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JP6307509B2 - 腎機能の診断若しくは監視又は腎機能障害の診断方法 - Google Patents

腎機能の診断若しくは監視又は腎機能障害の診断方法 Download PDF

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Description

本願発明の主題は、（ａ）対象において腎機能を診断し又は監視するための、又は（ｂ）対象において腎機能障害を診断するための、又は（ｃ）疾患のある対象において有害事象のリスクを予測し又は監視するための、ここで、前記有害事象は、腎不全（ｋｉｄｎｅｙ ｆａｉｌｕｒｅ）、腎機能の喪失及び末期腎疾患を含む腎機能障害の悪化、又は腎不全、腎機能の喪失及び末期腎疾患を含む腎機能障害による死を含む群から選択される、又は（ｄ）治療又は治療介入の成功を予測し又は監視するための方法であって、以下：
前記対象から取得した体液中のプロ‐エンケファリン（ＰＥＮＫ）又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片のレベルを決定し；そして
（ａ）対象おいて、前記プロ‐エンケファリン又はその断片のレベルと腎機能とを相関させ、又は
（ｂ）対象おいて、前記プロ‐エンケファリン又はその断片のレベルと腎機能障害とを相関させ、ここで、特定の閾値超の上昇したレベルが、前記対象における腎機能障害についての予測又は診断である、又は
（ｃ）疾患のある対象おいて、前記プロ‐エンケファリン又はその断片のレベルと前記有害事象のリスクとを相関させ、ここで、特定の閾値超の上昇したレベルが、前記有害事象の増大したリスクについての予測である、又は
（ｄ）疾患のある対象おいて、前記プロ‐エンケファリン又はその断片のレベルと治療又は治療介入の成功とを相関させる、ここで、特定の閾値未満のレベルが、治療又は治療介入の成功についての予測である
ことを含む、方法である。
Ｍｅｔ‐エンケファリンは、エンケファリン前駆体（プレ‐プロ‐エンケファリン）由来の５つのアミノ酸ペプチドであり、また「オピオイド成長因子（ＯＧＦ）」とも呼ばれ、プロ‐エンケファリン断片と共に放出される。成熟したペプチドは、さまざまなオピオイド受容体に結合する（Ｋｏｎｅｒｕら、２００９）。エンケファリン（ＯＧＦ）が、多くの生理的機能を有することを見出した。ＣＮＳにおいて、それは、サブスタンスＰ関連疼痛シグナル伝達を下方制御し、サイトカインとしての役割を果たす（Ｐｌｏｔｎｉｋｏｆｆら、１９９７）。プロ‐エンケファリンは、抗菌作用を示すペプチドと関連する（Ｇｏｕｍｏｎら、１９９８）。プロ‐エンケファリン及びエンケファリンは、抗腫瘍作用を示し、そしてプロアポトーシス剤として作用する（Ｔａｖｉｓｈら、２００７、Ｄｏｎａｈｕｅら、２０１１、Ｚａｇｏｎら、２００９）。エンケファリンは、腎機能障害において上昇することが報告されている（Ｓｍｉｔｈら、１９８５、Ｚｏｃｃａｌｉら、１９８７、Ｓｍｉｔｈら、１９８１）。エンケファリンは、より大きいプロ‐エンケファリンとして産生され、そしてタンパク質分解によって、成熟したペンタペプチドに変換される。成熟過程の間に、多くのプロ‐エンケファリン断片が産生され、そしてそれは、エンケファリンと一緒に放出される（Ｅｒｎｓｔら、２００６）。
本願発明の主題は、健康な及び疾患のある対象における腎機能及び腎機能障害及びその臨床的有用性のためのマーカーとしてのプロ‐エンケファリン（ＰＥＮＫ）又はその断片の使用である。本願発明の主題は、対象において、腎機能を診断し又は監視するための、又は対象において、腎機能障害を診断するための、又は疾患のある対象において、死又は有害事象のリスクを予測するための方法である。
本願発明の主題は、また、疾患のある対象における、腎機能、腎機能障害の診断及び予後値のためのＰＥＮＫ又はその断片の予後予測能力及び診断能力の提供である。
驚くべきことに、ＰＥＮＫ又はその断片は、強力なそして非常に重要な腎臓、その機能、その機能障害、死又は有害事象のリスク及び治療又は治療介入の成功を予測及び監視するためのバイオマーカーであることを示した。
本願発明の主題は、（ａ）対象において腎機能を診断し又は監視するための、又は（ｂ）対象において腎機能障害を診断するための、又は（ｃ）疾患のある対象において有害事象のリスクを予測し又は監視するための、ここで、前記有害事象は、腎不全、腎機能の喪失及び末期腎疾患を含む腎機能障害の悪化、又は腎不全、腎機能の喪失及び末期腎疾患を含む腎機能障害による死を含む群から選択される、又は（ｄ）治療又は治療介入の成功を予測し又は監視するための方法であって、以下：
前記対象から取得した体液中のプロ‐エンケファリン（ＰＥＮＫ）又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片のレベルを決定し；そして
（ａ）対象おいて、前記プロ‐エンケファリン又はその断片のレベルと腎機能とを相関させ、又は
（ｂ）対象おいて、前記プロ‐エンケファリン又はその断片のレベルと腎機能障害とを相関させ、ここで、特定の閾値超の上昇したレベルが、前記対象における腎機能障害についての予測又は診断である、又は
（ｃ）疾患のある対象おいて、前記プロ‐エンケファリン又はその断片のレベルと前記有害事象のリスクとを相関させ、ここで、特定の閾値超の上昇したレベルが、前記有害事象の増大したリスクについての予測である、又は
（ｄ）疾患のある対象おいて、前記プロ‐エンケファリン又はその断片のレベルと治療又は治療介入の成功とを相関させる、ここで、特定の閾値未満のレベルが、治療又は治療介入の成功についての予測である
ことを含む、方法である。
本願発明によれば、１つの具体的な実施態様では、前記プロ‐エンケファリン又はその断片は、ｌｅｕ‐エンケファリン及びｍｅｔ‐エンケファリンではない。他の具体的な実施態様では、前記プロ‐エンケファリン断片は、ＭＲ‐プロ‐エンケファリン（ＭＲＰＥＮＫ）又は少なくとも５つのアミノ酸を有するその断片である。
言い換えれば、本願発明の主題は、（ａ）対象において腎機能を診断し又は監視するための、又は（ｂ）対象において腎機能障害を診断するための、又は（ｃ）疾患のある対象において有害事象のリスクを予測し又は監視するための、ここで、前記有害事象は、腎不全、腎機能の喪失及び末期腎疾患を含む腎機能障害の悪化、又は腎不全、腎機能の喪失及び末期腎疾患を含む腎機能障害による死を含む群から選択される、又は（ｄ）治療又は治療介入の成功を予測し又は監視するための方法であって、以下：
前記対象から取得した体液中のプロ‐エンケファリン（ＰＥＮＫ）のアミノ酸配列内の領域に結合する少なくとも１つの結合剤を使用することによって免疫反応性分析物のレベルを決定し；そして
（ａ）対象において、前記免疫反応性分析物のレベルと腎機能とを相関させ、又は
（ｂ）対象において、前記免疫反応性分析物のレベルと腎機能障害とを相関させ、ここで、特定の閾値超の上昇したレベルが、前記対象における腎機能障害についての予測又は診断である、又は
（ｃ）疾患のある対象おいて、前記免疫反応性分析物のレベルと前記有害事象のリスクとを相関させ、ここで、特定の閾値超の上昇したレベルが、前記有害事象の増大したリスクについての予測である、又は
（ｄ）疾患のある対象おいて、前記免疫反応性分析物のレベルと治療又は治療介入の成功とを相関させる、ここで、特定の閾値未満のレベルが、治療又は治療介入の成功についての予測である
ことを含む、方法である。
本願発明によれば、１つの具体的な実施態様では、前記免疫反応性分析物は、Ｌｅｕ‐エンケファリン及びｍｅｔ‐エンケファリンではない。他の具体的な実施態様では、前記免疫反応性分析物は、ＭＲ‐プロ‐エンケファリン（ＭＲＰＥＮＫ）又は少なくとも５つのアミノ酸を有するその断片である。
これは、体液中のプロ‐エンケファリン（ＰＥＮＫ）のアミノ酸配列内の領域に結合する結合剤が本願発明の方法で使用される場合、「前記対象から取得した体液中のプロ‐エンケファリン（ＰＥＮＫ）又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片のレベルを決定すること」は、「前記対象から取得した体液中のプロ‐エンケファリン（ＰＥＮＫ）のアミノ酸配列内の領域に結合する少なくとも１つの結合剤を使用することによって免疫反応性分析物のレベルを決定すること」に相当することを意味する。１つの具体的な実施態様では、体液中のプロ‐エンケファリン（ＰＥＮＫ）のアミノ酸配列内の領域に結合する、結合剤が本願発明の方法で使用される。１つの具体的な実施態様では、本願発明の方法で使用される結合剤は、体液中のｌｅｕ‐エンケファリン又はｍｅｔ‐エンケファリンのアミノ酸配列内の領域に結合しない。他の本願発明の具体的な実施態様では、前記少なくとも１つの結合剤は、ＭＲ‐プロ‐エンケファリン（ＭＲＰＥＮＫ）又は少なくとも５つのアミノ酸を有するその断片に結合する。
本願明細書中で使用される場合、用語「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、生きているヒト又はヒト以外の生物を意味する。本明細書中で好ましくは、対象は、ヒト対象である。対象は、他に言及しない場合、健康又は疾患があってもよい。本願発明の１つの実施態様では、前記対象は、脳卒中に罹患していない。他の実施態様では、前記対象は、急性脳卒中患者ではない。
用語「上昇したレベル（ｅｌｅｖａｔｅｄ ｌｅｖｅｌ）」は、特定の閾値レベル超のレベルを意味する。
治療又は治療介入の成功を予測し又は監視することは、例えば、プロ‐エンケファリン（ＰＥＮＫ）又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片の測定を使用する腎代替療法の成功の予測又は監視であってもよい。
治療又は治療介入の成功を予測し又は監視することは、例えば、プロ‐エンケファリン（ＰＥＮＫ）又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片の測定を使用する腎代替療法を受けた患者におけるヒアルロン酸による治療の成功の予測又は監視であってもよい。
治療又は治療介入の成功を予測し又は監視することは、例えば、ＰＥＮＫ又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片の測定を使用する腎代替療法及び／又は薬剤介入の前及び後に、障害のある腎機能を有する患者における腎機能の回復の予測又は監視であってもよい。
体液は、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液（ｃｓｆ）及び唾液を含む群から選択されてもよい。
プロ‐エンケファリン又はその断片の決定は、対象における腎機能を示す。プロ‐エンケファリン又はその断片の増加した濃度は、低下した腎機能を示す。フォローアップ測定の間、プロ‐エンケファリン又はその断片の相対的な変化は、対象の腎機能の改善（低減したプロ‐エンケファリン又はその断片）及び悪化（増加したプロ‐エンケファリン又はその断片）と相関させる。
プロ‐エンケファリン又はその断片は、腎機能障害について診断し、ここで、特定の閾値超の上昇したレベルが、前記対象における腎機能障害についての予測又は診断である。フォローアップ測定の間、プロ‐エンケファリン又はその断片の相対的な変化は、対象の腎機能障害の改善（低減したプロ‐エンケファリン又はその断片）及び悪化（増加したプロ‐エンケファリン又はその断片）と相関させる。
プロ‐エンケファリン又はその断片は、腎機能／機能障害診断及びフォローアップ（ＮＧＡＬ、血中クレアチニン、クレアチニンクリアランス、システインＣ、尿素）のための他のマーカーと比較して優れている。優位性は、より高い特異性、より高い感受性及びより良い臨床的エンドポイントに対する相関を意味する。
疾患のある対象において、前記プロ‐エンケファリン又はその断片と死又は有害事象のリスクとを相関させ、ここで特定の閾値超の上昇したレベルは、死又は有害事象の増大したリスクについての予測である。また、この態様では、プロ‐エンケファリン又はその断片は、上記臨床マーカーよりも優れている。
本願発明によるリスクは、ＲＩＦＬＥ分類（Ｖｅｎｋａｔａｍａｒａｎ ａｎｄ Ｋｅｌｌｕｍ，２００６）に定義されるリスクと相関する。
疾患のある対象は、炎症に対する免疫応答に起因する慢性腎不全、外傷、外傷患者、手術、脳卒中、急性及び慢性腎不全（ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ）、ＳＩＲＳ患者、敗血症、敗血症性ショック、急性心筋梗塞及び心筋梗塞後、急性及び慢性心不全、局所及び全身細菌及びウィルス感染、自己免疫疾患、火傷患者、癌、肝臓疾患、肺疾患、シクロスポリン、アミノグリコシドを含む抗生物質、及びシスプラチンなどの抗癌剤などの腎毒素を受けた患者に起因する極めて低い血圧を併発するかもしれない減少した血流に起因する急性心不全から選択される疾患に罹患していてもよい。
腎機能を補助し又は腎機能に取って代わる治療又は治療介入は、限定されないが、血液透析、腹膜透析、血液濾過及び移植を含む腎代替療法の様々な方法を含んでもよい。
有害事象は、腎不全を含む腎機能障害、腎機能の喪失及び末期腎疾患を含む群から選択されてもよい（ＲＩＦＬＥ分類、Ｖｅｎｋａｔａｍａｒａｎ ａｎｄ Ｋｅｌｌｕｍ，２００６）。
本願発明の１つの実施態様では、用語「プロ‐エンケファリンの断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｏ‐Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）」が、また、Ｌｅｕ‐エンケファリン及びＭｅｔ‐エンケファリンを含むことを理解すべきである。
本願発明の主題は、プロ‐エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片のレベルが、プロ‐エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片に対する、結合剤、少なくとも１つの結合剤を使用することにより決定される、方法である。本願発明の１つの実施態様では、前記結合剤は、抗体、抗体断片、又はプロ‐エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片に結合する非‐Ｉｇスキャフォールドを含む群から選択される。具体的な実施態様では、前記少なくとも１つの結合剤は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０を含む群から選択される配列を有する領域に結合する。具体的な実施態様では、前記結合剤は、エンケファリンペプチドＭｅｔ‐エンケファリン（配列番号３）及びＬｅｕ‐エンケファリン（配列番号４）に結合しない。具体的な実施態様では、前記少なくとも１つの結合剤は、配列番号１、２、５、６、７、８、９及び１０を含む群から選択される配列を有する領域に結合する。他の具体的な実施態様では、前記少なくとも１つの結合剤は、配列番号２、５、６及び１０を含む群から選択される配列を有する領域に結合する。他の特に具体的な実施態様では、前記結合剤は、プロ‐エンケファリン（１１９〜１５９）、中領域プロ‐エンケファリン断片（ＭＲＰＥＮＫ）に結合する。
プロ‐エンケファリンは、以下の配列を有する。
配列番号１（プロ‐エンケファリン（１〜２４３））
体液中で決定されてもよいプロ‐エンケファリンの断片は、例えば、以下の断片の群から選択されてもよい。
配列番号２（シンエンケファリン（Ｓｙｎｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）、プロ‐エンケファリン１〜７３）
配列番号３（Ｍｅｔ‐エンケファリン）
配列番号４（Ｌｅｕ‐エンケファリン）
配列番号５（プロ‐エンケファリン９０〜１０９）
配列番号６（プロ‐エンケファリン１１９〜１５９、中領域（Ｍｉｄ ｒｅｇｉｏｎａｌ）プロ‐エンケファリン、ＭＲＰＥＮＫ）
配列番号７（Ｍｅｔ‐エンケファリン‐Ａｒｇ‐Ｇｌｙ‐Ｌｅｕ）
配列番号８（プロ‐エンケファリン１７２〜１８３）
配列番号９（プロ‐エンケファリン１９３〜２０３）
配列番号１０（プロ‐エンケファリン２１３〜２３４）
配列番号１１（プロ‐エンケファリン２１３〜２４１）
配列番号１２（Ｍｅｔ‐エンケファリン‐Ａｒｇ‐Ｐｈｅ）
Ｌｅｕ‐エンケファリン及びＭｅｔ‐エンケファリンを含むプロ‐エンケファリン又はその断片のレベルを決定は、Ｌｅｕ‐エンケファリン及びＭｅｔ‐エンケファリンを含む、プロエンケファリン又はその断片に向けての免疫反応性が決定されることを意味してもよい。結合の領域に依存する、Ｌｅｕ‐エンケファリン及びＭｅｔ‐エンケファリンを含むプロ‐エンケファリン又はその断片の決定のために使用される結合剤は、上に示した分子の１つ以上に結合してもよい。これは、当業者に明らかである。
従って、本願発明によれば、任意の上記ペプチド及びペプチド断片のアミノ酸配列（すなわち、プロ‐エンケファリン（ＰＥＮＫ）及び任意の配列番号１〜１２による断片）内の領域に結合する少なくとも１つの結合剤を使用することによる免疫反応性分析物のレベルを、前記対象から取得した体液において決定し；そして、臨床的関連の具体的な実施態様と相関させる。
本願発明による方法のより具体的な実施態様では、ＭＲＰＥＮＫのレベルが決定される（配列番号６：プロ‐エンケファリン１１９〜１５９、中領域プロ‐エンケファリン断片、ＭＲＰＥＮＫ）。より具体的な実施態様では、ＭＲ‐ＰＥＮＫに結合する少なくとも１つの結合剤を使用することによって、免疫反応性分析物のレベルが決定され、そして、例えば、以下：
前記免疫反応性分析物のレベルと腎機能とを相関させ、又は
（ｂ）前記免疫反応性分析物のレベルと腎機能障害とを相関させ、ここで、特定の閾値超の上昇したレベルが、前記対象における腎機能障害についての予測又は診断である、又は
（ｃ）疾患のある対象おいて、前記免疫反応性分析物のレベルと前記有害事象のリスクとを相関させ、ここで、特定の閾値超の上昇したレベルが、前記有害事象の増大したリスクについての予測である、又は
（ｄ）疾患のある対象おいて、前記免疫反応性分析物のレベルと治療又は治療介入の成功とを相関させる、ここで、特定の閾値未満のレベルが、治療又は治療介入の成功についての予測である
のように、臨床的関連の具体的な実施態様に対する本願発明による上記実施態様と相関させる。
あるいは、任意の上の分析物のレベルが、他の分析方法、例えば、質量分析法によって、決定されてもよい。
本願発明の主題は、（ａ）対象において腎機能を診断し又は監視するための、又は（ｂ）対象において腎機能障害を診断するための、又は（ｃ）疾患のある対象において有害事象のリスクを予測し又は監視するための、ここで、前記有害事象は、腎不全（ｋｉｄｎｅｙ ｆａｉｌｕｒｅ）、腎機能の喪失及び末期腎疾患を含む腎機能障害の悪化、又は腎不全、腎機能の喪失及び末期腎疾患を含む腎機能障害による死を含む群から選択される、又は（ｄ）治療又は治療介入の成功を予測し又は監視するための方法であって、以下：
前記対象から取得した体液中で、配列番号１〜１２のペプチド及び断片を含む群から選択されるペプチドのアミノ酸配列内の領域に結合する少なくとも１つの結合剤を使用することによって免疫反応性分析物のレベルを決定し、そして
（ａ）対象おいて、前記プロ‐エンケファリン又はその断片のレベルと腎機能とを相関させ、又は
（ｂ）対象おいて、前記プロ‐エンケファリン又はその断片のレベルと腎機能障害とを相関させ、ここで、特定の閾値超の上昇したレベルが、前記対象における腎機能障害についての予測又は診断である、又は
（ｃ）疾患のある対象おいて、前記プロ‐エンケファリン又はその断片のレベルと前記有害事象のリスクとを相関させ、ここで、特定の閾値超の上昇したレベルが、前記有害事象の増大したリスクについての予測である、又は
（ｄ）疾患のある対象おいて、前記プロ‐エンケファリン又はその断片のレベルと治療又は治療介入の成功とを相関させる、ここで、特定の閾値未満のレベルが、治療又は治療介入の成功についての予測である
ことを含む、方法である。
具体的な実施態様では、免疫反応性分析物のレベルは、プロ‐エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片を含む群から選択されるペプチドのアミノ酸配列内の領域に結合する少なくとも１つの結合剤を使用することによって決定される。具体的な実施態様では、前記少なくとも１つの結合剤は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０を含む群から選択される配列を有する領域に結合する。具体的な実施態様では、前記結合剤は、エンケファリンペプチドＭｅｔ‐エンケファリン（配列番号３）及びＬｅｕ‐エンケファリン（配列番号４）に結合しない。具体的な実施態様では、前記少なくとも１つの結合剤は、配列番号１、２、５、６、７、８、９及び１０を含む群から選択される配列を有する領域に結合する。他の具体的な実施態様では、前記少なくとも１つの結合剤は、配列番号２、５、６及び１０を含む群から選択される配列を有する領域に結合する。他の特に具体的な実施態様では、前記結合剤は、プロ‐エンケファリン（１１９〜１５９）、中領域プロ‐エンケファリン断片（ＭＲＰＥＮＫ）に結合する。上記結合剤は、前記対象から取得した体液中で前記ペプチドに結合する。
本願発明の１つの実施態様では、前記結合剤は、プロ‐エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片に結合する抗体、抗体断片、又は非‐Ｉｇスキャフォールドを含む群から選択される。
より具体的な実施態様では、反応性分析物のレベルは、前記対象から取得した体液において、プロ‐エンケファリン（１１９〜１５９）、中領域プロ‐エンケファリン断片（ＭＲＰＥＮＫ）（配列番号６）のアミノ酸配列内の領域に結合する少なくとも１つの結合剤を使用することによって決定される。
具体的な実施態様では、プロ‐エンケファリン又はその断片のレベルは、プロ‐エンケファリン又はその断片に結合する抗体又は抗体の断片を使用するイムノアッセイで測定される。プロ‐エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片を決定するために有用であり得るイムノアッセイは、実施例１で概説されるステップを含んでもよい。すべての閾値及び値は、実施例１に従って使用される試験及びキャリブレーションに対する相関について理解されなければならない。当業者は、閾値の絶対値が、使用されるキャリブレーションによって影響されるかもしれないことを理解しているであろう。これは、本願明細書中で与えられたすべての値及び閾値が、本願明細書中で使用されるキャリブレーション（実施例１）の文脈において理解されるべきであることを意味する。
本願発明によれば、プロ‐エンケファリンに対する診断結合剤は、抗体、例えば、ＩｇＧ、標準的な全長免疫グロブリン、又は、少なくとも重及び／又は軽鎖のＦ‐可変領域を有する抗体断片、例えば、化学結合した抗体（Ｆａｂ）、限定されないが、Ｆａｂミニボディを含むＦａｂ‐断片、単鎖Ｆａｂ抗体、エピトープタグを有する一価のＦａｂ抗体、例えば、ＣＨ３領域で二量体化されたＦａｂ‐Ｖ５Ｓｘ２；二価Ｆａｂ（ミニ抗体）；二価Ｆａｂ又は多価Ｆａｂ、例えば、異種ドメインを用いて多量体化を介して形成される、例えば、ｄＨＬＸドメインの二量体化を介して、例えば、Ｆａｂ‐ｄＨＬＸ‐ＦＳｘ２；Ｆ（ａｂ’）、ｓｃＦｘ‐断片、多量体化多価又は／及び多重特異性ｓｃＦｖ‐断片、二価及び／又は二重特異性ダイアボディ、ＢＩＴＥ（登録商標）（二重特異性Ｔ細胞誘導（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ・ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ））、三機能性（tｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）抗体、多価抗体、例えば、Ｇとは異なるクラス由来の；シングルドメイン抗体、例えば、ラクダ科の動物又はフィッシュ免疫グロブリン由来のナノボディからなる群から選択される。
特定の実施態様では、プロ‐エンケファリン又はその断片のレベルは、以下で詳細に記載されるような、プロ‐エンケファリン又はその断片に結合する、アプタマー、非‐Ｉｇスキャフォールドを含む群から選択される結合剤を使用するアッセイで測定される。
プロ‐エンケファリン又はその断片のレベルを決定するために使用され得る結合剤は、少なくとも１０7Ｍ-1、好ましくは、１０8Ｍ-1のプロ‐エンケファリンに対する親和定数、好ましい親和定数は、１０9Ｍ-1超、最も好ましくは、１０10Ｍ-1超を示す。当業者は、化合物のより高い用量を適用することによってより低い親和性を補うと考えられ得、そしてこの測定が、本願発明の範囲外につながらないことを理解する。結合親和性は、分析サービス、例えば、Ｂｉａｆｆｉｎ Ｋａｓｓｅｌ Ｇｅｒｍａｎｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉａｆｆｉｎ．ｃｏｍ／ｄｅ／）として提供されるＢｉａｃｏｒｅ法を使用して決定されてもよい。
ヒトプロ‐エンケファリン対照サンプルは、ＩＣＩ‐Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｃｉ‐ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．ｃｏｍ／から入手し得る。アッセイは、また、合成（本願発明者等の実験では、本願発明者等は、合成ＭＲＰＥＮＫ、配列番号６を使用）又は組み換えプロ‐エンケファリン又はその断片によってキャリブレーションしてもよい。
抗体に加えて、他のバイオポリマースキャフォールドが、標的分子を複雑にするために当該技術分野においてよく知られており、そして非常に標的特異的なバイオポリマーの生成のために使用される。例は、アプタマー、スピゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）及びコノトキシンである。非‐Ｉｇスキャフォールドは、タンパク質スキャフォールドであってもよく、そしてそれらは、リガンド又は抗原に結合することができる抗体模倣物として使用されてもよい。非‐Ｉｇスキャフォールドは、テトラネクチンベース非‐Ｉｇスキャフォールド（例えば、米国特許出願公開第２０１０／００２８９９５号に記載）、フィブロネクチンスキャフォールド（例えば、欧州特許第１２６６０２５号に記載）、リポカリンベーススキャフォールド（例えば、国際公開第２０１１／１５４４２０号に記載）、ユビキチンスキャフォールド（例えば、国際公開第２０１１／０７３２１４号に記載）、転移（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）スキャフォールド（例えば、米国特許出願公開第２００４／００２３３３４号に記載）、プロテインＡスキャフォールド（例えば、欧州特許第２２３１８６０号に記載）、アンキリンリピートベーススキャフォールド（例えば、国際公開第２０１０／０６０７４８号に記載）、微小タンパク質、好ましくは微小タンパク質形成シスチンノットスキャフォールド（欧州特許第２３１４３０８号に記載）、Ｆｙｎ ＳＨ３ドメインベーススキャフォールド（例えば、国際公開第２０１１／０２３６８５号に記載）及びクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインベーススキャフォールド（例えば、欧州特許第１９４１８６７号に記載）を含む群から選択されてもよい。
腎疾患／機能不全を診断するための閾値、又は死若しくは有害事象のリスクを決定するための閾値は、上限の正常範囲（９９パーセンタイル、８０ｐｍｏｌ ＭＲＰＥＮＫ／Ｌ、好ましくは、１００ｐｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、１２０ｐｍｏｌ／Ｌ）であってもよい。閾値の範囲は、７５〜１３０ｐｍｏｌ ＭＲＰＥＮＫ／Ｌの間が有用である。
１つの実施態様では、プロ‐エンケファリンのレベルは、イムノアッセイで測定され、そして結合剤は、プロ‐エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片に結合する抗体又は抗体断片である。
１つの具体的な実施態様では、使用されるアッセイは、アミノ酸１３３〜１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ（配列番号１３））及びアミノ酸１５２〜１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ（配列番号１４））である、プロ‐エンケファリンの領域内の２つの異なる領域に結合する２つの結合剤を含み、ここで、前記領域のそれぞれが、少なくとも４又は５つのアミノ酸を含む。
本願発明によるサンプル中のプロ‐エンケファリン又はプロ‐エンケファリン断片を決定するためのアッセイの１つの実施態様では、前記アッセイのアッセイ感度は、健康な対象のプロ‐エンケファリン又はプロ‐エンケファリン断片を定量でき、そしてそれは、＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは、＜１０ｐｍｏｌ／Ｌ、及びより好ましくは、＜６ｐｍｏｌ／Ｌである。
本願発明の主題は、（ａ）対象において腎機能を診断し又は監視するための、又は（ｂ）対象において腎機能障害を診断するための、又は（ｃ）疾患のある対象において有害事象のリスクを予測し又は監視するための、ここで、前記有害事象は、腎不全、腎機能の喪失及び末期腎疾患を含む腎機能障害の悪化、又は腎不全、腎機能の喪失及び末期腎疾患を含む腎機能障害による死を含む群から選択される、又は（ｄ）治療又は治療介入の成功を予測し又は監視するための方法における、前記対象から取得された体液中の配列番号１〜１２のペプチド及び断片を含む群から選択されるペプチドのアミノ酸配列内の領域に結合する少なくとも１つの結合剤の使用である。１つの実施態様では、前記結合剤は、プロ‐エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片に結合する、抗体、抗体断片、又は非‐Ｉｇスキャフォールドを含む群から選択される。具体的な実施態様では、前記少なくとも１つの結合剤は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０を含む群から選択される配列を有する領域に結合する。具体的な実施態様では、前記結合剤は、エンケファリンペプチド Ｍｅｔ‐エンケファリン（配列番号３）及びＬｅｕ‐エンケファリン（配列番号４）に結合しない。具体的な実施態様では、前記少なくとも１つの結合剤は、配列番号１、２、５、６、７、８、９及び１０を含む群から選択される配列を有する領域に結合する。他の具体的な実施態様では、前記少なくとも１つの結合剤は、配列番号２、５、６及び１０を含む群から選択される配列を有する領域に結合する。他の特に具体的な実施態様では、前記結合剤は、プロ‐エンケファリン（１１９〜１５９）、中領域プロ‐エンケファリン断片（ＭＲＰＥＮＫ）に結合する。
より具体的な実施態様では、少なくとも１つの結合剤は、前記対象から取得した体液において、プロ‐エンケファリン１１９〜１５９、中領域プロ‐エンケファリン、ＭＲＰＥＮＫ（配列番号６）のアミノ酸配列内の領域に、より好ましくは、アミノ酸１３３〜１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ（配列番号１３））及び／又はアミノ酸１５２〜１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ（配列番号１４））に結合し、ここで、前記領域のそれぞれは、少なくとも４又は５つのアミノ酸を含む。
従って、本願発明では、上記結合剤の免疫反応性のレベルは、前記対象から取得した体液において決定される。免疫反応性のレベルは、そのような分析物に対する結合剤の結合反応によって、定量的、半定量的又は定性的に決定された分析物の濃度を意味し、ここで、好ましくは、結合剤は、少なくとも１０8Ｍ-1の分析物に対する結合のための親和定数を有し、そして結合剤は、抗体、抗体断片又は非ＩｇＧスキャフォールドであってもよく、そして結合反応は、イムノアッセイである。
ＰＥＮＫ及びその断片、特にＭＲＰＥＮＫを使用する本願方法は、（ａ）対象において腎機能を診断し又は監視するための、又は（ｂ）対象において腎機能障害を診断するための、又は（ｃ）疾患のある対象において有害事象のリスクを予測し又は監視するための、ここで、前記有害事象は、腎不全、腎機能の喪失及び末期腎疾患を含む腎機能障害の悪化、又は腎不全、腎機能の喪失及び末期腎疾患を含む腎機能障害による死を含む群から選択される、又は（ｄ）治療又は治療介入の成功を予測し又は監視するための方法のための先行技術に従って使用される方法及びバイオマーカーよりも非常に優れている。まず第一に、上記使用のためのバイオマーカーとしてのＰＥＮＫ及びその断片は、炎症非依存性バイオマーカーである。ＮＧＡＬ及びＫＩＭなどの公知の腎バイオマーカーの大部分が炎症依存性であり、対象が、例えば、敗血症などで炎症を有する場合、ＮＧＡＬ又はＫＩＭの上昇が炎症又は腎機能／機能障害のいずれかに起因してもよいので、これは重要な特徴である。従って、単一のカットオフ値（１つの（１）カットオフ値を意味する）を少なくとも使用せずに、いかなる鑑別診断も行えず、そして、調査した特定の患者集団から独立している。ＮＧＡＬ及びＫＩＭについて、個々の及びすべての患者は、これらの腎臓マーカーの臨床応用をいくつかの疾患で困難にし、そして他の疾患で不可能にする前記対象の炎症状態に依存する、腎機能／機能障害のための「個々の（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」閾値を有する。逆に、対象の炎症状態に依存しない１つの単一の閾値は、すべての対象について本願方法に従って使用されてもよい。本願発明のこのマーカーは、上記マーカーと比較して臨床ルーチンのために適している。
本願発明の方法におけるバイオマーカーとしてのＰＥＮＫ及びその断片、特に、ＭＲＰＥＮＫは、腎障害及び炎症を反映する、ＮＧＡＬ及びＫＩＭと比較して、「実際の（ｒｅａｌ）」腎機能を反映する。
従って、本願発明の主題は、上記ステップ及び特徴を有する、（ａ）対象において腎機能を診断し又は監視するための、又は（ｂ）対象において腎機能障害を診断するための、又は（ｃ）疾患のある対象において有害事象のリスクを予測し又は監視するための、ここで、前記有害事象は、腎不全、腎機能の喪失及び末期腎疾患を含む腎機能障害の悪化、又は腎不全、腎機能の喪失及び末期腎疾患を含む腎機能障害による死を含む群から選択される、又は（ｄ）治療又は治療介入の成功を予測し又は監視するための方法であって、ここで、炎症状態非依存性閾値が使用される。
上記方法及び（ａ）対象において腎機能を診断し又は監視するための、又は（ｂ）対象において腎機能障害を診断するための、又は（ｃ）疾患のある対象において有害事象のリスクを予測し又は監視するための、ここで、前記有害事象は、腎不全、腎機能の喪失及び末期腎疾患を含む腎機能障害の悪化、又は腎不全、腎機能の喪失及び末期腎疾患を含む腎機能障害による死を含む群から選択される、又は（ｄ）治療又は治療介入の成功を予測し又は監視するための方法におけるバイオマーカーとしてのＰＥＮＫ及びその断片の使用の他の利点は、バイオマーカーとしてのＰＥＮＫ及びその断片が、腎機能、腎機能障害、有害事象のリスク、治療又は治療介入の成功のための非常に早期のバイオマーカーであることである。
クレアチニンに対するＰＥＮＫの優位性の１つの明確な兆候は、入院の日に重病の患者において決定されたそれぞれの濃度とかれらの７日間の死亡率との関連性の分析に由来し：生存者のＰＥＮＫ濃度は、非生存者と著しく異なる一方で、これは、クレアチニンクリアランスのケースではない。そのような患者集団の死亡率は、腎機能の喪失によって主に引き起こされる。従って、ＰＥＮＫと死亡率のクレアチニンクリアランスよりも顕著なそして非常に強い関連性が、腎機能障害のマーカーとして、クレアチニンに対するＰＥＮＫの優位性を裏付ける。
本願発明の主題は、また、（ａ）対象において腎機能を診断し又は監視するための、又は（ｂ）対象において腎機能障害を診断するための、又は（ｃ）疾患のある対象において有害事象のリスクを予測し又は監視するための、ここで、前記有害事象は、腎不全、腎機能の喪失及び末期腎疾患を含む腎機能障害の悪化、又は腎不全、腎機能の喪失及び末期腎疾患を含む腎機能障害による死を含む群から選択される、又は（ｄ）限定されないが、任意の上記実施態様に従った、血液透析、腹膜透析、血液濾過及び腎移植を含む腎代替療法の様々な方法を含む腎機能を補助し又は腎機能に取って代わる治療又は治療介入の成功を予測し又は監視するための方法であり、ここで、前記対象から取得された体液中のプロ‐エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片のレベルは、単独で又は他の予後予測に有用である実験又は臨床パラメーターと共に使用され、以下の選択肢：
「健康な」又は「見かけ上健康な（ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ ｈｅａｌｔｈｙ）」対象の集団において予め決定されたサンプルのアンサンブル中の前記対象から取得した体液中のプロ‐エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片のレベルの中央値との比較、
「健康な」又は「見かけ上健康な」対象の集団において予め決定されたサンプルのアンサンブル中の前記対象から取得した体液中のプロ‐エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片のレベルの変位値との比較、
Ｃｏｘ比例ハザード分析に基づく、又はリスク指標計算、例えば、ＮＲＩ（純再分類指標（Ｎｅｔ Ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ））又はＩＤＩ（統合判別指標（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ））を使用することによる計算
から選択されてもよい。
また、前記少なくとも１つの臨床パラメーターは、年齢、ＮＧＡＬ、シスタチンＣ、クレアチニンクリアランス、クレアチニン、尿素及びＡｐａｃｈｅスコアを含む群から選択され、決定されてもよい。
本願発明の１つの実施態様では、前記方法は、前記対象の機能又は機能不全又はリスクを監視するために、又は腎臓及び／又は疾患の治療経過を監視するために２回以上行われる。１つの具体的な実施態様では、前記監視は、採用される予防及び／又は治療手段に対する前記対象の応答を評価するために行う。
本願発明の１つの実施態様では、本願方法は、前記対象をリスク群に層別化するために使用される。
本願発明の主題は、アミノ酸１３３〜１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ（配列番号１３））及びアミノ酸１５２〜１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ（配列番号１４））であるプロ‐エンケファリンの領域内の２つの異なる領域に結合する２つの結合剤を含む、サンプル中のプロ‐エンケファリン及びプロ‐エンケファリン断片を決定するためのさらなるアッセイであり、ここで、それぞれの前記領域は、少なくとも４又は５つのアミノ酸を含む。
本願発明によるサンプル中のプロ‐エンケファリン又はプロ‐エンケファリン断片を決定するためのアッセイの１つの実施態様では、前記アッセイの分析感度は、健康な対象のプロ‐エンケファリン又はプロ‐エンケファリン断片を定量することができ、そして、＜１５ｐｍｏｌ／ｌ、好ましくは、＜１０ｐｍｏｌ／ｌ、そして最も好ましくは、＜６ｐｍｏｌ／ｌである。
本願発明によるサンプル中のプロ‐エンケファリン又はプロ‐エンケファリン断片を決定するためのアッセイの１つの実施態様では、前記結合剤は、少なくとも１０7Ｍ-1、好ましくは、１０8Ｍ-1のその結合パートナーに対する結合親和性を示し、好ましい親和定数は１０9Ｍ-1未満であり、最も好ましくは、１０10Ｍ-1未満である。当業者は、化合物のより高い用量を適用することによってより低い親和性を補うと考えられ得、そしてこの測定が、結合親和性が上記のように決定されてもよい、本願発明の範囲外につながらないことを理解する。
本願発明の１つの実施態様では、いわゆる、ＰＯＣ‐試験（臨床現場即時（ｐｏｉｎｔ‐ｏｆ‐ｃａｒｅ）試験）であってもよく、それは、完全に自動化されたアッセイ系の必要なしで、患者の近くで、１時間未満で、試験を行うことができる試験技術である。この技術の１つの例は、イムノクロマト試験技術である。
本願発明の１つの実施態様では、そのようなアッセイは、限定されないが、酵素標識、化学発光標識、電気化学発光標識を含む任意の種類の検出技術を使用するサンドイッチイムノアッセイ、好ましくは、完全に自動化されたアッセイである。本願発明の１つの実施態様では、そのようなアッセイは、酵素標識サンドイッチアッセイである。自動化又は完全自動化アッセイの例は、以下の系：Ｒｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ（登録商標）、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｃｅｎｔａｕｅｒ（登録商標）、Ｂｒａｈｍｓ Ｋｒｙｐｔｏｒ（登録商標）、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ Ｖｉｄａｓ（登録商標）、Ａｌｅｒｅ Ｔｒｉａｇｅ（登録商標）の１つに使用されてもよい系を含む。
様々なイムノアッセイが知られ、そして本願発明のアッセイ及び方法のために使用されてもよく、ラジオイムノアッセイ（「ＲＩＡ」）、均一酵素増幅イムノアッセイ（「ＥＭＩＴ」）、酵素結合免疫吸着アッセイ（「ＥＬＩＳＡ」）、アポ酵素再活性化イムノアッセイ（「ＡＲＩＳ」）、ディップスティックイムノアッセイ及びイムノクロマトグラフィーアッセイが挙げられる。
本願発明の１つの実施態様では、前記２つの結合剤の少なくとも１つが、検出するために、標識される。
好ましい検出方法は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、化学発光及び蛍光イムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ルミネックスベースビーズアレイ、タンパク質マイクロアレイアッセイ、及び例えば、イムノクロマトグラフィーストリップ試験などの迅速試験形式などの様々な形式のイムノアッセイを含む。
好ましい実施態様では、前記標識は、化学発光標識、酵素標識、蛍光標識、放射性ヨウ素標識を含む群から選択される。
アッセイは、均一系（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）アッセイ又は不均一系（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）アッセイ、競合アッセイ及び非競合アッセイであり得る。１つの実施態様では、アッセイは、サンドイッチアッセイ形式であり、そしてそれは、非競合アッセイであり、ここで、検出され及び／又は定量される分子は、第一抗体に結合し、そして第二抗体に結合する。第一抗体は、固相、例えば、ビーズ、ウェル又は他の容器の表面、チップ又はストリップに結合されてもよく、そして第二抗体は、例えば、色素、放射性同位体又は反応性若しくは触媒活性を有する部分で標識された抗体である。分析物に結合された標識された抗体の量が、その後、適切な方法で測定される。「サンドイッチアッセイ」に関係する一般的な組成物及び手順は、よく確立されており、そして当業者に公知である（２３）。
他の実施態様では、アッセイは、２つの捕捉分子、好ましくはどちらも液体反応混合物中に分散体として存在する抗体、を含み、ここで、分析物への両捕捉分子の結合に際して、サンプルを含む溶液中で形成されたサンドイッチ複合体の検出を可能とする測定可能なシグナルが生成されるように、第一標識構成要素が第一捕捉分子に結合され、ここで、前記第一標識構成要素は蛍光又は化学発光の消光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ‐ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）又は増幅に基づく標識系の一部であり、そして、上記マーキング系の第二標識構成要素が第二捕捉分子に結合される。
他の実施態様において、上記標識システムは、レアアースクリプテート又はレアアースキレートを、蛍光色素または化学発光色素、特にシアニンタイプの色素と共に含む。
本願発明の文脈において、蛍光に基づくアッセイは色素の使用を含み、それは例えば、ＦＡＭ（５‐または６‐カルボキシフルオレセイン）、ＶＩＣ、ＮＥＤ、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、フルオレセインイソチオシアネート（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（ＦＩＴＣ）、ＩＲＤ‐７００／８００、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ３．５、ＣＹ５．５、Ｃｙ７などのシアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）色素、キサンテン（Ｘａｎｔｈｅｎ）、６‐カルボキシ‐２’，４’，７’，４，７‐ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ＴＥＴ、６‐カルボキシ‐４’，５’‐ジクロロ‐２’，７’‐ジメトジフルオレセイン（ＪＯＥ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’‐テトラメチル‐６‐カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６‐カルボキシ‐Ｘ‐ローダミン（ＲＯＸ）、５‐カルボキシローダミン‐６Ｇ（Ｒ６Ｇ５）、６‐カルボキシローダミン‐６Ｇ（ＲＧ６）、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ローダミングリーン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ）、ローダミンレッド（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ）、ローダミン１１０（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １１０）、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲなどのＢＯＤＩＰＹ色素、オレゴン・グリーン（Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ）、Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅなどのクマリン（Ｃｏｕｍａｒｉｎｅｓ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８などのベンズイミド（Ｂｅｎｚｉｍｉｄｅｓ）；テキサス レッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、ヤキマ イエロー（Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ）、アレクサ フルオル（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）などのフェナントリジン（Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｄｉｎｅｓ）、ＰＥＴ、臭化エチジウム（Ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）、アクリジニウム（Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ）色素、カルバゾール（Ｃａｒｂａｚｏｌ）色素、フェノキサジン（Ｐｈｅｎｏｘａｄｉｎｅ）色素、ポルフィリン（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｅ）色素、ポリメチン（Ｐｏｌｙｍｅｔｈｉｎ）色素などを含む群から選択される。
本願発明の文脈において、化学発光に基づくアッセイは、化学発光材料について（２４）に記載された物理的原理に基づく色素の使用を含む。好ましい化学発光色素は、アクリジニウムエステルである。
本願明細書中で言及されるとおり、「アッセイ（ａｓｓａｙ）」又は「診断アッセイ（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｓｓａｙ）」は、診断の分野において適用される任意のタイプのものであることができる。そのようなアッセイは、検出される分析物の１つ又は複数の捕捉プローブへの一定の親和性による結合に基づくことができる。捕捉分子と標的分子又は着目の分子の間の相互作用に関しては、結合定数が１０8Ｍ-1超であることが好ましい。
本発明の文脈において、「結合剤分子（ｂｉｎｄｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、標的分子又は着目の分子、すなわち、サンプル由来の分析物（すなわち、本発明の関係においては、ＰＥＮＫ及びその断片）を結合するために使用されることができる分子である。従って、結合剤分子は、標的分子又は着目の分子を特異的に結合するために、空間的に並びに表面電荷、疎水性、親水性、ルイスドナー及び／又はアクセプターの存在又は不存在などの表面の特徴に関して適切に形作られなければならない。これによって、結合は、例えば、イオン性、ファン‐デル‐ワールス、ｐｉ‐ｐｉ、シグマ‐ｐｉ、疎水性又は水素結合相互作用、あるいは捕捉分子と標的分子又は着目の分子の間の上記相互作用のうちの２つ以上の組合せによって仲介されることができる。本発明の関係において、結合剤分子は、例えば、核酸分子、炭化水素分子、ＰＮＡ分子、タンパク質、抗体、ペプチド又は糖タンパク質を含む群から選択されることができる。好ましくは、結合剤分子は、標的又は着目の分子への十分な親和性を有するその断片を含む抗体であり、組換え抗体または組換え抗体断片、並びに少なくともその１２個のアミノ酸の長さを有する、変異鎖由来の上記抗体又は断片の化学的及び／又は生化学的に修飾された誘導体を含む。
化学発光標識は、アクリジニウムエステル標識、イソルミノール標識を含むステロイド標識などであってもよい。
酵素標識は、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、クレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、酸ホスファターゼ、グルコース‐６‐ホスフェートデヒドロゲナーゼなどであってもよい。
本願発明の１つの実施態様において、上記２つの結合剤のうちの少なくとも１つは、磁性粒子としての固相、及びポリスチレン表面に結合される。
本願発明によるサンプル中のプロ‐エンケファリン又はプロ‐エンケファリン断片を決定するためのアッセイの１つの実施態様では、そのようなアッセイは、サンドイッチアッセイ、好ましくは、完全に自動化されたアッセイである。ＥＬＩＳＡは完全に自動化又は手動であってもよい。いわゆる、ＰＯＣ‐試験（臨床現場即時（ｐｏｉｎｔ‐ｏｆ‐ｃａｒｅ）試験）であってもよい。自動又は完全に自動化されたアッセイの例は、以下のアッセイ：Ｒｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ（登録商標）、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｃｅｎｔａｕｅｒ（登録商標）、Ｂｒａｈｍｓ Ｋｒｙｐｔｏｒ（登録商標）、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ Ｖｉｄａｓ（登録商標）、Ａｌｅｒｅ Ｔｒｉａｇｅ（登録商標）の１つに使用されてもよいアッセイを含む。
本願発明によるサンプル中のプロ‐エンケファリン又はプロ‐エンケファリン断片を決定するためのアッセイの１つの実施態様では、前記２つの結合剤の少なくとも１つが、検出されるために、標識される。標識の種類は、上で提供される。
本願発明によるサンプル中のプロ‐エンケファリン又はプロ‐エンケファリン断片を決定するためのアッセイの１つの実施態様では、前記２つの結合剤の少なくとも１つが、固相に結合される。固相の例は、上で提供される。
本願発明によるサンプル中のプロ‐エンケファリン又はプロ‐エンケファリン断片を決定するためのアッセイの１つの実施態様では、前記標識は、化学発光標識、酵素標識、蛍光標識、放射性ヨード標識を含む群から選択される。本願発明のさらなる主題は、本願発明に従ったアッセイを含むキットであり、ここで、前記キットの構成要素は、１つ以上の容器中に含まれてもよい。
１つの実施態様では、本願発明の主題は、本願発明による方法を行うための臨床現場即時装置であり、ここで、前記臨床現場即時装置は、アミノ酸１３３〜１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ（配列番号１３））又はアミノ酸１５２〜１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ（配列番号１４））のいずれかに対する少なくとも１つの抗体又は抗体断片を含み、ここで、前記領域のそれぞれが、少なくとも４又は５つのアミノ酸を含む。
１つの実施態様では、本願発明の主題は、本願発明による方法を行うための臨床現場即時装置であり、ここで、臨床現場即時装置は、アミノ酸１３３〜１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ（配列番号１３））及びアミノ酸１５２〜１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ（配列番号１４））に対する少なくとも２つの抗体又は抗体断片を含み、ここで、前記領域のそれぞれが、少なくとも４又は５つのアミノ酸を含む。
１つの実施態様では、本願発明の主題は、本願発明による方法を行うためのキットであり、ここで、前記臨床現場即時装置は、アミノ酸１３３〜１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ（配列番号１３））又はアミノ酸１５２〜１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ（配列番号１４））のいずれかに対する少なくとも１つの抗体又は抗体断片を含み、ここで、前記領域のそれぞれが、少なくとも４又は５つのアミノ酸を含む。
１つの実施態様では、本願発明の主題は、本願発明による方法を行うためのキットであり、ここで、臨床現場即時装置は、アミノ酸１３３〜１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ（配列番号１３））及びアミノ酸１５２〜１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ（配列番号１４））に対する少なくとも２つの抗体又は抗体断片を含み、ここで、前記領域のそれぞれが、少なくとも４又は５つのアミノ酸を含む。
図１は、典型的なプロ‐エンケファリン用量／シグナル曲線を示す。プロ‐エンケファリンの標準曲線である。 図２は、健康な集団におけるプロ‐エンケファリンの度数分布を示す（ｎ＝４２１１）。ＰＥＮＫの平均値は、４４．７ｐｍｏｌ／Ｌであり、標準偏差＝１．２７であり、９９パーセンタイル（上限の正常範囲）は、８０ｐｍｏｌ ＰＥＮＫ／Ｌである。図２は、ＰＥＮＫのＬＮ値を示す。 図３は、健康な対象における、クレアチニンクリアランス対ＰＥＮＫの相関を示す。Ｙ軸はクレアチニンクリアランスの四分位数であり、Ｘ軸はＰＥＮＫの四分位数である。 図４は、クレアチニンクリアランスと非常に相関されたＰＥＮＫを示す（ｒ＝‐０．７４、ｐ＜０．０００１） 図５は、増加したＰＥＮＫが、腎機能障害と顕著に相関することを示す。 図６は、プロ‐エンケファリン及びＲＩＦＬＥ分類（上記参照）による腎機能障害の診断の受信者操作特性曲線（ＲＯＣ）を示す。曲線下面積（ＡＵＣ）は、０．８６８であり、腎機能障害のためのプロ‐エンケファリンの強い診断能力を示す。 図７は、増加したＮＧＡＬが、腎機能障害を有する患者を顕著に増加することを示す。ＮＧＡＬの正常範囲（０．０３７〜０．０．１０６μｇ／ｍＬの範囲；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｐｏｒｔｏ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｉｏｐｏｒｔｏ＿ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ／ｎｇａｌ＿ｅｌｉｓａ＿ｋｉｔｓ／ｎｇａｌ＿ｒａｐｉｄ＿ｅｌｉｓａ＿ｋｉｔ＿ｃｅｉｖｄ）は、図中の影の部分によって示される。 図８は、ＮＧＡＬ及びＲＩＦＬＥ分類（上記参照）による腎機能障害の診断の受信者操作特性曲線（ＲＯＣ）を示す。本願発明者等は、腎機能障害の参照マーカーとしてＮＧＡＬを使用した。ＡＵＣは０．８０９であり、実質的にプロ‐エンケファリン（ＡＵＣ０．８６８（図６））よりも低く、プロ‐エンケファリンの増分値を示す。 図９は、ＰＥＮＫが敗血症転帰について非常に予後予測することを示す。 図１０は、ＰＥＮＫとＡＰＡＣＨＥ２とを組み合わせた場合、重要な追加情報であることを示す。 図１１ａは、初期ＰＥＮＫが、＜１００ｐｍｏｌ／Ｌであり、入院の間、＜１００ｐｍｏｌ／Ｌに維持される患者（生存者）を示す。 図１１ｂは、初期ＰＥＮＫが、＞１００ｐｍｏｌ／Ｌであり、＜１００ｐｍｏｌ／Ｌの値に低減しなかった患者（入院中に死亡）を示す。 図１１ｃは、初期ＰＥＮＫが、＞１００ｐｍｏｌ／Ｌであり、＜１００ｐｍｏｌ／Ｌの値に低減しなかった患者（入院中に死亡）を示す。 図１１ｄは、初期ＰＥＮＫが、＞１００ｐｍｏｌ／Ｌであり、ＩＣＵ処置の１日以内に、ＰＥＮＫ値が、＜１００ｐｍｏｌ／Ｌの値に低減した患者（生存者）を示す。 図１２は、１日目（ＥＤでの提示）において、ＰＥＮＫが、男性集団における院内での死の予測について、さらに強いことを示す。 図１３は、ＡＵＣ０．８９をもたらすＰＥＮＫ及びＡｐａｃｈｅの組み合わせ対Ａｐａｃｈｅ単独の０．８３７を示す。 図１４は、ＡＣＵ０．９１の優れた予後予測値を生じるＰＥＮＫ及びクレアチニンクリアランスの組み合わせ対クレアチニンクリアランス単独の０．７２１を示す。 図１５Ａは、急性腎機能障害のグレードによって分類される敗血症患者における血漿ＰＥＮＫ（Ａ）の濃度を示す。０＝腎機能障害なし；Ｒ＝リスク（Ｒｉｓｋ）；Ｉ＝損傷（Ｉｎｊｕｒｙ）；Ｆ＝不全（Ｆａｉｌｕｒｅ）；Ｌ＝喪失（Ｌｏｓｓ）である。カテゴリーは、以下のように定義する（ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ａｃｕｔｅ＿Ｋｉｄｎｅｙ＿ｉｎｊｕｒｙ）：リスク：ＧＦＲ低下＞２５％、血清クレアチニンの１．５倍増加、又は６時間の＜０．５ｍｌ／ｋｇ／時間の尿産生；損傷：ＧＦＲ低下＞５０％、２倍のクレアチニン、又は１２時間の＜０．５ｍｌ／ｋｇ／時間の尿産生；不全：ＧＦＲ低下＞７５％、３倍のクレアチニン又はクレアチニン＞３５５μｍｏｌ／ｌ（＞４４の上昇を有する）（＞４ｍｇ／ｄｌ）、又は２４時間の０．３ｍｌ／ｋｇ／時間未満の尿排出；喪失：持続性のＡＫＩ、又は４週間超の腎機能の完全な喪失。ＰＥＮＫの正常範囲（図２を参照）及びＮＧＡＬ（０．０３７〜０．１０６μｇ／ｍＬの範囲；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ .ｂｉｏｐｏｒｔｏ.ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｉｏｐｏｒｔｏ＿ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ／ｎｇａｌ＿ｅｌｉｓａ＿ｋｉｔｓ／ｎｇａｌ＿ｒａｐｉｄ＿ｅＩｉｓａ＿ｋｉｔ＿ｃｅ＿ｉｖｄ）濃度は、図中の影の部分によって示される。図は、敗血症患者が腎機能障害を有していない場合でさえ、ＮＧＡＬ濃度が敗血症患者において大幅に上昇し、一方、ＰＥＮＫの場合はそうでないことを示す。 図１５Ｂは、急性腎機能障害のグレードによって分類される敗血症患者における血漿ＮＧＡＬ（Ｂ）の濃度を示す。０＝腎機能障害なし；Ｒ＝リスク（Ｒｉｓｋ）；Ｉ＝損傷（Ｉｎｊｕｒｙ）；Ｆ＝不全（Ｆａｉｌｕｒｅ）；Ｌ＝喪失（Ｌｏｓｓ）である。カテゴリーは、以下のように定義する（ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ａｃｕｔｅ＿Ｋｉｄｎｅｙ＿ｉｎｊｕｒｙ）：リスク：ＧＦＲ低下＞２５％、血清クレアチニンの１．５倍増加、又は６時間の＜０．５ｍｌ／ｋｇ／時間の尿産生；損傷：ＧＦＲ低下＞５０％、２倍のクレアチニン、又は１２時間の＜０．５ｍｌ／ｋｇ／時間の尿産生；不全：ＧＦＲ低下＞７５％、３倍のクレアチニン又はクレアチニン＞３５５μｍｏｌ／ｌ（＞４４の上昇を有する）（＞４ｍｇ／ｄｌ）、又は２４時間の０．３ｍｌ／ｋｇ／時間未満の尿排出；喪失：持続性のＡＫＩ、又は４週間超の腎機能の完全な喪失。ＰＥＮＫの正常範囲（図２を参照）及びＮＧＡＬ（０．０３７〜０．１０６μｇ／ｍＬの範囲；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ .ｂｉｏｐｏｒｔｏ.ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｉｏｐｏｒｔｏ＿ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ／ｎｇａｌ＿ｅｌｉｓａ＿ｋｉｔｓ／ｎｇａｌ＿ｒａｐｉｄ＿ｅＩｉｓａ＿ｋｉｔ＿ｃｅ＿ｉｖｄ）濃度は、図中の影の部分によって示される。図は、敗血症患者が腎機能障害を有していない場合でさえ、ＮＧＡＬ濃度が敗血症患者において大幅に上昇し、一方、ＰＥＮＫの場合はそうでないことを示す。 図１６Ａは、入院当日と翌日（１日目）における重症患者の血漿ＰＥＮＫ濃度に依存する患者の生存率を示す。図１６Ａ（左側）では、カプランマイヤープロットは、それぞれ、１００ｐｍｏｌ／Ｌ超及び未満の入院当日のＰＥＮＫ濃度を有する患者の部分母集団を示す。図１６Ａ（右側）では、カプランマイヤープロットは、それぞれ、１日目において、１００ｐｍｏｌ／Ｌ超及び未満のＰＥＮＫ濃度を有する患者の部分母集団を示し、そして患者は、入院当日において、１００ｐｍｏｌ／Ｌ未満のＰＥＮＫ濃度を有する。 図１６Ｂは、入院当日と翌日（１日目）における重症患者の血漿ＰＥＮＫ濃度に依存する患者の生存率を示す。図１６Ｂ（左側）では、カプランマイヤープロットは、それぞれ、１００ｐｍｏｌ／Ｌ超及び未満の入院当日のＰＥＮＫ濃度を有する患者の部分母集団を示す。図１６Ｂ（右側）では、カプランマイヤープロットは、それぞれ、１日目において、１００ｐｍｏｌ／Ｌ超及び未満のＰＥＮＫ濃度を有する患者の部分母集団を示し、そして患者は、入院当日において、１００ｐｍｏｌ／Ｌ超のＰＥＮＫ濃度を有する。 図１７は、ＰＥＮＫを予測する多変数線形回帰（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｂｌｅ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）を示す。注記：ＢＰ、クレアチニン及び尿素は、ＭＡＰ又はクレアチニンクリアランスとの高い相関により外した。線形回帰は、以下：Ｌｏｇ（ＰＥＮＫ）＝ａ*ＣｒｅａＣｌｅａｒａｎｃｅ＋ｂ*Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ＋ｃ＊ＭＡＰ＋ｅｔｃ．に挙げられた変数を使用して計算した。パーシャル（Ｐａｒｔｉａｌ） Ｒ2は、それぞれの変数がＰＥＮＫに寄与するまでの程度を与える、すなわち、ＣｒｅａＣｌｅａｒａｎｃｅ（クレアチニンクリアランス）が、最も強く、そして０．１５よりもやや高いパーシャルＲ2を有し、すなわち、ＣｒｅａＣｌｅａｒａｎｃｅは、ＰＥＮＫにおいて観察される変動の約１５％の割合を占める。
実施例１
抗体の開発
ペプチド
ペプチドを合成した（ＪＰＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
ペプチド／免疫コンジュゲート
免疫のためのペプチドを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対するペプチドのコンジュゲートのための追加のＮ‐末端システイン残基で合成した。ペプチドを、Ｓｕｌｆｏ‐ＳＭＣＣ（Ｐｅｒｂｉｏ‐ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することによってＢＳＡと共有結合させた。共有結合の方法を、Ｐｅｒｂｉｏの取扱説明書に従って、行った。
抗体を、以下の方法に従って作製した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０日及び１４日で、１００μｇペプチド‐ＢＳＡ‐コンジュゲート（１００μｌ完全フロイントアジュバントにおいて乳化）、２１日及び２８日で、５０μｇ（１００μｌ不完全フロイントアジュバントにおいて）で免疫した。融合実験を行った３日前に、動物は、１つは腹腔内注射及び１つは静脈内注射として与えられる、１００μｌ生理食塩水中に溶解した５０μｇのコンジュゲートを受けた。
免疫したマウス由来の脾細胞及び骨髄腫細胞株ＳＰ２／０の細胞を、１ｍｌの５０％ポリエチレングリコールで、３７℃で３０秒間、融合した。洗浄後、細胞を９６ウェル細胞培養プレートに播種した。ハイブリッドクローンを、ＨＡＴ培地で生育することによって選択した（２０％ウシ胎児血清及びＨＡＴサプリメントを補充したＲＰＭＩ１６４０培地）。２週間後、ＨＡＴ培地を、３回継代のために、ＨＴ培地で置換し、続いて、通常の細胞培養培地に戻した。
細胞培養物上清を、融合後３週間、抗原特異的ＩｇＧ抗体について、一次スクリーニングした。試験陽性ミクロ培養を、増殖のために、２４ウェル中に移した。再試験後、選択された培養物を、限界希釈技術を使用して、クローン化しそして再クローン化し、そしてアイソタイプを決定した。
（Ｌａｎａ，Ｒ．Ｄ．“Ａ ｓｈｏｒｔ‐ｄｕｒａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｆｕｓｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ‐ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．８１：２２３‐２２８；（１９８５）、Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｂ．ら、“Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＧＡＤ）ｉｓ ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｒａｔ ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ‐ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＧＡＤ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．２８：１１‐１５，（１９９６））。
モノクローナル抗体作製
抗体を、標準の抗体作製法（Ｍａｒｘら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（１９９７），ＡＴＬＡ ２５，１２１）を介して作製し、そしてＰｒｏｔｅｉｎ Ａ‐ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを介して精製した。抗体の精製率は、ＳＤＳゲル電気泳動分析に基づいて、＞９５％であった。
抗体の標識及びコーティング
すべての抗体を、以下の方法に従って、アクリジニウムエステルで標識した。
標識化合物（トレーサー）：１００μｇ（１００μｌ）抗体（ＰＢＳにおいて、１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）を、１０μｌアクリジニウムＮＨＳ‐エステル（アセトニトリルにおいて、１ｍｇ／ｍｌ、ＩｎＶｅｎｔ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（欧州特許第０３５３９７１号）と混合し、そして室温で、２０分間、インキュベートした。標識抗体を、Ｂｉｏ‐Ｓｉｌ ＳＥＣ ４００‐５でのゲルろ過ＨＰＬＣ（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）によって精製した。精製した標識抗体を、（３００ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム、１００ｍｍｏｌ／ｌ Ｎａｃｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｎａ‐ＥＤＴＡ、５ｇ／ｌウシ血清アルブミン、ｐＨ７．０）において、希釈した。最終濃度は、標識化合物（約２０ｎｇの標識抗体）（２００μｌあたり）で、約８００．０００相対発光量（ＲＬＵ）であった。アクリジニウムエステル化学発光を、ＡｕｔｏＬｕｍａｔ ＬＢ ９５３（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）を使用することにより、測定した。
固相抗体（コーティングされた抗体）
固相：ポリスチレンチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ‐Ｏｎｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＧ，Ａｕｓｔｒｉａ）を、抗体（１．５μｇ抗体／０．３ｍｌ、１００ｍｍｏｌ／ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．８）で、コーティングした（室温で１８時間）。５％ウシ血清アルブミンでブロッキングした後、チューブをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、そして真空乾燥した。
抗体特異性
抗体交差反応性を、以下のように決定した。
３００μｌ ＰＢＳ中の１μｇペプチド（ｐＨ７．４）を、ポリスチレンチューブに分注し、そして室温で、１時間、インキュベートした。インキュベーション後、チューブを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の５％ ＢＳＡを使用して、５回（それぞれ１ｍｌ）洗浄した。標識抗体のそれぞれを添加し（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の３００μｌ、８００．０００ＲＬＵ／３００μｌ）、室温で２時間、インキュベートした。５回洗浄した後（それぞれ１ｍｌの洗浄溶液（２０ｍｍｏｌ／l ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）、残存発光（標識抗体）を、Ａｕｔｏ Ｌｕｍａｔ ＬＢ ９５３を使用して定量した。ＭＲＰＥＮＫ‐ペプチドを、参照物質として使用した（１００％）。様々な抗体の交差反応性を表３に示す。
すべての抗体は、免疫のために使用したペプチドに相当する、ＭＲＰＥＮＫペプチドを結合した。ＮＴ‐ＭＲＰＥＮＫ抗体（ＥＥＤＤＳＬＡＮＳＳＤＬＬＫと１０％交差反応）以外の抗体は、個々の抗体の免疫のために使用されないＭＲ‐ＰＥＮＫペプチドと交差反応を示さなかった。
プロ‐エンケファリンイムノアッセイ
５０μｌのサンプル（又はキャリブレーター）を、コーティングされたチューブに分注し、標識抗体（２００μｌ）を添加した後、チューブを、１８〜２５℃で２時間、インキュベートした。結合しなかったトレーサーを、洗浄液（２０ｍｍｏｌ／ｌ ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００）で、５回洗浄することによって（それぞれ１ｍｌ）、除去した。チューブ結合標識抗体を、Ｌｕｍｉｎｕｍｅｔｅｒ ＬＢ ９５３及び１０００ｐｍｏｌ／ｌ ＭＲＰＥＮＫの固定された濃度を使用して、測定した。異なる抗体の組み合わせのノイズ（ＭＲＰＥＮＫなしのＲＬＵ）比に対するシグナル（１０００ｐｍｏｌ ＭＲＰＥＮＫ／ｌでのＲＬＵ）を、表４に示す。すべての抗体は、任意の他の抗体とのサンドイッチ複合体を生成することができた。驚くべきことに、ノイズ比に対する最も強いシグナル（最も良い感受性）を、ＭＲ‐ＭＲＰＥＮＫとＣＴ‐ＭＲＰＥＮＫ抗体とを組み合わせることで生成した。その後、本願発明者等は、この抗体の組み合わせを使用して、さらなる研究のためのＭＲＰＥＮＫ‐イムノアッセイを行った。ＭＲ‐ＭＲＰＥＮＫ抗体を、コーティングされたチューブ抗体として使用し、そしてＣＴ‐ＭＲＰＥＮＫ抗体を標識抗体として使用した。
キャリブレーション
アッセイを、２０ｍＭ Ｋ2ＰＯ4、６ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＢＡＳ、５０μＭ アマスタチン、１００μＭ ロイペプチン、ｐＨ８．０で希釈された、合成ＭＲＰＥＮＫの希釈液を使用して、キャリブレーションを行った。プロ‐エンケファリン対照血漿は、ＩＣＩ‐ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手し得る。図１は、典型的なプロ‐エンケファリン用量／シグナル曲線を示す。標準曲線プロ‐エンケファリンである。アッセイの感受性は、０‐キャリブレーター（（ＭＲＰＥＮＫの添加なし）＋２ＳＤ）の２０決定、５．５ｐｍｏｌ／Ｌであった。
クレアチニンクリアランス
クレアチニンクリアランスを、ＭＤＲＤ式（Ｌｅｖｅｙら、２００９参照）を使用して決定した。
実施例２
健康な対象中のＰＥＮＫ
健康な対象（ｎ＝４２１１、平均年齢５６歳）を、ＭＲＰＥＮＫを使用して測定した。平均値は、４４．７ｐｍｏｌ ＭＲＰＥＮＫ／Ｌであり、最低値は、９ｐｍｏｌ／Ｌであり、そして９９パーセンタイルは、８０ｐｍｏｌ／Ｌであった。アッセイ感度は、５．５ｐｍｏｌ／Ｌであり、健康な対象の１００％が、ＭＲＰＥＮＫアッセイ（図２参照）を使用して検出可能であった。
プロ‐エンケファリンは、正常な腎機能を有する健康な対象において、クレアチニンクリアランスと相関する。驚くべきことに、プロ‐エンケファリンは、健康な対象において、クレアチニンクリアランスと負に相関した（ｒ＝‐０．３３、Ｐ＜０．０００１）（図３参照）。相関係数は、女性よりも男性において、わずかに強かった（ｒ＝‐０．３４対‐０．２９、それぞれｐ＜０．０００１）。これらのデータは、ＰＥＮＫと腎機能との間の強い関連性を示す。
図３は、健康な対象におけるクレアチニンクリアランス対ＰＥＮＫの相関を示す。Ｙ軸は、クレアチニンクリアランスの四分位数であり、Ｘ軸は、ＰＥＮＫの四分位数である。
実施例３
慢性及び急性疾患を有する対象におけるＰＥＮＫと腎機能との相関
ＰＥＮＫは、急性疾患において、常に顕著にクレアチニンクリアランスと相関し、その相関は、慢性疾患又は健康な対象における相関よりもより強かった。
実施例４
急性臨床現場において、腎不全の診断のためのＰＥＮＫの診断性能を調査するために、本願発明者等は、以下の臨床試験を行った。
臨床試験
敗血症の定義（Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２００８ Ｊａｎ；３６（１）：２９６‐３２７）を満たす１０１人のＥＤ患者を、続いて入院させ（平均５日間の入院）、そして標準治療を受けた。ＥＤＴＡ血漿を、１日目（ＥＤプレゼンテーション）から作製し、そして入院の間、毎日１つのサンプルを作製した。後の分析物測定のための凍結サンプルの時間は、４時間未満であった。患者の特性を、以下の表６に要約する。
入院期間中にすべての患者の２６．７％が死亡し、そして処置非応答者としてカウントし、すべての患者の７３．３％が敗血症から生き延び、そして処置応答者としてカウントした。
敗血症を呈するすべての患者の５３％が、非正規ＰＥＮＫ値＞８０ｐｍｏｌ／Ｌ（９９パーセンタイル）を有し、ＰＥＮＫが感染のマーカーでないことを示した。
臨床試験の結果
ＰＥＮＫは、クレアチニンクリアランスと非常に相関した（ｒ＝‐０．７４、ｐ＜０．０００１、図４）。
ＰＥＮＫによる腎機能障害の診断
腎機能障害を、ＲＩＦＬＥ分類（Ｖｅｎｋａｔａｍａｒａｎ ａｎｄ Ｋｅｌｌｕｍ，２００７）に基づいて定義した。患者を、なんらかのＲＩＦＬＥ分類因子を充足した場合、腎機能障害としてカウントした。試験コホート内で、本願発明者等は、１日目（ＥＤプレゼンテーション）で、９０人の患者内でＲＩＦＬＥを決定し、３９人の患者がＲＩＦＬＥ分類を充足し（腎疾患のリスク、腎損傷、腎不全、腎機能の喪失又は末期腎疾患を有する）、そして５１人の患者が、腎機能障害を有さなかった。増加したＰＥＮＫは、有意に（ｐ＜０．０００１）腎機能障害と相関した（ＡＵＣ：０．８６８）（図５及び６）。
腎機能障害のための診断値を比較するために、本願発明者等は、ＮＧＡＬを参照マーカーとして使用した（Ｓｏｎｉら、２０１０）。ＮＧＡＬを、ＥＬＩＳＡ（ＮＧＡＬ Ｅｌｉｓａ ｋｉｔ，Ｂｉｏｐｏｒｔｏ，Ｇｅｎｔｏｆｔｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して測定した。
ＮＧＡＬは、ＰＥＮＫのように、腎機能障害を有する患者で有意に増加し（ｐ＜０．０００１）、腎機能障害の診断のためのＡＵＣは、０．８０９であった（図７及び８）。
ＰＥＮＫ及びＮＧＡＬの比較は、腎機能障害の診断のためのＰＥＮＫ対ＮＧＡＬの強い優位性を示した。ＰＥＮＫのＣｈｉ２値は、４５．３２であるのに対して、ＮＧＡＬは、３２．２１であり、ＰＥＮＫによって、診断品質（特異性及び感度）の４０％の改善を示した（表７）。
初期ＰＥＮＫの高い予後予測
本願発明者等は、初期ＰＥＮＫ値と院内死亡率とを相関させ、そしてＰＥＮＫとＡＰＡＣＨＥ２敗血症スコア（Ｋｎａｕｓら、１９８５，２００１）及びクレアチニンクリアランスとを比較した。ＰＥＮＫは、敗血症転帰について非常に予後予測し（図９参照）、そしてＡＰＡＣＨＥ２スコアに匹敵する（ＡＵＣ／Ｃ指標 ０．７４４（ＰＥＮＫ）及び０．７８３（Ａｐａｃｈｅ））。ＰＥＮＫ及びＡＰＡＣＨＥ２を組み合わせた場合、有意な追加情報である（組み合わせＡＵＣ：０．７９４ 図１０）。ＰＥＮＫは、予後予測において、クレアチニンクリアランス（ＡＵＣ ０．６３８）よりも実質的に強力である。驚くべきことに、ＰＥＮＫの予後予測値は、ＩＣＵ処置の初日後、より強力である（ＡＵＣ ０．７９）。
ＩＣＵ処置１日目後のベースライン及び１サンプルを使用する院内死予後予測のためのカットオフ分析
ＰＥＮＫの予後予測能力が、ＵＣＵ処置開始後１日目にさらに改善したので、本願発明者等は、ＩＣＵ処置前日及びＩＣＵ処置開始後１日目の連続測定で、ＰＥＮＫを分析した。臨床性能を示すために、本願発明者等は、１００ｐｍｏｌ／Ｌのカットオフ値で、単一カットオフ分析を使用した。
患者が、病院でのプレゼンテーションにおいて、カットオフ未満であり、そしてＩＣＵ処置開始後、カットオフ未満を維持する場合、死亡率は１１％であった（入院前及び中に十分処置された）。ＰＥＮＫが、両時点において、カットオフ超であった場合、死亡率は、約５倍高く（５２．５％）（処置に応答していない）、そして患者が、１００ｐｍｏｌ／ｌ超のＰＥＮＫ値を示し、そしてＩＣＵ処置中に、１００ｐｍｏｌ／ｌ未満にＰＥＮＫレベルが低下した場合、死亡率は０であった（処置応答者）。これらのデータは、ＰＥＮＫと処置の成功との強い関連性を示し、治療フォローアップのためのその使用を支持する。
図１１ａ〜ｄ：患者のフォローアップ測定の例
ａ）初期ＰＥＮＫ＜１００ｐｍｏｌ／Ｌを有し、そして入院中に、＜１００ｐｍｏｌ／Ｌを維持した患者（生存者）
ｂ）初期ＰＥＮＫ＞１００ｐｍｏｌ／Ｌを有し、そして＜１００ｐｍｏｌ／Ｌの値に低下しなかった患者（入院中に死亡）
ｃ）初期ＰＥＮＫ＞１００ｐｍｏｌ／Ｌを有し、そして＜１００ｐｍｏｌ／Ｌの値に低下しなかった患者（入院中に死亡）
ｄ）初期ＰＥＮＫ＞１００ｐｍｏｌ／Ｌを有し、ＰＥＮＫ値が、ＩＣＵ処置の１日目以内に＜１００ｐｍｏｌ／Ｌの値に低下した患者（生存者）
実施例５
ＰＥＮＫの連続測定の使用
実施例４に記載の患者集団において（敗血症、重度の敗血症又は敗血性ショック）、入院日及び翌日（１日目）に測定した。正常範囲の９９パーセンタイル近くである、１００ｐｍｏｌ／Ｌのサンプルカットオフ値を使用して、集団を２つの群に分け（１００ｐｍｏｌ／Ｌ超及び未満）、そして対応する７日目生存率をカプランマイヤープロットで示した（図１６ａ及びｂ）。入院日に１００ｐｍｏｌ／Ｌ未満のＰＥＮＫ濃度を有する患者で、ＰＥＮＫ濃度が１日目に１００ｐｍｏｌ／Ｌ未満を維持した患者は、８７％の高い生存率を有したが、一方で、一日目に、患者のＰＥＮＫ濃度が１００ｐｍｏｌ／Ｌ超に増加した場合、生存率は６７％に低下した。対照的に、入院日に１００ｐｍｏｌ／Ｌ超のＰＥＮＫ濃度を有する患者で、１日目に、ＰＥＮＫ濃度が１００ｐｍｏｌ／Ｌ超を維持した患者は、たった５０％の低い生存率を有したが、一方で、１日目に、患者のＰＥＮＫ濃度が１００ｐｍｏｌ／Ｌ未満に低下した場合、生存率は１００％であった。
実施例６
入院日に、実施例４に記載の患者集団（敗血症、重度の敗血症又は敗血性ショック）において決定した血漿ＰＥＮＫ濃度を使用して、多変数線形回帰分析によって分析し、そしてＰＥＮＫ濃度の程度のためにパラメーター／変数を決定する。図１７において、パーシャルＲ2を示す。分析は、腎機能の測定（クレアチニンクリアランスを示す場合）が、これまでで、ＰＥＮＫ濃度についての最も強い決定因子であることを示す。
表９：実施例４で記載したような、入院日において患者集団で決定された変数と７日目の死との関連性
男性におけるＰＥＮＫ
予後予測マーカーとしてＰＥＮＫを使用したところ、初日（ＥＤでのプレゼンテーション）でのＰＥＮＫは、男性集団における院内死の予後予測において、さらに強力であり（ＡＵＣ ０．８４９、図１２）、Ａｐａｃｈｅ単独ではＡＵＣ ０．８３７であったのに対して、ＰＥＮＫ及びＡｐａｃｈｅの組み合わせは、ＡＵＣ ０．８９をもたらした（図１３）。ＰＥＮＫ及びクレアチニンクリアランスの組み合わせは、クレアチニンクリアランス単独ではＡＵＣ ０．７２１であったのに対して、ＡＵＣ ０．９１の優れた予後予測値を生じた（図１４）。全患者集団については、ＰＥＮＫの予後予測値は、ＩＣＵ処置の初日後、より強力であった（２日目、ＡＵＣ ０．８７２）。

Claims (20)

  1. （ａ）対象において腎機能を診断し又は監視するための、又は（ｂ）対象において腎機能障害を診断するための、又は（ｃ）疾患のある対象において有害事象のリスクを予測し又は監視するための、ここで、前記有害事象は、腎不全、腎機能の喪失及び末期腎疾患を含む腎機能障害の悪化、又は腎不全、腎機能の喪失及び末期腎疾患を含む腎機能障害による死からなる群から選択される、又は（ｄ）治療又は治療介入の成功を予測し又は監視するための方法であって、以下：
    前記対象から取得した体液中のプロ‐エンケファリンの断片のレベルを決定し；そして
    （ａ）対象おいて、前記プロ‐エンケファリンの断片のレベルと腎機能とを相関させ、又は
    （ｂ）対象おいて、前記プロ‐エンケファリンの断片のレベルと腎機能障害とを相関させ、ここで、特定の閾値超の上昇したレベルが、前記対象における腎機能障害についての予測又は診断である、又は
    （ｃ）疾患のある対象おいて、前記プロ‐エンケファリンの断片のレベルと前記有害事象のリスクとを相関させ、ここで、特定の閾値超の上昇したレベルが、前記有害事象の増大したリスクについての予測である、又は
    （ｄ）疾患のある対象おいて、前記プロ‐エンケファリンの断片のレベルと治療又は治療介入の成功とを相関させる、ここで、特定の閾値未満のレベルが、治療又は治療介入の成功についての予測である
    ことを含み、ここで前記プロ‐エンケファリンの断片が、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群から選択され、ここで前記体液が、血液、血清及び血漿からなる群から選択される、方法。
  2. 前記プロ‐エンケファリンの断片のレベルが、プロ‐エンケファリンの断片に対する結合剤を使用することによって決定される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記結合剤が、プロ‐エンケファリンの断片に結合する抗体、抗体断片及び非‐Ｉｇスキャフォールドからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の（ａ）対象において腎機能を診断し又は監視するための、又は（ｂ）対象において腎機能障害を診断するための、又は（ｃ）疾患のある対象において有害事象のリスクを予測し又は監視するための、ここで、前記有害事象は、腎不全、腎機能の喪失及び末期腎疾患を含む腎機能障害の悪化、又は腎不全、腎機能の喪失及び末期腎疾患を含む腎機能障害による死からなる群から選択される、又は（ｄ）治療又は治療介入の成功を予測し又は監視するための方法であって、以下：
    前記対象から取得した体液中のプロ‐エンケファリンの断片のアミノ酸配列内の領域に結合する少なくとも１つの結合剤を使用することによって免疫反応性分析物のレベルを決定し；そして
    （ａ）対象において、前記免疫反応性分析物のレベルと腎機能とを相関させ、又は
    （ｂ）対象において、前記免疫反応性分析物のレベルと腎機能障害とを相関させ、ここで、特定の閾値超の上昇したレベルが、前記対象における腎機能障害についての予測又は診断である、又は
    （ｃ）疾患のある対象おいて、前記免疫反応性分析物のレベルと前記有害事象のリスクとを相関させ、ここで、特定の閾値超の上昇したレベルが、前記有害事象の増大したリスクについての予測である、又は
    （ｄ）疾患のある対象おいて、前記免疫反応性分析物のレベルと治療又は治療介入の成功とを相関させる、ここで、特定の閾値未満のレベルが、治療又は治療介入の成功についての予測である
    ことを含み、ここで前記プロ‐エンケファリンの断片が、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群から選択され、ここで前記体液が、血液、血清及び血漿からなる群から選択される、方法。
  5. 前記少なくも１つの結合剤が、配列番号２、３、４、５、６、８、９及び１０からなる群から選択されるアミノ酸配列内の領域に結合する、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記結合剤がエンケファリンペプチド Ｍｅｔエンケファリン（配列番号３）及びＬｅｕエンケファリン（配列番号４）に結合しない、請求項５に記載の方法。
  7. 前記結合剤が、配列番号２、５、６、８、９及び１０からなる群から選択される配列内の領域に結合する、請求項５又は６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記結合剤が、配列番号２、５、６及び１０からなる群から選択される配列を有する領域に結合する、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記結合剤が、配列番号６に結合する、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記閾値が８０ｐｍｏｌ／Ｌである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記プロ‐エンケファリンのレベルが、イムノアッセイで測定され、そして前記結合剤が、プロエンケファリンの断片に結合する抗体、又は抗体断片である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 使用されるアッセイが、アミノ酸１３３〜１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ（配列番号１３））及びアミノ酸１５２〜１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ（配列番号１４））であるプロ‐エンケファリンの領域内の２つの異なる領域に結合する２つの結合剤を含み、ここで、前記領域のそれぞれが、少なくとも４又は５つのアミノ酸を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. アッセイが、プロ‐エンケファリンの断片のレベルを決定するために使用され、そしてここで、前記アッセイのアッセイ感度が、健康な対象のプロ‐エンケファリン断片を定量することができ、そして＜１５ｐｍｏｌ／Ｌである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 年齢、ＢＵＮ、ＮＧＡＬ、クレアチニンクリアランス、クレアチニン及びＡｐａｃｈｅスコアからなる群から選択される、さらに少なくとも１つの臨床パラメーターが決定される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記プロ‐エンケファリンの断片の決定が、１人の患者について、２回以上行われる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記監視が、採用される予防及び／又は治療手段に対する前記対象の応答を評価するために行われる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記対象をリスク群に層別化するための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 疾患のある対象において、前記プロ‐エンケファリンの断片のレベルが、死又は有害事象のリスクと相関され、ここで、閾値超の上昇したレベルが、死又は有害事象の増大したリスクについての予測であり、そしてここで、前記疾患のある対象が男性である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法を行うための臨床現場即時装置であって、ここで、前記臨床現場即時装置が、アミノ酸１３３〜１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ（配列番号１３））及びアミノ酸１５２〜１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ（配列番号１４））に対する少なくとも２つの抗体又は抗体断片を含む、装置。
  20. 請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法を行うためのキットであって、ここで、前記キットが、アミノ酸１３３〜１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ（配列番号１３））又はアミノ酸１５２〜１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ（配列番号１４））のいずれかに対する少なくとも２つの抗体又は抗体断片を含む、キット。
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