JP6257052B2 - 皮膚の状態及び外観を改善するための組成物 - Google Patents

Description

本発明は、概して、皮膚の状態及び外観を改善するための組成物、より特定すると、正常ヒト真皮線維芽細胞における遺伝子の統計的に有意なアップレギュレーションを誘導するのに有効なプレニル化イソフラボノイド化合物を含む化粧用組成物に関する。本発明はまた、皮膚の状態を調節する方法にも関する。

より若く、より健康な外観には、数多くの要素が寄与しているが、最も重要なものの１つは、コラーゲンと呼ばれる線維性タンパク質である。コラーゲン、特にコラーゲン１Ａ１は皮膚組織を結合し、且つ支持する。コラーゲン１Ａ１は、別の線維性タンパク質、エラスチンと協働して作用する。根本的に、コラーゲンは皮膚にその形態及び堅固さを与える。エラスチンは、同じ皮膚に弾力性及び柔軟性を与える。さらに、皮膚は、皮膚細胞に重要な結合性を与える他の線維性タンパク質を産生する。例えば、フィブリリンタンパク質は、皮膚中に発現し、エラスチンと密接に結びつき、無定形のエラスチンフィラメントを取り囲んで、付加的な構造及び強度を与える。

人が加齢するに伴い、身体が産生するコラーゲン量はますます低減するため、皮膚はコラーゲンを失って行く。さらに、他の因子、例えばＵＶ光、はコラーゲンを分解するタンパク質分解酵素の産生増大を促進するため、これら因子もまたコラーゲン損失に寄与する。皮膚中のコラーゲン及びエラスチンの減少は、小じわ、しわ、加齢によるしみ、及び皮膚のたるみを引き起こす。

身体によるコラーゲン産生促進をおそらくは助ける活性成分を含む化粧用組成物がいくつか開示されている。

米国特許第７３５１７４５号は、Ｌ−テアニン、Ｓ−メチル−Ｌ−システイン、Ｓ−フェニル−Ｌ−システインからなる群から選択される１つ又は複数の活性成分を含む化粧用組成物を開示している。この特許によれば、活性成分は、コラーゲン４、コラーゲン７及び若干の他の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを増大させるのに有効であることが見出されている。

米国特許第７，３４８，０３４号は、コラーゲン又はエラスチンの合成を増大すること及び／又はコラーゲン及びエラスチンの分解を防止又は減速させることによって作用するとされている化粧用組成物を開示している。この組成物は、ブドウの種の抽出物、ウルフベリー抽出物及びローズヒップを含む。

これらの開示にもかかわらず、コラーゲン及びエラスチンの産生促進に有効であり、したがって皮膚の状態及び外観を改善する活性成分の必要性は依然として存在している。

フラボノイドは、植物性顔料の部類に属する。フラボノイドは、その抗酸化活性により最もよく知られている。ある種のフラボノイドは、局所用組成物に使用されている。

米国特許第６，０９３，４１１号は、ある種の選択されたフラボノイド化合物が皮膚疾患の予防又は処置のために使用され得ることを開示している。この活性成分は、イソフラボン、クマリン、クロモン、ジクマロール、クロマノン及びクロマノールから選択される。

米国特許公開第２００３／０１２５２６４号は、フラボン、フラボノール、フラバノン、イソフラバノン及びイソフラボンが、線維芽細胞の増殖を増大させることによって創傷の処置に使用され得ることを開示している。

今般、驚くべきことに、ある種のプレニル化イソフラボノイド化合物が正常ヒト真皮線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１及びエラスチン遺伝子の統計的に有意なアップレギュレーションを誘導するのに有効であることが見出された。

したがって、本発明の目的の１つは、皮膚の状態及び外観を改善するために適切な量の特定の種類のイソフラボノイド化合物を含む局所用組成物を提供することである。

本発明の別の目的は、課題の組成物を使用することにより皮膚を調節する方法を提供することである。

本発明のこれらの目的及び他の目的は、下記の開示を考慮すると明らかになるであろう。

一態様において、本発明は、正常ヒト真皮線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１及びエラスチン遺伝子の発現を増大するのに有効な活性成分を含む組成物に関する。組成物は、プレニル化イソフラボノイド及び化粧品に又は皮膚科学的に許容できるキャリヤーを含み、ここで、プレニル化イソフラボノイドは組成物の全重量を基準にして０．００００００１％から１０％、好ましくは０．００００１％から１％、最も好ましくは０．０１％から１％であり、且つ、キャリヤーは約５０％から約９９％、好ましくは約７５％から約９９％である。プレニル化イソフラボノイドは、ポミフェリン、オサジン及びこれらの組合せからなる群から選択される。

別の態様において、本発明は安全且つ有効な量のプレニル化イソフラボノイド及び許容できるキャリヤーを含む組成物を使用することによって皮膚の状態を調節する方法に関する。

本発明は、皮膚の細胞外マトリックスタンパク質、特にコラーゲン及びエラスチンを調節することによって皮膚の外観及び状態を改善する１つ又は複数の活性成分を含む局所用組成物に関する。本発明は、適切な量のプレニル化イソフラボノイドが正常ヒト真皮線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１及びエラスチン遺伝子の統計的に有意なアップレギュレーションを誘導するという驚くべき発見に基づいている。

線維芽細胞は、皮膚の真皮層において増殖する細胞であり、新たなコラーゲン及びエラスチンの皮膚中への発現の原因となる。局所的処置の有益な影響を試験するために、このような細胞を、培養皿中でｉｎ ｖｉｔｒｏとして知られている条件下で増殖させることができる。本発明のプレニル化イソフラボノイドはまた、皮膚中に存在することが知られている他の細胞、例えば、これらに限定するものではないが、ケラチノサイト、メラノサイト、神経細胞、免疫細胞、脂肪細胞などに対しても作用することがある。さらに、本発明のプレニル化イソフラボノイドは、真皮乳頭細胞、皮脂腺細胞、幹細胞などの細胞に影響を及ぼすことがある。本発明のプレニル化イソフラボノイドはまた、皮膚の一部であって、根本的に非生存ではあるが、にもかかわらずフリーラジカルの作用及び日光照射によるダメージに感受性である皮膚の角質層に対しても作用することがある。

コラーゲン及びエラスチンの発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いるなどの多様な方法によって測定することができるが、２つの非常に実際的な方法は、ヒト遺伝子マイクロアレイによる方法及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による方法である。マイクロアレイ法は、特定の処置が、ＲＮＡ発現の増大及び低減によってコラーゲン及びエラスチンを作り出す線維芽細胞の遺伝的素因に影響を及ぼすかどうかを試験するために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（カリフォルニア州サンタクララ）により提供されているものなどのゲノムマイクロチップを使用する。ＥＬＩＳＡ試験は、対象とする特定のタンパク質に特異的な蛍光標識した抗体を用いることによって、コラーゲン又はエラスチンの実際の発現を検査する。典型的には、ある処置が線維芽細胞のコラーゲン１Ａ１及びエラスチンの遺伝子発現をアップレギュレートすると、次いでその処置は、おそらくさらにコラーゲン１Ａ１及びエラスチンタンパク質の発現も増大することになる。

適切な量の１つ又は複数のプレニル化イソフラボノイド、特にオサジン及びポミフェリンは、コラーゲン１Ａ１及びエラスチン遺伝子の発現レベルを有意に増大するということが始めて見出されている。例えば、０．０５％のポミフェリンで処理を行うと、正常ヒト真皮線維芽細胞は、コラーゲン１Ａ１及びエラスチン遺伝子の発現において未処理の細胞と比較して統計的に有意な増加を示すことが研究により示されている。さらなる研究により、０．０００１％から０．０５％の濃度のポミフェリンは、コラーゲン１Ａ１及びエラスチン遺伝子の発現の増大において同等に有効であることが証明されている。

したがって、本発明は、安全且つ有効な量のプレニル化イソフラボノイド（単数又は複数）及びキャリヤーを含む組成物を提供する。組成物は、通常の処置条件下で皮膚に適用したとき、皮膚のコラーゲン及びエラスチンの産生を促進するのに有効である。本発明の組成物はまた、小じわ、しわ、加齢によるしみ、たるみ及びコラーゲン及びエラスチンの損失に随伴する他の皮膚の不健康な状態を処置し、予防し、且つ改善するのにも有効である。本発明のプレニル化イソフラボノイドはまた、皮膚の色又は色調を調節し、且つ、皮膚における炎症性の応答を低減させるのにも有効である。

本発明の目的のために、プレニル化イソフラボノイドは、組成物の全重量を基準にして０．００００００１％から約１０％の量、好ましくは０．００００１％から１％の量、より好ましくは０．０１％から１％の量で存在する。

不可欠な成分
プレニル化イソフラボノイド化合物
本発明の組成物の不可欠な成分は、下記に示す一般構造：

のプレニル化イソフラボノイドである。

プレニル化イソフラボノイドは、例えば、Ｂｉｓｓｅｔｔに対して交付された米国特許第６，０９３，４１１号に開示のものなどの単純なイソフラボノイドであって、下記に示す一般構造：

を有するものとは異なっている。

プレニル化イソフラボノイドは、追加の環状構造、Ｄ、を含むこと、及び米国特許第６，０９３，４１１号の単純なイソフラボノイドには存在しない環Ａに連結する追加のテルペン部分を有することによって、単純なイソフラボノイドとは異なっている。

プレニル化イソフラボノイドはまた、例えば、Ｎａｉｒ他に対して交付された米国特許第２００１／００２０００９号に開示のものなどの単純なフラボノイドであって、追加の６員環、Ｄ、環Ａに連結するテルペンももたない単純なフラボノイドなどとは異なっており、同様にこれらが環Ｂ及び環Ｃの間にプレニル化イソフラボノイドとは異なる立体化学を有することによってこれらのフラボノイドとは異なっている。

本発明のプレニル化イソフラボノイドは、合成による物質であっても、抽出物として天然供給源（例えば、植物）から得られてもよい。特に興味深いのは、植物、アメリカハリグワ（Ｍａｃｌｕｒａ ｐｏｍｉｆｅｒａ）（一般名：オセージオレンジ）の抽出物から分離されるプレニル化イソフラボノイドである。この植物の果実の抽出物は、ポミフェリン（Ｒ_１＝Ｒ_２＝ＯＨ）及びオサジン（Ｒ_１＝ＯＨ、Ｒ_２＝Ｈ）として知られている２つの独特なプレニル化イソフラボノイドを含むことが報告されてきた。これら２つのプレニル化イソフラボノイドの化学構造は、確立されている［ポミフェリン：Ｍａｒｅｋ Ｊ他、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ（２００３年）ｃ３９、ｏ３９〜ｏ４０頁、オサジン：Ｌｉｓｋｏｖａ Ｍ他、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ（２００５年）Ｅ６１、ｏ１８４８〜ｏ１８５０］。これら２つのプレニル化イソフラボノイドの単離及びこれらの一般的抗酸化特性は、先に報告されている［Ｔｓａｏ Ｒ他、Ｊ Ａｒｇｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ（２００３年）５１、６４４５〜６４５１頁及びＶｅｓｅｌａ Ｄ他、Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ（２００４年）７５、２０９〜２１１頁及びＨａｍｅｄ ＳＦ他、Ｇｒａｓａｓ ｙ Ａｃｅｉｔｅｓ（２００５年）５６、２１〜２４頁］。

米国特許出願ＷＯ２００６／０３３９８７は、オセージオレンジ心材のエタノール抽出物は、皮膚明色化への適用の可能性を含めて、メラニン合成に対する阻害活性を有する可能性があることを示唆した。しかし、この特許は、独特なプレニル化イソフラボノイドであるオサジン及びポミフェリンに言及しておらず、且つ、発明者によって提供されたクロマトグラフィー解析は、心材抽出物におけるオサジン又はポミフェリンのいずれの存在を示してはいない。さらに、この木の心材の抽出物は、ヒト皮膚を刺激する可能性がある望ましくない有機化学物質を含有できる樹液を含むことで知られている。

オセージオレンジからプレニル化イソフラボノイドを抽出するために使用される溶媒は、当業者には既知であり、且つ、水抽出物、水−アルコール抽出物、水−グリコール抽出物、有機溶媒抽出物、超臨界二酸化炭素抽出物、液化プロパン又は液化ブタン抽出物などを含むがこれらに限定されるものではない。抽出の方法には、単純溶媒抽出、加圧熱水抽出、水蒸気抽出、向流抽出、ガス抽出などが含まれてよいがこれらに限定されるものではない。

さらに、抽出物は、クロマトグラフィー、減圧蒸留、凍結乾燥、ドラム乾燥、サイクロン乾燥、噴霧乾燥、炭素処理、プレートフレームろ過、高圧ろ過、遠心分離などを含むがこれらに限定されるものではないさらなる下流プロセスに供されてよい。抽出物は、さらに脂質カプセル化剤、例えばリポソームなど、又はポリマーカプセル化剤、例えばマルトデキストリンなど、のいずれかにカプセル化される処理を受けてもよい。抽出物は、ポリマーマトリックス、ニオソーム及びナノ粒子でカプセル化されてよい。

天然由来の物質はまた、さらに誘導体化されてよい（例えば、天然供給源からの抽出に続いて調製されるエステル又はエーテル誘導体）。本明細書において有用なフラボノイド化合物は、Ｇａｉａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（コネチカット州ゲイロードビル）などの商業的供給原によって市販されている。プレニル化イソフラボノイドはまた、追加的発酵プロセス培地の一部に固体状態で、或いは、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの他の微生物と共に液体発酵プロセスの一部として使用されてもよい。

キャリヤー
本発明の別の不可欠な成分は、化粧品に又は皮膚科学的に許容できるプレニル化イソフラボノイドのキャリヤーである。キャリヤーは、いかなる特定の形態にも限定されることはない。典型的なキャリヤーは、水、油、油中水型、水中油型、シリコーン中水中油型エマルジョンである。これらのエマルジョンは、広範な粘度、例えば約１００ｃｐｓから約２００，０００ｃｐｓまで、に対応することができる。これらのエマルジョンはまた、機械的ポンプ容器又は慣例的な噴射剤を用いる加圧エアロゾル容器を使用するスプレーの形態で供給されてよい。これらのキャリヤーはまた、ムースの形態で供給されてよい。他の適切な局所用キャリヤーには、無水液体溶媒、例えば、油、アルコール、及びシリコーン（例えば、鉱油、エタノール、イソプロパノール、ジメチコン、シクロメチコンなど）；水ベースの単相液体溶媒（例えば、含水アルコール溶媒システム）；並びにこれら無水及び水ベースの単相溶媒の増粘タイプ（例えば、溶媒の粘度が、適切なガム、樹脂、ワックス、ポリマー、塩などの添加によって、固体又は半固体を形成するほどに増大されるものなど）が含まれる。本発明において有用な典型的なキャリヤーシステムの例は、下記の４つの参考文献に記載されている。「サンプロダクト処方集（Ｓｕｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ）」、Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ ＆ Ｔｏｉｌｅｔｒｉｅｓ、ｖｏｌ．１０５、１２２〜１３９頁（１９９０年１２月）；「サンプロダクト処方集（Ｓｕｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ）」、Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ ＆ Ｔｏｉｌｅｔｒｉｅｓ、ｖｏｌ．１０２、１１７〜１３６頁（１９８７年３月）；１９９０年１０月２日にＦｉｇｕｅｒｏａ他に交付の米国特許第４，９６０，７６４号；１９８１年３月３日にＦｕｋｕｄａ他に交付の米国特許第４，２５４，１０５号。

本発明のキャリヤーは、本発明の組成物の約５０重量％から約９９重量％、好ましくは約７５重量％から約９９重量％、最も好ましくは約８５重量％から約９５重量％の量で含まれてよい。

任意選択の成分
本発明の皮膚調節性組成物は、任意選択で、追加の皮膚活性化剤及びキャリヤーに依存する他の成分を含んでよい。適切な追加の皮膚活性化剤及び他の成分のより詳細な論述は、米国特許第６，０９３，４１１号において見ることができる。

このような皮膚活性化剤の非限定的な例には、ビタミンＢ３化合物、例えば、１９９７年１０月３０日にＯｂｌｏｎｇ他に発行されたＰＣＴ出願ＷＯ９７／３９７３３において記載されているものなど、サリチル酸などのヒドロキシ酸；両性界面活性剤などの剥離剤又は落屑剤；サンスクリーン、例えば、２−エチルヘキシル−ｐ−メトキシシンナメート、４，４’−ｔ−ブチルメトキシジベンゾイル−メタン、オクトクリレン、フェニルベンズイミダゾールスルホン酸；サンブロック、例えば、酸化亜鉛及び二酸化チタン；抗炎症剤；抗酸化剤／ラジカル捕捉剤、例えば、トコフェロール及びそのエステル；金属キレート化剤、特に鉄キレート化剤；レチノイド、例えば、レチノール、パルミチン酸レチニル、酢酸レチニル、プロピオン酸レチニル、及びレチナール；Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン及びその誘導体；グリコール酸などのヒドロキシ酸；ピルビン酸などのケト酸；ベンゾフラン誘導体；脱毛剤（例えば、スルフヒドリル化合物）；皮膚明色化剤（例えば、アルブチン、コウジ酸、ハイドロキノン、アスコルビン酸及びアスコルビルリン酸塩などの誘導体、胎盤抽出物など）；抗セルライト剤（例えば、カフェイン、テオフィリン）；保湿剤；抗菌剤；抗アンドロゲン剤；及び皮膚保護剤が含まれる。上記の皮膚活性化成分のいかなるものの混合物もまた、使用されてよい。これら活性成分のより詳細な記述は、Ｂｌａｎｋ他に発行された米国特許第５，６０５，８９４号中に見られる。好ましい皮膚活性化成分には、サリチル酸などのヒドロキシ酸、サンスクリーン剤、抗酸化剤、及びこれらの混合物が含まれる。

他の慣例的なスキンケア製品用添加剤もまた、本発明の組成物に含まれてよい。例えば、尿素、グアニジン、グリセロール、ペトロラタム、鉱油、糖エステル及びポリエステル、ポリオレフィン、イソステアリン酸メチル、イソステアリン酸エチル、リシノレイン酸セチル、イソノナン酸イソノニル、イソヘキサデカン、ラノリン、ラノリンエステル、コレステロール、ピロリドンカルボン酸／塩（ＰＣＡ）、トリメチルグリシン（ベタイン）、トラネキサム酸、アミノ酸（例えば、セリン、アラニン、トレオニン、ヒスチジン）及び／又はこれらの塩、パンテノール及びその誘導体、コラーゲン、ヒアルロン酸、エラスチン、加水分解物、プリムローズ油、ホホバ油、上皮成長因子、ダイズサポニン、ムコ多糖類、並びにこれらの混合物を使用してよい。他の適切な添加剤又は皮膚活性化剤は、１９９７年１０月３０日にＯｂｌｏｎｇ他に発行されたＰＣＴ出願ＷＯ９７／３９７３３において、より詳細に論述されている。

下記の実施例は、本発明の範囲における実施形態をさらに記述し、且つ、証明するものである。実施例は、その数多くの変形形態が本発明の精神及び範囲から逸脱することなく可能であるように、例証のみを目的として提示され、本発明を限定するものと解釈されてはならない。

（例１）
オセージオレンジ抽出物の調製
１４オンスのオセージオレンジ果実をＷａｒｉｎｇジューサーに入れ、果実の液体内容物のうちの７オンスを抽出して、果肉から取り出した。ジュースは、プレニル化イソフラボノイドのオサジン及びポミフェリン並びに追加のタンパク質、抗酸化剤、多糖類、酸、アルカロイド、植物によく見られるビタミン及び酵素を含む、粘性の、べたべたした水性混合物であった。抽出物をさらに水で希釈し、希釈時に生成した２つの不相容性の相を分別することにより、水に不溶な成分の一部を取り除いた。水溶性成分を、珪藻土を通してろ過し、それに続いて０．２マイクロメーターのフィルターを通してろ過した。これにより、局所適用に有用なポミフェリン及びオサジンを含むオセージオレンジの抽出物のベースが形成された。

（例２）
実施例１からのオセージオレンジ抽出物のＨＰＬＣ分析
試料の調製
実施例１から得られたオセージオレンジ抽出物を密閉容器中で、マグネティックスターラーを用いて、室温で１８〜２４時間、追加の水と混合した。オセージオレンジ抽出物の抽出溶媒に対する重量比は、１：４であった。混合物をＢｅｃｔｏｎ ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＣｌａｙ Ａｄａｍｓ ＤＹＮＡＣ遠心分離機中で、１００ｒｐｍで１５分間、遠心分離し、液体抽出物を回収した。別法として、混合物をろ過により清澄にしてもよい。

回収した液体抽出物を、移動相溶液に希釈し、０．２μｍのシリンジフィルターを通してろ過し、ＨＰＬＣ分析を行うために注入した。ＨＰＬＣ分析のために、上記で生成した水性抽出物をさらに２倍に希釈した。

ＨＰＬＣ分析の条件
光ダイオードアレイ（ＰＤＡ）９９６検出器及びＥｍｐｏｗｅｒソフトウエアを備えたＷａｔｅｒｓ２６９５セパレーションモジュールをＨＰＬＣ分析に使用した。オサジン及びポミフェリンの外部参照標準物質は、コネチカット州ゲイロードビルのＧａｉａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより購入した。標準物質を指示された濃度で移動相溶液中に溶解し、注入前に０．２μｍのシリンジフィルターを通してろ過した。注入した１０μｌの物質、すなわち標準溶液か希釈した液体抽出物のいずれかを、Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８カラム、４．６×２５０ｍｍで、２５℃で２５分間、３０％のＡ及び７０％のＢを含む移動相溶液、ここでＡは１％（ｗ／ｗ）酢酸水溶液であり；Ｂはアセトニトリルである、の流速１．０ｍｌ／分で、定組成溶出を用いてクロマトグラフィー分析にかけた。全ての試薬はＨＰＬＣ級である。２７３．５ｎｍで検出した。
ＨＰＬＣ試験の結果

（例３）
ヒト遺伝子マイクロアレイを用いた正常ヒト真皮線維芽細胞へのポミフェリンの影響の試験
方法
細胞培養
正常ヒト真皮線維芽細胞を、培養フラスコ中で、適切な培養条件下でコンフルエントになるまで培養した。コンフルエントに達したら、ポミフェリンを０．０５％濃度で補充した培養培地で細胞を処理することになる。この０．０５％は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの他の溶媒を使用せずにポミフェリンが培養培地に完全に溶解することが可能な最大レベルであった。別のフラスコの細胞は、培養培地のみで処理し、未処理のコントロールとした。試験物質を適用した後、細胞を３７±２℃、５±１％ＣＯ_２において２４時間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時にアスピレーションによって培養培地を取り除き、細胞を冷リン酸緩衝生理食塩水で１回洗った。洗浄液を取り除いた後、７００μｌのグアニジンチオシアネートリシス溶液を加えて細胞を溶解した。細胞ライセートは、ＲＮＡ抽出プロセスが完了するまで（下記を参照）−７５℃で保管した。

ＲＮＡの分離（Ａｍｂｉｏｎ ＲＮＡｑｕｅｏｕｓキット）
上記で調製した細胞ライセートに、等体積の６４％エタノールを添加し、チューブをボルテックス撹拌した。混合完了後、７００μｌまでの混合物をグラスファイバーフィルターカートリッジに移して、カートリッジを１．５ｍｌの回収用チューブに装填し、カートリッジを１４，０００ＲＰＭで１分間、遠心分離した。フロースルーを捨て、あらゆる残存混合物をフィルターカートリッジに装填し、全ての混合物が処理されるまで遠心分離プロセスを繰り返した。次いで、フィルターを洗浄し、続いて７００μｌの洗浄溶液１（１回）及び５００μｌの洗浄溶液２（２回）をフィルターカートリッジに適用し、１４，０００ＲＰＭで１分間、遠心分離を行ってカートリッジに各洗浄液を通過させることにより、グラスファイバーに結合したＲＮＡからのあらゆる残留細胞片を取り除いた。各洗浄後に、フロースルーを捨てた。最終の洗浄後に、洗浄溶液なしで最終スピンを１回行い、フィルターカートリッジ中のあらゆる残留洗浄溶液を取り除いた。カートリッジ内のグラスファイバーに結合したＲＮＡを、３０μｌのトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＡＴＡ、７０〜８０℃に予熱）をカートリッジに適用し、カートリッジを新しい回収チューブ中で１４，０００ＲＰＭで１分間、遠心分離することにより、溶出させた。追加の３０μｌの予熱したＴＥ緩衝液を用いて溶出プロセスを繰り返した。ＲＮＡを溶出させた後、その濃度をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイによって定量した。

ＲＮＡ濃度アッセイ（分子プローブＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ）
Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬がＤＳＭＯ中原液として提供された。使用前に、試薬をＴＥ緩衝液で２０００倍に希釈した。ＲＮＡアッセイは、試験する試料１つにつき２００μｌの希釈Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を必要とし、且つ、標準用として１ｍｌの試薬を必要とした。希釈した試薬は、光を防いで保管された。一連のＲＮＡ標準液を大腸菌由来の精製リボソームＲＮＡを下記の濃度：２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ及び０ｎｇ／ｍｌ（ブランク）、に希釈することによって調製した。アッセイを行う前に、上記で調製されたＲＮＡ試料は、ＴＥ緩衝液で１０００倍に希釈した。ＲＮＡアッセイのために、１００μｌの希釈した試料又は標準液を９６−ウエルプレートのウエルに移した。試料又は標準液のアッセイを２回ずつ行った。試料／標準液をプレートに加えた後、１００μｌの希釈したＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ試薬をウエルに加え、プレートを穏やかに混合し、５〜１０分間光を防いでインキュベートさせた。このインキュベーションの後に、プレートを励起波長５００ｎｍ及び蛍光波長５２５ｎｍを用いて、フルオロメーターによって測定した。

ｍＲＮＡ増幅（Ａｍｂｉｏｎ ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ ａＲＮＡキット）ファーストストランドｃＤＮＡ合成：ファーストストランド合成を開始するために、各試料について５μｇの全ＲＮＡを６００μｌのＰＣＲチューブに加え、チューブ内の液体の全容量をＤＥＰＣ水で１２μｌに合わせた。各チューブに、１μｌのＴ７ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを添加し、チューブを７０±２℃で１０分間インキュベートしてＲＮＡを変性させ、次いで氷上に置いて、プライマーをｍＲＮＡのポリＡ末端とアニーリングさせた。冷却後、２μｌの１０ｘファーストストランド緩衝液、１μｌのＲＮＡｓｅ阻害剤及び４μｌのｄＮＴＰミックスを各チューブに加え、各チューブを４２℃にしておいた。１μｌのリバーストランスクリプターゼを添加し、チューブを加熱して４２±２℃で２時間維持した。２時間経過した時点で、チューブをわずかに遠心分離してチューブの底部に全ての液を集め、次いで氷上に置いた。

セカンドストランド合成及びｃＤＮＡ精製：ｃＤＮＡのセカンドストランドの合成のために、上記のチューブに下記のものを（この順序で）加えた：６３μｌのＤＥＰＣ水、１０μｌの１０ｘセカンドストランド緩衝液、４μｌのｄＮＴＰミックス、２μｌのＤＮＡポリメラーゼ及び１μｌのＲＮＡｓｅＨ。チューブを混合し、次いで１６±２℃で２時間インキュベートした。２時間のインキュベーション終了の少し前に、十分な量のＤＥＰＣ水を５０±２℃に加熱し、ｃＤＮＡ精製フィルターカートリッジを５０μｌのｃＤＮＡ結合緩衝液（１試料あたり１カートリッジ）で少なくとも５分間平衡にした。試料のインキュベーション終了後に、２５０μｌのｃＤＮＡ結合緩衝液を各チューブに加え、十分に混合した。ＰＣＲチューブの中身をｃＤＮＡ精製フィルターカートリッジに移した。カートリッジを回収用チューブに入れ、１０，０００ＲＰＭで１分間、遠心分離した。フロースルーを捨て、６５０μｌのｃＤＮＡ洗浄溶液をカートリッジに加えた。カートリッジを再び遠心分離にかけ、フロースルーを捨て、次いで、洗浄緩衝液がフィルターから完全になくなっている状態を確保するために、最後に一回遠心分離を行った。１０μｌの予熱したＤＥＰＣ水をフィルターに適用し、フィルターを新しい回収用チューブ中で１０，０００ＲＰＭで１分間、遠心分離することにより、ｃＤＮＡを溶出させた。この溶出をさらにもう一回行って総量１６〜１８μｌのｃＤＮＡ溶液を得た。

ａＲＮＡを合成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写及びａＲＮＡの精製：下記をｃＤＮＡ溶液に添加することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を開始した：４μｌずつの、Ｔ７ ＡＴＰ溶液、Ｔ７ ＣＴＰ溶液、Ｔ７ ＧＴＰ溶液、Ｔ７ ＵＴＰ溶液、４μｌの１０ｘ反応緩衝液、及び４μｌのＴ７酵素ミックス。チューブを混合し、次いで３７±２℃で６〜１４時間インキュベートした。インキュベーション終了の少し前に、十分な量の溶出溶液（Ｅｌｕｓｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を５０〜６０℃に加温し、ａＲＮＡフィルターカートリッジを１００μｌのａＲＮＡ結合緩衝液で少なくとも５分間平衡にした。インキュベーション期間の終了時に、３５０μｌのａＲＮＡ結合緩衝液を試料チューブに加え、十分に混合した。追加の２５０μｌの無水エタノールを各チューブに加えた。混合物をａＲＮＡフィルターカートリッジに移した；カートリッジを回収用チューブに挿入し、１０，０００ＲＰＭで１分間、遠心分離した。フロースルーを捨て、６５０μｌのａＲＮＡ洗浄緩衝液をカートリッジに加え、それに続いて１０，０００ＲＰＭで１分間、遠心分離した。フロースルーを捨てた後、洗浄緩衝液の痕跡を全て取り除くために、カートリッジに最後の一回として回転をかけた。カートリッジを新しい回収用チューブに移し、２５μｌの予熱した溶出溶液をカートリッジに加えた。カートリッジを室温で２分間インキュベートし、次いで１０，０００ＲＰＭで１分間、遠心分離することにより、ａＲＮＡを溶出させた。この溶出をさらにもう一回行って総量４５〜５０μｌのａＲＮＡ溶液を得た。ａＲＮＡの最終濃度は、上記に記載のＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイによって決定した。

ａＲＮＡの蛍光染料による標識化（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＡＳＡＰ ＲＮＡラベリングキット）標識ａＲＮＡの精製
標識化：標識化プロセスのために２つのチューブを用意した、１つはＣｙ３標識化（グリーン）であり１つはＣｙ５標識化（レッド）であった。Ｃｙ３チューブに、未処理／コントロール試料から調製した２μｇのａＲＮＡを加え（各試料への実際の色の割り当ては重要ではないが、一貫性を保つために通常はＣｙ３を未処理試料に対して使用している）、十分なＤＥＰＣ水を加えて全量を４μｌにした。Ｃｙ５チューブに、試験物質で処理した試料から調製した２μｇのａＲＮＡを加え、十分なＤＥＰＣ水を加えて全量を４μｌにした。双方のチューブに５μｌのＡＳＡＰラベリング緩衝液及びチューブ（Ｃｙ３又はＣｙ５）に特異的な染料１μｌを加えた。チューブを８５±２℃で１５分間インキュベートした。１５分間のインキュベーション終了時に、チューブを氷上に置いて冷却し、次いで２．５μｌｍのＡＳＡＰ停止溶液を各チューブに添加した。ここで示された割合は、１つのマイクロアレイチップを分析するのに十分なものであった。

精製：標識ａＲＮＡを精製するために、マイクロコンＹＭ−３０フィルターカラムを回収チューブに挿入し４００μｌのＴＥ緩衝液を満たした。Ｃｙ３及びＣｙ５プローブを組み合わせ（それぞれ１２．５μｌ）、次いでマイクロコンフィルターに添加し、ＴＥ緩衝液と十分に混合した。フィルターを１２，０００ＲＰＭで８分間、遠心分離して、フロースルーを捨てた。カラムを４００μｌのＴＥ緩衝液で洗浄し、毎回フロースルーを捨てた。最終の洗浄後、フィルターカラムを反転させ、新しい回収用チューブに取り付け１２，０００ＲＰＭで２分間、遠心分離してプローブを回収した（プローブは２〜３０μｌの容量の残留ＴＥ緩衝液中でさらに濃縮した）。

マイクロアレイハイブリダイゼーション及び洗浄（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓマイクロアレイ）
ハイブリダイゼーションのために、１１μｌの１０ｘコントロール標的ＲＮＡ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーションキットと共に供給されたもの）を３０μｌのＤＥＰＣ水及び２．２μｌの２５ｘ Ａｇｉｌｅｎｔ断片化緩衝液（Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ）と混合した。この混合物をハイブリダイゼーションオーブン中、６５℃で約３０分間インキュベートした。インキュベーション終了時に、５５μｌのＡｇｉｌｅｎｔハイブリダイゼーション緩衝液（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ）を上記で調製した蛍光ａＲＮＡプローブと共に添加した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＵＲＥＨＹＢハイブリダイゼーションチャンバーを、ガラス製ガスケットスライドをチャンバーの下半分に挿入することにより準備した。インキュベーション終了時に、ハイブリダイゼーション混合物（約１１０μｌ）をガラス製ガスケットスライドに塗布し、Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイチップをこのガスケットの上部に表面を下にして置き、ハイブリダイゼーション溶液がガラス製ガスケットスライドとチップのマイクロアレイ表面との間に挟まれるようにした。チャンバーの上半分を取り付け、接続蝶ねじを締めた。チャンバー内に十分な泡形成があることを確認した後、チャンバーをハイブリダイゼーションオーブンに約１７時間（６５℃及び４ＲＰＭで回転）入れた。ハイブリダイゼーション期間の終了時に、マイクロアレイ／ガラス製ガスケットをＳＵＲＥＨＹＢチャンバーから外し、５０ｍｌの洗浄溶液１（室温、６ｘＳＳＣ、０．００５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０２）に入れた。ガスケットがマイクロアレイから外れ落ちた後、アレイをマグネティック撹拌プレート上の３００ｍｌの新しい洗浄溶液１に移した。溶液を中程度の速度で混合しながらアレイを１０分間洗浄し、次いで３００ｍｌの洗浄溶液２（０．１ｘＳＳＸ、０．００５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０２、４℃）に５分間移した。最終の洗浄後にアレイを乾燥するために、５００ＲＰＭで５分間遠心分離した。

マイクロアレイスキャニング及び解析
マイクロアレイを１０μｍにセットしたスキャニング解像度でＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ ４１００Ａスキャナーによってスキャンし、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏソフトウエアで解析した。初期スキャンの間に、スキャナーのＰＭＴゲインは、ｃｙ５／ｃｙ３画像カウント比率が０．８８と１．１２との間であるよう調節されていた。

計算
ＲＮＡ Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ
Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイの標準曲線を得るために、標準液についてμｇ／ｍｌで既知のＲＮＡ濃度に対する相対蛍光単位をプロットし、このデータポイントに最もよく適合する線を確立するために回帰分析に供した。試験物質及び未処理資料に対する平均ＲＦＵ値を各資料中に存在するＲＮＡの量を概算するために使用した。

マイクロアレイの算出
遺伝子発現のレベルは、マイクロアレイにおいて探査された遺伝子マーカーの蛍光強度に関連している。Ｃｙ３及びＣｙ５プローブを作製するときに標識化効率に違いがある可能性があるため、遺伝子発現における変化を見る前に、２つの染料それぞれの間での蛍光測定値を標準化することが不可欠である。マイクロアレイの蛍光強度を、ｇｌｏｂａｌ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎに供した。両方の染料についての総蛍光シグナルを、両方の染料についての総強度比を１に等しくする補正係数によって標準化した。

蛍光測定値を標準化した後は、遺伝子発現における変化を調べることが可能であった。遺伝子発現における変化を評価するための基準は、典型的に下記の３つの基準を必要とする：
１． Ｃｙ５／Ｃｙ３（処理／未処理）蛍光強度比が、１．３超又は０．７未満である。このことは、少なくとも＋／−３０％の遺伝子発現における変化に関連する。
２． 遺伝子マーカーの蛍光強度は、バックグラウンド強度よりも大きい。
３． 遺伝子特性は、ａＲＮＡプローブによって特異的に明確に特徴付けられるものであって、非特異的な蛍光に起因するのではない（すなわち、ＳＤＳストリークが蛍光痕跡を残すことになる）。

最初の２つの基準は、データのコンピュータ解析によってフィルターをかけることができる。最後の基準は、確認のためにアレイスポットの視覚的検査を必要とする。

結果
下記に報告される研究において、Ｃｙ５／Ｃｙ３は、Ｆ６３５／Ｆ５３２に等しく、蛍光比は、「Ｒａｔｉｏ ｏｆ Ｍｅｄｉａｎｓ ６３５／５３２」として識別される。ＩＤ１及び名称が遺伝子及びヒトゲノムにおけるその位置を同定する。

タイプ１Ａ１コラーゲン遺伝子発現（ＣＯＬ１Ａ１）を示す正常ヒト真皮線維芽細胞の０．０５％精製ポミフェリンによる処理の結果を表２に示す。

表１． 正常ヒト真皮線維芽細胞の０．０５％ポミフェリンによる処理によるタイプ１Ａ１コラーゲンの遺伝子発現

エラスチン遺伝子発現（ＥＬＮ）を示す正常ヒト真皮線維芽細胞の精製ポミフェリンによる処理の結果を表２に示す。

表２． 正常ヒト真皮線維芽細胞の０．０５％ポミフェリンによる処理によるエラスチン（ＥＬＮ）遺伝子発現

（例４）
ＥＬＩＳＡアッセイを用いたコラーゲン１Ａ１及びエラスチンタンパク質発現に対するポミフェリンの影響の検定
方法
線維芽細胞の調製
正常ヒト真皮線維芽細胞を、１２ウエルプレートの個々のウエルの１．０ｍｌの線維芽細胞用増殖培地（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉａ）（ＦＧＭ）に播種し、３７±２℃及び５±１％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、アスピレーションによって培地を取り除き、あらゆる非接着性の細胞を除去して１．０ｍｌの新しいＦＧＭで置換する。細胞は、４８又は７２時間ごとに培地を交換しながらコンフルエントになるまで増殖させた。コンフルエントに達したら１．５％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭで細胞を２４時間処理し、通常の培養培地に含まれる成長因子によるいかなる影響をも洗い流した。この２４時間の洗い流し期間の後に、１．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに特定の濃度で溶解させた試験物質で細胞を処理した。アスコルビン酸及びレチノールをコラーゲン合成のポジティブコントロールとして用いた。未処理細胞（ネガティブコントロール）は、１．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭのみで処理した。細胞を４８時間インキュベートし、インキュベーション期間の終了時に細胞培養培地を回収し、凍結（−７５℃）して保管するか又は直ちにアッセイにかけた。物質は３回ずつ試験した。

ＭＴＴアッセイ
２日間のインキュベーションの後、細胞培養培地を取り除き（上記を参照）、線維芽細胞をＰＢＳで２回洗って残存するあらゆる試験物質を除去した。最終の洗浄の後に、０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを補充した１ｍｌの培地を各ウエルに添加し、細胞を３７±２℃及び５±１％ＣＯ_２で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、ＭＴＴ溶液を取り除き、細胞をもう一度ＰＢＳで洗って、次いで紫色のホルマジン結晶を抽出するためにウエルに１ｍｌのイソプロピルアルコールを加えた。イソプロピル抽出物の２００μｌを９６−ウエルプレートに移し、イソプロピルアルコールをブランクに用いて５４０ｎｍでプレートを測定した。

プロコラーゲンアッセイ（Ｔａｋａｒａ ＥＬＩＳＡキット）
一連のタイプＩＣ−ペプチド標準液を、４０ｎｇ／ｍｌから６４０ｎｇ／ｍｌまでの範囲で調製した。プレートフレームからあらゆる不要なストリップを除去することにより、ＥＬＩＳＡマイクロプレートを準備した。使用する各ウエルに１００μｌのペルオキシダーゼ標識抗プロコラーゲンタイプのＩ−Ｃペプチドを添加し、それに続いて２０μｌの試料又は標準液のいずれかを加えた。マイクロプレートに覆いをかけ、３７℃で３±０．２５時間インキュベートした。インキュベーションの後、各ウエルを４００μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄した。最後の洗浄液を取り除いた後、１００μｌのペルオキシダーゼ基質溶液（過酸化水素＋色素原としてテトラメチルベンジジン）を、各ウエルに加えプレートを室温で１５±５分間インキュベートした。インキュベーションの後、各ウエルに１００μｌの停止溶液（１Ｎ亜硫酸）を加え、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍでプレートを測定した。

エラスチンＥＬＩＳＡプレートの調製
溶解性のα−エラスチンを、１．２５μｇ／ｍｌの濃度で、０．１Ｍの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．０）に溶解した。１５０μｌのこの溶液を９６−ウエルｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃプレートのウエルに適用し、プレートを４℃で一晩インキュベートした。翌日、０．２５％のＢＳＡ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳでウエルを満たした。プレートをこのブロッキング溶液と共に３７℃で１時間インキュベートし、次いで０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで２回洗浄した。

エラスチン競争ＥＬＩＳＡ
１セットのα−エラスチン標準液を０から１００ｎｇ／ｍｌの範囲で作製した。１８０μｌの標準液又は試料のいずれかを６５０μｌのマイクロ遠心チューブに移した。抗−エラスチン抗体溶液を調製し（抗体は、０．２５％のＢＳＡ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳに１：１００で希釈されることになる）、２０μｌの溶液をチューブに加える。チューブを４±２℃で、一晩インキュベートした。翌日、１５０μｌを各チューブから９６−ウエルエラスチンＥＬＩＳＡプレートに移し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、０．２５％のＢＳＡ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳに希釈（１：２５００）したペルオキシダーゼと結合した二次抗体を含む溶液２００μｌを加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを、上述のように３回洗浄した後、２００μｌの基質溶液を添加し、プレートを室温の暗所で１０〜３０分間インキュベートした。この最終のインキュベーションの後、プレートリーダーを用いて４６０ｎｍでプレートを測定した。

計算
ＭＴＴアッセイ
ネガティブコントロール細胞の平均ＭＴＴ吸収値を計算し、セル数に対して１００％の値を表すものとして使用した。種々の処理を受けた細胞の個々のＭＴＴ値を、ネガティブコントロール細胞の平均値で割り、各処置によって起こった細胞数の変化を決定するパーセントとして表した。ＭＴＴアッセイが、１０％超の細胞生存力の低下を示した場合、試験は妥当ではないと考えられる。ポミフェリンのアッセイにおいて、ＭＴＴアッセイは、試験した全ての濃度で１００％の細胞生存率を示した。

プロコラーゲン及びエラスチンの濃度
存在するプロコラーゲン及びエラスチンの量を定量するために、試験キットの製造業者より提供された既知の濃度の各基質を用いて、標準曲線を作成した。これらデータポイントに最もよく適合する線を確立するために回帰分析を行った。未知の試料の吸収値は、各試料中に存在するプロコラーゲン及びエラスチンの量を概算するのに使用した。

フィブリリン発現
フィブリリン免疫検出
ＰＶＤＦメンブレンを予めメタノールで湿らせ、ＴＢＳ（ＴＢＳ：２０ｍＭトリス、ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡にし、Ｂｉｏ−Ｄｏｔマイクロろ過装置に組み込んだ。組み込み後、１００μｌのＴＢＳをＢｉｏ−Ｄｏｔ中のウエルに添加し、全てのウエルに十分な流れが確実に生じるように真空にした。次に、各培地の試料２５０μｌを、装置のウエルに割り当て、試料を適切なウエルに適用した。全ての試料を添加した後、装置が試料の液体をメンブレンを通して引き出し、メンブレンに吸着しているタンパク質だけが残るように、装置に真空をかけた。処理を行う間にメンブレンが乾燥することがないように、試料の割り当てがないウエルにＴＢＳを添加した。吸着処理の終了時に、メンブレンをＢｉｏ−Ｄｏｔ装置から取り外し、ＴＢＳ中で５〜１０分間洗浄し、次いでブロッキング溶液（１％脱脂粉乳を含むＴＢＳ）に入れ、ロッキングプラットフォーム上、室温で少なくとも１時間インキュベートさせた。

抗体のインキュベーション及び検出
ブロッキング後に、メンブレンを、抗体を適切に希釈しながら２０ｍｌのＴＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ）及び０．１％の脱脂粉乳に移し、ロッキングプラットフォーム上、４℃で一晩インキュベートさせた。このインキュベーションの後、メンブレンをＴＢＳＴ中で３回（１ｘ １５分間及び２ｘ ５分間）洗浄した。（フルオロフォアと共役している）二次抗体を次いでメンブレンと共に０．１％の脱脂粉乳を含む１５ｍｌのＴＢＳＴ中で、室温で１時間インキュベートし、次いでＴＢＳ中で３回（１ｘ １５分間、２ｘ ５分間）洗浄した。

最終の洗浄の後、メンブレンをＢｉｏＲａｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＦＸに入れ、励起レーザー及びフルオロフォアに適した発光フィルターの組合せを用いてスキャンした。次いでスキャナーによって作られた画像を、ＩｍａｇｅＪ画像解析ソフトウエアを用いて解析した。

計算
ＭＴＴアッセイ
ネガティブコントロール細胞の平均ＭＴＴ吸収値を算出し、細胞生存力１００％に対応するものとして使用した。次いで種々の処理を受けた細胞の個々のＭＴＴ値を、ネガティブコントロール細胞の平均値で割り、各処置によって起こった細胞生存力の変化を決定するパーセントとして表した。

画像解析
蛍光強度測定は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表した。次いで、各処置に関する平均ＲＦＵ値を計算し、ｏｎｅ ｗａｙアノーバ（ＡＮＯＶＡ）を用いて処置を比較した。

結果
グラフ１．種々の濃度のポミフェリンによる正常ヒト真皮線維芽細胞の処理のタイプ１Ａ１プロコラーゲン発現についての結果

グラフ２．種々の濃度のポミフェリンによる正常ヒト真皮線維芽細胞の処理のエラスチン発現についての結果

グラフ３．種々の濃度のポミフェリンによる正常ヒト真皮線維芽細胞の処理のフィブリリン発現についての結果

（例５）
水中油エマルジョン
実施例１のオセージオレンジ抽出物を、下記の処方及びプロセスを用いて、水中油エマルジョンに処方した。

手順：
１．Ａ相を一緒にし、７５℃に加熱する。均一になるまで混合する。
２．Ｂ相を一緒にし、７５℃に加熱する。均一になるまで混合する。
３．ゆっくりと撹拌しながら、Ｂ相をＡ相に加える。２０分間混合する。
４．予め混合したＣ相を加え、均一になるまで混合する。加熱を止める。
５．別のケトル中でＤ相を予め混合し、４０℃以下でバッチに加える。均一になるまで混合する。
６．Ｍｉｋｒｏｋｉｌｌ ＣＯＳ及び香料をＥ相に加え、均一になるまで混合する。

（例６）
油中水エマルジョン
実施例１のオセージオレンジ抽出物を、下記の処方及びプロセスを用いて、油中水エマルジョンに処方した。

手順：
１．Ａ相の成分全てを一緒に混合する。
２．Ｂ相の成分を、次の成分を加える前に、均一になるまで各成分を十分に混合しながら、記載の順序で一緒にする。
３．十分に撹拌しながら、Ａ相をＢ相にゆっくりと加える。混合物が増粘するように、撹拌速度を次第に高せん断へと増大する。１０分間撹拌を続ける。

（例７）
アイジェル組成物
実施例１のオセージオレンジ抽出物をリポソーム組成物にカプセル化し、次いでカプセル化したオセージオレンジ抽出物を下記のプロセスを用いて、アイジェル組成物に配合した：

手順：
１．Ｃａｒｂｏｐｏｌ Ｕｌｔｒｅｚ ２１を５０℃で水に分散し、Ｋｅｌｔｒｏｌ ＣＧ−ＳＦＴを加える。均一になるまで混合する。
２．ブチレングリコール、Ｍｉｋｒｏｋｉｌｌ ＣＯＳ、ＡＭＰ、ＥＤＴＡ及びＳｉｌｉｃｏｎｅ １９３を加える。均一になるまで混合する。
３．オセージオレンジリポソームを、４０℃でゆっくり穏やかに撹拌しながら加える。均一になるまで混合する。
４．必要に応じて、ｐＨを５．５に調節する。

（例８）
カプセル化オセージオレンジ抽出物
実施例１のオセージオレンジを米国特許公開第２００３／０１９８６８２ Ａ１号に概説される手法を用いて、ポリマーマトリックスにカプセル化した。

（例９）
リップスティック組成物
実施例８のポリマーマトリックスにカプセル化されたオセージオレンジ抽出物を、下記の処方及びプロセスを用いて、リップスティックに処方した。

手順：
１．ワックス、油及び防腐剤（Ａ相）を一緒にし、８３〜８７℃に加熱する。
２．温度を維持しながら均一になるまで撹拌する。
３．温度を７５〜８０℃に下げ、Ｂ相を加える；均一になるまで混合する。
４．パール剤、オセージオレンジ抽出物及びパルミチン酸アルコルビル（Ｃ相）を加える。
５．型に注ぎ込む。

（例１０）
トニック組成物
実施例１のオセージオレンジ抽出物を、下記の処方及びプロセスを用いて、水性アルコール性トニックに処方した。

手順：
・ 水を入れ、Ｂｅｔａｆｉｎ ＢＰ−２０及びオセージオレンジ抽出物を加える。均一になるまで混合する。
・ ハマメリス（Ｗｉｔｃｈ Ｈａｚｅｌ）及びＭｉｋｒｏｋｉｌｌ ＣＯＳを加え、均一になるまで混合する。

（例１１）
ボディウォッシュ組成物
実施例１のオセージオレンジ抽出物を、下記の処方及びプロセスを用いて、ボディウォッシュに処方した。

手順：
１．水を７０℃に加熱してＥＤＴＡ二ナトリウム、グリセリン、を加え、均一になるまで混合する。
２．温度を７０℃以上に維持して、Ｓｔａｎｄａｐｏｌ ＷＡＱ−Ｓｐｅｃｉａｌ、Ｓｔａｎｄａｐｏｌ ＥＳ−２、Ｃｅｒａｓｙｎｔ ＩＰ、コカミドＭＥＡ、Ｖｅｌｖｅｔｅｘ ＢＡ−３５を加え、均一になるまで混合する。
３．４５℃まで冷却し、Ｍｉｋｒｏｋｉｌｌ ＣＯＳ及びオセージオレンジ抽出物を加える。
４．均一になるまで混合する。

（例１２）
イースト／オセージオレンジ発酵製品
実施例１のオセージオレンジ抽出物は、出芽酵母（Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含む発酵培地の一部として含まれる。実施例１からの抽出物の試料をＲｅｄ Ｓｔａｒ Ｙｅａｓｔ （ウイスコンシン州ミルウォーキー）が供給するＢａｋｅｒ’ｓ Ｙｅａｓｔ増殖培地の水性混合物中に入れた。培地には、同じくＲｅｄ Ｓｔａｒが供給する活性な出芽酵母培養物を接種し、この混合物を、制御された好気性条件下で発酵させて、米国特許第２，２３９，３４５号に記載のようなストレス条件を用いて得られるＬｉｖｅ Ｙｅａｓｔ Ｃｅｌｌ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ（ＬＹＣＤ）を提供する。

（例１３）
サブミクロンエマルジョンコンセントレート
本実施例は、実施例１に記載されているように調製したオセージオレンジ抽出物を含むサブミクロンエマルジョンコンセントレートを例証する。
成分 重量％
トリメチロールプロパントリカプリレート／トリカプレート １８．０
グリセリン ８．０
セテアリルアルコール ２．０
セテアレス２０ ２．０
ステアリン酸グリセリル ２．０
ＢＨＴ ０．０１
オセージオレンジ抽出物 １．０
水 １００まで

Claims (10)

1. リポソーム、マルトデキストリン、ポリマーマトリックス、ニオソーム及びナノ粒子からなる群から選択される送達ビヒクル中にカプセル化されているアメリカハリグワ（Ｍａｃｌｕｒａ ｐｏｍｉｆｅｒａ）（オセージオレンジ）果実抽出物を含む組成物を、皮膚に局所的に適用することを含む、治療方法を除く皮膚の状態を調節する方法であって、該果実抽出物が組成物の全重量を基準にして０．００００００１％から１％の量で存在し、該適用が正常ヒト真皮線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１及びエラスチン遺伝子の発現をアップレギュレートすることによって皮膚の外観及び状態を改善し、且つ該果実抽出物がプレニル化イソフラボノイドを含む、
   上記方法。
2. 前記果実抽出物が、組成物の全重量を基準にして０．００００１％から１％の量で存在する、請求項１に記載の方法。
3. 前記果実抽出物が、組成物の全重量を基準にして０．０１％から１％の量で存在する、請求項１に記載の方法。
4. （ａ）正常ヒト真皮線維芽細胞においてコラーゲン１Ａ１及びエラスチン遺伝子の発現を増大するのに十分な、安全且つ有効な量の、ポミフェリン、オサジン及びこれらの組合せからなる群から選択されるプレニル化イソフラボノイド；並びに
   （ｂ）化粧品に又は皮膚科学的に許容できる該プレニル化イソフラボノイドのキャリヤーを含む組成物であって、該プレニル化イソフラボノイドが組成物の全重量を基準にして０．００００００１％から１％の量で存在し、該キャリヤーが組成物の全重量を基準にして５０％から９９％の量で存在する上記組成物を、皮膚に局所的に適用することを含む、治療方法を除く皮膚の状態を調節する方法であって、該適用が正常ヒト真皮線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１及びエラスチン遺伝子の発現をアップレギュレートすることによって皮膚の外観及び状態を改善する、上記方法。
5. 前記プレニル化イソフラボノイドが植物抽出物から単離される、請求項４に記載の方法。
6. 前記植物抽出物が、アメリカハリグワ（Ｍａｃｌｕｒａ ｐｏｍｉｆｅｒａ）（オセージオレンジ）由来である、請求項５に記載の方法。
7. 前記プレニル化イソフラボノイドが、組成物の全重量を基準にして０．０１％から１％の量で存在する、請求項４に記載の方法。
8. 前記組成物が１つ又は複数の皮膚活性化成分をさらに含む、請求項４に記載の方法。
9. 前記プレニル化イソフラボノイドが、組成物の全重量を基準にして０．００００１％から１％の量で存在する、請求項４に記載の方法。
10. 前記プレニル化イソフラボノイドが、組成物の全重量を基準にして０．０００１％から０．０５％の量で存在する、請求項４に記載の方法。