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JP6296796B2 - 新規モジュレーターと使用の方法 - Google Patents

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Description

相互参照される特許出願
[001] 本出願は、そのそれぞれがその全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願シリアル番号：６１／４４４，６１４（２０１１年２月１８日出願）及び特許協力条約（ＰＣＴ）番号：ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５０４５１（２０１１年９月２日出願）に対する優先権を主張する。
配列表
[002] 本出願は、ＥＦＳ−ＷｅｂよりＡＳＣＩＩ形式で提出されて、その全体において参照により本明細書に組み込まれる「配列表」を含有する。２０１２年１月２６日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１１２３０４ＰＣＴ．ｔｘｔと指定されて、サイズは、１６３，０４９バイトである。
技術分野
[003] 本出願は、新規組成物と、過剰増殖性障害とその拡張、再発（recurrence）、再燃（relapse）、又は転移を予防、治療、又は改善することにおけるそれらの使用の方法に概して関する。広い側面において、本発明は、新生物障害の治療、診断、又は予防のためのプロテインキナーゼ７（ＰＴＫ７）モジュレーター（抗ＰＴＫ７抗体及び融合構築体が含まれる）の使用に関する。本発明の特に好ましい態様は、腫瘍始原細胞頻度の低下を含んでなる、悪性腫瘍の免疫療法的治療への、そのようなＰＴＫ７モジュレーターの使用を提供する。
[004] 幹細胞及び前駆細胞の分化と細胞増殖は、器官形成の間の組織成長とすべての生存生物の生涯の間でのほとんどの組織の細胞の置換及び修復とを支援するように協奏的に作用する、正常な進行プロセスである。分化と増殖の決定は、多くの場合、細胞運命の決定と組織構造とを維持するように均衡している数多くの因子及びシグナルによって制御される。正常な組織構造は、通常、細胞分裂と組織成熟化とを調節する微小環境の合図へ応答する細胞によって維持される。従って、細胞の増殖及び分化が正常に起こるのは、損傷を受けた細胞又は瀕死の細胞の置換のために、又は成長のために必要な場合だけである。残念ながら、例えば、様々なシグナル伝達性化学物質の過少又は過剰、改変した微小環境の存在、遺伝子の突然変異、又はこれらの何らかの組合せが含まれる無数の要因より、細胞の増殖及び／又は分化の破綻が生じ得る。正常な細胞の増殖及び／又は分化が妨害されるか又は何らかの様式で破綻すると、それは、癌のような過剰増殖性障害が含まれる様々な疾患又は障害をもたらす可能性がある。
[005] 癌への慣用の治療法には、化学療法、放射線療法、外科手術、免疫療法（例、生物学的応答調節物質、ワクチン、又は標的化治療剤）、又はこれらの組合せが含まれる。悲しむべきことに、このような慣用の治療法に対して、ずっと多くの癌が非応答性であるか又はほとんど応答せず、患者には治療選択肢がほとんど残っていない。例えば、ある患者では、ある種の癌が遺伝子変異を示して、選択された療法が一般には有効であるにも拘らず、それらを非応答性にする。さらに、癌の種類によっては、外科手術のようないくつかの利用可能な療法が有効な代替法でない場合もある。現行の標準的な治療薬剤に内在する限界が特に明らかになるのは、すでにいくつかの治療法を経験してその後で癌が再燃した患者への治療を試みるときである。そのような症例では、失敗した療法レジメンとそれにより生じる患者の悪化が難治性の腫瘍の原因となる場合があり、その腫瘍は、最終的に治癒不能であることが明らかとなる、相対的に進行性の疾患として多くの場合現れる。ここ数年にわたって癌の診断及び治療には多大な改善があったものの、既存の療法では再燃、腫瘍の再発及び転移を防ぐことができないために、多くの固形腫瘍で全生存率はほとんど変化していない。従って、より標的化されて強力な療法を開発することが依然として挑戦課題なのである。
[006] １つの有望な研究領域は、多くの癌の根底にあるように思われる腫瘍形成性の「種」細胞を狙撃する標的化治療剤の使用に関連する。そのために、ほとんどの固形組織は、その組織の大多数を含む分化した細胞種を産生する、成体の組織常在性の幹細胞集団を含有することが今日知られている。これらの組織に生じる腫瘍は、同様に、幹細胞からも発生する細胞の異種集団からなるが、それらの全体的な増殖性及び組織化は著しく異なる。腫瘍細胞の大多数には限られた増殖能力しかないことがますます認知されているが、癌細胞の少数集団（通常、癌幹細胞（cancer stem cell）又はＣＳＣとして知られる）は、広汎に自己再生する独占的な能力を有しており、それにより固有の腫瘍再始動能を可能にしている。より具体的には、この癌幹細胞仮説は、それぞれの腫瘍の内部に、無限の自己再生が可能であって、腫瘍前駆細胞とその後の最終分化腫瘍細胞への分化の結果としてその複製能力が進行的に制限される腫瘍細胞を産生することが可能である別個の細胞（即ち、ＣＳＣ）の亜集団が（ほぼ０．１〜１０％）存在することを提唱する。
[007] 近年、これらのＣＳＣ（腫瘍永続化細胞（tumor perpetuating cell）又はＴＰＣとしても知られる）が従来の化学療法剤又は放射線に対してより抵抗性であって、それにより標準的な臨床治療法の後にも存続して、後に難治性腫瘍、続発性腫瘍の増殖を促して転移を助長する可能性があることがより明白になっている。この点に関して言えば、癌幹細胞は、様々な新生物の転移及び浸潤ポテンシャルを促進する可能性があるとされてきた。さらに、ますます増える証拠は、器官形成及び／又は正常な組織常在型幹細胞の自己再生を調節する経路がＣＳＣでは調節解除又は改変されていて、自己再生する癌細胞の不断の拡張と腫瘍形成がもたらされることを示唆する。一般論としては、Al-Hajj et al., 2004, PMID: 15378087；及びDalerba et al., 2007, PMID: 17548814 を参照のこと（このそれぞれは、その全体において参照により本明細書に組み込まれる）。このように、従来の治療法だけでなくより最近の標的化治療法の有効性も、これらの多様な治療法に直面しても癌を永続化することが可能である抵抗性癌細胞の存在及び／又は出現によって制限されているようである。Huff et al., European Journal of Cancer 42: 1293-1297 (2006) 及び Zhou et al., Nature Reviews Drug Discovery 8: 806-823 (2009)（このそれぞれは、その全体において参照により本明細書に組み込まれる）。このような観察事実は、従来の腫瘍減量剤（debulking agent）では、固形腫瘍に罹患している場合の患者生存を実質的に高めることが常にできないことによって、そして腫瘍が増殖、再発、及び転移する方法についてのますます洗練された理解の進展を通して追認されている。従って、新生物障害を治療するための最新の戦略では、患者再燃をもたらす腫瘍の再発又は転移の可能性を減らすように、腫瘍永続化細胞を消失させる、枯渇する、沈静化する、又はその分化を促進することの重要性が認められてきた。
[008] そのような戦略を開発するための努力では、ヒトの原発性固形腫瘍標本を免疫不全マウスに排他的に移植して継代する、非従来型異種移植片（ＮＴＸ）モデルに関連する最近の研究が取り込まれている。数多くの癌において、そのような技術により、異種の腫瘍を産生してその増殖を無限に促進する独自の能力がある細胞の亜集団の存在が確かめられている。先に仮定されたように、ＮＴＸモデルでの研究では、同定された腫瘍細胞のＣＳＣ亜集団が化学療法や放射線のような腫瘍減量レジメン（debulking regimen）に対してより抵抗性であるらしいことが確認され、臨床応答率と全生存率の間の不一致を説明する可能性がある。さらに、ＣＳＣ研究におけるＮＴＸモデルの利用は、腫瘍の再発及び転移に重大な影響を及ぼすことによって患者生存率を改善するＣＳＣ標的化療法をもたらし得る医薬候補物質の医薬探索及び前臨床評価における根本的な変革の火付けになってきた。進展が見られた一方で、原発性及び／又は異種移植片腫瘍組織を取り扱うことに付随する固有の技術上の難題は、ＣＳＣの同一性及び分化能を特徴付けるための実験基盤の不足と相俟って、重大な挑戦課題を提起する。それで、癌幹細胞に選択的に標的指向して、過剰増殖性障害の治療、予防、及び／又は管理に使用し得る、診断、予防、又は治療用の化合物又は方法を開発することへの実質的なニーズが依然として存在するのである。
[009] 本発明は、上記及び他の目的のために、広義には、ＰＴＫ７関連障害（例、過剰増殖性障害又は新生物障害）の治療に使用し得る方法、化合物、組成物、及び製造品へ向けられる。そのために、本発明は、腫瘍細胞又は癌幹細胞に効果的に標的指向して、多種多様な悪性腫瘍に罹患している患者を治療するために使用し得る、新規プロテインチロシンキナーゼ７（又はＰＴＫ７）モジュレーターを提供する。本明細書においてより詳しく考察されるように、現在、数種のＰＴＫ７アイソフォームが知られていて、開示モジュレーターは、好ましくは、その１以上を含むか又はそれと関連する。さらに、ある態様において、開示されるＰＴＫ７モジュレーターは、ＰＴＫ７ポリペプチド又は遺伝子(又は、それらの断片)を認識する、それと競合する、それに作動する、それと拮抗する、それと相互作用する、結合する、又は会合して、１以上の生理学的経路に対するＰＴＫ７タンパク質の影響を調節する、調整する、改変させる、変化させる、又は修飾するどの分子も含んでよい。このように、広義において、本発明は、単離されたＰＴＫ７モジュレーターとその使用へ概して向けられる。好ましい態様において、本発明は、より具体的には、抗体（即ち、ＰＴＫ７の少なくとも１つのアイソフォームと免疫選好的に結合、反応、又は会合する抗体）を含んでなる単離ＰＴＫ７モジュレーターへ向けられる。さらに、下記に広汎に考察されるように、そのようなモジュレーターは、増殖性障害の予防、診断、又は治療に有用な医薬組成物を提供するために使用し得る。
[010] 本発明の選択態様において、ＰＴＫ７モジュレーターは、ＰＴＫ７ポリペプチド又はその断片を、単離型でも、他の部分との融合型又は会合型（例、Ｆｃ−ＰＴＫ７、ＰＥＧ−ＰＴＫ７、又は標的化部分と会合したＰＴＫ７）でも含んでよい。他の選択態様において、ＰＴＫ７モジュレーターは、ＰＴＫ７アンタゴニストを含んでよく、それは、本出願の目的のためには、ＰＴＫ７を認識する、それと競合する、相互作用する、結合する、又は会合して、腫瘍始原細胞が含まれる新生物細胞を中和する、消失させる、低下させる、増感させる、再プログラム化する、その増殖を阻害又は制御するどんな構築体又は化合物も意味すると理解される。好ましい態様において、本発明のＰＴＫ７モジュレーターは、新生物細胞を増やす、維持する、拡大する、増殖させる、又は他の方法でその生存、再発、再生、及び／又は転移を促進する腫瘍始原細胞の能力を沈静化する、中和する、低下させる、減少させる、除去する、緩和する、減衰させる、再プログラム化する、消失させる、又は他の方法で阻害することが意外にも見出された、抗ＰＴＫ７抗体又はその断片若しくは誘導体を含む。特に好ましい態様において、この抗体又は免疫反応性断片は、１以上の抗癌剤（例、細胞傷害剤）と会合しても、それへコンジュゲートしてもよい。
[011] 選択態様において、適合可能なＰＴＫ７モジュレーターは、軽鎖可変領域と重鎖可変領域を有する抗体を含んでよく、ここで前記軽鎖可変領域は、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、及び配列番号６０に示されるようなアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、そしてここで前記重鎖可変領域は、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、及び配列番号６１に示されるようなアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
[012] 当然ながら、本開示に照らして、当業者は、上述した重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のそれぞれに関連するＣＤＲを容易に同定して、それらＣＤＲを使用して、過度の実験をせずに、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はＣＤＲ移植抗体を工学処理するか又は作製することができよう。このように、選択態様において、本発明は、図面６Ａ又は図面６Ｂに示される可変領域配列由来の１以上のＣＤＲを含んでなる抗ＰＴＫ７抗体へ向けられる。好ましい態様において、このような抗体は、モノクローナル抗体を含み、そしてなおより好ましい態様において、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、又はヒト化抗体を含む。下記により詳しく考察するように、なお他の態様は、１以上の細胞傷害剤とコンジュゲート又は会合したそのような抗体を含む。
[013] 従って、他の態様において、本発明は、ｈＳＣ６．２３、ｈＳＣ６．２４、ｈＳＣ６．４１、及びｈＳＣ６．５８からなる群より選択されるヒト化ＰＴＫ７モジュレーターを含む。なお他の態様は、ヒト化抗体を含んでなるＰＴＫ７モジュレーターへ向けられ、ここで前記ヒト化抗体は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含み、ここで前記軽鎖可変領域は、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、及び配列番号６８に示されるようなアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、そしてここで前記重鎖可変領域は、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、及び配列番号６９に示されるようなアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
[014] 先に示したように、本発明の１つの側面は、癌幹細胞とＰＴＫ７ポリペプチドの予期せぬ関連を含む。このように、ある他の態様において、本発明は、被検者への投与時に腫瘍始原細胞の頻度を低下させるＰＴＫ７モジュレーターを含む。好ましくは、頻度の低下は、in vitro 又は in vivo の限界希釈分析を使用して決定される。特に好ましい態様において、そのような分析は、生きたヒト腫瘍細胞の免疫不全マウス中への移植を含んでなる in vivo 限界希釈分析を使用して実施してよい。あるいは、限界希釈分析は、生きたヒト腫瘍細胞の in vitro コロニー支持条件（colony supporting condition）中への限界希釈沈着（limiting dilution deposition）を含んでなる in vitro 限界希釈分析を使用して実施してよい。いずれの場合でも、頻度の低下の分析、計算、又は定量は、好ましくは、正確な数的処理を提供するポアソン分布統計の使用を含むであろう。そのような定量法が好ましい一方で、望まれる数値を提供するには、フローサイトメトリー又は免疫組織化学のような、他のさほど労働集約的ではない方法論も使用してよく、従って、それも本発明の範囲内にあるものと明白に考慮されると理解されよう。そのような場合、頻度の低下は、腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析又は免疫組織化学検出を使用して決定してよい。
[015] そのように、別の好ましい態様において、本発明は、治療有効量のＰＴＫ７モジュレーターをその必要な被検者へ投与することによって腫瘍始原細胞の頻度を低下させることを含んでなる、ＰＴＫ７関連障害を治療する方法を含む。好ましくは、ＰＴＫ７関連障害は、新生物障害を含む。ここでも、腫瘍始原細胞頻度の低下は、好ましくは、in vitro 又は in vivo の限界希釈分析を使用して決定されるであろう。
[016] この点に関して言えば、本発明は、少なくとも一部は、様々な新生物の病因に関与している腫瘍永続化細胞（即ち、癌幹細胞）とＰＴＫ７免疫原が関連するという発見に基づくものと認識されるであろう。より具体的には、本出願は、意外にも、様々な例示のＰＴＫ７モジュレーターの投与が腫瘍始原細胞による腫瘍形成性のシグナル伝達に媒介する、それを低下させる、阻害する、又は消失させる（即ち、腫瘍始原細胞の頻度を低下させる）ことができることを証明する。この低下したシグナル伝達は、腫瘍始原細胞の除去、中和、低下、消失、再プログラム化、又は沈静化によっても、又は腫瘍細胞形態を変化させること（例、分化誘導、ニッチ破壊）によっても、腫瘍形成性、腫瘍の維持、拡張、及び／又は転移及び再発を阻害することによるＰＴＫ７関連障害のより有効な治療を次々に可能にする。
[017] 上述した癌幹細胞との関連以外に、ＰＴＫ７アイソフォームには、血管新生、内皮細胞の遊走、及び発癌に結び付けられてきた特定の発生シグナルカスケード（即ち、Ｗｎｔシグナル伝達経路）に関与し得るという証拠がある。本明細書に記載の新規ＰＴＫ７モジュレーターを使用してそのような細胞相互作用に介入すると、１より多い機序（即ち、腫瘍始原細胞の低下と発癌経路シグナル伝達の破綻）によって相加又は相乗効果をもたらして、障害を改善又は治療する可能性がある。なお他の好ましい態様は、細胞表面ＰＴＫ７の細胞内在化を利用して、モジュレーター媒介性の抗癌剤を送達する場合がある。この点に関して言えば、本発明は、どの特別な作用機序にも制限されず、むしろＰＴＫ７関連障害（様々な新生物が含まれる）を治療するための開示モジュレーターの広汎な使用が含まれると理解されよう。
[018] このように、本発明の他の面は、腫瘍始原細胞を沈静化する一方で同時に発癌生存経路を潜在的に妨害する、開示モジュレーターの能力を利用する。このような多重活性ＰＴＫ７モジュレーター（例、ＰＴＫ７アンタゴニスト）は、標準治療の抗癌剤又は腫瘍減量剤と組み合わせて使用されるときに特に有効であることが判明するかもしれない。従って、本発明の好ましい態様は、初期治療に続く維持療法の間の抗転移剤として開示モジュレーターを使用することを含む。加えて、２以上のＰＴＫ７アンタゴニスト（例、ＰＴＫ７上の２つの別々のエピトープへ特異的に結合する抗体）を、本教示に従って組み合わせて使用してよい。さらに、下記にやや詳しく考察するように、本発明のＰＴＫ７モジュレーターは、コンジュゲート状態でも非コンジュゲート状態でも使用してよくて、多様な化学品又は生物学的抗癌剤との組合せにおいて増感剤として使用してもよい。
[019] 従って、本発明の別の好ましい態様は、ＰＴＫ７モジュレーターを被検者へ投与する工程を含んでなる、抗癌剤での治療のために前記被検者において腫瘍を増感させる方法を含む。他の態様は、ＰＴＫ７モジュレーターをその必要な被検者へ投与する工程を含んでなる、治療後の転移を低下させる方法を含む。本発明の特に好ましい側面において、ＰＴＫ７モジュレーターは、in vitro 又は in vivo の限界希釈分析を使用して決定されるように、腫瘍始原細胞頻度の低下を特異的にもたらす。
[020] 本発明のより一般的に好ましい態様は、ＰＴＫ７関連障害を治療することの必要な被検者へＰＴＫ７モジュレーターを投与する工程を含んでなる、前記被検者においてそれを治療する方法を含む。特に好ましい態様において、ＰＴＫ７モジュレーターは、抗癌剤と会合（例えば、コンジュゲート）している。なお他の態様において、ＰＴＫ７モジュレーターは、上記細胞の表面の上又は付近でのＰＴＫ７との会合又は結合に続いて内在化する。さらに、本発明の有益な側面（シグナル伝達経路の破綻と付帯的な利益が含まれる）は、被検者の腫瘍組織が正常隣接組織と比較して上昇レベルのＰＴＫ７を明示しても、低下又は抑圧レベルのＰＴＫ７を明示しても、達成され得る。
[021] なお別の側面において、本発明は、少なくとも１つの内在化ＰＴＫ７モジュレーターの治療有効量を投与する工程を含んでなる、新生物障害に罹患している被検者を治療する方法を含む。好ましい態様は、内在化抗体モジュレーターの投与を含み、ここでは、他の選択抗体において、内在化抗体モジュレーターは、細胞傷害剤とコンジュゲートしているか又は会合している。
[022] 他の態様は、少なくとも１つの枯渇性ＰＴＫ７モジュレーターの治療有効量を投与する工程を含んでなる、ＰＴＫ７関連障害に罹患している被検者を治療する方法へ向けられる。
[023] なお別の態様において、本発明は、腫瘍量の少なくとも一部を取り除くように設計された初期手順（例、化学療法、放射線、又は外科手術）に続く時間帯にわたって、開示されるエフェクター又はモジュレーターが投与される、維持療法の方法を提供する。このような療法レジメンは、数週の期間、数ヶ月の期間、又は数年の期間にもわたって投与してよく、ここでＰＴＫ７モジュレーターは、転移及び／又は腫瘍再発を阻むように予防的に作用し得る。なお他の態様において、開示モジュレーターは、転移、腫瘍の持続又は再発を防ぐか又は遅らせるために、既知の腫瘍減量レジメンと連携して投与してよい。
[024] 本発明のＰＴＫ７モジュレーターは、ＰＴＫ７の単一アイソフォーム又はこのタンパク質の選択される少数のアイソフォーム（即ち、スプライス変異体によって提供される）と反応するように製造又は選択してよく、又は逆に、いくつか又はすべてのＰＴＫ７アイソフォーム（現在、５種が同定されている）と反応又は会合する汎ＰＴＫ７モジュレーターを含んでよいとさらに理解される。より具体的には、本明細書に開示されるように、抗体のような好ましいモジュレーターが単一のスプライス変異体によって明示されるドメインと（例えば、特定のエクソン連結部で）、又は多数又はすべてのＰＴＫ７アイソフォーム全体で保存されているＩｇドメインと反応するように、それらを産生して選択することができる。このことは、ＴＩＣではあるアイソフォームが選好的に発現される場合があるので、腫瘍形成細胞頻度の選択的な低下、及び／又は癌幹細胞集団の枯渇をもたらすための療法上の標的としてそれが役立つ可能性があるという点で、本発明に関連して重要である。
[025] 従って、ある選択態様において、本発明は、汎ＰＴＫ７モジュレーターを含む。他の選択態様において、本発明は、１以上のスプライス変異体又はアイソフォームと免疫特異的に会合するＰＴＫ７モジュレーターを含む。好ましくは、このスプライス変異体は、アイソフォームａ、アイソフォームｂ、アイソフォームｃ、及びアイソフォームｄからなる群より選択され得る。なお他の態様において、本発明は、治療有効量の汎ＰＴＫ７モジュレーターを投与することを含んでなる、その必要な被検者を治療する方法を含む。なお他の態様は、１以上のアイソフォームと免疫特異的に会合するＰＴＫ７モジュレーターの治療有効量を投与することを含んでなる、その必要な被検者を治療する方法を含む。
[026] 上記に考察した療法上の使用にとどまらず、本発明のモジュレーターは、ＰＴＫ７関連障害、及び、特に過剰増殖性障害を診断するために使用し得ることも理解されよう。いくつかの態様において、該モジュレーターは、被検者へ投与されて、in vivo で検出又はモニターされ得る。当業者は、このようなモジュレーターを、下記に開示するようなマーカー又はレポーターで標識するか又はそれと会合させて、いくつかの標準技術（例、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャン、ＰＥＴスキャン、等）のいずれも使用して検出し得ることを理解されよう。
[027] このように、いくつかの態様において、本発明は、ＰＴＫ７モジュレーターを投与する工程を含んでなる、ＰＴＫ７関連障害を in vivo で診断、検出、又はモニターすることの必要な被検者においてそれをする方法を含む。
[028] 他の例において、該モジュレーターは、当該技術分野で認められた手順を使用する in vitro 診断の場で使用してよい。このように、好ましい態様は、過剰増殖性障害を診断することの必要な被検者においてそれを診断する方法を含み、該方法は：
ａ．前記被検者より組織試料を入手する工程；
ｂ．該組織試料を少なくとも１つのＰＴＫ７モジュレーターと接触させる工程；及び
ｃ．該試料と会合したＰＴＫ７モジュレーターを検出又は定量する工程を含んでなる。
[029] このような方法は、本出願と併せて容易に理解し得て、自動プレートリーダー、専用レポーター系、等のような一般に利用可能な市販技術を使用して、容易に実施し得る。選択態様において、ＰＴＫ７モジュレーターは、試料中に存在する腫瘍永続化細胞と会合する。他の好ましい態様において、検出又は定量の工程は、腫瘍始原細胞頻度の低下とその検出を含む。さらに、限界希釈分析は、上記においてすでに述べたように実施してよくて、好ましくは、頻度の低下に関する正確な数的処理をもたらすために、ポアソン分布統計の使用を利用する。
[030] 同じように、本発明はまた、癌のようなＰＴＫ７関連障害の診断及びモニタリングに有用であるキットを提供する。このために、本発明は、好ましくは、ＰＴＫ７モジュレーターを含んでなる容器（receptacle）とＰＴＫ７関連障害を治療又は診断するのに前記ＰＴＫ７モジュレーターを使用するための指示書（instructional materials）とを含んでなる、ＰＴＫ７関連障害を診断するか又は治療するのに有用な製造品を提供する。
[031] 本発明の他の好ましい態様はまた、フローサイトメトリー分析、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、又はレーザー媒介分画法のような方法を介して腫瘍始原細胞の集団又は亜集団を同定、単離、分画、又は濃縮するのに有用な道具としての開示モジュレーターの特性を利用する。
[032] このように、本発明の別の好ましい態様は、腫瘍始原細胞をＰＴＫ７モジュレーターと接触させる工程を含んでなる、前記腫瘍始原細胞の集団を同定、単離、分画、又は濃縮する方法へ向けられる。
[033] 上述のことは、概要であるので、必要上、簡略化、一般化、及び詳細の省略を含有する；従って、当業者は、この概要が説明にすぎず、限定的であることを決して企図しないと理解されよう。本明細書に記載する方法、組成物、及び／又はデバイスの他の側面、特徴、及び利点、及び／又は他の主題は、本明細書で説明する教示において明らかになろう。この概要を提供するのは、選択される概念を単純化された形式で紹介するためであって、それについては「発明を実施するための形態」において以下でさらに記載する。この概要は、特許請求される主題の重要な特徴又は本質的な特徴を特定することを企図するものでも、特許請求される主題の範囲を決定するときの一助として使用することを企図するものでもない。
[034] 図面１Ａ〜Ｃは、それぞれ、ヒトＰＴＫ７をコードする核酸配列（配列番号１）、例示のヒトＰＴＫ７変異体のアミノ酸配列（配列番号２）を図示して、図面１Ｃは、４種の代表的なＰＴＫ７のアイソフォームの並置され且つ記号表記された配列（配列番号３〜６）を図示し、ここで図面１Ａの下線部分は、ＰＴＫ７−１オープンリーディングフレームを表し、図面１Ｂの下線部分は、本明細書に定義されるようなＰＴＫ７の細胞外ドメインを示して、図面１Ｃは、ＮＣＢＩでの遺伝子データベースに報告されるようなヒトＰＴＫ７タンパク質の４種の知られた例示アイソフォームのタンパク質並置を示し（タンパク質アクセッション：アイソフォームａ＝ＮＰ＿００２８１２、アイソフォームｂ＝ＮＰ＿６９０６１９；アイソフォームｃ＝ＮＰ＿６９０６２０；アイソフォームｄ＝ＮＰ＿６９０６２１）、ここで図面１Ｃは、モチーフペプチド、「ＧｘＧｘＦＧｘＶ」、「ＨＲＤＬｘｘｘＮ」、及び「ＳＤＶＷＳｘＧ」をそれぞれ配列番号１１、１２、及び１３として開示する。 [034] 図面１Ａ〜Ｃは、それぞれ、ヒトＰＴＫ７をコードする核酸配列（配列番号１）、例示のヒトＰＴＫ７変異体のアミノ酸配列（配列番号２）を図示して、図面１Ｃは、４種の代表的なＰＴＫ７のアイソフォームの並置され且つ記号表記された配列（配列番号３〜６）を図示し、ここで図面１Ａの下線部分は、ＰＴＫ７−１オープンリーディングフレームを表し、図面１Ｂの下線部分は、本明細書に定義されるようなＰＴＫ７の細胞外ドメインを示して、図面１Ｃは、ＮＣＢＩでの遺伝子データベースに報告されるようなヒトＰＴＫ７タンパク質の４種の知られた例示アイソフォームのタンパク質並置を示し（タンパク質アクセッション：アイソフォームａ＝ＮＰ＿００２８１２、アイソフォームｂ＝ＮＰ＿６９０６１９；アイソフォームｃ＝ＮＰ＿６９０６２０；アイソフォームｄ＝ＮＰ＿６９０６２１）、ここで図面１Ｃは、モチーフペプチド、「ＧｘＧｘＦＧｘＶ」、「ＨＲＤＬｘｘｘＮ」、及び「ＳＤＶＷＳｘＧ」をそれぞれ配列番号１１、１２、及び１３として開示する。 [034] 図面１Ａ〜Ｃは、それぞれ、ヒトＰＴＫ７をコードする核酸配列（配列番号１）、例示のヒトＰＴＫ７変異体のアミノ酸配列（配列番号２）を図示して、図面１Ｃは、４種の代表的なＰＴＫ７のアイソフォームの並置され且つ記号表記された配列（配列番号３〜６）を図示し、ここで図面１Ａの下線部分は、ＰＴＫ７−１オープンリーディングフレームを表し、図面１Ｂの下線部分は、本明細書に定義されるようなＰＴＫ７の細胞外ドメインを示して、図面１Ｃは、ＮＣＢＩでの遺伝子データベースに報告されるようなヒトＰＴＫ７タンパク質の４種の知られた例示アイソフォームのタンパク質並置を示し（タンパク質アクセッション：アイソフォームａ＝ＮＰ＿００２８１２、アイソフォームｂ＝ＮＰ＿６９０６１９；アイソフォームｃ＝ＮＰ＿６９０６２０；アイソフォームｄ＝ＮＰ＿６９０６２１）、ここで図面１Ｃは、モチーフペプチド、「ＧｘＧｘＦＧｘＶ」、「ＨＲＤＬｘｘｘＮ」、及び「ＳＤＶＷＳｘＧ」をそれぞれ配列番号１１、１２、及び１３として開示する。 [034] 図面１Ａ〜Ｃは、それぞれ、ヒトＰＴＫ７をコードする核酸配列（配列番号１）、例示のヒトＰＴＫ７変異体のアミノ酸配列（配列番号２）を図示して、図面１Ｃは、４種の代表的なＰＴＫ７のアイソフォームの並置され且つ記号表記された配列（配列番号３〜６）を図示し、ここで図面１Ａの下線部分は、ＰＴＫ７−１オープンリーディングフレームを表し、図面１Ｂの下線部分は、本明細書に定義されるようなＰＴＫ７の細胞外ドメインを示して、図面１Ｃは、ＮＣＢＩでの遺伝子データベースに報告されるようなヒトＰＴＫ７タンパク質の４種の知られた例示アイソフォームのタンパク質並置を示し（タンパク質アクセッション：アイソフォームａ＝ＮＰ＿００２８１２、アイソフォームｂ＝ＮＰ＿６９０６１９；アイソフォームｃ＝ＮＰ＿６９０６２０；アイソフォームｄ＝ＮＰ＿６９０６２１）、ここで図面１Ｃは、モチーフペプチド、「ＧｘＧｘＦＧｘＶ」、「ＨＲＤＬｘｘｘＮ」、及び「ＳＤＶＷＳｘＧ」をそれぞれ配列番号１１、１２、及び１３として開示する。 [034] 図面１Ａ〜Ｃは、それぞれ、ヒトＰＴＫ７をコードする核酸配列（配列番号１）、例示のヒトＰＴＫ７変異体のアミノ酸配列（配列番号２）を図示して、図面１Ｃは、４種の代表的なＰＴＫ７のアイソフォームの並置され且つ記号表記された配列（配列番号３〜６）を図示し、ここで図面１Ａの下線部分は、ＰＴＫ７−１オープンリーディングフレームを表し、図面１Ｂの下線部分は、本明細書に定義されるようなＰＴＫ７の細胞外ドメインを示して、図面１Ｃは、ＮＣＢＩでの遺伝子データベースに報告されるようなヒトＰＴＫ７タンパク質の４種の知られた例示アイソフォームのタンパク質並置を示し（タンパク質アクセッション：アイソフォームａ＝ＮＰ＿００２８１２、アイソフォームｂ＝ＮＰ＿６９０６１９；アイソフォームｃ＝ＮＰ＿６９０６２０；アイソフォームｄ＝ＮＰ＿６９０６２１）、ここで図面１Ｃは、モチーフペプチド、「ＧｘＧｘＦＧｘＶ」、「ＨＲＤＬｘｘｘＮ」、及び「ＳＤＶＷＳｘＧ」をそれぞれ配列番号１１、１２、及び１３として開示する。 [035] 図面２は、結直腸腫瘍標本全体の亜集合より入手した、高度に濃縮された腫瘍始原細胞（ＴＰｒｏｇ）、腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ）、及び非腫瘍形成細胞（ＮＴＧ）の集団の全トランスクリプトーム（transcriptome）配列決定法を使用して測定した、未処置（−）及びイリノテカン処置（＋）マウス中のＰＴＫ７の遺伝子発現レベルを図示するグラフ表示である。 [036] 図面３は、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して測定した、３種の異なる非従来型異種移植片（ＮＴＸ）の結直腸又は膵臓腫瘍細胞株の１つを担うマウスより入手して非腫瘍形成（ＮＴＧ）濃縮細胞集団に対して正規化した、高度に濃縮された腫瘍始原細胞（ＴＰｒｏｇ）集団と腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ）集団中のヒトＰＴＫ７の相対的な遺伝子発現レベルを示すグラフ表示である。 [037] 図面４Ａ及び４Ｂは、ステージＩ〜ＩＶの疾患の患者由来の全結直腸腫瘍標本においてＲＴ−ＰＣＲを使用して測定したヒトＰＴＫ７の相対的な遺伝子発現レベルを、正常な結腸及び直腸組織中の発現の平均に対して正規化して（図面４Ａ）、又は正常隣接組織と比べて（図面４Ｂ）示すグラフ表示である。 [038] 図面５Ａ及び５Ｂは、１８種の異なる固形腫瘍型の１つを担う患者由来の全腫瘍標本（灰色のドット）又は比較したＮＡＴ（白色のドット）においてＲＴ−ＰＣＲによって測定した、ヒトＰＴＫ７遺伝子の相対的又は絶対的な遺伝子発現レベルをそれぞれ示すグラフ表示である。 [039] 図面６Ａ及び６Ｂは、本明細書の「実施例」に記載のように単離、クローン化、及び工学処理したいくつかのマウス及びヒト化例示ＰＴＫ７モジュレーターの重鎖及び軽鎖の可変領域の連続アミノ酸配列を表形式で提供する。 [039] 図面６Ａ及び６Ｂは、本明細書の「実施例」に記載のように単離、クローン化、及び工学処理したいくつかのマウス及びヒト化例示ＰＴＫ７モジュレーターの重鎖及び軽鎖の可変領域の連続アミノ酸配列を表形式で提供する。 [040] 図面７Ａ〜７Ｅは、例示ＰＴＫ７モジュレーターの物理化学特性をグラフ及び表の表示で提供し、ここで図面７Ａは、マウス及びヒトのＰＴＫ７に関するあるモジュレーターの結合特性を図示し、図面７Ｂは、選択モジュレーターの親和性、ビニング、及び交差反応性のデータを提供し、図面７Ｃ及び７Ｄは、選択したマウスモジュレーターとそのヒト化対照物の比較結合特性を示し、そして図面７Ｅは、ヒトＰＴＫ７とそのマウス相同分子種に関する選択モジュレーターの結合親和性を提供する。 [040] 図面７Ａ〜７Ｅは、例示ＰＴＫ７モジュレーターの物理化学特性をグラフ及び表の表示で提供し、ここで図面７Ａは、マウス及びヒトのＰＴＫ７に関するあるモジュレーターの結合特性を図示し、図面７Ｂは、選択モジュレーターの親和性、ビニング、及び交差反応性のデータを提供し、図面７Ｃ及び７Ｄは、選択したマウスモジュレーターとそのヒト化対照物の比較結合特性を示し、そして図面７Ｅは、ヒトＰＴＫ７とそのマウス相同分子種に関する選択モジュレーターの結合親和性を提供する。 [040] 図面７Ａ〜７Ｅは、例示ＰＴＫ７モジュレーターの物理化学特性をグラフ及び表の表示で提供し、ここで図面７Ａは、マウス及びヒトのＰＴＫ７に関するあるモジュレーターの結合特性を図示し、図面７Ｂは、選択モジュレーターの親和性、ビニング、及び交差反応性のデータを提供し、図面７Ｃ及び７Ｄは、選択したマウスモジュレーターとそのヒト化対照物の比較結合特性を示し、そして図面７Ｅは、ヒトＰＴＫ７とそのマウス相同分子種に関する選択モジュレーターの結合親和性を提供する。 [041] 図面８Ａ〜８Ｇは、本発明による様々なＰＴＫ７構築体を図示し、ここで図面８Ａ〜８Ｆは、Ｉｇ−ＰＴＫ７−ＥＣＤ構築体の形態での６種のＰＴＫ７モジュレーター変異体のアミノ酸配列を提供し、ここでは、各構築体の細胞外ドメイン部分が変化していて、図面８Ｇは、ＰＴＫ７の細胞外部分の７個のＩｇドメインを、いくつかのＰＴＫ７モジュレーターのＥＬＩＳＡ由来結合領域（括弧によって示される）とともに概略的に図解する。 [041] 図面８Ａ〜８Ｇは、本発明による様々なＰＴＫ７構築体を図示し、ここで図面８Ａ〜８Ｆは、Ｉｇ−ＰＴＫ７−ＥＣＤ構築体の形態での６種のＰＴＫ７モジュレーター変異体のアミノ酸配列を提供し、ここでは、各構築体の細胞外ドメイン部分が変化していて、図面８Ｇは、ＰＴＫ７の細胞外部分の７個のＩｇドメインを、いくつかのＰＴＫ７モジュレーターのＥＬＩＳＡ由来結合領域（括弧によって示される）とともに概略的に図解する。 [041] 図面８Ａ〜８Ｇは、本発明による様々なＰＴＫ７構築体を図示し、ここで図面８Ａ〜８Ｆは、Ｉｇ−ＰＴＫ７−ＥＣＤ構築体の形態での６種のＰＴＫ７モジュレーター変異体のアミノ酸配列を提供し、ここでは、各構築体の細胞外ドメイン部分が変化していて、図面８Ｇは、ＰＴＫ７の細胞外部分の７個のＩｇドメインを、いくつかのＰＴＫ７モジュレーターのＥＬＩＳＡ由来結合領域（括弧によって示される）とともに概略的に図解する。 [042] 図面９Ａ〜９Ｅは、異なる腫瘍溶解液とＮＴＸ試料におけるＰＴＫ７タンパク質の発現レベルを例証し、ここで図面９Ａ〜９Ｄは、様々な腫瘍及び病期についての腫瘍溶解液レベルを正常隣接組織対照と比較して図示して、図面９Ｅは、ヒトの非従来型異種移植片の選択モジュレーターでの染色を例証するヒストグラムを提供し、ここでは対照染色（灰色）を非腫瘍形成細胞集団（破線）と推定癌幹細胞集団（実線）での染色に比較した。 [042] 図面９Ａ〜９Ｅは、異なる腫瘍溶解液とＮＴＸ試料におけるＰＴＫ７タンパク質の発現レベルを例証し、ここで図面９Ａ〜９Ｄは、様々な腫瘍及び病期についての腫瘍溶解液レベルを正常隣接組織対照と比較して図示して、図面９Ｅは、ヒトの非従来型異種移植片の選択モジュレーターでの染色を例証するヒストグラムを提供し、ここでは対照染色（灰色）を非腫瘍形成細胞集団（破線）と推定癌幹細胞集団（実線）での染色に比較した。 [042] 図面９Ａ〜９Ｅは、異なる腫瘍溶解液とＮＴＸ試料におけるＰＴＫ７タンパク質の発現レベルを例証し、ここで図面９Ａ〜９Ｄは、様々な腫瘍及び病期についての腫瘍溶解液レベルを正常隣接組織対照と比較して図示して、図面９Ｅは、ヒトの非従来型異種移植片の選択モジュレーターでの染色を例証するヒストグラムを提供し、ここでは対照染色（灰色）を非腫瘍形成細胞集団（破線）と推定癌幹細胞集団（実線）での染色に比較した。 [043] 図面１０Ａ〜１０Ｅは、本発明の選択モジュレーターが細胞表面上でのＰＴＫ７との結合時に内在化する能力を例証し、ここで図面１０Ｃは、例示モジュレーター（即ち、図面１０Ｃ中でＨ１０と呼称されるＳＣ６．１０．２）に関連した蛍光シフトを示して、図面１０Ａ及び１０Ｂは、対照を表し、図面１０Ｄは、ハイブリドーマ上清由来の例示モジュレーターについて、精製対照（Ｈ２．３５、Ｈ１０．２、及びＨ２５．１とそれぞれ呼称される、ＳＣ６．２．３５、ＳＣ６．１０．２、及びＳＣ６．２５．１）と比較して内在化をスクリーニングし得ることを証明して、図面１０Ｅは、様々なモジュレーターの内在化の程度を例証し（各データ点は、別々のモジュレーターを表す）、ここで破線は、バックグラウンドカットオフを示して、ｙ軸には、結合イベントに応答した細胞によって内在化されるＰＴＫ７分子の数をプロットする。 [043] 図面１０Ａ〜１０Ｅは、本発明の選択モジュレーターが細胞表面上でのＰＴＫ７との結合時に内在化する能力を例証し、ここで図面１０Ｃは、例示モジュレーター（即ち、図面１０Ｃ中でＨ１０と呼称されるＳＣ６．１０．２）に関連した蛍光シフトを示して、図面１０Ａ及び１０Ｂは、対照を表し、図面１０Ｄは、ハイブリドーマ上清由来の例示モジュレーターについて、精製対照（Ｈ２．３５、Ｈ１０．２、及びＨ２５．１とそれぞれ呼称される、ＳＣ６．２．３５、ＳＣ６．１０．２、及びＳＣ６．２５．１）と比較して内在化をスクリーニングし得ることを証明して、図面１０Ｅは、様々なモジュレーターの内在化の程度を例証し（各データ点は、別々のモジュレーターを表す）、ここで破線は、バックグラウンドカットオフを示して、ｙ軸には、結合イベントに応答した細胞によって内在化されるＰＴＫ７分子の数をプロットする。 [043] 図面１０Ａ〜１０Ｅは、本発明の選択モジュレーターが細胞表面上でのＰＴＫ７との結合時に内在化する能力を例証し、ここで図面１０Ｃは、例示モジュレーター（即ち、図面１０Ｃ中でＨ１０と呼称されるＳＣ６．１０．２）に関連した蛍光シフトを示して、図面１０Ａ及び１０Ｂは、対照を表し、図面１０Ｄは、ハイブリドーマ上清由来の例示モジュレーターについて、精製対照（Ｈ２．３５、Ｈ１０．２、及びＨ２５．１とそれぞれ呼称される、ＳＣ６．２．３５、ＳＣ６．１０．２、及びＳＣ６．２５．１）と比較して内在化をスクリーニングし得ることを証明して、図面１０Ｅは、様々なモジュレーターの内在化の程度を例証し（各データ点は、別々のモジュレーターを表す）、ここで破線は、バックグラウンドカットオフを示して、ｙ軸には、結合イベントに応答した細胞によって内在化されるＰＴＫ７分子の数をプロットする。 [044] 図面１１Ａ〜１１Ｄは、細胞傷害剤の送達に免疫特異的に媒介して細胞殺傷を促進する、開示モジュレーターの能力を例証し、ここで図面１１Ａは、ＰＴＫ７を発現している細胞へ細胞傷害性ペイロードを指向させる標的化部分としての３種の例示モジュレーター（Ｈ２．３５、Ｈ１０．２、及びＨ２５．３とそれぞれ呼称される、ＳＣ６．２．３５、ＳＣ６．１０．２、及びＳＣ６．２５．３）の使用を図示して、ここで図面１１Ｂ〜１１Ｄは、３種の別個の細胞株を消失させる、４種の追加の例示モジュレーターの能力を例証する（ここでは、それぞれの図面において、下方傾斜曲線により、内在化毒素を介した細胞殺傷が示唆される）。 [044] 図面１１Ａ〜１１Ｄは、細胞傷害剤の送達に免疫特異的に媒介して細胞殺傷を促進する、開示モジュレーターの能力を例証し、ここで図面１１Ａは、ＰＴＫ７を発現している細胞へ細胞傷害性ペイロードを指向させる標的化部分としての３種の例示モジュレーター（Ｈ２．３５、Ｈ１０．２、及びＨ２５．３とそれぞれ呼称される、ＳＣ６．２．３５、ＳＣ６．１０．２、及びＳＣ６．２５．３）の使用を図示して、ここで図面１１Ｂ〜１１Ｄは、３種の別個の細胞株を消失させる、４種の追加の例示モジュレーターの能力を例証する（ここでは、それぞれの図面において、下方傾斜曲線により、内在化毒素を介した細胞殺傷が示唆される）。 [045] 図面１２は、細胞傷害剤の送達に免疫特異的に媒介して、それにより様々なＮＴＸ腫瘍細胞株における腫瘍細胞生存度を低下させる、３種の例示ＰＴＫ７モジュレーターの能力を証拠付ける。 [046] 図面１３Ａ〜１３Ｃは、腫瘍永続化細胞の頻度を低下させて、その腫瘍形成ポテンシャルを阻害する、開示モジュレーターの能力を示唆して、ここで図面１３Ａ及び１３Ｂは、細胞傷害剤のモジュレーター（即ち、ＳＣ６．Ｈ２と表示されるＳＣ６．２．３５）媒介送達が２種の別個のＮＴＸ乳癌細胞集団の生存度に影響することを示唆して、図面１３Ｃは、処理した細胞株の腫瘍形成性が、免疫不全マウスへの移植時に低下することを図示する。 [047] 図面１４は、細胞傷害剤のＰＴＫ７発現細胞への免疫特異的な送達及び内在化に効果的に媒介する、本発明の例示のヒト化ＰＴＫ７モジュレーターの能力を証明する。
Ｉ．序論
[048] 本発明は、多くの異なる形態で具現化され得るが、本明細書に開示するのは、本発明の諸原理を具体化する、本発明の例示の具体的態様である。例証される具体的態様に本発明が限定されないことが強調されるべきである。さらに、本明細書に使用するどのセクション見出しも、編成上の目的のみのためであって、記載される主題を限定するものと解釈してはならない。
[049] 先に述べたように、驚くべきことに、ＰＴＫ７（様々なアイソフォームが含まれる）の発現が新生物増殖と過剰増殖性障害に関連していること、そしてそのようなリガンドが関連疾患の治療に利用し得る有用な腫瘍マーカーを提供することが見出された。より具体的には、本明細書に開示するようなＰＴＫ７モジュレーターが、有利にも、その必要な被検者における新生物障害の診断、セラグノーシス（theragnosis）、治療、又は予防に使用し得ることが発見された。従って、本発明の好ましい態様について、特に癌幹細胞と開示モジュレーターとのその相互作用の文脈で、以下に広汎に考察するが、当業者は、本発明の範囲がそのような例示態様によって限定されないことを理解されよう。むしろ、本発明と付帯の特許請求項は、どの特別な作用機序にも、特異的に標的化される腫瘍成分にも拘ることなく、ＰＴＫ７モジュレーターと、新生物障害又は過剰増殖性障害が含まれる、多様なＰＴＫ７関連障害又はＰＴＫ７媒介障害の診断、セラグノーシス、治療、又は予防におけるそれらの使用へ概括的かつ明白に向けられる。
[050] さらに、様々な先行技術の開示とは対照的に、本発明は、一般的なプロテインチロシンキナーゼモジュレーターではなく、ＰＴＫ７の様々なアイソフォームの免疫特異的モジュレーターへ主に向けられる。即ち、プロテインチロシンキナーゼ受容体の群が数種の障害との関連が広く示唆されて、概して治療的介入の標的とされてきたのに対し、ＰＴＫ７特異的モジュレーターはこれまでさほど注意を惹いてこなかった。これは、一部は、この群の特別な成員のどの特異的な拮抗作用もキナーゼの余剰性により代償される可能性があるので、全般的なＰＴＫ活性への干渉（特に、保存されたキナーゼドメインと相互作用する低分子での干渉）のほうが治療上の視点からはより有効であるという信念の結果であろう。さらに、ＰＴＫ７は、治療標的としてのその利用を落胆させた可能性がある、不活性キナーゼドメイン（又は偽キナーゼドメイン）を含むと報告されてきた。
[051] 逆に、本発明は、ＰＴＫ７の１以上のアイソフォームと選好的に反応して治療上の利益を提供する、免疫特異的モジュレーターの使用を含む。上記に少し考察したように、ある態様では、単一のＰＴＫ７アイソフォームと会合するように本発明のモジュレーターを産生及び選択してよく、一方、他の態様では、選択したモジュレーターがＰＴＫ７の１より多いアイソフォーム又はすべての認知されたアイソフォームと反応してよい。この後者の態様において、本発明は、１より多いＰＴＫ７アイソフォームと会合又は反応して、それによって１種より多いＰＴＫ７媒介経路の静止を可能にし得る予期せぬ相加又は相乗効果を提供するモジュレーターを含み得る。
[052] より一般的には、本出願において証明されるように、開示される免疫特異的ＰＴＫ７モジュレーターは、効果的に、腫瘍形成細胞に標的指向して、それを消失させるか又は他の方法で無能力にして、ＰＴＫ７関連障害（例、新生物）を治療するために使用することができる。本明細書に使用するように、ＰＴＫ７関連障害は、この疾患又は障害の経過又は病因の間のＰＴＫ７発現の表現型の異常によって注目、診断、又は確定されるあらゆる障害又は疾患（増殖性障害が含まれる）を意味するとみなされよう。この点に関して言えば、表現型の異常は、例えば、ＰＴＫ７発現レベルの上昇又は下降、ある定義可能な細胞集団上での異常なＰＴＫ７発現、又は細胞の生命環の不適切な相又は段階での異常なＰＴＫ７発現を含み得る。
[053] 直前に考察した一般的な関連とは別に、本発明者は、選択した腫瘍始原細胞（ＴＩＣ）とＰＴＫ７の間のこれまで知られていなかった表現型的な関連をさらに発見した。この点に関して言えば、選択したＴＩＣでは、正常組織及び非腫瘍形成細胞（ＮＴＧ）（一緒に固形腫瘍のほとんどを含む）と比べるときに、上昇レベルのＰＴＫ７が発現されることが見出された。このように、ＰＴＫ７アイソフォームは、腫瘍関連マーカー（又は抗原又は免疫原）を含んで、細胞表面上又は腫瘍微小環境中のこのタンパク質の改変レベルの故に、ＴＩＣと関連新生物との検出及び抑制に有効な薬剤を提供することが見出された。より具体的には、ＰＴＫ７モジュレーターは、このタンパク質と会合、結合、又は反応する免疫反応性のアンタゴニスト及び抗体を含めて、腫瘍始原細胞の頻度を有効に低下させて、それ故に、腫瘍始原細胞を消失させ、枯渇し、無能化し、低下させ、その分化を促進し、あるいは他の方法で、これらの腫瘍始原細胞の患者の中での潜伏能力、及び／又は腫瘍の増殖、転移、又は再発を促すことを続ける能力を排除するか又は制限するのに有用であることがさらに発見された。下記により詳しく考察するように、ＴＩＣ腫瘍細胞の亜集団は、腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ）と高増殖性腫瘍始原細胞（ＴＰｒｏｇ）の両方からなる。
[054] 上記の発見に鑑みて、当業者は、さらに本発明がＰＴＫ７モジュレーターと腫瘍始原細胞の頻度を低下させることにおけるそれらの使用を提供することを理解されよう。以下に広汎に考察するように、本発明のＰＴＫ７モジュレーターは、ＰＴＫ７又はその遺伝子を認識する、それと反応する、競合する、拮抗する、相互作用する、結合する、それを作動させる、又はそれと会合するどの化合物も概括的に含む。これらの相互作用によって、ＰＴＫ７モジュレーターは、それにより腫瘍始原細胞の頻度を低下させるか又は適度にする。本明細書に開示する例示のモジュレーターは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、又はポリペプチドを含む。ある好ましい態様において、選択されるモジュレーターは、ＰＴＫ７に対する抗体又はその免疫反応性断片若しくは誘導体を含む。そのような抗体は、本質的に拮抗性でも作動性でもよく、場合により、細胞傷害剤とコンジュゲートしても会合してもよい。他の態様において、本発明内のモジュレーターは、ＰＴＫ７アイソフォーム又はその反応性断片を含んでなるＰＴＫ７構築体を含む。そのような構築体は、融合タンパク質を含んでよくて、免疫グロブリン又は生物学的応答調節物質のような他のポリペプチド由来の反応性ドメインを含めることができることが理解されよう。なお他の側面において、ＰＴＫ７モジュレーターは、所望の効果をゲノムレベルで発揮する核酸アセンブリーを含む。本教示と適合可能な更なる他のモジュレーターについては、下記に詳しく考察する。
[055] どの形態のモジュレーターが最終的に選択されたとしても、それは、被検者への導入に先立って、好ましくは、単離及び精製された状態にある。この点に関して、「単離されたＰＴＫ７モジュレーター」は、広義に解釈されて、標準の薬務に従って、望まれない混在物質（生物学的又は他の）が実質的に存在しない状態で該モジュレーターを含んでなるあらゆる調製物又は組成物を意味するように解釈されよう。以下にやや詳しく考察するように、上記の調製物は、当該技術分野で認められた様々な技術を使用して、所望のように精製及び製剤化してよい。当然ながら、そのような単離調製物は、最終製品の市販、製造、又は療法上の側面を改善して医薬組成物を提供するために所望されるように、不活性成分又は有効成分とともに意図的に製剤化又は複合化してよいと理解される。
ＩＩ．ＰＴＫ７の生理学
[056] 結腸癌キナーゼ４（ＣＣＫ４）としても知られるプロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ７）は、元は正常ヒトメラニン産生細胞よりクローン化されて（Lee et al., Oncogene 8(12), 1993）、別に結腸癌組織よりクローン化された（Mossie et al., Oncogene 11(10), 1995）、受容体チロシンキナーゼである。ＰＴＫ７遺伝子は、６ｐ２１．１−ｐ１２．２に位置している。精巣ｃＤＮＡより、ヒトＰＴＫ７の５種のスプライスアイソフォームがクローン化された（Jung, Ji et al., Biochim Biophys Acta 1579, 2002）。これらアイソフォームの互いに対する比存在度は、精巣と肝細胞癌の間でも、結腸癌系の間でも異なるが、これらアイソフォームの機能上の意義は、あるとしても、不明である。バイオインフォマティクス解析は、マウスでは選択的にスプライスされたｍＲＮＡより可溶性のＰｔｋ７アイソフォームが発現される可能性があることを示唆した（Forrest, Taylor et al., Genome Biol 7, 2006）。本出願の目的では、「ＰＴＫ７」及び「ＣＣＫ４」という用語が可換的に使用されてよく、文脈の制約によって他に指定されなければ、ヒトＰＴＫ７のスプライス変異体、アイソフォーム、相同分子種、及び相同体を含めてよいことが理解されよう。この用語はまた、ＰＴＫ７タンパク質モジュレーター（例えば、抗体又は免疫反応性断片）が特異的に結合し得るエピトープを含有する、ＰＴＫ７のネイティブ型又は変異型のあらゆる誘導体若しくは断片も意味することがさらに理解されよう。
[057] 全長ＰＴＫ７タンパク質は、６７４個のアミノ酸の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に続いて、短いＴＭ（膜貫通）拡がり部分と３４５個のアミノ酸細胞質ドメインがある、Ｉ型膜貫通タンパク質である。ヒトＰＴＫ７の例示アイソフォーム（即ち、転写変異体ＰＴＫ７−１）の完全な核酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００２８２１を有して、図面１Ａ（配列番号１）に表される。同様に、ＰＴＫ７−１タンパク質の全長の例示アミノ酸配列を図面１Ｂ（配列番号２）に示す。配列番号２のＰＴＫ７タンパク質が、配列番号１の下線を施した核酸配列の翻訳産物（即ち、配列番号３に示すアイソフォームａ）とは、図面１Ｂにおいて９３位に点突然変異（Ｌ→Ｐ）がある点で異なることに留意されたい。アイソフォームに関して言えば、図面１Ｃは、Ｇｅｎｂａｎｋに報告されるような、ＰＴＫ７の４種の例示アイソフォーム（タンパク質アクセッション：アイソフォームａ＝ＮＰ＿００２８１２，配列番号３；アイソフォームｂ＝ＮＰ＿６９０６１９，配列番号５；アイソフォームｃ＝ＮＰ＿６９０６２０，配列番号６；アイソフォームｄ＝ＮＰ＿６９０６２１，配列番号４）のアミノ酸配列を注釈付きで並置したものを示す。先に示した配列についてすでに述べたように、アイソフォームａは、図面１Ａに示すＰＴＫ７変異体１由来のオープンリーディングフレームの翻訳産物に対応して、これらのアイソフォームの中で最も長い。他のスプライスアイソフォームは、示すように、アイソフォームａに対して様々なＩｇｃａｍドメインが欠落している細胞外ドメインをコードする。すべてのアイソフォームが同じ細胞内ドメインをコードする。このタンパク質セリン／チロシンキナーゼの触媒ドメインにおいて保存されたサブモチーフを、そのキナーゼドメインを不活性にすると考えられるＰＴＫ７タンパク質中の変化（例えば、サブドメインＩ及びＶＩＩ中の変化）の注釈と同様に、ＰＴＫ７並置の下に示す。
[058] いずれにしても、成熟した全長ＰＴＫ７ ＥＣＤは、７個の免疫グロブリン様ドメインを含むが、一方、図面１Ｃに示すように、様々なスプライス変異体は、それらのＥＣＤ構造が異なるＰＴＫ７アイソフォームをコードする。いずれのアイソフォームも、一般的なチロシンキナーゼの群に見出されるものと実質的に相同な細胞質ドメインを含有する。しかしながら、ＰＴＫ７は、検出可能なチロシンキナーゼ活性を欠くので、様々な保存キナーゼサブドメインにおけるいくつかのアミノ酸変化がＡＴＰの結合不全をもたらす、偽キナーゼのサブファミリーに属する（Kroiheer et al. Bioessays 23(1), 2001）。具体的には、ＰＴＫ７では、ＡＴＰの非転移可能リン酸との直接的な相互作用と、これらリン酸の架橋となるＭｇ２＋補因子のキレート形成が妨害されるように、サブドメインＩ及びＶＩＩ中のキー残基が改変している（Hanks et al., Methods Enzymol 200, 1991）。
[059] 本発明と適合可能なＰＴＫ７ポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形態であっても、融合タンパク質のようなより大きいタンパク質の一部であってもよいことがさらに理解される。分泌又はリーダー配列、プレ、プロ、又はプレプロタンパク質配列、又は親和性タグ（例えば、限定なしに、多重ヒスチジン残基、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、又はｍｙｃタグ）のような、精製に役立つ配列を含有する、追加のアミノ酸配列を含めることは、しばしば有利である。組換え産生の間に安定性を提供し得る追加配列も使用してよい。そのような配列は、切断可能な配列を追加配列又はその一部として取込むことによって、必要に応じて除去してもよい。このように、本明細書において定義されるようなＰＴＫ７ポリペプチドは、他のポリペプチドが含まれる付属部分へ融合した構築体を含んでよい。このような追加配列と親和性タグは、当該技術分野でよく知られていて、標準の生化学技術を使用して産生してよい。
[060] ＰＴＫ７機能の生物学的意義は、そのキナーゼドメインが不活性であるにもかかわらず、ヒドラからショウジョウバエ、ニワトリ、及びヒトに至るまで保存された相同分子種（そのいずれも、配列解析によって、キナーゼ活性を欠くと予測されている）の存在より推量することができる（Kroiher et al., 2001）。ヘリックス−ヘリックス会合の傾向に関連する特異的ＴＭドメインが高度に保存されていることと、そしてＲＴＫが典型的にはリガンド結合（engagement）に応答して二量体化するという事実に基づいて、ＴＭドメインには、ＰＴＫ７二量体化に媒介する可能性があることが示唆された（Kroiher et al., 2001）。後の研究では、ＰＴＫ７ ＴＭドメインが選好的な自己会合を促進しないことが示唆された（Kobus et al., Biochemistry 44(5), 2005）が、他のＲＴＫのＴＭドメイン又はシグナル伝達複合体の成員とのヘテロマー相互作用が除外されたわけではなかった。故に、ＰＴＫ７偽キナーゼドメインそれ自体には、シグナルを直接伝達することは期待されないが、それは、シグナル伝達経路中の他の分子の支持構造（scaffold）として作用するか、又は他のチロシンキナーゼ（複数）を動員する可能性がある（Kroiher et al., 2001）。
[061] ヒトＰＴＫ７は、成人結腸中では発現されないものの、それは、胎児結腸と多様な結腸癌由来細胞株（Mossie et al. 上掲, 1995）、並びに転移性結直腸癌（Saha et al., Science 294(5545) 2001）において発現されている。ＰＴＫ７を発現すると報告されている他の正常組織及び細胞には、肺、甲状腺、及び卵巣（Mossie, Jallal et al. 1995）、ＣＤ４＋胸腺移出Ｔ細胞（Haines et al., J Exp Med 206(2) 2009）、及び正常骨髄系前駆細胞、及びＣＤ３４＋ＣＤ３８−骨髄細胞（Prebet et al., Blood 116(13), 2010）が含まれる。癌性組織に関して言えば、ＰＴＫ７発現は、結腸癌細胞（Mossie et al. 1995）；ＡＭＬ試料（Muller-Tidow, et al. Clin Cancer Res 10(4), 2004)；ＣＤ３４−プレＴＡＬＬ細胞（Shangguan et al., J Proteome Res 7(5) 2008）、及び胃癌（Gorringe et al., Genes Chromosomes Cancer 42(3), 2005）にも見出されてきた。興味深いことに、元は正常メラニン産生細胞よりクローン化されたのにもかかわらず、ＰＴＫ７は、転移性メラノーマでは失われていると報告された（Easty et al., Int J Cancer 71(6), 1997）。ＰＴＫ７は、染色体６ｐ２１の欠損を含有するある種の乳癌においても失われているらしい（Piao et al., Genes Chromosomes Cancer 30(2), 2001）が、乳癌細胞株での発現は、一定していない（Su et al., J Cancer 1 2010）。ＰＴＫ７は、肺腺癌においても発現されていて、これらの腫瘍では、より好ましい予後とより強い発現レベルが相関していた（Endoh et al., J Clin Oncol 22(5) 2004）。骨肉腫における６ｐ１２−ｐ２１領域の増幅の精密マッピングは、ｑＲＴ−ＰＣＲによって定量されるように、遺伝子コピー数の増加が必ずしもＰＴＫ７の過剰発現をもたらさないことを示した（Lu et al., Mol Cancer Res 6(6), 2008）。
[062] ＰＴＫ７の単数又は複数のリガンドについては知られていないが、ＰＴＫ７は、多様な生体シグナル伝達経路及び発生プロセスと結び付けられてきた。このタンパク質の免疫グロブリン様のＥＣＤドメイン構造は、それが細胞−細胞の接触及び接着の参画因子又はセンサーである可能性を示唆する。ＰＴＫ７のショウジョウバエ相同分子種であるＯＴＫは、軸索誘導の間のセマフォリンシグナル伝達の潜在的な補助受容体としてのプレキシンと関連付けられてきた（Winberg et al., Neuron 32(1), 2001）。最近、アフリカツメガエルにおいてプレキシンＡ１とＰＴＫ７の間の相互作用が証明された（Wagner et al., Biochem Biophys Res Commun 402(2) 2010）が、ニワトリのＰＴＫ７の相同分子種であるＫＬＧは、ヒヨコの心臓形態形成に重要な複合体においてプレキシンＡ１及びＳｅｍａ６Ｄと相互作用することが示された（Totofuku et al., Genes Dev 18(4), 2004）。可溶性ＰＴＫ７（ｓＰＴＫ７）を使用して、ＶＥＧＦ誘導血管新生、並びに、ヒト内皮細胞の in vitro 管腔形成、遊走、及び浸潤におけるＰＴＫ７の役割が示された（Shin et al., Biochem Biophys Res Commun 371(4), 2008）。マウスＰＴＫ７はまた、アクチン細胞骨格再構成と細胞遊走が必要とされる、表皮創傷治癒プロセスへ関連付けられた（Caddy et al., Dev Cell 19(1), 2010）。
[063] 特定のシグナル伝達カスケードに関して言えば、ＰＴＫ７は、発生に重要な様々なＷｎｔシグナル伝達経路の構成因子であるらしい（Puppo et al., EMBO Rep 12(1), 2010）。Ｐｔｋ７のヌル突然変異又は重度に低形質の突然変異を発現するマウスは、周産期に死亡して、平面内細胞極性（ＰＣＰ）経路におけるＰＴＫ７の役割と一致した表現型を示す（Lu et al., Nature 430(6995), 2004）。同様に、ＥＣＤに３個のアミノ酸挿入がある突然変異体のＰＴＫ７タンパク質を含有するｃｈｕｚｈｏｉマウスは、ＰＣＰ欠損性の表現型を示す（Paudyal, Damrau et al., 2010）。マウスのＰＴＫ７は、Ｖａｎｇｌ２（Lu et al., 2004）、Ｃｅｌｓｒ１（Paudyal, Damrau et al., 2010）、Ｓｃｒｂ１、及びＧｒｈｌ３（Caddy et al., 2010）が含まれる他のＰＣＰ遺伝子と遺伝的に相互作用することが示された。膜型−ＩマトリックスメタロプロテイナーゼＩ（ＭＴ１−ＭＭＰ）は、ＰＴＫ７を切断して可溶性ＰＴＫ７（即ち、ｓＰＴＫ７）を放出するが、ゼブラフィッシュでは、ＭＴ１−ＭＭＰ活性とｓＰＴＫ７産生の均衡の調節不全が収斂伸長の欠損をもたらす。これも、ＰＣＰ経路におけるＰＴＫ７の役割と一致している（Golubkov et al., J Biol Chem 285(46), 2010）。アフリカツメガエルにおいて、ＰＴＫ７は、非標準Ｗｎｔシグナル伝達経路におけるｄｓｈとＷｎｔ受容体ｆｚ７との複合体中で見出された（Shnitsar et al., Development 135(24), 2008）が、ＰＴＫ７とβ−カテニンの間の相互作用は、マウス細胞中の標準Ｗｎｔシグナル伝達によって動的に影響を受ける可能性があることが示された（Puppo et al., 2010）。追加的に、ＰＴＫ７プロモーター中の保存されたＴＣＦ／ＬＥＦ転写因子結合部位は、それがＷｎｔ応答遺伝子であることを示唆して、ある種の結直腸癌では、Ｗｎｔ経路シグナル伝達がしばしば調節不全になっているので、これらの腫瘍におけるＰＴＫ７の上方調節を説明する可能性がある（Katoh, Int J Mol Med 20(3), 2007）。
[064] 癌性組織内では、上記に記載したＷｎｔ経路を調節することへのその潜在可能性に加えて、ＰＴＫは、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞株において、好増殖及び抗アポトーシスのシグナルを伝えるようである。なぜなら、ＲＮＡｉ媒介性のＰＴＫ７のノックダウンによって、その表現型が逆転される可能性があるからである（Meng et al., PLoS One 5(11), 2010）。ＰＴＫ７の抗アポトーシスシグナルは、ＡＭＬ芽球におけるアントラサイクリン媒介性の細胞殺傷への抵抗性を付与したが、それは、可溶性ＰＴＫ７−Ｆｃタンパク質を使用して、逆転させることができた（Prebet et al., 2010）。特定の癌細胞によるＰＴＫ７の過剰発現は、ＰＴＫ７へ結合してその後内在化されるアプタマーを使用する、培養中のＴ−ＡＬＬ細胞へのダウノルビシンの標的送達への戦略に利用されたことがある（Xiao et al., Chemistry 14(6), 2008）。
[065] 上述した特徴に加えて、本開示は、ＰＴＫ７の発現が様々な腫瘍始原細胞集団において上昇していることを証明する。このことは、バルク腫瘍中の非腫瘍形成細胞の少なくともいくつかにおけるＰＴＫ７の同時の上方調節と並んで、ＰＴＫ７媒介性のリガンド−受容体相互作用が腫瘍の増殖、新生血管形成、及び／又は腫瘍転移に連結する細胞シグナル伝達カスケードの引き金になり得る可能性を提起する。どの特別な理論にも束縛されることを望まずに言えば、本発明のＰＴＫ７モジュレーター（特に、拮抗性又は中和性の態様）は、少なくとも一部は、腫瘍始原細胞頻度を低下させるか又は消失させることによって作用して、それにより従来の標準治療レジメン（例、イリノテカン）とは異なる方法で、又は免疫療法的なシグナル伝達、又はＰＴＫ７発現細胞を殺傷することが可能なペイロードを送達することを介して、腫瘍の増殖又は生存に干渉すると考えられる。例えば、ＰＴＫ７に拮抗することによる癌幹細胞活性の低下には、増殖性の細胞を消失させる化学療法レジメンに対抗して細胞増殖を単に促進すること、又は腫瘍始原細胞の自己再生（即ち、無限の増殖と多能性の維持）能力が失われるようにその分化を誘導することを含めてよい。あるいは、好ましい態様では、ＰＴＫ７発現細胞への細胞傷害性Ｔ細胞の動員、又は抗ＰＴＫ７抗体へコンジュゲートした、内在化することができる強力な毒素の送達によって、ＴＰＣを選択的に殺傷することができる。
ＩＩＩ．腫瘍永続化細胞
[066] 先行技術の教示とは対照的に、本発明は、腫瘍始原細胞、そして特に腫瘍永続化細胞に標的指向して、それによって新生物障害の治療、管理、又は予防を促進するのに特に有用であるＰＴＫ７モジュレーターを提供する。より具体的には、先に示したように、驚くべきことに、特定の腫瘍細胞亜集団は、ＰＴＫ７を発現して、癌幹細胞の自己再生と細胞の生存に重要なモルフォゲンシグナル伝達の局在化調整を変化させる可能性があることが見出された。このように、好ましい態様では、ＰＴＫ７のモジュレーターを本教示に従って使用して、腫瘍始原細胞頻度を低下させて、それによって過剰増殖性疾患の治療又は管理を促進することができる。
[067] 本明細書に使用するように、腫瘍始原細胞（ＴＩＣ）という用語には、腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ；即ち、癌幹細胞又はＣＳＣ）と高増殖性腫瘍始原細胞（ＴＰｒｏｇと呼ばれる）がともに含まれて、これらは一緒に、バルク腫瘍又は塊の独自の亜集団（即ち、０．１〜４０％）を概ね含む。本開示の目的では、腫瘍永続化細胞及び癌幹細胞又は新生物幹細胞という用語は、同等であって、本明細書において可換的に使用してよい。逆に、ＴＰＣは、腫瘍内部に存在する腫瘍細胞の組成を完全に再現し得て、少数の単離細胞の連続移植（マウスを介した２回以上の継代）によって証明されるような無制限の自己再生能力を有する点で、ＴＰｒｏｇとは異なる。下記により詳しく考察するように、適正な細胞表面マーカーを使用する蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、少なくとも一部は、単一の細胞と細胞の塊（即ち、ダブレット等）を識別するその能力の故に、高度に濃縮した細胞亜集団（例えば、９９．５％より高い純度）を単離するのに信頼し得る方法である。そのような技術を使用して、少ない細胞数の高度精製ＴＰｒｏｇ細胞が免疫不全マウスへ移植されるときに、それらが一次移植体中の腫瘍増殖を促すことができることが示された。しかしながら、精製されたＴＰＣ亜集団とは異なり、ＴＰｒｏｇ産生腫瘍は、表現型の細胞異種性において親腫瘍を完全には反映せず、後続の移植体において連続した腫瘍形成を再始動させることで明らかに非効率である。対照的に、ＴＰＣ亜集団は、親腫瘍の細胞異種性を完全に再構成して、連続的に単離及び移植されるときに、腫瘍を効率的に始動させることができる。このように、当業者は、いずれも一次移植体において腫瘍を産生し得ても、ＴＰＣとＴＰｒｏｇの間には明確な違いがあって、それは、少ない細胞数での連続移植時に異種な腫瘍増殖を永続的に促進するＴＰＣ独自の能力であることを認められよう。ＴＰＣの特性決定をするための他の通常のアプローチは、形態学と、細胞表面マーカー、転写プロフィール、及び薬物応答の検証に関連するが、マーカーの発現は、培養条件と in vitro での細胞株の継代で変化する場合がある。
[068] 従って、本発明の目的では、腫瘍永続化細胞は、正常組織において細胞の階層構造を支える正常幹細胞と同様に、好ましくは、多系統分化の能力を維持しながら無限に自己再生するその能力によって定義される。このように、腫瘍永続化細胞は、腫瘍形成性子孫（即ち、腫瘍始原細胞：ＴＰＣ及びＴＰｒｏｇ）と非腫瘍形成性（ＮＴＧ）子孫をともに産生することが可能である。本明細書に使用するように、非腫瘍形成細胞（ＮＴＧ）とは、腫瘍始原細胞より生じるが、それ自体では自己再生する能力も腫瘍を含む異種な系統の腫瘍細胞を産生する能力も有さない、腫瘍細胞を意味する。実験的には、ＮＴＧ細胞は、過剰の細胞数で移植されるときでも、マウスにおいて腫瘍を再現可能的に形成することができない。
[069] 示したように、ＴＰｒｏｇは、マウス中で腫瘍を産生するその限られた能力により、腫瘍始原細胞（又はＴＩＣ）としても分類される。ＴＰｒｏｇは、ＴＰＣの子孫であって、典型的には、有限回の非自己再生性の細胞分裂が可能である。さらに、ＴＰｒｏｇ細胞は、初期腫瘍始原細胞（ＥＴＰ）と後期腫瘍始原細胞（ＬＴＰ）へさらに分割される場合があり、このそれぞれは、表現型（例、細胞表面マーカー）と腫瘍細胞構造を再現する能力の差によって識別され得る。そのような技術上の差異にも拘らず、ＥＴＰとＬＴＰはともに、少ない細胞数で移植されるときに腫瘍を連続的に再構成することが概ね不可能であって、典型的には、親腫瘍の異種性を反映しないという点で、ＴＰＣとは機能的に異なる。上述の差異にも拘らず、様々なＴＰｒｏｇ集団が、稀な場合に、通常は幹細胞に起因する自己再生能力を獲得して、それ自体でＴＰＣ（又はＣＳＣ）になることが可能であることも示されてきた。いずれにしても、一人の患者の典型的な腫瘍塊には、両方の種類の腫瘍始原細胞が現れる可能性があって、本明細書に開示するモジュレーターでの治療の影響を受ける。即ち、開示される組成物は、腫瘍に表れる特別な態様又は混在に拘らず、このようなＰＴＫ７陽性腫瘍始原細胞の頻度を低下させるか又はその化学療法感受性を変化させるのに概ね有効である。
[070] 本発明の文脈では、ＴＰＣは、ＴＰｒｏｇ（ＥＴＰとＬＴＰの両方）、ＮＴＧ細胞、及び腫瘍のバルクを含む腫瘍浸潤性非ＴＰＣ由来細胞（例、線維芽細胞／間質細胞、内皮及び造血細胞）より腫瘍形成性であって、相対的により不活動性であって、より化学療法抵抗性であることが多い。慣用の療法及びレジメンが、大部分は、腫瘍を減量させるとともに迅速に増殖中の細胞を攻撃するように設計されてきたとすれば、ＴＰＣは、慣用の療法及びレジメンに対して、より速く増殖中のＴＰｒｏｇや他のバルク腫瘍細胞集団よりも抵抗性になる可能性がある。さらに、ＴＰＣは、慣用の療法に対してそれらを相対的に化学療法抵抗性にする、多剤耐性輸送体の発現増加、ＤＮＡ修復機序の増強、及び抗アポトーシスタンパク質といった他の特徴をしばしば発現する。そのそれぞれがＴＰＣによる薬剤耐性に寄与するこれらの特性は、標準腫瘍学の治療レジメンが進行期の新生物を担うほとんどの患者に長期の利益を保証することができないこと、即ち、継続した腫瘍の増殖及び再発を促すそれらの細胞（即ち、ＴＰＣ又はＣＳＣ）に充分に標的指向してそれらを根絶することができないことの主要な理由を構成する。
[071] 上述した先行技術の治療法の多くと異なり、本発明の新規組成物は、好ましくは、選択したモジュレーターの形態又は特定の標的（例、遺伝物質、ＰＴＫ７抗体、又はリガンド融合構築体）に拘らず、被検者への投与時に、腫瘍始原細胞の頻度を低下させる。上記に注目したように、腫瘍始原細胞頻度の低下は、ａ）腫瘍始原細胞の消失、枯渇、増感、沈静化、又は阻害；ｂ）腫瘍始原細胞の増殖、拡張、又は再発を制御すること；ｃ）腫瘍始原細胞の始動、伝播、維持、又は増殖を妨害すること；又はｄ）他の方法で、腫瘍形成細胞の生存、再生、及び／又は転移を妨げることの結果として起こり得る。いくつかの態様において、腫瘍始原細胞の頻度の低下は、１以上の生理学的経路における変化の結果として起こる。この経路の変化は、腫瘍始原細胞の低下又は消失によっても、それらの潜在能力（例、分化誘導、ニッチ破壊）を変化させるか又は、腫瘍環境又は他の細胞に対して影響を及ぼすそれらの能力に他の方法で干渉することによっても、腫瘍形成、腫瘍維持、及び／又は転移と再発を阻害することによって、ＰＴＫ７関連障害のより有効な治療を可能にする。
[072] このような腫瘍始原細胞の頻度の低下を評価するために使用し得る方法には、in vitro 又は in vivo のいずれかの限界希釈分析があり、好ましくは、ポアソン分布統計を使用する計数、又は in vivo で腫瘍を産生する能力の有無といった、既定義の決定的な事象の頻度を評価することをそれに続ける。そのような限界希釈分析は、腫瘍始原細胞頻度の低下を計算する好ましい方法であるが、他のさほど厳密でない方法も、やや正確ではないとしても、所望の数値を有効に決定するために使用し得て、本明細書の教示と全く適合可能である。このように、当業者によって理解されるように、頻度値の低下をよく知られたフローサイトメトリー又は免疫組織化学の手段により決定することも可能である。上述のすべての方法に関しては、例えば、そのそれぞれがその全体において参照により本明細書に組み込まれる、Dylla et al. 2008, PMCID: PMC2413402 及び Hoey et al. 2009, PMID: 19664991 を参照のこと。
[073] 限界希釈分析に関して言えば、コロニー形成を助長する in vitro 増殖条件の中へ分画又は未分画いずれかのヒト腫瘍細胞（例えば、それぞれ、処置済み及び未処置の腫瘍に由来する）を沈着させることによって、腫瘍始原細胞頻度の in vitro 計数を達成することができる。この方法では、コロニーの単純なカウンティング及び特性決定によっても、また例えば、系列希釈液のプレート中へのヒト腫瘍細胞の沈着と、各ウェルについてコロニー形成が陽性又は陰性かをプレート培養後少なくとも１０日間採点することからなる分析によっても、コロニー形成細胞を計数することができる。腫瘍始原細胞頻度を決定するその能力が概してより正確である、in vivo の限界希釈実験又は分析には、未処置対照又は処置条件のいずれかに由来のヒト腫瘍細胞を、例えば免疫不全マウスの中へ系列希釈液で移植した後で、各マウスについて腫瘍形成が陽性又は陰性かを移植後少なくとも６０日間採点することが含まれる。in vitro 又は in vivo での限界希釈分析による細胞頻度値の導出は、好ましくは、陽性及び陰性事象の既知頻度へポアソン分布統計を適用して、それにより陽性事象（この場合は、それぞれ、コロニー又は腫瘍の形成）の定義を満たす事象の頻度を提供することによって行う。
[074] 腫瘍始原細胞頻度を計算するために使用し得る、本発明と適合可能な他の方法に関して言えば、ごく普通の方法は、定量可能なフローサイトメトリー技術と免疫組織化学染色手順を含む。直前に記載した限界希釈分析技術ほど正確ではないが、これらの手順は、ずっと労働集約的ではなくて、妥当な数値を相対的に短い時間枠で提供する。このように、当業者は、腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている、当該技術分野で認められた細胞表面タンパク質（例えば、下記の実施例１で説明するような、潜在的に適合可能なマーカー）と結合する１以上の抗体又は試薬を利用して、それによって様々な試料由来のＴＩＣレベルを測定する、フローサイトメトリー細胞表面マーカープロフィール決定法を使用し得ることが理解されよう。なお別の適合可能な方法において、当業者は、これらの細胞を区別すると考えられる細胞表面タンパク質へ結合することが可能である１以上の抗体又は試薬を使用する免疫組織化学によって、ＴＩＣ頻度を in situ で（例えば、組織切片において）計数することができよう。
[075] 従って、上記に参照した方法のいずれを使用しても、本明細書の教示に従って、開示されるＰＴＫ７モジュレーター（細胞傷害剤へコンジュゲートしたものを含めて）によって提供されるＴＩＣ（又はその中のＴＰＣ）の頻度の低下を定量することが可能である。いくつかの事例において、本発明の化合物は、ＴＩＣの頻度を（消失、分化誘導、ニッチ破壊、沈静化、等が含まれる、上記に注目した多様な機序によって）１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、又は３５％も低下させる場合がある。他の態様において、ＴＩＣの頻度の低下は、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、又は６５％のオーダーであり得る。ある態様において、開示される化合物は、ＴＩＣの頻度を、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％も低下させる場合がある。当然ながら、ＴＩＣの頻度のどの低下も、新生物の腫瘍形成性、永続性、再発、及び攻撃性の対応する低下をもたらす可能性があると理解されよう。
ＩＶ．ＰＴＫ７モジュレーター
[076] いずれにしても、本発明は、いくつかのＰＴＫ７関連悪性腫瘍のいずれも含まれる様々な障害の診断、診断・治療、治療、及び／又は予防のためのＰＴＫ７モジュレーター（ＰＴＫ７アンタゴニストが含まれる）の使用へ向けられる。開示モジュレーターは、単独で使用しても、化学療法剤又は免疫療法剤（例、治療用抗体）又は生物学的応答調節物質のような多種多様な抗癌化合物と一緒に使用してもよい。他の選択態様では、２以上の別々のＰＴＫ７モジュレーターを組み合わせて使用して増強された抗新生物効果をもたらしても、それを使用して多重特異性の構築体を作製してもよい。
[077] ある態様において、本発明のＰＴＫ７モジュレーターは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、又はポリペプチドを含む。なおより好ましくは、当該モジュレーターは、可溶性ＰＴＫ７（ｓＰＴＫ７）、又はその形態、変異体、誘導体又は断片を含み、それには、例えば、ＰＴＫ７融合構築体（例、ＰＴＫ７−Ｆｃ、ＰＴＫ７−標的化部分、等）又はＰＴＫ７−コンジュゲート（例、ＰＴＫ７−ＰＥＧ、ＰＴＫ７−細胞傷害剤、ＰＴＫ７−ｂｒｍ、等）が含まれる。また、他の態様において、ＰＴＫ７モジュレーターは、抗体又はその免疫反応性断片若しくは誘導体を含むと理解される。特に好ましい態様において、本発明のモジュレーターは、中和抗体又はその誘導体若しくは断片を含む。他の態様において、ＰＴＫ７モジュレーターは、内在化抗体（internalizing antibody）又はその断片を含んでよい。なお他の態様において、ＰＴＫ７モジュレーターは、枯渇性抗体又はその断片を含んでよい。さらに、上述した融合構築体に関して言えば、これらの抗体モジュレーターは、選択される細胞傷害剤、ポリマー、生物学的応答調節物質（ＢＲＭ）、等とコンジュゲートする、連結する、又は他の方法で会合して、様々な（そして任意選択的に、多数の）作用機序で、指向される免疫療法を提供することができる。上記に述べたように、そのような抗体は、汎ＰＴＫ７抗体であって２以上のＰＴＫ７アイソフォームと会合しても、単一のアイソフォームと選択的に反応する免疫特異抗体であってもよい。なお他の態様において、当該モジュレーターは、遺伝子レベルで機能し得て、アンチセンス構築体、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、等といった化合物を含んでよい。
[078] 開示されるＰＴＫ７モジュレーターは、選択される経路に作動するか又は拮抗すること、又は、例えば、ＰＴＫ７モジュレーターの形態、あらゆる会合ペイロード、又は投薬及び送達法に依存して、特定の細胞を消失させることが含まれる多様な機序を介して、腫瘍細胞（特にＴＰＣ）及び／又は関連する新生物を枯渇する、沈静化する、中和する、消失させる、又はその増殖、伝播、又は生存を阻害し得ることがさらに理解されよう。従って、本明細書に開示する好ましい態様は、腫瘍永続化細胞のような特定の腫瘍細胞亜集団の枯渇、阻害、又は沈静化へ向けられるが、そのような態様は、単に例示であって、いかなる意味でも限定的ではないことが強調されなければならない。むしろ、付帯の特許請求項において説明されるように、本発明は、如何なる特別な機序にも標的腫瘍細胞集団にも拘りなく、ＰＴＫ７モジュレーターと、様々なＰＴＫ７関連過剰増殖性障害の治療、管理、又は予防におけるそれらの使用へ概括的に向けられる。
[079] 同じ意味において、本発明の開示態様は、ＰＴＫ７と会合する１以上のＰＴＫ７アンタゴニストを含んでよい。そのために、本発明のＰＴＫ７アンタゴニストは、ＰＴＫ７タンパク質又はその断片を認識する、それと反応する、結合する、複合する、競合する、会合する、又は他の方法で相互反応して、腫瘍始原細胞又は他の新生物細胞（バルク腫瘍又はＮＴＧ細胞が含まれる）を消失させる、沈静化する、低下させる、阻害する、妨害する、束縛する、又は制御する、如何なるリガンド、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、抗体、又は免疫学的に活性なその断片若しくは誘導体も含んでよいと理解されよう。選択される態様において、ＰＴＫ７モジュレーターは、ＰＴＫ７アンタゴニストを含む。
[080] 本明細書に使用するように、アンタゴニストは、特別又は特定のタンパク質の活性（受容体のリガンドへの結合、又は酵素の基質との相互作用が含まれる）を中和する、遮断する、阻害する、廃絶する、低下させる、又はそれに干渉することが可能な分子を意味する。より一般的には、本発明のアンタゴニストは、抗体とその抗原結合性断片若しくは誘導体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、アンチセンス構築体、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、生体有機分子、ペプチド模倣体、薬剤とその代謝産物、転写及び翻訳制御配列、等を含んでよい。アンタゴニストには、該タンパク質へ特異的に結合して、それによってその基質標的へのその結合を隔離する、低分子阻害剤、融合タンパク質、受容体の分子及び誘導体、該タンパク質のアンタゴニスト変異体、該タンパク質へ指向されるアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、並びに該タンパク質に対するリボザイムも含めてよい。
[081] 本明細書に使用するように、そして２以上の分子又は化合物へ適用されるように、「認識する」又は「会合する」という用語は、それによって一方の分子が他方の分子に対して影響を及ぼす、共有結合的又は非共有結合的な、両分子の反応、結合、特異結合、複合、相互作用、接続、連結、一体化、合体、合併、又は接合を意味するものとする。
[082] さらに、本明細書の実施例において証明するように、ヒトＰＴＫ７のモジュレーターには、ある事例において、ヒト以外の種（例、マウス）由来のＰＴＫ７と交差反応し得るものがある。他の事例において、例示のモジュレーターは、ヒトＰＴＫ７の１以上のアイソフォームに特異的であり得、他の種由来のＰＴＫ７相同分子種との交差反応性を示さない。当然ながら、本明細書の教示に一致して、そのような態様は、単一の種由来の２以上のアイソフォームと会合する汎ＰＴＫ７抗体、又は単一のアイソフォームと排他的に会合する抗体を含んでよい。
[083] いずれにしても、そして下記により詳しく考察するように、当業者は、開示モジュレーターをコンジュゲート形態でも非コンジュゲート形態でも使用してよいことを理解されよう。即ち、当該モジュレーターは、医薬活性化合物、生物学的応答調節物質、抗癌剤、細胞傷害剤又は細胞増殖抑制剤、診断部分、又は生体適合可能な修飾剤と（例えば、共有結合的又は非共有結合的に）会合又はコンジュゲートしてよい。この点について言えば、そのようなコンジュゲートは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、低分子、模倣剤、合成薬、無機分子、有機分子、及び放射性核種を含んでよいと理解されよう。さらに、本明細書で示したように、選択したコンジュゲートは、そのコンジュゲーションに影響を及ぼすのに使用される方法に少なくとも一部は依存して、ＰＴＫ７モジュレーターへ様々なモル比で共有結合的又は非共有結合的に連結してよい。
Ｖ．抗体
ａ．概説
[084] 先に述べたように、本発明の特に好ましい態様は、ＰＴＫ７モジュレーターを、ＰＴＫ７の１以上のアイソフォームと選好的に会合する抗体の形態で含む。抗体という用語は最も広義に使用されて、具体的には、合成抗体、モノクローナル抗体、オリゴクローナル又はポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、組換え産生抗体、細胞内抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、一価抗体、多価抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体（CDR-grafted antibody）、霊長類化抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、単鎖ＦｖＦｃｓ（ｓｃＦｖＦｃ）、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び（所望される生理活性、即ち、免疫特異的又は免疫選好的なＰＴＫ７の会合又は結合を示す限りにおいて）他のあらゆる免疫学的に活性な抗体断片を網羅する。より広義において、本発明の抗体には、免疫グロブリン分子と免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片（即ち、抗原結合部位を含有する分子）が含まれて、ここでこれらの断片は、限定されないが、Ｆｃ領域又はその断片が含まれる、別の免疫グロブリンドメインへ融合してもしなくてもよい。さらに、本明細書においてより詳しく概説されるように、抗体（複数及び複数）という用語には、具体的には、下記に記載のようなＦｃ変異体が含まれ、完全長の抗体と、Ｆｃ領域又はその断片を含んでなり、少なくとも１つのアミノ酸残基修飾を含んでもよく、そして免疫グロブリンの免疫学的に活性な断片へ融合してもよい、変異体Ｆｃ融合体が含まれる。
[085] 下記により詳しく考察するように、抗体又は免疫グロブリンという一般用語は、生化学的に、そしてその重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依って識別することができて、適正なクラスへ容易に帰属させることができる、５種の別個の抗体のクラスを含む。史的な理由のために、インタクト抗体の主要クラスは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭと呼ばれる。ヒトでは、ＩｇＧ及びＩｇＡのクラスが、構造とある種の生化学的特性に依って、認知されたサブクラス（アイソタイプ）、即ち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２へさらに分類され得る。ヒトのＩｇＧアイソタイプは、血清中のその豊富さの順で命名されて、ＩｇＧ１が最も豊富であることが理解されよう。
[086] 全５種の抗体クラス（即ち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）とすべてのアイソタイプ（即ち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、並びにその変異体が本発明の範囲内にあるが、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンを含んでなる好ましい態様について、単に例証の目的のために、やや詳しく考察する。しかしながら、そのような開示は、本発明を実施する例示の組成物及び方法について単に例証するのであって、本発明の範囲又は付帯の特許請求項を決して限定するものではないことを理解されたい。
[087] この点に関して言えば、ヒトＩｇＧ免疫グロブリンは、分子量がほぼ２３，０００ダルトンの２つの同一の軽いポリペプチド鎖と、分子量がアイソタイプに依存して５３，０００〜７０，０００である２つの同一の重鎖を含む。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、対応するギリシャ語の小文字、α、δ、ε、γ、及びμによってそれぞれ示される。どの脊椎動物種由来の抗体の軽鎖も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる、２つの明らかに別個の型の１つへ帰属させることができる。当業者は、異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造と三次元配置がよく知られていることを理解されよう。
[088] この４本の鎖は、ジスルフィド結合によってＹ配置で結合して、ここで軽鎖は、重鎖の外側にあって、Ｙの開口部より始まって、可変領域を通して続いて、Ｙの両端へ至る。それぞれの軽鎖が重鎖へ１つの共有ジスルフィド結合によって連結するのに対し、ヒンジ領域にある２つのジスルフィド連結は、重鎖を結合する。それぞれの重鎖及び軽鎖はまた、一定間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有するが、その数は、ＩｇＧのアイソタイプに基づいて変動し得る。
[089] それぞれの重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、いくつかの定常ドメインがこれに続く。それぞれの軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、そしてその他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一定常ドメインと並置して、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並置している。この点に関して言えば、軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）の両方の部分が抗原認識と特異性を決定すると理解される。一方、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、又はＣＨ３）は、分泌、経胎盤移動性、循環半減期、補体結合、等といった重要な生物学的特性を付与して制御する。転換によって、定常領域ドメインの番号付けは、それらが抗体の抗原結合部位又はアミノ末端からより離れるにつれて増加する。このように、抗体のアミノ又はＮ末端は、可変領域を含み、カルボキシ又はＣ末端は、定常領域を含む。このように、ＣＨ３ドメインとＣＬドメインは、それぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を実際に含む。
[090] 「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が免疫グロブリン間の配列において広範囲に異なっていて、これらのホットスポットが特別な抗体の結合及び特異性の特徴を概ね決定するという事実に関連する。これらの超可変部位は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方において、相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られる、それぞれ３つのセグメントにおいて出現する。ＣＤＲの近傍にある可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。より具体的には、天然に存在する単量体のＩｇＧ抗体において、抗体の各アームに存在するこの６つのＣＤＲは、抗体が水性環境においてその三次元構造をとるときに、抗原結合部位を形成するように特異的に定位される、アミノ酸の短い不連続配列である。
[091] 重鎖及び軽鎖の可変ドメインの残りを含んでなるフレームワーク領域は、アミノ酸配列において、より少ない分子間変動性を示す。むしろ、フレームワーク領域は、概ねβシートコンホメーションを採って、ＣＤＲは、このβシート構造に連結して、ある場合はその一部となるループを形成する。このように、これらのフレームワーク領域は、６つのＣＤＲを非共有結合性の鎖間相互作用によって正確な配向で定位することをもたらす骨格を形成するように作用する。この定位されたＣＤＲによって形成される抗原結合部位は、免疫反応性抗原上のエピトープに対して相補的な表面を決定する。この相補的な表面は、免疫反応性抗原エピトープに対する抗体の非共有結合を促進する。ＣＤＲの位置及び組成は、本明細書に提供される定義を使用して、当業者によって容易に確定され得ると理解されよう。
[092] 下記により詳しく考察するように、有効な抗体を提供するために、標準の組換え及び発現技術を使用して、重鎖及び軽鎖の可変領域の全部又は一部を再結合又は工学処理してよい。即ち、第一抗体（又はそのあらゆる部分）由来の重鎖又は軽鎖可変領域を、第二抗体由来の重鎖又は軽鎖可変領域のどの選択される部分とも混合して適合させてよい。例えば、１つの態様では、第一抗体の３つの軽鎖ＣＤＲを含んでなる軽鎖可変領域全体を、第二抗体の３つの重鎖ＣＤＲを含んでなる重鎖可変領域全体と対合させて、機能可能な（operative）抗体を提供することができる。さらに、他の態様では、様々な抗体に由来する個々の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを混合して適合させて、最適化された特徴を有する所望の抗体を提供することができる。このように、例示の抗体は、第一抗体由来の３つの軽鎖ＣＤＲ、第二抗体由来の２つの重鎖ＣＤＲ、及び第三抗体由来の第三の重鎖ＣＤＲを含んでよい。
[093] より具体的には、本発明の文脈では、図面６Ａ又は図面６Ｂに示されるマウス可変領域アミノ酸配列に由来する、開示される重鎖及び軽鎖ＣＤＲのいずれも、本明細書の教示に従ってこの方法で再配置させて、最適化された抗ＰＴＫ７（例、抗ｈＰＴＫ７）抗体を提供し得ることが理解されよう。即ち、図面６Ａに示される連続した軽鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号２０〜６０、偶数番号）又は図面６Ｂに示される連続した重鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号２１〜６１、奇数番号）に由来するＣＤＲの１以上を、ＰＴＫ７モジュレーターに、そして特に好ましい態様では、１以上のＰＴＫ７アイソフォームと免疫特異的に会合するＣＤＲ移植又はヒト化抗体に取り込むことができる。図面６Ａ及び６Ｂには、そのようなヒト化モジュレーターの軽鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号６２〜６８、偶数番号）及び重鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号６３〜６９、奇数番号）の例も示される。まとめると、これらの新規アミノ酸配列は、本発明に準拠した、２１種のマウスと４種のヒト化の例示モジュレーターを図示する。さらに、本出願に付帯する配列表には、図面６Ａ及び６Ｂに示す２１種の例示マウスモジュレーターと４種のヒト化モジュレーターのそれぞれに対応する核酸配列（配列番号１２０〜１６９）が含まれる。
[094] いずれにしても、相補性決定領域の残基番号は、Kabat et al.（1991, NIH 公開公報 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.）のそれのように定義され得て、具体的には、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（ＣＤＲ１）、５０〜５６（ＣＤＲ２）及び８９〜９７（ＣＤＲ３）と重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（ＣＤＲ１）、５０〜６５（ＣＤＲ２）及び９５〜１０２（ＣＤＲ３）である。ＣＤＲは、抗体ごとにかなり変動する（そして、定義上、カバット（Kabat）コンセンサス配列との相同性を示さない）ことに留意されたい。フレームワーク残基の最大の並置には、しばしば、Ｆｖ領域に使用するために、スペーサー残基をこの番号付けシステムに挿入することが求められる。加えて、ある個別残基の同一性は、どの所与のカバット部位番号でも、種間又は対立遺伝子の多様性により、抗体鎖ごとに変動する場合がある。Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342, pp.877-883 (1989)、MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)、及び S. Dubel（監修）「治療用抗体の手引き（Handbook of Therapeutic Antibodies）」（第3版）WILEY-VCH Verlag GmbH and Co.(2007) も参照のこと。ここでその定義には、互いに対して比較するときのアミノ酸残基の重なり又は亜集合が含まれる。上述した参考文献のそれぞれは、その全体において参照により本明細書に組み込まれて、上記に引用した参考文献のそれぞれによって定義されるような結合領域又はＣＤＲを含むアミノ酸残基を比較のために下記に示す。
[095] 本明細書に考察されるように、当業者は、図面６Ａ又は６Ｂに示すそれぞれの各重鎖及び軽鎖配列について、Kabat et al.、Chothia et al.、又は MacCallum et al. によって定義されるようにＣＤＲを容易に定義、同定、導出、及び／又は列挙することができよう。従って、本発明の範囲内には、すべてのそのような命名法によって定義されるＣＤＲを含んでなる主題のＣＤＲ及び抗体が明白に含まれる。より概括的に言えば、「可変領域ＣＤＲアミノ酸残基」という用語には、上記に示したようなどの配列又は構造ベースの方法を使用しても同定されるようなＣＤＲ中のアミノ酸が含まれる。
[096] 本明細書に使用するように、「可変領域フレームワーク（ＦＲ）アミノ酸残基」という用語は、Ｉｇ鎖のフレームワーク領域中のアミノ酸に言及する。本明細書に使用する「フレームワーク領域」又は「ＦＲ領域」という用語には、可変領域の一部であるが、ＣＤＲの一部ではない（例えば、ＣＤＲのカバット定義を使用する）アミノ酸残基が含まれる。故に、可変領域フレームワークは、長さが約１００〜１２０個の間のアミノ酸の不連続配列であるが、ＣＤＲの外側のアミノ酸だけが含まれる。
[097] 重鎖可変領域の具体例では、そして Kabat et al. によって定義されるようなＣＤＲでは、フレームワーク領域１がアミノ酸１〜３０を囲む可変領域のドメインに対応し；フレームワーク領域２がアミノ酸３６〜４９を囲む可変領域のドメインに対応し；フレームワーク領域３がアミノ酸６６〜９４を囲む可変領域のドメインに対応して、フレームワーク領域４がアミノ酸１０３〜可変領域の末端までの可変領域のドメインに対応する。軽鎖のフレームワーク領域も、軽鎖可変領域ＣＤＲのそれぞれによって同様に分離している。同様に、Chothia et al. によるＣＤＲの定義（例、ＣＤＲ−Ｌ１ ２３〜３４、ＣＤＲ−Ｌ２ ５０〜５６、ＣＤＲ−Ｌ３ ８９〜９７；ＣＤＲ−Ｈ１ ２６〜３２、ＣＤＲ−Ｈ２ ５０〜５８、ＣＤＲ−Ｈ３ ９５〜１０２）又は McCallum et al. によるＣＤＲの定義を使用すると、フレームワーク領域の境界は、上記に記載のようなそれぞれのＣＤＲ末端によって分離される。
[098] 上述した構造上の考慮事項を銘記して、当業者は、本発明の抗体が、いくつかの機能的な態様のいずれも含んでよいことを理解されよう。この点に関して言えば，適合可能な抗体は、被検者において所望される生理学的応答をもたらす、どの免疫反応性抗体（この用語は、本明細書において定義される）も含んでよい。開示される抗体のいずれも本教示に従って使用してよいが、本発明のある態様は、キメラ、ヒト化、又はヒトモノクローナル抗体、又はそれらの免疫反応性断片を含む。なお他の態様は、例えば、同種の（homogeneous）又は異種の（heterogeneous）多量体構築体、Ｆｃ変異体、及びコンジュゲートされたか又はグリコシル化により改変された抗体を含んでよい。さらに、そのような配置が相互に排他的ではないこと、そして適合可能な個々の抗体が本明細書に開示される機能的な側面の１以上を含んでよいことが理解されよう。例えば、適合可能な抗体は、ヒト化可変領域がある一本鎖の二重特異性抗体（diabody）、又はグリコシル化パターンを変化させて血清半減期を調節するＦｃ修飾がある、完全にヒトの完全長ＩｇＧ３抗体を含んでよい。当業者には、他の例示態様が容易に明らかであって、本発明の範囲内にあるものとして容易に識別可能であり得る。
ｂ．抗体作製
[099] よく知られていて、本明細書の「実施例」に示されるように、本明細書の教示に従った抗体を提供するには、ウサギ、マウス、ラット、等が含まれる様々な宿主動物に接種して、これを使用してよい。免疫学的応答を高めるために使用し得る、当該技術分野で知られたアジュバントには、接種される種に依存して、限定されないが、フロイント（完全及び不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル剤、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、スカシ貝ヘモシアニン、ジニトロフェノールのような界面活性物質、並びにＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）及びコリネバクテリウム・パルブム（corynebacterium parvum）のような、潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。このようなアジュバントは、抗原を局所の貯蔵部位（deposit）に隔離することによってその速やかな拡散からそれを防ぐ場合もあれば、マクロファージにとって走化性である因子や免疫系の他の成分を分泌するように宿主を刺激する物質を含有する場合もある。好ましくは、ポリペプチドを投与するならば、免疫化のスケジュールは、該ポリペプチドの２回以上の投与が数週にわたって行われることを伴う。
[0100] 選択されるアイソフォーム及び／又はペプチド、又は所望のタンパク質を発現する生細胞又は細胞調製物を含み得るＰＴＫ７免疫原（例、可溶性ＰＴＫ７又はｓＰＴＫ７）での動物の免疫化の後で、その動物より、当該技術分野で公知の技術を使用して、抗体及び／又は抗体産生細胞を入手することができる。いくつかの態様では、動物を出血させるか又は犠牲にすることによってポリクローナル抗ＰＴＫ７抗体含有血清を入手する。この血清は、動物より入手した形態で研究目的に使用しても、あるいは、この抗ＰＴＫ７抗体を部分的又は完全に精製して、免疫グロブリン画分又は同種の抗体調製物を提供してもよい。
ｃ．モノクローナル抗体
[0101] 本発明のある側面と併せてポリクローナル抗体を使用してよいが、好ましい態様は、ＰＴＫ７反応性モノクローナル抗体の使用を含む。本明細書に使用するように、「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」という用語は、実質的に同種の抗体の集団より得られる抗体を意味し、即ち、この集団を含んでなる個々の抗体は、微量で存在し得る可能な突然変異（例、天然に存在する突然変異）以外は、同一である。このように、「モノクローナル」という修飾語は、別々の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示して、どの種類の抗体と併せて使用してもよい。ある態様において、そのようなモノクローナル抗体には、ＰＴＫ７と結合又は会合するポリペプチド配列を含んでなる抗体が含まれて、ここでＰＴＫ７結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択が含まれる方法によって入手される。
[0102] 好ましい態様では、免疫化した動物より単離した細胞より抗体産生細胞株を調製する。免疫化の後で、その動物を犠牲にして、付帯の「実施例」に示すような、当該技術分野で周知の手段によって、リンパ節及び／又は脾臓Ｂ細胞を不死化する。細胞を不死化する方法には、限定されないが、それらを発癌遺伝子でトランスフェクトすること、それらを発癌ウイルスに感染させて不死化細胞を選別する条件の下でそれらを培養すること、それらを発癌性化合物又は変異原性化合物へ処すること、それらを不死化細胞（例、骨髄腫細胞）と融合すること、及び腫瘍抑制遺伝子を不活性化することが含まれる。骨髄腫細胞との融合を使用する場合、骨髄腫細胞は、好ましくは、免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌細胞株）。下記の「実施例」に示すように、ＰＴＫ７（選択されるアイソフォームが含まれる）又はその免疫反応性部分を使用して、不死化細胞をスクリーニングしてよい。好ましい態様において、最初のスクリーニングは、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又はラジオイムノアッセイを使用して実施する。
[0103] より一般的には、ハイブリドーマ、組換え技術、ファージディスプレイ技術、酵母ライブラリー、トランスジェニック動物（例、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）又はＨｕＭＡｂ Ｍｏｕｓｅ（登録商標））、又はこれらの何らかの組み合わせが含まれる、当該技術分野で公知の多種多様な技術を使用して、本発明に一致した別々のモノクローナル抗体を製造することができる。例えば、上記に概括的に記載されて、Harlow et al.「抗体：実験マニュアル（Antibodies：A Laboratory Manual）」（コールドスプリングハーバーラボラトリー出版局、第2版、1988）；「モノクローナル抗体とＴ細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas）」（エルセヴィエ、ニューヨーク、1981）中、Hammerling, et al., 563-681（このそれぞれは、本明細書に組み込まれる）においてより詳しく教示されるようなハイブリドーマ技術を使用して、モノクローナル抗体を製造することができる。開示されるプロトコールを使用して、好ましくは、関連の抗原とアジュバントの多数の皮下又は腹腔内注射によって、抗体を哺乳動物中で産生する。先に考察したように、この免疫化は、活性化された脾臓細胞又はリンパ球からの抗原反応性抗体（免疫化動物がトランスジェニックであれば、完全にヒトのものであり得る）の産生を含む免疫応答を概ね誘発する。生じる抗体は、この動物の血清より採取してポリクローナル調製物を提供し得るが、一般的には、脾臓、リンパ節、又は末梢血より個々のリンパ球を単離して、モノクローナル抗体の同種調製物を提供することがより望ましい。最も典型的には、脾臓よりリンパ球を入手して不死化して、ハイブリドーマを提供する。
[0104] 例えば、上記に記載のように、この選択法は、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、又は組換えＤＮＡクローンのプールのような複数のクローンからのユニークなクローンの選択であり得る。例えば、標的への親和性を高める、標的結合配列をヒト化する、細胞培養中でのその産生を改善する、その in vivo での免疫原性を低下させる、多重特異性抗体を創出する、等のために選択したＰＴＫ７結合配列をさらに改変することができること、そしてその改変した標的結合配列を含んでなる抗体も本発明のモノクローナル抗体であることが理解されるべきである。異なる決定基（エピトープ）に対して指向された別々の抗体が典型的には含まれるポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対して指向される。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には、交差反応性であり得る他の免疫グロブリンがそこに混在していない点で有利である。
ｄ．キメラ抗体
[0105] 別の態様において、本発明の抗体は、少なくとも２つの異なる種又は型の抗体からの共有結合したタンパク質セグメントに由来するキメラ抗体を含んでよい。本明細書に使用するように、「キメラ抗体」という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特別な種に由来するか又は特別な抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応配列と同一又は相同である一方で、この鎖（複数）の残りは、別の種に由来するか又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体、並びにそのような抗体の断片（それらが所望される生理活性を示す限りにおいて）の中の対応配列と同一又は相同である構築体へ向けられると理解されよう（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)）。１つの例示態様において、本明細書の教示に従うキメラ抗体は、マウスのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列とヒトの供給源に由来する定常領域を含んでよい。他の適合可能な態様において、本発明のキメラ抗体は、下記に記載のようなＣＤＲ移植抗体又はヒト化抗体を含んでよい。
[0106] 一般的に言えば、キメラ抗体を作製する目標は、企図される被検者種からのアミノ酸の数が最大化されたキメラを創出することである。１つの例は、ＣＤＲ移植抗体であって、ここでこの抗体は、特別な種に由来するか又は特別な抗体クラス又はサブクラスに属する１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む一方で、この抗体鎖（複数）の残りは、別の種に由来するか又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応配列と同一又は相同である。ヒトにおける使用のためには、齧歯動物の抗体からの可変領域又は選択ＣＤＲをしばしばヒト抗体の中へ移植して、ヒト抗体の天然に存在する可変領域又はＣＤＲに置き換える。これらの構築体は、一般的には、最強のモジュレーター機能（例、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、等）を提供する一方で、この抗体に対する被検者による望まれない免疫応答を低下させるという利点を有する。
ｅ．ヒト化抗体
[0107] ＣＤＲ移植抗体に似ているのがヒト化抗体である。一般的に言えば、ヒト化抗体は、初めは非ヒト動物において作製されたモノクローナル抗体より産生する。本明細書に使用するように、非ヒト（例、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体である。１つの態様において、ヒト化抗体は、レシピエント抗体のＣＤＲからの残基が、所望される特異性、親和性、及び／又は能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長動物のような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基に置き換わっている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント又はアクセプター抗体）である。
[0108] 一般的に言えば、抗体のヒト化は、ドナー抗体とレシピエント抗体の両方の配列相同性及びカノニカル構造の分析を含む。選択態様において、レシピエント抗体は、コンセンサス配列を含む場合がある。ヒトのコンセンサスフレームワークを創出するには、いくつかのヒト重鎖又は軽鎖アミノ酸配列からのフレームワークを並置して、コンセンサスアミノ酸配列を同定してよい。さらに、多くの事例では、ヒト免疫グロブリンの可変ドメイン中の１以上のフレームワーク残基を、ドナー抗体からの対応する非ヒト残基によって置き換える。これらのフレームワーク置換は、当該技術分野で周知の方法によって（例えば、ＣＤＲ残基とフレームワーク残基の相互作用をモデル化して、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定すること、及び特別な位置での異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって）確認される。このような置換は、移植ＣＤＲ（複数）の適正な三次元配置を維持するのに役立ち、フレームワーク置換のない類似の構築体に優って親和性をしばしば改善する。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体やドナー抗体に見出されない残基を含んでよい。これらの修飾を施して、既知の技術を使用して抗体性能をさらに洗練させることができる。
[0109] ＣＤＲ移植抗体とヒト化抗体については、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、５，６９３，７６２号、５，６９３，７６１号、５，５８５，０８９号、及び５，５３０，１０１号に記載されている。概して言えば、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここでそのＣＤＲのすべて又は実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのそれに対応して、フレームワーク領域のすべて又は実質的にすべては、ヒト免疫グロブリン配列のそれである。ヒト化抗体はまた、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれである、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含んでもよい。さらなる詳細については、例えば、Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988)；及び Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992) を参照のこと。また、例えば、Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 :105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)；及び、米国特許第６，９８２，３２１号及び７，０８７，４０９号を参照のこと。なお別の方法は、ヒューマニアリング（humaneering）と呼ばれて、例えば、Ｕ．Ｓ．２００５／０００８６２５に記載されている。本出願の目的では、「ヒト化抗体」という用語には、フレームワーク置換が無いかほとんど無いＣＤＲ移植抗体（即ち、１以上の移植非ヒトＣＤＲを含んでなるヒト抗体）が明白に含まれるものとする。
[0110] 追加的に言えば、非ヒト抗ＰＴＫ７抗体はまた、ＷＯ９８／５２９７６及びＷＯ００／３４３１７に開示される方法による、ヒトＴ細胞エピトープの特異的除去又は脱免疫化によって修飾してよい。簡潔に言えば、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域についてＭＨＣクラスＩＩへ結合するペプチドを解析することができて；これらのペプチドは、潜在的なＴ細胞エピトープ（ＷＯ９８／５２９７６及びＷＯ００／３４３１７において定義されるような）を代表する。潜在的なＴ細胞エピトープの検出には、ペプチドスレディング（peptide threading）と呼ばれるコンピュータモデリングアプローチを適用し得て、加えて、ＷＯ９８／５２９７６及びＷＯ００／３４３１７に記載のように、ＶＨ及びＶＬ配列に存在するモチーフを求めて、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースを検索することができる。これらのモチーフは、１８種の主要ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲアロタイプのいずれへも結合して、それにより潜在的なＴ細胞エピトープを構成する。検出された潜在的なＴ細胞エピトープは、可変領域中の少数のアミノ酸残基を置換することによるか又は単一アミノ酸置換によって消失させることができる。可能な限り、保守的な置換がなされる。しばしば、絶対的ではないが、ヒト生殖細胞株抗体配列中のある位置に共通のアミノ酸を使用してよい。脱免疫化の変化を確認した後で、突然変異誘発又は他の合成法（例、de novo 合成、カセット置換、等）によって、ＶＨ及びＶＬをコードする核酸を構築することができる。突然変異誘発した可変配列をヒト定常領域へ融合させてもよい。
[0111] 選択態様では、ヒト化抗体可変領域残基の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％が親のフレームワーク領域（ＦＲ）及びＣＤＲ配列の残基に対応する。他の態様では、ヒト化抗体残基の少なくとも８５％又は９０％が親のフレームワーク領域（ＦＲ）及びＣＤＲ配列の残基に対応する。さらに好ましい態様では、ヒト化抗体残基の９５％より多くが親のフレームワーク領域（ＦＲ）及びＣＤＲ配列の残基に対応する。
[0112] ヒト化抗体は、本明細書に記載のような通常の分子生物学及び生体分子工学の技術を使用して製造することができる。これらの方法には、重鎖又は軽鎖の少なくとも１つに由来する免疫グロブリンＦｖ可変領域の全部又は一部をコードする核酸配列を単離すること、操作すること、及び発現させることが含まれる。そのような核酸の供給源は、当業者に周知であり、例えば、上記に記載のような、予め決定された標的に対する抗体又は免疫反応性断片を産生するハイブリドーマ、真核細胞、又はファージより、生殖細胞株免疫グロブリン遺伝子より、又は合成構築体より入手し得る。次いで、ヒト化抗体をコードする組換えＤＮＡを適正な発現ベクターの中へクローン化することができる。
[0113] ヒト生殖細胞株配列は、例えば、Tomlinson, I. A. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 776-798; Cook, G. P. et al. (1995) Immunol. Today 16: 237-242; Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Bio. 227: 799-817; 及び Tomlinson et al. (1995) EMBOJ 14: 4628-4638 に開示されている。Ｖ ＢＡＳＥディレクトリは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的なディレクトリを提供する（Retter et al., (2005) Nuc Acid Res 33: 671-674 を参照のこと）。これらの配列は、ヒト配列の（例えば、フレームワーク領域及びＣＤＲのための）供給源として使用することができる。本明細書に説明するように、コンセンサスヒトフレームワーク領域も、例えば、米国特許第６，３００，０６４号に記載のように、使用することができる。
ｆ．ヒト抗体
[0114] 上述した抗体に加えて、当業者は、本発明の抗体が完全ヒト抗体を含み得ることを理解されよう。本出願の目的では、「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって産生される、及び／又は本明細書に開示するようなヒト抗体を作製するための技術のいずれも使用して作製された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する抗体を含む。このヒト抗体の定義では、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体が排除される。
[0115] 当該技術分野で公知の様々な技術を使用して、ヒト抗体を産生することができる。上記に述べたように、ファージディスプレイ技術を使用して、本教示に準拠した免疫活性の結合領域を提供することができる。このように、本発明のある態様は、（好ましくは、ヒト）抗体のライブラリーをファージ上で合成する工程、このライブラリーについて選択されるＰＴＫ７又はその抗体結合部分でスクリーニングする工程、ＰＴＫ７へ結合するファージを単離する工程、及びこのファージより免疫反応性断片を入手する工程を含んでなる、抗ＰＴＫ７抗体又はその抗原結合部分を産生するための方法を提供する。例を挙げると、ファージディスプレイ技術における使用のための抗体ライブラリーを作製するための１つの方法は、ヒト又は非ヒトの免疫グロブリン遺伝子座を含んでなる非ヒト動物を、選択したＰＴＫ７又はその抗原性部分で免疫化して、免疫応答を創出する工程、免疫化した動物より抗体産生細胞を抽出する工程；この抽出した細胞より、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖をコードするＲＮＡを単離する工程、このＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを産生する工程、プライマーを使用してこのｃＤＮＡを増幅する工程、及びこのｃＤＮＡを、抗体がファージ上で発現されるように、ファージディスプレイベクターへ挿入する工程を含む。より具体的には、ＶＨ及びＶＬドメインをコードするＤＮＡをｓｃＦｖリンカーと共にＰＣＲによって組換えて、ファージミドベクター（例、ｐＣＡＮＴＡＢ６又はｐＣｏｍｂ３ＨＳＳ）へクローン化する。次いで、このベクターは、大腸菌（E. coli）中へ電気穿孔させてよく、次いでこの大腸菌にヘルパーファージを感染させる。これらの方法で使用されるファージは、典型的には、ｆｄ及びＭ１３が含まれる繊維状ファージであって、ＶＨ及びＶＬドメインは、通常、ファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩの一方へ組換え的に融合される。
[0116] 上記のように製造した組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって、本発明の組換えヒト抗ＰＴＫ７抗体を単離することができる。好ましい態様において、該ライブラリーは、Ｂ細胞より単離したｍＲＮＡより製造されるヒトのＶＬ及びＶＨｃＤＮＡを使用して産生される、ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーである。当該技術分野では、このようなライブラリーを製造してスクリーニングする方法が周知であり、ファージディスプレイライブラリーを産生するためのキットが市販されている（例えば、ファルマシア社の組換えファージ抗体システム（Recombinant Phage Antibody System）、カタログ番号：２７−９４００−０１；及び、Stratagene のＳｕｒｆＺＡＰＴＭファージディスプレイキット、カタログ番号：２４０６１２）。抗体ディスプレイライブラリーを産生してスクリーニングするのに使用し得る他の方法及び試薬も存在する（例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公開公報番号：ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０；Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993); Hawkins et. al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580 (1992); Garrad et al., Bio/Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nuc. Acid Res. 19:4133-4137 (1991); 及び Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991) を参照のこと）。
[0117] ナイーブライブラリー（天然又は合成のいずれか）によって産生される抗体は、中等度の親和性（約１０６〜１０７Ｍ−１のＫａ）であり得るが、当該技術分野で記載されるような二次ライブラリーより構築して再選択することによって、親和性成熟も in vitro で模倣することができる。例えば、Hawkins et. al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992) の方法において、又は Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992) の方法において、エラーを起こしやすい（error-prone）ポリメラーゼ（Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989) に報告されている）を使用することによって、突然変異を in vitro で無作為に導入することができる。追加的に言えば、例えば、選択した個々のＦｖクローンにおいて、対象のＣＤＲが含まれるランダム配列を担うプライマーでＰＣＲを使用して１以上のＣＤＲを無作為に突然変異させて、より高親和性のクローンをスクリーニングすることによって、親和性成熟を実施することができる。ＷＯ９６０７７５４は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域中に突然変異誘発を引き起こして、軽鎖遺伝子のライブラリーを創出するための方法について記載した。別の有効なアプローチは、Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992) に記載のように、ファージディスプレイによって選択されるＶＨ又はＶＬドメインを、非免疫化ドナーより得られる天然に存在するＶドメイン変異体のレパートリーと組換えて、数回の鎖リシャッフリング（chain reshuffling）においてより高い親和性をスクリーニングすることである。この技術により、解離定数：Ｋｄ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が約１０−９Ｍ以下である抗体及び抗体断片の産生が可能になる。
[0118] 結合対をその表面に発現する真核細胞（例、酵母）を含んでなるライブラリーを使用して同様の手順を利用し得ることがさらに理解されよう。ファージディスプレイ技術と同様に、この真核細胞ライブラリーを対象の抗原（即ち、ＰＴＫ７）に対してスクリーニングして、候補結合対を発現する細胞を単離してクローン化する。ライブラリー内容を最適にすることと反応性結合対の親和性成熟のために種々の工程を講じてよい。例えば、米国特許第７，７００，３０２号及び米国仮特許出願シリアル番号：１２／４０４，０５９を参照のこと。１つの態様において、ヒト抗体は、ファージライブラリーより選択されて、ここでそのファージライブラリーは、ヒト抗体を発現する（Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks et al., J. MoI. Biol, 222:581 (1991)）。他の態様では、酵母のような真核細胞において産生されるコンビナトリアル抗体ライブラリーよりヒト結合対を単離してよい。例えば、米国特許第７，７００，３０２号を参照のこと。このような技術は、有利にも、多数の候補モジュレーターのスクリーニングを可能にして、候補配列の相対的に容易な操作（例えば、親和性成熟又は組換えシャッフリング（recombinant shuffling）による）を提供する。
[0119] ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物（例えば、内因性の免疫グロブリン遺伝子が一部又は完全に不活性化されたマウス）の中へ導入することによって作製することができる。抗原チャレンジすると、ヒト抗体産生が観測されて、これは、遺伝子再編成、アセンブリー、及び抗体レパートリーを含めて、ヒトで見られるものとすべての点で酷似している。このアプローチについては、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；５，５４５，８０６号；５，５６９，８２５号；５，６２５，１２６号；５，６３３，４２５号；５，６６１，０１６号に記載され、ゼノマウス（Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ）（登録商標）技術に関しては、以下の科学文献とともに米国特許第６，０７５，１８１号及び６，１５０，５８４号に記載されている：Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対して指向された抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化により産生してよい（このようなＢリンパ球は、新生物障害に罹患している個体より回収してもよく、in vitro で免疫化してもよい）。例えば、Cole et al.「モノクローナル抗体と癌療法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）」 Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol, 147 (l):86-95 (1991); 及び米国特許第５，７５０，３７３号を参照のこと。
ＶＩ．抗体の特徴
[0120] 当該抗体モジュレーターをどのように入手したとしても、またそれが上述した形態（例、ヒト化、ヒト、等）のいずれを採るとしても、開示モジュレーターの好ましい態様は、様々な特徴を示す可能性がある。この点に関して言えば、抗ＰＴＫ７抗体産生細胞（例、ハイブリドーマ又は酵母コロニー）を、例えば、活発な増殖、高い抗体産生、及び（下記により詳しく考察するような）望ましい抗体特徴が含まれる望ましい特徴について選択し、クローン化して、さらにスクリーニングしてよい。ハイブリドーマは、同系遺伝子の動物、免疫系を欠損している動物（例、ヌードマウス）において in vivo で、又は細胞培養において in vitro で拡充させることができる。そのそれぞれが別々の抗体種を産生するハイブリドーマ及び／又はコロニーを選択する、クローン化する、及び拡充させる方法は、当業者に周知である。
ａ．中和抗体
[0121] 特に好ましい態様において、本発明のモジュレーターは、中和抗体又はその誘導体若しくは断片を含む。「中和抗体」又は「中和アンタゴニスト」という用語は、ＰＴＫ７へ結合するか又はそれと相互作用してリガンドのその結合相手への結合又は会合を防ぎ、それによってこれら分子の相互作用より生じるはずの生体応答（例、リン酸化又はＶＥＧＦ誘発性の血管新生）を妨害する抗体又はアンタゴニストを意味する。抗体又はその免疫学的に機能的な断片若しくは誘導体の結合と特異性について評価する場合、抗体又は断片がリガンドのその結合相手又は基質への結合を実質的に阻害するのは、例えば、選択基質のリン酸化（Shin et al., Biochem and Biophys Res Com, Vol. 371:4）によるか又は in vitro 競合結合アッセイで測定されるように、過剰の抗体が標的分子へ結合する結合相手の量を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％以上低下させるときである。例えば、ＰＴＫ７に対する抗体の場合、中和抗体又はアンタゴニストは、好ましくは、特定の基質に関するＰＴＫ７のリン酸化能力を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％以上減少させる。この減少した活性は、当該技術分野で認められた技術を使用して直接測定しても、そのような低下が血管新生のような二次活性に及ぼす影響によって測定してもよいと理解されよう。
ｂ．内在化抗体
[0122] ＰＴＫ７又はその選択されるアイソフォームが可溶型で存在し得ることを示す証拠はあるが、少なくともある種のＰＴＫ７は、細胞表面と会合したままの状態にあることにより開示モジュレーターの内在化を可能にするようである。従って、本発明の抗ＰＴＫ７抗体は、ＰＴＫ７を発現する細胞によって、少なくともある程度は、内在化され得る。例えば、腫瘍始原細胞の表面上のＰＴＫ７へ結合する抗ＰＴＫ７抗体は、腫瘍始原細胞によって内在化され得る。特に好ましい態様では、そのような抗ＰＴＫ７抗体を、内在化と同時に該細胞を殺傷する細胞傷害性部分のような抗癌剤と会合させるか又はそれへコンジュゲートさせてよい。
[0123] 本明細書に使用するように、内在化する抗ＰＴＫ７抗体とは、哺乳動物細胞と会合したＰＴＫ７への結合時にその細胞によって取り込まれるものである。この内在化抗体には、抗体断片、ヒト又はヒト化抗体、及び抗体コンジュゲートが含まれる。内在化は、in vitro でも in vivo でも起こり得る。療法上の応用では、内在化が in vivo で起こり得る。内在化される抗体分子の数は、ＰＴＫ７発現細胞、特にＰＴＫ７発現腫瘍始原細胞を殺傷するのに十分又は充分であり得る。抗体又は抗体コンジュゲートの効力に依っては、いくつかの事例において、抗体が結合する標的細胞を殺傷するのに、該細胞への単一の抗体分子の取込みで十分である。例えば、ある毒素は、殺傷においてきわめて強力であるので、腫瘍細胞を殺傷するには、抗体へコンジュゲートした毒素の１分子の内在化で十分である。抗ＰＴＫ７抗体が哺乳動物細胞上のＰＴＫ７への結合時に内在化されるかどうかは、下記の実施例（例、実施例１２及び１３）に記載されるものが含まれる様々なアッセイによって決定することができる。抗体が細胞中へ内在化されるかどうかを検出する方法については、その全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，６１９，０６８号にも記載されている。
ｃ．枯渇性抗体
[0124] 他の好ましい態様において、本発明のモジュレーターは、枯渇性抗体又はその誘導体若しくは断片を含む。「枯渇性抗体」という用語は、細胞表面の上又は近くにあるＰＴＫ７へ結合するか又はそれと会合して、該細胞の死滅、無能化、又は消失を（例えば、補体依存性細胞傷害又は抗体依存性細胞傷害によって）誘発する、促進する、又は引き起こす抗体又は断片を意味する。下記により詳しく考察するいくつかの態様において、選択した枯渇性抗体は、細胞傷害剤へ会合又はコンジュゲートされる。好ましくは、枯渇性抗体は、ある一定の細胞集団において、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％の腫瘍永続化細胞を除去する、無能化する、消失させる、又は殺傷することができよう。いくつかの態様において、この細胞集団は、濃縮、分画、精製、又は単離された腫瘍永続化細胞を含んでよい。他の態様において、この細胞集団は、腫瘍永続化細胞を含む腫瘍試料全体又は異種の腫瘍抽出物を含んでよい。当業者は、下記の実施例（例、実施例１３及び１４）に記載のような標準の生化学技術を本明細書の教示に従って使用して、腫瘍形成細胞又は腫瘍永続化細胞の枯渇をモニターして定量し得ることを理解されよう。
ｄ．エピトープ結合
[0125] 開示される抗ＰＴＫ７抗体は、選択された標的（複数）によって提示される別々のエピトープ又は決定基と会合するか又はそれへ結合するとさらに理解されよう。本明細書に使用するように、「エピトープ」という用語は、特別の抗体によって認識されて特異的に結合されることが可能な標的抗原のその部分を意味する。抗原がＰＴＫ７のようなポリペプチドである場合、エピトープは、連続したアミノ酸からも、タンパク質の三次元フォールディングによって並列される不連続アミノ酸からも形成され得る。連続したアミノ酸より形成されるエピトープがタンパク質の変性時にも典型的には保持されるのに対し、三次元フォールディングによって形成されるエピトープは、タンパク質の変性時に典型的には失われる。エピトープには、典型的には、少なくとも３個、そしてより通常は、少なくとも５又は８〜１０個のアミノ酸が独自の空間コンホメーションに含まれる。より具体的には、当業者は、エピトープという用語には、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体へ特異結合するか又は他の方法で分子と相互作用することが可能などのタンパク質決定基も含まれると理解されよう。エピトープの決定基は、一般的には、アミノ酸又は炭水化物又は糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面配置（grouping）からなり、一般的には、特異的な三次元構造上の特性、並びに特異的な荷電特性を有する。追加的に言えば、エピトープは、線状でも高次構造状でもよい。線状エピトープでは、該タンパク質と相互作用分子（抗体のような）の間の相互作用点のすべてが該タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線状に生じる。高次構造状エピトープでは、相互反応の点が、直線的には互いに分離しているタンパク質上のアミノ酸残基の全域で生じる。
[0126] 抗原上の所望のエピトープが決定されたならば、例えば、本発明に記載の技術を使用して、該エピトープを含んでなるペプチドで免疫化することによって、そのエピトープに対する抗体を産生することが可能である。あるいは、この探索プロセスの間に、抗体の産生及び特性決定によって、望ましいエピトープに関する情報を解明することができる。次いで、この情報より、同じエピトープへ結合する抗体を競合的にスクリーニングすることが可能である。このことを達成するアプローチは、競合試験を実施して、互いに競合的に結合する抗体（即ち、この抗体は、抗原への結合に関して競合する）を見出すことである。ＷＯ０３／４８７３１には、それらの交差競合性に基づいて抗体をビニングする（binning）ためのハイスループット法が記載されている。
[0127] 本明細書に使用するように、「ビニング（binning）」という用語は、それらの抗原結合特性に基づいて抗体を群分けするための方法を意味する。ビンの割当ては、試験した抗体の観測された結合パターンがどのくらい異なるかに依存して、やや恣意的である。このように、この技術は、本発明の抗体を分類するのに有用なツールであるが、そのビンは、必ずしも直にエピトープと相関するものではないので、エピトープ結合についてのそのような初めの決定は、本明細書に記載のような当該技術分野で認められた他の方法論によってさらに確かめるべきである。
[0128] この注意事項に留意して、選択した一次抗体（又はその断片）が同じエピトープへ結合するのかどうか、又は結合に関して二次抗体と交差競合するのかどうかを、当該技術分野で公知であり、且つ本明細書の実施例において説明される方法を使用することによって決定することができる。１つの態様では、本発明の一次抗体を飽和条件の下でＰＴＫ７へ結合させることが可能であり、次いでＰＴＫ７へ結合する二次抗体の能力を測定する。この試験抗体が一次の抗ＰＴＫ７抗体と同時にＰＴＫ７へ結合することが可能であれば、その二次抗体は、一次抗体と異なるエピトープへ結合する。しかしながら、二次抗体が同時にＰＴＫ７へ結合することができなければ、二次抗体は、同じエピトープ、一部重なるエピトープ、又は一次抗体が結合するエピトープのごく近傍にあるエピトープへ結合する。当該技術分野で公知であり、下記の実施例において詳述されるように、所望のデータは、固相の直接又は間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相の直接又は間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ、ＢｉａｃｏｒｅＴＭシステム（即ち、表面プラズモン共鳴法−GE Healthcare）、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ（即ち、バイオレイヤー干渉法−ForteBio 社）、又はフローサイトメトリー法を使用して入手することができる。本明細書に使用する「表面プラズモン共鳴法」という用語は、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出による、リアルタイムの生体特異的な相互作用の分析を可能にする光学現象に関連する。特に好ましい態様において、この分析は、下記の実施例において証明されるように、Ｂｉａｃｏｒｅ又はＦｏｒｔｅＢｉｏ機器を使用して実施する。
[0129] 抗体の文脈において使用される場合の「競合する」という用語は、試験下の抗体又は免疫学的に機能的な断片が共通抗原に対する参照抗体の特異結合を防ぐか又は阻害するアッセイにおいて決定されるような、抗体間の競合を意味する。典型的には、そのようなアッセイは、上記抗体のいずれかを担う固体表面又は細胞へ結合する精製抗原、非標識の被検免疫グロブリン、及び標識された参照免疫グロブリンの使用を伴う。競合阻害は、被検免疫グロブリンの存在下でこの固体表面又は細胞へ結合する標識の量を定量することによって測定する。通常、この被検免疫グロブリンは、過剰に存在する。競合アッセイによって同定される抗体（競合抗体）には、参照抗体と同じエピトープへ結合する抗体と、参照抗体が結合するエピトープに対して立体障害が起こるほど十分近傍にある隣接エピトープへ結合する抗体が含まれる。競合結合を決定するための方法に関する追加の詳細を本明細書の実施例に提供する。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、それは、参照抗体の共通抗原への特異結合を少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、又は７５％阻害する。ある事例では、結合が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９７％以上阻害される。
[0130] エピトープ特異性以外に、開示される抗体は、いくつかの異なる物理特性（例えば、結合親和性、融点（Ｔｍ）、及び等電点が含まれる）を使用して、特性決定してよい。
ｅ．結合親和性
[0131] この点に関して言えば、本発明には、選択されるＰＴＫ７に対して（又は、汎抗体の場合は、１種より多いＰＴＫ７に対して）高い結合親和性を有する抗体の使用がさらに含まれる。本発明の抗体がその標的抗原へ特異的に結合すると言われるのは、解離定数：Ｋｄ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が≦１０−８Ｍであるときである。この抗体は、Ｋｄが≦５ｘ１０−９Ｍであるときには高い親和性で、そしてＫｄが≦５ｘ１０−１０Ｍであるときはきわめて高い親和性で抗原へ特異的に結合する。本発明の１つの態様において、該抗体は、１０−９Ｍ以下のＫｄと約１ｘ１０−４／秒のオフ速度を有する。本発明の１つの態様において、オフ速度は、＜１ｘ１０−５／秒である。本発明の他の態様において、該抗体は、ＰＴＫ７へ約１０−８Ｍと１０−１０Ｍの間のＫｄで結合して、なお別の態様において、それは、２ｘ１０−１０Ｍ以下のＫｄで結合する。本発明のなお他の選択される態様は、１０−２Ｍ未満、５ｘ１０−２Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５ｘ１０−３Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５ｘ１０−４Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５ｘ１０−５Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５ｘ１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５ｘ１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５ｘ１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５ｘ１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５ｘ１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５ｘ１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５ｘ１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５ｘ１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５ｘ１０−１４Ｍ未満、１０−１５Ｍ未満、又は５ｘ１０−１５Ｍ未満の解離定数又はＫｄ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有する抗体を含む。
[0132] 具体的態様において、ＰＴＫ７へ免疫特異的に結合する本発明の抗体は、少なくとも１０５Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも２ｘ１０５Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも５ｘ１０５Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも１０６Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも５ｘ１０６Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも１０７Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも５ｘ１０７Ｍ−ｌｓ−ｌ、又は少なくとも１０８Ｍ−ｌｓ−ｌの会合速度定数又はｋｏｎ速度（ＰＴＫ７（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）ｋ ｏｎ←Ａｂ−Ａｇ）を有する。
[0133] 別の態様において、ＰＴＫ７へ免疫特異的に結合する本発明の抗体は、ｌ０−ｌｓ−ｌ未満、５ｘｌ０−ｌｓ−ｌ未満、ｌ０−２ｓ−ｌ未満、５ｘｌ０−２ｓ−ｌ未満、ｌ０−３ｓ−ｌ未満、５ｘｌ０−３ｓ−ｌ未満、ｌ０−４ｓ−ｌ未満、５ｘｌ０−４ｓ−ｌ未満、ｌ０−５ｓ−ｌ未満、５ｘｌ０−５ｓ−ｌ未満、ｌ０−６ｓ−ｌ未満、５ｘｌ０−６ｓ−ｌ未満、ｌ０−７ｓ−ｌ未満、５ｘｌ０−７ｓ−ｌ未満、ｌ０−８ｓ−ｌ未満、５ｘｌ０−８ｓ−ｌ未満、ｌ０−９ｓ−ｌ未満、５ｘｌ０−９ｓ−ｌ、又はｌ０−１０ｓ−未満の解離速度定数又はｋｏｆｆ速度（ＰＴＫ７（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）ｋ ｏｆｆ←Ａｂ−Ａｇ）を有する。
[0134] 本発明の他の選択態様において、抗ＰＴＫ７抗体は、少なくとも１０２Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０２Ｍ−１、少なくとも１０３Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０３Ｍ−１、少なくとも１０４Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０４Ｍ−１、少なくとも１０５Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０５Ｍ−１、少なくとも１０６Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０６Ｍ−１、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０１３Ｍ−１、少なくとも１０１４Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０１４Ｍ−１、少なくとも１０１５Ｍ−１、又は少なくとも５ｘ１０１５Ｍ−１の親和定数又はＫａ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）を有する。
ｆ．等電点
[0135] 上述した結合特性に加えて、抗ＰＴＫ７抗体とその断片は、すべてのポリペプチドのように、一般的にはポリペプチドが実効電荷を担わないときのｐＨとして定義される、等電点（ｐＩ）を有する。当該技術分野では、溶液のｐＨがタンパク質の等電点（ｐＩ）に等しい場合、典型的には該タンパク質の溶解度が最低になることが知られている。故に、抗体中のイオン化可能な残基の数と位置を改変してｐＩを調整することによって溶解度を最適化することが可能である。例えば、ポリペプチドのｐＩは、適正なアミノ酸置換を施すことによって（例えば、アラニンのような非電荷残基にリジンのような荷電アミノ酸を代用することによって）操作することができる。どの特別な理論にも束縛されることを望まずに言えば、抗体のｐＩの変化をもたらす前記抗体のアミノ酸置換は、該抗体の溶解度及び／又は安定性を改善する場合がある。当業者は、ある特別な抗体が所望のｐＩを達成するのにどのアミノ酸置換が最も適正であるかを理解されよう。
[0136] タンパク質のｐＩは、限定されないが、等電点電気泳動と様々なコンピュータアルゴリズムが含まれる多様な方法によって決定することができる（例えば、Bjellqvist et al., 1993, Electrophoresis 14: 1023 を参照のこと）。１つの態様において、本発明の抗ＰＴＫ７抗体のｐＩは、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、又は約９．０の間かそれより高い。別の態様において、本発明の抗ＰＴＫ７抗体のｐＩは、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、又は９．０の間かそれより高い。なお別の態様において、本発明の抗体のｐＩの改変をもたらす置換は、ＰＴＫ７へのその結合親和性を有意には減少させない。下記により詳しく考察するように、具体的には、ＦｃγＲへの結合の改変をもたらすＦｃ領域の置換（複数）は、ｐＩの変化ももたらす場合があると考慮される。好ましい態様では、所望されるＦｃγＲ結合の改変とｐＩの所望されるあらゆる変化をともに有効にするように、Ｆｃ領域の置換（複数）が具体的に選択される。本明細書に使用するように、ｐＩ値は、優勢な荷電形状のｐＩとして定義される。
ｇ．熱安定性
[0137] 抗体のＦａｂドメインのＴｍは、抗体の熱安定性の良好な指標であり得、さらに貯蔵寿命の指標となり得ることがさらに理解されよう。Ｔｍは、所与のドメイン又は配列の５０％アンフォールディングの温度に他ならない。Ｔｍが低いほどより多くの凝集／より少ない安定性を示すのに対し、Ｔｍが高いほど、より少ない凝集／より大きな安定性を示す。従って、より高いＴｍを有する抗体又はその断片若しくは誘導体が好ましい。さらに、当該技術分野で認められた技術を使用して、抗ＰＴＫ７抗体又はそのドメインの組成を改変して、分子安定性を高めるか又は最適化することが可能である。例えば、米国特許第７，９６０，１４２号を参照のこと。このように、１つの態様において、選択した抗体のＦａｂドメインは、少なくとも５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、１００℃、１０５℃、１１０℃、１１５℃、又は１２０℃より高いＴｍ値を有する。別の態様において、抗体のＦａｂドメインは、少なくとも約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃、約９５℃、約１００℃、約１０５℃、約１１０℃、約１１５℃又は約１２０℃より高いＴｍ値を有する。当該技術分野で知られたどの標準法も使用して、例えば、示差走査熱量測定（例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれる、Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 78: 394-404; Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 79: 2150-2154 を参照のこと）によって、タンパク質ドメイン（例、Ｆａｂドメイン）の熱融解温度（Ｔｍ）を測定することができる。
ＶＩＩ．ＰＴＫ７モジュレーターの断片及び誘導体
[0138] 本発明の薬剤が、インタクト融合構築体、抗体、断片、又は誘導体のいずれを含むとしても、選択したモジュレーターは、ＰＴＫ７と反応する、結合する、組み合わさる、複合する、接続する、付着する、一緒になる、相互作用する、又は他の方法で会合して、それによって所望の抗新生物効果をもたらす。当業者は、抗ＰＴＫ７抗体を含んでなるモジュレーターが該抗体上で発現される１以上の結合部位を介してＰＴＫ７と相互作用するか又は会合することを理解されよう。より具体的には、本明細書に使用するように、「結合部位」という用語は、対象の標的分子（例、酵素、抗原、リガンド、受容体、基質、又は阻害剤）へ選択的に結合することの原因となるポリペプチドの領域を含む。結合ドメインは、少なくとも１つの結合部位を含む（例えば、インタクトＩｇＧ抗体は、２つの結合ドメインと２つの結合部位を有するものである）。例示の結合ドメインには、抗体の可変ドメイン、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメイン、又は酵素ドメインが含まれる。本発明の目的では、ＰＴＫ７の典型的な活性領域は、（例えば、Ｆｃ−ＰＴＫ７融合構築体の一部として）基質の結合部位を含み得るか又はリン酸化を促進し得る。
ａ．断片
[0139] 本発明を実施するのに、どの形態のモジュレーター（例、キメラ、ヒト化、等）を選択しても、その免疫反応性断片は、本明細書の教示に従って使用し得ると理解されよう。最も広義において、「抗体断片」という用語は、インタクト抗体（例、天然に存在する免疫グロブリン）の少なくとも一部を含む。より具体的には、「断片」という用語は、インタクト又は完全な抗体又は抗体鎖より少ないアミノ酸残基を含んでなる抗体又は抗体鎖（又は、Ｆｃ融合体の場合はＰＴＫ７分子）の一部又は部分を意味する。「抗原結合断片」という用語は、抗原と結合するか又はインタクト抗体と（即ち、それらが導かれたインタクト抗体と）抗原結合（即ち、特異結合）について競合する、免疫グロブリン又は抗体のポリペプチド断片を意味する。本明細書に使用するように、「抗体分子の断片」という用語には、抗体の抗原結合断片、例えば、抗体軽鎖（ＶＬ）、抗体重鎖（ＶＨ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単ドメイン抗体断片、二重特異性抗体、線状抗体、単鎖抗体分子、及び抗体断片より生成される多重特異性抗体が含まれる。同様に、ＰＴＫ７の活性断片は、ＰＴＫ７基質又は受容体と相互作用してインタクトＰＴＫ７のそれと似た様式でそれらを修飾する（例えば、リン酸化−やや低い効率であるかもしれないが）その能力を保持するＰＴＫ７分子の一部を含む。
[0140] 当業者は、インタクト又は完全なモジュレーター（例、抗体又は抗体鎖）の化学的又は酵素的処理によるか又は組換え手段によって断片を入手し得ることを理解されよう。この点に関して言えば、インタクト抗体の消化の点から様々な抗体断片が規定されるが、当業者は、そのような断片を化学的に、又は組換えＤＮＡの方法論を使用することによって de novo 合成し得ることを理解されよう。このように、本明細書に使用する抗体という用語には、抗体全体の修飾によって産生されるか又は組換えＤＮＡの方法論を使用して de novo 合成される抗体又はその断片若しくは誘導体が明白に含まれる。
[0141] より具体的には、抗体のパパイン消化は、それぞれに単一の抗原結合部位がある、Ｆａｂ断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、残余のＦｃ断片（この名称は、容易に結晶するその能力を反映する）を産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有して、依然として抗原と交差結合することが可能であるＦ（ａｂ’）２断片を生じる。Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１以上のシステインが含まれる重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基（複数）が少なくとも１つのフリーチオール基を担うＦａｂ’の明示である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングについても知られている。他の抗体断片のより詳しい記載については、例えば「基礎免疫学（Fundamental Immunology）」W. E. Paul（監修）レイブン・プレス、ニューヨーク（1999）を参照のこと。
[0142] Ｆｖ断片が完全な抗原認識及び結合部位を含有する抗体断片であることがさらに理解されよう。この領域は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインが緊密に会合した（これは、天然では、例えばｓｃＦｖでは、共有結合性であり得る）二量体からなる。それぞれの可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を規定するのは、この配置においてである。この６つのＣＤＲ又はその亜集合は、集合的に、抗体へ抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなる、Ｆｖの半分）でも、通常は完全な結合部位より低い親和性であるものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
[0143] 他の態様において、抗体断片は、例えば、Ｆｃ領域を含んで、ＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能、及び補体結合といった、インタクト抗体中に存在しているときのＦｃ領域に普通は関連する生体機能の少なくとも１つを保持するものである。１つの態様において、抗体断片は、インタクト抗体に実質的に類似した in vivo 半減期を有する一価抗体である。例えば、そのような抗体断片は、その断片へ in vivo 安定性を付与することが可能なＦｃ配列へ連結した抗原結合アームを含む場合がある。
ｂ．誘導体
[0144] 別の態様では、本発明のモジュレーターが一価でも多価（例、二価、三価、等）でもよいことがさらに理解されよう。本明細書に使用するように、「結合価」という用語は、抗体と会合する潜在的な標的（即ち、ＰＴＫ７）結合部位の数を意味する。それぞれの標的結合部位は、１つの標的分子、又は標的分子上の特定の位置又は座へ特異的に結合する。本発明の抗体が１より多い標的結合部位を含む（多価）とき、それぞれの標的結合部位は、同じ分子か又は異なる分子へ特異的に結合し得る（例えば、異なるリガンド又は異なる抗原へ、又は同じ抗原上の異なるエピトープ又は位置へ結合し得る）。本発明の目的では、主題の抗体は、好ましくは、ヒトＰＴＫ７に特異的な少なくとも１つの結合部位を有する。１つの態様において、本発明の抗体は、その分子のそれぞれの結合部位が単一のＰＴＫ７の位置又はエピトープへ特異的に結合するという点で一価であろう。他の態様において、該抗体は、それらが１より多い結合部位と、単一より多い位置又はエピトープと特異的に会合する異なる結合部位を含むという点で多価であろう。そのような場合は、選択したＰＴＫ７ポリペプチド又はスプライス変異体に多重エピトープが存在し得るか、又はＰＴＫ７上に単一エピトープが存在し得る一方で、別の分子又は表面上に第二の異なるエピトープが存在し得る。例えば、米国特許第２００９／０１３０１０５号を参照のこと。
[0145] 上記に述べたように、多価抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープへ免疫特異的に結合しても、標的分子だけでなく、異種ポリペプチドのような異種エピトープ又は固体支持材料へも免疫特異的に結合してよい。抗ＰＴＫ７抗体の好ましい態様は、２つの抗原だけに結合する（即ち、二重特異性抗体）が、本発明には、三重特異性抗体のような追加の特異性がある抗体も含まれる。二重特異性抗体の例には、限定なしに、一方のアームがＰＴＫ７へ対して指向されて、他のアームが他のあらゆる抗原（例、モジュレーター細胞マーカー）に対して指向されるものが含まれる。当該技術分野では、二重特異性抗体を作製するための方法が知られている。完全長の二重特異性抗体の従来的な産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づき、ここでこの２つの鎖は、異なる特異性を有する（Millstein et al., 1983, Nature, 305: 537-539）。他のより洗練された適合可能な多重特異性構築体とそれらの製造の方法は、米国特許第２００９／０１５５２５５号に説明されている。
[0146] なお他の態様では、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）のある抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列へ融合する。この融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３領域の少なくとも一部を含んでなる、免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。１つの例では、軽鎖結合に必要な部位を含有する第一重鎖定常領域（ＣＨ１）がその融合物の少なくとも１つに存在する。免疫グロブリン重鎖融合物と、所望されるならば、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクター中へ挿入して、好適な宿主生物へ同時トランスフェクトする。これにより、構築体中で使用される３つのポリペプチド鎖の同等でない割合が最適な収量をもたらす場合の態様において、この３つのポリペプチド断片の相互比率を調整するのに大きな柔軟性が得られる。しかしながら、等しい割合の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高収量をもたらす場合、又はこの割合が特に重要でないときは、２個又は全３個のポリペプチド鎖のコーディング配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
[0147] このアプローチの１つの態様において、二重特異性抗体は、第一の結合特異性が一方のアームにあるハイブリッド免疫グロブリン重鎖（例、ＰＴＫ７）と、他のアーム中のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を提供する）からなる。この不斉構造は、二重特異性分子の片方だけに免疫グロブリン軽鎖が存在することで容易な分離法がもたらされるので、望まれない免疫グロブリン鎖の組合せからの所望の二重特異性化合物の分離を促進することが見出された。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を産生することのさらなる詳細には、例えば、Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology, 121: 210 を参照のこと。ＷＯ９６／２７０１１に記載される別のアプローチによれば、抗体分子の対を工学処理して、組換え細胞培養より回収されるヘテロ二量体の百分率を最大にすることができる。好ましいインターフェイスは、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第一抗体分子のインターフェイス由来の１以上の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例、チロシン又はトリプトファン）に置き換える。大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例、アラニン又はスレオニン）に置き換えることによって、第二抗体分子のインターフェイス上に、大きな側鎖（複数）と同一又は類似の大きさの代償性空洞（compensatory cavities）が創出される。これにより、ホモ二量体のような他の望まれない最終産物に優ってヘテロ二量体の収量を高めるための機序が提供される。
[0148] 二重特異性抗体には、架橋連結又はヘテロコンジュゲートの抗体も含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の一方をアビジンへ、他方をビオチンへカップリングすることができる。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞を望まれない細胞へ標的化すること（米国特許第４，６７６，９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、及びＥＰ０３０８９）に提唱されてきた。ヘテロコンジュゲート抗体は、どの簡便な架橋連結法を使用しても作製してよい。当該技術分野では好適な架橋連結剤が周知であり、いくつかの架橋連結技術とともに、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
ＶＩＩＩ．ＰＴＫ７モジュレーター−定常領域の修飾
ａ．Ｆｃ領域及びＦｃ受容体
[0149] 上記に示した、開示モジュレーター（例、Ｆｃ−ＰＴＫ７又は抗ＰＴＫ７抗体）の可変又は結合領域に対する様々な修飾、置換、付加、又は削除に加えて、当業者は、本発明の選択態様が定常領域（即ち、Ｆｃ領域）の置換又は修飾も含み得ることを理解されよう。より具体的には、本発明のＰＴＫ７モジュレーターは、限定されないが、改変した薬物動態、増加した血清半減期、増加した結合親和性、低下した免疫原性、増加した産生、改変したＦｃリガンド結合、増強又は低下したＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性、改変したグリコシル化及び／又はジスルフィド結合、及び変化した結合特異性が含まれる、好ましい特徴のある化合物をもたらす１以上の追加のアミノ酸残基置換、突然変異及び／又は修飾をとりわけ含有し得ると考慮される。この点に関して言えば、これらのＦｃ変異体を有利にも使用して、開示モジュレーターの有効な抗新生物特性を高めることができると理解されよう。
[0150] 本明細書の「Ｆｃ領域」という用語は、ネイティブ配列のＦｃ領域と変異体のＦｃ領域が含まれる、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトのＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、又はＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端まで拡がるように定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号方式によれば残基４４７）は、例えば、抗体の産生又は精製の間に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組換え的に工学処理することによって除去してよい。従って、インタクト抗体の組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、及びＫ４４７残基が有る抗体と無い抗体の混合物を有する抗体集団を含んでよい。機能的なＦｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域のエフェクター機能を保有する。例示のエフェクター機能には、Ｃ１ｑ結合；ＣＤＣ；Ｆｃ受容体結合；ＡＤＣＣ；食作用；細胞表面受容体（例、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方調節、等が含まれる。そのようなエフェクター機能には、概して、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例、抗体可変ドメイン）と結び付くことが求められて、例えば、本明細書の諸定義において開示されるような様々なアッセイを使用して、評価することができる。
[0151] Ｆｃ受容体又はＦｃＲは、抗体のＦｃ領域へ結合する受容体を言い表す。いくつかの態様では、ＦｃＲがネイティブなヒトＦｃＲである。いくつかの態様では、ＦｃＲがＩｇＧ抗体（γ受容体）へ結合するものであって、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が含まれて、それら受容体の対立遺伝子変異体と選択的にスプライスされた形態が含まれる。ＦｃγＩＩ受容体には、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる同様のアミノ酸配列を有する、ＦｃγＲＩＩＡ（活性化受容体）とＦｃγＲＩＩＢ（阻害性受容体）が含まれる。活性化受容体のＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体のチロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体のＦγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体のチロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（例えば、Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997) を参照のこと）。ＦｃＲｓについては、例えば、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)；Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994)；及び de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。他のＦｃＲも、将来同定されるものを含めて、本明細書のＦｃＲという用語に含まれる。Ｆｃ受容体又はＦｃＲという用語には、ある事例では、母体ＩｇＧの胎児への輸送（Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) 及び Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)）と免疫グロブリンのホメオスタシスの調節の原因となる新生児受容体、ＦｃＲｎも含まれる。ＦｃＲｎへの結合を測定する方法が知られている（例えば、Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12) :592-598 (1997)；Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7): 637-640 (1997)；Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216 (2004)；ＷＯ２００４／９２２１９（Hinton et al.）を参照のこと）。
ｂ．Ｆｃ機能
[0152] 本明細書に使用するように、補体依存性細胞傷害及びＣＤＣは、補体の存在下での標的細胞の溶解を意味する。この補体活性化経路は、補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）が、例えば、コグネイト抗原と複合した分子、抗体へ結合することによって始動される。補体活性化を評価するには、例えば、Gazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods, 202: 163 に記載のようなＣＤＣアッセイを実施することができる。
[0153] さらに、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害又はＡＤＣＣは、ある種の細胞傷害性細胞（例、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上へ結合する分泌型Ｉｇによって、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を担う標的細胞へ特異的に結合して、その後この標的細胞を細胞毒素で殺傷することが可能になる、細胞傷害の形態を意味する。標的へ指向される特異的な高親和性ＩｇＧ抗体は、細胞傷害性細胞を装備して、そのような殺傷に絶対的に必要とされる。標的細胞の溶解は細胞外であり、直接的な細胞−細胞の接触を必要として、補体は関与しない。
[0154] ＦｃＲ結合親和性又はＡＤＣＣ活性が改変されたＰＴＫ７モジュレーター変異体とは、親抗体又は非修飾抗体と、又はネイティブ配列のＦｃ領域を含んでなるモジュレーターと比較して増強又は減少したＦｃＲ結合活性及び／又はＡＤＣＣ活性を有するものである。ＦｃＲへの増加した結合を示すモジュレーター変異体は、親抗体又は非修飾抗体、又はネイティブ配列のＦｃ領域を含んでなるモジュレーターに優る親和性で少なくとも１つのＦｃＲへ結合する。ＦｃＲへの減少した結合を示す変異体は、親抗体又は非修飾抗体、又はネイティブ配列のＦｃ領域を含んでなるモジュレーターに劣る親和性で少なくとも１つのＦｃＲへ結合する。ＦｃＲへの減少した結合を示すそのような変異体は、ＦｃＲに対する結合性をほとんど又は認められるほどに保有しない。例えば、当該技術分野で周知の技術によって決定されるように、ネイティブ配列のＩｇＧ Ｆｃ領域に比較して、例えば、ＦｃＲに対する０〜２０％の結合性を保有する。
[0155] ＦｃＲｎに関しては、本発明の抗体はまた、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、５日より大きい、１０日より大きい、１５日より大きい、好ましくは２０日より大きい、２５日より大きい、３０日より大きい、３５日より大きい、４０日より大きい、４５日より大きい、２ヶ月より大きい、３ヶ月より大きい、４ヶ月より大きい、又は５ヶ月より大きい半減期（例、血清半減期）をもたらす、定常領域への修飾があるＦｃ変異体を含むか又はそれに含まれる。本発明の抗体（又はＦｃ含有分子）の増加した半減期は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、該哺乳動物中の前記抗体又は抗体断片のより高い血清力価をもたらして、それによって前記抗体又は抗体断片の投与の頻度を低下させる、及び／又は投与される前記抗体又は抗体断片の濃度を低下させる。増加した in vivo 半減期を有する抗体は、当業者に知られた技術によって産生することができる。例えば、in vivo 半減期が増加した抗体は、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体の間の相互作用に関与するものとして同定されたアミノ酸残基を修飾すること（例えば、置換すること、欠失させること、又は付加すること）によって産生することができる（例えば、国際特許公開公報番号：ＷＯ９７／３４６３１；ＷＯ０４／０２９２０７；米国特許第６，７３７，０５６号及び米国特許第２００３／０１９０３１１号を参照のこと）。ヒトＦｃＲｎへの in vivo での結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期については、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又はトランスフェクトされたヒト細胞株において、又は変異体Ｆｃ領域があるポリペプチドが投与された霊長動物においてアッセイすることができる。ＷＯ２０００／４２０７２は、ＦｃＲｎへの結合が改善又は減少した抗体変異体について記載する。例えば、Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001) も参照のこと。
ｃ．グリコシル化修飾
[0156] なお他の態様では、本発明の抗体のグリコシル化の様式又は組成が修飾される。より具体的には、本発明の好ましい態様は、１以上の工学処理された糖型、即ち、Ｆｃ領域を含んでなる分子へ共有結合的に付加される、改変したグリコシル化様式又は改変した炭水化物組成を含んでよい。工学処理された糖型は、限定されないが、エフェクター機能を増強又は低下させること、抗体の標的抗原への親和性を高めること、又は抗体の産生を促進することが含まれる、多様な目的に有用であり得る。低下したエフェクター機能が所望される事例では、その分子が非グリコシル化型で発現されるように工学処理し得ることが理解されよう。そのような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１以上の部位を改変することによって達成することができる。即ち、１以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の消失をもたらすことによってその部位でのグリコシル化を消失させる、１以上のアミノ酸置換を行うことができる（例えば、米国特許第５，７１４，３５０号及び６，３５０，８６１号を参照のこと）。逆に、１以上の追加のグリコシル化部位において工学処理することによって、Ｆｃ含有分子へエフェクター機能の増強又は結合の改善を付与することができる。
[0157] 追加的に、あるいはまた、フコシル残基の量が低下した低フコシル化抗体又は二分するＧｌｃＮＡｃ構造が増加した抗体といった、改変したグリコシル化組成を有するＦｃ変異体も作製することができる。これらの、そして同様の改変したグリコシル化様式は、抗体のＡＤＣＣ能力を高めることが証明されてきた。工学処理される糖型は、当業者に公知の如何なる方法によっても、例えば、工学処理されたか又は変異体の発現株を使用することによって、１以上の酵素（例えばＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１））での同時発現によって、Ｆｃ領域を含んでなる分子を様々な生物又は様々な生物由来の細胞株において発現させることによって、又はＦｃ領域を含んでなる分子が発現された後で炭水化物（複数）を修飾することによって産生してよい。例えば、Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1、並びに欧州特許番号：ＥＰ１，１７６，１９５；ＰＣＴ公開公報：ＷＯ０３／０３５８３５；ＷＯ９９／５４３４２、Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473、米国特許第６，６０２，６８４号；米国仮特許出願シリアル番号：１０／２７７，３７０；１０／１１３，９２９；ＰＣＴ ＷＯ００／６１７３９Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０１／２９２２４６Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０２／３１１１４０Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０２／３０９５４Ａ１；ＰｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔＴＭ技術（Biowa 社）；ＧｌｙｃｏＭＡｂＴＭグリコシル化工学技術（GLYCART biotechnology AG）；ＷＯ０００６１７３９；ＥＡ０１２２９１２５；米国特許第２００３／０１１５６１４号；Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49 を参照のこと。
ＩＸ．モジュレーター発現
ａ．概論
[0158] 慣用の手順を使用して（例えば、抗体重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子へ特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、所望のＰＴＫ７モジュレーターをコードするＤＮＡを容易に単離して配列決定することができる。単離されてサブクローン化されたハイブリドーマ細胞（又はファージ若しくは酵母由来のコロニー）は、そのモジュレーターが抗体であれば、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ場合がある。所望されるならば、この核酸を本明細書に記載のようにさらに操作して、融合タンパク質、又はキメラ、ヒト化、又は完全ヒト抗体が含まれる薬剤を創出することができる。より具体的には、単離ＤＮＡ（修飾されている場合がある）を使用して、米国特許第７，７０９，６１１号に記載のような製造抗体のために、定常及び可変領域の配列をクローン化することができる。
[0159] この例示の方法には、選択した細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、及び抗体特異プライマーを使用するＰＣＲによる増幅を伴う。好適なプライマーは、当該技術分野で周知であり、また本明細書において例示されるように、数多くの市販供給源より容易に入手可能である。コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって単離される組換えヒト又は非ヒト抗体を発現するには、この抗体をコードするＤＮＡを組換え発現ベクターへクローン化して、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌が含まれる宿主細胞へ導入することが理解されよう。なお他の態様において、モジュレーターは、他の方法では所望の構築体を産生しない、サルＣＯＳ細胞、ＮＳ０細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞へ導入されてそれによって発現される。下記により詳しく考察するように、臨床及び市販の融合構築体又は免疫グロブリンの供給をもたらすには、所望のモジュレーターを発現する形質転換細胞を相対的に多い量で増殖させることができる。
[0160] ＰＴＫ７モジュレーターの所望の部分をコードする核酸が、ファージディスプレイ技術、酵母ライブラリー、ハイブリドーマベースの技術より、合成的に、又は市販の供給源より入手されるか又はそれらに由来するかに拘らず、本発明には、融合タンパク質と抗ＰＴＫ７抗体又はその抗原結合断片若しくは誘導体が含まれるＰＴＫ７モジュレーターをコードする核酸分子及び配列が明白に含まれると理解されるべきである。さらに本発明には、高いストリンジェンシーの下で、またあるいは、中間的又はより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（例えば、下記に定義するような）の下で、本発明のモジュレーター又はその断片若しくは変異体をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸へ相補的なポリヌクレオチドへハイブリダイズする核酸又は核酸分子（例、ポリヌクレオチド）が含まれる。本明細書に使用する「核酸分子」又は「単離された核酸分子」という用語には、少なくともＤＮＡ分子とＲＮＡ分子が含まれると企図される。核酸分子は、一本鎖でも二本鎖でもよいが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。さらに、本発明は、そのようなモジュレーターコード化ポリヌクレオチドを取り込むどの担体又は構築体も含み、限定なしに、ベクター、プラスミド、宿主細胞、コスミド、又はウイルス構築体が含まれる。
[0161] 「単離された核酸」という用語は、その核酸が（ｉ）例えばポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって in vitro で増幅された、（ｉｉ）クローニングによって組換え的に産生された、（ｉｉｉ）例えば、切断とゲル電気泳動分画化によって精製された、又は（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。単離核酸とは、組換えＤＮＡ技術による操作によって利用可能である核酸である。
[0162] より具体的には、本発明の抗体の一方又は両方の鎖、又はその断片、誘導体、ムテイン、又は変異体が含まれるモジュレーターをコードする核酸、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用に十分なポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定する、分析する、突然変異させる、又は増幅するためのＰＣＲプライマー又は配列決定プライマー、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、及び上記の相補性配列も提供される。この核酸はどの長さでもあり得る。それらは、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００又はそれより多いヌクレオチドの長さであり得る、及び／又は１以上の追加配列（例えば、調節配列）を含み得る、及び／又はより大きな核酸（例えば、ベクター）の一部であり得る。これらの核酸は、一本鎖でも二本鎖でもよくて、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡヌクレオチドとその人工的な変異体（例、ペプチド核酸）を含み得る。抗体又はその免疫反応性断片若しくは誘導体が含まれる、本発明のモジュレーターをコードする核酸は、好ましくは、上記に記載のように単離されている。
ｂ．ハイブリダイゼーションと同定
[0163] 示したように、本発明は、他の核酸へ特別なハイブリダイゼーション条件の下でハイブリダイズする核酸をさらに提供する。当該技術分野では、核酸をハイブリダイズさせる方法が周知である。例えば、「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク（1989）、6.3.1-6.3.6 を参照のこと。本出願の目的では、中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が、５ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有するプレ洗浄溶液、約５０％ホルムアミド、６ｘＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液と５５℃のハイブリダイゼーション温度（又は、約５０％ホルムアミドを含有するもののような他の同様のハイブリダイゼーション溶液を４２℃のハイブリダイゼーション温度で）と、０．５ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で６０℃の洗浄条件を使用する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、６ｘＳＳＣ中４５℃でハイブリダイズさせることに、０．１ｘＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ中６８℃での１回以上の洗浄を続ける。さらに、当業者は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄の条件を操作して、互いに少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含んでなる核酸が典型的には互いにハイブリダイズしたままであるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加又は減少させることができる。より一般的は、本開示の目的では、「核酸配列に関して実質的に同一である」という用語は、参照の核酸配列に対して少なくとも約８５％、又は９０％、又は９５％、又は９７％の配列同一性を示すヌクレオチドの配列として解釈され得る。
[0164] ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本のパラメータと好適な条件を設計するための手引きについては、例えば、Sambrook, Fritsch, and Maniatis（1989）「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」：コールドスプリングハーバーラボラトリー出版局、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、第9章及び11章；及び「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」（1995）Ausubel et al.（監修）ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社、セクション 2.10 及び 6.3-6.4）によって示されて、例えば、核酸の長さ及び／又は塩基組成に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。
[0165] 本発明によれば、核酸が単独で存在しても、相同又は異種であり得る、他の核酸との組合せにおいて存在してもよいことがさらに理解されよう。好ましい態様において、核酸は、前記核酸に関して相同又は異種であり得る発現制御配列へ機能的に連結している。この文脈において、相同という用語は、核酸が発現制御配列へ本来的に機能的に連結していることを意味し、異種という用語は、核酸が発現制御配列へ本来的には機能的に連結していないことを意味する。
ｃ．発現
[0166] ＲＮＡ及び／又はタンパク質又はペプチドを発現する核酸のような核酸と発現制御配列は、前記核酸の発現又は転写が前記発現制御配列の制御下又は影響下にあるような様式でそれらが互いに共有結合的に連結しているならば、互いに機能的に連結している。その核酸が機能的なタンパク質へ翻訳されるならば、発現制御配列機能はコーディング配列へ機能的に連結していて、前記発現制御配列の誘導は、コーディング配列のフレームシフトを引き起こすことも、前記コーディング配列が所望のタンパク質又はペプチドへ翻訳され得ないことも無く、前記核酸の転写をもたらす。
[0167] 「発現制御配列」という用語は、本発明のプロモーターによれば、リボソーム結合部位、エンハンサー、及び遺伝子の転写又はｍＲＮＡの翻訳を調節する他の制御要素を含む。本発明の特別な態様において、発現制御配列は、調節することができる。発現制御配列の正確な構造は、その種又は細胞型に応じて変動し得るが、一般的に言えば、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列、等といった、転写と翻訳の開始にそれぞれ関与する５’非転写配列と５’及び３’非翻訳配列を含む。より具体的には、５’非転写発現制御配列は、機能的に連結した核酸の転写制御のためのプロモーター配列が含まれるプロモーター領域を含む。発現制御配列はまた、エンハンサー配列又は上流アクチベータ配列も含み得る。
[0168] 本発明によれば、「プロモーター」又は「プロモーター領域」という用語は、発現される核酸配列の上流（５’）に位置して、ＲＮＡポリメラーゼに認識及び結合部位を提供することによって該配列の発現を制御する核酸配列に関する。プロモーター領域には、遺伝子の転写の調節に関与するさらなる因子のためのさらなる認識及び結合部位が含まれ得る。プロモーターは、原核生物又は真核生物の遺伝子の転写を制御し得る。さらに、プロモーターは、誘導可能であり得、誘導剤に応答して転写を開始してもよく、又は転写が誘導剤によって制御されない場合は、構成的であってもよい。誘導可能プロモーターの制御下にある遺伝子は、誘導剤が存在しなければ、発現されないか又はわずかな程度しか発現されない。誘導剤の存在下では、その遺伝子にスイッチが入るか、又は転写のレベルが増加する。このことは、概して、特定の転写因子の結合によって媒介される。
[0169] 本発明により好ましいプロモーターには、ＳＰ６、Ｔ３、及びＴ７ポリメラーゼのプロモーター、ヒトＵ６ ＲＮＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、及びこれらの人工的なハイブリッドプロモーター（例、ＣＭＶ）［ここでは、例えば、ヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロヒドロゲナーゼ）のような他の細胞タンパク質の遺伝子のプロモーターの一部又は諸部分へその一部又は諸部分が融合する］が含まれて、追加のイントロン（複数）が含まれるか又は含まれない。
[0170] 本発明によれば、「発現」という用語は、その最も一般的な意味で使用されて、ＲＮＡの産生又はＲＮＡ及びタンパク質／ペプチドの産生を含む。それは、核酸の部分的な発現も含む。さらに、発現は、一過的に行われても安定的に行われてもよい。
[0171] 好ましい態様において、本発明による核酸分子は、適宜（該核酸の発現を制御する）プロモーターとともに、ベクター中に存在する。「ベクター」という用語は、本明細書において、その最も一般的な意味で使用されて、核酸が例えば原核細胞及び／又は真核細胞の中へ導入されて、適宜、ゲノムの中へ組み込まれることを可能にする、前記核酸のどの媒介担体も含む。この種のベクターは、好ましくは、細胞中で複製及び／又は発現される。ベクターは、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージ、又はウイルスゲノムを含んでよい。本明細書に使用する「プラスミド」という用語は、一般的には、染色体ＤＮＡから独立して複製することができる、染色体外遺伝物質の構築体、通常は、環状ＤＮＡ二重鎖に関する。
[0172] 本発明を実施する場合、分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技術中の多くの慣用技術を使用してもよいと理解されよう。そのような慣用技術は、本明細書に定義されるようなベクター、宿主細胞、及び組換え方法に関する。これらの技術は周知であり、例えば、Berger and Kimmel「酵素学の方法（Methods in Enzymology）」第152巻、「分子クローニング技術の手引き（Guide to Molecular Cloning Techniques）」、アカデミックプレス社（カリフォルニア州サンディエゴ）；Sambrook et al.「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning - A Laboratory Manual）」第3版、1-3 巻、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（2000）、及び「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」F. M. Ausubel et al.（監修）上掲、に説明されている。例えば、細胞の単離及び培養のために（例えば、後続の核酸又はタンパク質の単離のために）有用な他の参考文献には、Freshney（1994）「動物細胞の培養、基本技術マニュアル（Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique）」第3版、Wiley-Liss，ニューヨークとその中の引用参考文献；Payne et al.（1992）「植物細胞及び組織の液体系培養（Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems）」ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社、ニューヨーク州ニューヨーク；Gamborg and Phillips（監修）（1995）「植物細胞、組織、及び器官の培養；基本法のスプリンガー・ラボ・マニュアル（Plant Cell and Tissue Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual）」Springer-Verlag（ベルリン−ハイデルベルグ−ニューヨーク）、及び Atlas and Parks（監修）「微生物培地ハンドブック（The Handbook of Microbiological Media）」（1993）ＣＲＣプレス（フロリダ州ボカラトン）が含まれる。核酸を作製する方法（例えば、in vitro 増幅、細胞からの精製、又は化学合成によって）、核酸を操作する方法（例えば、制限酵素消化、ライゲーション、等による部位特異的突然変異誘発）、及び核酸を操作して作製するのに有用な様々なベクター、細胞株、等についても、上記の参考文献に記載されている。加えて、本質的には、どのポリヌクレオチド（例えば、標識化又はビオチニル化ポリヌクレオチドが含まれる）も、多様な市販供給源のいずれかより、カスタム又は標準注文することができる。
[0173] このように、１つの側面において、本発明は、本発明の抗体又はその部分の組換え発現を可能にする組換え宿主細胞を提供する。そのような組換え宿主細胞中での発現によって産生される抗体を本明細書では組換え抗体と呼ぶ。本発明はまた、そのような宿主細胞の子孫細胞と、それによって産生される抗体を提供する。
[0174] 本明細書に使用する「組換え宿主細胞（又は単に、宿主細胞）」という用語は、組換え発現ベクターが導入された細胞を意味する。組換え宿主細胞と宿主細胞は、特別な被検細胞だけでなくそのような細胞の子孫も意味すると理解されるべきである。後継の世代では、突然変異又は環境上の影響により、ある何らかの修飾が起こり得るので、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、それでも本明細書に使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。そのような細胞は、本発明による、上記に記載のようなベクターを含んでよい。
[0175] 別の側面において、本発明は、本明細書に記載のような抗体又はその部分を作製するための方法を提供する。１つの態様によれば、前記方法は、上記に記載のようなベクターでトランスフェクトされたか又は形質転換された細胞を培養することと、抗体又はその部分を回収することを含む。
[0176] 上記に示したように、本発明の抗体（又はその断片若しくは変異体）の発現は、好ましくは、所望の抗ＰＴＫ７抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター（複数）を含む。当業者に周知の方法を使用して、抗体コーディング配列と適正な転写及び翻訳制御シグナルを含んでなる発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、in vitro 組換えＤＮＡ技術、合成技術、及び in vivo 遺伝子組換えが含まれる。このように、本発明の態様は、本発明の抗ＰＴＫ７抗体（例、全抗体、抗体の重鎖又は軽鎖、抗体の重鎖若しくは軽鎖可変ドメイン、又はその部分、又は重鎖若しくは軽鎖のＣＤＲ、単鎖Ｆｖ、又はこれらの断片若しくは変異体）をコードするヌクレオチド配列をプロモーターへ機能可能的に連結して含んでなる複製可能なベクターを提供する。好ましい態様では、そのようなベクターに、抗体分子の重鎖（又はその断片）をコードするヌクレオチド配列、抗体の軽鎖（又はその断片）又は重鎖と軽鎖の両方をコードするヌクレオチド配列が含まれてよい。
[0177] 本発明のヌクレオチドが本明細書の教示に従って単離されて修飾されたならば、それらを使用して、抗ＰＴＫ７抗体又はその断片が含まれる、選択したモジュレーターを産生することができる。
Ｘ．モジュレーターの産生及び精製
[0178] 当該技術分野で認められた分子生物学技術と現行のタンパク質発現の方法論を使用して、所望のモジュレーターの実質的な量を産生することができる。より具体的には、上記に記載のように入手されて工学処理される抗体のようなモジュレーターをコードする核酸分子を、様々な種類の宿主細胞を含んでなる、周知の市販されているタンパク質産生系へ組み込んで、所望の医薬品の前臨床量、臨床量、又は市販量を提供することができる。好ましい態様において、モジュレーターをコードする核酸分子は、選択した宿主細胞中への効率的な組込みと所望されるＰＴＫ７モジュレーターの後続の高い発現レベルをもたらすベクター又は発現ベクターの中へ工学処理されると理解されよう。
[0179] 好ましくは、ＰＴＫ７モジュレーターをコードする核酸分子とこれらの核酸分子を含んでなるベクターを好適な哺乳動物、植物、細菌、又は酵母の宿主細胞のトランスフェクションに使用することができるが、モジュレーターの産生には、原核細胞株も使用し得ることが理解されよう。トランスフェクションは、ポリヌクレオチドを宿主細胞へ導入することで知られたどの方法によってもよい。当該技術分野では、異種ポリヌクレオチドの哺乳動物細胞への導入の方法が周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチド（複数）のリポソーム被包化、及びＤＮＡの核中への直接的なマイクロインジェクションが含まれる。加えて、核酸分子を哺乳動物細胞中へウイルスベクターによって導入してよい。当該技術分野では、哺乳動物細胞を形質転換する方法が周知である。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、４，９１２，０４０号、４，７４０，４６１号、及び４，９５９，４５５号を参照のこと。さらに、当該技術分野では、植物細胞を形質転換する方法が周知であり、例えば、アグロバクテリウム媒介形質転換、生物銃（biolistic）形質転換、直接注入、エレクトロポレーション、及びウイルス形質転換が含まれる。当該技術分野では、細菌細胞や酵母細胞を形質転換する方法も周知である。
[0180] さらに、宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター、例えば、重鎖由来ポリペプチドをコードする第一ベクターと軽鎖由来ポリペプチドをコードする第二ベクターで同時トランスフェクトしてよい。この２つのベクターは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの実質的に等しい発現を可能にする、同一の選択可能マーカーを含有し得る。あるいは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方をコードして、それらを発現することが可能である単一ベクターを使用してよい。そのような状況では、軽鎖は、好ましくは、重鎖の手前に配置されて、過度の有害な遊離重鎖を回避する。重鎖及び軽鎖のコーディング配列は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含んでよい。
ａ．宿主発現系
[0181] 多くが市販されている、多様な宿主発現ベクター系は、本明細書の教示に適合可能であって、本発明のモジュレーターを発現するために使用し得る。そのような宿主発現系は、対象のコーディング配列が発現されて後に精製される媒体を意味するが、適正なヌクレオチドコーディング配列で形質転換されるか又はトランスフェクトされる場合は、本発明の分子を in situ で発現し得る細胞も意味する。そのような系には、限定されないが、モジュレーターコーディング配列を含有する、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例、大腸菌、枯草菌、ストレプトマイセス）のような微生物；モジュレーターコーディング配列を含有する組換え酵母発現ベクターでトランスフェクトされた酵母（例、サッカロミセス属、ピキア属）；モジュレーターコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞株；モジュレーターコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染されたか又はそれを含有する組換えプラスミド発現ベクター（例、Ｔｉプラスミド）でトランスフェクトされた植物細胞株（例、タバコ属、アラビドプシス属、アオウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、等）；又は哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築体を収容する哺乳動物細胞株（例、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が含まれる。
[0182] 細菌系では、有利にも、発現される分子のために企図される使用に依存して、いくつかの発現ベクターを選択することができる。例えば、モジュレーターの医薬組成物の産生のために、大量のそのようなタンパク質を産生すべき場合は、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベル発現を指令するベクターが望ましいかもしれない。そのようなベクターには、限定されないが、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther et al., EMBO1. 2： 1791 (1983)）[ここでは、融合タンパク質を産生するように、コーディング配列を該ベクターの中へｌａｃＺコーディング領域と正しいフレームで個別に連結（ligate）し得る]；ｐＩＮベクター（Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109 (1985)；Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509 (1989)）、等が含まれる。ｐＧＥＸベクターも、グルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として異種ポリペプチドを発現するのに使用してよい。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であって、溶解した細胞より、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着及び結合に続く、遊離グルタチオンの存在下での溶出によって容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローン化された標的遺伝子産物がＧＳＴ部分より放出され得るように、トロンビン又は第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位が含まれるように設計されている。
[0183] 昆虫系では、異種遺伝子を発現するためのベクターとして、Autographa californica（キンウワバ科）核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を使用してよい。このウイルスは、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞中で増殖する。コーディング配列は、このウイルスの非本質的な領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）へ個別にクローン化して、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置してよい。
[0184] 哺乳動物の宿主細胞では、所望のヌクレオチド配列を導入するのに、いくつかのウイルスベースの発現系を使用してよい。発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、対象のコーディング配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーター及び３部分（tripartite）リーダー配列）へ連結してよい。次いで、このキメラ遺伝子を、in vitro 又は in vivo の組換えによって、アデノウイルスゲノムに挿入してよい。ウイルスゲノムの非本質領域（例えば、領域Ｅ１又はＥ３）での挿入は、被感染宿主において生存可能でその分子を発現することが可能である組換えウイルスをもたらす（例えば、Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 355-359 (1984) を参照のこと）。挿入されたコーディング配列の効率的な翻訳には、特定の始動シグナルが求められる場合もある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンと隣接配列が含まれる。さらに、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために、所望のコーディング配列のリーディングフレームと同調していなければならない。これら外因性の翻訳制御シグナルと開始コドンは、天然と合成ともに、多様な起源のものであり得る。発現の効率は、適正な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター、等の包含によって増強することができる（例えば、Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987) を参照のこと）。このように、当該技術分野では、発現用の宿主として利用し得る適合可能な哺乳動物細胞株が周知であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）より入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、293 Freestyle 細胞（Life Technologies）、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、及びいくつかの他の細胞株が含まれる。
[0185] 組換えタンパク質の長期の高収量産生には、安定した発現が好ましい。従って、当該技術分野で認められた標準技術を使用して、選択されるモジュレーターを安定的に発現する細胞株を設計することができる。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用することよりむしろ、宿主細胞は、適正な発現制御要素（例、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、等）と選択可能マーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換することができる。異種ＤＮＡの導入に続いて、工学処理された細胞を濃縮培地においてそのまま１〜２日間増殖してよく、次いで選択培地へスイッチさせる。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、この選択に対する抵抗性を付与して、細胞がプラスミドをその染色体中へ安定的に組み込んで、増殖して細胞巣を形成することを可能にし、次いでこれをクローン化して細胞株へ拡大することができる。この方法は、有利にも、上記分子を発現する細胞株を設計するために使用し得る。このような設計された細胞株は、該分子と直接的又は間接的に相互作用する組成物のスクリーニング及び評価において特に有用であり得る。
[0186] 当該技術分野では、いくつかの選択系が周知であり、限定されないが、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（Wigler et al., Cell 11:223 (1977)）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al., Cell 22:8 17 (1980)）の遺伝子がそれぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、又はａｐｒｔ−の細胞中で利用され得る系を含めて、使用することができる。また、代謝拮抗薬への抵抗性を以下の遺伝子の選択についての基礎として使用することができる：メトトレキセートに対する抵抗性を付与する、ｄｈｆｒ（Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981))；ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与する、ｇｐｔ（Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を付与する、ｎｅｏ（Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); 及び Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); TIB TECH 11(5):155-2 15 (May, 1993)）；並びに、ヒグロマイシンに対する抵抗性を付与する、ｈｙｇｒｏ（Santerre et al., Gene 30:147 (1984)）。所望の組換えクローンを選択するには、当該技術分野で一般に公知の組換えＤＮＡ技術の方法を定型的に適用してよくて、そのような方法については、例えば、Ausubel et al. (監修)「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（1993）；Kriegler,「遺伝子の移入及び発現：実験マニュアル（Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual）」ストックトン・プレス、ニューヨーク（1990）；及び、Dracopoli et al.（監修)「ヒト遺伝学の最新プロトコール（Current Protocols in Human Genetics）」ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク（1994）中12及び13章；Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981) に記載されている。安定した高収量細胞株を確立する１つの特に好ましい方法は、ある条件の下で発現を高めるのに効率的なアプローチを提供するグルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）を含むと理解されよう。このＧＳ系については、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、ＥＰ特許：０２１６８４６、０２５６０５５、０３２３９９７、及び０３３８８４１に関連して、その全体又は一部が考察されている。
[0187] 加えて、挿入された配列の発現を調節するか又はその遺伝子産物を所望される特定の形式で修飾及び処理する宿主細胞株を選択してよい。タンパク質産物のそのような修飾（例、グリコシル化）及びプロセシング（例、切断）は、該タンパク質の機能及び／又は精製に重要であり得る。異なる宿主細胞は、翻訳後プロセシングとタンパク質及び遺伝子産物の修飾に特徴的で特異的な機序を有する。当該技術分野で公知であるように、適正な細胞株又は宿主系を選択して、発現されるポリペプチドの望まれる修飾及びプロセシングを確実にすることができる。このために、本発明における使用には、一次転写物の適切なプロセシング、グリコシル化、及び遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を保有する真核宿主細胞が特に有効である。従って、特に、好ましい哺乳動物宿主細胞には、限定されないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＮＳ０、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、並びに、例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２Ｏ、及びＴ４７Ｄのような乳癌細胞株と、例えば、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ及びＨｓＳ７８Ｂｓｔのような正常な乳腺細胞株が含まれる。モジュレーターと選択される産生系に依って、当業者は、モジュレーターの効率的な発現に適正な宿主細胞を容易に選択して最適化することができる。
ｂ．化学合成
[0188] 上述した宿主細胞株以外に、本発明のモジュレーターは、当該技術分野で公知の技術を使用して、化学的に合成し得ることが理解されよう（例えば、Creighton (1983)「タンパク質：構造及び分子の諸原理（Proteins: Structures and Molecular Principles）」W. H. フリーマン社、ニューヨーク、及び Hunkapiller, M., et al.（1984）Nature 310: 105-111 を参照のこと）。例えば、本発明のポリペプチド断片に対応するペプチドをペプチド合成機の使用によって合成することができる。さらに、所望されるならば、ポリペプチド配列中への代用物又は付加物として非典型型アミノ酸又は化学アミノ酸類似体を導入することができる。非典型型アミノ酸には、限定されないが、通常のアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、ザルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロ−アミノ酸、ｂ−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸のようなデザイナーアミノ酸、並びにアミノ酸類似体全般が含まれる。さらに、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）でもＬ（左旋性）でもよい。
ｃ．トランスジェニック系
[0189] 本発明のＰＴＫ７モジュレーターはまた、対象の免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖配列（又は、その断片若しくは誘導体若しくは変異体）についてトランスジェニックである哺乳動物又は植物の産生と、所望の化合物の回収可能形態での産生により、トランスジェニックに産生することができる。哺乳動物中でのトランスジェニック産生に関連して、抗ＰＴＫ７抗体は、例えば、ヤギ、ウシ、又は他の哺乳動物において産生されて、その乳より回収することができる。例えば、米国特許第５，８２７，６９０号、５，７５６，６８７号、５，７５０，１７２号、及び５，７４１，９５７号を参照のこと。いくつかの態様では、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物を上記に記載のようにＰＴＫ７又はその免疫原性部分で免疫化する。抗体を植物中で作製する方法については、例えば、米国特許第６，０４６，０３７号及び５，９５９，１７７号に記載されている。
[0190] 本明細書の教示に従って、本発明のＰＴＫ７モジュレーターをコードする１以上の核酸分子を動物又は植物の中へ標準トランスジェニック技術によって導入することによって、非ヒトのトランスジェニック動物又は植物を産生することができる。Hogan と米国特許第６，４１７，４２９号を参照のこと。トランスジェニック動物を作製するのに使用されるトランスジェニック細胞は、胚性幹細胞でも、体細胞でも、受精卵でもよい。トランスジェニック非ヒト生物は、キメラ、非キメラの異型接合体と非キメラの同型接合体であり得る。例えば、Hogan et al.「マウス胚の操作法：実験マニュアル（Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual）」第2版、コールドスプリングハーバー出版局（1999）；Jackson et al.「マウスの遺伝学とトランスジェニック技術：実践アプローチ（Mouse Genetics and Transgencs: A Practical Approach）」オックスフォード大学出版局（2000）；及び Pinkert「トランスジェニック動物技術：実験手引き（Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook）」アカデミックプレス（1999）を参照のこと。いくつかの態様において、トランスジェニック非ヒト動物は、例えば、対象の重鎖及び／又は軽鎖をコードする標的化構築体による、標的指向された破壊及び置換を有する。１つの態様において、トランスジェニック動物は、ＰＴＫ７へ特異的に結合する重鎖及び軽鎖をコードする核酸分子を含んで発現する。抗ＰＴＫ７抗体は、どのトランスジェニック動物でも作製してよいが、特に好ましい態様において、非ヒト動物は、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、又はウマである。さらなる態様において、非ヒトトランスジェニック動物は、所望の医薬品を血液、乳、尿、唾液、涙液、粘液、及び他の体液において発現して、それは、当該技術分野で認められた精製技術を使用して、容易に入手することができる。
[0191] 異なる細胞株によるか又はトランスジェニック動物において発現されるモジュレーター（抗体が含まれる）は、互いに異なるグリコシル化様式を有する可能性がある。しかしながら、本発明で提供される核酸分子によってコードされるか又は本発明で提供されるアミノ酸配列を含んでなるすべてのモジュレーターが、該分子のグリコシル化状態に拘らず、そしてより一般的には、翻訳後修飾（複数）の存在又は非存在に拘らず、本発明の一部である。加えて、本発明には、翻訳の間又は後に差示的に修飾される（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導化、タンパク分解的切断、抗体分子又は他の細胞リガンドへの連結、等により）モジュレーターが含まれる。数多くの化学修飾のいずれも、限定されないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下での代謝合成、等が含まれる既知の技術によって行ってよい。様々な翻訳後修飾も本発明に含まれて、例えば、Ｎ連結又はＯ連結した炭水化物鎖、Ｎ末端又はＣ末端のプロセシング、アミノ酸骨格への化学部分の付加、Ｎ連結又はＯ連結した炭水化物鎖の化学修飾、並びに原核宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加又は削除が含まれる。さらに、本文と下記の「実施例」において説明するように、該ポリペプチドはまた、そのモジュレーターの検出及び単離を可能にする、酵素、蛍光、放射性同位体、又は親和性の標識のような、検出可能な標識で修飾してよい。
ｄ．精製
[0192] 本明細書に開示する組換え発現技術又は他の技術のいずれによっても本発明のモジュレーターを産生したならば、それは、免疫グロブリンの精製について当該技術分野で公知の如何なる方法によって精製してもよく、又はより一般的には、タンパク質の精製についての如何なる他の標準技術によって精製してもよい。この点に関して言えば、モジュレーターは、単離することができる。本明細書に使用するように、単離ＰＴＫ７モジュレーターとは、同定されて、その本来の環境の成分より分離及び／又は回収されたものである。その本来の環境の混在成分は、該ポリペプチドの診断又は療法上の使用に干渉し得る物質であって、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性若しくは非タンパク質性の溶質が含まれる場合がある。単離モジュレーターには、該ポリペプチドの本来環境の少なくとも１つの成分も存在していないという理由から、組換え細胞内の in situ モジュレーターが含まれる。
[0193] 組換え技術を使用する場合、ＰＴＫ７モジュレーター（例えば、抗ＰＴＫ７抗体又はその誘導体若しくは断片）は、細胞内で、又は細胞周辺腔で産生され得るか、その培地へ直接分泌され得る。所望の分子が細胞内で産生されるならば、第一の工程として、粒子状の残渣（宿主細胞又は溶出断片）を例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去することができる。例えば、Carter, et al., Bio／Technology 10: 163 (1992) は、大腸菌の細胞周辺腔へ分泌される抗体を単離する手順について説明する。簡潔に言えば、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分にわたり融解する。遠心分離によって細胞残滓を取り除くことができる。抗体が培地中へ分泌される場合、一般的には、そのような発現系からの上清を市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、アミコン（Amicon）又はミリポア（Millipore）ペリコン（Pellicon）限外濾過ユニットを使用して初めに濃縮する。上記工程のいずれでも、タンパク質加水分解を防ぐためにＰＭＳＦのようなプロテアーゼ阻害剤を含めてよくて、偶発的な汚染体の増殖を防ぐために抗生物質を含めてよい。
[0194] 細胞より調製したモジュレーター（例、ｆｃ−ＰＴＫ７又は抗ＰＴＫ７抗体）組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができて、親和性クロマトグラフィーは、好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適格性は、選択した構築体に存在するあらゆる免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用して、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４重鎖に基づいた抗体を精製することができる（Lindmark, et al., J Immunol Meth 62:1 (1983)）。すべてのマウスアイソタイプとヒトＩｇＧ３には、プロテインＧが推奨されている（Guss, et al., EMBO J 5:1567 (1986)）。親和性リガンドが付着するマトリックスは、多くの場合、ほぼアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御された細孔ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成され得るものより速い流速とより短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂（J. T. Baker；ニュージャージー州フィリップスバーグ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画化、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン樹脂でのセファロースクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラムのような）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿といった、タンパク質精製用の他の技術も、回収すべき抗体に依って利用可能である。特に好ましい態様において、本発明のモジュレーターは、少なくとも一部は、プロテインＡ若しくはプロテインＧ親和性クロマトグラフィーを使用して精製される。
ＸＩ．コンジュゲートされたＰＴＫ７モジュレーター
[0195] 本明細書の教示に従って本発明のモジュレーターを精製したならば、それらは、医薬活性部分又は診断部分、又は生体適合性の修飾剤と連結、融合、コンジュゲートさせる（例えば、共有結合的又は非共有結合的に）、又は他の方法で会合させることができる。本明細書に使用するように、「コンジュゲート（conjugate）」という用語は概括的に使用されて、会合の方法に拘らず、開示モジュレーターと会合するあらゆる分子を意味するものとする。この点に関して言えば、そのようなコンジュゲートは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ポリマー、核酸分子、低分子、模倣薬剤、合成薬、無機分子、有機分子、及び放射性同位体を含んでよいと理解されよう。さらに、上記に示したように、選択したコンジュゲートは、モジュレーターへ共有結合的又は非共有結合的に連結してよく、少なくとも一部は、このコンジュゲーションを有効にするために使用される方法に依存して、様々なモル比を示し得る。
[0196] 好ましい態様において、本発明のモジュレーターは、選択される特徴を付与するタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド（例、生体毒素、バイオマーカー、精製タグ、等）とコンジュゲート又は会合し得ることが明らかであろう。より一般的には、選択態様において、本発明には、異種のタンパク質又はポリペプチドへ組換え的に融合されるか又は化学的にコンジュゲートされる（共有結合と非共有結合の両方のコンジュゲーションが含まれる）モジュレーター又はその断片の使用が含まれ、ここで該ポリペプチドは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、又は少なくとも１００のアミノ酸を含む。この構築体は、必ずしも直接的に連結している必要はないが、リンカー配列を介して生じ得る。例えば、抗体を使用して、特別な細胞表面受容体に特異的な抗体へ本発明のモジュレーターを融合又はコンジュゲートさせることによって、ＰＴＫ７を発現する特別な細胞種へ異種ポリペプチドを in vitro 又は in vivo のいずれかで標的指向することができる。さらに、異種ポリペプチドへ融合又はコンジュゲートしたモジュレーターはまた、in vitro イムノアッセイに使用し得て、当該技術分野で知られた精製の方法論と適合可能であり得る。例えば、国際特許公開公報番号：ＷＯ９３／２１２３２；欧州特許番号：ＥＰ４３９，０９５；Naramura et al., 1994, Immunol. Lett. 39: 91-99；米国特許第５，４７４，９８１号；Gillies et al., 1992, PNAS 89: 1428-1432；及び Fell et al., 1991, J. Immunol. 146: 2446-2452 を参照のこと。
ａ．生体適合性の修飾剤
[0197] 好ましい態様において、本発明のモジュレーターは、モジュレーター特徴を所望のように調整、改変、改善、又は加減するために使用し得る、生体適合性の修飾剤とコンジュゲートさせるか又は他の方法で会合させることができる。例えば、市販のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は同様の生体適合性ポリマーといった、相対的に分子量が高いポリマー分子を付着させることによって、in vivo 半減期が増加した抗体又は融合構築体を産生することができる。当業者は、該抗体へ特異的な特性を付与する（例えば、半減期を設計することができる）ように選択することが可能である、多くの異なる分子量及び分子配置でＰＥＧを入手し得ることを理解されよう。ＰＥＧは、多機能性リンカーを伴うか又は伴わずに、前記抗体又は抗体断片のＮ若しくはＣ末端へのＰＥＧの部位特異的なコンジュゲーションによるか、又はリジン残基上に存在するε−アミノ基を介して、モジュレーター又は抗体断片若しくは誘導体へ付着させることができる。生理活性の損失をほとんどもたらさない、線状又は分岐鎖ポリマーの誘導体化を使用してよい。コンジュゲーションの度合いは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析法によって密接にモニターして、ＰＥＧ分子の抗体分子への最適なコンジュゲーションを確実にすることができる。未反応のＰＥＧは、例えば、サイズ排除又はイオン交換クロマトグラフィーによって抗体−ＰＥＧコンジュゲートより分離することができる。同様の方法で、開示モジュレーターをアルブミンへコンジュゲートさせて、抗体又は抗体断片を in vivo でより安定にするか又はより長い in vivo 半減期を持たせることができる。この技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、国際特許公開公報番号：ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００、及びＷＯ０１／７７１３７；及び欧州特許第０４１３，６２２号を参照のこと。当業者には、他の生体適合性コンジュゲートが明らかであって、本明細書の教示に従って容易に確定することができる。
ｂ．診断剤又は検出剤
[0198] 他の好ましい態様では、本発明のモジュレーター又はその断片若しくは誘導体を、診断又は検出可能な薬剤、生体分子であり得るマーカー又はレポーター（例、ペプチド又はヌクレオチド）、低分子、フルオロフォア、又は放射性同位体へコンジュゲートする。標識化モジュレーターは、過剰増殖性障害の発症又は進行をモニターするのに、又は開示モジュレーターが含まれる特別な療法の効力を決定するか又は治療の将来経過を判定するための臨床検査手技（即ち、診断・治療）の一部として有用であり得る。そのようなマーカー又はレポーターは、選択したモジュレーターを精製すること、ＴＩＣを分離又は単離すること、又は前臨床手順又は毒性試験においても有用であり得る。
[0199] そのような診断及び検出は、限定されないが、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含んでなる様々な酵素；限定されないが、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンのような補欠分子族；限定されないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、又はフィコエリトリンのような蛍光物質；限定されないが、ルミノールのような発光物質；限定されないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンのような生物発光物質；限定されないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ、）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ、）、及びテクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、及び１１７Ｔｉｎのような放射活性物質；様々な陽電子放射断層撮影法に使用する陽電子放射金属、非放射性常磁性金属イオン、及び放射標識化されるか又は特定の放射性同位体へコンジュゲートされる分子が含まれる、検出可能な物質へ当該モジュレーターをカップリングすることによって達成することができる。そのような態様において、当該技術分野では、適正な検出の方法論が周知であり、数多くの市販供給源より容易に入手可能である。
[0200] 上記に示したように、他の態様において、当該モジュレーター又はその断片は、ペプチド又はフルオロフォアのようなマーカー配列へ融合させて、免疫組織化学又はＦＡＣのような精製又は診断の手順を促進することができる。好ましい態様において、マーカーアミノ酸配列は、中でも、その多くが市販されている、ｐＱＥベクター（Qiagen 社）において提供されるタグのような、ヘキサヒスチジンペプチド（配列番号７）である。Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 に記載されるように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグには、限定されないが、インフルエンザへマグルチニンタンパク質（Wilson et al., 1984, Cell 37:767）に由来するエピトープに対応する、へマグルチニン「ＨＡ」タグと「ｆｌａｇ（フラッグ）」タグ（米国特許第４，７０３，００４号）が含まれる。
ｃ．治療薬の部分
[0201] 先に述べたように、当該モジュレーター又はその断片若しくは誘導体はまた、抗癌剤、細胞毒素又は細胞傷害剤（例、細胞増殖抑制剤又は細胞致死剤）、治療薬剤、又は放射活性金属イオン（例、α又はβ−放出体）のような治療薬部分へコンジュゲート、連結、又は融合させるか又は他の方法で会合させてよい。本明細書に使用するように、細胞毒素又は細胞傷害剤には、細胞に有害であって、細胞の増殖又は生存を阻害し得るあらゆる薬剤又は治療薬部分が含まれる。例には、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン、ＤＭ−１ａ及びＤＭ−４（Immunogen 社）のようなメイタンシノイド類、ジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、及びシクロホスファミドとこれらの類似体又は相同体が含まれる。追加の細胞毒素は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）（Seattle Genetics 社）が含まれるアウリスタチン類、α−アマンチン、β−アマンチン、γ−アマンチン又はε−アマンチン（Heidelberg Pharma AG）のようなアマンチン類、デュオカマイシン誘導体（Syntarga, B. V.）のようなＤＮＡ副溝結合剤、及び修飾されたピロロベンゾジアピン二量体（ＰＢＤ、Spirogen 社）を含む。さらに、１つの態様において、本発明のＰＴＫ７モジュレーターは、抗ＣＤ３結合分子と会合して細胞傷害性Ｔ細胞を動員して、それらを腫瘍始原細胞へ標的指向させることができる（ＢｉＴＥ技術；例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Fuhrmann, S. et al. ＡＡＣＲ年次会合抄録番号：5625（2010）を参照のこと）。
[0202] 追加の適合可能な治療薬部分は、限定されないが、代謝拮抗薬（例、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン）、アルキル化剤（例、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン類（例、ダウノルビシン（かつてのダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例、ダクチノマイシン（かつてのアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、及び抗有糸分裂剤（例、ビンクラスチン及びビンブラスチン）が含まれる細胞傷害剤を含む。治療薬部分のより広汎なリストは、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開公報：ＷＯ０３／０７５９５７及び米国特許第２００９／０１５５２５５号に見出すことができる。
[0203] 選択したモジュレーターはまた、放射活性物質、又は放射金属イオンをコンジュゲートするのに有用な大環状キレート剤といった治療薬部分へコンジュゲートすることができる（放射活性物質の例については、上記を参照のこと）。ある態様において、大環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体へ付けることができる、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。当該技術分野では、このようなリンカー分子が普通に知られていて、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4: 2483；Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10: 553；及び Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26: 943 に記載されている。
[0204] 本発明のこの側面と適合可能であり得る例示の放射性同位体には、限定されないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ、）、炭素（１４Ｃ）、銅（６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ビスマス（２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、１１７Ｔｉｎ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、及び２１１Ａｔが含まれる。他の放射性核種（特に、６０〜４，０００ｋｅＶのエネルギー範囲にあるもの）も、診断剤及び治療剤として利用可能である。治療される状態と望まれる治療プロフィールに依存して、当業者は、開示モジュレーターとの使用に適した放射性同位体を容易に選択することができる。
[0205] 本発明のＰＴＫ７モジュレーターはまた、所与の生体応答を変化させる治療薬部分又は薬物（例、生物学的応答調節物質又はＢＲＭ）へコンジュゲートさせてよい。即ち、本発明に適合可能な治療薬剤又は治療成分は、典型的な化学治療薬剤に限定されると解釈してはならない。例えば、特に好ましい態様において、薬物部分は、所望の生理活性を保有する、タンパク質又はポリペプチド又はその断片であってよい。そのようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンＡ、オンコナーゼ（Onconaze）（又は別の細胞傷害性ＲＮアーゼ）、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、又はジフテリア毒素のような毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲンアクチベータ、アポトーシス誘発剤（例、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際特許公開公報番号：ＷＯ９７／３３８９９を参照のこと）、ＡＩＭ ＩＩ（国際特許公開公報番号：ＷＯ９７／３４９１１を参照のこと）、Ｆａｓリガンド（Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6: 1567）、及びＶＥＧＩ（国際特許公開公報番号：ＷＯ９９／２３１０５を参照のこと）、血栓形成剤又は抗血管新生剤（例、アンジオスタチン又はエンドスタチン）のようなタンパク質；又は、例えば、リンホカイン（例、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、及び顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」））、又は成長因子（例、成長ホルモン（「ＧＨ」））のような生物学的応答調節物質を含めてよい。上記に説明したように、当該技術分野では、モジュレーターをポリペプチド部分へ融合又はコンジュゲートさせる方法が知られている。先に開示した主題の参考文献に加えて、例えば、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３３６，６０３号；５，６２２，９２９号；５，３５９，０４６号；５，３４９，０５３号；５，４４７，８５１号、及び５，１１２，９４６号；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７，１６６；ＰＣＴ公開公報：ＷＯ９６／０４３８８及びＷＯ９１／０６５７０；Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88: 10535；Zheng et al., 1995, J Immunol 154: 5590；及び Vil et al., 1992, PNAS USA 89: 11337 を参照のこと。ある部分とモジュレーターの会合は、必ずしも直接的である必要はなくて、リンカー配列を介して生じてよい。当該技術分野では、そのようなリンカー分子が一般に公知であり、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res 4 :2483；Peterson et al., 1999, Bioconjug Chem 10: 553；Zimmerman et al., 1999, Nucl Med Biol 26: 943；Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53: 171 に記載されている。
[0206] より一般的には、治療薬部分又は細胞傷害剤をモジュレーターへコンジュゲートさせるための技術が周知である。限定されないが、アルデヒド／シッフ連結、スルフィドリル連結、酸不安定連結、ｃｉｓ−アコチニル連結、ヒドラゾン連結、酵素分解可能連結（一般的には、Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53: 171 を参照のこと）が含まれる、当該技術分野で認められたどの方法によっても、モジュレーターへ種々の部分をコンジュゲートさせることができる。また、例えば、「モノクローナル抗体と癌療法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）」Reisfeld et al.（監修）中、Amon et al.「癌療法における薬物の免疫標的化のためのモノクローナル抗体（Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy）」、243-56頁（Alan R. Liss 社、1985）；「制御された薬物送達（Controlled Drug Delivery）第2版」Robinson et al.（監修）中、Hellstrom et al.「薬物送達用の抗体（Antibodies For Drug Delivery）」623-53頁（マーセル・デッカー社、1987）；「モノクローナル抗体 '８４：生物学及び臨床上の応用（Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications）」Pinchera et al.（監修）中、Thorpe「癌療法における細胞傷害剤の抗体担体：概説（Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review）」475-506頁 (1985)；「癌の検出及び療法用のモノクローナル抗体（Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy）」Baldwin et al.（監修）中、「放射標識化抗体の癌療法における療法上の使用の分析、結果、及び将来展望（Analysis, Results And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy）」 303-16頁（アカデミック・プレス、1985）、及び Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119 を参照のこと。好ましい態様では、治療薬部分又は細胞傷害剤へコンジュゲートしたＰＴＫ７モジュレーターを細胞表面と会合したＰＴＫ７分子への結合時に細胞によって内在化させて、それによって治療薬ペイロードを送達することができる。
ＸＩＩ．診断薬とスクリーニング
ａ．診断
[0207] 示したように、本発明は、過剰増殖性障害を検出する、診断する、又はモニターするための in vitro 又は in vivo の方法と、ＴＰＣが含まれる腫瘍形成細胞を同定するために患者由来の細胞についてスクリーニングする方法を提供する。そのような方法には、患者又は患者より入手した試料を本明細書に記載のような選択したＰＴＫ７モジュレーターと接触させて、試料中の結合型又は遊離ＰＴＫ７への該モジュレーターの会合の存在又は非存在、又はそのレベルを検出することを含んでなる、癌の治療又はその進行のモニタリングのために癌を有する個体を同定することが含まれる。該モジュレーターが抗体又はその免疫学的に活性な断片を含む場合、試料中の特別なＰＴＫ７との会合は、該試料が腫瘍永続化細胞（例、癌幹細胞）を含有し得る可能性があることを示し、癌を有する個体が本明細書に記載のようなＰＴＫ７モジュレーターで効果的に治療され得ることを示唆する。この方法は、対照への結合のレベルを比較する工程をさらに含んでよい。逆に、選択したモジュレーターがＦｃ−ＰＴＫ７である場合、試料との接触時に、選択したプロテインキナーゼ７の結合特性を（in vivo 又は in vitro で直接的又は間接的に）利用してモニターして、所望の情報を得ることができる。当該技術分野では、本明細書の教示と適合可能な他の診断又はセラグノーシスの方法が周知であり、専用のレポーティング系のような市販の材料を使用して、実践することができる。
[0208] 特に好ましい態様では、本発明のモジュレーターを使用して、患者試料（例、血漿又は血液）中のＰＴＫ７レベルを検出して定量することができ、次いでそれを使用して、過剰増殖性障害が含まれるＰＴＫ７関連障害を検出、診断、又はモニターすることができる。関連した態様では、本発明のモジュレーターを使用して、循環性の腫瘍細胞を in vivo 又は in vitro で検出、モニター、及び／又は定量することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／０１２８８０１を参照のこと）。なお他の好ましい態様において、循環性の腫瘍細胞は、癌幹細胞を含み得る。
[0209] 例示の適合可能なアッセイ方法には、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、競合結合アッセイ、蛍光イムノアッセイ、イムノブロットアッセイ、ウェスタンブロット分析、フローサイトメトリーアッセイ、及びＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。より一般的には、生体試料中のＰＴＫ７の検出、又はＰＴＫ７の酵素的活性（又はその阻害）の測定は、当該技術分野で公知の如何なるアッセイを使用しても達成してよい。適合可能な in vivoセラグノーシス又は診断は、磁気共鳴造影法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影法（例、ＣＡＴスキャン）、ポジトロン断層撮影法（例、ＰＥＴスキャン）、Ｘ線撮影法、超音波法、等のような、当該技術分野で認められた造影又はモニタリング技術を含んでよい。当業者には、障害の病因、病理学的症状、又は臨床進行に基づいて、適正な検出、モニタリング、又は造影技術（市販の供給源をしばしば含んでなる）を認識して実行することが容易に可能であろう。
[0210] 別の態様において、本発明は、癌の進行及び／又は発病を in vivo で分析する方法を提供する。別の態様において、癌の進行及び／又は発病の in vivo 分析は、腫瘍進行の程度を決定することを含む。別の態様において、分析は、腫瘍の同定を含む。別の態様では、腫瘍進行の分析を原発性腫瘍について実施する。別の態様では、当業者に公知であるような癌の種類に依存して、分析を経時的に実施する。別の態様では、原発性腫瘍の転移細胞を起源とする続発性腫瘍のさらなる分析を in vivo で分析する。別の態様では、続発性腫瘍の大きさと形状を分析する。いくつかの態様では、さらなる体外（ex vivo）分析を実施する。
[0211] 別の態様において、本発明は、細胞転移を決定すること又は循環性の腫瘍細胞を検出してそのレベル定量することを含めて、癌の進行及び／又は発病を in vivo で分析する方法を提供する。なお別の態様において、細胞転移の分析は、原発性腫瘍から断続している部位での細胞の進行性増殖の決定を含む。別の態様において、細胞転移分析の部位は、新生物拡散の経路を含む。いくつかの態様では、細胞が血管系構造、リンパ管を介して、体腔内で、又はこれらの組合せで分散することができる。別の態様では、細胞遊走、播種、滲出、増殖、又はこれらの組合せの観点で細胞転移分析を実施する。
[0212] ある実施例では、被検者又は被検者由来試料中の腫瘍形成細胞について、開示モジュレーターを療法又はレジメンに先立って使用して評価又は特性決定して、ベースラインを確定することができる。他の実施例において、試料は、治療された被検者に由来する。いくつかの実施例では、被検者が治療を始めるか又は終えてから少なくとも約１、２、４、６、７、８、１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、３０、６０、９０日、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、又は１２ヶ月以上後で該被検者より試料を採取する。ある実施例では、ある回数の投薬後に（例えば、２、５、１０、２０、３０又はそれ以上の回数の治療薬の投薬後に）腫瘍形成細胞について評価するか又は特性決定する。他の実施例では、１以上の療法を受けてから１週、２週、１ヶ月、２ヶ月、１年、２年、３年、４年、又はそれ以上の後で腫瘍形成細胞について特性決定するか又は評価する。
[0213] 別の側面において、そして下記により詳しく考察するように、本発明は、過剰増殖性障害を検出する、モニターする、又は診断する、そのような障害を有する個体について可能な治療を確定する、又は患者における障害の進行（又は退縮）をモニターするためのキットを提供し、ここで該キットは、本明細書に記載のようなモジュレーターと、試料に対する該モジュレーターの影響を検出するための試薬を含む。
ｂ．スクリーニング
[0214] 当該ＰＴＫ７モジュレーターとそれを含んでなる細胞、培養物、集団、並びに組成物（それらの子孫が含まれる）はまた、ＰＴＫ７（例えば、そのポリペプチド又は遺伝成分）と相互作用することによって腫瘍始原細胞又はその子孫の機能又は活性に影響を及ぼす化合物又は薬剤（例、薬物）をスクリーニングするか又は同定するために使用することができる。故に、本発明は、ＰＴＫ７又はその基質と会合することによって腫瘍始原細胞又はその子孫の機能又は活性に影響を及ぼし得る化合物又は薬剤の評価又は同定のためのシステム及び方法をさらに提供する。そのような化合物及び薬剤は、例えば、過剰増殖性障害の治療についてスクリーニングされる薬物候補であり得る。１つの態様において、システム又は方法は、ＰＴＫ７を明示する腫瘍始原細胞と化合物又は薬剤（例、薬物）を含み、ここで該細胞と化合物又は薬剤（例、薬物）は、互いに接触している。
[0215] さらに本発明は、腫瘍始原細胞又は子孫細胞の活性又は機能を変化させることについて、ＰＴＫ７モジュレーター又は薬剤及び化合物をスクリーニングして同定する方法を提供する。１つの態様では、試験薬剤又は化合物と腫瘍始原細胞又はその子孫を接触させること；及び、この試験薬剤又は化合物がＰＴＫ７と会合した腫瘍始原細胞の活性又は機能を調節するかどうかを決定することが方法に含まれる。
[0216] 集団内のそのような腫瘍始原細胞又はその子孫のＰＴＫ７関連活性又は機能を調節する試験薬剤又は化合物により、試験薬剤又は化合物を活性剤として同定する。調節され得る例示の活性又は機能には、腫瘍始原細胞又はその子孫の細胞形態の変化、マーカーの発現、分化又は脱分化、成熟化、増殖、生存能力、アポトーシス、又は細胞死が含まれる。
[0217] 「接触させること」は、細胞又は細胞培養物、又は方法工程又は治療と関連して使用される場合、組成物（例、ＰＴＫ７会合細胞又は細胞培養物）と別の参照実体（referenced entity）との間の直接的又は間接的な相互作用を意味する。直接的な相互作用の特別な例は、物理的な相互作用である。間接的な相互作用の特別な例は、組成物が中間分子に作用して、次いでそれが参照実体（例、細胞又は細胞培養物）に作用する。
[0218] 本発明のこの側面において、「調節する」は、本発明の腫瘍始原細胞又は子孫細胞の特別な側面（例、転移又は増殖）に関連していることが判明した細胞の活性又は機能に対する効果を検出することに適合可能な様式で、腫瘍始原細胞又は子孫細胞の活性又は機能に影響を及ぼすことを示す。例示の活性及び機能には、限定されないが、計量し得る形態、発生マーカー、分化、増殖、生存能力、細胞呼吸、ミトコンドリア活性、膜完全性、又はある状態に関連したマーカーの発現が含まれる。従って、化合物又は薬剤（例、候補医薬品）について、該化合物又は薬剤と腫瘍始原細胞又は子孫細胞を接触させて、本明細書に開示されるか又は当業者に公知であるような腫瘍始原細胞又は子孫細胞の活性又は機能のあらゆる調節を測定することによって、そのような細胞又は子孫細胞に対するその効果を評価することができる。
[0219] 薬剤及び化合物についてスクリーニングして同定する方法には、ハイスループットスクリーニングに適したものが含まれて、それには、任意選択的に所定の位置又はアドレスに定位又は配置された細胞のアレイ（例、マイクロアレイ）が含まれる。ハイスループットのロボット又はマニュアル操作法では、化学的な相互作用を精査して、多くの遺伝子の発現レベルを短い時間帯で定量することができる。分子シグナル（例、フルオロフォア）と、情報をごく高速で処理する自動分析を利用する技術が開発されてきた（例えば、Pinhasov et al., Comb. Chem. High Throughput Screen. 7: 133 (2004) を参照のこと）。例えば、特定遺伝子の情報を提供する一方で、何千もの遺伝子の相互作用を同時に精査するためのマイクロアレイ技術が広汎に利用されてきた（例えば、Mocellin and Rossi, Adv. Exp. Med. Biol. 593: 19 (2007) を参照のこと）。
[0220] そのようなスクリーニング方法（例、ハイスループット）では、活性のある薬剤及び化合物を迅速かつ効率的に同定することができる。例えば、潜在的に療法性の分子を同定するために、培養皿、試験管、フラスコ、ローラーボトル又はプレート（例えば、８、１６、３２、６４、９６、３８４、及び１５３６穴のマルチウェルプレート又はディッシュのような、単一のマルチウェルプレート又はディッシュ）に、任意選択的に所定の位置で、細胞を定位又は配置する（予め播く）ことができる。スクリーニングされ得るライブラリーには、例えば、低分子ライブラリー、ファージディスプレイライブラリー、完全ヒト抗体酵母ディスプレイライブラリー（Adimab, LLC）、ｓｉＲＮＡライブラリー、及びアデノウイルストランスフェクションベクターが含まれる。
ＸＩＩＩ．医薬調製物と療法使用
ａ．製剤と投与経路
[0221] モジュレーターの形態、並びに任意選択のコンジュゲート、企図される送達形式、治療又はモニターされる疾患、及び他の数多くの変数に依存して、本発明の組成物は、当該技術分野で認められた技術を使用して、所望されるように製剤化してよい。即ち、本発明の様々な態様では、ＰＴＫ７モジュレーターを含んでなる組成物を多種多様な医薬的に許容される担体とともに製剤化する（例えば、Gennaro「レミントン：調剤の科学と実践：事実と比較（Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons）」Drugfacts Plus, 第20版 (2003); Ansel et al.「医薬剤形と薬物送達系（Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems）」第7版、Lippencott Williams and Wilkins（監修）(2004); Kibbe et al.「医薬賦形剤の手引き（Handbook of Pharmaceutical Excipients）」第3版、Pharmaceutcal Press (2000) を参照のこと）。媒体、アジュバント、及び希釈剤が含まれる、様々な医薬的に許容される担体が数多くの市販供給源より容易に利用可能である。さらに、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張度調整剤、安定化剤、湿潤剤、等のような、医薬的に許容される補助物質の取り合わせも利用可能である。ある非限定的な例示の担体には、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びこれらの組合せが含まれる。
[0222] より具体的には、いくつかの態様において、本発明の治療組成物は、そのまま投与しても、最少量の追加成分とともに投与してもよいと理解されよう。逆に、本発明のＰＴＫ７モジュレーターは、当該技術分野で周知の相対的に不活性な物質であって、該モジュレーターの投与を促進するか又は作用部位への送達について医薬的に最適化された調製物への活性化合物の加工処理を補佐する賦形剤及び補助剤を含んでなる、好適な医薬的に許容される担体を含有するように任意に製剤化してもよい。例えば、賦形剤は、形態又は堅さを与えるか又は希釈剤として作用して、モジュレーターの薬物動態を改善することができる。好適な賦形剤には、限定されないが、安定化剤、湿潤及び乳化剤、浸透性を変化させるための塩類、被包化剤、緩衝液、及び皮膚浸透エンハンサーが含まれる。
[0223] 全身投与用の開示モジュレーターは、経腸、非経口、又は局所投与用に製剤化することができる。実際、有効成分の全身投与を達成するには、全３種類の製剤を同時に使用してよい。非経口及び非腸管外の薬物送達用の賦形剤並びに製剤については、「レミントン、調剤の科学及び実践（Remington, The Science and Practice of Pharmacy）」第20版、マック・パブリッシング（2000）に説明されている。非経口投与に適した製剤には、水溶型の活性化合物、例えば、水溶性塩の水溶液剤が含まれる。加えて、油性の注射懸濁液剤に適正のような活性化合物の懸濁液剤も投与し得る。好適な脂溶性の溶媒又は媒体には、脂肪油剤、例えば、ゴマ油、又は合成脂肪酸エステル類、例えば、オレイン酸エチル又はトリグリセリドが含まれる。水性注射懸濁液剤は、該懸濁液剤の粘度を高める物質を含有してよくて、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、及び／又はデキストランが含まれる。懸濁液剤は、安定化剤を含有してもよい。また、リポソーム剤を使用して、細胞中への送達のために薬剤を被包化することができる。
[0224] 経腸投与に適した製剤には、硬又は軟ゼラチンカプセル剤、丸剤、錠剤（被覆錠剤が含まれる）、エリキシル剤、懸濁液剤、シロップ剤、又は吸入剤とこれらの制御放出形態が含まれる。
[0225] 一般に、ＰＴＫ７モジュレーターを含んでなる本発明の化合物及び組成物は、その必要な被検者へ、限定されないが、経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口、鼻腔内、筋肉内、心臓内、心室内、気管内、頬内、直腸、腹腔内、皮内、局所、経皮、及び鞘内が含まれる様々な経路によって、また他の様式では、移植又は吸入によって in vivo で投与され得る。主題の組成物は、調製物へ固体、半固体、液体、又は気体の形態で製剤化し得て；限定されないが、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、溶液剤、坐剤、浣腸剤、注射剤、吸入剤、及びエアゾール剤が含まれる。企図される適用と療法レジメンに従って、適正な製剤と投与経路を選択してよい。
ｂ．投与量
[0226] 同様に、特別な投与レジメン（即ち、用量、時機、及び反復）は、特別な個体とその個体の治療歴に依存するものである。投与量の決定には、薬物動態（例、半減期、クリアランス速度、等）のような経験的な考慮事項が寄与する。投与の頻度は、療法の経過にわたって決定して調整してよくて、腫瘍始原細胞が含まれる過剰増殖性細胞又は新生物細胞の数を低下させること、そのような新生物細胞の低下を維持すること、新生物細胞の増殖を低下させること、又は転移の発現を遅らせることに基づく。あるいは、主題の治療組成物の持続した連続放出製剤が適正であり得る。上記に述べたように、当該技術分野では、持続放出を達成するための様々な製剤及びデバイスが知られている。
[0227] 治療上の視点から、当該医薬組成物は、特定の適応症の治療又は予防に有効な量で投与される。治療有効量は、典型的には、治療される被検者の体重、彼又は彼女の身体又は健康状態、治療すべき状態の広がり、又は治療される被検者の年齢に依存する。一般に、本発明のＰＴＫ７モジュレーターは、投薬につき約１０μｇ／ｋｇ（体重）〜約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与してよい。ある態様において、本発明のＰＴＫ７モジュレーターは、投薬につき、約５０μｇ／ｋｇ（体重）〜約５ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与してよい。ある他の態様において、本発明のＰＴＫ７モジュレーターは、投薬につき、約１００μｇ／ｋｇ（体重）〜約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与してよい。本発明のＰＴＫ７モジュレーターは、投薬につき、約１００μｇ／ｋｇ（体重）〜約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与してもよい。さらに、本発明のＰＴＫ７モジュレーターは、投薬につき、約０．５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与してもよい。ある態様において、本発明の化合物は、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ（体重）、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ（体重）、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ（体重）、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ（体重）、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ（体重）、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の用量で提供される。
[0228] 他の投薬レジメンは、その全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，７４４，８７７号に開示されるような体表面積（ＢＳＡ）計算値に基づいてよい。当該技術分野で周知であるように、ＢＳＡは、患者の身長及び体重を使用して計算して、彼又は彼女の身体の表面積によって表されるような被検者のサイズの尺度を提供する。ＢＳＡを使用する、本発明の選択態様において、モジュレーターは、１０ｍｇ／ｍ２〜８００ｍｇ／ｍ２の投与量で投与してよい。他の好ましい態様において、該モジュレーターは、５０ｍｇ／ｍ２〜５００ｍｇ／ｍ２の投与量で、そしてなおより好ましくは、１００ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、２５０ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、３５０ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、又は４５０ｍｇ／ｍ２の投与量で投与される。当然ながら、投与量をどのように計算するかに拘らず、選択された時間帯にわたって多数の投与量を投与して、個々の投与より実質的に高い絶対的な投与量を提供してよい。
[0229] いずれにしても、当該ＰＴＫ７モジュレーターは、好ましくは、その必要な被検者へ必要に応じて投与される。投与頻度の決定は、担当医のような当業者によって、治療される状態、治療される被検者の年齢、治療される状態の重症度、治療される被検者の全般的な健康状態、等の考慮事項に基づいてなされてよい。一般的には、ＰＴＫ７モジュレーターの有効量が被検者へ１回以上投与される。より具体的には、該モジュレーターの有効量が被検者へ１ヶ月に１回、１ヶ月に１回より多く、又は１ヶ月に１回より少なく投与される。ある態様において、ＰＴＫ７モジュレーターの有効量は、少なくとも１ヶ月、少なくとも６ヶ月、又は少なくとも１年の期間の間を含めて、数回投与してよい。なお他の態様では、開示モジュレーターの投与の間に、数日（２、３、４、５、６又は７日）、数週（１、２、３、４、５、６、７又は８週）、又は数ヶ月（１、２、３、４、５、６、７又は８ヶ月）が経過してよい。
[0230] 開示される治療組成物の投与量及びレジメンはまた、１回以上の投与（複数）を受けてきた個体において、経験的に決定することができる。例えば、本明細書に記載のように製造した治療組成物の漸増する投与量を個体へ与えてよい。選択した組成物の効力を評価するために、特定の疾患、障害、又は状態のマーカーを先に記載のように追跡することができる。個体が癌を有する態様において、これらには、触診又は目視観察による腫瘍サイズの直接的な測定、Ｘ線又は他の造影技術による腫瘍サイズの間接的な測定；直接的な腫瘍生検と腫瘍試料の顕微鏡検査によって評価されるような改善；間接的な腫瘍マーカー（例、前立腺癌のＰＳＡ）又は本明細書に記載の方法によって同定される抗原の測定、疼痛又は麻痺の減少；言語能力、視覚、呼吸、又は腫瘍に関連した他の無能力の改善；食欲増加；又は承認された検査法によって測定されるような生活の質の増加、又は生存の延長化が含まれる。当業者には、その個体、新生物状態の種類、新生物状態の段階、その新生物状態が個体中の他の部位へ転移し始めたかどうか、及び使用されているこれまでの治療薬と併用治療薬に依って、投与量が変動するものであることが明らかであろう。
ｃ．組合せ療法
[0231] 本発明によって考慮される組合せ療法は、望まれない新生物細胞増殖（例、内皮細胞）を減少させるか又は阻害すること、癌の発生を減少させること、癌の再発を減少させるか又は予防すること、又は癌の広がり又は転移を減少させるか又は予防することに特に有用であり得る。そのような場合、本発明の化合物は、腫瘍塊（例、ＮＴＧ細胞）を支援して永続化させるＴＰＣを除去することによって増感剤又は化学増感剤として機能し得て、現行の標準治療の腫瘍減量剤又は抗癌剤のより有効な使用を可能にし得る。即ち、ＰＴＫ７モジュレーターと１以上の抗癌剤を含んでなる組合せ療法を使用して、定着した癌を減衰させる（例えば、存在する癌細胞の数を減少させる、及び／又は腫瘍負荷を減少させる）、又は癌の少なくとも１つの徴候又は副作用を改善することができる。このように、組合せ療法は、ＰＴＫ７モジュレーターと１以上の抗癌剤（限定されないが、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、化学療法剤、標的化抗癌剤、生物学的応答調節物質、免疫療法剤、癌ワクチン、抗血管新生剤、サイトカイン、ホルモン療法、放射線療法、及び抗転移剤が含まれる）の投与に関連する。
[0232] 本発明の方法によれば、組み合わせた結果がそれぞれの治療法（例、抗ＰＴＫ７抗体と抗癌剤）を別々に実施するときに観測される効果の相加である必要はない。少なくとも相加的な効果が一般的には望ましいが、単一療法の１つに優る増加された抗腫瘍効果が有益である。さらに、本発明は、組合せ治療が相乗効果を明示することを求めない。しかしながら、当業者は、好ましい態様を含むある選択した組合せでは、相乗作用が観測され得ることを理解されよう。
[0233] 本発明による組合せ療法を実践するには、１以上の抗癌剤と組合せたＰＴＫ７モジュレーター（例、抗ＰＴＫ７抗体）を、その必要な被検者へ抗癌活性を該被検者内でもたらすのに有効な様式で投与してよい。ＰＴＫ７モジュレーターと抗癌剤は、それらの組合わされた存在と腫瘍環境中でのそれらの組合わされた作用を所望されるようにもたらすのに有効な量と有効な時間帯で提供される。この目標を達成するために、ＰＴＫ７モジュレーターと抗癌剤は、単一組成物において、又は同じか又は異なる投与経路を使用する２以上の別個の組成物として、被検者へ同時に投与してよい。
[0234] あるいは、当該モジュレーターは、例えば、数分〜数週に及ぶ間隔で、抗癌剤の治療に先行又は後続してよい。抗癌剤と抗体が被検者へ別々に適用されるある態様において、それぞれの送達の時機の間の時間帯は、抗癌剤とモジュレーターが腫瘍に対して組合せ効果を発揮することができるようなものである。特別な態様では、抗癌剤とＰＴＫ７モジュレーターの両方が互いから約５分〜約２週以内に投与されると考慮される。
[0235] なお他の態様では、モジュレーターと抗癌剤の投与の間に、数日（２、３、４、５、６又は７日）、数週（１、２、３、４、５、６、７又は８週）、又は数ヶ月（１、２、３、４、５、６、７又は８ヶ月）が経過してよい。ＰＴＫ７モジュレーターと１以上の抗癌剤（組合せ療法）は、１回、２回、又は少なくとも該状態が治療、緩和、又は治癒されるまでの時間帯で投与してよい。好ましくは、組合せ療法は、数回投与される。組合せ療法は、１日３回〜６ヶ月ごとに１回投与してよい。投与することは、１日３回、１日２回、１日１回、２日ごとに１回、３日ごとに１回、週１回、２週ごとに１回、１ヶ月ごとに１回、２ヶ月ごとに１回、３ヶ月ごとに１回、６ヶ月ごとに１回のようなスケジュールであっても、ミニポンプより連続的に投与してもよい。先に示したように、組合せ療法は、経口、粘膜、頬内、鼻腔内、吸入可能、静脈内、皮下、筋肉内、腸管外、腫瘍内、又は局所の経路より投与してよい。組合せ療法は、腫瘍の部位より離れた部位で投与してよい。組合せ療法は、一般的には、腫瘍が存在する限りにおいて、その組合せ療法により、腫瘍又は癌が増殖を止めるか又はその重量又は体積が減少することを引き起こす前提で、投与される。
[0236] １つの態様では、ＰＴＫ７モジュレーターを１以上の抗癌剤と組合せて、その必要な被検者へ短い治療サイクルの間投与する。この抗体での治療の継続期間は、使用する特別な抗癌剤に従って変動してよい。本発明はまた、不連続な投与、又は数回の部分投与へ分割される１日用量を考慮する。当業者には、特別な抗癌剤に適正な治療時間が評価されて、本発明は、それぞれの抗癌剤に最適な治療スケジュールの継続的な評価を考慮する。
[0237] 本発明は、組合せ療法が投与される間の少なくとも１回のサイクル、好ましくは、１回より多いサイクルを考慮する。当業者には、１回のサイクルに適正な時間帯が評価されて、サイクルの全数とサイクル間の間隔も評価されよう。本発明は、それぞれのモジュレーター及び抗癌剤に最適な治療スケジュールの継続的な評価を考慮する。さらに、本発明はまた、抗ＰＴＫ７抗体又は抗癌剤のいずれか一方の１回より多い投与を提供する。モジュレーターと抗癌剤は、可換的に、隔日又は隔週で投与してよい；又は連続した抗体治療を与えて、抗癌剤療法の１回以上の治療を続けてよい。いずれにしても、当業者によって理解されるように、化学療法剤の適正な用量は、一般的には、臨床療法においてすでに利用されてきた用量に近いものであって、ここでこの化学療法剤は、単独で、又は他の化学療法剤と組み合わせて投与される。
[0238] 別の好ましい態様において、本発明のＰＴＫ７モジュレーターは、腫瘍疾患の初期症状に続く腫瘍再発の見込みを低下又は消失させるために、維持療法で使用されてよい。好ましくは、該障害は、治療が済んで、患者が無症候性又は寛解状態にあるように、最初の腫瘍塊は、消失、低下、又は他の様式で改善している。このような時間に、標準の診断手順を使用して疾患の徴候がほとんど又は全くないとしても、被検者へ開示モジュレーターの医薬有効量を１回以上投与してよい。いくつかの態様において、エフェクターは、ある時間帯にわたり規則的なスケジュールで投与される。例えば、ＰＴＫ７モジュレーターは、毎週、毎２週、毎月、毎６週、毎２ヶ月、毎３ヶ月、毎６ヶ月、又は毎年で投与することができる。本明細書の教示があれば、当業者は、疾患再発の潜在可能性を低下するのに好ましい投与量及び投薬レジメンを容易に決定することができよう。さらに、そのような治療は、患者の応答と臨床及び診断の諸変数に依って、数週、数ヶ月、数年の期間、又は無期限でも続けることができる。
[0239] なお別の好ましい態様において、本発明のモジュレーターは、腫瘍減量術（debulking procedure）に続く腫瘍転移の可能性を防ぐか又は抑えるために予防的に使用してよい。本開示に使用されるように、腫瘍減量術は概括的に定義されて、腫瘍又は腫瘍増殖を消失、低下、治療、又は改善するあらゆる手順、技術、又は方法を意味する。例示の腫瘍減量術には、限定されないが、外科手術、放射線治療（即ち、ビーム放射線）、化学療法、又は除去が含まれる。本開示に照らして当業者によって容易に決定される適正な時間で、臨床及び診断、又はセラグノーシスの手順によって示唆されるように、腫瘍転移を抑えるためにＰＴＫ７モジュレーターを投与してよい。当該モジュレーターは、標準的な技術を使用して決定されるように、医薬的に有効な投与量で１回以上投与してよい。好ましくは、投薬レジメンには、それを必要に応じて変更することを可能にする、適正な診断又はモニタリング技術が付随するものである。
ｄ．抗癌剤
[0240] 本明細書に使用するように、「抗癌剤」という用語は、癌のような細胞増殖性障害を治療するために使用し得るあらゆる薬剤を意味して、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、抗血管新生剤、腫瘍減量剤、化学療法剤、放射線療法と放射線療法剤、標的化抗癌剤、生物学的応答調節物質、抗体、及び免疫療法剤が含まれる。上記に考察したような選択態様では、抗癌剤がコンジュゲートを含んでよくて、投与に先立ってモジュレーターと会合させてよいと理解されよう。
[0241] 細胞傷害剤という用語は、細胞の機能を減少させるか又は阻害する、及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質を意味し、即ち、その物質は、細胞にとって有害である。典型的には、この物質は、生物に由来する天然に存在する分子である。細胞傷害剤の例には、限定されないが、細菌（例、ジフテリア毒素、シュードモナス内毒素及び外毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ）、真菌（例、α−サクリン、レストリクトシン）、植物（例、アブリン、リシン、モデッシン、ビスクミン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモリジン、トリコサンチン、麦毒、アレウリテス・フォーディ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラッカ・アメリカーナ（Phytolacca Americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（Momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス（saponaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミテゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、及びトリコテセン類）、又は動物（例、細胞外膵臓ＲＮアーゼのような細胞傷害性ＲＮアーゼ；ＤＮアーゼＩ）の低分子毒素又は酵素活性毒素が含まれて、これらの断片及び／又は変異体が含まれる。
[0242] 化学療法剤は、癌細胞の成長、増殖、及び／又は生存を非特異的に減少させるか又は阻害する化学化合物（例、細胞傷害性又は細胞増殖抑制性の薬剤）を意味する。そのような化学薬剤は、多くの場合、細胞の増殖又は分裂に必要な細胞内プロセスへ指向されるので、概して速やかに増殖して分裂する癌性細胞に対して特に有効である。例えば、ビンクリスチンは、微小管を脱重合させて、それにより細胞が有糸分裂に入ることを阻害する。一般に、化学療法剤には、癌性細胞、又は癌性になるか又は腫瘍形成性の子孫（例、ＴＩＣ）を産生する可能性がある細胞を阻害するか又は阻害するように設計されたあらゆる化学薬剤を含めることができる。そのような薬剤は、多くの場合、組合せて（例えば、ＣＨＯＰ処方において）投与され、そして多くの場合、最も効果的である。
[0243] 本発明のモジュレーターと組み合わせて（又はそれへコンジュゲートして）使用され得る抗癌剤の例には、限定されないが、アルキル化剤、アルキルスルホネート、アジリジン、エチレンイミン及びメチルアメラミン、アセトゲニン、カンプトテシン、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ−１０６５、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカマイシン、エレウテロビン、パンクラチスタチン、サルコディクチン、スポンジスタチン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エネジイン抗生物質、ダイネマイシン、ビスホスホネート類、エスペラマイシン、色素タンパク質−エネジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン類、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）（登録商標）ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン類、ペプレオマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、キュエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、葉酸類似体、プリン類似体、アンドロゲン類、抗副腎薬、フロリン酸のような葉酸リプレニッシャー、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトラキセート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジコン、エルフォルニチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダイニン、メイタンシノイド類、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール、ニトラエリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカバルジン、ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（JHS Natural Products, オレゴン州ユージーン）、ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テニュアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（特に、Ｔ−２毒素、ベラキュリンＡ、ロリジンＡ、及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類、クロラムブシル；ジェムザール（Ｇｅｍｚａｒ）（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類似体、ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ナベルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ）（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ，ＣＰＴ−１１）、トポイソメラーゼ阻害剤：ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド類；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン；細胞増殖を抑制する、ＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ、及びＶＥＧＦ−Ａの阻害剤と、上記のいずれもの医薬的に許容される塩、酸、又は誘導体が含まれる。この定義にまた含まれるのは、抗エストロゲン剤と選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、酵素アロマターゼ［副腎中でのエストロゲン産生を調節する］を阻害するアロマターゼ阻害剤、及び抗アンドロゲン剤のような、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤；並びに、トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド；ＶＥＧＦ発現阻害剤及びＨＥＲ２発現阻害剤のようなリボザイム；ワクチン類、プロロイキン（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ）（登録商標）ｒＩＬ−２；ラルトテカン（ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ）（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；アバレリクス（ＡＢＡＲＥＬＩＸ）（登録商標）ｒｍＲＨ；ビノレルビン及びエスペラマイシン類、及び上記のいずれもの医薬的に許容される塩、酸、又は誘導体である。他の態様は、限定されないが、リツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、トシツモマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、イピリムマブ、及びブレンツキシマブ・ベドチンが含まれる、癌療法について承認された抗体のような免疫療法剤の使用を含む。当業者は、本明細書の教示と適合可能である追加の抗癌剤を容易に同定することができよう。
ｅ．放射線療法
[0244] 本発明はまた、放射線療法（即ち、γ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出、等といった、ＤＮＡ損傷を腫瘍細胞内で局所的に誘発するためのあらゆる機序）とＰＴＫ７モジュレーターの組合せを提供する。腫瘍細胞へ指向された放射性同位体の送達を使用する組合せ療法も考慮されて、標的指向された抗癌剤又は他の標的化手段と共に使用してよい。典型的には、放射線療法は、約１〜約２週の時間帯にわたりパルスで投与される。放射線療法は、頭頚部癌を有する被検者へ約６〜７週の間投与することができる。放射線療法は、単一用量として投与してもよく、多数回の連続用量として投与してもよい。
ｆ．新生物状態
[0245] 単独で、又は抗癌剤又は放射線療法との組合せのいずれで投与しても、本発明のＰＴＫ７モジュレーターは、良性又は悪性の腫瘍（例、腎癌、肝臓癌、腎臓癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、卵巣癌、結直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、甲状腺癌、肝細胞癌；肉腫；膠芽腫；及び様々な頭頚部腫瘍）；白血病とリンパ系悪性腫瘍；神経細胞、神経膠細胞、星状細胞、視床下部、及び他の腺、マクロファージ、上皮、間質、及び割腔の障害のような他の障害；並びに、炎症性障害、血管新生障害、免疫障害、及び病原体によって引き起こされる障害が含まれ得る、患者又は被検者の新生物状態を全般的に治療するのに特に有用である。本発明の治療組成物及び方法での治療に特に好ましい標的は、固形腫瘍を含んでなる新生物状態である。他の好ましい態様において、本発明のモジュレーターは、血液悪性腫瘍の診断、予防、又は治療に使用してよい。本明細書に使用するように、この用語は、明白に、あらゆる哺乳動物種を含むとみなされるが、好ましくは、治療される被検者又は患者はヒトであろう。
[0246] より具体的には、本発明による治療へ処せられる新生物状態は、限定されないが、副腎腫瘍、ＡＩＤＳ関連癌、胞巣状軟部肉腫、星状細胞腫瘍、膀胱癌（扁平上皮癌と移行上皮癌）、骨癌（アダマンチノーム、脈瘤性骨嚢胞、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳及び脊髄の癌、転移性脳腫瘍、乳癌、頚動脈小体腫瘍、子宮頚癌、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞癌、淡明細胞癌、結腸癌、結直腸癌、皮膚良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣腫、ユーイング腫瘍、骨外性粘液型軟骨肉腫、骨性線維形成不全症（fibrogenesis imperfecta ossium）、線維性骨異形成症、胆嚢及び胆管癌、妊娠性絨毛疾患、生殖細胞腫瘍、頭頚部癌、島細胞腫瘍、カポシ肉腫、腎臓癌（腎芽腫、乳頭状腎細胞癌）、白血病、脂肪腫／良性脂肪様腫瘍、脂肪肉腫／悪性脂肪様腫瘍、肝臓癌（肝芽腫、肝細胞癌）、リンパ腫、肺癌（小細胞癌、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、等）、髄芽腫、メラノーマ、髄膜腫、多発性内分泌新生物、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、乳頭状甲状腺癌、副甲状腺腫瘍、小児癌、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺癌、後ブドウ膜黒色腫、稀な血液系障害、腎転移癌、横紋筋肉腫様腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、滑膜肉腫、精巣癌、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺転移癌、及び子宮癌（子宮頚癌、子宮内膜癌、及び平滑筋腫）が含まれる群より選択され得る。ある好ましい態様において、癌性細胞は、限定されないが、乳癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌、膵臓癌、結腸癌、前立腺癌、肉腫、腎転移癌、甲状腺転移癌、及び淡明細胞癌が含まれる固形腫瘍の群より選択される。
[0247] 血液系腫瘍に関しては、本発明の化合物及び方法は、低悪性度／ＮＨＬ濾胞細胞リンパ腫（ＦＣＣ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度非分割型小細胞ＮＨＬ、巨大腫瘤疾患ＮＨＬ、ワルデンストローム・マクログロブリン血症、リンパ形質細胞様リンパ腫（ＬＰＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、単球性Ｂ細胞リンパ腫、血管性免疫芽細胞性リンパ腺症、小リンパ球性、濾胞性、びまん性大細胞、びまん性小分割型細胞、大細胞免疫芽球性リンパ芽腫、小細胞、非分割型、バーキット及び非バーキット、濾胞性、大細胞優勢型；濾胞性、小分割細胞優勢型；及び、濾胞性、小分割型細胞及び大細胞混合型のリンパ腫が含まれる多様なＢ細胞リンパ腫を治療するのに特に有効であり得る。「癌：腫瘍学の原理と実践（CANCER：PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY）」第2巻：2131-2145（DeVita et al（監修）、第5版、1997）中 Gaidono et al.「リンパ腫（Lymphomas）」を参照のこと。当業者には、上記のリンパ腫が、多くの場合、分類体系の変更によって異なる名称を有するであろうことと、異なる名称下に分類されるリンパ腫を有する患者も本発明の組合せ療法レジメンより利益を得る可能性があることとが明らかなはずである。
[0248] なお他の好ましい態様において、当該ＰＴＫ７モジュレーターは、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ又はＢ−ＣＬＬ）又は急性骨髄白血病（ＡＭＬ）のような白血病が含まれる、ある種の骨髄性及び血液系腫瘍を効果的に治療するために使用し得る。このような白血病は、５０歳以降で発症率が増加し始めて６０代後半にピークに達する、主に高齢者の疾患である。ＣＬＬは、一般的には、新生物性の末梢血リンパ球の増殖を伴う。ＣＬＬの臨床知見には、リンパ球増加症、リンパ腺症、巨脾症、貧血、及び血小板減少症が伴う。ＡＭＬは、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性顆粒球性白血病、及び急性非リンパ球性白血病とも呼ばれる。ＡＭＬの根底にある病態生理は、骨髄細胞のごく初期の発生における成熟停止からなる。いずれの障害の症例においても、治療レジメンは、当業者により、本開示に照らして、臨床的に受容された手技を使用して容易に導くことができる。
[0249] 本発明はまた、良性又は前癌性の腫瘍を提示する被検者の防止的又は予防的な治療を提供する。どの特別な種類の腫瘍又は新生物障害も、本発明を使用する治療より除外されるべきであるとは考えられない。しかしながら、腫瘍細胞の種類は、二次的な治療薬剤、特に、化学療法剤と標的化抗癌剤と組み合わせた本発明の使用に関連する場合がある。
[0250] 本発明のなお他の好ましい態様は、固形腫瘍に罹患している被検者を治療するためのＰＴＫ７モジュレーターの使用を含む。そのような被検者では、これら固形腫瘍の多くが、開示されるエフェクターでの治療に対して特に敏感にさせ得る様々な遺伝子変異を示す組織を含む。例えば、結直腸癌の患者では、ＫＲＡＳ、ＡＰＣ、ＣＴＮＮＢ１、及びＣＤＨ１の突然変異がかなり共通している。さらに、上記の突然変異がある腫瘍に罹患している患者は、通常、現行の療法に対して最も難治性である；特に、ＫＲＡＳ突然変異のある患者でそうである。ＫＲＡＳ活性化突然変異（典型的には、単一のアミノ酸置換をもたらす）はまた、肺腺癌、粘液腺腫、及び膵臓の腺管癌が含まれる、他の治療困難な悪性腫瘍において関連が示唆されている。
[0251] 現在、結直腸癌患者が例えばＥＧＦＲ又はＶＥＧＦ阻害性の薬物へ応答するかどうかの最も信頼し得る予測は、ある種のＫＲＡＳ「活性化」突然変異を検査することである。結直腸癌の３５〜４５％でＫＲＡＳが突然変異しており、腫瘍が突然変異ＫＲＡＳを発現している患者は、これらの薬物に対して十分に応答しない。例えば、ＫＲＡＳの突然変異から、結直腸癌におけるパニツムマブ及びツキシマブ療法に対する応答の不足が予測される（Lievre et al. Cancer Res 66: 3992-5; Karapetis et al. NEJM 359: 1757-1765）。結直腸癌患者のほぼ８５％でＡＰＣ遺伝子に突然変異があって（Markowitz & Bertagnolli. NEJM 361: 2449-60）、家族性大腸腺腫症と結直腸癌の患者では、８００より多いＡＰＣ突然変異が特性決定されてきた。これら突然変異の大多数が、β−カテニンの破壊に媒介する機能能力が低下した、末端切断型のＡＰＣタンパク質をもたらす。β−カテニン遺伝子、ＣＴＮＮＢ１中の突然変異はまた、該タンパク質の増加した安定化をもたらし得て、いくつかの発癌転写プログラムの細胞核輸入と後続の活性化をもたらすが、これは、突然変異したＡＰＣがβ−カテニン破壊に適正に媒介し得ないこと（正常な細胞増殖及び分化のプログラムを阻止するために必要とされる）より生じる発癌の機序でもある。
[0252] ＣＤＨ１（Ｅ−カドヘリン）発現の喪失は、結直腸癌において一般に発生する更なる別の事象であり、多くの場合、この疾患のより進行した段階で観察される。Ｅ−カドヘリンは、上皮層中の細胞を繋げて組織化する接着構造の中心的なメンバーである。通常、Ｅ−カドヘリンは、β−カテニン（ＣＴＮＮＢ１）を形質膜で物理的に捕捉するので、結直腸癌におけるＥ−カドヘリン発現の喪失は、β−カテニンの核への局在化とβ−カテニン／ＷＮＴ経路の転写活性化をもたらす。異常なβ−カテニン／ＷＮＴシグナル伝達は、発癌にとって中核的であって、核内のβ−カテニンは、癌の幹細胞性との関連が示唆されてきた（Schmalhofer et al., 2009 PMID 19153669）。Ｅ−カドヘリンは、上皮細胞中のＰＴＫ７リガンドの既知の結合相手である、ＥｐｈＡ２の発現及び機能に必要とされる（Dodge Zantek et al., 1999 PMID 10511313; Orsulic S and Kemler R, 2000 PMID 10769210）。ＰＴＫ７リガンドへ結合して受容体結合と作動するか又はそれに拮抗するモジュレーターを使用することは、発癌促進プロセスを変化させる、妨害する、又は逆転させる可能性がある。あるいは、ＰＴＫ７モジュレーターは、ＰＴＫ７モジュレーターの結合選好性に基づいて、ＰＴＫ７相互作用が異常な腫瘍細胞へ選好的に結合する可能性がある。従って、上記に言及した遺伝形質を担う担癌患者は、上述したＰＴＫ７モジュレーターでの治療より利益を得る可能性がある。
ＸＩＶ．製造品
[0253] ＰＴＫ７モジュレーターの１以上の用量を含んでなる１以上の容器を含んでなる、医薬パック及びキットも提供される。ある態様では、単位投与量が提供され、ここで該単位投与量は、例えば、抗ＰＴＫ７抗体を１以上の追加薬剤の有り無しで含んでなる所定量の組成物を含有する。他の態様では、そのような単位投与量が単回使用の注射用充填済みシリンジにおいて供給される。なお他の態様において、単位投与量に含有される組成物は、生理食塩水、ショ糖、等；リン酸塩、等のような緩衝液を含んでよい；及び／又は、安定して有効なｐＨ範囲内で製剤化してよい。あるいは、ある態様において、当該組成物は、適正な液体、例えば、無菌水の添加時に復元され得る凍結乾燥散剤として提供してよい。ある好ましい態様において、当該組成物は、タンパク質凝集を阻害する１以上の物質（限定されないが、ショ糖及びアルギニンが含まれる）を含む。その容器（複数）上にあるか又はそれに付随したどのラベルも、封入される組成物が第一選択の疾患状態を診断又は治療するために使用されることを示す。
[0254] 本発明はまた、ＰＴＫ７モジュレーターの単用量又は多用量の投与単位と、任意選択的に、１以上の抗癌剤をもたらすためのキットを提供する。当該キットは、容器と、その容器の上にあるか又はそれに付随したラベル又は添付文書を含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックのような多様な材料より生成され得る。容器は、該状態を治療するのに有効である組成物を保持して、無菌のアクセスポートを有してよい（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。そのようなキットは、一般に、好適な容器中に、ＰＴＫ７モジュレーターの医薬的に許容される製剤を含有して、同じか又は異なる容器に１以上の抗癌剤を含有してもよい。当該キットはまた、診断又は組合せ療法のいずれかのために、他の医薬的に許容される製剤を含有してよい。例えば、本発明のＰＴＫ７モジュレーターに加えて、そのようなキットは、化学療法薬又は放射線療法薬；抗血管新生薬剤；抗転移剤；標的化抗癌剤；細胞傷害剤；及び／又は他の抗癌剤といった幅広い抗癌剤のどの１以上も含有してよい。そのようなキットはまた、抗癌剤又は診断剤とＰＴＫ７モジュレーターをコンジュゲートするのに適正な試薬を提供し得る（例えば、その全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４２２，３７９号を参照のこと）。
[0255] より具体的には、当該キットは、ＰＴＫ７モジュレーターを追加成分の有り無しで含有する単一容器を有しても、所望される各薬剤で別個の容器を有してもよい。組み合わされた治療剤がコンジュゲーションのために提供される場合、単一の溶液剤を、モル濃度が等しい組合せで、又はある成分を他の成分より過剰な状態でプレ混合してよい。あるいは、このキットのＰＴＫ７モジュレーターとどの任意選択の抗癌剤も、患者への投与に先立って、別個の容器内で別々に維持されてよい。当該キットはまた、無菌の医薬的に許容される緩衝液、又は注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル液、及びデキストロース溶液のような他の希釈剤を含有するための第二／第三の容器手段を含んでよい。
[0256] 当該キットの成分が１以上の液体溶液剤で提供される場合、この液体溶液剤は、好ましくは、水溶液剤であって、無菌水溶液剤が特に好ましい。しかしながら、当該キットの成分は、乾燥散剤（複数）として提供してよい。試薬又は成分が乾燥散剤として提供される場合、この散剤は、好適な溶媒の添加によって復元することができる。この溶媒も、別の容器で提供されてよいことが想定される。
[0257] 上記に簡潔に示したように、当該キットはまた、当該抗体とある任意選択の成分を動物又は患者へ投与するための手段（例えば、それより該製剤が動物へ注射又は導入され得るか又は身体の患部へ適用され得る、１以上の針又はシリンジ、さらにまた点眼器、ピペット、又は他のそのような器具）を含有してよい。本発明のキットには、典型的には、バイアル又はそのようなものと他の成分を市販用に厳重密封して含有するための手段（例えば、所望のバイアルと他の器具がその中へ配置されて保持される、注入又は吹込み成形されたプラスチック容器のような）も含まれる。どのラベル又は添付文書も、当該ＰＴＫ７モジュレーター組成物が癌（例えば、結直腸癌）を治療するために使用されることを示す。
[0258] 他の好ましい態様において、本発明のモジュレーターは、増殖性障害の診断又は治療に有用な診断又は治療デバイスと一緒に使用しても、それらを含んでもよい。例えば、１つの好ましい態様において、本発明の化合物及び組成物は、増殖性障害の病因又は顕現に関与する細胞又はマーカー化合物について検出する、モニターする、定量する、又はプロファイリングするために使用し得るある種の診断デバイス又は機器と組み合わせてよい。特に好ましい態様において、そのデバイスは、循環性の腫瘍細胞について in vivo 又は in vitro のいずれかで検出する、モニターする、及び／又は定量するために使用され得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１２／０１２８８０１を参照のこと）。なお他の好ましい態様では、そして上記に考察されるように、循環性の腫瘍細胞は、癌幹細胞を含み得る。
ＸＶ．研究試薬
[0259] 本発明の他の好ましい態様はまた、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、又はレーザー媒介分画法のような方法を介して腫瘍始原細胞の集団又は亜集団を同定、単離、分画、又は濃縮するのに有用な道具としての開示モジュレーターの特性を利用する。当業者は、癌幹細胞が含まれるＴＩＣの特性決定及び操作に適合可能ないくつかの技術において当該モジュレーターが使用され得ることを理解されよう（例えば、そのそれぞれがその全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願シリアル番号：１２／６８６，３５９、１２／６６９，１３６、及び１２／７５７，６４９を参照のこと）。
ＸＶＩ．その他
[0260] 本明細書において他に定義されなければ、本発明に関連して使用される科学及び技術用語は、当業者によって通常理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって他に求められなければ、単数形の用語には複数が含まれて、複数形の用語には単数が含まれる。より具体的には、本明細書と付帯の特許請求項において使用されるように、単数形の冠詞（「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）には、文脈が明らかに他のことを示さなければ、複数の指示語が含まれる。このように、例えば、「タンパク質（a protein）」への言及には、複数のタンパク質が含まれ；「細胞（a cell）」への言及には、細胞の混合物が含まれる、といった具合である。加えて、本明細書と付帯の特許請求項において提供される範囲には、両方の終点とその終点間のすべての点が含まれる。故に、２．０〜３．０の範囲には、２．０、３．０と２．０と３．０の間のすべての点が含まれる。
[0261] 一般的に言えば、本明細書に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸の化学及びハイブリダイゼーションと関連して使用される命名法とその技術は、当該技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。本発明の方法及び技術は、他に示さなければ、当該技術分野で周知の、本明細書を通して引用されて考察される様々な概説とより専門的な参考文献に記載されるような慣用の方法に従って概ね実施される。例えば、Sambrook J. & Russell D.「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」第3版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版局、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（2000）；Ausubel et al.「分子生物学の簡略プロトコール：分子生物学の最新プロトコールからの方法の要約（A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology）」Wiley, John & Sons 社（2002）；Harlow and Lane「抗体の使用法：実験マニュアル（Using Antibodies: A Laboratory Manual）」コールドスプリングハーバーラボラトリー出版局、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（1998）；及び、Coligan et al.「タンパク質科学の簡略プロトコール（Short Protocols in Protein Science）」Wiley, John & Sons 社（2003）を参照のこと。酵素反応と精製技術は、当該技術分野で通常実施されているか又は本明細書に記載のように、製造業者の仕様に従って実施する。本明細書に記載のような分析化学、合成有機化学、並びに医化学及び製薬化学に関連して使用される命名法とその実験手順及び技術は、当該技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。
[0262] 本明細書内で開示又は引用されるすべての参考文献又は文書は、限定なしに、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書に使用されるどのセクション見出しも、編成上の目的のみのためであって、記載される主題を限定するものと解釈してはならない。
[0263] このように、上記で一般的に記載された本発明は、以下の実施例を参照して、より容易に理解されよう。これらは、例証のために提供されるのであって、本発明を限定することを企図するものではない。これらの実施例は、下記の実験が実施されるすべての実験又は唯一の実験であることを表明するものではない。他に示さなければ、割合は、重量割合であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏（℃）であり、そして圧力は大気圧か又は大気圧付近である。
実施例１
[0264] 腫瘍始原細胞集団の濃縮
癌患者の中に存在するような固形腫瘍の細胞異種性について特性決定し、特別な表現型マーカーを使用して腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ；即ち、癌幹細胞：ＣＳＣ）の同一性を解明して、臨床意義のある療法標的を同定するために、当該技術分野で認められた技術を使用して大きな非従来型異種移植片（ＮＴＸ）腫瘍バンクを開発して維持した。多数の別個の腫瘍細胞株を含んでなるＮＴＸ腫瘍バンクを、免疫不全マウスにおいて、当初は多様な固形悪性腫瘍に罹患している数多くの癌患者より得られた異種の腫瘍細胞を多数回にわたって継代することを通じて、増殖させた。明確に定義された系統を有する多数の別個の初期継代ＮＴＸ腫瘍細胞株が継続して利用可能であることで、この細胞株より精製された細胞の再現可能で反復性の特性決定を可能にするようなＴＰＣの同定及び単離が大いに促進される。より具体的には、単離又は精製されたＴＰＣは、その細胞の起源となった患者腫瘍試料を反復するマウスにおいて、表現型でも形態学的にも異種の腫瘍を産生するそれらの能力に従って、レトロスペクティブに極めて正確に特徴付けられる。このように、単離細胞の小集団を使用して完全に異種の腫瘍をマウスにおいて産生する能力は、その単離細胞がＴＰＣを含むという事実を強く示唆する。そのような研究において、最小限に継代されたＮＴＸ細胞株の使用は、in vivo 実験を大いに単純化して、容易に証明可能な結果を提供する。さらに、初期継代ＮＴＸ腫瘍はまた、イリノテカン（即ち、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））のような治療薬剤に反応して、腫瘍増殖、現行療法への抵抗性、及び腫瘍再発を推進する根源的な機序への臨床的に関連性のある見識を提供する。
[0265] ＮＴＸ腫瘍細胞株が確立されたので、構成要素の腫瘍細胞表現型についてフローサイトメトリーを使用して分析して、腫瘍始原細胞（ＴＩＣ）について特性決定し、単離、精製、又は濃縮して、そのような集団内のＴＰＣ及びＴＰｒｏｇ細胞を分離又は分析するために使用され得る別々のマーカーを同定した。この点に関して、本発明者は、タンパク質の発現に基づいた細胞の迅速な特性決定と潜在的に有用なマーカーの同時同定をもたらす、専用のプロテオミックベースプラットフォーム（即ち、PhenoPrintＴＭ Array）を利用した。PhenoPrint Array は、その多くが市販供給源より入手されて、９６ウェルプレートに配置された、数百もの別々の結合分子を含んでなる専用のプロテオミックプラットフォームであって、ここで各ウェルは、フィコエリトリン蛍光チャネル中の別個の抗体とプレート全体で各ウェルに配置された異なる蛍光色素の多数の追加抗体を含有する。これにより、非フィコエリトリンチャネルを介して関連細胞を迅速に包含させ、又は非関連細胞を除外することを通じて、選択した腫瘍細胞の亜集団における対象の抗原の発現レベルの決定が可能になる。この PhenoPrint Array を当該技術分野周知の組織解離、移植、及び幹細胞の技術（Al-Hajj et al., 2004, Dalerba et al., 2007 及び Dylla et al., 2008, いずれも上掲、このそれぞれは、その全体において参照により本明細書に組み込まれる）と組み合わせて使用した場合、関連マーカーを効果的に同定した後で、特異的なヒト腫瘍細胞亜集団をきわめて効率的に単離及び移植することが可能であった。
[0266] 従って、重度の免疫不全マウス中のヒト腫瘍について一般になされているように様々なＮＴＸ腫瘍細胞株を確立したらすぐに、８００〜２，０００ｍｍ３に達した時点でマウスより腫瘍を切除して、当該技術分野で認められた酵素消化技術（例えば、本明細書に取り込まれる、米国特許第２００７／０２９２４１４号を参照のこと）を使用して、この細胞を単一細胞懸濁液へ解離させた。これらの懸濁液より PhenoPrint Array を使用して得られたデータは、細胞ごとのベースで、絶対的（各細胞あたり）と相対的（集団中の他の細胞に対する）の両方の表面タンパク質発現を提供し、細胞集団のより複雑な特性決定及び層別化をもたらした。より具体的には、PhenoPrint Array の使用は、ＮＴＧバルク腫瘍細胞及び腫瘍間質よりＴＩＣ又はＴＰＣをあらかじめ識別するタンパク質又はマーカーの迅速な同定を可能にして、ＮＴＸ腫瘍モデルから分離されるときに、特異的な細胞表面タンパク質の異なるレベルを発現する腫瘍細胞亜集団の相対的に迅速な特性決定を提供した。特に、腫瘍細胞集団全体で異種に発現されるタンパク質により、ある特別なタンパク質又はマーカーの発現レベルが高いか又は低い、独自の高度精製された腫瘍細胞亜集団の単離と免疫不全マウスへの移植が可能になり、それによって、ある亜集団又は別の亜集団においてＴＰＣが濃縮されたかどうかの評価が促進される。
[0267] 「濃縮する」という用語は、細胞を単離することと同義的に使用されて、ある種類の細胞の収率（画分）が出発又は最初の細胞集団と比較して、他の種類の細胞の画分に対して増加していることを意味する。好ましくは、「濃縮すること」は、ある細胞集団中の１種類の細胞の百分率を、出発の細胞集団と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、又は５０％より多く高めることを意味する。
[0268] 本明細書に使用するように、細胞又は組織の文脈において、マーカーは、ある特別な細胞、細胞集団、又は組織と同定可能なほどに関連しているか又はその中又は上に特異的に見出される化学的又は生物学的な実体（疾患又は障害に影響を受けている組織又は細胞集団の中又は上で同定されるものも含まれる）の形式のあらゆる特徴を意味する。はっきり明示されるように、マーカーは、本質的に、形態学的、機能的、又は生化学的であり得る。好ましい態様において、マーカーは、特定の細胞種（例、ＴＰＣ）によるか又はある条件下の細胞（例えば、細胞周期の特別な時点にある細胞、又は特別なニッチにある細胞）によって差示的又は選好的に発現される細胞表面抗原である。好ましくは、そのようなマーカーは、タンパク質であり、そして好ましくは、当該技術分野で公知であるような抗体、アプタマー、又は他の結合分子のエピトープを保有する。しかしながら、マーカーは、細胞の表面又はその内部に見出されるどの分子からもなってよく、限定されないが、タンパク質（ペプチド及びポリペプチド）、脂質、多糖、核酸、及びステロイドが含まれる。形態学的マーカーの特徴又は形質の例には、限定されないが、形状、大きさ、及び「核」対「細胞質」比が含まれる。機能的マーカーの特徴又は形質の例には、限定されないが、特別な基質へ付着する能力、特別な色素を取り込むか又は排除する能力（例えば、限定されないが、脂溶性色素の排除）、特別な条件の下で遊走する能力、及び特別な系譜に沿って分化する能力が含まれる。マーカーはまた、レポーター遺伝子より発現されるタンパク質であり得て、例えば、レポーター遺伝子をコードする核酸配列の細胞への導入とその転写の結果として該細胞によって発現されるレポーター遺伝子は、マーカーとして使用し得るレポータータンパク質の産生をもたらす。マーカーとして使用し得るこのようなレポーター遺伝子は、例えば、限定されないが、蛍光タンパク質酵素、呈色性（chromomeric）タンパク質、耐性遺伝子、等である。
[0269] 関連した意味において、「マーカー表現型」という用語は、組織、細胞、又は細胞集団（例、安定したＴＰＣ表現型）の文脈において、特別な細胞又は細胞集団を（例えば、ＦＡＣＳによって）特性決定する、同定する、分離する、単離する、又は濃縮するために使用し得るあらゆるマーカー又はマーカーの組合せを意味する。具体的態様において、マーカー表現型は、細胞表面マーカーの組合せの発現を検出又は同定することによって決定され得る細胞表面表現型である。
[0270] 当業者は、数多くのマーカー（又はそれらの非存在）が癌幹細胞の様々な集団と関連付けられて、腫瘍細胞亜集団を単離するか又は特性決定するのに使用されてきたことを認めよう。この点に関して言えば、例示の癌幹細胞マーカーは、ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＴＡＴ３、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ２４、ＣＤ３４、ＮＢ８４、ＴｒｋＡ、ＧＤ２、ＣＤ１３３、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＣＤ２９、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ４６、トランスフェリン受容体、ＪＡＭ３、カルボキシペプチダーゼＭ、ＡＤＡＭ９、オンコスタチンＭ、Ｌｇｒ５、Ｌｇｒ６、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ネスチン、Ｓｏｘ１、Ｂｍｉ−１、ｅｅｄ、ｅａｓｙｈ１、ｅａｓｙｈ２、ｍｆ２、ｙｙ１、ｓｍａｒｃＡ３、ｓｍａｒｃｋＡ５、ｓｍａｒｃＤ３、ｓｍａｒｃＥ１、ｍｌｌｔ３、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１６、ＡＸＩＮ１、ＢＣＬ９、ＭＹＣ、（ＴＣＦ４）ＳＬＣ７Ａ８、ＩＬ１ＲＡＰ、ＴＥＭ８、ＴＭＰＲＳＳ４、ＭＵＣ１６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ４Ａ１１、ＰＰＡＰ２Ｃ、ＣＡＶ１、ＣＡＶ２、ＰＴＰＮ３、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＳＬＣ１Ａ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＭＰＺＬ１、ＦＬＪ１００５２、Ｃ４．４Ａ、ＥＤＧ３、ＲＡＲＲＥＳ１、ＴＭＥＰＡＩ、ＰＴＳ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＮＩＤ２、ＳＴＥＡＰ、ＡＢＣＡ３、ＣＲＩＭ１、ＩＬ１Ｒ１、ＯＰＮ３、ＤＡＦ、ＭＵＣ１、ＭＣＰ、ＣＰＤ、ＮＭＡ、ＡＤＡＭ９、ＧＪＡ１、ＳＬＣ１９Ａ２、ＡＢＣＡ１、ＰＣＤＨ７、ＡＤＣＹ９、ＳＬＣ３９Ａ１、ＮＰＣ１、ＥＮＰＰ１、Ｎ３３、ＧＰＮＭＢ、ＬＹ６Ｅ、ＣＥＬＳＲ１、ＬＲＰ３、Ｃ２０ｏｒｆ５２、ＴＭＥＰＡＩ、ＦＬＶＣＲ、ＰＣＤＨＡ１０、ＧＰＲ５４、ＴＧＦＢＲ３、ＳＥＭＡ４Ｂ、ＰＣＤＨＢ２、ＡＢＣＧ２、ＣＤ１６６、ＡＦＰ、ＢＭＰ−４、β−カテニン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ９、ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４、デコリン、ＥＧＦＲ、ＣＤ１０５、ＣＤ６４、ＣＤ１６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＣＤ４９ｂ、及びＣＤ４９ｆを含む。例えば、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Schulenburg et al., 2010, PMID：20185329、米国特許第７，６３２，６７８号、及び米国特許公開公報番号：２００７／０２９２４１４、２００８／０１７５８７０、２０１０／０２７５２８０、２０１０／０１６２４１６、及び２０１１／００２０２２１を参照のこと。上記に記載の PhenoPrint Array には、これらマーカーのいくつかが含まれていたことを理解されたい。
[0271] 同様に、ある腫瘍型の癌幹細胞に関連した細胞表面表現型の非限定的な例には、ＣＤ４４ｈｉＣＤ２４ｌｏｗ、ＡＬＤＨ＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ１２３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８-、ＣＤ４４＋ＣＤ２４-、ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋ＣＤ６６ｃ-、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋ＣＤ１０-ＣＤ１９-、ＣＤ１３８-ＣＤ３４-ＣＤ１９＋、ＣＤ１３３＋ＲＣ２＋、ＣＤ４４＋α２β１ ｈｉＣＤ１３３＋、ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋ＥＳＡ＋、ＣＤ２７１＋、ＡＢＣＢ５＋、並びに、当該技術分野で公知である他の癌幹細胞表面表現型が含まれる。例えば、そのそれぞれがその全体において参照により本明細書に組み込まれる、Schulenburg et al., 2010、上掲、Visvader et al., 2008, PMID: 18784658 及び米国特許公開公報番号：２００８／０１３８３１３を参照のこと。当業者は、直前に例示したようなマーカー表現型を標準のフローサイトメトリー分析及び細胞選別技術と併せて使用して、ＴＩＣ及び／又はＴＰＣ細胞又は細胞集団をさらなる分析のために特性決定する、単離する、精製する、又は濃縮することができることを理解されよう。本発明に関連して興味深い、ＣＤ４６、ＣＤ３２４、及び任意選択的にＣＤ６６ｃは、多くのヒト結直腸（「ＣＲ」）、乳房（「ＢＲ」）、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺（ＳＣＬＣ）、膵臓（「ＰＡ」）、前立腺（「ＰＲ」）、腎臓（「ＫＤＹ」）、メラノーマ（「Ｍｅｌ」）、卵巣（「ＯＶ」）、及び頭頚部癌（「ＨＮ」）の腫瘍細胞の表面で、分析される腫瘍標本が原発性の患者腫瘍標本であるか又は患者由来のＮＴＸ腫瘍であるかに拘らず、高度に、又は異種に発現されている。
[0272] 陰性発現（即ち、「−」）の細胞とは、本明細書において、対象の他のタンパク質を蛍光放射の追加チャネルにおいて標識する完全な抗体染色カクテルの存在下に蛍光のチャネル中のアイソタイプ対照抗体で観測される発現の９５パーセンタイル以下を発現する細胞として定義される。当業者は、陰性事象を明確化するためのこの手順が「蛍光マイナス１」又は「ＦＭＯ」染色と呼ばれることを理解されよう。本明細書では、上記に記載したＦＭＯ染色手順を使用してアイソタイプ対照抗体で観測される発現の９５パーセンタイルより大きい発現がある細胞を「陽性」（即ち「＋」）と定義する。本明細書で明確にされるように、概括的に「陽性」と定義される様々な細胞の集団がある。第一に、低い発現（即ち「ｌｏ」）の細胞とは、観測される発現が、アイソタイプ対照抗体でのＦＭＯ染色を使用して決定される９５パーセンタイルより高くて、上記に記載のＦＭＯ染色手順を使用してアイソタイプ対照抗体で観測される発現の９５パーセンタイルの１標準偏差内にある細胞として一般的に定義される。「高い」発現（即ち「ｈｉ」）の細胞とは、観測される発現が、アイソタイプ対照抗体でのＦＭＯ染色を使用して決定される９５パーセンタイルより高くて、上記に記載のＦＭＯ染色手順を使用してアイソタイプ対照抗体で観測される発現の９５パーセンタイルより１標準偏差だけ大きい細胞として定義され得る。他の態様では、好ましくは、９９パーセンタイルを陰性及び陽性のＦＭＯ染色の間の境界点として使用してよく、特に好ましい態様において、このパーセンタイルは、９９％より大きくてよい。
[0273] 結直腸癌患者由来のいくつかのＮＴＸ腫瘍全体の発現の強度及び異種性に基づいて結直腸腫瘍抗原を速やかに同定して順位付ける上記に記載のような技術を使用して、候補のＴＰＣ抗原について、「腫瘍」対「正常隣接組織」の比較によってさらに評価してから、少なくとも一部は、悪性腫瘍細胞中の特別な抗原の上方又は下方調節に基づいて選択した。さらに、完全に異種な腫瘍をマウス中へ移植する能力を高めるその能力（即ち、腫瘍形成能力）に関して多様な細胞表面マーカーについて体系的に分析して、その後これらのマーカーを組み合わせることで、この方法の解明が実質的に向上して、移植時に全ての腫瘍産生能力を専ら含有する、高く濃縮された区別可能な腫瘍細胞亜集団（即ち、腫瘍始原細胞）を同定して特性決定するように蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）技術を独自設計する能力も向上した。
[0274] 繰り返すと、腫瘍始原細胞（ＴＩＣ）又は腫瘍形成（ＴＧ）細胞という用語には、腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ；即ち、癌幹細胞）と高増殖性腫瘍始原細胞（ＴＰｒｏｇ）が共に含まれ、これらは一緒に、バルク腫瘍又は塊の独自の亜集団（即ち、０．１〜２５％）を概して含み；その特徴は、上記に定義されている。この形式で特性決定される腫瘍細胞の大部分はこの腫瘍形成能力を欠失しているので、非腫瘍形成性（ＮＴＧ）と特性決定され得る。驚くべきことに、専用の PhenoPrint Array を使用して同定されたほとんどの個別マーカーは、標準ＦＡＣＳプロトコールを使用すると、結直腸腫瘍中の腫瘍始原細胞集団を濃縮する能力を証明しなかったが、個別マーカーの組合せを使用すれば、腫瘍始原細胞の２つの亜集団：ＴＰＣとＴＰｒｏｇを同定し得ることが観測された。当業者は、ＴＰＣとＴＰｒｏｇの間の明確な違いが、いずれも一次移植体において始動する腫瘍であるが、低い細胞数での連続移植時にも腫瘍増殖を永続的に促進するＴＰＣの能力であることを認めよう。さらに、ＴＰＣとＴＰｒｏｇをともに濃縮するために組み合わせて使用されるマーカー／タンパク質は、腫瘍形成細胞を濃縮するために同様に使用し得る明確化された細胞表面マーカー又は酵素活性を有するものもあるが、本発明者による発見以前には、どの組織又は新生物中でもそのような活性を含有する細胞に関連していることが知られていなかった（Dylla et al 2008, 上掲）。下記に説明するように、次いで、上記に言及した細胞表面マーカーの組合せを使用して単離した特定の腫瘍細胞亜集団を、全トランスクリプトームの次世代配列決定法を使用して分析して、差示的に発現される遺伝子を同定して特性決定した。
実施例２
濃縮された腫瘍始原細胞集団からのＲＮＡ試料の単離と分析
[0275] 確立された結直腸ＮＴＸ細胞株：ＳＣＲＸ−ＣＲ４を実施例１に記載のように継代して、免疫不全マウスにおいて腫瘍を始動させるために使用した。平均腫瘍負荷が約３００ｍｍ３に達したならば、このマウスを無作為化して、１５ｍｇ／ｋｇのイリノテカン、２５ｍｇ／ｋｇのゲムシタビン、又は媒体対照（ＰＢＳ）で週２回、安楽死に先立つ少なくとも２０日の期間の間、処理した。次いで、腫瘍を取り出して、切除したばかりの結直腸ＮＴＸ腫瘍より、ＴＰＣ、ＴＰｒｏｇ、及びＮＴＧ細胞をそれぞれ単離して、同様に、実施例１で説明した技術を概ね使用して、膵臓ＮＴＸ腫瘍よりＴＧ細胞とＮＴＧ細胞を単離した。より具体的には、ＦＡＣＳによって細胞集団を単離して、すぐにペレット状にして、Qiagen RLTplus ＲＮＡ溶解緩衝液（Qiagen 社）に溶解させた。次いで、この溶解物を使用するまで−８０℃で保存した。融解させてすぐに、Qiagen RNeasy 単離キット（Qiagen 社）をベンダーの説明書に従って使用して全ＲＮＡを抽出して、ベンダーのプロトコールと推奨される機器設定を再び使用して、Nanodrop（Thermo Scientific）と Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies）で定量した。生じる全ＲＮＡ調製物は、遺伝子の配列決定及び解析に適していた。
[0276] 媒体又は化学療法剤で処理されたマウスより上記に記載のように単離したそれぞれの細胞集団より入手した全ＲＮＡ試料を、Applied Biosystems SOLiD 3.0（オリゴライゲーション／検出による配列決定法）次世代配列決定プラットフォーム（Life Technologies）を使用する全トランスクリプトーム配列決定用に、各試料につき５ｎｇの全ＲＮＡから開始して、調製した。SOLiD プラットフォームによって作成されたデータより、ヒトゲノム由来の３４，６０９の遺伝子へマッピングして、いくつかの試料において、ＰＴＫ７を検出することができた。
[0277] 一般的には、SOLiD3 次世代配列決定プラットフォームは、ビーズへ連結したクローン増幅ＲＮＡ／ＤＮＡ断片の並列した配列決定を可能にする。次いで、色素標識化オリゴヌクレオチドでのライゲーションによる配列決定を使用して、試料中に存在する各断片の５０塩基読み取りを５０００万より多い読み取りの全数で作成し、ゲノム中のタンパク質のｍＲＮＡ転写物レベル発現のずっとより正確な表示を作成する。SOLiD3 プラットフォームは、読み取りカバー率（ゲノム位置へ独自にマッピングされる読み取り）だけに基づいて、発現だけでなく、ＳＮＰ、既知及び未知の選択的スプライシング事象、及び潜在的に新しいエクソンの発見を捉えることができる。このように、この次世代プラットフォームの使用は、転写物レベルでの発現の差異だけでなく、発現されるｍＲＮＡ転写物の特定のスプライス変異体の差異又は選好性の決定を可能にした。さらに、Applied Biosystems からの改良された全トランスクリプトームプロトコールを使用する SOLiD3 プラットフォームでの分析には、増幅前にほぼ５ｎｇの出発材料だけを必要とした。このことが重要であるのは、選別された細胞集団では、例えば、ＴＰＣ細胞の亜集合がＮＴＧ又はバルク腫瘍よりごくわずかな数しかないので、そこからの全ＲＮＡの抽出がごく少量の使用可能な出発材料しかもたらさないからである。
[0278] SOLiD3 プラットフォームからの同一２回試行の配列決定データを正規化して変換して、標準的な業界手法のように倍率比を計算した。図面２に見られるようにそれぞれのＳＣＲｘ−ＣＲ４腫瘍細胞亜集団において、ＰＴＫ７遺伝子発現レベル（エクソンへマッピングされる百万あたりの読取り値；ＲＰＭ＿エクソンとして表される）を測定した。このデータの解析は、担体又はイリノテカン処理マウスにおいて、それぞれ、ＰＴＫ７が転写物レベルでＮＴＧ集団に対して２〜４倍、そしてＴＰｒｏｇ集団に対して５０〜２００％上方調節されていることを示した。
[0279] 上記に詳述した観測事実は、ＰＴＫ７の発現がＴＰＣ集団において概ね上昇していることを示して、ＰＴＫ７が腫瘍形成性と腫瘍維持において重要な役割を担うことにより、免疫療法アプローチへの興味深い標的を構成する可能性があることを示唆する。
実施例３
濃縮された腫瘍始原細胞集団中のＰＴＫ７のリアルタイムＰＣＲ分析
[0280] 結直腸癌ではＴＰｒｏｇ及びＮＴＧ細胞に対してＴＰＣ集団において、そして膵臓癌ではＮＴＧ細胞に対してＴＧにおいて、全トランスクリプトーム配列決定によって観測された、差示的なＰＴＫ７発現を検証するために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量的リアルタイムＰＣＲを使用して、上記に示したような様々なＮＴＸ系より単離したそれぞれの細胞集団中の遺伝子発現レベルを測定した。そのようなリアルタイムＰＣＲ分析は、特別な対象の遺伝子に特異的なプライマー及びプローブのセットを使用する別々の標的の遺伝子発現レベルのより直接的で迅速な測定を可能にすると理解されよう。ＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイム定量的ＰＣＲを Applied Biosystems 7900HT Machine（Life Technologies）で実施して、これを使用して多数の患者由来ＮＴＸ系細胞集団と対応する対照におけるＰＴＫ７とＰＴＫ７遺伝子発現を測定した。さらに、この分析は、TaqMan System と共に供給される説明書において特定されるように、そして市販のＰＴＫ７及びＰＴＫ７プライマー／プローブセット（Life Technologies）を使用して行った。
[0281] 図面３に見られるように、２種の別個の結直腸ＮＴＸ腫瘍系（ＳＣＲｘ−ＣＲ４及びＣＲ５）と膵臓腫瘍系（ＳＣＲＸ−ＰＡ３）より単離したＮＴＧ及びＴＰＣ集団を使用して、遺伝子発現の定量的リアルタイムＰＣＲインターロゲーション（interrogation）を実施した。ＴＰｒｏｇ細胞集団も分離して、ＳＣＲｘ−ＣＲ４について分析した。図面３に示すデータは、ＰＴＫ７遺伝子発現が、同じ腫瘍由来のＮＴＧ細胞に対して比較するとき、結直腸ＴＰＣにおいて２倍より多く上昇していることを示す。ＰＴＫ７は、イリノテカンでの処理を受けているマウスのＴＰＣにおいて、そして膵臓腫瘍（例、ＳＣＲｘ−ＰＡ３）のＴＩＣ細胞集団においても、２倍より多く上昇していた。リアルタイム定量的ＰＣＲのより広く認められた方法論を使用する、結直腸と膵臓の両方の患者由来ＮＴＸ腫瘍からのＮＴＧ細胞対照と比較した、ＮＴＸ ＴＰＣ調製物における上昇したＰＴＫ７発現の観測事実より、先の実施例の SOLiD3 全トランスクリプトーム配列決定データがより高感度であることが確認される。このような知見は、腫瘍形成性、治療への抵抗性、及び再発の根底にあるＰＴＫ７発現レベルと細胞の間で観測される関連性をさらに裏付ける。
実施例４
未分画結直腸腫瘍標本におけるＰＴＫ７の発現
[0281] ＰＴＫ７遺伝子発現が結直腸腫瘍由来のＴＰＣ集団において同じ腫瘍由来のＴＰｒｏｇ及びＮＴＧ細胞と比較するときに上昇していることがわかったという事実に照らして、上昇したＰＴＫ７発現が未分画結直腸腫瘍試料においても正常隣接組織（ＮＡＴ）に対して検出可能であるかどうかを判定する実験を行った。ＰＴＫ７の腫瘍中の発現が正常組織標本（ＮＬ）中のレベルといかに比較されるかを判定するための測定も行った。
[0283] より具体的には、当該技術分野で公知の技術を使用して、異なる病期での１１０の結直腸患者腫瘍標本、正常隣接組織、及び４８の正常組織を含有するカスタム TumorScan qPCR（Origene Technologies）３８４ウェルアレイを設計して製作した。実施例３において詳述した手順と、同一のＰＴＫ７特異プライマー／プローブセットを使用して、カスタムプレートのウェルにおいてＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイム定量的ＰＣＲを実施した。
[0284] 図面４Ａ及び４Ｂは、発現データの結果を正常な結腸及び直腸組織における平均の発現に対して正規化したグラフ形式で示す。より特別には、図面４Ａは、この疾患の様々な病期（Ｉ〜ＩＶ）での１１０名の結直腸癌患者より入手した１６８の組織標本（このうち３５の組織標本は、結直腸癌患者由来の正常隣接組織（ＮＬＴ）である）と他の部位由来の４８の正常組織（ＮＬ組織）を使用して作成したデータを要約する。このプロットでは、それぞれの組織標本／患者からのデータを点によって表して、Ｘ軸上で区切られた各集団の幾何平均値が線として表される。同様に、図面４Ｂは、この疾患の様々な病期（Ｉ〜ＩＶ）での腫瘍（Ｔ）又は正常隣接組織（Ｎ）より入手した、２４のマッチした結直腸患者標本からのデータを含有する。ここで、プロットしたデータは、試料ごとのベースで提示されて、個々の患者由来のそれぞれの腫瘍と正常隣接組織の間に関連がある。ＰＴＫ７の発現は、マッチした「腫瘍」対「正常隣接組織」の大多数で明らかにより高くて、病期３及び４における差示的な発現は、統計学的有意差（ｎ≧４、Ｐ≦０．０３７）に達する。
[0285] 図面４Ａと図面４Ｂはともに、提示した全４つの病期において、ＰＴＫ７遺伝子の発現レベルが結直腸腫瘍の大多数において、そして正常隣接組織に対してマッチした腫瘍標本において上昇していることを示す。さらに、平均のＰＴＫ７遺伝子発現は、結直腸癌のどの病期でも、評価したほとんどの正常組織に対して上昇しているように見える（図面４Ａ）。上記の結果は、ＰＴＫ７発現が結直腸癌において増加していること、そしてＰＴＫ７発現が結直腸ＴＰＣと膵臓ＴＩＣにおいて最大であるという上記の観測事実と併せた場合に、ＰＴＫ７を発現する癌幹細胞の療法標的化が癌患者に対して治療利益をもたらす可能性があることを示唆する。
実施例５
例示の腫瘍試料におけるＰＴＫ７の差示的な発現
[0286] 追加の結直腸癌患者の腫瘍試料と１８の他の異なる固形腫瘍型のうち１つを診断された患者からの腫瘍標本におけるＰＴＫ７遺伝子発現についてさらに評価するために、実施例４に記載のようにカスタム製作されたＴｉｓｓｕｅＳｃａｎ ｑＰＣＲ（Origene Technologies）３８４ウェルアレイを使用して、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。この測定の結果は、図面５Ａ及び５Ｂに提示されて、ＰＴＫ７の遺伝子発現がいくつかの固形腫瘍型において有意に上昇していることを示す。
[0287] この点に関して、図面５Ａ及び５Ｂは、１８の異なる固形腫瘍型の１つがある患者由来の全腫瘍標本（灰色の点）又はマッチした正常隣接組織（ＮＡＴ；白色の点）中のヒトＰＴＫ７の相対的な遺伝子発現レベルと絶対的な遺伝子発現レベルをそれぞれ示す。図面５Ａでは、分析した各腫瘍型についてＮＡＴ中の平均した遺伝子発現に対してデータを正規化している。図面５Ｂでは、ＰＴＫ７の絶対的な発現について様々な組織／腫瘍において評価して、このデータを、定量的リアルタイムＰＣＲによる指数的増幅に達するのに必要とされるサイクルの数（Ｃｔ）としてプロットした。増幅しなかった標本には４５のＣｔ値を割り当てたが、これは、この実験プロトコールでの最終増幅サイクルを表す。各点は、個別の組織標本を表して、その平均値を実線として表す。
[0288] このカスタム組立て OriGene TissueScan Array を使用すると、結直腸癌と診断された患者の大多数と、副腎癌、子宮内膜癌、食道癌、肝臓癌、甲状腺癌、及び膀胱癌と診断されたほとんどの患者がその腫瘍においてＮＡＴに対して有意に多いＰＴＫ７遺伝子発現を有することが観測され、これらの腫瘍における腫瘍形成及び／又は腫瘍進行にＰＴＫ７が何らかの役割を担う可能性があることを示唆した。また、肺癌及び前立腺癌患者の亜集合では、ＮＡＴに対してＰＴＫ７発現が上昇していた。また上記の試験から明らかであったのは、ＰＴＫ７遺伝子発現がほとんどのＮＡＴ試料において概して中等度であったことであり；最も高い発現は、乳房、子宮頚部、卵巣、膵臓、精巣、及び膀胱において観測された。再び、上記のデータは、選択した過剰増殖性障害を示す患者の腫瘍形成性又は腫瘍永続性に関して、上昇したＰＴＫ７発現がその指標になって、手掛かりとなる（dispositive）可能性があることを示唆する。
実施例６
ＰＴＫ７免疫原の構築及び発現
[0289] 本発明によるある種のＰＴＫ７モジュレーターを産生して特性決定するために、２つの形態のＰＴＫ７免疫原を構築して発現させた。初めに、市販の発現ベクター、ｐＣＭＶ６−ＸＬ４−ＰＴＫ７を Origene 社より購入した。全長ＯＲＦの配列（図面１Ａの下線部分）を確定してから、ＰＣＲによって、ｐＣＤＨ−ＥＦ１−ＭＣＳ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰレンチウイルスベクター（System Biosciences）のＥｃｏＲＩ部位とＮｏｔＩ部位の中へサブクローン化した。このレンチウイルスベクターは、Ｔ２Ａリボソームスキップペプチドへ融合した全長ＰＴＫ７タンパク質とＧＦＰ選択可能マーカーを発現して、形質導入された細胞中での多シストロン発現を可能にする。このレンチウイルスベクターを使用して、標準プロトコールに従って、２９３Ｔ細胞又はＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞へ形質導入した。加えて、ｐＣＭＶ６−ＸＬ４−ＰＴＫ７を使用して、ポリエチレンイミンを使用する細胞のトランスフェクションから４８時間後に、２９３Ｔ細胞の表面上でＰＴＫ７タンパク質を一過的に発現させた。ＰＴＫ７過剰発現細胞より、分画遠心分離法を使用して、細胞膜調製物を入手した。
[0290] 他の事例では、可溶性ＰＴＫ７免疫原を調製して、このタンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（図面１において下線を施したアミノ酸によって示される配列によってコードされる）をコードする、ＰＴＫ７ ｃＤＮＡの部分が挿入されたｐＥＥ１２．４発現ベクター（Lonza AG）を使用して発現させた。第一の例では、ＥＣＤ断片を、ＩｇＫリーダー配列の下流、そして８ｘＨｉｓエピトープタグ（配列番号８）の上流で正しいフレームでサブクローン化した。ＣＨＯ−ＫＳＶ細胞の一過性トランスフェクションによって、可溶性Ｈｉｓタグ付きＰＴＫ７ ＥＣＤ免疫原を産生して、この分泌されたタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂と標準法（Qiagen 社）を使用して、細胞上清より精製した。上述したＰＴＫ７−ＥＣＤ−Ｈｉｓ構築体、血漿調製物、及び上記に記載のトランスフェクトされた細胞に加えて、Ｆｃ−ＰＴＫ７−ＥＣＤ構築体も産生して発現させた。この方法は、高忠実度のＫＯＤ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（EMD Chemicals）を使用する、図面１Ｂに示すＥＣＤ断片のＰＣＲ増幅によって開始した。このＰＣＲ反応に使用するフォワードプライマーは、ＰＴＫ７配列：ＧＣＣＡＴＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣ（配列番号９）を有して、５’ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位と（産物の培養上清への分泌用の）マウスＩｇＧ κシグナルペプチド／リーダー配列も含まれた。上記構築体を増幅するために使用したリバースプライマーは、ＰＴＫ７配列：ＣＴＧＧＡＴＣＡＴＣＴＴＧＴＡＧＧＧＧＧＧＡＧ（配列番号１０）を有して、合成済み遺伝子（DNA 2.0 社）として注文される、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃタンパク質の上流でのクローニングを可能にする５’ＤｒａＩＩＩ及びＢｇｌＩＩ制限部位が含まれた。
[0291] 次いで、増幅又はサブクローン化された産物を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位を使用して、最終の発現ベクターｐＥＥ１２．４（Lonza AG）の中へ移動させ、ＤＮＡ配列決定法によって忠実度を確かめた。ＣＨＯ−Ｓ又は２９３Ｔいずれかの懸濁細胞中へプラスミドを一過的にトランスフェクトして、Ｈｉｓタグ付きタンパク質用のニッケル親和性カラム又はＦｃ融合産物用のプロテインＡカラムのいずれかによって精製した。この産物を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（GE Healthcare）をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．２）において使用するサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製して、精製した融合タンパク質を、ブラッドフォード法（Bradford, 1976： PMID 942051）を使用して定量した。
実施例７
ｈＰＴＫ７免疫原を使用する、抗ＰＴＫ７抗体の産生
[0292] 本明細書の教示に従って、先の実施例において示したように作製した、全長のｈＰＴＫ７、ｈＰＴＫ７−Ｈｉｓ、又はｈＰＴＫ７−Ｆｃを過剰発現するＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞又はＨＥＫ２９３細胞それぞれでの接種により、マウスの抗体の形態でのＰＴＫ７モジュレーターを産生した。この点に関して言えば、３系統の雌性マウス（各３匹：Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢ）を上述のＰＴＫ７免疫原の調製物で免疫化した。いずれのマウスも、それぞれの場合に等量のＴｉｔｅｒＭＡＸ（登録商標）又はアルムアジュバントで乳化した、１０μｇの選択したＰＴＫ７構築体又は１ｘ１０６個の細胞で、足蹠（footpad）の経路より免疫化した。
[0293] ＦＡＣＳアッセイ又は固相ＥＬＩＳＡアッセイのいずれかを使用して、マウス血清について、ヒトＰＴＫ７に特異的なマウスＩｇＧ抗体をスクリーニングした。ＥＬＩＳＡでは、プレートを、ＰＢＳ中０．０１〜１μｇ／ｍＬに及ぶ異なる濃度のＰＴＫ７−Ｈｉｓで一晩コートした。０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで洗浄後、このウェルをＰＢＳ中３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ又はＰＢＳ中２％ ＦＣＳ、２００μＬ／ウェルで、室温で１時間ブロックした。５０μＬ／ウェルでのマウス血清希釈液を、ＰＴＫ７−Ｈｉｓコート化プレート上で、室温で１時間インキュベートした。このプレートを洗浄してから、３％ ＢＳＡ−ＰＢＳ又はＰＢＳ中２％ ＦＣＳで１０，０００倍希釈した５０μＬ／ウェルのＨＲＰ標識化ヤギ抗マウスＩｇＧとともに、室温で１時間インキュベートした。このプレートを洗浄して、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Thermo Scientific 34028）を室温で１５分間加えた。最後に、等量の２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて基質発色を止めて、分光光度計によってＯＤ４５０で分析した。
[0294] 示したように、マウス血清について、ＧＦＰで同時形質導入したヒトＰＴＫ７を過剰発現する細胞に対しても、ＦＡＣＳによって抗ＰＴＫ７抗体を試験した。簡潔に言えば、ウェルに付き１ｘ１０５個のＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞をヒトＰＴＫ７とＧＦＰで形質導入して、ＰＢＳ／２％ ＦＣＳで１００倍希釈した１００μｌのマウス血清とともに３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／２％ ＦＣＳで洗浄してから、各試料につき５０μＬの DyeLight 649 標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的二次抗体（ＢＳ／２％ ＦＣＳで２００倍希釈）とともにインキュベートした。１５分のインキュベーションの後で、細胞をＰＢＳ／２％ ＦＣＳで２回洗浄して、ＤＡＰＩ入りのＰＢＳ／２％ ＦＣＳに再懸濁させて、ＦＡＣＳによって分析した。
[0295] 血清陽性の免疫化マウスを犠牲にして、漏出するリンパ節（拡げれば、膝窩及び鼠蹊部）を切り出して、抗体産生細胞の供給源として使用した。Ｂ細胞（３７５ｘ１０６個の細胞）の単一細胞懸濁液を非分泌型Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞（ATCC ＃CRL-1580）と１：１の比で電気融合によって融合した。細胞電気融合は、BTX Hybrimmune System 又は ECM2001（いずれも、BTX Harvard Apparatus）を製造業者の説明書に従って使用して実施した。電気融合に続いて、アザセリン（Azaserine）（シグマ ＃Ａ９６６６）を補充したハイブリドーマ選択培地［１５％胎仔クローンＩ血清（Hyclone）、１０％ ＢＭ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Roche Applied Sciences）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ＩＵペニシリン−ストレプトマイシン、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、及び１００μＭヒポキサンチンを含有するＤＭＥＭ（Cellgro カタログ番号：15-017-CM）培地］に再懸濁させた。第一の融合では、細胞を平底マイクロタイタープレートに２Ｘ１０４個／ウェルで播いた後で、選択ＨＡＴ培地（シグマ、CRL P-7185）にて２週間のインキュベーションを続けた。第二の融合では、融合後４つのＴ２２５フラスコに９０ｍｌ選択培地／フラスコで細胞を播いた。次いで、このフラスコを、５％ ＣＯ２及び９５％空気を含有する３７℃加湿インキュベーターに６〜７日間入れた。
[0296] 増殖後、Ｔ２２５中の第二融合物由来の細胞を含んでなるライブラリーを、FACSAria I 細胞ソーターを使用して分別して、Falcon 96 ウェルＵ底プレート（いずれも BD Biosciences）においてウェルあたり１細胞でプレート培養する。残存する未使用のどのハイブリドーマライブラリー細胞も、必要ならば、将来の試験のために凍結した。次いで、選択したハイブリドーマを、１５％胎仔クローンＩ血清（Hyclone）、１０％ ＢＭ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Roche Applied Sciences）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ＩＵペニシリン−ストレプトマイシン、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、及び１００μＭヒポキサンチンを含有する２００μＬの培養基において増殖させた。いずれの融合物についても９６ウェルプレート中で１０〜１４日の増殖後、各ウェルからの上清について、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳアッセイを使用して、マウスＰＴＫ７に反応性の抗体をアッセイした。
[0297] 簡潔に言えば、９６ウェルプレート（VWR, 610744）を、炭酸ナトリウム緩衝液中１μｇ／ｍＬのマウスＰＴＫ７−Ｈｉｓで、４℃で一晩コートした。このプレートを洗浄して、２％ ＦＣＳ−ＰＢＳで、３７℃で１時間ブロックして、すぐに使用するか又は４℃に保存した。そのプレート上で非希釈ハイブリドーマ上清を室温で１時間インキュベートした。このプレートを洗浄して、１％ ＢＳＡ−ＰＢＳで１０，０００倍希釈したＨＲＰ標識化ヤギ抗マウスＩｇＧで、室温で１時間プローブした。上記に記載のような基質溶液とのインキュベーションに続いて、このプレートをＯＤ４５０で読み取った。
[0298] マウス免疫グロブリンを分泌している増殖陽性ハイブリドーマウェルについても、上記の記載に似たＦＡＣＳアッセイを使用して、ヒトＰＴＫ７の特異性をスクリーニングした。簡潔に言えば、ヒトＰＴＫ７とＧＦＰで形質導入した、ウェルにつき１ｘ１０５個のＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞を２５〜１００μｌのハイブリドーマ上清とともに３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／２％ ＦＣＳで２回洗浄してから、試料あたり５０μｌの DyeLight 649 標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的二次抗体（ＰＢＳ／２％ ＦＣＳで２００倍希釈）とともにインキュベートした。１５分のインキュベーションの後で細胞をＰＢＳ／２％ ＦＣＳで２回洗浄して、ＤＡＰＩ（Life Technologies）入りのＰＢＳ／２％ ＦＣＳに再懸濁させて、ＦＡＣＳによって分析した。第二の融合では、生じるＰＴＫ７特異的クローンのハイブリドーマを増やして、ＣＳ−１０凍結培地（Biolife Solutions）に冷凍保存して、液体窒素に保存した。
[0299] 第一融合物では、選択された抗原陽性ウェルに対して、限界希釈プレーティングを使用してサブクローニングを実施した。プレートについて、単一コロニー増殖の存在を目視検査してから、単一コロニーからの上清について、上記に記載のような抗原特異的ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ確認によってスクリーニングした。生じるクローン集団を増やして、凍結培地（９０％ ＦＢＳ，１０％ ＤＭＳＯ）において冷凍保存して、液体窒素に保存した。
[0300] 第一融合物では、陽性ウェルからのＰＴＫ７分泌ハイブリドーマ（２０分でのＯＤ４０５＞０．７５で４つのヒット）をさらなる特性決定のために選択した。
[0301] ４８プレート（４６０８ウェル）にわたって播いた第二融合物は、数百のヒットでほぼ６５％のクローニング効率をもたらした。選択したクローンは、ヒトＰＴＫ７に免疫特異的である数十のマウス抗体をもたらして、そのいくつかはマウスＰＴＫ７とも交差反応した。
実施例８
ＰＴＫ７モジュレーターの配列決定及びヒト化
８（ａ）配列決定：
[0302] 上述したことに基づいて、固定化したヒトＰＴＫ７へ結合するいくつかの例示の別個のモノクローナル抗体と、マウスＰＴＫ７と見かけ上高い親和性で交差反応する抗体を配列決定とさらなる分析のために選択した。図面６Ａ及び６Ｂ中の表形式に示すように、実施例７において作製した選択モノクローナル抗体からの軽鎖可変領域（図面６Ａ）及び重鎖可変領域（図面６Ｂ）の配列分析により、その多くが新規の相補性決定領域を有して、しばしば新規のＶＤＪ再配列を示すことが確認された。図面６Ａ及び６Ｂに示す相補性決定領域は、ＶＢＡＳＥ２分析に由来していることに留意されたい。
[0303] より具体的には、図面６Ａは、抗ＰＴＫ７抗体由来の２１種の新規マウス軽鎖可変領域（配列番号２０〜６０、偶数番号）と代表的なマウス軽鎖由来の４種のヒト化軽鎖可変領域（配列番号６２〜６８、偶数番号）の連続アミノ酸配列を図示する。同様に、図面６Ｂは、同じ抗ＰＴＫ７抗体由来の２１種の新規マウス重鎖可変領域（配列番号２１〜６１、偶数）とヒト化軽鎖を提供するのと同じマウス抗体由来の４種のヒト化重鎖可変領域（配列番号６３〜６９、偶数）の連続アミノ酸配列を図示する。このように、一緒にすると、図面６Ａ及び６Ｂは、２１種のマウス抗ＰＴＫ７抗体（ＳＣ６．２．３５、ＳＣ６．１０．２、ＳＣ６．４．１、ＳＣ６．５０．１、ＳＣ６．３、ＳＣ６．４、ＳＣ６．６、ＳＣ６．７、ＳＣ６．１３、ＳＣ６．１４、ＳＣ６．１５、ＳＣ６．１９、ＳＣ６．２０、ＳＣ６．２１、ＳＣ６．２３、ＳＣ６．２４、ＳＣ６．２６、ＳＣ６．２９、ＳＣ６．４１、ＳＣ６．５８、及びＳＣ６．５９と呼称される）と４種のヒト化抗体（ｈＳＣ６．２３、ｈＳＣ６．２４、ｈＳＣ６．４１、及びｈＳＣ６．５８と呼称される）の注釈付き配列を提供する。ＳＣ６．４．１とＳＣ６．４という呼称は、命名上の変則を単に反映するのであって、これらのモジュレーターは、実際には、新規の重鎖及び軽鎖可変領域がある２つの別個の抗体を含むことに留意されたい。
[0304] 本出願の目的では、それぞれの特別な抗体の配列番号が連続している。従って、ｍＡｂ ＳＣ６．２．３５は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域にそれぞれ配列番号２０と配列番号２１を含む。この関連で言えば、ＳＣ６．１０．２は、配列番号２２及び２３を含み、ＳＣ６．４．１は、配列番号２４及び２５を含む、といった具合である。さらに、本出願では、図面６Ａ及び６Ｂ中のそれぞれの抗体アミノ酸配列に対応する核酸配列が付帯の配列表として含まれる。この含まれる核酸配列は、対応するアミノ酸配列（重鎖又は軽鎖）より１００大きい配列番号を含む。ｍＡｂ ＳＣ６．２．３５の重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸配列（即ち、配列番号２０及び２１）をコードする核酸配列は、配列番号１２０及び１２１を含む。他の抗体核酸配列も、ヒト化構築体をコードするものも含めて、同等に番号付けされる。
[0305] 例示のモジュレーターを配列決定することの第一工程として、ＲＮＡを調製するために、選択したハイブリドーマ細胞をＴｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬（Life Technologies）に溶解させた。この点に関して言えば、１０４〜１０５個の細胞を１ｍｌ Ｔｒｉｚｏｌに再懸濁させて、２００μｌのクロロホルムの添加後に激しく振り混ぜた。次いで、試料を４℃で１０分間遠心分離させて、水相を新鮮な微量遠心管へ移して、ここに等量のイソプロパノールを加えた。この管を再び激しく振り混ぜて、そのまま室温で１０分間インキュベートした後で、４℃で１０分間遠心分離させた。生じるＲＮＡペレットを１ｍｌの７０％エタノールで１回洗浄して、室温で少しの間乾燥させた後で、４０μＬのＤＥＰＣ処理水に再懸濁させた。ＲＮＡ調製物の量は、１％アガロースゲルに３μＬを分画することによって定量して、その後、使用するまで、−８０℃で保存した。
[0306] 完全なマウスＶＨレパートリーに標的指向するように設計された、３２種のマウス特異的リーダー配列プライマーを含んでなる５’プライマーミックスをすべてのマウスＩｇアイソタイプに特異的な３’マウスＣγプライマーと組み合わせて使用して、それぞれのハイブリドーマのＩｇ重鎖の可変領域を増幅した。同じＰＣＲプライマーを使用して、ＶＨの４００塩基対ＰＣＲ断片を両端より配列決定した。同様に、Ｖｋマウスファミリーのそれぞれを増幅するように設計された３２種の５’Ｖｋリーダー配列プライマーミックスをマウスκ定常領域へ特異的な単一のリバースプライマーと組み合わせて使用して、κ軽鎖を増幅して配列決定した。このＶＨ及びＶＬ転写物は、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、１００ｎｇの全ＲＮＡより増幅した。
[0307] それぞれのハイブリドーマにつき全部で８回のＲＴ−ＰＣＲ反応（Ｖκ軽鎖についての４回と、Ｖγ重鎖（γ１）についての４回）を実行した。増幅には、QIAGEN ワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（Qiagen 社）を使用した。このキットは、Sensiscript 及び Omniscript の逆転写酵素、HotStarTaq ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰミックス、緩衝液及びＱ−溶液、「困難な」（例えば、ＧＣリッチ）鋳型の効率的な増幅を可能にする新規添加剤の混和物を提供する。抽出したＰＣＲ産物を、特異的Ｖ領域プライマーを使用して、直接的に配列決定した。ＩＭＧＴを使用してヌクレオチド配列を解析して、最高の配列相同性がある生殖細胞株Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子メンバーを同定した。Ｖ−ＢＡＳＥ２（Retter et al., 上掲）を使用して、そしてＶＨ及びＶＬ遺伝子のマウス生殖細胞株データベースへの並置によって、この導いた配列をＩｇ Ｖ及びＪ領域の既知の生殖細胞株ＤＮＡ配列と比較した。
[0308] ３μＬのＲＮＡ、１００μＭの重鎖又はκ軽鎖いずれかのプライマーの０．５μＬ、５μＬの５ｘＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、１μＬ ｄＮＴＰ、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを含有する１μＬの酵素ミックス、及び０．４μＬのリボヌクレアーゼ阻害剤ＲＮａｓｉｎ（Promega BioSystems）が含まれる反応混合物を調製した。この反応混合物は、逆転写とＰＣＲの両方に必要とされる試薬のすべてを含有する。熱サイクルプログラムは、ＲＴ（逆転写）工程、５０℃で３０分間、９５℃で１５分間に、３０サイクルの（９５℃で３０秒間、４８℃で３０秒間、７２℃で１．０分間）を続けた。次いで、７２℃で１０分間の最終インキュベーションがあった。
[0309] 直接的なＤＮＡ配列決定用のＰＣＲ産物を産生するために、ＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭＰＣＲ精製キットを製造業者のプロトコールに従って使用して、それらを精製した。このＤＮＡを、５０μＬの無菌水を使用してスピンカラムより溶出させてから、両鎖より直接的に配列決定した。再び、生じるＤＮＡ配列についてＶＢＡＳＥ２を使用して解析し（データ示さず）、図面６Ａ及び６Ｂに示す注釈付き配列を得た。より具体的には、上記に考察したように、２１種のマウス抗ＰＴＫ７抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の注釈付きアミノ酸配列を図面６Ａ及び６Ｂに示す。
８（ｂ）ヒト化：
[0310] 実施例７において作製したマウス抗体のうち４つを、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植法を使用してヒト化した。機能性ヒト生殖細胞株遺伝子に関する配列及び構造の類似性に基づいて、重鎖及び軽鎖のヒトフレームワークを選択した。この点に関して言えば、Chothia et al.（上掲）に記載のように、マウスカノニカルＣＤＲ構造を同じカノニカル構造のあるヒト候補物と比較することによって、構造類似性を評価した。
[0311] より具体的には、コンピュータ支援ＣＤＲ移植法（Abysis Database, UCL Business Plc.）と標準分子工学技術を使用してマウスの抗体：ＳＣ６．２３、ＳＣ６．２４、ＳＣ６．４１、及びＳＣ６．５８をヒト化して、ｈＳＣ６．２３、ｈＳＣ６．２４、ｈＳＣ６．４１、及びｈＳＣ６．５８のモジュレーターを得た。マウスフレームワーク配列とそのカノニカル構造に対するその最高の配列相同性に基づいて、可変領域のヒトフレームワーク領域を選択した。この解析の目的では、ＣＤＲドメインそれぞれへのアミノ酸の帰属は、Kabat et al. の番号付けに準拠する。最適のヒト化抗体を産生するためにいくつかのヒト化抗体変異体を作製したが、このヒト化抗体は、ヒトフレームワーク領域に関連する、マウスハイブリドーマ由来の抗原結合性の相補性決定領域（ＣＤＲ）を概して保持していた。最終的には、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを使用して測定されるように、ヒト化ＳＣ６．２３、ＳＣ６．２４、ＳＣ６．４１、及びＳＣ６．５８のｍＡｂは、そのマウス対照物と同様の親和性でヒトＰＴＫ７抗原へ結合することがわかった。
[0312] 当該技術分野で認められた技術を使用して、分子工学手順を実行した。そのために、製造業者のプロトコール（Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ ＲＮＡ精製システム、Life Technologies）に従って、先のハイブリドーマより全ｍＲＮＡを抽出した。それぞれのハイブリドーマを増幅するように設計された配列特異的５’リーダー配列プライマーを３’ヒトＣγ１プライマーと組み合わせて使用して、それぞれのヒト化抗体の可変領域を増幅してクローン化した。同様に、Ｖｋ領域のそれぞれを増幅するように特異的に設計された５’Ｖｋリーダー配列を、ヒトκ定常領域に特異的な単一のリバースプライマーと組み合わせて使用して、κ軽鎖を増幅してクローン化した。この増幅した断片をキメラのヒトγ１／κ鎖としてクローン化して、それぞれのヒト化ｍＡｂのベンチマークとして役立てた。
[0313] このヌクレオチド配列情報より、ＳＣ６．２３、ＳＣ６．２４、ＳＣ６．４１、及びＳＣ６．５８の重鎖及び軽鎖のＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントに関するデータを入手した。この配列データに基づいて、抗体のＩｇ ＶＨ及びＶＫ鎖のリーダー配列に特異的な新しいプライマーセットを組換えモノクローナル抗体のクローニングのために設計した。引き続き、このＶ−（Ｄ）−Ｊ配列をマウスＩｇ生殖細胞株配列と並置した。ＳＣ６．２３の重鎖遺伝子は、ＶＨ３６０９６（Ｖ）、ＤＳＰ２．３（Ｄ）、及びＪＨ３として同定された。ＳＣ６．２４の重鎖遺伝子は、ＶＨＪ５５８（Ｖ）、ＤＳＰ２．７（Ｄ）、及びＪＨ４として同定された。ＳＣ６．４１の重鎖遺伝子は、ＩＧＨＶ１４−４（Ｖ）、ＤＦＬ１６．１（Ｄ）、及びＪＨ２として同定された。ＳＣ６．５８の重鎖遺伝子は、ＩＧＨＶ４−１（Ｖ）、ＤＦＬ１６．１（Ｄ）、及びＪＨ４として同定された。４つの軽鎖は、いずれもＫクラスであった。軽鎖遺伝子については、ＳＣ６．２３ ｍＡｂではＩＧＫＶ１４−１１１及びＪＫ５として、ＳＣ６．２４ ｍＡｂではＩＧＫＶ３−５及びＪＫ１として、ＳＣ６．４１ ｍＡｂではＩＧＫＶ２−１３７及びＪＫ４生殖細胞株配列として、そしてＳＣ６．５８κ軽鎖ではＩＧＫＶ１７−１２１及びＪＫ４生殖細胞株配列として同定された。これらの結果をすぐ下の表１に要約する。
[0314] 全４つのクローンより入手した重鎖及び軽鎖配列を機能性ヒト可変領域配列へ並置して、相同性とカノニカル構造について検討した。この重鎖及び軽鎖解析の結果を下記の表２及び３にそれぞれ示す。
[0315] この生殖細胞株選択とＣＤＲ移植の方法により、その結合特性を概ね保持する抗体が提供されたので、この構築体のほとんどでマウスの残基を挿入する必要は、ほとんどないようであった。
[0316] 上記に述べたように、全４種の抗体のヒト化重鎖可変領域及びヒト化κ軽鎖のアミノ酸配列を図面６Ａ及び６Ｂ（配列番号６２〜６９）に示して、対応する核酸配列（配列番号１６２〜１６９）を付帯の配列表に示す。
[0317] より具体的には、ヒト化ＳＣ６．２３軽鎖のアミノ酸配列と対応する核酸配列（配列番号６２及び１６２）とヒト化重鎖のそれ（配列番号６３及び１６３）を図面６Ａ及び６Ｂと配列表に示す。同様に、ヒト化ＳＣ６．２４軽鎖のアミノ酸配列と対応する核酸配列（配列番号６４及び１６４）とヒト化重鎖のそれ（配列番号６５及び１６５）を同じ方法で示す。本発明の別の態様をヒト化ＳＣ６．４１軽鎖のアミノ酸配列と対応する核酸配列（配列番号６６及び１６６）とヒト化重鎖のそれ（配列番号６７及び１６７）によって例示する。なお別の態様では、ヒト化ＳＣ６．５８軽鎖のアミノ酸配列と対応する核酸配列（配列番号６８及び１６８）とヒト化重鎖のそれ（配列番号６９及び１６９）を図示する。下記の実施例で証明されるように、上述のヒト化抗体のそれぞれは、本明細書の教示に従って、有効なＰＴＫ７モジュレーターとして機能する。
[0318] いずれにしても、当該技術分野で認められた技術を使用して、開示モジュレーターを発現させて単離した。そのために、両方の重鎖の合成ヒト化可変ＤＮＡ断片（Integrated DNA Technologies）をヒトＩｇＧ１発現ベクター中へクローン化した。可変軽鎖断片は、ヒトＣ−κ発現ベクター中へクローン化した。この重鎖と軽鎖のＣＨＯ細胞への同時トランスフェクションによって、抗体を発現させた。
[0319] より具体的には、抗体産生のために、マウス及びヒト化の可変遺伝子ＰＣＲ産物のヒト免疫グロブリン発現ベクター中への一方向性クローニングを行った。Ｉｇ遺伝子特異的ＰＣＲに使用されるすべてのプライマーには、制限部位（ＩｇＨではＡｇｅＩとＸｈｏＩ、ＩｇＫではＸｍａＩとＤｒａＩＩＩ）が含まれ、これらによりヒトＩｇＧ１及びＩＧＫの定常領域をそれぞれ含有する発現ベクター中への直接的なクローニングを可能にした。簡潔に言えば、ＰＣＲ産物を Qiaquick ＰＣＲ精製キット（Qiagen 社）で精製して、ＡｇｅＩとＸｈｏＩ（ＩｇＨ）、ＸｍａＩとＤｒａＩＩＩ（ＩｇＫ）のそれぞれでの消化を続けた。発現ベクターへのライゲーションに先立って、消化されたＰＣＲ産物を精製した。全量１０μＬにおいて、２００Ｕ Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）、７．５μＬの消化及び精製済み遺伝子特異的ＰＣＲ産物、及び２５ｎｇの線状化ベクターＤＮＡでライゲーション反応を実施した。コンピテント大腸菌：ＤＨ１０Ｂ細菌（Life Technologies）を４２℃での熱ショックにより３μＬのライゲーション産物で形質転換させて、アンピシリンプレート（１００μｇ／ｍＬ）上へ播いた。次いで、ＶＨ領域のＡｇｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１（Lonza AG）発現ベクターの同じ部位へ挿入する一方、合成のＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ ＶＫ挿入物をそれぞれのｐＥＥ１２．４Ｈｕ−κ発現ベクターのＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ部位へクローン化した。
[0320] ２９３フェクチンを使用する、適正なプラスミドでのＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションによって、ヒト化抗体を産生する細胞を作製した。この点に関しては、プラスミドＤＮＡを QIAprep Spin カラム（Qiagen）で精製した。１０％熱不活性化ＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリンＧ（いずれも Life Technologies より）を補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の標準条件下で１５０ｍｍプレート（Falcon, Becton Dickinson）においてヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３Ｔ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１１２６８）細胞を培養した。
[0321] 一過性トランスフェクションのために、細胞を８０％の集密度まで増殖させた。１．５ｍＬ ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中５０μＬのＨＥＫ２９３トランスフェクション試薬と混合した１．５ｍＬ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭへ等量のＩｇＨと対応するＩｇＬ鎖ベクターＤＮＡ（各ベクターＤＮＡの１２．５μｇ）を加えた。この混合物を室温で３０分間インキュベートして、培養プレートへ均等に分配した。トランスフェクションの３日後に上清を採取し、１０％ ＦＢＳを補充した２０ｍＬの新鮮なＤＭＥＭに置き換えて、トランスフェクション後６日目に再び採取した。８００ｘｇで１０分間の遠心分離によって培養上清から細胞残滓を除いて、４℃で保存した。組換えキメラ抗体とヒト化抗体をプロテインＧビーズ（GE Healthcare）で精製した。
実施例９
ＰＴＫ７モジュレーターの特性
９（ａ）全般的なモジュレーター特性
[0322] 様々な方法を使用して、上記に説明したように産生した、選択したＰＴＫ７モジュレーター（マウスとヒト化の両方）の免疫化学特性を分析した。具体的には、上記抗体のいくつかについて、親和性、動態、ビニング（binning）、並びにカニクイザル及びマウスの相同体との交差反応性に関して（例えば、ＦｏｒｔｅＢＩＯによって）特性決定した。このモジュレーターの反応性は、還元及び非還元試料を使用するウェスタンブロットによっても測定して、エピトープが線状であるかないかに関するいくらかの示唆を得た。図面７Ａに示すマウス及びヒトの抗原結合データに加えて、選択したマウスモジュレーターについての抗体特性決定の結果を図面７Ｂにおいて表形式で示す。最後に、図面７Ｃ〜７Ｅに示すように、選択したマウス−ヒト化モジュレーターの親和性について、ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＲＥＤ（ForteBio 社）での生体層干渉法分析を標準抗原濃度系列とともに使用して、測定した。一般に、選択したモジュレーターは、相対的に高い親和性をナノモル濃度範囲で示した。
[0323] 本発明に従って、精度を確実にするために３つの様式でモジュレーター親和性を測定した。第一に、ＥＬＩＳＡにおいて、抗原の系列希釈液に対してプローブされる一定量の抗体について結合シグナルを測定して、相対的なモジュレーター活性を決定した（データ示さず）。第二に、次いで、標準抗原濃度系列での生体層干渉測定分析をＦｏｒｔｅＢＩＯ ＲＥＤ（ForteBIO 社）で使用して、選択したエフェクターの親和性及び運動定数（ｋｏｎ及びｋｏｆｆ）を測定した。最後に、選択したモジュレーターの親和性を表面プラズモン共鳴法（Biacore System, GE Healthcare）によって測定した。標準抗原濃度系列に基づいて、そして１：１ラングミュア結合モデルを使用して、抗原への抗体結合のＫｄと運動定数（ｋｏｎ及びｋｏｆｆ）を、当該技術分野で通常の技術を使用して決定した（例えば、図面７Ｃ及び７Ｅを参照のこと）。全般に、選択したエフェクターは、マウスのものでもヒト化のものでも、相対的に高い親和性をナノモル濃度範囲で明示した。図面７Ｂの表において、上付きのＢは、Ｂｉａｃｏｒｅで行った親和性測定値を示して、上付きのＦは、ＦｏｒｔｅＢｉｏで行った測定値を示す。
[0324] ＰＴＫ７エフェクターによって認識されるエピトープが連続アミノ酸を含むのか、又は抗原の二次構造によって並列される不連続アミノ酸によって形成されるのかを決定するために、予備研究も行った。この点に関しては、還元条件（例えば、０．５Ｍ ＤＴＴを使用する）と非還元条件の下でウェスタンブロットを行った。より具体的には、当該技術分野で周知の標準の電気泳動技術を使用して、両方の状態のＰＴＫ７抗原をゲル上に泳動させてブロッティングした後で、選択したモジュレーターへ曝露した。図面７Ｂに示すように、ジスルフィド結合がインタクトである場合（ＮＲ）のみ抗原と見かけ上反応する２つのＰＴＫ７モジュレーターについて試験した。残りのＰＴＫ７モジュレーターについては、ウェスタンブロット活性を試験しなかった。
[0325] 抗体ビニングに関しては、ＦｏｒｔｅＢＩＯ Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６分析機（ForteBio 社）を製造業者の説明書と当該技術分野で認められたサンドイッチ法［Analytical Biochemistry 386:172-180 (2009)］に従って使用して、同じ又は異なるビン（bins）へ結合する抗体を同定した。簡潔に言えば、抗体（Ａｂ１）を抗マウス捕捉チップ上に捕捉させた後で、高濃度の非結合抗体を１５μｇ／ｍＬ（１００ｎＭ）で使用してそのチップをブロックして、ベースライン値を確定した。次いで、実施例６において提供されたような単量体の組換えｈＰＴＫ７−Ｈｉｓ（アイソフォームａ）を特異抗体（Ａｂ１）によって捕捉させて、そのチップを、対照としての同一抗体（Ａｂ１）のあるウェルか又は異なる抗体（Ａｂ２）のあるウェルのいずれかへ浸漬した（ここでは、いずれの抗体も４μｇ／ｍＬ（２５ｎＭ）である）。新しい抗体との追加の結合が観測されたならば、Ａｂ１とＡｂ２は、異なるビンにあるものと判定された。対照のＡｂ１と同様に、さらなる結合が生じなければ、Ａｂ２は同じビンにあると判定された。この方法を拡張して、９６ウェルプレートにおいて独自のビンを表す完全列の抗体を使用して、独自抗体の大きなライブラリーについてスクリーニングすることができる。ヒトとマウスの両方のＰＴＫ７抗原について、３種の代表的なモジュレーターの例示データを図面７Ａに示す。図面７Ａは、ＳＣ６．１０．２がマウスへ全く結合しなかったのに対し、ＳＣ６．２．３５がヒトの約１０％で結合して、ＳＣ６．２５．１がマウスのＰＴＫ７−Ｈｉｓへ同一の親和性で結合したことを例証する（註；抗体は、図面７Ａでは、Ｈ２．３５、Ｈ１０．２、及びＨ２５．１と表示した）。さらに、これらの試験した抗体のそれぞれは、異なるビンに属すると判定された。同様の方法で、９つの追加のＰＴＫ７モジュレーターについてビニング分析を実施して、図面７Ｂに示す結果を得た。これらのデータにより、試験したモジュレーターによって認識される少なくとも７種の別個のビンが同定された。表中のＮＤは、データが判定不能であったことを示す。
[0326] 最後に、カニクイザル及びマウスのＰＴＫ７相同体に関する交差反応性について、組換え的に発現される単量体抗原を含んでなる濃度系列を使用して、ＦｏｒｔｅＢＩＯにおいて評価した。図面７Ｂに収載されるように、きわめて似ているカニクイザルＰＴＫ７とはすべての抗体が交差反応したのに対し、マウスＰＴＫ７と反応性であったのは、いくつかの例示モジュレーターであった。
９（ｂ）ヒト化モジュレーターの特性
[0327] 本実施例において上記に説明した技術を使用して、ヒト化構築体のｈＳＣ６．２３、ｈＳＣ６．２４、ｈＳＣ６．４１、及びｈＳＣ６．５８について分析して、それらの結合特性を判定した。加えて、ヒト化抗体の結合性を親マウスの抗体と直接比較して、両方の抗体について、ヒト化の方法によって生じる速度定数の微妙な変化を同定した。
[0328] より具体的には、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を使用するＢｉａｃｏｒｅによってマウスＳＣ６．２３の親和性を測定して、図面７Ｃに示す結果を得た。２５、１２．５、及び６．２５ｎＭの濃度系列（図面７Ｃ及び７Ｄ中の最上部から最下部への曲線を作成する）に基づいて、そして１：１ラングミュア結合モデルを使用して、抗原への抗体結合のＫｄが２．３ｎＭであると推定した。次いで、ヒト化ＳＣ６．２３構築体で行った同様の実験は、ヒト化の方法が親和性に悪影響を及ぼさなかったことを示唆する、同等の結果を示した（図面７Ｄ）。この点に関して言えば、この測定値は、ヒト化構築体が、治療用抗体の許容可能限界内に十分にある、３．９ｎＭの親和性を有することを示した。実施例８において記載したヒト化構築体のそれぞれについての同様の測定値を図面７Ｅに示して、本実施例において示した他の技術と共に、この開示したヒト化ＰＴＫ７モジュレーターが治療用抗体に望ましい特質を保有することを示す。
実施例１０
選択したＰＴＫ７モジュレーターのエピトープ決定
[0329] ビニングデータをさらに洗練させて、上記に示したように作製した選択ＰＴＫ７モジュレーターによって規定されるエピトープ領域を決定するために、ＰＴＫ７ ＥＣＤのいくつかの異なる変異体を構築して、発現させた。より具体的には、様々なＰＴＫ７ Ｉｇドメインを増幅するプライマーを使用してＰＴＫ７欠失変異体を設計して、これらを、合成遺伝子（DNA 2.0）として注文されるヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメインの上流にあるＢｇｌＩＩ制限部位へ融合した。次いで、これらのＦｃ融合タンパク質を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位を使用して、ｐＥＥ１２．４発現ベクター（Lonza AG）中へクローン化した。２９３フェクチン（Life Technologies）を使用する接着性２９３細胞のトランスフェクションに、単離した内毒素フリーのプラスミドＤＮＡ（Qiagen 社）を使用した。トランスフェクションから７２時間後に、２９３トランスフェクト細胞からの上清を採取した。具体的には、Ｆｃ領域へ融合させる以下の欠失構築体を設計した：
１．ＰＴＫ７ ＥＣＤ Ｉｇドメイン１〜２ （配列番号７０） 図面８Ａ
２．ＰＴＫ７ ＥＣＤ Ｉｇドメイン３〜７ （配列番号７１） 図面８Ｂ
３．ＰＴＫ７ ＥＣＤ Ｉｇドメイン１〜５ （配列番号７２） 図面８Ｃ
４．ＰＴＫ７ ＥＣＤ Ｉｇドメイン６〜７ （配列番号７３） 図面８Ｄ
５．ＰＴＫ７ ＥＣＤ Ｉｇドメイン２〜３ （配列番号７４） 図面８Ｅ
６．ＰＴＫ７ ＥＣＤ Ｉｇドメイン１〜４ （配列番号７５） 図面８Ｆ
７．ＰＴＫ７ ＥＣＤ Ｉｇドメイン１〜７ （配列番号３） 図面１Ｃ−ＥＣＤ
[0330] 上記構築体の最初の６つのアミノ酸配列を図面８Ａ〜８Ｆ（選択したＰＴＫ７ ＥＣＤをＦｃ領域と共に含んでなる）に示す。第七の構築体の配列は、Ｆｃドメインへ融合した、図面１Ｃに示すようなアイソフォームａの細胞外ドメイン（配列番号３）を含む。
[0331] 上記構築体を使用して、いくつかのモジュレーターについて、定義されたＩｇドメインの欠失があるＰＴＫ７タンパク質を認識する能力を試験した。ドメイン欠失構築体の使用を含んでなるＥＬＩＳＡアッセイにより、標準条件の下で行った。この点に関して言えば、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異抗体（Jackson Immunoresearch）でコートしたＥＬＩＳＡプレート上で、ＰＴＫ７ ＩｇドメインＦｃ融合物を捕捉した。次いで、様々な欠失Ｆｃ融合タンパク質へ結合するそれぞれのマウス抗ＰＴＫ７抗体の能力を、ＨＲＰ標識化ヤギ抗マウスＦｃ特異抗体で検出した。
[0332] このアッセイを使用して、特別なＰＴＫ７ Ｉｇドメインに対して指向されているものとして例示のモジュレーターを同定した。ＥＬＩＳＡ結果の１例は、それぞれの代表的な検出エピトープ又は結合パターンを明確にして、すぐ下の表４に含まれる。
[0333] ＥＬＩＳＡアッセイにおける陽性結合の異なるパターン（表４及び図面８Ｇ）に基づけば、抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体は、いくつかの異なるエピトープを認識するらしい。図面８Ｇにおいて、モジュレーターは、ＳＣ６ではなくて６Ｍとして収載されて、ＳＣ６．２．３５とＳＣ６．１０．２がＨ２．３５とＨ１０．２として収載されていることに留意されたい。Ｉｇドメイン６〜７内のエピトープだけへ結合する抗体はないが、これら２つのドメインは、ＳＣ６．１８とＳＣ６．３１（表中になし）が結合したＩｇ３−７Ｆｃ融合構築体の二次／三次構造へ貢献する可能性がある。さらに、３つの抗体（ＳＣ６．２．３５、ＳＣ６．４．１、及びＳＣ６．１０．２）は、最初の４つのＩｇドメイン中のエピトープを認識して、これら抗体のいずれも、Ｉｇドメイン６〜７内のエピトープへ結合しない。最初の４つのＩｇドメインにおいて、ＳＣ６．２．３５は、ドメイン１〜２内のエピトープへ結合する。ＳＣ６．４．１は、Ｉｇドメイン２及び３の境界内のエピトープを認識する。逆に、ＳＣ６．１０．２は、最初の４つのＩｇドメイン内のどの欠失にも影響されるように見えるので、４つのＩｇ様ドメインは、いずれもＳＣ６．１０．２のエピトープを規定することに関与している可能性がある。同様に、いくつかの抗体は、全長構築体、Ｉｇドメイン１〜７だけへ結合して、Ｉｇ欠失により、これらエピトープの結合部位又は二次構造の一部が破壊された可能性があることを示唆する。図面８Ｇは、追加の抗体と開示モジュレーターの結合局在化を示す比較可能データが含まれる、上記結合パターンの概略表示を提供し、ここでは、ＰＴＫ７ ＥＣＤの７つのＩｇドメインをブロック形式で表示して、括弧を使用して、それぞれの抗ＰＴＫ７抗体のこのＥＣＤ内の解明されたエピトープ位置に注目する。
実施例１１
例示の腫瘍試料におけるＰＴＫ７タンパク質の発現
[0334] 先の実施例において、上昇した遺伝子発現レベルを報告してＰＴＫ７に対する抗体を作製した後で、選択した患者腫瘍集団における対応するＰＴＫ７タンパク質の発現についての証拠を探求した。この点に関して言えば、１１の腫瘍型からの４３２の組織溶解物、又はそのそれぞれの正常隣接組織の４つの希釈液を含んでなる逆相癌タンパク質溶解物アレイ（ProteoScanＴＭArrays；OriGene Technologies）を、外因性プロモーターによって推進されるＴＰ５３過剰発現の有り無しのＨＥＫ２９３細胞からなる対照と共に提供した。実施例７に示すように作製してＰＴＫ７タンパク質を認識するマウスモノクローナルＰＴＫ７抗体（例えば、クローンＳＣ６．２．３５）を使用して、ウェスタンブロットによって、このアレイ上の溶解物中のＰＴＫ７タンパク質発現を検出した。比色検出試薬とプロトコールは、ProteoScan Arrays の製造業者によって提供されて、BZScan2 Java Software（INSERM-TAGC）を使用する平底型スキャナーを使用して、製作したアレイ上のスポットをデジタル画像へ変換して、スポット強度を定量した。
[0335] そのようなアッセイの結果は、ＰＴＫ７タンパク質の発現が、メラノーマ、非小細胞肺癌（ＮＳＣＣＬ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、結直腸癌、膵臓癌、乳癌、及び卵巣癌患者由来の腫瘍試料の亜集合において上方調節されていることを示す。選択した腫瘍についてのこれらアッセイからの例示データを図面９Ａ〜９Ｄに示す。より具体的には、図面９Ａは、ＰＴＫ７タンパク質発現が結直腸腫瘍標本の亜集合において有意に上昇しているように見える（特に、病期ＩＶ疾患の患者において、正常隣接組織、又はより初期の疾患より入手した標本由来の腫瘍組織と比較した場合）ことを示す。図面９Ｂに示すように、ＰＴＫ７タンパク質の発現は、ほとんどの神経内分泌膵臓腫瘍において、並びに乳癌（図面９Ｃ）及び卵巣癌（図面９Ｄ）の患者それぞれの亜集合においても上昇していた。上記の記載のようにデータを作成して、スポットあたりの平均ピクセル強度（スポット強度）として表した。各試料中の水平の黒いバーは、それぞれのカテゴリーの標本についての平均を表す。
[0336] 上記のデータは、ＰＴＫ７の過剰発現が結直腸癌中のＴＩＣ及び／又はＴＰＣに関連していて、増殖及び／又は生存に関与している可能性があるという上記実施例での観測事実を裏付ける。ａ）ＰＴＫ７遺伝子発現が結直腸癌中のＴＰＣ細胞亜集団と膵臓腫瘍中のＴＧ細胞亜集団に主に関連していること；ｂ）そのＰＴＫ７タンパク質発現がＴＩＣ細胞亜集団上でより高いこと；ｃ）ＰＴＫ７タンパク質発現が後期結直腸癌由来の腫瘍標本全体で上昇していること；及びｄ）全般的な観測事実は、後期腫瘍においてＴＩＣがより頻繁であるということを示す上述の実施例に照らせば、ＰＴＫ７は、腫瘍増殖、療法への抵抗性、及び腫瘍再発の根本原因であるそれらの細胞に関連しているように見えて、上記に言及した腫瘍のＴＰＣ及び／又はＴＩＣを支援するのにＰＴＫ７が不可欠な役割を担う可能性があるとする仮説を補強する。
[0337] 上記の結果を考慮して、ヒトの乳房（ＢＲ）、肺（ＬＵ）、卵巣（ＯＶ）、結腸（ＣＲ）及び腎臓（ＫＤＹ）腫瘍異種移植片の非腫瘍形成（ＮＴＧ）及び癌幹細胞（ＣＳＣ）集団内で、フローサイトメトリーを使用して、ＰＴＫ７の発現について評価した。実施例１に示されるように、表現型マーカーのＣＤ４６−／ｌｏＣＤ３２４−及びＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋をそれぞれ使用して、ＮＴＧ集団とＣＳＣ濃縮集団を同定し、モニターして、濃縮することができる。従って、免疫不全マウス由来のヒト腫瘍異種移植片を採取し、解離させて、市販の抗ＣＤ４６、抗ＣＤ３２４、及び抗ＰＴＫ７抗体（Miltenyi Biotech）で同時染色した後で、ＣＤ４６−／ｌｏＣＤ３２４−ＮＴＧ集団とＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋ＣＳＣ集団において、フローサイトメトリーを使用してＰＴＫ７発現について評価した。より具体的には、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭＩＩフローサイトメーター（BD Biosciences）で、アイソタイプ染色された蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）対照を、染色特異性を確定するために利用して、標準技術を使用して、フローサイトメトリー分析を実施した。
[0338] 例示の乳房、肺、卵巣、結直腸、及び腎臓の腫瘍試料についての結果を図面９Ｅに示し、ここでは、アイソタイプ対照を灰色部分で印し、ＮＴＧ細胞集団を破線によって表して、ＣＳＣ濃縮集団を実線によって示す。これら腫瘍のそれぞれのＮＴＧ集団では表面ＰＴＫ７染色が相対的に低かったのに対し、ＣＳＣ濃縮集団では表面ＰＴＫ７染色が顕著に上昇していたことが理解されよう。上記の結果は、いくつかの開示モジュレーターを使用してこれまでに追認されてきて（データ示さず）、試験した２５種より多い独自のＮＴＸ系（様々な固形腫瘍が含まれる）を代表している。
[0339] ＴＰＣの他の表面マーカーとＰＴＫ７の発現パターンとの相関性について、ＮＳＣＬＣと卵巣癌における腫瘍形成試験において機能的にさらに明確化した。上記のように染色した、解離したヒト腫瘍異種移植片より、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によってＰＴＫ７−及びＰＴＫ７＋腫瘍集団を単離して、同数をＭａｔｒｉｇｅｌ（BD Biosciences）と混合して、ＮＯＤ／ＳＣＩＤレシピエントマウス中へ皮下移植した。ＰＴＫ７−細胞がレシピエントマウスにおいて腫瘍を産生し得なかった一方で、ＰＴＫ７＋腫瘍細胞は、ＮＳＣＬＣと卵巣の両方の癌腫で、迅速に増殖する腫瘍を一貫して産生した。従って、本明細書の教示によれば、ＰＴＫ７は、卵巣癌とＮＳＣＬＣにおいてＴＰＣを機能的に描写して、開示モジュレーターの診断剤及び診断・治療剤としての有用性についてのさらなる裏付けを提供する。
実施例１２
選択されたＰＴＫ７モジュレーターは、Ｋ５６２細胞とＧ４０１細胞によって内在化される。
[0340] 上記の記載のようにマウスを免疫化することによって産生したハイブリドーマからのＰＴＫ７モジュレーターについて、Ｋ５６２細胞とＧ４０１細胞に内在化するその能力をスクリーニングした。
[0341] この点に関して言えば、１０６個／ｍｌ（単一細胞懸濁液）の出発濃度でのＫ５６２細胞を Human TruStain（BioLegend 社、422302）で、室温で１０分間ブロックした。細胞を反応あたり５０ｘ１０３個の細胞へ希釈した。同一２検体の試料を、最終容量５０μｌの抗体上清で、氷上にて３０分間染色してから、ＦＡＣＳ染色培地（ＦＳＭ；２％胎仔ウシ血清／ハンクス緩衝化生理食塩水溶液／２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］Mediatech 社）で洗浄して、非結合抗体を除去した。これに、ロバ抗マウスＡｌｅｘａ６４７（Life Technologies）での氷上で３０分間の第二染色を続けた。次いで、細胞を再び洗浄して未結合抗体を除去して、試料を内在化培地（２％胎仔ウシ血清／イスコブ（Iscove's）改良ダルベッコ培地）に再懸濁させて、内在化を可能にするために、５％ ＣＯ２において３７℃で（又は、対照では４℃で）１時間インキュベートした。試料を氷へ移して氷冷ＦＳＭを加えることによって、この反応を止めた。内在化せずに細胞表面に残ったあらゆる抗体を除去するために、試料を低ｐＨのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ［ｐＨ２．０］）で、氷上で１０分間処理した。この「酸ストリップ」手順に続いて、試料をＦＳＭで十分洗浄し、２μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（Life Technology）を含有する１５０μｌのＦＳＭに再懸濁させて、BD FACS Canto フローサイトメーターで分析した。本実験において氷上でインキュベートした細胞より検出されるものに優る、どの蛍光の増加も、［蛍光分子が低ｐＨリン酸緩衝液処理の間に細胞表面より剥がれ落ちることを護る］抗体内在化の能力より生じたものである。すべてのインキュベーションは、他に述べなければ、ＦＡＣＳ染色培地において実施した。
[0342] 上記に記載の酸ストリッププロトコールを使用して、ＰＴＫ７抗体含有ハイブリドーマ上清の個別クローンについてスクリーニングするとき、いくつかの上清は、非染色細胞とＩｇＧ陰性対照抗体に対して蛍光のポジティブシフトを示した（図面１０Ａ及び１０Ｂ）。いくつかの抗ＰＴＫ７抗体では、Ａｌｅｘａ二次抗体を酸ストリッピングから護って、蛍光の右方へのシフトをもたらす、これら抗体の能力によって証明されるように、抗体内在化が観測された。抗体クローン、ＳＣ６．１０．２（即ち、図面１０Ｃ中のＨ１０）は、この活性のある抗ＰＴＫ７抗体による典型的な内在化能力の例である。ＩｇＧ対照と比較すると、ＰＴＫ７抗体含有上清のほぼ１５％（２７のうち４）が内在化を引き起こした。Ｋ５６２細胞を使用すると、このデータは、ＰＴＫ７ ＥＣＤへ結合することが可能な抗体の亜集合が細胞上に提示されるままの抗原へ結合して効率的に内在化することが可能であることを証明する。
[0343] 開示モジュレーターが様々な例示の細胞株において内在化に媒介し得ることを示すさらなる証拠を図面１０Ｄに示す。より具体的には、膠芽腫細胞株（Ｇ４０１ウィルムス腫瘍細胞）は、高レベルのＰＴＫ７を発現することが見出され（データ示さず）、この細胞株が選択されたアッセイ条件の下でより感受性があって、それ故に、内在化を誘発することが可能なモジュレーターをより効果的に同定することが可能であり得ることを示唆した。これらの細胞を上述した酸ストリップ手順で概ね使用して、実施例７からの１７０の独自ハイブリドーマ上清についてスクリーニングして、それらが内在化抗体を含有するかどうかを判定した。上述のスクリーニングにおいて同定された精製抗体、ＳＣ６．２．３５、ＳＣ６．１０．２、及びＳＣ６．２５．３（図面１０Ｄにおいて、Ｈ２．３５、Ｈ１０．２、及びＨ２５．３と表示される）を陽性対照として使用した（図面１０Ｄ）。６種の例示の上清（ウェル表記によって同定される）に存在するモジュレーターの内在化能力を対照の真下に示す。このより洗練されたアッセイを用いると、このデータは、上記に考察した免疫化手順によって提供される数多くのモジュレーターが、ＰＴＫ７へ結合して内在化することができることを示す（１Ａ０２、１Ｆ０２、２Ａ０３、及び２Ｆ１０によって裏付けられるように）。但し、どのクローン（２Ｆ１１と２Ｆ０９）も、この能力を保有したわけではない。
[0344] 開示モジュレーターの特質に関するなおさらなる証明において、Ｇ４０１細胞へ結合したすべてのスクリーニングされた抗体は、有意な方法で、ある程度は内在化することが見出された（図面１０Ｅ）。図面１０Ｅ中の破線によって表されるように、０〜３％の細胞の非特異的な染色を示すマウスアイソタイプ対照抗体に基づいて、陽性細胞染色を４％へ設定した。それぞれの抗体で染色したＧ４０１細胞の平均蛍光強度を酸ストリップ工程の後で（即ち、内在化の後で）３７℃と４℃で測定して、既知数の蛍光分子を含有する８色虹ビーズ（BD Spherotech ＃559123）を使用して、細胞あたりの相対受容体数へ内挿した。内在化工程を４℃で行った試料より得られる受容体数（対照）を３７℃でのそれより差し引くことによって、内在化受容体の数を計算した。内在化される受容体の数が細胞結合のレベルとは無関係に１０倍も異なること（図面１０Ｅの右上象限）を考慮すると、ＰＴＫ７特異抗体は、内在化を誘発するその能力において不均質であることが注目された。
実施例１３
ＰＴＫ７モジュレーターは、細胞傷害剤の送達を促進する
[0345] 抗体へ安定的に連結した細胞傷害薬の標的化は、固形腫瘍のある患者へ大きな治療利益を与える可能性がある、強化された抗体アプローチを代表する。上記に記載の内在化するＰＴＫ７特異抗体が細胞傷害剤の生細胞への送達を媒介することができるかどうかを判定するために、リボソーム不活性化タンパク質、サポリン（Advanced Targeting Systems）へコンジュゲートしたストレプトアビジンをビオチニル化ＰＴＫ７抗体へ結合させる in vitro 細胞殺傷アッセイを実施して、これらのサポリン複合体が内部化して細胞を殺傷する能力を、細胞生存度を測定することによって、７２時間後に測定した。
[0346] 具体的には、ウェルあたり１ｘ１０４個のＧ４０１ウィルムス腫瘍細胞を９６ウェルプレートのウェルに播いた。上記に記載の抗ＰＴＫ７抗体の形態でＰＴＫ７モジュレーターを上清より精製し、ビオチニル化してから、２０μｇ／ｍＬへ希釈した。それぞれの抗体のアリコートをストレプトアビジン−ＺＡＰ（Advanced Targeting Systems）と１：１で混合し、５秒間激しく振り混ぜてから、室温で１時間インキュベートした。次いで、抗体−サポリン複合体の３つの更なる１０倍系列希釈液を作製して、各混合物のそれぞれ５０μＬをＧ４０１細胞含有ウェルへ加えた。次いで、この細胞／抗体−サポリン混合物を３７℃／５％ ＣＯ２で２４時間インキュベートした。このインキュベーションに続いて、細胞を丸底９６ウェルプレートにおいてスピンダウンさせ、上清を除去して、１００μＬの新鮮な培養基を各ウェルへ加えた。次いで、この細胞をさらに７２時間インキュベートした後で、CellTiter-Glo（プロメガ社）を製造業者のプロトコールに従って使用して、生存細胞数を計数した。
[0347] 上記に記載の細胞殺傷アッセイを使用して、クローン：ＳＣ６．２．３５、ＳＣ６．１０．２、及びＳＣ６．２５．３（図面１１Ａにおいて、Ｈ２．３５、Ｈ１０．２、及びＨ２５．３と表示される）由来の抗体を含んでなる例示の内在化ＰＴＫ７モジュレーターがサポリン毒素内在化と細胞殺傷とを媒介することが示された。より特別には、図面１１Ａは、非特異的なアイソタイプ対照抗体（即ち、ＭＯＰＣ）とは対照的に、ＰＴＫ７媒介内在化による細胞殺傷をもたらす上記モジュレーターの能力を明らかに証明する。このようなデータは、開示モジュレーターがＰＴＫに免疫特異的であって、細胞傷害性ペイロードの送達を媒介して細胞表面会合を介してＰＴＫ７陽性細胞を殺傷することが効果的に可能であることを証明する。
[0348] 上述した殺傷アッセイの延長において、ＰＴＫ７特異抗体を介した細胞傷害性ペイロードの送達を、さらに４種の例示モジュレーター（ＳＣ６．２３、ＳＣ６．４１、ＳＣ６．５１、及びＳＣ６．５８）を使用して（陽性対照としてＳＣ６．１０．２を使用する）証明した。このために、以下の細胞種を、抗体と毒素の添加の１日前に、そのそれぞれの培養基中の９６ウェル組織培養プレートへ播いた（５００細胞／ウェル）：Ｇ４０１ウィルムス腫瘍細胞、レトロウイルス形質導入を使用してその細胞表面にＰＴＫ７分子を発現するように工学処理したＨＥＫ２９３Ｔ（ここでは、２９３．ＰＴＫ７細胞として表示する）、及び対照として機能するＨＥＫ２９３Ｔ。
[0349] このアッセイのために、プレート培養細胞を含有するウェルへ精製済みのＰＴＫ７モジュレーターを様々な濃度で加えた。モジュレーターの添加に続いて、サポリン（Ｆａｂ−ＺＡＰ，Advanced Targeting Systems，＃ＩＴ−４８）へ共有結合した一定量の抗マウスＩｇＧ Ｆａｂ断片を４ｎＭの濃度でこのウェルへ加えて、この培養物を７２時間インキュベートした。生存細胞数を、CellTiter-Glo を使用して、上記に記載のように定量した。サポリン−Ｆａｂ断片とともに細胞を含有する培養物（但し、モジュレーター無し）を使用する未処理（raw）発光カウントを１００％基準値として設定して、他のすべてのカウントをそれに従って計算した（「正規化ＲＬＵ」として言及する）。
[0350] このアッセイを使用して、（アイソタイプ対照抗体以外の）試験したすべてのＰＴＫ７抗体が標的細胞を殺傷することが可能であることを証明した（図面１１Ｂ〜１１Ｄ）［ここで図面１１Ｂ、１１Ｃ、及び１１Ｄは、それぞれＧ４０１細胞、２９３．ＰＴＫ７細胞、及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対するモジュレーターの影響を例解する］。モジュレーター媒介性の内在化及び殺傷は、細胞種（図面１１Ｂ−Ｇ４０１細胞と１１Ｄ−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を比較すること）、ＰＴＫ７の標的細胞上での発現レベル（図面１１Ｃ−２９３．ＰＴＫ７細胞と１１Ｄ−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を比較すること）、及び様々なモジュレーターの内在化する固有能力に依存することが理解されよう。本アッセイは、内在化が主としてＰＴＫ７特異抗体の細胞表面への結合により、追加の架橋形成の必要なく生じることをさらに証明する。図面１１Ｂ〜１１Ｄの用量応答曲線を作成するために使用するデータ（並びに、追加のモジュレーターについて同様に導いた数値−示さず）に基づいて、試験したモジュレーター／標的細胞の組合せそれぞれについて、５０％有効濃度（「ＥＣ５０」）を決定した。より具体的には、すぐ下の表５は、すぐ上記に記載のアッセイを使用して３種の標的細胞のそれぞれについて決定した１３種のモジュレーターのＥＣ５０を（ｐＭで）収載する。ＮＤは、数値を決定しなかったことを示す。
[0351] 個々のモジュレーターの間では、殺傷に関してのいくらかの変動が注目されたが、表５のデータより明白であるいくつかの全般的な傾向があった。この点に関連すると、当該モジュレーターは、Ｇ４０１細胞又は野性型２９３細胞のいずれかより、工学処理されたＰＴＫ過剰発現２９３細胞の細胞殺傷を仲介することにおいて、全般により有効であった。興味深いことに、試験したモジュレーターの多くは、ＰＴＫ７を細胞表面で発現することが知られている非工学処理Ｇ４０１腫瘍細胞の殺傷に媒介することに比較的有効であった。このような再現可能な結果は、本明細書に例示した広範囲の内在化するＰＴＫ７モジュレーターの治療ポテンシャルに関して示唆的である。
実施例１４
ＰＴＫ７モジュレーターは、細胞傷害剤の腫瘍形成細胞への送達を促進する
[0352] 先の実施例の結果を確証して、ＰＴＫ７モジュレーターが毒素内在化と原発性ヒト腫瘍細胞の細胞殺傷に媒介し得ることを証明するために、マウスの系統枯渇（lineage-depleted）ＮＴＸ細胞（即ち、免疫不全マウス中の低継代異種移植片として増殖させたヒト腫瘍細胞）をプレート培養して、その後、抗ＰＴＫ７抗体とＦａｂ−ＺＡＰへ曝露した。
[0353] 具体的には、肺（ＬＵ）、卵巣（ＯＶ）癌、及びメラノーマ（ＳＫ）患者由来のＮＴＸ腫瘍を単一細胞懸濁液へ解離させて、癌幹細胞増殖に有利である、当該技術分野で認められた技術を使用する、増殖因子補充無血清培地において、ＰｒｉｍａｒｉａＴＭプレート（BD Biosciences）に播いた。３７℃／５％ ＣＯ２／５％ Ｏ２で３〜５日の培養後、上記細胞を、先の実施例において概ね示したように、アイソタイプ対照（ＩｇＧ２ａ）抗体又は３種のマウス抗ＰＴＫ７抗体（０．１ｎＭでのＳＣ６．２．３５、ＳＣ６．１０．２、又はＳＣ６．２５．１；ＳＣ６．Ｈ２、ＳＣ６．Ｈ１０、及びＳＣ６．Ｈ２５と標示）の１つ、及びＦａｂ−ＺＡＰ（４０ｎＭで）と接触させた。次いで、モジュレーター媒介性サポリン細胞傷害性について、CellTiter Glo を製造業者の説明書に従って５〜７日後に使用して残存細胞数を定量することによって評価した。この結果は、未処置細胞へ正規化した。
[0354] 図面１２に見られるように、試験したモジュレーター（但し、アイソタイプ対照を除く）のそれぞれへの曝露は、すべての腫瘍型で生細胞数の低下をもたらした。この点に関連して言えば、細胞殺傷の量は、一見して、特定の腫瘍細胞株と、並びに特別なモジュレーターに依存していると理解されよう。上記のデータは、本発明のモジュレーターが、様々な腫瘍型由来の様々な抗原発現細胞と免疫特異的に会合し、内在化して、それによって構成細胞の殺傷に媒介することができることを示す。さらに、先に記載のような癌幹細胞増殖に有利である条件の下で培養したＮＴＸ腫瘍細胞株に関してそれをなし得る、開示モジュレーターの能力は、癌幹細胞を選択的に消失させるそれらの能力を強く示唆している。
実施例１５
ＰＴＫ７モジュレーターは、癌幹細胞の腫瘍形成性を低下させる
[0355] 癌幹細胞の頻度を低下させてそれらの腫瘍形成ポテンシャルに影響を及ぼす、開示モジュレーターの能力をさらに確かめるために、ＮＴＸ乳房腫瘍細胞をＳＣ６．２．３５で処理して、その後、免疫不全マウスへ移植した。
[0356] この点に関して言えば、２種の乳癌患者由来ＮＴＸ腫瘍（ＢＲ１３及びＢＲ６４）を解離させて、このヒト腫瘍細胞を、腫瘍形成細胞を維持することが当該技術分野で知られている条件の下で培養して、先の実施例において示したように、ＰＴＫ７モジュレーター（とアイソタイプ対照）及びＦａｂ−ＺＡＰで処理した。次いで、細胞生存度に関して、処理の１４日後に CellTiter Glo を製造業者の説明書に従って使用して、細胞傷害性を測定した。再び、この結果は、未処置細胞へ正規化した。
[0357] 図面１３Ａ及び１３Ｂにそれぞれ見られるように、ＢＲ１３（図面１３Ａ）とＢＲ６４（図面１３Ｂ）に由来する乳房腫瘍細胞は、ＰＴＫ７モジュレーター媒介性の免疫特異的な会合とサポリン細胞傷害剤の内在化を介してほぼ消失した。より具体的には、ＩｇＧ２ａ対照処理細胞がほとんど影響されなかったのに対して、ＰＴＫ７モジュレーター、Ｃ６．２．３５（ＳＣ６．Ｈ２）の０．２ｎＭでの処理は、該細胞のほぼ７０〜８０％の消失をもたらした。この知見は、実施例１３で見られた結果と一致していて、多様な腫瘍に由来する腫瘍永続化細胞を消失させる、開示モジュレーターの能力に基づいた、本発明の広い応用可能性をさらに証明する。
[0358] 開示モジュレーターが腫瘍始原細胞を消失させることを確かめるために、２種の乳癌細胞株からの処理済み調製物をマウスへ移植して、腫瘍始原細胞が生きたままでいるかどうかを判定した。より具体的には、同一３検体のウェルからの細胞をそれぞれ独立的に採取し、２％ ＢＳＡ含有ＰＢＳにおいて洗浄し、１００μｌに再懸濁させてから、実施例１に示した手順を概ね使用して、個々の免疫不全マウスへ移植した。マウスについて腫瘍増殖を毎週モニターして、生じる腫瘍を測定して、その体積を計算した。ＩｇＧ対照で処理されたＮＴＸ ＢＲ１３及びＢＲ６４細胞が移植されたマウスだけが腫瘍を発現したのに対して、ＰＴＫ７モジュレーターと接触させた細胞を移植したものは、腫瘍を発現しなかった。これらの結果は、毒素送達に媒介することができるＰＴＫ７モジュレーターによってＴＩＣが消失されることを証明する（図面１３Ｃ）。
[0359] 上記データの検討は、いずれかの乳癌細胞株のＰＴＫ７モジュレーター及びサポリンでの処理後に残っている生細胞を移植しても腫瘍の形成を生じないことを示す。逆に、両方の乳癌細胞株由来の対照細胞（即ち、アイソタイプ対照抗体で処理したもの）は、移植時に腫瘍増殖を再始動させることができた。特に、それぞれの対照細胞株（ＢＲ２２及びＢＲ６４）が移植された３匹のマウスのうち２匹は、適度の腫瘍を発現して、移植された細胞に腫瘍永続化細胞が含まれることを示した。より重要にも、モジュレーター処理済み細胞が腫瘍を形成し得ないことより、移植された細胞に腫瘍永続化細胞が含まれなかったことが強く推量される。即ち、ＰＴＫ７モジュレーター／サポリンの組合せでの処理は、本発明による腫瘍永続化細胞に選択的に標的指向して、これを消失させた可能性がある。いずれにしても、上記データは、開示モジュレーターでの処理が腫瘍細胞の腫瘍形成ポテンシャルを低下させるのに有効であることを証明する。
実施例１６
ヒト化ＰＴＫ７モジュレーターは、細胞傷害剤の送達を媒介する
[0360] 本発明の好ましい態様では、治療現場においてヒト化ＰＴＫ７モジュレーターが利用される可能性があるので、ヒト化抗ＰＴＫ７抗体（実施例８に示すように作製する）が細胞傷害剤の送達を介した細胞殺傷の有効なメディエーターとして機能することを証明する研究を実施した。
[0361] より特別には、３種の例示ヒト化ＰＴＫ７モジュレーター（ｈＳＣ６．２３、ｈＳＣ６．５８、及びｈＳＣ６．２４）を利用して、本明細書の教示に従って、細胞傷害性ペイロードの導入に媒介して腫瘍形成細胞を消失させた。上記の実施例１３に示したプロトコールを概ね使用して、ＰＴＫ７を発現するように工学処理したＨＥＫ２９３細胞（即ち、２９３．ＰＴＫ７細胞）を、様々な濃度の選択モジュレーターと抗ヒトＦａｂ（Ｆａｂ−ＺＡＰヒト、Advanced Targeting Systems）へ連結したサポリンへ曝露した。インキュベーションに続いて、この細胞を洗浄してから、モジュレーター媒介性サポリン細胞傷害性について、CellTiter Glo を製造業者の説明書に従って５〜７日後に使用して残存細胞数を定量することによって評価した。この結果を未処置細胞へ正規化して、図面１４にグラフ表示する。
[0362] 図面１４に示す曲線の検証は、試験したＰＴＫ７モジュレーターの全３種が、細胞生存度を低下させる細胞傷害性ペイロードの内在化を誘発するのにきわめて有効であったことを示す。この点に関して言えば、このモジュレーターのそれぞれは、細胞生存度の５０％低下を１ｐＭと１０ｐＭの間の濃度で、そして細胞生存度の８０％より多い低下を１００ｐＭの濃度でもたらした。再び、本開示によれば、上記のデータは、選択される細胞集団への細胞傷害剤の送達を免疫特異的に媒介することができる、きわめて有効なモジュレーターのことを示唆する。
[0363] 当業者は、本発明が、その精神又は主要属性より逸脱することなく他の特定の形態で具現化し得ることをさらに理解されよう。上記の本発明の記載は、その例示態様だけを開示したのであって、他の変更態様も本発明の範囲内にあると考慮されると理解されたい。従って、本発明は、本明細書において詳しく記載した特別な態様に限定されない。むしろ、本発明の範囲及び内容を示すものとしては、付帯の特許請求項を参照にすべきである。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］単離されたＰＴＫ７モジュレーター。
［態様２］ＰＴＫ７モジュレーターがＰＴＫ７アンタゴニストを含む、態様１に記載の単離されたＰＴＫ７モジュレーター。
［態様３］ＰＴＫ７モジュレーターが抗体又はその免疫反応性断片を含む、態様１に記載の単離されたＰＴＫ７モジュレーター。
［態様４］抗体又はその免疫反応性断片がモノクローナル抗体を含む、態様３に記載の単離されたＰＴＫ７モジュレーター。
［態様５］モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体からなる群より選択される、態様４に記載の単離されたＰＴＫ７モジュレーター。
［態様６］前記モノクローナル抗体が中和抗体を含む、態様４に記載の単離されたＰＴＫ７モジュレーター。
［態様７］前記モノクローナル抗体が内在化抗体を含む、態様４に記載の単離されたＰＴＫ７モジュレーター。
［態様８］前記モノクローナル抗体が、アイソフォームａ、アイソフォームｂ、アイソフォームｃ、及びアイソフォームｄからなる群より選択されるＰＴＫ７アイソフォームと会合する抗体を含む、態様４に記載の単離されたＰＴＫ７モジュレーター。
［態様９］前記モノクローナル抗体がアイソフォームａと会合する抗体を含む、態様８に記載の単離されたＰＴＫ７モジュレーター。
［態様１０］前記モノクローナル抗体が３つの相補性決定領域を有する軽鎖可変領域と３つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域とを含み、ここで重鎖及び軽鎖の相補性決定領域は、図面６Ａ及び図面６Ｂに示す相補性決定領域を含む、態様９に記載の単離されたＰＴＫ７モジュレーター。
［態様１１］前記モノクローナル抗体が軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、ここで前記軽鎖可変領域は、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、及び配列番号６０に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、そしてここで前記重鎖可変領域は、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、及び配列番号６１に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様９に記載の単離されたＰＴＫ７モジュレーター。
［態様１２］細胞傷害剤をさらに含んでなる、態様１０又は１１に記載の単離されたＰＴＫ７モジュレーター。
［態様１３］態様１０又は１１に記載の単離されたＰＴＫ７モジュレーターのＰＴＫ７への結合を少なくとも約４０％阻害する競合抗体を含んでなる、単離されたＰＴＫ７モジュレーター。
［態様１４］態様１１に記載のアミノ酸重鎖可変領域又はアミノ酸軽鎖可変領域をコードする核酸。
［態様１５］態様１４に記載の核酸を含んでなるベクター。
［態様１６］配列番号３に示されるアミノ酸配列又はその断片を含んでなる、態様１に記載の単離されたＰＴＫ７モジュレーター。
［態様１７］ＰＴＫ７モジュレーターが免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部をさらに含む、態様１６に記載の単離されたＰＴＫ７モジュレーター。
［態様１８］モジュレーターが、それを必要とする被検者への投与時に腫瘍始原細胞の頻度を低下させる、態様１に記載の単離されたＰＴＫ７モジュレーター。
［態様１９］頻度の低下が、腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を使用して決定される、態様１８に記載の単離されたＰＴＫ７モジュレーター。
［態様２０］頻度の低下が、腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている腫瘍細胞表面マーカーの免疫組織化学検出を使用して決定される、態様１８に記載の単離されたＰＴＫ７モジュレーター。
［態様２１］前記腫瘍始原細胞が腫瘍永続化細胞を含む、態様１８に記載の単離されたＰＴＫ７モジュレーター。
［態様２２］細胞傷害剤をさらに含んでなる、態様１に記載の単離されたＰＴＫ７モジュレーター。
［態様２３］態様１に記載の単離されたＰＴＫ７モジュレーターを含んでなる医薬組成物。
［態様２４］前記単離されたＰＴＫ７モジュレーターがモノクローナル抗体を含む、態様２３に記載の医薬組成物。
［態様２５］前記モノクローナル抗体がヒト化抗体を含む、態様２４に記載の医薬組成物。
［態様２６］前記ヒト化抗体が、ｈＳＣ６．２３、ｈＳＣ６．２４、ｈＳＣ６．４１、及びｈＳＣ６．５８からなる群より選択される抗体を含む、態様２５に記載の医薬組成物。
［態様２７］前記ＰＴＫ７モジュレーターが汎ＰＴＫ７モジュレーターを含む、態様１に記載の単離されたＰＴＫ７モジュレーター。
［態様２８］治療有効量のＰＴＫ７モジュレーターを、それを必要とする被検者へ投与することを含んでなる、ＰＴＫ７関連障害を治療する方法。
［態様２９］前記ＰＴＫ７モジュレーターがＰＴＫ７アンタゴニストを含む、態様２８に記載の方法。
［態様３０］前記ＰＴＫ７モジュレーターが抗体又はその免疫反応性断片を含む、態様２８に記載の方法。
［態様３１］抗体又はその免疫反応性断片がモノクローナル抗体を含む、態様３０に記載の方法。
［態様３２］モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体からなる群より選択される、態様３１に記載の方法。
［態様３３］前記モノクローナル抗体が軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、ここで前記軽鎖可変領域は、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、及び配列番号６０に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、そしてここで前記重鎖可変領域は、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、及び配列番号６１に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様３２に記載の方法。
［態様３４］前記モノクローナル抗体がヒト化抗体である、態様３３に記載の方法。
［態様３５］前記モノクローナル抗体が中和抗体を含む、態様３１に記載の方法。
［態様３６］前記モノクローナル抗体が内在化抗体を含む、態様３１に記載の方法。
［態様３７］前記内在化抗体が細胞傷害剤を含む、態様３６に記載の方法。
［態様３８］前記ＰＴＫ７関連障害が過剰増殖性障害を含む、態様２８に記載の方法。
［態様３９］前記過剰増殖性障害が新生物障害を含む、態様３８に記載の方法。
［態様４０］前記新生物障害が固形腫瘍を含む、態様３９に記載の方法。
［態様４１］新生物障害が、副腎癌、膀胱癌、子宮頚部癌、子宮内膜癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、結直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、又は乳癌を含む、態様４０に記載の方法。
［態様４２］前記新生物障害が血液系腫瘍を含む、態様３９に記載の方法。
［態様４３］前記血液系腫瘍が白血病又はリンパ腫を含む、態様４２に記載の方法。
［態様４４］前記新生物障害に罹患している被検者が、腫瘍始原細胞を含んでなる腫瘍を明示する、態様３９に記載の方法。
［態様４５］腫瘍始原細胞の頻度を前記被検者において低下させる工程をさらに含んでなる、態様４４に記載の方法。
［態様４６］頻度の低下が、腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析、又は腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている腫瘍細胞表面マーカーの免疫組織化学検出を使用して決定される、態様４５に記載の方法。
［態様４７］頻度の低下が、in vitro 又は in vivo の限界希釈分析を使用して決定される、態様４５に記載の方法。
［態様４８］頻度の低下が、生きたヒト腫瘍細胞の免疫不全マウス中への移植を含んでなる in vivo 限界希釈分析を使用して決定される、態様４７に記載の方法。
［態様４９］in vivo 限界希釈分析を使用して決定される頻度の低下が、ポアソン分布統計を使用する腫瘍始原細胞頻度の定量を含む、態様４８に記載の方法。
［態様５０］頻度の低下が、生きたヒト腫瘍細胞の in vitro コロニー支持条件中への限界希釈沈着を含んでなる in vitro 限界希釈分析を使用して決定される、態様４７に記載の方法。
［態様５１］in vivo 限界希釈分析を使用して決定される頻度の低下が、ポアソン分布統計を使用する腫瘍始原細胞頻度の定量を含む、態様５０に記載の方法。
［態様５２］抗癌剤を投与する工程をさらに含んでなる、態様２８に記載の方法。
［態様５３］前記ＰＴＫ７モジュレーターが配列番号３に示されるアミノ酸配列又はその断片を含む、態様２８に記載の方法。
［態様５４］前記ＰＴＫ７モジュレーターが汎ＰＴＫ７モジュレーターを含む、態様２８に記載の方法。
［態様５５］腫瘍始原細胞の頻度を、それを必要とする被検者において低下させる方法であって、前記被検者へＰＴＫ７モジュレーターを投与する工程を含んでなる、前記方法。
［態様５６］腫瘍始原細胞が腫瘍永続化細胞を含む、態様５５に記載の方法。
［態様５７］前記腫瘍永続化細胞がＣＤ４４+細胞又はＣＤ１３３+細胞である、態様５６に記載の方法。
［態様５８］前記ＰＴＫ７モジュレーターが抗体を含む、態様５５に記載の方法。
［態様５９］前記抗体がモノクローナル抗体を含む、態様５８に記載の方法。
［態様６０］前記モノクローナル抗体が細胞傷害剤をさらに含む、態様５９に記載の方法。
［態様６１］被検者が、副腎癌、膀胱癌、子宮頚部癌、子宮内膜癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、結直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、及び乳癌からなる群より選択される新生物障害に罹患している、態様５５に記載の方法。
［態様６２］腫瘍始原細胞の頻度が少なくとも１０％低下する、態様５５に記載の方法。
［態様６３］頻度の低下が、腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析、又は腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている腫瘍細胞表面マーカーの免疫組織化学検出を使用して決定される、態様５５に記載の方法。
［態様６４］血液系腫瘍に罹患している被検者へＰＴＫ７モジュレーターを投与する工程を含んでなる、前記被検者を治療する方法。
［態様６５］前記ＰＴＫ７モジュレーターがモノクローナル抗体を含む、態様６４に記載の方法。
［態様６６］ＰＴＫ７モジュレーターを被検者へ投与する工程を含んでなる、被検者における腫瘍を抗癌剤での治療のために増感させる方法。
［態様６７］前記ＰＴＫ７モジュレーターが抗体を含む、態様６６に記載の方法。
［態様６８］前記腫瘍が固形腫瘍である、態様６６に記載の方法。
［態様６９］前記抗癌剤が化学療法剤を含む、態様６６に記載の方法。
［態様７０］前記抗癌剤が免疫療法剤を含む、態様６６に記載の方法。
［態様７１］過剰増殖性障害を、それを必要とする被検者において診断する方法であって：
前記被検者より組織試料を入手する工程；
該組織試料を少なくとも１つのＰＴＫ７モジュレーターと接触させる工程；及び
該試料と会合したＰＴＫ７モジュレーターを検出又は定量する工程を含んでなる、前記方法。
［態様７２］ＰＴＫ７モジュレーターがモノクローナル抗体を含む、態様７１に記載の方法。
［態様７３］抗体がレポーターと機能可能的に会合している、態様７２に記載の方法。
［態様７４］ＰＴＫ７モジュレーターを含んでなる容器（receptacle）とＰＴＫ７関連障害を治療又は診断するのに前記ＰＴＫ７モジュレーターを使用するための指示書（instructional materials）とを含んでなる、ＰＴＫ７関連障害を診断するか又は治療するのに有用な製造品。
［態様７５］前記ＰＴＫ７モジュレーターがモノクローナル抗体である、態様７４に記載の製造品。
［態様７６］容器が読取り可能プレートを含む、態様７４に記載の製造品。
［態様７７］少なくとも１つの内在化ＰＴＫ７モジュレーターの治療有効量を投与する工程を含んでなる、新生物障害に罹患している被検者を治療する方法。
［態様７８］前記ＰＴＫ７モジュレーターが抗体を含む、態様７７に記載の方法。
［態様７９］前記抗体がモノクローナル抗体を含む、態様７８に記載の方法。
［態様８０］モノクローナル抗体が細胞傷害剤をさらに含む、態様７９に記載の方法。
［態様８１］抗癌剤を投与する工程をさらに含んでなる、態様８０に記載の方法。
［態様８２］少なくとも１つの中和ＰＴＫ７モジュレーターの治療有効量を投与する工程を含んでなる、新生物障害に罹患している被検者を治療する方法。
［態様８３］前記ＰＴＫ７モジュレーターが抗体を含む、態様８２に記載の方法。
［態様８４］前記抗体がモノクローナル抗体を含む、態様８３に記載の方法。
［態様８５］前記モノクローナル抗体がヒト化抗体を含む、態様８４に記載の方法。
［態様８６］前記ヒト化抗体が細胞傷害剤をさらに含む、態様８５に記載の方法。
［態様８７］新生物障害が、副腎癌、膀胱癌、子宮頚部癌、子宮内膜癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、結直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、及び乳癌からなる群より選択される、態様８２に記載の方法。
［態様８８］腫瘍始原細胞をＰＴＫ７モジュレーターと接触させる工程を含んでなる、前記腫瘍始原細胞の集団を同定する、単離する、分画する、又は濃縮する方法。
［態様８９］前記ＰＴＫ７モジュレーターが抗体を含む、態様８８に記載の方法。
［態様９０］ヒト化抗体を含んでなるＰＴＫ７モジュレーターであって、前記ヒト化抗体は軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、ここで前記軽鎖可変領域は、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、及び配列番号６８に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、そしてここで前記重鎖可変領域は、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記ＰＴＫ７モジュレーター。
［態様９１］医薬有効量のＰＴＫ７モジュレーターを投与する工程を含んでなる、転移を阻害するか又は予防することを、それを必要とする被検者においてする方法。
［態様９２］被検者がＰＴＫ７モジュレーターの投与の前又は後に腫瘍減量術を受ける、態様９１に記載の方法。
［態様９３］前記腫瘍減量術が少なくとも１つの抗癌剤の投与を含む、態様９２に記載の方法。
［態様９４］医薬有効量のＰＴＫ７モジュレーターを投与する工程を含んでなる、維持療法を、それを必要とする被検者に実施する方法。
［態様９５］前記被検者がＰＴＫ７モジュレーターの投与に先立って新生物障害について治療された、態様９４に記載の方法。
［態様９６］ＰＴＫ７モジュレーターを投与する工程を含んでなる、過剰増殖性障害に罹患している被検者において腫瘍始原細胞を枯渇する方法。
［態様９７］ＰＴＫ７モジュレーターを投与する工程を含んでなる、ＰＴＫ７関連障害の in vivo での診断、検出、又はモニタリングを、それを必要とする被検者においてする方法。
［態様９８］循環腫瘍細胞をＰＴＫ７モジュレーターと接触させる工程を含んでなる、ＰＴＫ７関連障害の診断、検出、又はモニタリングを、それを必要とする被検者においてする方法。
［態様９９］前記接触させる工程が in vivo で生じる、態様９８に記載の方法。
［態様１００］前記接触させる工程が in vitro で生じる、態様９８に記載の方法。

Claims (31)

  1. （ａ）配列番号６２として示される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び配列番号６３として示される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ；又は
    （ｂ）配列番号６４として示される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び配列番号６５として示される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ
    を含む抗体を含み、ＣＤＲ番号付けがカバット（Kabat）、チョシア（Chothia）またはマッカラム（MacCallum）に従う、ヒトＰＴＫ７に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片。
  2. （ａ）ＶＬＣＤＲ１について配列番号６２の残基２４〜３４、ＶＬＣＤＲ２について配列番号６２の残基５０〜５６、及びＶＬＣＤＲ３について配列番号６２の残基８９〜９７として示される３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域；および
    （ｂ）ＶＨＣＤＲ１について配列番号６３の残基３１〜３５、ＶＨＣＤＲ２について配列番号６３の残基５０〜６５、及びＶＨＣＤＲ３について配列番号６３の残基９５〜１０２として示される３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域
    を含み、ＣＤＲ番号付けがカバット（Kabat）に従う、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  3. （ａ）ＶＬＣＤＲ１について配列番号６４の残基２４〜３４、ＶＬＣＤＲ２について配列番号６４の残基５０〜５６、及びＶＬＣＤＲ３について配列番号６４の残基８９〜９７として示される３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域；および
    （ｂ）ＶＨＣＤＲ１について配列番号６５の残基３１〜３５、ＶＨＣＤＲ２について配列番号６５の残基５０〜６５、及びＶＨＣＤＲ３について配列番号６５の残基９５〜１０２として示される３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域
    を含み、ＣＤＲ番号付けがカバット（Kabat）に従う、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  4. （ａ）ＶＬＣＤＲ１について配列番号６２の残基２６〜３２、ＶＬＣＤＲ２について配列番号６２の残基５０〜５２、及びＶＬＣＤＲ３について配列番号６２の残基９１〜９６として示される３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域；および
    （ｂ）ＶＨＣＤＲ１について配列番号６３の残基２６〜３２、ＶＨＣＤＲ２について配列番号６３の残基５３〜５５、及びＶＨＣＤＲ３について配列番号６３の残基９６〜１０１として示される３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域
    を含み、ＣＤＲ番号付けがチョシア（Chothia）に従う、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  5. （ａ）ＶＬＣＤＲ１について配列番号６４の残基２６〜３２、ＶＬＣＤＲ２について配列番号６４の残基５０〜５２、及びＶＬＣＤＲ３について配列番号６４の残基９１〜９６として示される３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域；および
    （ｂ）ＶＨＣＤＲ１について配列番号６５の残基２６〜３２、ＶＨＣＤＲ２について配列番号６５の残基５３〜５５、及びＶＨＣＤＲ３について配列番号６５の残基９６〜１０１として示される３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域
    を含み、ＣＤＲ番号付けがチョシア（Chothia）に従う、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  6. （ａ）ＶＬＣＤＲ１について配列番号６２の残基３０〜３６、ＶＬＣＤＲ２について配列番号６２の残基４６〜５５、及びＶＬＣＤＲ３について配列番号６２の残基８９〜９６として示される３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域；および
    （ｂ）ＶＨＣＤＲ１について配列番号６３の残基３０〜３５、ＶＨＣＤＲ２について配列番号６３の残基４７〜５８、及びＶＨＣＤＲ３について配列番号６３の残基９３〜１０１として示される３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域
    を含み、ＣＤＲ番号付けがマッカラム（MacCallum）に従う、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  7. （ａ）ＶＬＣＤＲ１について配列番号６４の残基３０〜３６、ＶＬＣＤＲ２について配列番号６４の残基４６〜５５、及びＶＬＣＤＲ３について配列番号６４の残基８９〜９６として示される３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域；および
    （ｂ）ＶＨＣＤＲ１について配列番号６５の残基３０〜３５、ＶＨＣＤＲ２について配列番号６５の残基４７〜５８、及びＶＨＣＤＲ３について配列番号６５の残基９３〜１０１として示される３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域
    を含み、ＣＤＲ番号付けがマッカラム（MacCallum）に従う、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  8. 配列番号６２として示される軽鎖可変領域、及び配列番号６３として示される重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  9. 配列番号６４として示される軽鎖可変領域、及び配列番号６５として示される重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  10. 中和抗体、枯渇性抗体、及び／又は内在化抗体である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  11. モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、又はそれらの抗原結合断片である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  12. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む抗体コンジュゲートであって、抗体又はその抗原結合断片が細胞傷害剤又は検出剤とコンジュゲートする、連結する、又は他の方法で会合する、前記抗体コンジュゲート。
  13. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする、核酸。
  14. （ａ）配列番号４８として示される軽鎖可変領域、及び配列番号４９として示される重鎖可変領域、又は
    （ｂ）配列番号５０として示される軽鎖可変領域、及び配列番号５１として示される重鎖可変領域、又は
    （ｃ）配列番号６２として示される軽鎖可変領域、及び配列番号６３として示される重鎖可変領域、又は
    （ｄ）配列番号６４として示される軽鎖可変領域、及び配列番号６５として示される重鎖可変領域、
    をコードする、核酸。
  15. （ａ）配列番号４８として示される軽鎖可変領域、及び配列番号４９として示される重鎖可変領域、又は
    （ｂ）配列番号５０として示される軽鎖可変領域、及び配列番号５１として示される重鎖可変領域、又は
    （ｃ）配列番号６２として示される軽鎖可変領域、及び配列番号６３として示される重鎖可変領域、又は
    （ｄ）配列番号６４として示される軽鎖可変領域、及び配列番号６５として示される重鎖可変領域、
    をコードする核酸を含む、ベクター。
  16. （ａ）配列番号４８として示される軽鎖可変領域、及び配列番号４９として示される重鎖可変領域、又は
    （ｂ）配列番号５０として示される軽鎖可変領域、及び配列番号５１として示される重鎖可変領域、又は
    （ｃ）配列番号６２として示される軽鎖可変領域、及び配列番号６３として示される重鎖可変領域、又は
    （ｄ）配列番号６４として示される軽鎖可変領域、及び配列番号６５として示される重鎖可変領域、
    をコードする核酸を含む、宿主細胞。
  17. 請求項１５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  18. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、医薬組成物。
  19. 請求項１２に記載の抗体コンジュゲートを含む、医薬組成物。
  20. 被検者における癌の検出用、診断用、又はモニタリング用である、請求項１８又は１９に記載の医薬組成物。
  21. 癌が、乳癌、卵巣癌、結直腸癌、膵臓癌、肺癌、又は皮膚癌である、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 被検者における癌の治療用である、請求項１８又は１９に記載の医薬組成物。
  23. 癌が、乳癌、卵巣癌、結直腸癌、膵臓癌、肺癌、又は皮膚癌である、請求項２２に記載の医薬組成物。
  24. 腫瘍始原細胞の頻度を被検者において低下させるための、請求項１８又は１９に記載の医薬組成物。
  25. 被検者が、乳癌、卵巣癌、結直腸癌、膵臓癌、肺癌、又は皮膚癌に罹患している、請求項２４に記載の医薬組成物。
  26. 被検者における癌の検出用、診断用、又はモニタリング用の薬剤を製造するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片の使用。
  27. 癌が、乳癌、卵巣癌、結直腸癌、膵臓癌、肺癌、又は皮膚癌である、請求項２６に記載の使用。
  28. 被検者における癌の治療用の薬剤を製造するための、請求項１２に記載の抗体コンジュゲートの使用。
  29. 癌が、乳癌、卵巣癌、結直腸癌、膵臓癌、肺癌、又は皮膚癌である、請求項２８に記載の使用。
  30. 腫瘍始原細胞の頻度を被検者において低下させるための薬剤を製造するための、請求項１２に記載の抗体コンジュゲートの使用。
  31. 被検者が、乳癌、卵巣癌、結直腸癌、膵臓癌、肺癌、又は皮膚癌に罹患している、請求項３０に記載の使用。
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