JP6416628B2 - 標的変異体αヘリックスバンドルサイトカイン - Google Patents

Description

本発明は、αヘリックスバンドルサイトカイン受容体を媒介として低下した活性を有し、標的細胞に特異的に送達される、修飾されたαヘリックスバンドルサイトカインに関する。好ましくは、前記αヘリックスバンドルサイトカインは変異体であり、より好ましくは、インターフェロン受容体への低い親和性を有し、標的細胞に特異的に送達される、変異体インターフェロンである。標的化は、修飾αヘリックスバンドルサイトカインの、標的化部分への、好ましくは抗体への融合により、実現される。本発明はさらに、かかる標的修飾αヘリックスバンドルサイトカインの、疾患を処置するための使用に関する。好ましい態様は、標的変異体インターフェロンの、疾患、好ましくはウイルス性疾患および腫瘍を処置するための使用である。

サイトカインは、細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を果たす小さなタンパク質である。サイトカインはそれらの構造に基づいて分類することができ、最大のグループは４αヘリックスバンドルファミリーである。このファミリーは、受容体の使用に基づいてさらに、インターフェロン（ＩＦＮ）およびインターロイキン（ＩＬ）−２、−３、−１０、および−１２のサブファミリーに分けることができる。αヘリックスバンドルサイトカインは、ヒト疾患の処置のための可能な生物医薬品として重要である；非限定的な例として、エリスロポエチンは貧血または赤血球欠乏の処置に、ソマトトロピンは成長ホルモン欠損症に、およびインターロイキン２は癌の処置に使用される。

αヘリックスバンドルサイトカインの中で、Ｉ型ＩＦＮは、重要な生物学的機能を有するサイトカインファミリーに属している。ヒトには１７種類の異なるＩ型ＩＦＮ（１３α、β、ε、κ、ω）があり、それは、２つの鎖ＩＦＮＡＲ１とＩＦＮＡＲ２とから構成された、普遍的に発現される細胞表面受容体を介してシグナル伝達する。ＩＦＮ受容体複合体が集合すると、細胞型に依存して、細胞分化および／または機能を変更するいくつかのシグナル伝達経路の活性化が開始される。
Ｉ型ＩＦＮは、事実上すべての細胞型に作用することにより、増殖性ウイルス感染を防止することができる。また顕著な抗血管新生およびアポトーシス促進効果を発揮する。Ｉ型ＩＦＮはまた、先天性および適応性免疫のいくつかの機能の調節および骨の恒常性に深く関与している。これは特に、樹状細胞および破骨細胞の活性化／分化に作用する。Ｉ型ＩＦＮ系は実際、哺乳動物の健康に決定的に重要である。

マウスでの前臨床試験により、ウイルス性または腫瘍性疾患の両方の処置のための、Ｉ型ＩＦＮの顕著な有効性が確立された。注目に値するのは、ＩＦＮ処置により実験的腫瘍が治癒したマウスが、初発腫瘍に対して免疫化されていることが見出されたことであり、ＩＦＮが腫瘍拒絶のプロセスに関与するだけでなく、腫瘍に対する免疫寛容を破壊するよう作用することを示唆する。これらの研究に基づき、ＩＦＮαは、ウイルス感染および癌の両方の処置のために診療で承認された。より最近では、ＩＦＮβは再発寛解型多発性硬化症に有効であることが示され、また、この病理学のためにも承認された。しかし残念なことに、ＩＦＮの臨床効果はしばしば期待外れであることが見出され、今日では、可能な場合には、特定の抗ウイルス化合物、化学療法およびモノクローナル抗体などの他の治療戦略が、ＩＦＮの広範な適用に大きく取って代わっている。今日ではＩＦＮは、ＨＢＶおよびＨＣＶ慢性感染症および限定数の腫瘍に対してのみ、第一の治療選択肢である。

臨床診療におけるＩ型ＩＦＮの有効性は、インフルエンザ様症候群、うつ病、肝毒性、自己免疫疾患、甲状腺機能障害、および体重減少などの重大な全身毒性および副作用がゆえに無効な投薬により、制限される。したがって、ＩＦＮで処置されるべき細胞集団（例えば、感染した器官または腫瘍塊）またはＩＦＮで活性化されるべき細胞集団（例えば、免疫細胞のサブセット）のみに向けてＩＦＮの活性を標的とすることは、非常に価値がある。
サイトカインの全身毒性を解決または制限するために、抗体−サイトカイン融合タンパク質によるサイトカインの特異的標的化が提案されている（Ortiz-Sanchez et al., 2008）。Rossi et al. (2009)は、ＣＤ２０を標的とした四量体ＩＦＮα、およびＢ細胞リンパ腫の治療におけるその使用を具体的に開示している。しかし、融合ではその生物学的活性が維持され、市販のペグ化ＩＦＮよりもさらに活性であり、これは、ヒトの処置における望ましくない副作用が依然として存在し、またはさらに深刻になるだろうことを意味する。WO2009039409は、標的ＩＦＮとそのアポトーシス活性および抗腫瘍活性を開示している。この特許出願は、標的化部分としての抗体の、野生型ＩＦＮとの、また変異型ＩＦＮとの融合を開示している。しかしながら、ＩＦＮ断片は、その内因性活性を少なくとも８０％のレベルで、または野生型ＩＦＮよりも高いレベルで保持すべきであると述べられている。このケースではまた、融合は、野生型の望ましくない副作用も保持する。

驚くべきことに、我々は、αヘリックスバンドルサイトカイン受容体に対する低下した親和性とその結果としての特定の低下した生物活性を有する、修飾αヘリックスバンドルサイトカインを、標的化部分に融合させることができ、ここで生物活性は標的細胞に向けては回復されるが、しかし構築物が標的としない細胞に向けては回復されない、ということを見出した。かかる構築物は、標的細胞に対する生物活性を保持しつつ、より少ない副作用、特により低い全身毒性を有するという、従来技術に優る利点を有する。

本発明の第１の側面は、αヘリックスバンドルサイトカイン受容体に対する低下した親和性を特徴とする修飾αヘリックスバンドルサイトカイン、および標的化部分を含む、標的化構築物である。αヘリックスバンドルサイトカインは当業者に知られており、限定はされないが、以下を含む：カルジオトロフィン様サイトカインＮＮＴ−１、毛様体神経栄養因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、カルジオトロフィン−１、エリスロポエチン、ＦＬＴ３リガンド、ソマトトロピン、インターフェロンα−１、２、４、５、６、７、８、１０、１３、１４、１６、１７、２１、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンκ、インターフェロンε、インターフェロンτ-１、インターフェロンω−１、インターロイキン２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２α鎖、１３、１５、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２７、２８Ａ、２９、３１、幹細胞因子、レプチン、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、プロラクチン、およびトロンボポエチン。αヘリックスバンドルサイトカインのレビューについては、Conklin (2004)を参照のこと。修飾αヘリックスバンドルサイトカインとは、αヘリックスバンドルサイトカインが、受容体への親和性が変化するように変更されて、最終的に修飾αヘリックスバンドルサイトカインが、受容体に正常に結合する内在性野生型サイトカインと比較して、受容体に対して低下した親和性を有し、その結果低下した生物学的活性を有することを意味する。かかる修飾は、正常な野生型サイトカインの活性を低下させる修飾であってよく、または、相同な非内在性αヘリックスバンドルサイトカイン（例えば、限定はされないが、ヒトαヘリックスバンドルサイトカイン受容体に結合する、マウスαヘリックスバンドルサイトカイン）の親和性を増加させる修飾であってもよい。

修飾は、当業者に周知の、活性を減少または増加させる任意の修飾であってよく、これには、限定はされないがペグ化およびグリコシル化などの化学的および／または酵素修飾、他のタンパク質への融合および突然変異を含む。好ましくは、修飾は突然変異であり、さらにより好ましくは、αヘリックスバンドルサイトカインの親和性を低下させる突然変異である。本明細書で使用される場合、低下した親和性およびその結果として低下した生物学的活性とは、修飾αヘリックスバンドルサイトカインが、受容体に正常に結合するαヘリックスバンドルサイトカインと比較して、αヘリックスバンドルサイトカインの７０％未満の生物学的活性を有すること、さらにより好ましくはαヘリックスバンドルサイトカインの６０％未満の生物学的活性を有すること、さらに好ましくはαヘリックスバンドルサイトカインの５０％未満の生物学的活性を有すること、さらに好ましくはαヘリックスバンドルサイトカインの４０％未満の生物学的活性を有すること、さらに好ましくはαヘリックスバンドルサイトカインの３０％未満の生物学的活性を有すること、さらに好ましくはαヘリックスバンドルサイトカインの２０％未満の生物学的活性を有すること、さらに好ましくはαヘリックスバンドルサイトカインの１０％未満の生物学的活性を有すること、を意味する。好ましくは、修飾αヘリックスバンドルサイトカインは、野生型αヘリックスバンドルサイトカインの変異体であり、活性は、野生型αヘリックスバンドルサイトカインと比較される。親和性および／または活性は、当業者に知られている任意の方法によって測定することができる。好ましくは、活性は、ＳＴＡＴリン酸化を測定および定量することによって測定される。

本発明の好ましい態様は、ＩＦＮ受容体に対する低下した親和性を特徴とする変異体ＩＦＮおよび標的化部分を含む、標的化構築物である。ＩＦＮは任意のＩＦＮであることができ、限定はされないが、ＩＦＮα、 ＩＦＮβおよびωを含む。本明細書で用いる場合、変異体ＩＦＮは、受容体に対してより低い親和性と、その結果としてより低い抗増殖活性および／またはより低い抗ウイルス活性を有する、任意の変異体であることができる。実際、Piehler et al. (2000)によって示されるように、相対的親和性は、相対的な抗増殖活性および相対的な抗ウイルス活性と直接相関する。野生型ＩＦＮ受容体に対する親和性と比較した、変異体ＩＦＮ受容体に対する親和性は、Brecht et al. (1993)によって記載されるように、フロースルー条件下で反射率測定干渉分光法によって測定することができる。変異体は、点変異体、欠失または挿入変異体、またはそれらの組み合わせであってもよい。好ましくは、変異体ＩＦＮは、アクティブな突然変異誘発により、例えば限定はされないがポリメラーゼ連鎖反応増幅による部位特異的突然変異誘発により得られる。好ましくは、変異体ＩＦＮは、野生型ＩＦＮの生物学的活性の７０％未満の生物学的活性を有し、さらにより好ましくは野生型ＩＦＮの生物学的活性の６０％未満、さらに好ましくは野生型ＩＦＮの生物学的活性の５０％未満、さらに好ましくは野生型ＩＦＮの生物学的活性の４０％未満、さらに好ましくは野生型ＩＦＮの生物学的活性の３０％未満、さらに好ましくは野生型ＩＦＮの生物学的活性の２０％未満、最も好ましくは推定された野生型（すなわち、変異体ＩＦＮを得るためにコード配列が突然変異した、野生型ＩＦＮ）の生物学的活性の１０％未満を有する（）。ＩＦＮの変異体は、当業者に知られている。非限定的な例として、ＩＦＮα２変異体はPiehler et al. (2000)にリストされている。好ましくは、前記ＩＦＮはＩ型ＩＦＮである。さらにより好ましくは、変異体はＩＦＮαであり、さらにより好ましくは、変異体はＩＦＮα２である。より好ましくは、ＩＦＮα２変異体は、領域１４４〜１５４の、好ましくは位置１４８、１４９、および／または１５３の、１または２以上のアミノ酸において突然変異しており、さらにより好ましくは、変異体ＩＦＮα２は、ＩＦＮα２ Ｌ１５３Ａ、ＩＦＮα２ Ｒ１４９ＡおよびＩＦＮα２ Ｍ１４８Ａからなる群から選択される。最も好ましくは、変異体は、ＩＦＮα２ Ｌ１５３ＡおよびＩＦＮα２ Ｒ１４９Ａからなる群から選択される。

好ましくは、前記受容体はＩＦＮＡＲ２である。
好ましくは、前記標的化部分は、ＩＦＮ受容体を発現する細胞、好ましくはＩＦＮＡＲ２を発現する細胞上で発現されるマーカーに、標的化される。１つの好ましい態様において、標的化部分は、組織特異的マーカーに指向される。好ましくは、組織は癌組織である。癌は任意の癌であってよく、限定はされないが、Ｂ細胞リンパ腫、肺癌、乳癌、結腸直腸癌または前立腺癌を含む。別の好ましい態様において、標的化部分は、ＨＥＲ２およびＣＤ２０からなる群から選択されるマーカーに指向される。さらに別の好ましい態様において、標的化部分は、限定はされないが例えばインフルエンザＭ２タンパク質、ＬＭＰ１およびＥＢＶタンパク質などのウイルス感染細胞に特異的な細胞表面マーカーに指向される。さらに別の態様において、標的化部分は、ＤＣ−ＳＴＡＭＰまたはＲＡＮＫなどの破骨細胞マーカーに指向される。実際にＩＦＮ−βは、ＲＡＮＫおよびＩＦＮＡＲ共発現細胞により制御される、骨恒常性に重要な役割を果たすことが知られている（Abraham et al., 2009）。また別の態様において、標的化部分は、ＩＦＮがその活性および／または分化を調節し得る免疫細胞型の表面上に特異的に発現されるマーカーに指向される。樹状細胞およびいくつかの免疫細胞上に特異的に発現されるマーカーＰＤＬ２は、その１つの例である。

標的化部分とは、本明細書で用いる場合、当業者に周知の、特異的に結合するタンパク質複合体の一部としてのタンパク質、または任意の特異的に結合するタンパク質またはタンパク質断片などであり得る。これには、限定はされないが以下が含まれる：炭水化物結合ドメイン（ＣＢＤ）（Blake et al, 2006）、レクチン結合タンパク質、重鎖抗体（ｈｃＡｂ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ミニボディ（Tramontano et al., 1994）、ラクダ科動物重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）、新たな抗原受容体の可変ドメイン（ＶＮＡＲ）、アフィボディ（Nygren et al., 2008）、アルファボディ（alphabodies）（WO2010066740）、設計されたアンキリン反復ドメイン（ＤＡＲＰｉｎｓ）（Stumpp et al., 2008）、アンチカリン（Skerra et al., 2008）、knottins（Kolmar et al., 2008）、および操作されたＣＨ２ドメイン（ナノ抗体；Dimitrov, 2009）。好ましくは、標的化部分は、単一のポリペプチド鎖からなり、翻訳後修飾されない。さらに好ましくは、標的化部分はナノボディである。

標的化構築物は、当業者に知られている任意の標的化構築物であることができる。非限定的な例として、標的化部分は変異体インターフェロンに化学的に連結されてもよく、またはこれは組換え融合タンパク質であってもよい。好ましくは、標的化構築物は、組換え融合タンパク質である。標的化部分は、変異体ＩＦＮに直接融合してもよく、またはリンカー断片の助けにより融合してもよい。標的化部分は、変異型ＩＦＮのアミノ末端またはカルボキシ末端に融合することができる；好ましくは、標的化部分は、変異型ＩＦＮ分子のアミノ末端で融合される。
本発明の別の側面は、医薬として使用するための本発明の標的化構築物である。

本発明のさらに別の側面は、癌を処置するための医薬の製造のための、本発明の標的化構築物の使用である。
本発明のさらに別の側面は、ウイルス性疾患を処置するための医薬の製造のための、本発明の標的化構築物の使用である。非限定的な例としては、ウイルス性疾患は、ＨＩＶ感染症、ＨＢＶ感染症またはＨＣＶ感染症であってよい。
本発明の別の側面は、癌の処置における使用のための、本発明の標的化構築物である。

本発明のさらに別の側面は、ウイルス性疾患の処置における使用のための、本発明の標的化構築物である。非限定的な例としては、ウイルス性疾患は、ＨＩＶ感染症、ＨＢＶ感染症またはＨＣＶ感染症であってよい。
本発明のさらに別の側面は、例えば限定はされないが骨粗しょう症などの、骨の分解を伴う疾患の処置における使用のための、本発明の標的化構築物である。
本発明のさらに別の側面は、本発明の標的化構築物および好適な賦形剤を含む、医薬組成物である。当業者にとって、かかる医薬組成物は単独で、または併用処置、例えば限定はされないが化学療法との併用などにおいて、用いることができる。

図１は、ナノボディ−ＩＦＮ融合タンパク質の構造要素を表す図である。 図２は、ＨＬ１１６細胞（パネルＡおよびＢ）またはマウスレプチン受容体（ｍＬＲ）を発現するＨＬ１１６細胞（パネルＣおよびＤ）上で、示されたＩＦＮ製剤により誘導されるホタルルシフェラーゼ活性の図である。パネルＡとＣ、およびパネルＢとＤは、２つの別個の実験で生成された。そのため、垂直方向の比較のみが可能である（パネルＡ対パネルＣ、またはパネルＢ対パネルＤ）。 図３は、レプチン受容体およびＩＦＮ誘導性ホタルルシフェラーゼを発現する細胞の１：１の共培養物における、またはＩＦＮ誘導性ウミシイタケルシフェラーゼを発現するが、レプチン受容体を欠く細胞における、ナノボディ−ＩＦＮα２Ｒ１４９ＡによってまたはＩＦＮα２（７ｐＭ）によって誘導される、ウミシイタケ（薄灰色）およびホタル（濃灰色）のルシフェラーゼ活性を示す図である。ルシフェラーゼ活性は、３ｎＭのＩＦＮα２によって誘導されたルシフェラーゼ活性のパーセンテージとして表す。

図４は、ｍＬＲを標的とする、精製された構築物の活性を示す図である：Ａ．標的を発現する細胞（ＨＬ１１６−ｍＬＲ）、または標的を欠く細胞（ＨＬ１１６）でのそれらの特異的活性の定量化。Ｂ．異なる構築物の標的化効率の算出。 図５は、非抱合型レプチン受容体結合ナノボディの存在下および不在下での、構築物４−１１−ＩＦＮＡ２−Ｒ１４９Ａの活性を示す図である。ｍＬＲを発現するＨＬ１１６細胞は、ＩＦＮ−α２（ＩＦＮＡ２）またはナノボディ４−１１に融合したＩＦＮＡ２−Ｒ１４９Ａ（ナノボディ−ＩＦＮＡ２−Ｒ１４９Ａ）を、遊離の４−１１ナノボディの１００倍モル過剰の存在下または不在下（対照）におけるそれぞれのＥＣ５０濃度で用いて、６時間インキュベートした。 図６は、レプチン結合ナノボディ４−１０を用いた、変異体ＩＦＮの標的化を示す図である。

図７は、ｍＬＲを発現するＨＬ１１６細胞において、ナノボディ−ＩＦＮα２Ｒ１４９Ａによって、抗ＩＦＮＡＲ１モノクローナル抗体６４Ｇ１２の存在下（Benoit et al. J. Immunol. 150, 707-716. 1993）、または抗ＩＦＮＡＲ２モノクローナル抗体ＭＭＨＡＲ２の存在下（ＰＢＬインターフェロンソース）において誘導された、ホタルルシフェラーゼ活性を示す図である。 図８は、４−１１−ＩＦＮＡ２−Ｒ１４９Ａの、ｍＬＲを発現するＨＬ１１６細胞への標的化の特異性を示す図である。Ａ：親のＩＦＮＡ２（左上パネル）または４−１１−ＩＦＮＡ２−Ｒ１４９Ａ（左下のパネル）の、ＨＬ１１６細胞（濃灰色の記号）またはＨＬ１１６−ｍＬＲ（薄灰色の記号）に対するＥＭＣＶの細胞変性効果。Ｂ．上パネル：抗ウイルス活性について算出されたＥＣ５０；下パネル：算出された標的化効率。 図９は、ＩＦＮα２（パネルＡ）およびナノボディ−ＩＦＮα２Ｒ１４９Ａ（２Ｒ５Ａ；パネルＢ）の、異なる数のＨｅｒ２分子をその表面で発現するＢＸＰＣ３およびＢＴ４７４細胞（それぞれ１０．９×１０^３および４７８×１０^３）に対する、特異的活性（ＥＣ５０）を示す図である。パネルＡの縦軸スケールとパネルＢの縦軸スケールは比較不能である。

図１０は、１Ｒ５９Ｂ−ＩＦＮＡ２−Ｑ１２４Ｒの、ヒトＨｅｒ２発現マウス細胞への標的化を示す図である。Ｈｅｒ２発現有りまたはなしでの、ＢＴＧ９Ａ細胞におけるＯＡＳＬ２ ｍＲＮＡ発現の定量化。 図１１は、一本鎖抗体を用いた、変異体ＩＦＮＡ２の、ヒトＨｅｒ２発現マウス細胞への標的化を示す図である。Ｈｅｒ２発現有りまたはなしでの、ＢＴＧ９Ａ細胞におけるＩＳＧ１５ ｍＲＮＡ発現の定量化。 図１２は、Ｈｅｒ２リン酸化の活性の制御を示す図である：レーン１３から７６：異なる濃度（レーン３〜５については２００ｐＭ、レーン６については２ｎＭ））および時間（レーン３：５分、レーン４および６：１０分、レーン５：３０分）にて構築物１Ｒ５９Ｂ−ＩＦＮＡ２−Ｑ１２４Ｒで処理した、ヒトＨｅｒ２を発現するＢＴＧ９Ａ細胞の抽出物中に、リン酸化Ｈｅｒ２は存在せず。レーン７および８：ヒトＢＴ４７４細胞株におけるリン酸化Ｈｅｒ２を検出するための対照。レーン１、ＢＴＧ９Ａ細胞の抽出物。レーン２：ヒトＨｅｒ２を発現するＢＴＧ９Ａ細胞の抽出物。

図１３は、抗ＰＤ−Ｌ２ １２２−ＩＦＮＡ２−Ｑ１２４Ｒの、内因的にＰＤ−Ｌ２を発現するマウス初代細胞への標的化を示す図である。活性化は、ＳＴＡＴのリン酸化として測定する。薄灰色の領域はＰＤ−Ｌ２陰性細胞集団を表し；濃灰色の領域はＰＤ−Ｌ２陽性集団を表す。 図１４は、１２２−ＩＦＮＡ２−Ｑ１２４Ｒの、ＰＤ−Ｌ２を発現する細胞へのin vivo標的化を示す図である。マウスには、腹腔内（ＩＰ）または静脈内（ＩＶ）に、ＰＢＳ、対照構築物（変異体ＩＦＮＡ２−Ｑ１２４Ｒに融合したＧＦＰに対するナノボディ、「対照」と表示）、または標的変異体ＩＦＮ（ＰＤ−Ｌ２に標的化、Ｎｂ１２２−ＩＦＮ２−Ｑ１２４Ｒ、「１２２−Ｑ１２４Ｒ」と表示）のいずれかを注射した。薄灰色の領域はＰＤ−Ｌ２陰性細胞集団を表し；濃灰色の領域はＰＤ−Ｌ２陽性集団を表す。

図１５は、マウスにおける、１２２−ＩＦＮ−Ｑ１２４ＲのＩＶ注射後の用量反応曲線を示す図である。薄灰色の領域はＰＤ−Ｌ２陰性細胞集団を表し；濃灰色の領域はＰＤ−Ｌ２陽性集団を表す。 図１６は、標的変異体レプチンにより誘導されたレプチン依存性増殖を示す図である：変異体レプチンの活性の喪失は、ヒトＴＮＦＲ１を発現するＢａ／Ｆ３細胞において取り戻すことができる。上パネル：Ｈ６−レプチン構築物を用いた実験；下パネル：ｍレプチン構築物を用いた実験。Ｈ６は、ｈｉｓタグを示す（６×ｈｉｓ）。 図１７は、標的レプチン構築物の構築を示す図である。実施例

例における材料および方法
ナノボディおよびＳｃＦｖ
マウスレプチン受容体に指向されたナノボディ４−１１は、Zabeau et al. (2012)および特許WO 2006/053883に記載された。そのコード配列を、ＳＩｇｋリーダーペプチド、ＨＡタグ、およびアルブミンと融合した哺乳動物発現ベクターｐＭＥＴ７（Takebe et al., 1988）にクローニングする。プラスミド名：ｐＭＥＴ７ ＳＩｇＫ−ＨＡ−４．１１−アルブミン。
ナノボディ４−１０もまた、Zabeau et al. (2012)に記載されている。
抗Ｈｅｒ２ナノボディ１Ｒ５９Ｂおよび２Ｒ５Ａは、Vaneycken et al. (2011)に記載されている。これらを、ｐＭＥＴ７ベクター中のヒトＩＦＮＡ２−Ｑ１２４ＲおよびヒトＩＦＮＡ２−Ｒ１４９Ａに融合させた。融合タンパク質は、２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって生成した。
抗ＰＤ−Ｌ２ナノボディ１２２は、Johan Grooten（VIB）からのものであった。これは、ｐＭＥＴ７ベクター中のヒトＩＦＮＡ２−Ｑ１２４Ｒに融合させた。融合タンパク質は、２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって生成され、HisPur Ni-NTA精製キット（Pierce, Thermo Scientific）を用いて精製した。
抗ＴＮＦナノボディは、Claude Libert（VIB）から入手した。
抗Ｈｅｒ２ ＳｃＦｖは、Andrea Pluckthun（Worn et al., 1998）から入手した。これを、ｐＭＥＴ７ベクター中のヒトＩＦＮＡ２−Ｑ１２４Ｒに融合させた。融合タンパク質は、２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって生成した。
ＧＦＰに対する対照ナノボディは、Katrien Van Impe（University Ghent）から入手した。

インターフェロン
ＩＦＮα２および、それぞれ１０および１００倍の係数で低減されたＩＦＮＡＲ２親和性を示す変異体Ｌ１５３ＡおよびＲ１４９Ａは、Roisman et al., (2001)に記載されている。ＩＦＮコード配列を、ｙｂｂＲタグに融合したｐＴ３Ｔ７ベクター（Stratagene）にクローニングする。プラスミド名：ｐＴ７Ｔ３ｙｂｂＲ−ＩＦＮａ２、ｐＴ７Ｔ３ｙｂｂＲ−ＩＦＮａ２−Ｌ１５３Ａ、ｐＴ７Ｔ３ｙｂｂＲ−ＩＦＮａ２−Ｒ１４９Ａ。
ヒトＩＦＮＡ２ Ｑ１２４Ｒは、マウスＩＦＮＡＲ１鎖に対して高い親和性を、およびマウスＩＦＮＡＲ２鎖に対して低い親和性を有する（Weber et al., 1987）。

ナノボディ−ＩＦＮ融合の構築
ＩＦＮα２、野生型、Ｌ１５３ＡおよびＲ１４９Ａのコード配列を、対応するｐＴ３Ｔ７ｙｂｂＲ ＩＦＮａ２プラスミドから、Roche DiagnosticsからのExpand High FidelityＰＣＲシステムおよび次のプライマーを用いて合成した：フォワード：５’ＧＧＧＧＧＧＴＣＣＧＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＣＴＧＣＴＴＣＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＧＴＧＡＴＡＧＣＣＴＧＧＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣ３’、リバース：５’ＣＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＴＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣ３’。このＰＣＲにより、Ｈｉｓタグおよび５プロリン−アラニン−セリン（ＰＡＳ）反復のシリーズが、ＩＦＮのアミノ末端に導入される。ＰＣＲ産物をＢｓｐＥＩおよびＸｂａＩで消化し、ＢｓｐＥＩ−ＸｂａＩ消化ｐＭＥＴ７ ＳＩｇＫ−ＨＡ−４．１１−アルブミンベクター中にクローニングして、ｐＭＥＴ７ ＳＩｇＫ−ＨＡ−４．１１−Ｈｉｓ−ＰＡＳ−ｙｂｂｒ−ＩＦＮＡ２、ｐＭＥＴ７ ＳＩｇＫ−ＨＡ−４．１１−Ｈｉｓ−ＰＡＳ−ｙｂｂｒ−ＩＦＮＡ２−Ｌ１５３ＡおよびｐＭＥＴ７ ＳＩｇＫ−ＨＡ−４．１１−Ｈｉｓ−ＰＡＳ−ｙｂｂｒ−ＩＦＮＡ２−Ｒ１４９Ａを得た。
同様の方法で、ヒト変異体Ｑ１２４Ｒを１Ｒ５９Ｂナノボディおよび抗ＰＤ−Ｌ２ナノボディに融合した。

ナノボディ−ＩＦＮ融合タンパク質の生成
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で増殖させた。これらを、ｐＭＥＴ７ ＳＩｇＫ−ＨＡ−４．１１−Ｈｉｓ−ＰＡＳ−ｙｂｂｒ−ＩＦＮＡ２、ｐＭＥＴ７ ＳＩｇＫ−ＨＡ−４．１１−Ｈｉｓ−ＰＡＳ−ｙｂｂｒ−ＩＦＮＡ２−Ｌ１５３Ａ、ｐＭＥＴ７ ＳＩｇＫ−ＨＡ−４．１１−Ｈｉｓ−ＰＡＳ−ｙｂｂｒ−ＩＦＮＡ２−Ｒ１４９Ａ、ｐＭＥＴ７ ＳＩｇＫ−ＨＡ−２Ｒ５Ａ−Ｈｉｓ−ＰＡＳ−ｙｂｂｒ−ＩＦＮＡ２−Ｒ１４９Ａ、ｐＭＥＴ７ ＳＩｇＫ−ＨＡ−１Ｒ５９Ｂ−Ｈｉｓ−ＰＡＳ−ｙｂｂｒ−ＩＦＮＡ２−Ｑ１２４Ｒ、ｐＭＥＴ７ ＳＩｇＫ−ＨＡ−４Ｄ５−Ｈｉｓ−ＰＡＳ−ｙｂｂｒ−ＩＦＮＡ２−Ｑ１２４ＲまたはｐＭＥＴ７ ＳＩｇＫ−ＨＡ−１２２−Ｈｉｓ−ＰＡＳ−ｙｂｂｒ−ＩＦＮＡ２−Ｑ１２４Ｒにて、リポフェクタミン（Invitrogen）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、培養培地を採取し、−２０℃で保存した。
代替的に、異なるナノボディ−ＩＦＮ融合体をコードする配列を、バキュロウイルストランスファープラスミドｐＢＡＣ−３（Novagen）にサブクローニングした。タンパク質は、昆虫細胞によって、BacVectorキット（Novagen）を用いて生成し、HisPur Ni-NTA精製キット（Pierce, Thermo Scientific）およびゲル濾過を用いて均一に精製した。タンパク質濃度は、２８０ｎｍでの吸光度によって測定した。

ＩＦＮレポーター細胞株
ＨＬ１１６クローン（Uze et al. 1994）は、ヒトＨＴ１０８０細胞株に由来する。これは、ＩＦＮ誘導性６−１６プロモーターによって制御されるホタルルシフェラーゼ遺伝子を含む。ＨＬ１１６細胞を、マウスレプチン受容体の短いアイソフォームをコードする発現ベクター（ｐＭＥＴ７ ｍＬＲｓｈ−ＦＬＡＧ、Eyckerman et al., 1999）およびｐＳＶ２ｎｅｏ（Southern and Berg 1982）と共に同時トランスフェクションした。安定してトランスフェクトされたクローンを、Ｇ４１８含有培地中で単離した。クローン１０の選択は、ＦＡＣＳによるマウスレプチン受容体の表面発現レベルの分析後に、R&Dからのビオチン化抗マウスレプチン受容体抗体ＢＡＦ４９７およびストレプトアビジン−ＡＰＣ（BD bioscience）を用いて行った。
ＨＴ１０８０細胞は、ｐ６−１６−ＲＬ、すなわちＩＦＮ誘導性６−１６プロモーターによって制御されるウミシイタケルシフェラーゼ（ＰＲＬ−ヌルから、Promega）をコードするプラスミド、ｐＢＢ３（Bourachot et al. 1982）、およびサケ精子ＤＮＡ（Sigma）と共に同時トランスフェクションした。安定してトランスフェクトされたクローンを、ＨＡＴ含有培地中で単離した。クローン４は、ＩＦＮ誘導の際のウミシイタケルシフェラーゼ活性の高レベルの誘導について選択した。
ヒト膵臓癌ＢＸＰＣ３（Tan et al., 1986；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１６８７）および乳癌ＢＴ４７４（Lasfargues et al., 1979；ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−２０）細胞株は、ＡＴＣＣから入手した。マウスＢＴＧ９Ａ細胞は、Uze et al. (1990)に記載されている。

ルシフェラーゼ活性の測定
ＩＦＮ特異的活性を、ＨＬ１１６細胞内およびｍＬＲを発現するＨＬ１１６クローン１０上で誘導されるルシフェラーゼ活性を定量することにより測定した。ＥＣ５０は、GraphPad Prismソフトウェアでの非線形データ回帰を用いて算出した。
ルシフェラーゼ活性は、Berthold centro LB960ルミノメーターで、PromegaのFirefly Luciferase Assay SystemまたはDual-Luciferase Reporter Assay Systemのいずれかを使用して、ＩＦＮ刺激の６時間後に決定した。

定量的ＲＴ−ＰＣＲ
インターフェロン誘導性遺伝子６−１６の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより、ＧＡＰＤＨまたはβアクチンに相対的に定量した。細胞を、標的ＩＦＮまたは対照ＩＦＮで４時間処理した。全ＲＮＡは、RNeasyカラム（Qiagen）で精製した。逆転写は、ランダムプライマーでプライミングし、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Invitrogen）を用いて実施した。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、Light Cyclerを使用し記載のようにして（Coccia et al. 2004）実施した。
Ｈｅｒ２については、トランスフェクション培養培地のアッセイは、マウスＢＴＧ９ＡおよびヒトＨｅｒ２を発現するＢＴＧ９Ａ細胞上で、βアクチン遺伝子発現に相対的なＯＡＳＬ２遺伝子発現について、定量的ＲＴ−ＰＣＲによりLight Cycler（Roche）および以下のプライマーを使用して実施した：ＯＡＳＬ２フォワード：ＣＡＣ−ＧＡＣ−ＴＧＴ−ＡＧＧ−ＣＣＣ−ＣＡＧ−ＣＧＡ；ＯＡＳＬ２リバース：ＡＧＣ−ＡＧＣ−ＴＧＴ−ＣＴＣ−ＴＣＣ−ＣＣＴ−ＣＣＧ；βアクチンフォワード：ＡＧＡ−ＧＧＧ−ＡＡＡ−ＴＣＧ−ＴＧＣ−ＧＴＧ−ＡＣ；βアクチンリバース：ＣＡＡ−ＴＡＧ−ＴＧＡ−ＴＧＡ−ＣＣＴ−ＧＧＣ−ＣＧＴ。同様の方法で、Ｈｅｒ２標的細胞におけるＩＳＧ発現を、同じβアクチンプライマーおよび以下のＩＳＧ１５プライマーを使用して測定した：ＩＳＧ１５フォワード：ＧＡＧ−ＣＴＡ−ＧＡＧ−ＣＣＴ−ＧＣＡ−ＧＣＡ−ＡＴ；ＩＳＧ１５リバース：ＴＴＣ−ＴＧＧ−ＧＣＡ−ＡＴＣ−ＴＧＣ−ＴＴＣ−ＴＴ。

抗ウイルスアッセイ
抗ウイルスアッセイを、ＥＭＣウイルスを用い、Stewart (1979)に記載されているようにウイルス複製依存的細胞変性効果をスコアリングして実施した。
Ｈｅｒ２リン酸化の測定
ヒトＨｅｒ２を発現するＢＴＧ９Ａ細胞を、２００ｐＭ〜２ｎＭの１Ｒ５９Ｂ−ＩＦＮＡ２−Ｑ１２４Ｒで１０〜３０分間処理した。細胞をＲＩＰＡで溶解し、７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４０μｇ／レーン）後にOdyssey Fc（Licor Bioscience）上のウェスタンブロットによって分析した。ホスホ−Ｈｅｒ２を、抗Ｈｅｒ２ ＹＰ１２４８（Upstate #06-229）およびヤギ抗ウサギ二次抗体ＩＲＤｙｅ６８０（Licor Bioscience #926-32221）で検出した。
ＳＴＡＴ１リン酸化の測定
Ｙ７０１でリン酸化されたＳＴＡＴ１を、ＦＡＣＳによりＳＴＡＴ１−ＰＹ７０１（ＰＥ）（Beckton Dickinston #612564）およびPhosFlow技術についてのメーカーの指示を用いて検出した。
標的レプチン構築物
標的レプチン構築物の配列を図１７に示す。示されているＬ８６は、ＳまたはＮのいずれかに変異したアミノ酸である。

例１：ナノボディ−インターフェロン融合タンパク質
図１は、ＩＦＮα２野生型またはＬ１５３ＡおよびＲ１４９Ａ変異体を用いて構築したナノボディ−ＩＦＮ融合タンパク質の模式図を示す。

例２：ナノボディ−ＩＦＮ融合タンパク質のＩＦＮ活性をマウスレプチン受容体発現細胞に向けて標的化する
ＩＦＮα２ＷＴ、ＩＦＮα２ Ｌ１５３ＡまたはＲ１４９Ａを有する３つのナノボディ融合タンパク質を、ＨＬ１１６細胞およびマウスレプチン受容体を発現するＨＬ１１６−ｍＬＲ−クローン１０細胞の両方でアッセイした。ＩＦＮα２単独も、２つの細胞クローンのＩＦＮ応答に差がないことをチェックするために、このアッセイ系においてアッセイした。実際、ＨＬ１１６およびＨＬ１１６−ｍＬＲ−クローン１０細胞の両方は、このＩＦＮに対して同様に感受性である（図２Ａおよび２Ｃ、黒色記号）。しかし、３つのナノボディ−ＩＦＮ融合タンパク質のＩＦＮ活性は、ＨＬ１１６親細胞と比較して、レプチン受容体を発現する細胞において顕著に増加した（図２Ａを図２Ｃと、および図２Ｂを図２Ｄと比較のこと）。

我々は、レプチン受容体を発現する細胞は、ナノボディ−ＩＦＮ ＷＴ、Ｌ１５３ＡおよびＲ１４９Ａに対して、親のＨＬ１１６細胞よりもそれぞれ１０倍、１００倍、および１０００倍の感受性であると推定した。ＩＦＮ変異体Ｌ１５３ＡおよびＲ１４９Ａの、ＩＦＮＡＲ２に対する親和性は、ＷＴと比べて０．１および０．０１であるため、ＩＦＮＡＲ２結合部位における変異によって引き起こされる活性の喪失と、ナノボディによる標的化効率の間には相関がある。
ナノボディ−ＩＦＮ融合タンパク質のＩＦＮ活性が、ナノボディ標的を発現する細胞にのみ送達されるのか、または隣接セルにも送達されるのかを判断するために、ナノボディ−ＩＦＮα２Ｒ１４９Ａを、ＨＬ１１６−ｍＬＲ−クローン１０とＨＴ１０８０−６−１６ウミシイタケルシフェラーゼクローン４の共培養でアッセイした。両方の細胞型は、ＩＦＮ刺激に応答してルシフェラーゼ活性を発現するが、ナノボディの標的を発現する細胞はホタルルシフェラーゼ活性を表示し、一方レプチン受容体を欠く細胞はウミシイタケルシフェラーゼ活性を表示する。ナノボディ−ＩＦＮα２Ｒ１４９Ａタンパク質の希釈は１／３０とされ、これは、レプチン受容体を有する細胞において最大の応答を誘導し、ナノボディ標的を欠いた細胞において最小の応答を誘導する（図２ＢおよびＤ、黒い曲線を参照）。図３は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性が、ナノボディ−ＩＦＮα２Ｒ１４９Ａによる共培養物の刺激によって誘導されないことを明らかに示し、これは、標的ＩＦＮ活性が、ナノボディによって認識される抗原を発現する細胞のみに送達されることを示す。

標的化の有効性を、野生型および２種類の変異体ＩＦＮ（Ｌ１５３ＡおよびＲ１４９Ａ）の活性を、標的化に用いられるマウスレプチン受容体を発現するかまたは発現しないＨＬ１１６細胞に加えた場合に比較することにより、さらに説明する。結果は、構築物が標的化された場合に変異体の活性が高いこと、および標的化の効果が、野生型よりも変異体で大きいことを明示する。（図４ＡおよびＢ）
標的化がナノボディ特異的であることを証明するために、ｍＬＲを発現するＨＬ１１６細胞を、ＩＦＮ−α２（ＩＦＮＡ２として示される）またはナノボディ４−１１に融合したＩＦＮＡ２−Ｒ１４９Ａ（ナノボディ−ＩＦＮＡ２−Ｒ１４９Ａ）のいずれかで、それぞれのＥＣ５０濃度において、遊離の４−１１ナノボディの１００倍モル過剰の存在または不在（対照）のもとで、６時間インキュベートした。細胞を溶解し、ＩＦＮ誘導性ルシフェラーゼ活性を測定した。図５に示すように、非標的ＩＦＮは遊離ナノボディによって阻害されず、一方標的構築物は強く阻害され、標的化の特異的効果を示す。
レプチン受容体を標的とすることは、受容体上のエピトープとは独立している：ナノボディ４−１１とは別の受容体上のドメインを認識する抗レプチン受容体ナノボディ４−１０（Zabeau et al., 2012）を使用して、標的変異体ＩＦＮを用いて類似の活性化を得ることができる（図６）。

例３：レプチン受容体を発現する細胞に対するナノボディ−ＩＦＮ融合タンパク質のＩＦＮ活性は、両方のＩＦＮ受容体鎖により媒介される
ナノボディ−ＩＦＮ融合タンパク質のＩＦＮ活性が、ＩＦＮ受容体の活性化を必要とするかどうかを決定するために、マウスレプチン受容体を発現するＨＬ１１６細胞を、ＩＦＮＡＲ１またはＩＦＮＡＲ２に対する中和抗体で前処理した後、ナノボディ−ＩＦＮＡ２−Ｒ１４９Ａ融合タンパク質で刺激した。ＩＦＮ誘導性ルシフェラーゼ活性を測定した。図７は、抗ＩＦＮＡＲ１および抗ＩＦＮＡＲ２中和抗体の両方が、ナノボディ−ＩＦＮＡ２−Ｒ１４９ＡのＩＦＮ活性を阻害することを示す。

例４：マウスレプチン受容体を発現する細胞における、４−１１−ＩＦＮＡ２−Ｒ１４９Ａによる抗ウイルス活性の標的特異的誘導
抗ウイルス活性はＩＦＮ応答の統合された部分であり、いくつかの遺伝子の発現を示唆する。そのため、ｍＬＲ発現細胞への抗ウイルス活性は、抗レプチン受容体抗体４−１１を使用して変異体Ｒ１４９Ａ ＩＦＮを標的化した後に制御された。結果を図８に要約する。活性は、レプチン受容体発現有りまたはなしのＨＬ１１６細胞に対する細胞変性効果として測定した。４−１１−ＩＦＮＡ２−Ｒ１４９Ａナノボディ−ＩＦＮ融合タンパク質の特異的抗ウイルス活性は、レプチン受容体発現細胞でアッセイした場合、ＨＬ１１６細胞より７１６倍高い。

例５： Ｈｅｒ２発現細胞上へのＩＦＮ活性の標的化
概念がサイトカイン受容体標的化に限定されないことを実証するために、Ｈｅｒ２に対するナノボディ２Ｒ５Ａを使用して同様の融合タンパク質（Vaneycken et al., 2011）および変異体ＩＦＮα２ Ｒ１４９Ａ（２Ｒ５Ａ−ＩＦＮＡ２−Ｒ１４９Ａ）を生成した。この分子を、ＢＸＰＣ３（膵癌、ＡＴＣＣから）およびＢＴ４７４（乳癌、ＡＴＣＣから）細胞株でアッセイし、定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＧＡＰＤＨに対して相対的に決定される、６−１６ ＩＦＮ誘導性遺伝子の誘導についてのＩＦＮ−α２（ＩＦＮＡ２）の活性と比較した。ＢＸＰＣ３およびＢＴ４７４細胞株は、それらの表面で発現されるＨｅｒ２分子の数が異なる（Gaborit et al. (2011)の報告により、それぞれ１０．９×１０^３および４７８×１０^３）。
図９は、ＢＸＰＣ３およびＢＴ４７４細胞株におけるＩＦＮ誘導性遺伝子６−１６の誘導のための、ＩＦＮＡ２活性（パネルＡ）および２Ｒ５Ａ−ＩＦＮＡ２−Ｒ１４９Ａ活性（パネルＢ）のＥＣ_５０の決定を示す。パネルＡは、ＢＸＰＣ３およびＢＴ４７４細胞株が、ＩＦＮ−α２に同じ感受性を示すことを示す。パネルＢは、２Ｒ５Ａ−ＩＦＮＡ２−Ｒ１４９Ａナノボディ−ＩＦＮ融合タンパク質が、ＢＸＰＣ３よりも４０倍多くのＨｅｒ２分子を発現するＢＴ４７４細胞株でより強力であることを示している。
結論として、マウスレプチン受容体を発現するヒト細胞上で示したように、特定の細胞表面抗原を発現する細胞に対するＩ型ＩＦＮ活性を標的とすることから構成される概念が、異なる構造ファミリー由来の別の細胞表面分子を発現する非トランスフェクトヒト細胞にも、乳癌のいくつかのタイプにおいて天然に見出されるレベルで、拡張可能である。

例６：変異体ＩＦＮＡ２−Ｑ１４９Ｒの、ヒトＨｅｒ２を発現するマウス細胞への標的化
変異体ヒトＩＦＮＡ２ Ｑ１４９Ｒを、ヒトＨｅｒ２を発現するマウス細胞に対して、１Ｒ５９Ｂ−ＩＦＮＡ２−Ｑ１２４Ｒのナノボディ１Ｒ５９Ｂを使用して標的化した。ＩＦＮＡ２ Ｑ１２４Ｒは、マウスＩＦＮＡＲ１鎖に対する高い親和性およびマウスＩＦＮＡＲ２鎖に対する低い活性を有する（Weber et al., 1987）。ＩＦＮによる誘導を、ＲＴ−ＱＰＣＲにより、ＯＡＳＬ２メッセンジャーＲＮＡの発現として測定した。結果を図１０に示す。Ｈｅｒ２発現細胞において明白な標的化特異的誘導が存在し、一方、非トランスフェクトＢＴＧ９Ａ細胞においては有意な発現は検出されなかった。
Ｈｅｒ２に対するＨｅｒ２特異的ＳｃＦｖを用いて、変異体ＩＦＮ Ｑ１２４Ｒを標的化した場合にも、同様の結果が得られた。この場合には、ＩＦＮ誘導は、ＩＳＧ１５メッセンジャーＲＮＡの発現を用いて測定した。結果を図１１に示す。再度、Ｈｅｒ２発現細胞においてＩＳＧ１５の特異的誘導が見られ、一方で、Ｈｅｒ２を発現しない細胞に対して、変異体ＩＦＮはほとんど効果がなかった。

例７：構築物１Ｒ５９Ｂ−ＩＦＮＡ２−Ｑ１２４Ｒは、Ｈｅｒ２のリン酸化を活性化しない
Ｈｅｒ２の標的化がＨｅｒ２の活性化を生じるかどうかを調べるため、Ｈｅｒ２のリン酸化を標的細胞で制御した。結果を図１２に示す；濃度または処置の時間に関わらず、１Ｒ５９Ｂ−ＩＦＮＡ２−Ｑ１２４Ｒ標的細胞においては、リン酸化されたＨｅｒ２を検出できなかったことが実証される。

例８：抗ＰＤ−Ｌ２ Ｎｂ１２２−ＩＦＮＡ２−Ｑ１２４Ｒ構築物活性を、ＰＤ−Ｌ２を発現するマウス一次細胞に標的化する
マウス腹腔からの細胞を単離し、in vitroでＮｂ１２２−ＩＦＮＡ２−Ｑ１２４Ｒまたは天然のｍＩＦＮα／βで３０分処理した。細胞を固定し、透過処理し、ＰＤ−Ｌ２（ＡＰＣ）（BD #560086）およびＳＴＡＴ１−ＰＹ７０１（ＰＥ）（BD #612564）に対する抗体で標識し、ＦＡＣＳによって分析した。
ＰＤ−Ｌ２陽性細胞集団は、マウス腹腔に存在する全細胞集団の２０％を表す。
結果を図１３に示す。図から明らかであるのは、未処理細胞において、または非標的マウスＩＦＮ処理細胞において、ＰＤ−Ｌ２を発現するおよび発現しない細胞に対するＳＴＡＴ１−Ｐのピークが一致することである。また、ＳＴＡＴ１−Ｐの明確な誘導はマウスＩＦＮ処理によって見ることができる。標的変異体ＩＦＮを用いた処理は、ＰＤ−Ｌ２を発現する細胞についてのみ、ＳＴＡＴ１−Ｐの特定のシフトをもたらす。
同一の結果が、脾細胞のＩＦＮ応答を同様の実験で分析した場合に得られる。ＰＤ−Ｌ２陽性細胞集団は、マウス脾臓中に存在する全細胞集団の１％を表し、マイナーな細胞集団を効率的に標的化することができることを示す。

例９：１２２−ＩＦＮＡ２−Ｑ１２４Ｒ構築物のin vivo注入はＰＤ−Ｌ２発現細胞のみにＩＦＮ応答を誘導する
マウスに、ＰＢＳ、Ｎｂ１２２−ＩＦＮＡ２−Ｑ１２４ＲまたはＩＦＮＡ２−Ｑ１２４Ｒに融合された対照Ｎｂ（ＧＦＰに対する）のいずれかを、（ＩＰまたはＩＶで）注射した。注射の３０分後にマウスを死亡させ、腹腔をＰＢＳで洗浄することによって腹膜腔からの細胞を回収し、固定し（PhosLow Fix buffer I BD # 557870）、透過処理し（PhosFlow Perm buffer III, BD #558050）、ＰＤ−Ｌ２（ＡＰＣ）（BD #560086）およびＳＴＡＴ１−ＰＹ７０１（ＰＥ）（BD #612564）に対するＡｂで標識し、ＦＡＣＳにより分析した。結果を図１４に示す。ＳＴＡＴ１−Ｐは、ＰＢＳまたは対照ナノボディのいずれかで処理したＰＤ−Ｌ２陽性および陰性細胞において一致する。しかし、ＳＴＡＴ１−Ｐの明確な誘導（ＰＤＬ２陽性細胞集団のみにおける）は、マウスに標的変異体ＩＦＮを注射した時にのみ、みることができる。
対照として、ＳＴＡＴ１−Ｐを、天然のマウスＩＦＮの異なる用量（１０，０００、１００，０００または１０００，０００単位）をｉｖ注射したマウスにおいて検査したが、ＰＤＬ２陽性およびＰＤＬ２陰性細胞の間に、ＳＴＡＴ１−Ｐの差は検出できなかった。
図１５は、Ｎｂ１２２−ＩＦＮＡ２−Ｑ１２４Ｒ構築物のｉｖ注射後の、同様の用量反応曲線を示す。ＰＤ−Ｌ２を発現する細胞におけるＳＴＡＴ１−Ｐのシフトは、最低用量の６４ｎｇにおいても検知することができる。

例１０：切断型ＴＮＦα受容体を用いた、変異体レプチンのレプチン受容体への標的化
Ｂａ／Ｆ３細胞は、ＩＬ−３に増殖依存性である。ｍＬＲを用いたトランスフェクション後、Ｂａ／Ｆ３細胞もレプチンで増殖する。それらの受容体に対する低下した親和性を持つレプチン変異体は、Ｂａ／Ｆ３−ｍＬＲ細胞増殖の誘導および維持において、より弱い。レプチン変異体Ｌ８６Ｓは中等度の、および変異体Ｌ８６Ｎは強い、親和性の減少を有し、したがってそれぞれ、中等度のおよび強い、増殖を誘導する能力の低下を有する。 Ｂａ／Ｆ３−ｍＬＲ細胞の、その細胞内ドメインを欠くヒトＴＮＦα受容体１（ｈＴＮＦＲ１）による追加のトランスフェクションは、膜結合細胞外マーカーとして機能することができる、非機能的受容体を導入する。
レプチンおよびヒトＴＮＦＲ１（ここではｎｂ９６）に対するナノボディからなるキメラタンパク質は、ｍＬＲを有する細胞およびｈＴＮＦＲ１を有する細胞に結合する。レプチン変異体Ｌ８６ＳおよびＬ８６Ｎを有するキメラタンパク質は、ＬＲに対する親和性は減少したが、ｈＴＮＦＲ１に対するそれらの親和性を保持している。

キメラタンパク質は、発現プラスミドによるＨｅｋ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにより作製した。上清を０．４５μｍ濾過し、アッセイのために９６ウェルプレート中で連続希釈した。精製した組換えレプチンの連続希釈を、基準として使用した。３０００〜１００００個の細胞をウェル当たり播種し、増殖は、ＸＴＴで染色することにより４、５日後に測定した。ＯＤを４５０ｎｍで測定した。異なるレプチン構築物を用いた２つの実験について、結果を図１６に示す（図１７を参照）。両方の構築物について、ｈＴＮＦＲ依存性増殖刺激は変異体構築物についてみることができ、一方、ｈＴＮＦＲ発現は、ｗｔ（非標的）レプチンで処理した細胞の増殖に影響を与えない。これらの結果から、標的化が変異の負の効果を補償できることは明らかである。

参考文献

Claims (14)

1. 標的化部分にカップリングされた変異体ヒトインターフェロンα２を含む、標的化構築物であって、
   該変異体ヒトインターフェロンα２は、Ｒ１４９ＡおよびＬ１５３Ａから選択される変異を含み、
   そのインターフェロン受容体に対する低下した親和性および野生型ヒトインターフェロンα２の生物学的活性の７０％未満の低下した生物学的活性を特徴とし、
   該標的化部分は、免疫細胞特異的マーカーまたは癌組織に指向されているラクダ科動物重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）を含み、ここで該標的化部分が、Ｈｅｒ２、ＤＣ−ＳＴＡＭＰ、ＰＤ−Ｌ２およびＣＤ２０からなる群から選択されるマーカーに指向されている、
   前記標的化構築物。
2. 標的化部分が、インターフェロン受容体を発現する細胞の表面上で発現されたマーカーに指向されている、請求項１に記載の標的化構築物。
3. インターフェロン受容体が、ＩＦＮＡＲ２である、請求項２に記載の標的化構築物。
4. 医薬として使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の標的化構築物。
5. 癌の処置において使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の標的化構築物。
6. ウイルス性疾患の処置において使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の標的化構築物。
7. 骨分解が関与する疾患の処置において使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の標的化構築物。
8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の標的化構築物、および好適な賦形剤を含む、医薬組成物。
9. 標的化部分にカップリングされた変異体ヒトインターフェロンα２を含む、標的化構築物であって、
   該変異体ヒトインターフェロンα２は、Ｒ１４９ＡおよびＬ１５３Ａから選択される変異を含み、そのインターフェロン受容体に対して低下した親和性および野生型ヒトインターフェロンα２の生物学的活性の７０％未満の低下した生物学的活性を特徴とし、
   該標的化部分は、プログラム細胞死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）に指向されているラクダ科動物重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）を含む、
   前記標的化構築物。
10. 変異体ヒトインターフェロンα２が、Ｒ１４９Ａ変異を含む、請求項９に記載の標的化構築物。
11. 癌の処置において使用するための、請求項９または１０に記載の標的化構築物。
12. 標的化部分にカップリングされた変異体ヒトインターフェロンα２を含む、標的化構築物であって、
    該変異体ヒトインターフェロンα２は、Ｒ１４９ＡおよびＬ１５３Ａから選択される変異を含み、そのインターフェロン受容体に対して低下した活性および野生型ヒトインターフェロンα２の生物学的活性の７０％未満の低下した生物学的活性を特徴とし、
    該標的化部分は、Ｈｅｒ２に指向されているラクダ科動物重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）を含む、
    前記標的化構築物。
13. 変異体ヒトインターフェロンα２がＲ１４９Ａ変異を含む、請求項１２に記載の標的化構築物。
14. 癌の処置において使用するための、請求項１２または１３に記載の標的化構築物。