（形質膜脂質の高速分子追跡マップナノスケール動力学）、ＰＮＡＳ、２０１０年４月１３日、Ｖｏｌ．１０７、Ｎｏ、１５、６８２９〜６８３４は、標準的な分子追跡手順における蛍光粒子の追跡のための３個のファイバ入力面によって実現される３個の隣接している点検出器の使用を開示している。これらの点検出器は、粒子によって放射された光子を検出する本発明の方法で使用されてもよい。

本発明の方法の狙いは、粒子から放射される光子の割合を最小化することであるので、対象の光子に加えて検出されるバックグラウンドが重要である。バックグラウンドは、たとえば、粒子を駆動して光子を放射するように試料に照射される光または試料の自己蛍光によるかもしれない。バックグラウンドの影響を最小にするために、粒子を駆動して光子を放射させる光を試料にパルス状に照射してもよく、粒子によって放射される光子は、光のパルスの各々の後の限定された時間間隔内で検出されてもよい。この時間間隔つまりゲートは、極大の信号対雑音比が達成されるように調整することができる。バックグランドを減少させる他のアプローチは、粒子が多重光子過程を通して光によって光子を放射するように粒子を選択することである。それから、粒子によって放射される光子は、試料に照射される光よりもはるかに短い波長を有し、この光による背景は、波長によって容易に抑制することができる。また、多重光子励起または吸収は、全ての３個の次元において粒子を囲んでいる領域に制限される。多重光子励起は、試料の大きな体積には広がらず、したがって必要のない（自己）蛍光励起を最小にする。この多重光子励起の制限は、多重光子励起蛍光顕微鏡法でよく知られている。

本発明の方法において、粒子を駆動して光子を放射させる光は、白色光から波長を選択することができる。この選択を変化させることによって、さまざまなグループに属しているさまざまな粒子を追跡することができる。白色光を発光する光源が一般に知られている。それらは、たとえば、デンマークのＮＫＴ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓから入手できる。これらの光源は、実質的に一定の強度の光パルスを波長の広い範囲にわたって発光する。本発明の方法で使用される光を、この範囲から選択してもよい。

本発明の方法の一実施形態において、追跡される粒子から放射された光子は、波長、偏光、絶対速度、隣接する点検出器によって検出された相対数、コインシデンス、光の各パルス後の時間における点からなる特徴のグループから選択された少なくとも１個の特徴を求めるために、さらに分析される。これによって、追跡される粒子の追加の情報つまり詳細を得ることができるこれらの詳細は、粒子の追跡を通して変化してもよい。光子の波長の結果としての変化及び光の各パルス後の光子の時間の点を分析してこれらの詳細を監視することができる。特に、Ａ．Ｓｃｈｏｎｌｅ及びＳ．Ｗ．Ｈｅｌｌ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｎａｎｏｓｃｏｐｙ ｇｏｅｓ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ（マルチカラー化される蛍光ナノスコピー）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２５、Ｎｏ．１１、２００７年１１月、１２４３〜１２３５に記載されているような同様な技法を適用可能である。粒子の詳細のこのような分析は非常に敏感である。これは、１個の粒子だけが、分析される光子に貢献する、つまり他の詳細を備えている他の粒子からの光子によって希薄化されないためである。これによって、波長の微妙な違いや粒子によって放射される光子の他の特徴に基づいて、分析される粒子の特に正確な分類が可能になる。

粒子からの光子を分析することによって、粒子が有している発光中心が１個なのか２個以上なのか、またこれらの発光中心が一緒に存在しているのか時々互いに離れているのかどうかを決定することもできる。したがって、たとえば、個別の結合パートナまたは結合複合体パートナについてそれぞれ結合体および複合体を監視することができる。

本発明の方法において、粒子によって放射される光子の検出に使用される検出器は、粒子の同じグループに属しており、検出器の検出体積内に位置している他の粒子によって放射される全ての光子も検出する。しかし、本発明の方法は、１個の粒子が、粒子の追跡のために最小化されている光の割合において検出され考慮される全ての光子を放射する場合にだけ適切に動作することになる。この条件が満たされていることを確認するために、検出器の検出体積から放射される、つまり光強度分布の最小値を有している体積の光子を１個または２個以上の前述の特徴を求めるために分析することが可能で、求められた特徴が分析される光子を放射している１個の粒子に適合していることを確認することができる。この状況においては特に、粒子から放射された光子の絶対速度の特徴は、粒子の明るさと呼ぶこともできる。光子が２個以上の粒子から放射される場合、１個を除き全ての粒子をスイッチオフするつまりブリーチするか、他の粒子を試料の他の部分で選択すべきである。

本発明の方法は、スイッチ可能な粒子、たとえばスイッチ可能な分子の追跡に応用されてもよく、光子の放射を駆動する光が、スイッチ可能な分子を、粒子が光子を放射するように駆動できない状態から粒子が光子を放射するように駆動することができる蛍光状態へ活性化させてもよい。そのような切り替え可能な分子の一例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）様タンパク質であるＲＡＤＲＯＮと呼ばれている。必要ではないが、本実施形態において、粒子が素早く非蛍光の暗状態に戻ることが好ましかもしれず、それは、これが、光子の放射を駆動する光の強度分布の最小値において達成される放射された光子の割合を最小にする効果を支援するからである。粒子が暗状態に戻ることは、自発的に発生してもよいし、任意の物理的または化学的な信号によって引き起こされてもよい。この信号の誘発は空間的に構造化されている必要がないので、空間的に構造化されていないことが好ましい。

切り替え可能な粒子を使用している本発明の他の実施形態において、光子を放射するように駆動する光とは別の波長の光は、たとえば、１個の粒子の追跡に必要となるように、試料中で光子を放射するように駆動可能な活性化された粒子の小さい集中を調整するのに使用してもよい。この目的のために、自体の励起波長以外の波長で活性化するＤＲＯＰＮＰＡ、ｒｓＥＧＦＰ、ＥＯＳ、およびＤｅｎｄｒａ２と呼ばれる光スイッチングタンパク質を使用してもよい。ＤＲＯＮＰＡ及びｒｓＥＧＦＰは、光子を放射するように励起されるだけでなく、それらの励起波長で非活性化もされる。本発明の方法に必要な光子の数が少ないので、それらは、励起光の光強度分布を使用して、しばらくの間うまく追跡されるかもしれない。
ＥＯＳ及びＤｅｎｄｒａ２は、まず、その励起波長で非活性化されず、ブリーチされるだけかもしれない。

スイッチング粒子を使用する本発明の全ての実施形態において、空間的に限定されている最小値を備えている光強度分布を実現するように形成されている光子の放射を駆動する光は、１個の波長の光成分だけを有していてもよいし、さまざまな波長の２個の成分を有していてもよい。光成分が１個だけの場合、光成分は、既にオンにスイッチされているか他の態様に活性化されている光子の放射のために粒子を励起するかもしれないし、光子の放射のために粒子を活性化しまた励起している。２個の光成分の場合、これらの２個の光成分の１個は、粒子を活性化するのに使用されてもよいのに対して、光成分の他の１個は、光子の放射のために粒子を励起させる。

本発明の一実施形態において、別個のスイッチオフ信号には、信号強度分布が備わっており、光強度分布を囲んでいる。このスイッチオフ信号は、光を受けると光子を放射するように駆動される粒子のグループに属している他の粒子をオフに切り換える。オフへの切り換えは、たとえば、光化学ブリーチングまたは安定した暗状態にある光不活性化可能粒子の切り換えによって発生してもよい。本発明のこの実施形態は、追跡されている粒子の経路を横切る粒子が、最小化される光子の割合に貢献する光子を放射することによってその追跡を乱さないことを保証している。スイッチオフ信号は、スイッチオフ光であってもよい。スイッチオフ信号は、光と概ね同様に、また光の強度分布の最小値に対して同心に、しかしスイッチオフ信号の最小値がより大きくなるように共通の中心に形成されてもよい。スイッチオフ信号のこのより大きな最小値によって、追跡される粒子がオフに切り換えられることが回避される。

本発明の方法の一実施形態において、粒子によって放射され検出される光子が計数され、粒子によって既に放射され検出されている光子の絶対数が示される。各粒子は、通常、粒子がブリーチされ、したがって追跡不能になる前に多数の光子を放射するように駆動されてもよい。この光子の数は絶対的に固定されていないが、粒子の各グループ内で大きく変動することはない。したがって、粒子によって既に放射され検出されている光子の絶対数は、既になくなっている粒子の追跡可能な寿命の部分及び粒子が依然として追跡できる追跡可能な寿命の残りの良好な指標である。

本発明の方法の一実施形態において、光を受けたときに光子を放射するように駆動される同じグループの粒子から選択された少なくとも２個の粒子が光強度分布の最小値によって交互に追跡されている。ＳＴＥＤ及びＲＥＳＯＬＦＴ蛍光顕微鏡法から知られる上述のこれらのスキャナは、光強度分布の最小値を高精度で試料内のどのような粒子の移動よりも速く再配置するのに適している。他の適切なスキャナは、たとえば光ピンセットにおいてのように複数の粒子を追跡しトラップするのに既に使用されているものである。したがって、本発明の方法のステップが複数の粒子の各々について交互に実行されるのと平行して複数の粒子が追跡されてもよい。

前の段落に記載されている本発明の実施形態の変形例において、光強度分布は同じグループから選択された２個または３個以上の粒子が位置している試料を貫通する線つまり軌道に沿って定期的に前後に移動する。この線つまり軌道に垂直な全ての方向において、この線のコースが粒子によって放射される光子の割合が最小になるように再調整されることで、２個または３個以上の粒子が直接追跡される。しかし線に沿っている粒子の位置は、線に沿っている粒子から放射され検出された光子の割合の極小値の位置から求めることができる。この実施形態によって、互いに非常に接近している粒子を別個に追跡することもできる。この場合、光強度分布がそれに沿って前後に移動する線は、粒子の間の距離の方向に特に延びていてもよい。この実施形態において、粒子の距離は、線に沿った検出された光子の割合の極小値の距離である。

本発明の方法によって、２個または３個以上のさまざまな粒子を追跡することも可能である。この目的のために、２個または３個以上のさまざまな波長または偏光の光を使用し、それぞれの粒子について特徴的な波長または偏光の光子が検出されてもよい。２個または３個以上の様々な粒子のこの追跡は、共通の対物レンズ以外に、別個の装置を使用して実施されてもよい。本発明の他の実施形態においては、別個の光源が存在するだけで、追跡設定の他の全ての部分は共有されている。共有されている全ての部分は、両方の粒子に対して交互に、つまり、一方の粒子の追跡と他方の粒子の追跡との間で切り換えることによって使用されることになる。

本発明によれば、粒子の追跡は、試料の撮像に使用される。この目的のために、粒子の滞在時間は、試料の複数の部分の各々について求められる。試料のこれらの部分は特に、試料の全体積か細分化されている体積要素つまりボクセルであってもよい。試料にわたる滞留時間の分布がマッピングされると、試料の画像が得られる。基本的な実施形態において、試料の結果の画像は、追跡される粒子が存在していた全ての領域を示していてもよいし、または追跡される粒子が存在したことのない全ての領域を示していてもよい。より洗練された画像は、さまざまな滞留時間のさまざまな領域を示していてもよい。たとえば、粒子がまれにマッピングされている領域は、粒子がしばしばマッピングされている領域とは別個にマッピングされる。それぞれの領域の粒子のこれらのさまざまな滞留時間から、試料のこれらの領域が様々であると結論づけてもよい。これらの領域は、粒子への接近性、粒子の運動性、粒子への類似性、さらには粒子への結合の傾向が特に異なることになる。

追加で、たとえば試料のそれぞれの部分内の全ての個別の滞留時間の総和として計算される粒子の絶対滞留時間と、たとえば試料のそれぞれの部分内の粒子の個別の滞留時間の平均値として計算される一時滞留時間とを区別してもよい。絶対滞留時間は、試料のそれぞれの部分の粒子との親和性をよりよく表しているかもしれないのにたいして、一時滞留時間は、試料のそれぞれの部分内での粒子の運動性をよりよく表しているかもしれない。

当然、試料のこのような撮像は、試料の固定されている画像を得ることしかできないわけではない。その代わりに、試料のさまざまな部分の滞留時間の時間的な進展も使用して、一連の画像、つまり試料の時間的な進展を示している動画を得てもよい。

このように試料を撮像する空間解像度は、滞在時間が求められるボクセルの大きさに依存している。試料内の粒子の位置が、回折限界を超えた精度で追跡可能であるので、画像は、回折限界を超えた空間解像度を有しているかもしれない。

粒子が試料中で長い経路にわたって追跡されてきた場合、これは、試料全体を撮像するのに十分かもしれない。しかし、滞留時間のマッピングが複数の粒子の各々について繰り返される場合、試料の粒子が超えることができないまたは超える割合が低いかもしれない区分で分離されている様々な領域を認識することができる。

様々な成分の光を受けたときに光子を放射するように駆動されるさまざまな粒子が本発明のこの実施形態で使用される場合、試料の複数色の画像が得られる。この画像の各「色」は、粒子のそれぞれのグループの粒子がプローブの役割を果たす試料のさまざまな特性に関連付けられている。

本開示の装置は、光子を放射するように粒子を駆動するのに使用される光を発光する光源及び、粒子によって放射される光子を検出する検出器を有している。装置は、空間的に限定されている最小値を特徴としている強度分布を備えている光を試料に照射するように構成されているビーム成形手段をさらに有している。さらに、検出器の信号に依存して制御されるビーム偏向手段が設けられている。実際の依存性は、検出器によって検出される光子の割合が、試料に対して光強度分布を移動させるつまり偏向させることによって最小に維持されるような依存性である。したがって、粒子の移動は、光強度分布の最小値を使用して追跡される。

本開示の装置の一実施形態において、ビーム成形手段は、光のコヒーレントビーム波面を変調し、それからビームを試料内に集光して光強度分布の最小値を光の干渉パターンの実質的にゼロ強度の点として実現する。光ビームの波面を変調するために、ビーム成形手段は、動的に制御可能な空間光変調器を有していてもよい。

本開示の装置の他の実施形態において、ビーム成形手段は、光の少なくとも２個のコヒーレントビームを試料の同じ焦点領域に集光させる。この場合も、光強度分布の最小値を干渉パターンの実質的にゼロ強度の点として実現する。

さらに、ビーム成形手段は、空間的に限定されている最小値の空間的位置が光の波長と共に変化しないように、無色であってもよい。

カメラが試料の撮像のために設けられていてもよい。カメラは、たとえば、追跡されている粒子が試料中のどこに位置しているのかを求めるために使用されてもよい。これを求めるために、試料に空間構造を有していない光を当ててもよい。カメラは、粒子が試料内で追跡されたときに光強度分布の位置を求めるために使用されてもよい。さらに、カメラは、粒子を追跡するために強度分布を移動させなければならない方向を求めるために使用されてもよい。カメラの代わりに、粒子の追跡のために強度分布が移動を開始する方向を求めるために１個または好ましくは２個または３個以上の隣接している点検出器が設けられていてもよい。特に、Ｓ．Ｊ．Ｓａｈｌ他、Ｆａｓｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｒａｃｋｉｎｇ ｍａｐｓ ｎａｎｏｓｃａｌｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｉｐｉｄｓ（形質膜脂質の高速分子追跡マップナノスケール動力学）、ＰＮＡＳ、２０１０年４月１３日、Ｖｏｌ。１０７、Ｎｏ。１５、６８２９〜６８３４に記載されているような一式のマルチモード光ファイバを隣接している点検出器として使用してもよい。

２個の異なる粒子を追跡するために、波長の異なる光を発光する２個の光源を設けてもよい。同時に追跡するために、別個のビーム成形手段及びビーム偏向手段を光源の各々に対して設けてもよい。しかし、共通の手段を交互に使用される両方の光源に対して設けることも可能である。２個よりも多い粒子を同時にまたは高速に交互に追跡するために、２個よりも多い光源を設けることも可能である。

特に、光源は、光が試料中にパルス状に照射されるように、パルスレーザーなどのパルス光源であってもよい。それから、検出器がゲート共に設けられており、粒子から放射された光子が光の各パルスの後で、限定された時間間隔内に最大信号対雑音比で検出されるようにパルス光源と同期していてもよい。この手順は、時間ゲート検出として知られている。

本開示の装置の一実施形態において、光源は、たとえば波長または偏光によって白色光から光を選択するように構成されているセレクタを有している。それから白色光は、たとえば、デンマークのＮＫＴ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓから入手可能なパルス状光源のような、何らかの既知のパルス状光源によって発光されてもよい。

本開示に装置の検出器は、波長、偏光、絶対速度、隣接している点検出器によって検出された相対数、コインシデンス、および光の各パルス後の検出時点からなる特徴のグループから選択された少なくとも１個の特徴について光強度分布の最小値を有している体積から放射された光子を分析するように構成されている分析器をさらに有していてもよい。分析器によって、粒子の永久的及び変化する詳細についての情報が収集できる。この情報に基づいて、粒子を特定したり、粒子の特定のクラスに割り当てたりしてもよい。分析器によって、光子がただ１個の粒子によって放射されたのか関連しているかもしれない２個以上の粒子によって放射されたのかを判断することもできる。

本開示の装置の検出器は、光源によって発光される光の波長の実質的に半分の波長で粒子によって放射された光子を選択的にさらに検出してもよい。これは、粒子が２光子過程を通して光子を放射するように駆動されていることを意味している。光子を放射するように粒子を駆動する光と粒子から放射された光子との間の波長の大きな違いによって、光子の検出におけるバックグラウンドの抑制が特に容易になる。さらに、粒子を駆動して光子を放射させる２個の光子過程の場合、光が誤って試料の他の領域の粒子も駆動して光子を放射させる可能性が大きく減少する。これは、光が集光される焦点平面よりもｚ方向の他の位置の粒子に特に当てはまり、ｚは光が集光される光軸を表している。多重光子誘発過程は、強度が最も高い焦点領域で主に発生するので、すべての３個の次元に励起が制限される。

多重光子過程の同じｚ選択的特徴を、多重光子過程を介して、試料内の特定のｚ位置にある活性化可能な粒子をｚ位置、つまり光軸の方向のその深さの焦点領域に集光された活性化光によって選択的に活性化することにも使用してもよい。

さらに、本開示の装置は、スイッチオフ信号、特に光強度分布を囲んでいる信号強度分布を備えているスイッチオフ光を発光する信号源を有していてもよい。スイッチオフ信号が光を受けたときに光子を放射する他の粒子をスイッチオフする場合、これらの他の粒子は、光強度分布の移動や他の粒子のせいで光を受ける前に既にスイッチオフされている。そたがって、他の粒子は、粒子の追跡を妨げるかもしれない光子を放射しない。スイッチオフ信号は、たとえば、活性化されている粒子を、光子を放射するように駆動できない非活性状態に非活性化してもよい。他の実施形態において、スイッチオフ信号は、誘導放射によって、検出される光子を粒子が放射する励起されている分子状態の占有を防止する。このようにして、粒子が組み合わされている光の強度分布及びスイッチオフ信号によって光子を放射するように効果的に駆動される試料内の領域を示す効果的な点像分布関数が光強度分布の最小値を囲んでいる小さい領域に空間的に限定される。

本開示の装置は、光強度分布の最小値を含んでいる体積から放射され、検出器によって検出される光子を計数し、計数された光子の絶対数を示すカウンタを有していてもよい。計数された光子の絶対数を示すことは、１個の粒子によってブリーチされる前に放射されると予測される光子の予測数に対する、粒子について既に計数されている光子のパーセントを示す相対的指示であってもよい。

本開示の装置は、さらなる粒子を駆動して光子を放射させるようにさらなる光を発光する少なくとも１個のさらなる光源を有していてもよい。さらなる光は、光とは、少なくとも１個の光成分の波長または偏光が異なっていてもよい。光源及び少なくとも１個のさらなる光源は、粒子またはさらなる粒子の移動を同時にまたは交互に追跡するように構成されていてもよい。

１個の光源だけを使用して、本開示の装置を、多数の粒子を平行に、つまり実質的に同時に追跡するのに使用してもよい。これは、たとえば、ビーム偏向手段が粒子及び少なくとも１個の他の粒子を光強度分布の最小値を使用して交互に追跡するように構成されることによって達成されてもよい。ビーム偏向手段がたとえば音響光学偏向器または高速電気光偏向器を有している場合、光強度分布の空間的に限定されている最小値を２個または３個以上の粒子に対して、粒子の考え得るどのような移動よりもはるかに速く交互に調整することができる。

以前に指摘しているように、光強度分布の最小値は、検出された時間依存計測信号、つまり検出された光子の割合が時間または軌跡に沿った位置の関数として最小値を特徴とするように、線つまり軌跡に沿って高速で並進移動させることができる。各最小値は、１個の粒子を表している。それぞれの粒子の位置は、計測信号のそれぞれの最小値の位置から直接または数学的な評価後に求めることができる。数学的な評価には、１個の粒子に対する数学的応答を持つ線形または非線形逆たたみ込みが含まれていてもよい。したがって、複数の粒子を高速に高い空間解像度で追跡することができる。

本開示の装置は、放射のために粒子を駆動する光を発光するだけでよいので、その設定は簡単なままでよい。しかし、本開示の装置は、（もしかすると既に存在している）ＳＴＥＤまたはＲＥＳＯＬＦＴ蛍光顕微鏡を元にまたはそれと組み合わせて、実現されてもよい。特に、ＳＴＥＤまたはＲＥＳＯＬＦＴ蛍光顕微鏡内で蛍光を阻止する光のために使用されるビーム成形手段を、本開示においては光子を放射するように粒子を駆動する光に使用してもよい。さらに、試料の走査に使用するビーム偏向手段は、検出される光子の割合を最小にすることによって粒子を追跡するために使用するように容易に適合させることができるかもしれない。本開示をＳＴＥＤまたはＲＥＳＯＬＦＴ蛍光顕微鏡に実装する場合、試料を本開示の方法の実施の前または後、あるいはその間などの任意の時間にＳＴＥＤまたはＲＥＳＯＬＦＴ蛍光顕微鏡法によって追加で撮像する選択肢がある。

ここで図面をより詳細に参照すると、図１は、試料３内の粒子２の移動を追跡する装置１を示している。粒子２は、たとえば、蛍光マーカーであってもよいし、粒子２はそのような蛍光マーカーでマーキングされていてもよい。光源５からの光４によって、蛍光マーカーが駆動され、光子が放射される。これは、試料３内の光４の強度分布の最小値の実質的に外側でだけ発生する。この強度分布は、図３から６を参照してより詳細に説明する。光源５はレーザー６を有している。ビーム成形手段７が所望の光強度分布を対物レンズ８の焦点体積内に形成するために設けられており；ビーム偏向手段９、１０、及び１１が試料３内の光４の強度分布の最小値の位置を調整するために設けられている。ビーム偏向手段９及び１０は光４に直接作用して、最小値をｘ及び／またはｙ方向に、つまり光路に対して横方向に移動つまり偏向させる。しかし、ビーム偏向手段１１は、試料３に直接作用し、光４の強度分布の最小値を試料３に対してｚ方向に移動つまり偏向させる。２色性ビームスプリッタ１３の背後に、点検出器１２が粒子２から放射された光子を選択的に検出するように設けられている。ビームスプリッタ１３は、レーザー６と試料３との間の光路内に、特にレーザー６とビーム偏向手段９および１０との間に位置している。他のビームスプリッタ１４は、ビーム偏向手段９および１０と対物レンズ８との間に位置している。ビームスプリッタ１４を介して、２次元検出器を有しているカメラ１５が試料３を監視している。最初に粒子２を見つけるために、光４が試料３に大きな領域にわたって照射され、粒子２は、粒子２によって放射された光子を元に位置が求められ、カメラ１５を使用して撮像される。それから、粒子２が光の強度分布の最小値の位置に配置されるように、光４の強度分布が粒子２に対して調整される。粒子２が実際に最小値の位置に配置されていることは、光４の強度分布を試料３に対して試行ベースで移動させることによって確認される。これらの移動時に、点検出器１２によって検出される粒子２から放射される光子の割合は増加するはずである。しかし、割合が減少する場合は、粒子２が移動しているので粒子２を最小値を使用して追跡するために光４の強度分布を調整しなければならないことを示している。光４の強度分布が移動していないのに光子の割合が増加するのも、粒子２が試料３内で移動したことを示している。そして、光子の割合が最小値に再び達するまで最小値を使用して粒子２を追跡するには、光４の強度分布を移動させなければならない。この追跡のために、ビーム偏向手段９〜１１は、検出器１２の信号に依存してコントローラ１６によって制御される。追跡時に求められる光４の強度分布の最小値の位置及び／または移動は、試料３内の粒子２の移動に似ている。粒子２の移動の方向は、最小値を使用した粒子の追跡を支援するために、粒子２から放射された光子がカメラ１５によって検出される位置、つまり粒子が最小値から外れる位置から求められてもよい。

図１において、コントローラ１６は、ビーム成形手段７も制御することが示されている。実際に、ビーム成形手段７は、試料３内の光４の様々な強度分布が適切に調整されるようにする空間光変調器であってもよい。これらの光強度分布の最小値は、各々が１次元または２次元に限定されており、試料３内で粒子２が追跡可能な交差部分の共通点だけを有している。本実施形態は、全ての３個の次元において極大空間精度で、試料３内のその移動について粒子２の追跡を可能にする。

図２に示している装置１の実施形態は、図１の点検出器１２を有していない。ここではカメラ１５だけが試料３内の粒子２によって放射された光子を検出するために設けられている。さらに、試料３は、実質的に２個の次元においてのみ延びている試料である。光４の強度分布は、粒子２が追跡されるリング状の最大値によって囲まれている中心最小値を有している。光４のこのドーナツ形状の強度分布は、静的ビーム成形手段７によって生成が促進される。２次元試料３の平面内で、光４の強度分布の最小値は、光４に直接作用するビーム偏向手段９及び１０を使用して配置される。カメラ１５は、対物レンズ８とは反対の試料３の側に配置されているさらなる対物レンズ１７の背後に配置される。ここで、カメラ１５は、試料３内の光４の強度分布の位置を求めるために、追加で使用される。これによって、一方で、ビーム偏向手段９及び１０の現在の位置を求めることができる。他方で、これは、試料内の光４の強度分布の最小値の位置を求めるのに使用することができる。特に、試料内の最小値の位置も回折限界を超えた空間精度で求めることができるかもしれない。

光軸のＺ方向における粒子の移動の方向を求めるために、追加の光学手段を設けることができる（本明細書では不図示）。そのような手段は、重心ベースの単粒子追跡および移動から知られている。手段は、たとえば、非点収差（たとえば、Ｈｕａｎｇ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１９ （２００８）を参照）または２重螺旋検出ＰＳＦ（たとえば、Ｐａｖａｎｉ他、ＰＮＡＳ １０６（２００９）を参照）を使用する。非点収差は、たとえば、円柱レンズを粒子から放射された光子の経路内、つまり試料および検出器またはカメラの間のどこかに挿入することによって実現してもよい。

図３は、試料３内の光４の強度分布を模式的に示しており、粒子２は光強度分布１８の中心の最小値１９に位置している。図４は、（拡大して）図３の試料３を貫通する線プロフィルに沿った光強度分布１８（直線）の強度Ｉを示しているグラフである。最小値１９の領域において、光強度分布１８は最小値１９について対称な正弦曲率を実質的に有している。光強度分布１８に加えて、図３は、粒子２が光４の対応する強度Ｉを受けたと仮定したときに粒子２から放射される光子の結果の割合Ｒ（破線）を示している。最小値１９の位置では、割合Ｒも最小値Ｒｍｉｎを有している。粒子２がこの最小値１９を離れるとすぐに、割合Ｒも急に増加する。特に、最小値１９からの距離が短くても、割合Ｒは最大値Ｒｍａｘに近いか等しい値に既に到達している。この振る舞いは、光強度分布１８の最小値１９を使用して、高い空間精度で、試料３内の粒子２の追跡に使用されるのが有利である。

粒子２が、強度分布１８に対して位置を変え、図５に示しているように最小値１９を離れると、粒子２によって放射される光子の割合Ｒの増加が検出される。強度分布１８を試料３内で試行ベースで移動させることによって、割合が再び減少して極小値を維持する。このようにして、どの方向及びどれだけの距離、粒子２が移動したかが求められるが、それは、割合の最小値が、図６に示しているように最小値１９を有している光強度分布１８が試料３に対して同じ方向に同じ距離だけ移動していないと達成されないからである。粒子２を追跡するために最小値１９を有している強度分布１８を移動させる方向は、粒子２によって放射される光子がカメラによって検出される位置から求められてもよい。

図７に示している装置１の実施形態は、図１に示しているそれとは以下の詳細が異なる。光源５は、白色光２１の源２０及び光４を白色光２１から波長によって選択するセレクタ２２を有している。さらに、図１のただ１個の点検出器１２の代わりに、３個の隣接している点検出器２３〜２５がコントローラ１６への入力を実現している。粒子２から放射される光子および点検出器２３〜２５によって検出される光子の相対数は、試料３内で粒子２が移動している方向を示している。さらに、図７の装置１は、追加のビームスプリッタ２７及び粒子２によって放射される光子の波長用の分析器２８を有している。この実施形態において、偏向手段９及び１０は、粒子２及びさらなる粒子２９の試料３中の移動を交互で追跡するように構成されている。これは、光４の光強度分布の空間的に限定されている最小値が粒子２及び粒子２９のそれぞれの追跡に交互で使用されることを意味している。

図８の装置１の実施形態も、図１の装置１に基づいており、したがって、本明細書では違いについてのみ説明する。図１の点検出器１２は、４個の隣接している点検出器２３から２６に置き換えられている。レーザー６を有しており、光４を発光する光源５以外に、光４の波長成分とは異なる他の波長成分のさらなる光３２を発光するさらなるレーザー３１を有しているさらなる光源３０がある。さらなる光３２は、２色性ビームスプリッタ３３を介して光４と組み合わされる。さらなる光３２がビーム成形手段７によって光４と同じようにさらなる光分布に形成される。この目的のために、ビーム成形手段７は無色である。両方の光源５及び３０はパルス状であるので、光４に応答して粒子２によって放射される光子と、光３２に応答してさらに異なる粒子３４によって放射される光子とは、点検出器２３〜２６の位置で時間的に分離可能である。点検出器２３〜２６は、光４及び３２のそれぞれのパルスの後の特定の時点についての光子の分析にも使用されてもよい。図８の装置１は、同じ追加のビームスプリッタ２７及び図７の装置１のように粒子２によって放射された光子の波長用の分析器２８も有している。

図９は、光子の放射のために粒子を駆動つまり励起する光４のドーナツ形状の光強度分布１８を通るｘ方向の断面を示している。この光高度分布１８には、本開示の方法において検出される光子の放射を防止するスイッチオフ信号の強度分布３５が重ねられている。具体的には、スイッチオフ信号は、誘導放射によって粒子の励起された分子状態を占めないようにするＳＴＥＤ光３６である。強度分布１８及び３５は同心である、つまり両方が最小値１９を共通の中心の位置に示している。しかしｘ方向の光強度分布１８の最大値の間の距離は、ＳＴＥＤ光３６のｘ方向の強度分布３５の最大値の間の距離よりも幾分短い。これは、光４と比べてＳＴＥＤ光３６のより長い波長に対応している。さらに、強度分布３５は、直径を図９の両矢印３７で示している領域の外側では飽和強度Ｉｓを超えている。したがって、この領域内に位置している場合、粒子は効果的に駆動されて光４によって光子を放射し、その他の領域では、検出される光子の放射は、ＳＴＥＤ光３６によって阻止される。

図１０は、図９の２個の重ねられている光強度分布１８及び３５に起因する効果的な点像分布関数ｈｅｆｆを示している。粒子は、両矢印３７で示している領域内に位置している場合にだけ光子を放射するように駆動される。その結果、粒子は、他の粒子が同じ狭い領域内に位置していないかぎり、本開示の方法によって個別に追跡可能である。図９の光強度分布１８に含まれている全体積に、光４によって光子を放射するように同様に駆動される他の粒子がないことは必要ない。

多くの変形及び修正を、本開示の精神及び原理から実質的に離れることなく、本開示の実施形態に対して行ってもよい。そのような修正及び変形の全ては、以下の請求項によって定められるような本開示の範囲に本明細書において含まれることを意図している。

Claims (28)

1. 試料を撮像する方法であって、
   第１の波長成分の光を発光し、
   前記第１の波長成分の光を受けたときに光子を放射するように駆動される粒子のグループから粒子を選択し、
   空間的に限定されている最小値を有している光強度分布を実現するように前記第１の波長成分の光を形成し、
   前記粒子が前記光強度分布の前記空間的に限定されている最小値に位置するように前記光強度分布を前記試料に照射し、
   前記粒子によって放射される前記光子を検出し、
   前記光強度分布の最小値を使用して、前記粒子によって放射される前記光子の割合が最小のままになるように前記光強度分布を前記試料に対して移動させ、前記試料中の前記光強度分布の前記最小値の実際の位置を前記試料中の前記粒子の実際の位置として追跡することによって、前記粒子の移動を追跡する
   ステップを有し、
   前記試料の複数の部分の各々について、前記粒子の滞在時間を求め、
   前記滞在時間の分布を前記試料にわたってマッピングする
   ステップをさらに有することを特徴とする、
   方法。
2. 追跡し、求め、マッピングする前記ステップは、前記粒子のグループから選択された複数の粒子の各々について繰り返される、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１の波長成分とは異なる第２の波長成分のさらなる光をさらに発光し、
   前記さらなる光を受けたときに光子を放射するように駆動される粒子のさらなるグループからさらなる粒子を選択し、
   空間的に限定されているさらなる最小値を有しているさらなる光強度分布を実現するように前記さらなる光を形成し、
   前記さらなる粒子が前記さらなる光強度分布の前記空間的に限定されているさらなる最小値に位置するように前記さらなる光強度分布を前記試料に照射し、
   前記さらなる粒子によって放射される前記光子を検出し、
   前記さらなる光強度分布の最小値を使用して、前記さらなる粒子によって放射される前記光子の割合が最小のままになるように前記さらなる光強度分布を前記試料に対して移動させ、前記試料中の前記さらなる光強度分布の前記さらなる最小値の実際の位置を前記試料中の前記さらなる粒子の実際の位置として追跡することによって、前記さらなる粒子の移動を追跡し、
   前記試料の複数の部分の各々について、前記さらなる粒子のさらなる滞在時間を求め、
   前記さらなる滞在時間の分布を前記試料にわたってマッピングする
   ステップを有する、請求項１または２に記載の方法。
4. 追跡し、求め、マッピングする前記ステップは、前記粒子のグループから選択された複数の粒子と前記粒子のさらなるグループから選択された複数のさらなる粒子の各々とについて繰り返される、請求項３に記載の方法。
5. 前記光強度分布の前記最小値は、少なくとも１個の空間の次元内で空間的に限定されており、
   前記粒子は、前記最小値が空間的に限定されている全ての次元の全ての方向で前記光強度分布の前記最小値を使用して追跡され、
   前記粒子の前記滞在時間が求められている前記試料の前記複数の部分の各々は、前記最小値が空間的に限定されている全ての次元の全ての方向で空間的に限定されている、
   請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記光は、前記光のコヒーレントビームの波面が変調され、前記変調されている波面を備えている前記光の前記ビームが前記光強度分布の前記最小値を干渉パターンの実質的にゼロ強度の点として実現するように前記試料内に集光されている前記光強度分布を実現するように構成されている、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記波面の変調は、前記光強度分布の前記最小値が異なる空間次元において交互に空間的に限定されるように動的に変化する、請求項６に記載の方法。
8. 前記光は、前記光の少なくとも２個のコヒーレントビームが前記光強度分布の前記最小値を、干渉パターンの実質的にゼロ強度の点として実現するように前記試料内の同じ焦点領域内に集光されている前記光強度分布を実現するように構成されている、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記光が、前記空間的に限定されている最小値の空間位置が前記光の波長と共に変化しないような前記光強度分布を実現するように構成される、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記光子は、点検出器によって検出される、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記光子は、少なくとも２個の隣接している点検出器によって検出される、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記粒子の初期の移動の方向は、前記粒子によって放射され、隣接している前記点検出器によって検出される光子の相対的な数から求められる、請求項１１に記載の方法。
13. 前記試料は、カメラを使用して撮像される、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記粒子の開始位置は、前記試料が、前記光を一様に受けたときに、前記カメラを使用して求められる、請求項１３に記載の方法。
15. 前記光強度分布の前記最小値の前記実際の位置は、前記試料によって反射された前記光が前記カメラによって検出された位置を元に求められる、請求項１３または１４に記載の方法。
16. 前記試料内の前記光強度分布の前記最小値の実際の位置は前記試料に対して前記光強度分布を移動するのに使用されるスキャナの実際の設定を元に求められる、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記粒子の初期移動の方向は、前記粒子から放射された前記光子が前記カメラによって検出される位置を元に求められる、請求項１３から１５のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記光は、パルス状態で前記試料に照射され、
    前記粒子によって放射された前記光子は、パルスの各々の後の限定された時間間隔内で検出される、
    請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記光は白色光から選択される、請求項１８に記載の方法。
20. 前記粒子は、多重光子過程によって前記光を受けたときに、光子を放射するように駆動される粒子のグループから選択される、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記粒子によって放射された前記光子は、
    波長、
    偏光、
    絶対速度、
    隣接している点検出器によって検出された相対数、
    同時計数、
    光の各パルス後の検出時点、
    からなる特徴のグループから選択された少なくとも１個の特徴を求めるように分析される、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記光強度分布の前記最小値を含んでいる検出体積から放射された前記光子は、
    波長、
    偏光、
    絶対速度、
    隣接している点検出器によって検出された相対数、
    同時計数、
    光の各パルス後の検出時点、
    からなる特徴のグループから選択された少なくとも１個の特徴を求めるように分析され、求められた少なくとも１個の前記特徴は、分析されている光子を放射した１個の粒子との適合を確認される、
    請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 粒子の前記グループに属する前記試料内の複数の粒子は、前記複数の粒子の少なくとも１個の前記粒子をブリーチングすることで減少する、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記粒子は、前記粒子が前記光によって光子を放射するように駆動できない第１の状態から、前記粒子が前記光によって光子を放射するように駆動できる第２の状態に活性化可能な前記粒子の部分グループから選択される、請求項１から２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記粒子は、多重光子過程の活性化光によって前記第１の状態から前記第２の状態に活性化可能な前記粒子の部分グループから選択され、
    前記粒子は、前記試料内に集光されている前記活性化光によって活性化される、
    請求項２４に記載の方法。
26. スイッチオフ信号には前記光強度分布を含んでいる信号強度分布が備わっており、前記スイッチオフ信号は前記光を受けたときに光子を放射するように駆動される粒子の前記グループに属している他の粒子をスイッチオフする、請求項１から２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記粒子によって放射され、検出される前記光子は、計数され、
    前記粒子から放射され検出されている前記光子の絶対数が示される、
    請求項１から２６のいずれか１項に記載の方法。
28. 粒子の前記グループから選択された２個の粒子の移動は、前記光強度分布の前記最小値を使用して交互に追跡される、請求項１から２７のいずれか１項に記載の方法。

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