JP6353751B2 - Novel heterocyclic compound and salt thereof, and luminescent substrate composition - Google Patents
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Description
本発明は、新規複素環式化合物及びその塩、並びに、発光基質組成物に関し、特には、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性に優れ、ホタル生物発光系における発光基質として利用可能な複素環式化合物に関するものである。 The present invention relates to a novel heterocyclic compound and a salt thereof, and a luminescent substrate composition, and in particular, has excellent solubility in a buffer solution having a pH near neutral and can be used as a luminescent substrate in a firefly bioluminescence system. The present invention relates to a heterocyclic compound.
生物発光系の中でも、ホタルの発光系は、発光効率に優れた系として知られている。該ホタルの発光系においては、発光基質であるホタルルシフェリンが、発光酵素のホタルルシフェラーゼと、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及びマグネシウムイオン（Ｍｇ2+）の存在下、励起状態のオキシルシフェリンに変換され、該オキシルシフェリンが基底状態へと失活する際に波長が約５６０ｎｍの黄緑色の蛍光が発せられる。 Among the bioluminescent systems, the firefly luminescent system is known as a system excellent in luminous efficiency. In the firefly luminescence system, the luminescent substrate firefly luciferin is converted to excited oxyluciferin in the presence of the luminescent enzyme firefly luciferase, adenosine triphosphate (ATP) and magnesium ion (Mg 2+ ). When the oxyluciferin is deactivated to the ground state, yellow-green fluorescence having a wavelength of about 560 nm is emitted.
また、昨今、かかるホタルの発光系の発光基質の類似体として、多彩な発光波長を実現する化合物が合成されている。例えば、下記特許文献１には、ホタルルシフェリンのフェノール性水酸基を２級又は３級アミノ基で置換したルシフェリン誘導体が開示されている。また、下記特許文献２及び３には、ホタルルシフェリンと類似の分子構造を有するルシフェラーゼの発光基質が開示されている。
Recently, compounds that realize various emission wavelengths have been synthesized as analogs of the luminescent substrate of such a firefly luminescent system. For example,
これらのホタルルシフェリン類似体の中でも、長波長の光を発する発光基質は、長波長光は生体内での透過率が高いため、生体内深部の病巣を可視化するための標識材料として有望であり、例えば、和光純薬工業株式会社から商品名「アカルミネ」として、長波長光を発するホタルルシフェリン類似体が市販されている。 Among these firefly luciferin analogs, a luminescent substrate that emits light of long wavelength is promising as a labeling material for visualizing lesions in the deep part of the living body because long wavelength light has high transmittance in the living body, For example, a firefly luciferin analog that emits long-wavelength light is commercially available from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. under the trade name “Akalumine”.
しかしながら、上記ホタル発光系の発光基質類似体は、多彩な発光波長を実現できるものの、水溶性が低く、特に、生体内深部の可視化に有用な長波長光を発する発光基質で顕著である。一般に、マウスやラット等の実験動物の生体内への投与においては、発光基質は１〜１５ｍｇ／ｍｌ程度の溶解度を有することが必要であるが、上記の長波長光を発する発光基質は、水への溶解度が約０．１ｍｇ／ｍｌであり、実用性に問題が有った。 However, although the above-mentioned firefly luminescent luminescent substrate analogs can realize various emission wavelengths, they have low water solubility, and are particularly prominent among luminescent substrates that emit long-wavelength light useful for visualization in the deep part of the living body. In general, in the administration to the living body of a laboratory animal such as a mouse or a rat, the luminescent substrate needs to have a solubility of about 1 to 15 mg / ml. Solubility in water was about 0.1 mg / ml, and there was a problem in practicality.
これに対して、本発明者らは、特定の分子構造を有し、ホタル生物発光系における発光基質として機能する水に難溶性の発光基質を、ハロゲン化水素で塩化することで、ホタル生物発光系における発光能を保持しつつ、水溶性が大幅に向上することを見出している。 On the other hand, the present inventors have developed a firefly bioluminescence by chlorinating a water-insoluble luminescent substrate having a specific molecular structure and functioning as a luminescent substrate in a firefly bioluminescent system with hydrogen halide. It has been found that the water solubility is greatly improved while maintaining the luminous ability in the system.
しかしながら、上記水に難溶性の発光基質のハロゲン化水素塩は、生体内への投与のために、ｐＨが中性付近の緩衝液に添加すると、水に難溶性の発光基質が析出してしまうという問題があった。また、上記水に難溶性の発光基質のハロゲン化水素塩をｐＨが約２の酸性溶液として、実験動物の生体内へ投与すると、生体内の細胞が適切に活動するためにｐＨが７．４前後で調節されている血液（細胞外液）のバランスが崩れる等の問題があり、実験動物への投与は可能であるが好ましくない。 However, when the above-mentioned hydrogen halide salt of a luminescent substrate that is sparingly soluble in water is added to a buffer solution having a pH near neutral for administration into a living body, a luminescent substrate that is sparingly soluble in water will precipitate. There was a problem. In addition, when the above-mentioned hydrogen halide salt of a luminescent substrate that is sparingly soluble in water is administered as an acidic solution having a pH of about 2 to the living body of a laboratory animal, the pH is 7.4 in order for cells in the living body to act appropriately. There is a problem that the balance of blood (extracellular fluid) adjusted before and after is lost, and administration to experimental animals is possible but not preferred.
そこで、本発明の目的は、上記従来技術の問題を解決し、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性に優れ、ホタル生物発光系における発光基質として利用可能な新規化合物を提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a novel compound that solves the above-described problems of the prior art, has excellent solubility in a buffer solution having a pH near neutral, and can be used as a luminescent substrate in a firefly bioluminescence system. is there.
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、特定の複素環を有する化合物が、ホタル生物発光系における発光基質として機能する上、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性に優れることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors have found that a compound having a specific heterocyclic ring functions as a luminescent substrate in a firefly bioluminescence system and dissolves in a buffer solution having a pH near neutral. As a result, the present invention was completed.
即ち、本発明によれば、下記一般式（I）：
本発明の複素環式化合物の好適例においては、前記一般式（I）中のＲ1が−Ｈである。この場合、複素環式化合物の発光効率及びｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性が更に良好である。 In a preferred example of the heterocyclic compound of the present invention, R 1 in the general formula (I) is —H. In this case, the luminous efficiency and solubility of the heterocyclic compound in a buffer solution having a neutral pH are even better.
本発明の複素環式化合物の他の好適例においては、前記一般式（I）中のＲ2が−Ｎ（ＣＨ3）2である。この場合、複素環式化合物の発光効率が更に優れる。 In another preferred embodiment of the heterocyclic compound of the present invention, R 2 in the general formula (I) is —N (CH 3 ) 2 . In this case, the luminous efficiency of the heterocyclic compound is further improved.
本発明の複素環式化合物の中でも、下記化学式（II）、（III）又は（IV）：
また、本発明によれば、前記複素環式化合物の塩が提供され、該塩も、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性に優れ、ホタル生物発光系における発光基質として機能する。 In addition, according to the present invention, a salt of the heterocyclic compound is provided, and the salt is also excellent in solubility in a buffer solution having a pH near neutral, and functions as a luminescent substrate in a firefly bioluminescence system.
また、本発明によれば、前記複素環式化合物又は塩を含む発光基質組成物が提供され、該発光基質組成物は、ｐＨが中性付近でも安定であり、発光酵素のホタルルシフェラーゼと共にホタル生物発光系を構成できる。 In addition, according to the present invention, there is provided a luminescent substrate composition comprising the heterocyclic compound or salt. The luminescent substrate composition is stable even when the pH is near neutral, and together with the firefly luciferase, a firefly organism. A light emitting system can be constructed.
本発明によれば、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性に優れ、ホタル生物発光系における発光基質として利用可能な新規化合物を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the novel compound which is excellent in the solubility to the buffer solution near pH neutral, and can be utilized as a luminescent substrate in a firefly bioluminescence system can be provided.
以下に、本発明を詳細に説明する。本発明の複素環式化合物は、上記一般式（I）で表される。本発明の複素環式化合物は、ジヒドロチアゾール環に加えて、複素環をもう一つ有し、該複素環は、ベンゼン環よりも極性が高い。そのため、本発明の複素環式化合物は、水溶性が高く、また、ｐＨが中性付近（好ましくはｐＨが４〜１０、より好ましくはｐＨが６〜８）の緩衝液への溶解性に優れる。また、本発明の複素環式化合物は、分子構造がホタルルシフェリンと類似しているため、ホタル生物発光系における発光基質として利用できる。 The present invention is described in detail below. The heterocyclic compound of the present invention is represented by the above general formula (I). The heterocyclic compound of the present invention has another heterocyclic ring in addition to the dihydrothiazole ring, and the heterocyclic ring is more polar than the benzene ring. Therefore, the heterocyclic compound of the present invention has high water solubility, and is excellent in solubility in a buffer solution having a pH near neutral (preferably pH 4 to 10, more preferably pH 6 to 8). . Moreover, since the heterocyclic compound of the present invention has a molecular structure similar to firefly luciferin, it can be used as a luminescent substrate in a firefly bioluminescence system.
＜一般式（I）で表される複素環式化合物＞
上記一般式（I）中、Ｒ1は、−Ｈ（水素）又は炭素数１〜３のアルキル基である。ここで、アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基が挙げられる。なお、Ｒ1としては、発光効率及びｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性の観点から、−Ｈが好ましい。
<Heterocyclic compound represented by general formula (I)>
In said general formula (I), R < 1 > is -H (hydrogen) or a C1-C3 alkyl group. Here, examples of the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, and an i-propyl group. R 1 is preferably -H from the viewpoint of luminous efficiency and solubility in a buffer solution having a pH near neutral.
上記一般式（I）中、Ｒ2は、−ＯＨ（ヒドロキシ基）、−ＮＨ2（アミノ基）、又は−Ｎ（ＣＨ3）2（ジメチルアミノ基）である。なお、Ｒ2としては、発光効率の観点から、−Ｎ（ＣＨ3）2が好ましい。 In the general formula (I), R 2 is —OH (hydroxy group), —NH 2 (amino group), or —N (CH 3 ) 2 (dimethylamino group). As the R 2, from the viewpoint of emission efficiency, -N (CH 3) 2 is preferred.
また、上記一般式（I）中、Ｒ3は、−Ｎ＝、−ＣＨ＝、又は−ＣＲ4＝で、ここで、Ｒ4は−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2（アリル基）であり、但し、１つ以上のＲ3は−Ｎ＝である。なお、本発明においては、合成の容易性の観点から、４つのＲ3の内、１つが−Ｎ＝で、３つが−ＣＨ＝であることが好ましく、即ち、本発明の複素環式化合物は、ピリジン環を有することが好ましい。また、本発明においては、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性の観点から、４つのＲ3の内、２つが−Ｎ＝で、２つが−ＣＨ＝であることが好ましく、即ち、本発明の複素環式化合物は、ピラジン環、ピリミジン環、ピリダジン環を有することも好ましく、ピラジン環を有することが更に好ましい。 In the general formula (I), R 3 is —N═, —CH═, or —CR 4 ═, where R 4 is —CH 2 CH═CH 2 (allyl group), provided that One or more of R 3 is —N═. In the present invention, from the viewpoint of ease of synthesis, it is preferable that one of the four R 3 s is —N═ and three are —CH═, that is, the heterocyclic compound of the present invention is It preferably has a pyridine ring. Further, in the present invention, from the viewpoint of solubility in a buffer solution having a pH near neutral, it is preferable that two of the four R 3 are -N = and two are -CH =, The heterocyclic compound of the present invention preferably has a pyrazine ring, a pyrimidine ring and a pyridazine ring, and more preferably has a pyrazine ring.
上記一般式（I）中、ｎはビニレン単位（−ＣＨ＝ＣＨ−）の繰り返し数を示し、０〜３の整数である。ｎの数が大きい程、発光波長が長くなるため、生体内深部の可視化の観点から、ｎは２又は３であることが好ましく、入手容易性の観点から、ｎは２であることが好ましい。 In said general formula (I), n shows the repeating number of vinylene units (-CH = CH-), and is an integer of 0-3. Since the emission wavelength becomes longer as the number of n is larger, n is preferably 2 or 3 from the viewpoint of visualization of the deep part in the living body, and n is preferably 2 from the viewpoint of availability.
上記一般式（I）で表される複素環式化合物は、特に限定されるものではないが、以下のようにして合成することができる。例えば、出発物質として２−アミノ−５−シアノピリジン、５−アミノ−２−シアノピリジン等のシアノピリジン誘導体を使用し、所望により、ヨードメタンと反応させて、ジメチルアミノ体を得、次いで、水素化ジイソブチルアミニウムと反応させて、アルデヒド体を生成させる。或いは、出発物質として２−アミノ−５−ブロモ−ピラジン等のブロモピラジン誘導体を使用し、所望により、ヨードメタンと反応させて、ジメチルアミノ体を得、次いで、ノルマルブチルリチウム等のアルキルリチウムと反応させた後、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のアミド化合物と反応させて、アルデヒド体を生成させる。次いで、該アルデヒド体を４−ホスホノクロトン酸トリエチルと反応させてエチルエステル体を得、次いで、該エチルエステル体を水酸化ナトリウム水溶液中でカルボキシル体に変換する。一方、Ｄ−システイン−Ｓ−トリチル化合物を塩化水素、１，４−ジオキサン溶液存在下、メタノール溶液中で反応させて、メチルエステル体を準備し、次いで、該メチルエステル体と前記カルボキシル体とを反応させて、アミド体を生成させる。次いで、該アミド体をトリフルオロ酢酸無水物、トリフルオロメタンスルホン酸無水物等の酸無水物によって環化させて複素環を生成させ、チアゾリン体を得る。次いで、所望により、チアゾリン体のメチルエステル部分を加水分解して、チアゾリン環を有するカルボキシル体を得る。また、出発物質を適宜変更したり、種々の置換基を導入したりする等して、或いは、他の合成経路を利用して、所望の複素環式化合物を得ることができる。 The heterocyclic compound represented by the general formula (I) is not particularly limited, but can be synthesized as follows. For example, cyanopyridine derivatives such as 2-amino-5-cyanopyridine and 5-amino-2-cyanopyridine are used as starting materials, and optionally reacted with iodomethane to obtain a dimethylamino compound, followed by hydrogenation It reacts with diisobutylaminium to produce an aldehyde form. Alternatively, a bromopyrazine derivative such as 2-amino-5-bromo-pyrazine is used as a starting material and, if desired, reacted with iodomethane to obtain a dimethylamino compound, which is then reacted with alkyllithium such as normal butyllithium. Then, it is reacted with an amide compound such as N, N-dimethylformamide to produce an aldehyde form. Next, the aldehyde form is reacted with triethyl 4-phosphonocrotonate to obtain an ethyl ester form, which is then converted into a carboxyl form in an aqueous sodium hydroxide solution. On the other hand, a D-cysteine-S-trityl compound is reacted in a methanol solution in the presence of hydrogen chloride and a 1,4-dioxane solution to prepare a methyl ester form, and then the methyl ester form and the carboxyl form are prepared. React to produce an amide form. Next, the amide is cyclized with an acid anhydride such as trifluoroacetic anhydride or trifluoromethanesulfonic anhydride to produce a heterocyclic ring, thereby obtaining a thiazoline. Next, if desired, the methyl ester portion of the thiazoline body is hydrolyzed to obtain a carboxyl body having a thiazoline ring. In addition, a desired heterocyclic compound can be obtained by appropriately changing the starting material, introducing various substituents, or utilizing other synthetic routes.
上述した一般式（I）で表される複素環式化合物の中でも、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性、発光効率、生体内深部の可視化、入手容易性の観点から、上記化学式（II）、（III）又は（IV）で表される複素環式化合物が好ましく、化学式（III）又は（IV）で表わされる化合物が特に好ましい。なお、上記化学式（III）で表わされる化合物は、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性が非常に高い上、発光波長が長く、生体内深部の可視化に特に有用である。また、上記化学式（IV）で表わされる化合物は、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性が極めて高い。 Among the heterocyclic compounds represented by the general formula (I) described above, from the viewpoints of solubility in a buffer solution having a pH near neutrality, luminous efficiency, visualization of deep in vivo, and availability, the above chemical formula ( A heterocyclic compound represented by II), (III) or (IV) is preferred, and a compound represented by chemical formula (III) or (IV) is particularly preferred. In addition, the compound represented by the chemical formula (III) has a very high solubility in a buffer solution having a pH near neutral, has a long emission wavelength, and is particularly useful for visualization in the deep part of the living body. In addition, the compound represented by the chemical formula (IV) has extremely high solubility in a buffer solution having a pH near neutral.
＜一般式（I）で表される複素環式化合物の塩＞
上記一般式（I）で表される複素環式化合物は、塩とすることもできる。ここで、本発明の複素環式化合物の塩は、酸との付加塩でも、塩基との付加塩でもよい。例えば、本発明の複素環式化合物と酸との付加塩における酸としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸、亜リン酸、亜硝酸、クエン酸、ギ酸、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、安息香酸、マンデル酸、ケイ皮酸、パモ酸、ステアリン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、コハク酸、トリフルオロ酢酸等が挙げられ、また、酸付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、スルファミン酸塩、リン酸塩、硝酸塩、亜リン酸塩、亜硝酸塩、クエン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、安息香酸塩、マンデル酸塩、ケイ皮酸塩、パモ酸塩、ステアリン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンジスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、トリフルオロ酢酸塩等が挙げられる。一方、本発明の複素環式化合物と塩基との付加塩における塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等が挙げられ、また、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等が挙げられる。
<Salt of heterocyclic compound represented by general formula (I)>
The heterocyclic compound represented by the general formula (I) may be a salt. Here, the salt of the heterocyclic compound of the present invention may be an addition salt with an acid or an addition salt with a base. For example, the acid in the addition salt of the heterocyclic compound of the present invention and an acid includes hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, sulfamic acid, phosphoric acid, nitric acid, phosphorous acid, nitrous acid, citric acid. Acid, formic acid, acetic acid, oxalic acid, maleic acid, lactic acid, tartaric acid, fumaric acid, benzoic acid, mandelic acid, cinnamic acid, pamoic acid, stearic acid, glutamic acid, aspartic acid, methanesulfonic acid, ethanedisulfonic acid, p- Examples include toluenesulfonic acid, salicylic acid, succinic acid, trifluoroacetic acid, and acid addition salts include hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, sulfate, sulfamate, phosphate , Nitrate, phosphite, nitrite, citrate, formate, acetate, oxalate, maleate, lactate, tartrate, fumarate, benzoate, mandelate, cinnamic acid salt, Mo, stearate, glutamate, aspartate, methanesulfonate, ethanedisulfonate, p- toluenesulfonate, salicylate, succinate, trifluoroacetate, and the like. On the other hand, examples of the base in the addition salt of the heterocyclic compound and the base of the present invention include sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide and the like, and examples of the base addition salt include sodium salt, potassium salt, A calcium salt etc. are mentioned.
上記一般式（I）で表される複素環式化合物の塩も、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性に優れ、ホタル生物発光系における発光基質として機能する。上述のように、上記一般式（I）で表される複素環式化合物はｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性に優れるため、上記一般式（I）で表される複素環式化合物の塩をｐＨが中性付近の緩衝液に溶解させても、上記一般式（I）で表される複素環式化合物の析出を抑制することができる。 The salt of the heterocyclic compound represented by the general formula (I) is also excellent in solubility in a buffer solution having a pH near neutral, and functions as a luminescent substrate in a firefly bioluminescence system. As described above, since the heterocyclic compound represented by the general formula (I) is excellent in solubility in a buffer solution having a pH near neutral, the heterocyclic compound represented by the general formula (I) Even when the salt is dissolved in a buffer solution having a pH near neutral, precipitation of the heterocyclic compound represented by the general formula (I) can be suppressed.
＜発光基質組成物＞
本発明の発光基質組成物は、上述した一般式（I）で表される複素環式化合物又はその塩を含み、上述した一般式（I）で表される複素環式化合物又はその塩のみからなってもよい。本発明の発光基質組成物は、ｐＨが中性付近でも、上記一般式（I）で表される複素環式化合物の析出が抑制されているため、安定であり、また、発光酵素のホタルルシフェラーゼと共にホタル生物発光系を構成できる。
<Luminescent substrate composition>
The luminescent substrate composition of the present invention includes the heterocyclic compound represented by the above general formula (I) or a salt thereof, and only from the heterocyclic compound represented by the above general formula (I) or a salt thereof. It may be. The luminescent substrate composition of the present invention is stable because the precipitation of the heterocyclic compound represented by the general formula (I) is suppressed even when the pH is near neutral, and the luminescent enzyme firefly luciferase A firefly bioluminescence system can be constructed together.
上述した本発明の複素環式化合物及びその塩は、発光甲虫ルシフェラーゼ、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及びマグネシウムイオン（Ｍｇ2+）の存在する系に添加することによって、発光甲虫ルシフェラーゼにより酸化して発光する。なお、本発明の複素環式化合物及びその塩は、ＡＴＰ及びＭｇ2+と共に発光検出キット（発光基質組成物）として提供することもでき、また、該発光検出キットには、他の発光基質や適切なｐＨに調整した溶液を含めてもよい。 The above-described heterocyclic compound of the present invention and its salt are oxidized by the luminescent beetle luciferase by adding to the system in which the luminescent beetle luciferase, adenosine triphosphate (ATP) and magnesium ion (Mg 2+ ) are present. Emits light. The heterocyclic compound and its salt of the present invention can also be provided as a luminescence detection kit (luminescence substrate composition) together with ATP and Mg 2+ , and the luminescence detection kit includes other luminescence substrates and A solution adjusted to an appropriate pH may be included.
本発明の複素環式化合物及びその塩を発光系に応用する場合、好適な発光強度を得るためには、本発明の複素環式化合物及びその塩を１μＭ以上の濃度で使用することが好ましく、５μＭ以上の濃度で使用することが更に好ましい。即ち、本発明の発光基質組成物は、上述した一般式（I）で表される複素環式化合物又はその塩を１μＭ以上の濃度で含むことが好ましく、５μＭ以上の濃度で含むことが更に好ましい。また、本発明の発光基質組成物のｐＨ、並びに、発光系のｐＨは、好ましくは４〜１０、より好ましくは６〜８であり、必要に応じて、ｐＨを安定化するために、リン酸カリウム、トリス塩酸、グリシン、ＨＥＰＥＳ等の緩衝剤を含んでもよい。 When applying the heterocyclic compound of the present invention and a salt thereof to a light emitting system, it is preferable to use the heterocyclic compound of the present invention and a salt thereof at a concentration of 1 μM or more in order to obtain suitable emission intensity. More preferably, it is used at a concentration of 5 μM or more. That is, the luminescent substrate composition of the present invention preferably contains the above-described heterocyclic compound represented by the general formula (I) or a salt thereof at a concentration of 1 μM or more, more preferably 5 μM or more. . In addition, the pH of the luminescent substrate composition of the present invention and the pH of the luminescent system are preferably 4 to 10, more preferably 6 to 8. If necessary, phosphoric acid is used to stabilize the pH. Buffers such as potassium, Tris-HCl, glycine, HEPES may be included.
また、本発明の複素環式化合物及びその塩は、ホタル発光甲虫ルシフェラーゼ発光系において、種々の酸化酵素によって発光させることができる。ルシフェラーゼは、北アメリカ産ホタル（Photinus pyralis）、鉄道虫（Railroad worm）等から単離されており、いずれも使用できる。また、使用可能な酸化酵素としては、ヒカリコメツキムシルシフェラーゼ、イリオモテボタルルシフェラーゼ、フラビン含有モノオキシゲナーゼ等も挙げられる。 Moreover, the heterocyclic compound and its salt of this invention can be light-emitted by various oxidase in a firefly light emission beetle luciferase light emission system. Luciferase has been isolated from North American firefly (Photinus pyralis), railroad worm (Railroad worm), etc., and any of them can be used. Examples of the oxidase that can be used include Hikari Komekimushiluciferase, Iriomote luciferase, and flavin-containing monooxygenase.
本発明の複素環式化合物及びその塩を発光基質とする生物発光は、発光系にコエンザイムＡ（ＣｏＡ）、ピロリン酸又はマグネシウムイオン（Ｍｇ2+）が存在すると、その発光が増強される。これらの化合物の発光増強効果は、発光系におけるＣｏＡ、ピロリン酸又はＭｇ2+の濃度がそれぞれ５μＭ以上において顕著であり、濃度の増加にしたがって発光が増強される。 Bioluminescence using the heterocyclic compound of the present invention and a salt thereof as a luminescent substrate is enhanced when coenzyme A (CoA), pyrophosphate or magnesium ion (Mg 2+ ) is present in the luminescent system. The luminescence enhancement effect of these compounds is remarkable when the concentration of CoA, pyrophosphate or Mg 2+ in the luminescence system is 5 μM or more, respectively, and the luminescence is enhanced as the concentration increases.
ホタル生物発光系を測定／検出に使用するためには、酵素の失活を防止してプラトーな発光挙動を示すように、発光を安定化させることが好ましく、例えば、発光系にマグネシウムイオンを存在させることが好ましく、マグネシウムイオンとピロリン酸を共存させることが更に好ましい。なお、マグネシウムイオン単独の場合、発光安定化の観点から、発光系のマグネシウムイオン濃度は、０．５ｍＭ以上が好ましく、濃度の増加に従って発光の安定性が向上する。また、ピロリン酸マグネシウムを使用する場合、発光安定化の観点から、発光系のピロリン酸マグネシウム濃度は、１０μＭ以上が好ましく、１００μＭ以上が更に好ましい。なお、ピロリン酸とマグネシウムイオンとの割合は、当量比でなくてもよい。また、好適なマグネシウム塩としては、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等の無機酸塩、酢酸マグネシウム等の有機酸塩が挙げられる。また、好適なピロリン酸塩として、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属のピロリン酸塩、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属のピロリン酸塩、鉄のピロリン酸塩が挙げられる。 In order to use the firefly bioluminescence system for measurement / detection, it is preferable to stabilize the luminescence so that inactivation of the enzyme is prevented and a plateau luminescence behavior is exhibited, for example, magnesium ions are present in the luminescence system It is preferable to coexist magnesium ions and pyrophosphate. In the case of magnesium ion alone, from the viewpoint of light emission stabilization, the magnesium ion concentration of the light emitting system is preferably 0.5 mM or more, and the stability of light emission improves as the concentration increases. When using magnesium pyrophosphate, the concentration of the magnesium pyrophosphate in the luminescent system is preferably 10 μM or more, and more preferably 100 μM or more, from the viewpoint of stabilization of light emission. In addition, the ratio of pyrophosphate and magnesium ion may not be an equivalent ratio. Suitable magnesium salts include inorganic acid salts such as magnesium sulfate and magnesium chloride, and organic acid salts such as magnesium acetate. Suitable pyrophosphates include alkali metal pyrophosphates such as sodium and potassium, alkaline earth metal pyrophosphates such as magnesium and calcium, and iron pyrophosphate.
本発明の複素環式化合物及びその塩は、生物学的測定／検出における発光標識として利用でき、例えば、アミノ酸、ポリペプチド、タンパク質、核酸等を標識するために使用できる。なお、本発明の複素環式化合物又はその塩をこれらの物質に結合させる方法は、当業者に周知であり、例えば、当業者に周知の方法を使用して、目的の物質のカルボキシル基やアミノ基に対して本発明の複素環式化合物又はその塩を結合させることができる。 The heterocyclic compounds and salts thereof of the present invention can be used as luminescent labels in biological measurement / detection, and can be used, for example, for labeling amino acids, polypeptides, proteins, nucleic acids and the like. In addition, the method for binding the heterocyclic compound of the present invention or a salt thereof to these substances is well known to those skilled in the art. For example, a method known to those skilled in the art can be used to form a carboxyl group or amino group of the target substance. The heterocyclic compound of the present invention or a salt thereof can be bonded to the group.
また、本発明の複素環式化合物及びその塩は、発光基質の発光によって発光甲虫ルシフェラーゼ活性を検出することを利用した測定／検出に利用することができる。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞又は動物に対して本発明の複素環式化合物又はその塩を投与することにより、インビボにおける標的遺伝子又はタンパク質の発現などを測定／検出することができる。なお、波長の長い光は、光透過性が高く、組織透過性も高い。従って、本発明の複素環式化合物及びその塩の中でも、長波長の発光を有する複素環式化合物及びその塩は、生体内深部を可視化するための標識材料として有用である。 Further, the heterocyclic compound and the salt thereof of the present invention can be used for measurement / detection utilizing detection of luminescent beetle luciferase activity by luminescence of a luminescent substrate. For example, by administering the heterocyclic compound of the present invention or a salt thereof to a cell or animal into which a luciferase gene has been introduced, the expression or the like of a target gene or protein in vivo can be measured / detected. Note that light having a long wavelength has high light permeability and high tissue permeability. Therefore, among the heterocyclic compounds and salts thereof of the present invention, the heterocyclic compounds having a long wavelength emission and salts thereof are useful as labeling materials for visualizing the deep part in the living body.
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
（１）機器分析及び測定装置
・1Ｈ核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ ＮＭＲ）
日本電子社製ＥＣＡ５００（５００ＭＨｚ）を使用して測定し、“1Ｈ ＮＭＲ（測定周波数，測定溶媒）：ケミカルシフト値（水素の数，多重度，スピン結合定数）”と記載した。ケミカルシフト値（δ）はテトラメチルシラン（δ＝０）を内部基準とし、ｐｐｍで表記した。多重度は、ｓ（単一線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｑ（四重線）、ｍ（多重線あるいは複雑に重なったシグナル）で表示し、幅広いシグナルについては、ｂｒと付記した。スピン結合定数（Ｊ）は、Ｈｚで記載した。
(1) Instrumental Analysis and measurement device · 1 H nuclear magnetic resonance spectra (1 H NMR)
It was measured using ECA500 (500 MHz) manufactured by JEOL Ltd. and described as “ 1 H NMR (measurement frequency, measurement solvent): chemical shift value (number of hydrogen, multiplicity, spin coupling constant)”. The chemical shift value (δ) is expressed in ppm with tetramethylsilane (δ = 0) as an internal standard. The multiplicity is displayed as s (single line), d (double line), t (triple line), q (quadruple line), m (multiple line or complex overlapping signals). It was noted as br. The spin coupling constant (J) is described in Hz.
・13Ｃ核磁気共鳴スペクトル（13Ｃ ＮＭＲ）
日本電子社製ＥＣＡ ５００（１２５ＭＨｚ）を使用して測定し、“13Ｃ ＮＭＲ（測定周波数，測定溶媒）：ケミカルシフト値（多重度）”と記載した。ケミカルシフト値（δ）はテトラメチルシラン（δ＝０）を内部基準とし、ｐｐｍで表記した。多重度は、ｓ（単一線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｑ（四重線）、ｍ（多重線あるいは複雑に重なったシグナル）で表示した。
・13 C nuclear magnetic resonance spectrum ( 13 C NMR)
It was measured using ECA 500 (125 MHz) manufactured by JEOL Ltd. and described as “ 13 C NMR (measurement frequency, measurement solvent): chemical shift value (multiplicity)”. The chemical shift value (δ) is expressed in ppm with tetramethylsilane (δ = 0) as an internal standard. The multiplicity was expressed as s (single line), d (double line), t (triple line), q (quadruple line), m (multiple line or complicated overlapping signals).
・質量スペクトル（ＭＳ）：電子衝撃法（ＥＩ）
日本電子社製ＪＭＳ−６００Ｈ型質量分析計を用い、電子衝撃法（ＥＩ、イオン化エネルギー：７０ｅＶ）により測定した。“ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ 質量数（相対強度）”と記載した。
Mass spectrum (MS): Electron impact method (EI)
It measured by the electron impact method (EI, ionization energy: 70 eV) using the JMS-600H type | mold mass spectrometer by JEOL. It was described as “MS (EI) m / z mass number (relative intensity)”.
・質量スペクトル（ＭＳ）：エレクトロンスプレーイオン法（ＥＳＩ）
日本電子社製ＪＭＳ−Ｔ１００ＬＣ型ＴＯＦ質量分析計ＡｃｃｕＴＯＦを用い、エレクトロンスプレーイオン化法（ＥＳＩ）により測定した。なお、装置の設定は、脱溶媒ガス２５０℃、オリフィス１温度８０℃、ニードル電圧２０００Ｖ、リングレンズ電圧１０Ｖ、オリフィス１電圧８５Ｖ、オリフィス２電圧５Ｖとした。サンプル送液は、インフュージョン法で行い、流速３０μｌ／ｍｉｎとした。“ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ 質量数（Ｍ＋付加イオン）”と記載した。
Mass spectrum (MS): Electron spray ion method (ESI)
It measured by the electron spray ionization method (ESI) using JEOL Co., Ltd. JMS-T100LC type TOF mass spectrometer AccuTOF. The apparatus settings were as follows: solvent removal gas 250 ° C.,
（２）クロマトグラフィー
・分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
Ｅ．Ｍｅｒｃｋ社製のＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ254（Ａｒｔ．５７１５）厚さ０．２５ｍｍを使用した。ＴＬＣ上の化合物の検出はＵＶ照射（２５４ｎｍ又は３６５ｎｍ）及び発色剤に浸した後に加熱して発色させることによって行った。発色剤としてはｐ−アニスアルデヒド（９．３ｍｌ）と酢酸（３．８ｍｌ）をエタノール（３４０ｍｌ）に溶解し、濃硫酸（１２．５ｍｌ）を添加したものを使用した。
(2) Thin-layer chromatography (TLC) for chromatography and analysis
E. A Merck TLC plate, silica gel 60F 254 (Art. 5715) thickness 0.25 mm was used. Detection of the compound on TLC was performed by irradiating with UV irradiation (254 nm or 365 nm) and a color former, followed by heating to cause color development. As the color former, p-anisaldehyde (9.3 ml) and acetic acid (3.8 ml) dissolved in ethanol (340 ml) and concentrated sulfuric acid (12.5 ml) were added.
・分取用薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）
Ｅ．Ｍｅｒｃｋ社製のＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ254（Ａｒｔ．５７４４）厚さ０．５ｍｍを用いるか、又はＥ．Ｍｅｒｃｋ社製の薄層クロマトグラフィー用シリカゲル６０ＧＦ254（Ａｒｔ．７７３０）を２０ｃｍ×２０ｃｍのガラスプレート上に、厚さ１．７５ｍｍに調整したものを使用して行い、“［使用したガラスプレートの縦の長さ×横の長さ×厚さ×枚数；展開溶媒］”と記載した。
・ Preparative thin layer chromatography (PTLC)
E. A Merck TLC plate, silica gel 60F 254 (Art. 5744) 0.5 mm thick is used, or E.I. This is performed using Merck silica gel 60GF 254 (Art. 7730) for thin layer chromatography on a 20 cm × 20 cm glass plate adjusted to a thickness of 1.75 mm. Length × horizontal length × thickness × number of sheets; developing solvent] ”.
・高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
Ａｇｉｌｅｎｔ社製の１１００ｓｅｒｉｅｓを用いて測定した。
・ High performance liquid chromatography (HPLC)
Measurement was performed using Agilent 1100 series.
・シリカゲルカラムクロマトグラフィー
Ｅ．Ｍｅｒｃｋ社製のシリカゲル６０Ｆ254（Ａｒｔ．７７３４）を使用して行い、“使用したシリカゲルの重さ、展開溶媒”と記載した。
・ Silica gel column chromatography This was performed using Merck silica gel 60F 254 (Art. 7734), and was described as “weight of silica gel used, developing solvent”.
（３）基本操作
・反応後の抽出溶液の乾燥は、飽和食塩水にて洗浄後、無水硫酸ナトリウムを加えることで行った。
(3) Drying of the extracted solution after the basic operation and reaction was performed by adding anhydrous sodium sulfate after washing with saturated saline.
・反応後の中和を樹脂で行ったものについては、オルガノ株式会社製陽イオン交換樹脂アンバーライトＩＲ１２０Ｂ ＮＡ、又は陰イオン交換樹脂アンバーライトＩＲＡ４００ ＯＨ ＡＧを用いた。 -About what performed neutralization after reaction with resin, the cation exchange resin Amberlite IR120B NA or the anion exchange resin Amberlite IRA400 OH AG made from Organo Corporation was used.
・溶液の減圧濃縮は、アスピレーターの減圧下（２０〜３０ｍｍＨｇ）、ロータリーエバポレーターを用いて行った。痕跡量の溶媒の除去は、液体窒素浴で冷却したトラップを装着させた真空ポンプ（約１ｍｍＨｇ）を用いて行った。 The solution was concentrated under reduced pressure using a rotary evaporator under reduced pressure of an aspirator (20 to 30 mmHg). The trace amount of the solvent was removed using a vacuum pump (about 1 mmHg) equipped with a trap cooled in a liquid nitrogen bath.
・溶媒の混合比はすべて体積比で表した。 -All the mixing ratios of the solvent were expressed by volume ratio.
（４）溶媒
・蒸留水
アドバンテック東洋株式会社製ＧＳ−２００型蒸留水製造装置を用いて蒸留、及びイオン交換処理したものを使用した。
(4) Solvent / Distilled Water Distilled and ion-exchanged using a GS-200 type distilled water production apparatus manufactured by Advantech Toyo Co., Ltd. was used.
・トルエン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトニトリル
関東化学株式会社製の有機合成用脱水溶媒、又は特級溶媒を、モレキュラーシーブス（４Ａ）を用いて乾燥させて使用した。
・ Toluene, methanol, ethanol, isopropanol, dichloromethane, tetrahydrofuran, N, N-dimethylformamide, acetonitrile Use dehydrated solvent for organic synthesis or special grade solvent manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd. using molecular sieves (4A). did.
・ＮＭＲ測定用溶媒
以下に示すものをそのまま用いた。
ＣＤＣｌ3：ＩＳＯＴＥＣ Ｉｎｃ.製 ９９．７ ＡＴＯＭ％Ｄ、０．０３％ ＴＭＳ
ＣＤ3ＯＤ：ＩＳＯＴＥＣ Ｉｎｃ.製 ９９．８ ＡＴＯＭ％Ｄ（〜０．７ ＡＴＯＭ％13Ｃ）、０．０５％ ＴＭＳ
-Solvent for NMR measurement The following were used as they were.
CDCl 3 : 99.7 ATOM% D, 0.03% TMS, manufactured by ISOTEC Inc.
CD 3 OD: manufactured by ISOTEC Inc. 99.8 ATOM% D (˜0.7 ATOM% 13 C), 0.05% TMS
＜ピリジン環含有発光基質の合成１＞
（２−ジメチルアミノ−５−シアノピリジン（１）の合成）
２−アミノ−５−シアノピリジン（０）（１，１８５ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）、ヨードメタン（ＭｅＩ）（２．８３ｍｌ、４５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（５０ｍｌ）に溶解させた。この溶液を０℃にし、６０％水素化ナトリウム（ＮａＨ）（１,４３７ｍｇ、３５ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、混合物を３０分間撹拌した。反応混合物を室温に昇温し、１２時間撹拌した。反応混合物に少量のメタノールを加え、過剰のヨードメタン、水素化ナトリウムを分解させた。続いて水（１０ｍｌ）を加え、酢酸エチル（３×３０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー［シリカゲル６２．９ｇ；ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］にて精製すると、２−ジメチルアミノ−５−シアノピリジン（１）（１，１２１ｍｇ、７．６２ｍｍｏｌ、７６．２％）が茶褐色粉末固体として得られた。
(Synthesis of 2-dimethylamino-5-cyanopyridine (1))
2-Amino-5-cyanopyridine (0) (1,185 mg, 10 mmol) and iodomethane (MeI) (2.83 ml, 45 mmol) were dissolved in tetrahydrofuran (THF) (50 ml). The solution was brought to 0 ° C., 60% sodium hydride (NaH) (1,437 mg, 35 mmol) was added slowly and the mixture was stirred for 30 minutes. The reaction mixture was warmed to room temperature and stirred for 12 hours. A small amount of methanol was added to the reaction mixture to decompose excess iodomethane and sodium hydride. Subsequently, water (10 ml) was added and extracted with ethyl acetate (3 × 30 ml). The organic layers were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by column chromatography [silica gel 62.9 g; hexane-ethyl acetate (1: 1)] to give 2-dimethylamino-5-cyanopyridine (1) (1,121 mg, 7.62 mmol, 76.2%) was obtained as a brown powder solid.
・２−ジメチルアミノ−５−シアノピリジン（１）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 3.15 (6 H, s), 6.48 (1 H, d, J = 9.1 Hz), 7.58 (1 H, dd, J = 9.1, 2.3 Hz), 8.41 (1 H, d, J = 2.3 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 38.0 (q) × 2, 95.3 (d), 105.2 (s), 119.1 (s), 139.4 (s), 152.8 (s), 159.7 (s)
ＭＳ（ＥＩ） m/z 147 (M+・,97%),132 (100%), 118 (78%)
・ Identification result of 2-dimethylamino-5-cyanopyridine (1)
1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ): δ 3.15 (6 H, s), 6.48 (1 H, d, J = 9.1 Hz), 7.58 (1 H, dd, J = 9.1, 2.3 Hz), 8.41 ( (1 H, d, J = 2.3 Hz)
13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ): δ 38.0 (q) × 2, 95.3 (d), 105.2 (s), 119.1 (s), 139.4 (s), 152.8 (s), 159.7 (s)
MS (EI) m / z 147 (M +・, 97%), 132 (100%), 118 (78%)
（５−アルデヒド−２−ジメチルアミノピリジン（２）の合成）
５−シアノ−２−ジメチルアミノピリジン（１）（１,１２１ｍｇ、７．６２ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１０ｍｌ）に溶解し、アルゴン雰囲気下とした。この溶液を０℃まで冷却し、１．０Ｍ水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ−Ｈ）−トルエン溶液（１２ｍｌ）をゆっくり加え、３０分間撹拌した。続いてこの混合溶液を室温に昇温させ、１時間撹拌した。その後この反応混合物に少量のアセトン、水を加え過剰の還元剤を分解させた。さらにこの混合溶液に飽和酒石酸カリウムナトリウム水溶液（５０ｍｌ）、酢酸エチル（１０ｍｌ）を加え、一晩攪拌した。その後、酢酸エチル（２×３０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［シリカゲル６０ｇ；ヘキサン−酢酸エチル（１：１→０：１）］にて精製すると、５−アルデヒド−２−ジメチルアミノピリジン（２）（６９９．５ｍｇ、４．６７ｍｍｏｌ、６１．０％）が淡黄色粉末固体として得られた。
5-Cyano-2-dimethylaminopyridine (1) (1,121 mg, 7.62 mmol) was dissolved in dehydrated tetrahydrofuran (THF) (10 ml) and placed in an argon atmosphere. The solution was cooled to 0 ° C., 1.0 M diisobutylaluminum hydride (DIBAL-H) -toluene solution (12 ml) was slowly added, and the mixture was stirred for 30 minutes. Subsequently, the mixed solution was warmed to room temperature and stirred for 1 hour. Thereafter, a small amount of acetone and water were added to the reaction mixture to decompose the excess reducing agent. Furthermore, saturated potassium sodium tartrate aqueous solution (50 ml) and ethyl acetate (10 ml) were added to this mixed solution and stirred overnight. Then extracted with ethyl acetate (2 × 30 ml). The organic layers were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by silica gel column chromatography [silica gel 60 g; hexane-ethyl acetate (1: 1 → 0: 1)] to give 5-aldehyde-2-dimethylaminopyridine (2) (699.5 mg, 4 .67 mmol, 61.0%) was obtained as a pale yellow powdered solid.
・５−アルデヒド−２−ジメチルアミノピリジン（２）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3)：δ 3.21 (6 H, s), 6.55 (1 H, d, J = 9.2 Hz), 7.91 (1 H, dd, J = 9.2, 2.3 Hz), 8.55 (1 H, d, J = 2.3 Hz), 9.77 (1 H, s)
13Ｃ ＮＭＲ (125 MHz, ＣＤＣｌ3)：δ 38.3 (q) × 2, 105.8 (d), 121.8 (s), 136.1 (d), 154.7 (d), 161.5 (s), 189.3 (d)
ＭＳ（ＥＩ） m/z 150 (M+・, 100%), 135 (74%), 121 (60%)
・ Identification result of 5-aldehyde-2-dimethylaminopyridine (2)
1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ): δ 3.21 (6 H, s), 6.55 (1 H, d, J = 9.2 Hz), 7.91 (1 H, dd, J = 9.2, 2.3 Hz), 8.55 ( 1 H, d, J = 2.3 Hz), 9.77 (1 H, s)
13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ): δ 38.3 (q) × 2, 105.8 (d), 121.8 (s), 136.1 (d), 154.7 (d), 161.5 (s), 189.3 (d)
MS (EI) m / z 150 (M + ・, 100%), 135 (74%), 121 (60%)
（エチルエステル体（３）の合成）
５−アルデヒド−２−ジメチルアミノピリジン（２）（６００ｍｇ、４ｍｍｏｌ）、４−ホスホノクロトン酸トリエチル（１．５ｍｌ、１２ｍｍｏｌ）を、脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（３ｍｌ）に溶解し、アルゴン雰囲気下とした。この溶液を０℃まで冷却し、水素化ナトリウム（ＮａＨ）（３４２ｍｇ、１４．３ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、３０分間撹拌した。この反応混合物に水（１０ｍｌ）を加えて過剰の水素化ナトリウムを分解し、この溶液を室温に昇温させた。続いて、酢酸エチル（３×３０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［シリカゲル６０．１ｇ；ヘキサン−酢酸エチル（２：１）］にて精製すると、エチルエステル体（３）（４３３ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ、４４．０％）が黄色粉末固体として得られた。
5-Aldehyde-2-dimethylaminopyridine (2) (600 mg, 4 mmol) and triethyl 4-phosphonocrotonate (1.5 ml, 12 mmol) were dissolved in dehydrated tetrahydrofuran (THF) (3 ml) and placed under an argon atmosphere. did. The solution was cooled to 0 ° C. and sodium hydride (NaH) (342 mg, 14.3 mmol) was added slowly and stirred for 30 minutes. Water (10 ml) was added to the reaction mixture to decompose excess sodium hydride and the solution was allowed to warm to room temperature. Subsequently, it was extracted with ethyl acetate (3 × 30 ml). The organic layers were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by silica gel column chromatography [silica gel 60.1 g; hexane-ethyl acetate (2: 1)], and the ethyl ester (3) (433 mg, 1.76 mmol, 44.0%) was yellow. Obtained as a powdered solid.
・エチルエステル体（３）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 1.30 (3 H, t, J = 7.2 Hz), 3.12 (6 H, s), 4.21 (2 H, q, J = 7.2 Hz), 5.88 (1 H, d, J = 14.9 Hz), 6.50 (1 H, d, J = 9.2 Hz), 6.66 (1 H, dd, J = 10.9, 16.0 Hz), 6.79 (1 H, d, J = 16.0 Hz), 7.42 (1 H, dd, J = 14.9, 10.9 Hz), 7.62 (1 H, dd, J = 2.3, 9.2 Hz), 8.19 (1 H, d, J = 2.3 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 14.4 (q), 38.2 (q) × 2, 60.2 (t), 105.9 (d), 119.0 (d), 120.1 (s), 122.4 (d), 134.4 (d), 138.0 (d), 145.3 (d), 148.9 (d), 159.2 (s), 167.4 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） [M+H]+ ; m/z 247.11
・ Identification result of ethyl ester (3)
1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ): δ 1.30 (3 H, t, J = 7.2 Hz), 3.12 (6 H, s), 4.21 (2 H, q, J = 7.2 Hz), 5.88 (1 H , d, J = 14.9 Hz), 6.50 (1 H, d, J = 9.2 Hz), 6.66 (1 H, dd, J = 10.9, 16.0 Hz), 6.79 (1 H, d, J = 16.0 Hz), 7.42 (1 H, dd, J = 14.9, 10.9 Hz), 7.62 (1 H, dd, J = 2.3, 9.2 Hz), 8.19 (1 H, d, J = 2.3 Hz)
13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ): δ 14.4 (q), 38.2 (q) × 2, 60.2 (t), 105.9 (d), 119.0 (d), 120.1 (s), 122.4 (d), 134.4 (d), 138.0 (d), 145.3 (d), 148.9 (d), 159.2 (s), 167.4 (s)
MS (ESI) [M + H] + ; m / z 247.11
（カルボキシル体（４）の合成）
エチルエステル体（３）（３４０ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）をイソプロパノール（ｉＰｒＯＨ）（１０ｍｌ）に溶解し、５．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（５６０μｌ）を加え、その溶液を５時間加熱還流した。反応混合物に５．０Ｍ塩酸（５６０μｌ）を加え中和した後、ＴＨＦ（３×５０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。カルボキシル体（４）（２４０．２ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ、７９．７％）が薄黄色固体として得られた。
The ethyl ester (3) (340 mg, 1.38 mmol) was dissolved in isopropanol (iPrOH) (10 ml), 5.0 M aqueous sodium hydroxide solution (560 μl) was added, and the solution was heated to reflux for 5 hours. The reaction mixture was neutralized with 5.0 M hydrochloric acid (560 μl), and extracted with THF (3 × 50 ml). The organic layers were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The carboxyl body (4) (240.2 mg, 1.10 mmol, 79.7%) was obtained as a pale yellow solid.
・カルボキシル体（４）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 3.13 (6 H, s), 5.88 (1 H, d, J = 15.4 Hz), 6.51 (1 H, d, J = 9.2 Hz), 6.69 (1 H, dd, J = 11.4, 15.2 Hz), 6.83 (1 H, d, J = 15.4 Hz), 7.50 (1 H, dd, J = 11.4, 15.2 Hz), 7.63 (1 H, dd, J = 2.3, 9.2 Hz), 8.20 (1 H, d, J = 2.3 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125MHz, ＤＭＳＯ-Ｄ6）：δ 38.1(q) × 2, 106.6(d), 120.1(d), 122.9(s), 135.0(d), 138.0(d), 138.3(d), 145.6(d), 149.1(d), 159.3(s), 168.3(s)
ＭＳ（ＥＳＩ） [M+H]+ ; m/z 219.08
・ Identification result of carboxyl body (4)
1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ): δ 3.13 (6 H, s), 5.88 (1 H, d, J = 15.4 Hz), 6.51 (1 H, d, J = 9.2 Hz), 6.69 (1 H , dd, J = 11.4, 15.2 Hz), 6.83 (1 H, d, J = 15.4 Hz), 7.50 (1 H, dd, J = 11.4, 15.2 Hz), 7.63 (1 H, dd, J = 2.3, 9.2 Hz), 8.20 (1 H, d, J = 2.3 Hz)
13 C NMR (125 MHz, DMSO-D6): δ 38.1 (q) × 2, 106.6 (d), 120.1 (d), 122.9 (s), 135.0 (d), 138.0 (d), 138.3 (d), 145.6 (d), 149.1 (d), 159.3 (s), 168.3 (s)
MS (ESI) [M + H] + ; m / z 219.08
（アミド体（５）の合成）
カルボキシル体（４）（１２６ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）とＳ−トリチル−Ｄ−システインメチルエステル（２６１ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５．０ｍｌ）に溶解した。この溶液に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（２７８ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１４１ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合物を室温で１５時間撹拌した。反応混合物に水（５０ｍｌ）を加え、酢酸エチル（３×５０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［シリカゲル５０ｇ；酢酸エチル−ヘキサン（１：１）］にて精製すると、アミド体（５）（２６４ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、７９．０％）が黄色固体として得られた。
Carboxyl derivative (4) (126 mg, 0.58 mmol) and S-trityl-D-cysteine methyl ester (261 mg, 0.70 mmol) were dissolved in N, N-dimethylformamide (DMF) (5.0 ml). To this solution was added 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) (278 mg, 1.45 mmol), N, N-dimethyl-4-aminopyridine (DMAP) (141 mg, 1.15 mmol). And the reaction mixture was stirred at room temperature for 15 hours. Water (50 ml) was added to the reaction mixture and extracted with ethyl acetate (3 × 50 ml). The organic layers were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by silica gel column chromatography [silica gel 50 g; ethyl acetate-hexane (1: 1)] to obtain amide compound (5) (264 mg, 0.46 mmol, 79.0%) as a yellow solid. It was.
・アミド体（５）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 2.69 (2 H, m), 3.13 (6 H, s), 3.70 (3 H, s), 4.73 (1 H, m), 5.84 (1 H, d, J = 15.0 Hz), 6.50 (1 H, d, J = 9.2 Hz), 6.64 (1 H, dd, J = 10.9, 15.5 Hz), 6.76 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 7.18-7.38 (17 H, comp), 7.60 (1 H, dd, J = 2.3, 9.2 Hz), 8.19 (1 H, d, J = 2.3 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 34.2 (t), 38.2 (q) × 2, 51.2 (q), 52.7 (d), 67.0 (s), 105.9 (d), 120.3 (s), 121.0 (d), 122.4 (d), 127.0 (d), 128.1 (d) × 2, 129.6 (d) × 2, 134.5 (d), 137.4 (d), 142.5 (d), 144.4 (s), 148.6 (d), 159.1 (s), 165.8 (s), 171.2 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） [(M+H)+] m/z : 578.22
・ Identification result of amide (5)
1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ): δ 2.69 (2 H, m), 3.13 (6 H, s), 3.70 (3 H, s), 4.73 (1 H, m), 5.84 (1 H, d , J = 15.0 Hz), 6.50 (1 H, d, J = 9.2 Hz), 6.64 (1 H, dd, J = 10.9, 15.5 Hz), 6.76 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 7.18- 7.38 (17 H, comp), 7.60 (1 H, dd, J = 2.3, 9.2 Hz), 8.19 (1 H, d, J = 2.3 Hz)
13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ): δ 34.2 (t), 38.2 (q) × 2, 51.2 (q), 52.7 (d), 67.0 (s), 105.9 (d), 120.3 (s), 121.0 (d), 122.4 (d), 127.0 (d), 128.1 (d) × 2, 129.6 (d) × 2, 134.5 (d), 137.4 (d), 142.5 (d), 144.4 (s), 148.6 ( d), 159.1 (s), 165.8 (s), 171.2 (s)
MS (ESI) [(M + H) + ] m / z: 578.22
（チアゾリン体（６）の合成）
アミド体（５）（１６０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下にし、ジクロロメタン（５．０ｍｌ）を加えた。この溶液を０℃に冷却し、トリフルオロ酢酸無水物（ＴＦＡＡ）（０．２ｍｌ、１．４４ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、３０分間撹拌した。続いて室温に昇温させ、２４時間撹拌した。原料が消失したのを確認した後、陰イオン交換樹脂ＩＲＡ４００ ＯＨ ＡＧを用いて中和した。樹脂を洗浄して濾別し、得られた洗液を減圧濃縮した。得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー［２０ｃｍ×２０ｃｍ×１．７５ｍｍ×３枚；ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］で精製すると、チアゾリン体（６）（１３．４ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ、１５．０％）が黄色固体として得られた。
The amide compound (5) (160 mg, 0.28 mmol) was placed under an argon atmosphere, and dichloromethane (5.0 ml) was added. The solution was cooled to 0 ° C. and trifluoroacetic anhydride (TFAA) (0.2 ml, 1.44 mmol) was added slowly and stirred for 30 minutes. Then, it heated up to room temperature and stirred for 24 hours. After confirming the disappearance of the raw material, it was neutralized using an anion exchange resin IRA400 OH AG. The resin was washed and filtered off, and the resulting wash was concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by preparative thin layer chromatography [20 cm × 20 cm × 1.75 mm × 3; hexane-ethyl acetate (1: 1)] to obtain thiazoline (6) (13.4 mg, 0.042 mmol). 15.0%) was obtained as a yellow solid.
・チアゾリン体（６）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 3.11 (6 H, s), 3.56 (2 H, m), 3.81 (3 H, s), 5.15 (1 H, t, J = 9.2 Hz), 6.49 (1 H, d, J = 9.2 Hz), 6.53 (1 H, d, J = 14.9 Hz), 6.72 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.92 (1 H, dd, J = 9.8, 15.5 Hz), 7.37 (1 H, dd, J = 9.8, 14.9 Hz), 7.61 (1 H, dd, J = 2.3, 9.2 Hz), 8.16 (1 H, d, J = 2.3 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 34.6 (t), 38.2 (q) × 2, 52.8 (q), 77.9 (d), 106.0 (d), 120.2 (s), 123.1 (d), 123.3 (d), 134.1 (d), 136.3 (d), 143.3 (d), 148.8 (d), 159.0 (s), 170.2 (s), 171.4 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） m/z: [(M+H)+] 318.08
・ Identification result of thiazoline (6)
1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ): δ 3.11 (6 H, s), 3.56 (2 H, m), 3.81 (3 H, s), 5.15 (1 H, t, J = 9.2 Hz), 6.49 (1 H, d, J = 9.2 Hz), 6.53 (1 H, d, J = 14.9 Hz), 6.72 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.92 (1 H, dd, J = 9.8, 15.5 Hz), 7.37 (1 H, dd, J = 9.8, 14.9 Hz), 7.61 (1 H, dd, J = 2.3, 9.2 Hz), 8.16 (1 H, d, J = 2.3 Hz)
13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ): δ 34.6 (t), 38.2 (q) × 2, 52.8 (q), 77.9 (d), 106.0 (d), 120.2 (s), 123.1 (d), 123.3 (d), 134.1 (d), 136.3 (d), 143.3 (d), 148.8 (d), 159.0 (s), 170.2 (s), 171.4 (s)
MS (ESI) m / z: [(M + H) + ] 318.08
（ピリジン環含有発光基質（７）の合成）
チアゾリン体（６）（１０．７ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（５ｍｌ）に溶解し、５．０Ｍ塩酸（３００μｌ）を加え、その溶液を２４時間室温で撹拌した。反応混合物に重曹を加え中和した後、酢酸エチル（３×５０ｍｌ）で抽出した。ピリジン環含有発光基質（７）［即ち、上記化学式（II）で表される化合物］（９．２ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ、８８．２％）が粗生成物として得られた。
The thiazoline (6) (10.7 mg, 0.034 mmol) was dissolved in tetrahydrofuran (THF) (5 ml), 5.0 M hydrochloric acid (300 μl) was added, and the solution was stirred for 24 hours at room temperature. The reaction mixture was neutralized with sodium bicarbonate, and extracted with ethyl acetate (3 × 50 ml). A pyridine ring-containing luminescent substrate (7) [that is, a compound represented by the above chemical formula (II)] (9.2 mg, 0.030 mmol, 88.2%) was obtained as a crude product.
・発光基質（７）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤ3ＯＤ）：δ 3.29 (6 H, s), 3.76-3.68 (2 H, comp.), 5.25 (1 H, m), 6.69 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 7.10 (1 H, dd, J = 10.9, 15.5 Hz), 7.22 (1 H, d, J = 9.8 Hz), 8.05 (1 H, s), 7.23 (1 H, m), 8.25 (1 H, d, J = 9.7 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤ3ＣＤ）：δ 35.5 (t), 37.2 (q) × 2, 80.8 (d), 106.5 (d), 120.7 (d), 123.3 (d), 123.6 (d), 134.4 (s), 135.3 (d), 142.5 (d), 147.7 (d), 158.9 (s), 169.5 (s), 176.9 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） m/z: [(M+H)+] 304.10
・ Identification result of luminescent substrate (7)
1 H NMR (500 MHz, CD 3 OD): δ 3.29 (6 H, s), 3.76-3.68 (2 H, comp.), 5.25 (1 H, m), 6.69 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 7.10 (1 H, dd, J = 10.9, 15.5 Hz), 7.22 (1 H, d, J = 9.8 Hz), 8.05 (1 H, s), 7.23 (1 H, m), 8.25 (1 (H, d, J = 9.7 Hz)
13 C NMR (125 MHz, CD 3 CD): δ 35.5 (t), 37.2 (q) × 2, 80.8 (d), 106.5 (d), 120.7 (d), 123.3 (d), 123.6 (d), 134.4 (s), 135.3 (d), 142.5 (d), 147.7 (d), 158.9 (s), 169.5 (s), 176.9 (s)
MS (ESI) m / z: [(M + H) + ] 304.10
＜ピリジン環含有発光基質の合成２＞
（２−シアノ−５−ジメチルアミノピリジン（１１）の合成）
５−アミノ−２−シアノピリジン（１０）（１，３０８ｍｇ、１１ｍｍｏｌ）、ヨードメタン（ＣＨ3Ｉ）（２．０ｍｌ、３３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１００ｍｌ）に溶解させた。この溶液を０℃にし、６０％水素化ナトリウム（ＮａＨ）（１３０８ ｍｇ、３３ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、混合物を５０時間撹拌した。反応混合物に少量のメタノールを加え、過剰のヨードメタン、水素化ナトリウムを分解させた。続いて水（１０ｍｌ）を加え、酢酸エチル（３×３０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー［シリカゲル５９．２ｇ；ヘキサン−酢酸エチル（１：２）］にて精製すると、２−シアノ−５−ジメチルアミノピリジン（１１）（１，３０３．８ｍｇ、８．８６ｍｍｏｌ、８０％）が茶褐色粉末固体として得られた。
(Synthesis of 2-cyano-5-dimethylaminopyridine (11))
5-Amino-2-cyanopyridine (10) (1,308 mg, 11 mmol) and iodomethane (CH 3 I) (2.0 ml, 33 mmol) were dissolved in tetrahydrofuran (THF) (100 ml). The solution was brought to 0 ° C., 60% sodium hydride (NaH) (1308 mg, 33 mmol) was added slowly and the mixture was stirred for 50 h. A small amount of methanol was added to the reaction mixture to decompose excess iodomethane and sodium hydride. Subsequently, water (10 ml) was added and extracted with ethyl acetate (3 × 30 ml). The organic layers were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by column chromatography [silica gel 59.2 g; hexane-ethyl acetate (1: 2)] to give 2-cyano-5-dimethylaminopyridine (11) (1,303.8 mg, 8. 86 mmol, 80%) was obtained as a brown powder solid.
・２−シアノ−５−ジメチルアミノピリジン（１１）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 3.08 (6 H, s), 6.87 (1 H, dd, J = 9.2, 2.9 Hz), 7.48 (1 H, d, J = 9.2 Hz), 8.12 (1 H, d, J = 2.9 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 39.8 (q) × 2, 116.5 (s), 119.0 (d), 119.1 (s), 129.1 (d), 135.3 (d), 147.2 (s)
ＭＳ（ＥＩ） m/z 146 (M+・, 100%), 147 (81%)
・ Identification result of 2-cyano-5-dimethylaminopyridine (11)
1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ): δ 3.08 (6 H, s), 6.87 (1 H, dd, J = 9.2, 2.9 Hz), 7.48 (1 H, d, J = 9.2 Hz), 8.12 ( (1 H, d, J = 2.9 Hz)
13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ): δ 39.8 (q) × 2, 116.5 (s), 119.0 (d), 119.1 (s), 129.1 (d), 135.3 (d), 147.2 (s)
MS (EI) m / z 146 (M + ・, 100%), 147 (81%)
（２−アルデヒド−５−ジメチルアミノピリジン（１２）の合成）
２−シアノ−５−ジメチルアミノピリジン（１１）（７２３．０ｍｇ、４．９ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２０ｍｌ）に溶解し、アルゴン雰囲気下とした。この溶液を０℃まで冷却し、１．０Ｍ水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ−Ｈ）−トルエン溶液（７．５ｍｌ）をゆっくり加え、１５分間撹拌した。続いてこの混合溶液を室温に昇温させ、１時間撹拌した。その後この反応混合物に十分量のアセトン、水を加え過剰の還元剤を分解させた。さらにこの混合溶液に飽和酒石酸カリウムナトリウム水溶液（５０ｍｌ）、酢酸エチル（１０ｍｌ）を加え、一晩攪拌した。その後、酢酸エチル（２×３０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［シリカゲル５６．９ｇ；クロロホルム−メタノール（１０：１）］にて精製すると、２−アルデヒド−５−ジメチルアミノピリジン（１２）（３６８．７ｍｇ、２．４６ｍｍｏｌ、５０％）が淡黄色粉末固体として得られた。
2-Cyano-5-dimethylaminopyridine (11) (723.0 mg, 4.9 mmol) was dissolved in dehydrated tetrahydrofuran (THF) (20 ml) and placed in an argon atmosphere. The solution was cooled to 0 ° C., 1.0 M diisobutylaluminum hydride (DIBAL-H) -toluene solution (7.5 ml) was slowly added, and the mixture was stirred for 15 minutes. Subsequently, the mixed solution was warmed to room temperature and stirred for 1 hour. Thereafter, sufficient amounts of acetone and water were added to the reaction mixture to decompose excess reducing agent. Furthermore, saturated potassium sodium tartrate aqueous solution (50 ml) and ethyl acetate (10 ml) were added to this mixed solution and stirred overnight. Then extracted with ethyl acetate (2 × 30 ml). The organic layers were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by silica gel column chromatography [silica gel 56.9 g; chloroform-methanol (10: 1)] to give 2-aldehyde-5-dimethylaminopyridine (12) (368.7 mg, 2.46 mmol, 50%) was obtained as a pale yellow powdered solid.
・２−アルデヒド−５−ジメチルアミノピリジン（１２）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3)：δ 3.13 (6 H, s), 6.96 (1 H, dd, J = 8.6, 2.9 Hz), 7.86 (1 H, d, J = 8.6 Hz), 8.19 (1 H, d, J = 2.9 Hz), 9.88 (1 H, s)
13Ｃ ＮＭＲ (125 MHz, ＣＤＣｌ3)：δ 39.7 (q) × 2, 116.5 (d), 123.4 (d), 133.9 (d), 141.5 (s), 148.2 (s), 191.5(s)
ＭＳ（ＥＩ） m/z 150 (M+・, 100%)
・ Identification result of 2-aldehyde-5-dimethylaminopyridine (12)
1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ): δ 3.13 (6 H, s), 6.96 (1 H, dd, J = 8.6, 2.9 Hz), 7.86 (1 H, d, J = 8.6 Hz), 8.19 ( 1 H, d, J = 2.9 Hz), 9.88 (1 H, s)
13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ): δ 39.7 (q) × 2, 116.5 (d), 123.4 (d), 133.9 (d), 141.5 (s), 148.2 (s), 191.5 (s)
MS (EI) m / z 150 (M + ・, 100%)
（エチルエステル体（１３）の合成）
２−アルデヒド−５−ジメチルアミノピリジン（１２）（３１．４ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）、４−ホスホノクロトン酸トリエチル（８０μｌ、０．３６ｍｍｏｌ）を、脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１０ｍｌ）に溶解し、アルゴン雰囲気下とした。この溶液を０℃まで冷却し、６０％水素化ナトリウム（ＮａＨ）（２１．６ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、３０分間撹拌した。この反応混合物に水（１０ｍｌ）を加えて過剰の水素化ナトリウムを分解し、この溶液を室温に昇温させた。続いて、酢酸エチル（３×３０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー［２０ｃｍ×２０ｃｍ×１．７５ｍｍ×２枚；ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］にて精製すると、エチルエステル体（１３）（３８．７ｍｇ、０．１５７ｍｍｏｌ、７４％）が黄色粉末固体として得られた。
2-aldehyde-5-dimethylaminopyridine (12) (31.4 mg, 0.21 mmol), triethyl 4-phosphonocrotonate (80 μl, 0.36 mmol) was dissolved in dehydrated tetrahydrofuran (THF) (10 ml), Under an argon atmosphere. The solution was cooled to 0 ° C. and 60% sodium hydride (NaH) (21.6 mg, 0.54 mmol) was added slowly and stirred for 30 minutes. Water (10 ml) was added to the reaction mixture to decompose excess sodium hydride and the solution was allowed to warm to room temperature. Subsequently, it was extracted with ethyl acetate (3 × 30 ml). The organic layers were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by preparative thin layer chromatography [20 cm × 20 cm × 1.75 mm × 2 sheets; hexane-ethyl acetate (1: 1)] to give an ethyl ester (13) (38.7 mg, 0 .157 mmol, 74%) was obtained as a yellow powdered solid.
・エチルエステル体（１３）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 1.31 (3 H, t, J = 7.5 Hz), 3.03 (6 H, s), 4.21 (2 H, q, J = 6.8 Hz), 5.98 (1 H, d, J = 14.9 Hz), 6.87 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.90 (1 H, dd, J = 8.6, 2.8 Hz), 7.12 (1 H, dd, J = 11.4, 15.5 Hz), 7.22 (1 H, d, J = 8.6 Hz), 7.46 (1 H, dd, J = 11.5, 15.5 Hz), 8.14 (1 H, d, J = 2.8 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 14.4 (q), 40.0 (q) × 2, 60.3 (t), 118.0 (d), 120.7 (d), 123.8 (d), 125.4 (d), 135.0 (d), 139.8 (d), 142.3 (s), 144.9 (s), 145.6 (d), 167.4 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） [M+H]+ ; m/z 247.15
・ Identification result of ethyl ester (13)
1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ): δ 1.31 (3 H, t, J = 7.5 Hz), 3.03 (6 H, s), 4.21 (2 H, q, J = 6.8 Hz), 5.98 (1 H , d, J = 14.9 Hz), 6.87 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.90 (1 H, dd, J = 8.6, 2.8 Hz), 7.12 (1 H, dd, J = 11.4, 15.5 Hz ), 7.22 (1 H, d, J = 8.6 Hz), 7.46 (1 H, dd, J = 11.5, 15.5 Hz), 8.14 (1 H, d, J = 2.8 Hz)
13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ): δ 14.4 (q), 40.0 (q) × 2, 60.3 (t), 118.0 (d), 120.7 (d), 123.8 (d), 125.4 (d), 135.0 (d), 139.8 (d), 142.3 (s), 144.9 (s), 145.6 (d), 167.4 (s)
MS (ESI) [M + H] + ; m / z 247.15
（カルボキシル体（１４）の合成）
エチルエステル体（１３）（５４．０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）をイソプロパノール（ｉＰｒＯＨ）（１０ｍｌ）に溶解し、５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１３０μｌ）を加え、その溶液を２６時間加熱還流した。反応混合物に４Ｍ塩酸を加え中和した後、減圧濃縮した。カルボキシル体（１４）（２４０．２ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ、７９．７％）が薄黄色個体として得られた。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［シリカゲル１１．９ｇ；クロロホルム−メタノール（５：１）］にて精製すると、カルボキシル体（１４）（５０．０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、１１５％）が淡緑色粉末固体として得られた。
The ethyl ester compound (13) (54.0 mg, 0.22 mmol) was dissolved in isopropanol (iPrOH) (10 ml), 5M aqueous sodium hydroxide solution (130 μl) was added, and the solution was heated to reflux for 26 hours. The reaction mixture was neutralized with 4M hydrochloric acid, and concentrated under reduced pressure. The carboxyl body (14) (240.2 mg, 1.10 mmol, 79.7%) was obtained as a pale yellow solid. When the obtained residue was purified by silica gel column chromatography [silica gel 11.9 g; chloroform-methanol (5: 1)], the carboxyl form (14) (50.0 mg, 0.23 mmol, 115%) was a pale green powder. Obtained as a solid.
・カルボキシル体（１４）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤ3ＯＤ）：δ 3.02 (6 H, s), 5.99 (1 H, d, J = 15.4 Hz), 6.86 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 7.06 (1 H, dd, J = 11.5, 15.4 Hz), 7.12 (1 H, dd, J = 2.9, 8.6 Hz), 7.37 (1 H, dd, J = 11.5, 15.4 Hz), 7.45 (1 H, d, J = 8.6 Hz), 8.00 (1 H, d, J = 2.9 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125MHz, ＣＤ3ＯＤ）：δ 38.6 (q) × 2, 118.9 (d), 123.1 (d), 123.6 (d), 126.1 (d), 133.2 (d), 137.8 (d), 142.0 (s), 143.5 (s), 146.0 (d), 172.3 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） [M+H]+ ; m/z 219.11
・ Identification result of carboxyl body (14)
1 H NMR (500 MHz, CD 3 OD): δ 3.02 (6 H, s), 5.99 (1 H, d, J = 15.4 Hz), 6.86 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 7.06 (1 H, dd, J = 11.5, 15.4 Hz), 7.12 (1 H, dd, J = 2.9, 8.6 Hz), 7.37 (1 H, dd, J = 11.5, 15.4 Hz), 7.45 (1 H, d, J = 8.6 Hz), 8.00 (1 H, d, J = 2.9 Hz)
13 C NMR (125 MHz, CD 3 OD): δ 38.6 (q) × 2, 118.9 (d), 123.1 (d), 123.6 (d), 126.1 (d), 133.2 (d), 137.8 (d), 142.0 (s), 143.5 (s), 146.0 (d), 172.3 (s)
MS (ESI) [M + H] + ; m / z 219.11
（アミド体（１５）の合成）
カルボキシル体（１４）（１０４．８ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）とＳ−トリチル−Ｄ−システインメチルエステル（３８６．８ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５０ｍｌ）に溶解した。この溶液に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（３００．６ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）（２９５．１ｍｇ、２．４１ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物に水（５０ｍｌ）を加え、酢酸エチル（３×５０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［シリカゲル５０．５ｇ；クロロホルム−メタノール（１０：１）］にて精製したのち、さらに、分取薄層クロマトグラフィー［２０ｃｍ×２０ｃｍ×１．７５ｍｍ×４枚；クロロホルム−メタノール（１０：１）］にて精製すると、アミド体（１５）（２６４ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、７９％）が黄色固体として得られた。
Carboxyl compound (14) (104.8 mg, 0.48 mmol) and S-trityl-D-cysteine methyl ester (386.8 mg, 1.06 mmol) were dissolved in N, N-dimethylformamide (DMF) (50 ml). To this solution was added 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) (300.6 mg, 1.57 mmol), N, N-dimethyl-4-aminopyridine (DMAP) (295.1 mg, 2.41 mmol) was added and the reaction mixture was stirred at room temperature for 2 hours. Water (50 ml) was added to the reaction mixture and extracted with ethyl acetate (3 × 50 ml). The organic layers were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by silica gel column chromatography [silica gel 50.5 g; chloroform-methanol (10: 1)], and further preparative thin layer chromatography [20 cm × 20 cm × 1.75 mm × 4 pieces; Purification with chloroform-methanol (10: 1)] gave the amide compound (15) (264 mg, 0.46 mmol, 79%) as a yellow solid.
・アミド体（１５）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 2.70 (2 H, m), 3.02 (6 H, s), 4.73 (1 H, m), 5.91 (1 H, d, J = 14.9 Hz), 5.96 (1 H, d, J = 8.0 Hz), 6.49 (1 H, m), 6.84 (1 H, d, J = 15.4 Hz), 6.90 (1H, dd, J = 2.9 Hz, 8.6 Hz), 7.12 (1 H, dd, J = 11.5, 15.4 Hz), 7.25-7.39 (15 H, m), 8.14 (1 H, d, J = 2.8 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 34.1 (t), 40.1 (q) × 2, 51.2 (s), 52.8 (d), 67.1 (s), 118.1 (d), 122.6 (d), 123.8 (d), 125.5 (d), 127.0 (t) × 3, 128.1 (d) × 6, 129.6 (d) × 6, 135.0 (d), 139.1 (n), 142.2 (d), 144.4 (s) × 3, 145.5 (s) × 3, 149.4 (s), 165.7 (s), 171.1 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） [(M+H)+] m/z : 578.22
・ Identification result of amide compound (15)
1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ): δ 2.70 (2 H, m), 3.02 (6 H, s), 4.73 (1 H, m), 5.91 (1 H, d, J = 14.9 Hz), 5.96 (1 H, d, J = 8.0 Hz), 6.49 (1 H, m), 6.84 (1 H, d, J = 15.4 Hz), 6.90 (1H, dd, J = 2.9 Hz, 8.6 Hz), 7.12 ( 1 H, dd, J = 11.5, 15.4 Hz), 7.25-7.39 (15 H, m), 8.14 (1 H, d, J = 2.8 Hz)
13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ): δ 34.1 (t), 40.1 (q) × 2, 51.2 (s), 52.8 (d), 67.1 (s), 118.1 (d), 122.6 (d), 123.8 (d), 125.5 (d), 127.0 (t) × 3, 128.1 (d) × 6, 129.6 (d) × 6, 135.0 (d), 139.1 (n), 142.2 (d), 144.4 (s) × 3, 145.5 (s) × 3, 149.4 (s), 165.7 (s), 171.1 (s)
MS (ESI) [(M + H) + ] m / z: 578.22
（チアゾリン体（１６）の合成）
アミド体（１５）（１４５．１ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下にし、ジクロロメタン（１０．０ｍｌ）を加えた。この溶液を０℃に冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（Ｔｆ2Ｏ）（１０５μｌ、０．６２ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、５０分間撹拌した。原料が消失したのを確認した後、陰イオン交換樹脂ＩＲＡ４００ ＯＨ ＡＧを用いて中和した。樹脂を洗浄して濾別し、得られた洗液を減圧濃縮した。得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー［２０ｃｍ×２０ｃｍ×１．７５ｍｍ×２枚；酢酸エチル］で精製すると、チアゾリン体（１６）（１５．６ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ、２０％）が黄色油状物として得られた。
The amide compound (15) (145.1 mg, 0.25 mmol) was placed under an argon atmosphere, and dichloromethane (10.0 ml) was added. The solution was cooled to 0 ° C. and trifluoromethanesulfonic anhydride (Tf 2 O) (105 μl, 0.62 mmol) was added slowly and stirred for 50 minutes. After confirming the disappearance of the raw material, it was neutralized using an anion exchange resin IRA400 OH AG. The resin was washed and filtered off, and the resulting wash was concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by preparative thin layer chromatography [20 cm × 20 cm × 1.75 mm × 2; ethyl acetate] to give thiazoline derivative (16) (15.6 mg, 0.049 mmol, 20%) as a yellow oil It was obtained as a product.
・チアゾリン体（１６）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤ3ＯＤ）：δ 3.05 (6 H, s), 3.56 (2 H, m), 3.82 (3 H, s), 5.16 (1 H, t, J = 9.2 Hz), 6.64 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.79 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.89 (1 H, dd, J = 2.9, 8.6 Hz), 6.95 (1 H, dd, J = 10.9, 15.5 Hz), 7.13 (1 H, dd, J = 10.9, 15.5 Hz), 7.20 (1 H, d, J = 8.6 Hz), 8.12 (1 H, d, J = 2.9 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 34.6 (t), 40.0 (q) × 2, 52.9 (q), 78.0 (d), 118.1 (d), 123.7 (d), 125.1 (d), 126.3 (d), 135.0 (d), 138.1 (d), 142.6 (s), 142.9 (s), 145.5 (d), 170.2 (s), 171.5 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） m/z: [(M+H)+] 318.12
・ Identification result of thiazoline (16)
1 H NMR (500 MHz, CD 3 OD): δ 3.05 (6 H, s), 3.56 (2 H, m), 3.82 (3 H, s), 5.16 (1 H, t, J = 9.2 Hz), 6.64 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.79 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.89 (1 H, dd, J = 2.9, 8.6 Hz), 6.95 (1 H, dd, J = 10.9, 15.5 Hz), 7.13 (1 H, dd, J = 10.9, 15.5 Hz), 7.20 (1 H, d, J = 8.6 Hz), 8.12 (1 H, d, J = 2.9 Hz)
13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ): δ 34.6 (t), 40.0 (q) × 2, 52.9 (q), 78.0 (d), 118.1 (d), 123.7 (d), 125.1 (d), 126.3 (d), 135.0 (d), 138.1 (d), 142.6 (s), 142.9 (s), 145.5 (d), 170.2 (s), 171.5 (s)
MS (ESI) m / z: [(M + H) + ] 318.12
（ピリジン環含有発光基質（１７）の合成）
チアゾリン体（１６）（１５．６ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）をＨ2Ｏ（１ｍｌ）に溶解し、４Ｍ塩酸（１ｍｌ）を加え、その溶液を４０時間室温で撹拌した。反応混合物に重曹を加え中和した後、減圧濃縮した。ピリジン環含有発光基質（１７）［即ち、上記化学式（III）で表される化合物］（３ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ、２０％）が粗生成物として得られた。
The thiazoline derivative (16) (15.6 mg, 0.049 mmol) was dissolved in H 2 O (1 ml), 4M hydrochloric acid (1 ml) was added, and the solution was stirred at room temperature for 40 hours. The reaction mixture was neutralized with sodium bicarbonate, and then concentrated under reduced pressure. A pyridine ring-containing luminescent substrate (17) [that is, a compound represented by the above chemical formula (III)] (3 mg, 0.01 mmol, 20%) was obtained as a crude product.
・ピリジン環含有発光基質（１７）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤ3ＯＤ）：δ 3.02 (6 H, s), 3.52 (2 H, m), 5.95 (1 H, t, J = 9.2 Hz), 6.63 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.81 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.96 (1 H, dd, J = 10.9, 15.5 Hz), 7.08 (1 H, dd, J = 10.9, 15.5 Hz), 7.11 (1 H, dd, J = 2.8, 8.9 Hz), 7.44 (1 H, d, J = 8.9), 7.99 (1 H, d, J = 2.8 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤ3ＯＤ）：δ 35.5 (t), 38.7 (q) × 2, 80.9 (d), 118.9 (d), 122.9 (d), 125.1 (d), 126.6 (d), 133.3 (d), 136.9 (d), 141.8 (s), 142.2 (s), 146.0 (d), 169.2 (s), 176.8 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） m/z: [(M+H)+] 304.09
・ Identification result of luminescent substrate containing pyridine ring (17)
1 H NMR (500 MHz, CD 3 OD): δ 3.02 (6 H, s), 3.52 (2 H, m), 5.95 (1 H, t, J = 9.2 Hz), 6.63 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.81 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.96 (1 H, dd, J = 10.9, 15.5 Hz), 7.08 (1 H, dd, J = 10.9, 15.5 Hz), 7.11 ( 1 H, dd, J = 2.8, 8.9 Hz), 7.44 (1 H, d, J = 8.9), 7.99 (1 H, d, J = 2.8 Hz)
13 C NMR (125 MHz, CD 3 OD): δ 35.5 (t), 38.7 (q) × 2, 80.9 (d), 118.9 (d), 122.9 (d), 125.1 (d), 126.6 (d), 133.3 (d), 136.9 (d), 141.8 (s), 142.2 (s), 146.0 (d), 169.2 (s), 176.8 (s)
MS (ESI) m / z: [(M + H) + ] 304.09
＜ピラジン環含有発光基質の合成＞
（２−ジメチルアミノ−５−ブロモ−ピラジン（２１）の合成）
２−アミノ−５−ブロモ−ピラジン（２０）（１，１７０ｍｇ、６．７２ｍｍｏｌ）、ヨードメタン（ＣＨ3Ｉ）（１．２ｍｌ、１９．５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１００ｍｌ）に溶解させた。この溶液を０℃にし、６０％水素化ナトリウム（ＮａＨ）（１．５ｇ、３７．５ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、混合物を５時間撹拌した。反応混合物に少量のメタノールを加え、過剰のヨードメタン、水素化ナトリウムを分解させた。続いて水（１０ｍｌ）を加え、酢酸エチル（３×２００ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー［シリカゲル４８．５ｇ；ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］にて精製すると、２−ジメチルアミノ−５−ブロモ−ピラジン（２１）（１，０９６ｍｇ、５．４ｍｍｏｌ、８０％）が淡黄色粉末固体として得られた。
(Synthesis of 2-dimethylamino-5-bromo-pyrazine (21))
2-Amino-5-bromo-pyrazine (20) (1,170 mg, 6.72 mmol) and iodomethane (CH 3 I) (1.2 ml, 19.5 mmol) were dissolved in tetrahydrofuran (THF) (100 ml). The solution was brought to 0 ° C., 60% sodium hydride (NaH) (1.5 g, 37.5 mmol) was added slowly and the mixture was stirred for 5 hours. A small amount of methanol was added to the reaction mixture to decompose excess iodomethane and sodium hydride. Subsequently, water (10 ml) was added and extracted with ethyl acetate (3 × 200 ml). The organic layers were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by column chromatography [silica gel 48.5 g; hexane-ethyl acetate (1: 1)] to give 2-dimethylamino-5-bromo-pyrazine (21) (1,096 mg, 5.4 mmol). 80%) was obtained as a pale yellow powdered solid.
・２−ジメチルアミノ−５−ブロモ−ピラジン（２１）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 3.08 (6 H, s), 7.74 (1 H, s), 8.10 (1 H, s)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 37.9 (q) × 2, 124.7 (s), 129.2 (d), 143.8 (d), 154.0 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） [M+H]+ ; m/z 201.96, 203.96
・ Identification result of 2-dimethylamino-5-bromo-pyrazine (21)
1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ): δ 3.08 (6 H, s), 7.74 (1 H, s), 8.10 (1 H, s)
13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ): δ 37.9 (q) × 2, 124.7 (s), 129.2 (d), 143.8 (d), 154.0 (s)
MS (ESI) [M + H] + ; m / z 201.96, 203.96
（５−アルデヒド−２−ジメチルアミノピラジン（２２）の合成）
２−ジメチルアミノ−５−ブロモ−ピラジン（２１）（１．３７ｇ、６．８ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（５０ｍｌ）に溶解し、アルゴン雰囲気下とした。この溶液を、アセトンバスを用いて−８０℃まで冷却し、１．５７Ｍノルマルブチルリチウム（ｎ−ＢｕＬｉ）−ヘキサン溶液（１０．８ｍｌ）をゆっくり加え、１時間撹拌した。続いてこの混合溶液にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２．０ｍｌ、２６ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた後、室温に昇温させ１時間撹拌した。その後この反応混合物に水を加え１５分間撹拌し、酢酸エチル（２×２００ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［シリカゲル４６．９ｇ；ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］にて精製すると、５−アルデヒド−２−ジメチルアミノピラジン（２２）（９７５ｍｇ、６．５ｍｍｏｌ、９５％）が淡黄色粉末固体として得られた。
2-Dimethylamino-5-bromo-pyrazine (21) (1.37 g, 6.8 mmol) was dissolved in dehydrated tetrahydrofuran (THF) (50 ml) and placed under an argon atmosphere. The solution was cooled to −80 ° C. using an acetone bath, a 1.57 M normal butyl lithium (n-BuLi) -hexane solution (10.8 ml) was slowly added, and the mixture was stirred for 1 hour. Subsequently, N, N-dimethylformamide (DMF) (2.0 ml, 26 mmol) was slowly added to the mixed solution, and then the mixture was warmed to room temperature and stirred for 1 hour. Water was then added to the reaction mixture, stirred for 15 minutes, and extracted with ethyl acetate (2 × 200 ml). The organic layers were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by silica gel column chromatography [silica gel 46.9 g; hexane-ethyl acetate (1: 1)] to give 5-aldehyde-2-dimethylaminopyrazine (22) (975 mg, 6.5 mmol, 95 %) Was obtained as a pale yellow powdered solid.
・５−アルデヒド−２−ジメチルアミノピラジン（２２）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3)：δ 3.23 (6 H, s), 8.05 (1 H, d, J = 1.2 Hz), 8.64 (1 H, d, J = 1.2 Hz), 9.86 (1 H, s)
13Ｃ ＮＭＲ (125 MHz, ＣＤＣｌ3)：δ 38.0 (q) × 2, 129.4 (d), 136.8 (s), 144.4 (d), 155.7 (s), 190.8 (d)
ＭＳ（ＥＳＩ） [M+Na]+ ; m/z 174.04
・ Identification result of 5-aldehyde-2-dimethylaminopyrazine (22)
1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ): δ 3.23 (6 H, s), 8.05 (1 H, d, J = 1.2 Hz), 8.64 (1 H, d, J = 1.2 Hz), 9.86 (1 H , s)
13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ): δ 38.0 (q) × 2, 129.4 (d), 136.8 (s), 144.4 (d), 155.7 (s), 190.8 (d)
MS (ESI) [M + Na] + ; m / z 174.04
（エチルエステル体（２３）の合成）
５−アルデヒド−２−ジメチルアミノピラジン（２２）（４４．５ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）、４−ホスホノクロトン酸トリエチル（１５０μｌ、０．５８ｍｍｏｌ）を、脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２０ｍｌ）に溶解した。この溶液を０℃まで冷却し、６０％水素化ナトリウム（ＮａＨ）（２７．４ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、１５分間撹拌した。この反応混合物にエタノール（ＥｔＯＨ）（５ｍｌ）を加えて過剰の水素化ナトリウムを分解し、この溶液を室温に昇温させた。続いて、酢酸エチル（３×３０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー［２０ｃｍ×２０ｃｍ×１．７５ｍｍ×１枚；ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］にて精製すると、エチルエステル体（２３）（４７．６ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、６５％）が黄色粉末固体として得られた。
5-Aldehyde-2-dimethylaminopyrazine (22) (44.5 mg, 0.29 mmol) and triethyl 4-phosphonocrotonate (150 μl, 0.58 mmol) were dissolved in dehydrated tetrahydrofuran (THF) (20 ml). The solution was cooled to 0 ° C. and 60% sodium hydride (NaH) (27.4 mg, 0.69 mmol) was added slowly and stirred for 15 minutes. Ethanol (EtOH) (5 ml) was added to the reaction mixture to decompose excess sodium hydride, and the solution was allowed to warm to room temperature. Subsequently, it was extracted with ethyl acetate (3 × 30 ml). The organic layers were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by preparative thin layer chromatography [20 cm × 20 cm × 1.75 mm × 1 sheet; hexane-ethyl acetate (1: 1)] to obtain an ethyl ester (23) (47.6 mg, 0 .19 mmol, 65%) was obtained as a yellow powdered solid.
・エチルエステル体（２３）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 1.31 (3 H, t, J = 7.4 Hz), 3.17 (6 H, s), 4.22 (2 H, q, J = 7.4 Hz), 5.99 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.83 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 7.14 (1 H, dd, J = 11.5, 15.5 Hz), 7.45 (1 H, dd, J = 11.5, 15.5 Hz), 7.22 (1 H, d, J = 8.6 Hz), 8.04 (1 H, s), 8.05 (1 H, s)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 14.4 (q), 37.8 (q) × 2, 60.4 (t), 120.7 (s), 121.2 (d), 125.7 (d), 130.0 (d), 136.2 (s), 142.4 (d), 144.5 (d), 153.9 (s), 167.3 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） [M+H]+ ; m/z 248.11
・ Identification result of ethyl ester (23)
1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ): δ 1.31 (3 H, t, J = 7.4 Hz), 3.17 (6 H, s), 4.22 (2 H, q, J = 7.4 Hz), 5.99 (1 H , d, J = 15.5 Hz), 6.83 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 7.14 (1 H, dd, J = 11.5, 15.5 Hz), 7.45 (1 H, dd, J = 11.5, 15.5 Hz ), 7.22 (1 H, d, J = 8.6 Hz), 8.04 (1 H, s), 8.05 (1 H, s)
13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ): δ 14.4 (q), 37.8 (q) × 2, 60.4 (t), 120.7 (s), 121.2 (d), 125.7 (d), 130.0 (d), 136.2 (s), 142.4 (d), 144.5 (d), 153.9 (s), 167.3 (s)
MS (ESI) [M + H] + ; m / z 248.11
（カルボキシル体（２４）の合成）
エチルエステル体（２３）（４７．６ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）をイソプロパノール（ｉＰｒＯＨ）（１０ｍｌ）に溶解し、５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１２０μｌ）を加え、その溶液を４５分間加熱還流した。反応混合物に４Ｍ塩酸を加え中和した後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［シリカゲル１６．５ｇ；クロロホルム−メタノール（５：１）］にて精製すると、カルボキシル体（２４）（３６．８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ、８４％）が淡黄色粉末固体として得られた。
The ethyl ester compound (23) (47.6 mg, 0.19 mmol) was dissolved in isopropanol (iPrOH) (10 ml), 5M aqueous sodium hydroxide solution (120 μl) was added, and the solution was heated to reflux for 45 minutes. The reaction mixture was neutralized with 4M hydrochloric acid, and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by silica gel column chromatography [silica gel 16.5 g; chloroform-methanol (5: 1)] to obtain a carboxyl form (24) (36.8 mg, 0.16 mmol, 84%) as a pale yellow powder. Obtained as a solid.
・カルボキシル体（２４）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤ3ＯＤ）：δ 3.15 (6 H, s), 5.97 (1 H, d, J = 14.9 Hz), 6.87 (1 H, d, J = 14.9 Hz), 7.13 (1 H, dd, J = 11.5, 14.9 Hz), 7.39 (1 H, dd, J = 11.5, 14.9 Hz), 8.07 (1 H, s), 8.11 (1 H, s)
13Ｃ ＮＭＲ（125MHz, ＣＤ3ＯＤ）：δ 36.6 (q) × 2, 121.7 (d), 125.5 (d), 129.8 (d), 135.8 (d), 136.8 (d), 142.0 (d), 144.5 (s), 153.3 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） [M+H]+ ; m/z 220.07
・ Identification result of carboxyl body (24)
1 H NMR (500 MHz, CD 3 OD): δ 3.15 (6 H, s), 5.97 (1 H, d, J = 14.9 Hz), 6.87 (1 H, d, J = 14.9 Hz), 7.13 (1 H, dd, J = 11.5, 14.9 Hz), 7.39 (1 H, dd, J = 11.5, 14.9 Hz), 8.07 (1 H, s), 8.11 (1 H, s)
13 C NMR (125 MHz, CD 3 OD): δ 36.6 (q) × 2, 121.7 (d), 125.5 (d), 129.8 (d), 135.8 (d), 136.8 (d), 142.0 (d), 144.5 (s), 153.3 (s)
MS (ESI) [M + H] + ; m / z 220.07
（アミド体（２５）の合成）
カルボキシル体（２４）（７２０．０ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）とＳ−トリチル−Ｄ−システインメチルエステル（３，６００ｍｇ、９．９ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５０ｍｌ）に溶解した。この溶液に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（２，０３５ｍｇ、６．６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１，２７０ｍｇ、６．６ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合物を室温で１７時間撹拌した。反応混合物に水（５０ｍｌ）を加え、酢酸エチル（３×５０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［シリカゲル５６．０ｇ；ヘキサン−酢酸エチル（１：２）］にて精製すると、アミド体（２５）（１，６２６ｍｇ、２．８１ｍｍｏｌ、８４％）が黄色固体として得られた。
Carboxyl compound (24) (720.0 mg, 3.3 mmol) and S-trityl-D-cysteine methyl ester (3,600 mg, 9.9 mmol) were dissolved in N, N-dimethylformamide (DMF) (50 ml). To this solution was added 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) (2,035 mg, 6.6 mmol), N, N-dimethyl-4-aminopyridine (DMAP) (1,270 mg, (6.6 mmol) was added and the reaction mixture was stirred at room temperature for 17 hours. Water (50 ml) was added to the reaction mixture and extracted with ethyl acetate (3 × 50 ml). The organic layers were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by silica gel column chromatography [silica gel 56.0 g; hexane-ethyl acetate (1: 2)] to give an amide compound (25) (1,626 mg, 2.81 mmol, 84%) as a yellow solid. As obtained.
・アミド体（２５）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 2.66-2.75 (2 H, m), 3.17 (6 H, s), 3.72 (3 H, s), 4.73 (1 H, m), 5.93 (1 H, dd, J = 7.5, 14.9 Hz), 6.81 (1 H, d, J = 14.9 Hz), 7.13 (1 H, dd, J = 11.4, 14.9 Hz), 7.20-7.43 (16 H, m), 8.05 (2 H, s)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 34.1 (t), 37.8 (q) × 2, 51.2 (q), 52.7 (d), 67.1 (s), 123.0 (d), 125.7 (d), 127.0 (d) × 3, 128.1 (d) × 4, 129.6 (d) × 4, 135.7 (d), 137.4 (d), 141.8 (d), 142.3 (d), 144.4 (s) × 3, 153.9 (s), 165.6 (s), 171.1 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） [(M+Na)+] m/z : 601.13
・ Identification result of amide compound (25)
1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ): δ 2.66-2.75 (2 H, m), 3.17 (6 H, s), 3.72 (3 H, s), 4.73 (1 H, m), 5.93 (1 H , dd, J = 7.5, 14.9 Hz), 6.81 (1 H, d, J = 14.9 Hz), 7.13 (1 H, dd, J = 11.4, 14.9 Hz), 7.20-7.43 (16 H, m), 8.05 (2 H, s)
13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ): δ 34.1 (t), 37.8 (q) × 2, 51.2 (q), 52.7 (d), 67.1 (s), 123.0 (d), 125.7 (d), 127.0 (d) × 3, 128.1 (d) × 4, 129.6 (d) × 4, 135.7 (d), 137.4 (d), 141.8 (d), 142.3 (d), 144.4 (s) × 3, 153.9 (s ), 165.6 (s), 171.1 (s)
MS (ESI) [(M + Na) + ] m / z: 601.13
（チアゾリン体（２６）の合成）
アミド体（２５）（１１４．０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下にし、ジクロロメタン（１０．０ｍｌ）を加えた。この溶液を０℃に冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（Ｔｆ2Ｏ）（１００μｌ、０．６ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、３５分間撹拌した。原料が消失したのを確認した後、陰イオン交換樹脂ＩＲＡ４００ ＯＨ ＡＧを用いて中和した。樹脂を洗浄して濾別し、得られた洗液を減圧濃縮した。得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー［２０ｃｍ×２０ｃｍ×１．７５ｍｍ×１枚；ヘキサン−酢酸エチル（１：２）］で精製すると、チアゾリン体（２６）（２８．２ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ、４４％）が黄色固体として得られた。
The amide (25) (114.0 mg, 0.20 mmol) was placed under an argon atmosphere, and dichloromethane (10.0 ml) was added. The solution was cooled to 0 ° C. and trifluoromethanesulfonic anhydride (Tf 2 O) (100 μl, 0.6 mmol) was added slowly and stirred for 35 minutes. After confirming the disappearance of the raw material, it was neutralized using an anion exchange resin IRA400 OH AG. The resin was washed and filtered off, and the resulting wash was concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by preparative thin layer chromatography [20 cm × 20 cm × 1.75 mm × 1 sheet; hexane-ethyl acetate (1: 2)] to obtain thiazoline derivative (26) (28.2 mg, 0.089 mmol). 44%) as a yellow solid.
・チアゾリン体（２６）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 3.16 (6 H, s), 3.53 (1 H, dd, J = 9.2, 11.5 Hz), 3.60 (1 H, dd, J = 9.2, 11.5 Hz), 3.82 (3 H, s), 5.17 (1 H, t, J = 9.2 Hz), 6.65 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.77 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.96 (1 H, dd, J = 11.2, 14.9 Hz), 7.16 (1 H, dd, J = 11.2, 14.9 Hz), 8.03 (2 H, s)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 34.6 (t), 37.8 (q) × 2, 52.9 (q), 78.1 (d), 125.4 (d), 126.5 (d), 130.0 (d), 134.6 (d), 137.4 (d), 142.3 (s), 142.5 (d), 153.8 (s), 170.1 (s), 171.4 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） m/z: [(M+H)+] 319.05
・ Identification result of thiazoline (26)
1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ): δ 3.16 (6 H, s), 3.53 (1 H, dd, J = 9.2, 11.5 Hz), 3.60 (1 H, dd, J = 9.2, 11.5 Hz), 3.82 (3 H, s), 5.17 (1 H, t, J = 9.2 Hz), 6.65 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.77 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.96 (1 H, dd, J = 11.2, 14.9 Hz), 7.16 (1 H, dd, J = 11.2, 14.9 Hz), 8.03 (2 H, s)
13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ): δ 34.6 (t), 37.8 (q) × 2, 52.9 (q), 78.1 (d), 125.4 (d), 126.5 (d), 130.0 (d), 134.6 (d), 137.4 (d), 142.3 (s), 142.5 (d), 153.8 (s), 170.1 (s), 171.4 (s)
MS (ESI) m / z: [(M + H) + ] 319.05
（ピラジン環含有発光基質（２７）の合成）
チアゾリン体（２６）（１１．２ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）をＨ2Ｏ（２ｍｌ）に溶解し、４Ｍ塩酸（１．５ｍｌ）を加え、その溶液を１９時間室温で撹拌した。反応混合物にアンモニア水を加え中和した後、減圧濃縮した。逆相カラムクロマトグラフィー（ＳｕｐｅｌｃｌｅａｎTM ＬＣ−１８ ＳＰＥ）で精製すると、ピラジン環含有発光基質（２７）（４．１ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、３７％）が茶色固体として得られた。
The thiazoline (26) (11.2 mg, 0.035 mmol) was dissolved in H 2 O (2 ml), 4M hydrochloric acid (1.5 ml) was added, and the solution was stirred for 19 hours at room temperature. The reaction mixture was neutralized by adding aqueous ammonia, and then concentrated under reduced pressure. Purification by reverse phase column chromatography (Superclean ™ LC-18 SPE) gave the pyrazine ring-containing luminescent substrate (27) (4.1 mg, 0.013 mmol, 37%) as a brown solid.
・ピラジン環含有発光基質（２７）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤ3ＯＤ）：δ 3.15 (6 H, s), 3.52-3.62 (2 H, m), 5.04 (1 H, t, J = 9.2 Hz), 6.60 (1 H, d, J = 15.4 Hz), 6.85 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 7.02 (1 H, dd, J = 11.2, 15.5 Hz), 7.17 (1 H, dd, J = 11.2, 15.5 Hz), 8.08 (1 H, s), 8.11 (1H, s)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤ3ＯＤ）：δ 35.1 (t), 36.6 (q) × 2, 79.1 (d), 124.5 (d), 126.3 (d), 129.8 (d), 133.8 (d), 134.5 (d), 137.1 (s), 141.8 (d), 142.2 (s), 153.9 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） m/z: [(M+H)+] 305.06
-Identification results of pyrazine ring-containing luminescent substrate (27)
1 H NMR (500 MHz, CD 3 OD): δ 3.15 (6 H, s), 3.52-3.62 (2 H, m), 5.04 (1 H, t, J = 9.2 Hz), 6.60 (1 H, d , J = 15.4 Hz), 6.85 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 7.02 (1 H, dd, J = 11.2, 15.5 Hz), 7.17 (1 H, dd, J = 11.2, 15.5 Hz), 8.08 (1 H, s), 8.11 (1H, s)
13 C NMR (125 MHz, CD 3 OD): δ 35.1 (t), 36.6 (q) × 2, 79.1 (d), 124.5 (d), 126.3 (d), 129.8 (d), 133.8 (d), 134.5 (d), 137.1 (s), 141.8 (d), 142.2 (s), 153.9 (s)
MS (ESI) m / z: [(M + H) + ] 305.06
＜溶解度測定＞
上記のようにして得たピリジン環含有発光基質（７）、ピリジン環含有発光基質（１７）、ピラジン環含有発光基質（２７）又は下記化学式（ａ）：
A pyridine ring-containing luminescent substrate (7), a pyridine ring-containing luminescent substrate (17), a pyrazine ring-containing luminescent substrate (27) or the following chemical formula (a):
表１から、ピリジン環含有発光基質（７）は、アカルミネより、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性が５．７倍高く、また、ピリジン環含有発光基質（１７）は、アカルミネより、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性が９．７倍高く、また、ピラジン環含有発光基質（２７）は、アカルミネより、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性が１４倍高いことが分かる。 From Table 1, the pyridine ring-containing luminescent substrate (7) is 5.7 times more soluble in a buffer near pH neutral than the Aka luminescence, and the pyridine ring-containing luminescent substrate (17) is from the Aka luminescence. In addition, the solubility in a buffer near neutral pH is 9.7 times higher, and the luminescent substrate (27) containing a pyrazine ring has 14 times the solubility in a buffer near neutral pH than Aka Lumine. I understand that it is expensive.
＜発光測定＞
上記のようにして得たピリジン環含有発光基質（７）又は（１７）、或いは、ピラジン環含有発光基質（２７）を用いて、発光経時変化及び発光強度、並びに、発光スペクトルの測定を行った。また、比較対照として、上記アカルミネ、並びに、下記化学式（ｂ）：
Using the pyridine ring-containing luminescent substrate (7) or (17) or the pyrazine ring-containing luminescent substrate (27) obtained as described above, luminescence change with time, emission intensity, and emission spectrum were measured. . Further, as a comparative control, the above-mentioned Akalumine, and the following chemical formula (b):
・発光経時変化及び発光強度測定
ｐＨ８．０で０．５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ溶液）を２０μｌ、各発光基質の溶解液（発光基質濃度＝１００μＭ）を２０μｌ、発光基質を分解する酵素である０．０１ｍｇ／ｍｌのｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を２０μｌ、０．２ｍＭのＭｇ−ＡＴＰを４０μｌ混合し、発光測定装置（ＡＴＴＯ株式会社製、ＡＢ−２２７０）で６０秒間発光経時変化の測定を行った。結果を図１、図２及び図３に示す。
また、同測定条件下、発光測定装置（ＡＴＴＯ株式会社製、ＡＢ−１８５０）で３００秒間積算し、発光強度測定を行った（Ｎ＝２）。なお、天然ホタルルシフェリンは５７０ｎｍ、アカルミネは６７５ｎｍ、ピリジン環含有発光基質（７）は６２５ｎｍ、ピリジン環含有発光基質（１７）は６７０ｎｍ、ピラジン環含有発光基質（２７）は６２５ｎｍの発光強度で比較した。天然ホタルルシフェリンの発光強度を１００とした相対発光強度の値を表２に示す。
・ Luminescence change and measurement of
Moreover, it integrated | accumulated for 300 second with the light-emission measuring apparatus (The product made from ATTO, AB-1850) on the same measurement conditions, and performed light emission intensity measurement (N = 2). In addition, natural firefly luciferin was compared at 570 nm, red light intensity at 675 nm, pyridine ring-containing luminescent substrate (7) at 625 nm, pyridine ring-containing luminescent substrate (17) at 670 nm, and pyrazine ring-containing luminescent substrate (27) at 625 nm. . Table 2 shows values of relative luminescence intensity with the luminescence intensity of natural firefly luciferin as 100.
図１、図２及び図３から、ピリジン環含有発光基質（７）及び（１７）、並びに、ピラジン環含有発光基質（２７）は、ホタル生物発光系における発光基質として機能することが分かる。また、図１、図２及び図３から分かるように、ピリジン環含有発光基質（７）及び（１７）、並びに、ピラジン環含有発光基質（２７）の発光経時変化は、アカルミネの発光経時変化とほぼ同じであった。
また、表２から、ピリジン環含有発光基質（７）及び（１７）、並びに、ピラジン環含有発光基質（２７）の発光強度は、天然のホタルルシフェリンに比べ約１割の発光強度であるものの、アカルミネとほぼ同じ発光強度であることが分かる。
1, 2 and 3, it can be seen that the pyridine ring-containing luminescent substrates (7) and (17) and the pyrazine ring-containing luminescent substrate (27) function as luminescent substrates in the firefly bioluminescent system. In addition, as can be seen from FIGS. 1, 2 and 3, the luminescence time-dependent changes of the pyridine ring-containing luminescent substrates (7) and (17) and the pyrazine ring-containing luminescent substrate (27) It was almost the same.
Moreover, from Table 2, although the luminescence intensity of the pyridine ring-containing luminescent substrates (7) and (17) and the pyrazine ring-containing luminescent substrate (27) is about 10% of that of natural firefly luciferin, It can be seen that the emission intensity is almost the same as that of Aka Lumine.
・発光スペクトル測定
ｐＨ８．０で０．５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ溶液）を２０μｌ、各発光基質の溶解液（発光基質濃度＝１００μＭ）を２０μｌ、発光基質を分解する酵素である０．０１ｍｇ／ｍｌのｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を２０μｌ、０．２ｍＭのＭｇ−ＡＴＰを４０μｌ混合し、発光測定装置（ＡＴＴＯ株式会社製、ＡＢ−１８５０）で１８０秒間発光スペクトルを測定した。結果を図４、図５及び図６に示す。
図４及び図６から分かるように、ピリジン環含有発光基質（７）及びピラジン環含有発光基質（２７）の発光スペクトルにおける極大波長は６２５ｎｍであり、天然のホタルルシフェリンの極大波長５６０ｎｍに比べ、６５ｎｍ長波長であり、また、アカルミネの極大波長６７５ｎｍに比べ、５０ｎｍ短波長であった。
また、図５から分かるように、ピリジン環含有発光基質（１７）の発光スペクトルにおける極大波長は６７０ｎｍであり、天然のホタルルシフェリンの極大波長５６０ｎｍに比べ、１１０ｎｍ長波長であり、また、アカルミネの極大波長と同等であった。
As can be seen from FIGS. 4 and 6, the maximum wavelength in the emission spectrum of the pyridine ring-containing luminescent substrate (7) and the pyrazine ring-containing luminescent substrate (27) is 625 nm, which is 65 nm compared to the maximum wavelength 560 nm of natural firefly luciferin. It was a long wavelength, and it was a short wavelength of 50 nm as compared to the maximum wavelength of 675 nm of Aka Lumine.
Further, as can be seen from FIG. 5, the maximum wavelength in the emission spectrum of the pyridine ring-containing luminescent substrate (17) is 670 nm, which is 110 nm longer than the maximum wavelength 560 nm of natural firefly luciferin, and the maximum of red luminescence. It was equivalent to the wavelength.
本発明の複素環式化合物及びその塩は、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性に優れ、ホタル生物発光系における発光基質として利用できる。 The heterocyclic compound and salts thereof of the present invention are excellent in solubility in a buffer solution having a pH near neutral, and can be used as a luminescent substrate in a firefly bioluminescence system.
Claims (6)
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