JP6220919B2

JP6220919B2 - 肺がんへの傾向についてのスクリーニングのための方法およびマーカー組合せ

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Publication number: JP6220919B2
Application number: JP2016092476A
Authority: JP
Inventors: ジヨン・ラツセル; トレイシー・コルピツツ; エリツク・ラツセル; ステイーブン・フロスト; ハビアー・ラミレス; バワーニ・シン
Original assignee: アボツト・モレキユラー・インコーポレイテツド
Priority date: 2005-12-22
Filing date: 2016-05-02
Publication date: 2017-10-25
Anticipated expiration: 2026-12-21
Also published as: EP2485047A3; EP3147665A1; JP5793114B2; EP3153860A3; JP5160447B2; EP1969363B1; ES2606015T3; CA2634797A1; EP3153860A2; JP2016176954A; ES2610806T3; JP6106700B2; EP2485047A2; WO2007076439A3; WO2007076439A2; JP2017207499A; CA2821426A1; CA2949753A1; EP1969363A4; JP2015148621A

Description

肺がんは米国において男性および女性両方にて、第二のもっとも一般的ながんであり、２００５年には、推定１７２，５００新規症例が診断されると推定される（ＡｍｅｒｉｃａｎＣａｎｃｅｒＳｏｃｉｅｔｙ統計）。両性にて、がんの死のもっとも一般的な原因であり、２００５年に１６３，０００以上の肺がんが死に関連すると推測される。肺がんはまた、世界の他の地域でも主要な健康問題である。欧州連合において、およそ１３５，０００の新規症例が毎年起こっている。ＧｅｎｅｓｉｓＲｅｐｏｒｔ，１９９５年２月。また、男性のタバコ消費率が世界でもっとも高い中央および東ヨーロッパにて、罹患率が急速に増加している。Ｔ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．８７：１３４８−１３４９（１９９５）。タバコのみで、肺、気管および気管支のがんのすべての症例の、９０％以上の原因である。ＣＰＭＣｎｅｔ、ＧｕｉｄｅｔｏＣｌｉｎｉｃａｌＰｒｅｖｅｎｔｉｖｅＳｅｒｖｉｃｅｓ。世界保健機関（ＷｏｒｌｄＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）のがん研究の国際機関（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｇｅｎｃｙｆｏｒＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＣａｎｃｅｒ）は、２００２年に、全世界で、１，３５２，０００症例の肺がんが存在し、１，１７９，０００の死がこの疾患によるものと推定した。

早期段階の肺がんは、胸部レントゲン写真および喀痰細胞診によって検出可能であるが、これらの手順は、無症状の個体に対するスクリーニング試験として日常的に使用するほど十分な精度を有していない。腰部レントゲン写真の感度を制限しうる可能性のある技術問題には、準最適技術、不十分な暴露、および患者の位置決めと協力が含まれる。Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１０４：６６３−６７０（１９８６）。放射線科医師はしばしば、胸部レントゲン写真の解釈に同意せず、これらの４０％以上が有意であるか、または潜在的に有意である。Ｐ．Ｇ．Ｈｅｒｍａｎ，ｅｔａｌ．，Ｃｈｅｓｔ６８：２７８−２８２（１９７５）。偽陰性解釈が、ほとんどのエラーの原因であり、決定的でない結果が、明確化のための追加試験を必要とする。Ｔ．Ｇ．Ｔａｐｅｅｔａｌ．，上記。

喀痰細胞診は、早期肺がんを検出することにおいて、胸部レントゲン写真よりも感度が低い。国立がんセンター（ＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）共同早期肺がん検出プログラム（ＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅＥａｒｌｙＬｕｎｇＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎＰｒｏｇｒａｍ）、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．１３０：５６５−５６７（１９８４）。肺がんを診断する喀痰細胞診の能力に影響を与える因子には、十分な唾液を産出する患者の能力、腫瘍の大きさ、主要な気道への腫瘍の近さ、腫瘍の組織学的型、および細胞病理学者の経験およびトレーニングが含まれる。Ｒ．Ｊ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ，ＦｏｕｒｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．６７３−７２３，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｊ／Ｂ．ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＣｏ．（１９９３）。

もっとも新しい肺がんは、この疾患が肺の下に広がっている場合に検出されうる。米国において、新規非小細胞肺がんのたった１６％が、局在化ステージで検出され、５年生存率は、４９．５％もっとも高い。反対に、新規症例の６８％が、それぞれ１８．５％および１．８％の５年生存率である、疾患が局所的に広く広がっている場合、または遠位部に転移した場合に検出される。同様に、新規検出小細胞肺がんの８０％が、局所浸潤または遠位転移にて発見され、それぞれ９．５％および１．７％の５年生存率である。ＳｔａｔＢｉｔｅ，Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．８７：１６６２（１９９５）。これらの統計は、現在の手段が、疾患の早期、治療可能ステージでの肺がんを検出できていないこと、および死亡率を減少させるために、検出および治療の方法の改善を必要とすることを示している。

最初の治療後に肺がん患者をモニタリングするためのもっとも頻繁に使用される方法は、病院訪問、胸部Ｘ線、全血球計数、肝臓機能検査および胸部コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）である。しかしながら、定期的モニタリングによる再発の検出は、治療の様式および総合生存時間に大きな影響を与えず、これによって、現在のモニタリング法が費用効率が高くないという結論を導く。Ｋ．Ｓ．Ｎａｕｎｈｅｉｍｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６０：１６１２−１６１６（１９９５）。Ｇ．Ｌ．Ｗａｌｓｈｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６０：１５６３−１５７２（１９９５）。

最近になり、肺がんに対して高い危険性のある無症状の患者を検査するために、ＣＴの利用が再検証されてきた。Ｃ．Ｉ．Ｈｅｎｓｃｈｋｅｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍａｇｉｎｇ２８：３１７−３２１（２００４）は、ＣＴスキャニングが、多くの擬陽性を産出することなしに、無症状性肺がんを検出可能であることを示唆している２つの研究を報告している。Ｊ．Ｇｏｈａｇｅｎｅｔａｌ．，Ｃｈｅｓｔ１２６：１１４−１２１（２００４）は、胸部Ｘ線を低用量スパイラルコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）と比較している無作為研究のための試験プロトコールを評価し、肺がんに対する検査への大規模無作為臨床試験が適していたと結論づけた。しかしながら、臨床診療にて実行する場合でさえ、ＣＴスクリーニングのコストは高く、さらなる検査を導く偽陽性の数は高い。良好な特異性を有する低コスト血液試験が、がんの早期検出に対してＣＴを補完する。ＣＴの利用を改善するための他の戦略には、早期ステージ肺がんに対する高感度血液試験の利用が関与する。そのような試験が、ＣＴまたはＸ線に対する代替案として患者に提案され、試験が陽性の場合、患者は撮像され、試験が陰性の場合、患者はスキャンされず、将来再試験される。血液試験が高感度または高特異性、または理想的には両方を提供するかどうか、そのような試験が、早期ステージ肺がんを検出するために使用される現在のプロトコールに有用性を発見する。

さらに、肺がんの危険性のある個体を同定するために、パネル内に統合した場合に、腫瘍マーカーおよびその有用性の最近の再評価が存在する。しかしながら、個々のマーカーの特性である感度の欠如によって、腫瘍マーカーのパネルが、肺がんの早期検出のために有用であることを妨げる。反対に、公知の免疫アッセイマーカー、すなわちＣＥＡ、ＮＳＥおよびＰｒｏＧＲＰのパネルが、生検試料を得ることが難しい場合に、肺がんの組織学的を行うのに有用であると知られている。（Ｃ．Ｇｒｕｂｅｒｅｔａｌ．，ＴｕｍｏｒＢｉｏｌｏｇｙ２７（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１）：７１（２００６）およびＰ．Ｓｔｉｅｂｅｒｅｔａｌ．，ＴｕｍｏｒＢｉｏｌｏｇｙ，２７（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ２）：Ｓ５−４（２００６）。

正常肺組織と比較して、肺腫瘍組織中で異なった形で発現した細胞成分をまず同定することによって、肺がんに対する改善された腫瘍マーカーを発見する試みがなされてきた。二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動が、ポリペプチド組成中の定量的および定性的差違を特性化するために使用されてきた。Ｔ．Ｈｉｒａｎｏｅｔａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ７２：８４０−８４８（１９９５）。Ａ．Ｔ，Ｅｎｄｌｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．ＣｈｅｍＣｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４：９８１−９９２（１９８６）。しかしながら、本技術の感度は、２つの電気泳動段階のタンパク質分解の程度によって、そしてゲル中のタンパク質の染色に依存する検出段階によって制限される。また、ポリペプチドの不安定性が、二次元パターンにて不自然な結果を産出しうる。

イースタンバージニアメディカルスクール（ＥａｓｔｅｒｎＶｉｒｇｉｎｉａＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ）による、国際公開番号ＷＯ２００５／０９８４４５Ａ−２にて記述されたもののような、バイオマーカーおよび肺がんの診断での補助におけるこれら利用を同定する試みも行われてきた。国際公開番号ＷＯ２００５／０９８４４５にて議論されたバイオマーカーは、表面増強レーザー脱着／イオン化質量分析（ＳＥＬＤＩ）を用いて同定された。種々のマーカー、キット、方法およびディシジョンツリー解析法が開示されている。しかしながら、これらのマーカー、キットおよび方法は、これらのマーカーおよび方法が、任意の研究室にて再現できなかったので、日常の診療での使用に適合できなかった。

疾患を患う、または患っていない個体からの血清で、酵母または細菌中で発現されたペプチドライブラリーを調査することによって、肺がんに特異的な免疫応答を発見する試みも行われてきた。Ｈｉｒｓｃｈｏｗｉｔｚ（Ｌ．Ｚｈｏｎｇｅｔａｌ．，Ｃｈｅｓｔ１２５：１０５−１０６（２００４）、Ｌ．Ｚｈｏｎｇｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．１５：１３０８−１３１４（２００５））の研究所からの発行物が、肺がんの患者に対する自己抗原であるタンパク質を発見するための、ファージライブラリーの利用を記述した。著者は、対照試験にて、症候性および無症候性両方の肺がん患者の良好な同定について報告した。しかしながら、症例数および対照が制限されており（＜２００総被験者）、本方法は、非常の多くの集団において正当性を立証する必要がある。

現在、肺がんの危険性がある個体の同定は、個体の喫煙歴に大きく基づいている。アスベスト、微粒子などのような他の環境暴露がまた、肺がんを発現させる危険性を増加させる。これらの公知の危険性因子が、１つ以上のアルゴリズム内に統合され、臨床医が利用可能であり、肺がんの個体の危険性を査定するために公的である（Ｐ．Ｂ．Ｂａｃｈｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．９５：４７０−４７８（２００３））。残念なことに、本アルゴリズムは、早期ステージ肺がんの検出のために有用であるほど十分感度がよくなく、特異的でない。実際、引用されたアルゴリズムに基づいて、明らかな喫煙歴を有する個体が、肺がんを発現される、１／５００から１／１００の相対危険性を有する。これは、Ｂａｃｈ等の方法を用いても、５００のＣＴスキャンのうち４９９が、肺がんの症例の発見にいたらないことを意味する。

その結果、実施するために迅速で、簡便で、費用効率が高い肺がんを検出するために有用な方法およびマーカーに対して、当技術分野で必要性が残っている。肺がんを発現させる、患者の可能性ある素因または危険性を示唆するために使用可能な、特定の方法およびマーカーを提供する。そのような方法には、肺がんを示唆するバイオマーカーについて試料を検査し、そのようなマーカーを検出するための方法が含まれうる。そのような方法には、マーカーに対して、生体試料のマススペクトルを解析する、または試料をアッセイし、ついでバイオマーカーを、肺がんの指標として、または肺がんを発現させる危険性として検出するための改善方法が含まれうる。

国際公開第２００５／０９８４４５号

ＡｍｅｒｉｃａｎＣａｎｃｅｒＳｏｃｉｅｔｙ統計ＧｅｎｅｓｉｓＲｅｐｏｒｔ，１９９５年２月Ｔ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．８７：１３４８−１３４９（１９９５）Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１０４：６６３−６７０（１９８６）Ｐ．Ｇ．Ｈｅｒｍａｎ，ｅｔａｌ．，Ｃｈｅｓｔ６８：２７８−２８２（１９７５）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．１３０：５６５−５６７（１９８４）ＳｔａｔＢｉｔｅ，Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．８７：１６６２（１９９５）Ｋ．Ｓ．Ｎａｕｎｈｅｉｍｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６０：１６１２−１６１６（１９９５）Ｇ．Ｌ．Ｗａｌｓｈｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６０：１５６３−１５７２（１９９５）Ｃ．Ｉ．Ｈｅｎｓｃｈｋｅｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍａｇｉｎｇ２８：３１７−３２１（２００４）Ｊ．Ｇｏｈａｇｅｎｅｔａｌ．，Ｃｈｅｓｔ１２６：１１４−１２１（２００４）Ｃ．Ｇｒｕｂｅｒｅｔａｌ．，ＴｕｍｏｒＢｉｏｌｏｇｙ２７（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１）：７１（２００６）Ｐ．Ｓｔｉｅｂｅｒｅｔａｌ．，ＴｕｍｏｒＢｉｏｌｏｇｙ，２７（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ２）：Ｓ５−４（２００６）Ｔ．Ｈｉｒａｎｏｅｔａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ７２：８４０−８４８（１９９５）Ａ．Ｔ，Ｅｎｄｌｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．ＣｈｅｍＣｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４：９８１−９９２（１９８６）Ｈｉｒｓｃｈｏｗｉｔｚ（Ｌ．Ｚｈｏｎｇｅｔａｌ．，Ｃｈｅｓｔ１２５：１０５−１０６（２００４）Ｌ．Ｚｈｏｎｇｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．１５：１３０８−１３１４（２００５）Ｐ．Ｂ．Ｂａｃｈｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．９５：４７０−４７８（２００３）

（発明の要約）
本発明は部分的に、肺がんを患っていることが疑われる被験者中の肺がんの検出において補助するための、迅速で感度のよい方法が、バイオマーカーおよびバイオマーカーとバイオメトリックパラメーターの特定の組合せに基づきうるという発見に基づく。

１つの態様において、本方法には、
ａ．被験者より試験試料を得る段階
ｂ．試験試料中、パネル中の１つ以上のバイオマーカーの量を定量する段階、
ｃ．前記バイオマーカーに対して、所定のカットオフと、パネル中の各バイオマーカーの量を比較し、前記比較に基づいた各バイオマーカーに対するスコアを割り当てる段階、
ｄ．段階ｃにおいて決定された各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアを比較して、前記被験者に関する総スコアを見つけ出す段階、
ｅ．段階ｄにて決定された総スコアを、所定の総スコアと比較する段階、および
ｆ．前記被験者が総スコアに基づく肺がんの危険性を有するかどうか決定する段階、
が含まれうる。

上記方法において、肺がんに関連するバイオマーカーのＤＦＩは、好ましくは約０．４未満である。

場合により、上記方法はさらに、被験者より少なくとも１つのバイオメトリックパラメーターを得る段階を含み得る。得ることが可能なバイオメトリックパラメーターの例は、被験者の喫煙歴である。上記方法がさらに、被験者から少なくとも１つのバイオメトリックパラメーターを得る段階を含む場合、本方法にはさらに、少なくとも１つのバイオメトリックパラメーターを、各前記バイオメトリックパラメーターに対する所定のカットオフに対して比較する段階、および前記比較に基づいた各バイオメトリックパラメーターに対してスコアを割り当てる段階、各バイオメトリックパラメーターに対する割り当てられたスコアを、段階ｃにて定量した各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアと統合して、段階ｄでの前記被験者に対する総スコアを見つけ出す段階、総スコアを、段階ｅでの所定の総スコアと比較する段階、および前記被験者が、段階ｆ中の総スコアに基づいて、肺がんの危険性を有するかどうかを決定する段階、が含まれうる。

上記方法にて定量可能なバイオマーカーの例には、抗体、抗原および関心領域の群から選択される１つ以上のバイオマーカーがあげられる。より具体的には、定量可能なバイオマーカーには、限定はしないが、１つ以上の、抗−ｐ５３、抗−ＴＭＰ２１、抗−ニーマン−ピックＣ１−様タンパク質１、Ｃ末端ペプチド）−ドメイン（抗−ＮＰＣ１Ｌ１Ｃ−ドメイン）、抗−ＴＭＯＤ１、抗−ＣＡＭＫ１、抗−ＲＧＳ１、抗−ＰＡＣＳＩＮ１、抗−ＲＣＶ１、抗−ＭＡＰＫＡＰＫ３、免疫反応性サイクリンＥ２に対する少なくとも１つの抗体、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、ｐｒｏＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−抗−トリプシン、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、Ａｃｎ６３９９、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ６４５３、Ｐｕｂ２９５１、Ｐｕｂ２４３３、Ｐｕｂ１７３３８、ＴＦＡ６４５３およびＨＩＣ３９５９が含まれる。

他の態様において、方法には、
ａ．被験者から少なくとも１つのバイオメトリックパラメーターを得る段階、
ｂ．少なくとも１つのバイオメトリックパラメーターを、前記各バイオメトリックパラメーターに関して、所定のカットオフと比較し、前記比較に基づいた各バイオメトリックパラメーターに対してスコアを割り当てる段階、
ｃ．被験者から試験試料を得る段階、
ｄ．試験試料中、パネル内の２つ以上のバイオマーカーの量を定量し、パネルは、少なくとも１つの抗体および少なくとも１つの抗原を含む段階、
ｅ．パネル中で定量された各バイオマーカーの量を、前記バイオマーカーに関する所定のカットオフに対して比較する段階と、前記比較に基づいて各バイオマーカーに対してスコアを割り当てる段階、
ｆ．段階ｂにて決定した各バイオメトリックパラメーターに対する割り当てられたスコアを、段階ｅにて定量した各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアと統合して、前記被験者の総スコアを見つけ出す段階、
ｇ．段階ｆで決定された総スコアを、所定の総スコアと比較する段階、
ｈ．前記被験者が、段階ｆで決定した総スコアに基づいて、肺がんの危険性を有するかどうかを決定する段階、
が含まれうる。

上記方法において、パネルは、抗−ｐ５３、抗−ＴＭＰ２１、抗−ＮＰＣ１Ｌ１Ｃ−ドメイン、抗−ＴＭＯＤ１、抗−ＣＡＭＫ１、抗−ＲＧＳ１、抗−ＰＡＣＳＩＮ１、抗−ＲＣＶ１、抗−ＭＡＰＫＡＰＫ３および免疫反応性サイクリンＥ２に対する少なくとも１つの抗体からなる群より選択される少なくとも１つの抗体、およびサイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、ｐｒｏＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−抗−トリプシンおよびアポリポタンパク質ＣＩＩＩからなる群から選択される少なくとも１つの抗原を含み得る。

上記方法において、被験者から得たバイオメトリックパラメーターは、被験者の喫煙歴、年齢、発がん物質への暴露および性別からなる群より選択される。好ましくは、バイオメトリックパラメーターは、経験者の喫煙のパックイヤーである。

場合により、方法には、試料試験中の少なくとも１つの関心領域を定量することが含まれうる。関心領域が、試験試料中で定量される場合、パネルにはさらに、Ａｃｎ６３９９、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ６４５３、Ｐｕｂ２９５１、Ｐｕｂ２４３３、Ｐｕｂ１７３３８、ＴＦＡ６４５３およびＨＩＣ３９５９からなる群から選択される、少なくとも１つの関心領域を含み得る。

場合により、上記方法はまた、患者が肺がんを発現させる危険性があるかどうかを決定するために、分割加重スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＷｅｉｇｈｔｅｄＳｃｏｒｉｎｇＭｅｔｈｏｄ）を利用可能である。上記方法が、そのような分割加重スコア法を利用する場合、前記方法にて、段階ｂが、少なくとも１つのバイオメトリックパラメーターを、前記バイオメトリックパラメーターに対する所定のカットオフの数に対して比較する段階、および前記比較に基づいて、各前記バイオメトリックパラメーターに対してスコアを割り当てる段階、を含み、段階ｅが、パネル中の各バイオマーカーの量を、前記バイオマーカーに対する所定のカットオフの数に対して比較する段階、および前記比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てる段階を含み、段階ｆが、段階ｂでの各バイオメトリックパラメーターに対する割り当てられたスコアを、段階ｅで定量された各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアと統合して、前記被験者に対する総スコアを見つけ出す段階を含み、段階ｇが、段階ｆで決定した総スコアを、所定の総スコアの数と比較する段階を含み、段階ｈが、前記被験者が、段階ｇで決定した総スコアに基づいて、肺がんを有するかどうかを決定する段階を含む。

他の態様において、方法には、
ａ．被験者から試験試料を得る段階、
ｂ．パネル中の２つ以上のバイオマーカーの量を、試験試料中で定量し、パネルは、少なくとも１つの抗体と少なくとも１つの抗原を含む段階、
ｃ．パネル中で定量された各バイオマーカーの量を、前記バイオマーカーに対して所定のカットオフと比較し、前記比較に基づいて各バイオマーカーに対してスコアを割り当てる段階、
ｄ．段階ｃにおいて定量された各バイオマーカーに対して割り当てたスコアを統合して、前記被験者に対する総スコアを見つけ出す段階、
ｅ．段階ｄにて決定された総スコアを、所定の総スコアと比較する段階、
ｆ．前記被験者が、段階ｅにて決定された総スコアに基づいて、肺がんの危険性を有するかどうかを決定する段階、
が含まれうる。

上記方法において、パネルには、抗−ｐ５３、抗−ＴＭＰ２１、抗−ＮＰＣ１Ｌ１Ｃ−ドメイン、抗−ＴＭＯＤ１、抗−ＣＡＭＫ１、抗−ＲＧＳ１、抗−ＰＡＣＳＩＮ１、抗−ＲＣＶ１、抗−ＭＡＰＫＡＰＫ３および免疫反応性サイクリンＥ２に対する少なくとも１つの抗体からなる群より選択される少なくとも１つの抗体が含まれうる。パネルには、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、ｐｒｏＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−抗−トリプシンおよびアポリポタンパク質ＣＩＩＩからなる群から選択される少なくとも１つの抗原が含まれうる。

場合により、方法にはさらに、試験試料中、少なくとも１つの関心領域を定量化することが含まれうる。関心領域が定量化される場合、パネルにはさらに、Ａｃｎ６３９９、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ６４５３、Ｐｕｂ２９５１、Ｐｕｂ２４３３、Ｐｕｂ１７３３８、ＴＦＡ６４５３およびＨＩＣ３９５９からなる群より選択される、少なくとも１つの関心領域が含まれうる。

場合により、上記方法はまた、患者が肺がんを発現させる危険性があるかどうかを決定するために、分割加重スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＷｅｉｇｈｔｅｄＳｃｏｒｉｎｇＭｅｔｈｏｄ）を利用可能である。上記方法が、そのような分割加重スコア法を利用する場合、前記方法にて、段階ｃが、パネル中の各バイオマーカーの量を、前記バイオマーカーに関して所定のカットオフの数と比較する段階、および前記比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てる段階、を含み、段階ｄが、段階ｃにて定量した各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアを統合して、前記被験者に対する総スコアを見つけ出す段階を含み、段階ｅが、段階ｄで決定した総スコアを、所定の総スコアの数と比較する段階を含み、段階ｆが、段階ｅで決定した総スコアに基づいて、前記被験者が肺がんを有するかどうかを決定する段階を含む。

他の態様において、方法には、
ａ．被験者から試験試料を得る段階、
ｂ．パネル中、少なくとも１つのバイオマーカーの量を、試験試料中で定量し、パネルが、免疫反応性サイクリンＥ２に対する少なくとも１つの抗体を含む段階、
ｃ．パネル中で定量した各バイオマーカーの量を、前記バイオマーカーに対する所定のカットオフに対して比較する段階、および前記比較に基づいて各バイオマーカーに対してスコアを割り当てる段階、
ｄ．段階ｃにて定量した各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアを統合して、前記被験者に対する総スコアを見つけ出す段階、
ｅ．段階ｄにて決定した総スコアを、所定の総スコアと比較する段階、
ｆ．段階ｅで決定した総スコアに基づいて、前記被験者が肺がんを有するかどうか決定する段階、
を含み得る。

場合により、上記方法にはさらに、試験試料中の少なくとも１つの抗原を定量する段階、試験試料中の少なくとも１つの抗体を定量する段階、または試験試料中の少なくとも１つの抗原と少なくとも１つの抗体の組合せを定量する段階、が含まれうる。その結果、少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの抗体、または少なくとも１つの抗原と少なくとも１つの抗体の組合せが、試験試料中で定量されるべき場合、パネルにはさらに、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、ｐｒｏＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−抗−トリプシンおよびアポリポタンパク質ＣＩＩＩからなる群から選択される少なくとも１つの抗原、抗−ｐ５３、抗−ＴＭＰ２１、抗−ＮＰＣ１Ｌ１Ｃ−ドメイン、抗−ＴＭＯＤ１、抗−ＣＡＭＫ１、抗−ＲＧＳ１、抗−ＰＡＣＳＩＮ１、抗−ＲＣＶ１、抗−ＭＡＰＫＡＰＫ３および免疫反応性サイクリンＥ２に対する少なくとも１つの抗体からなる群より選択される少なくとも１つの抗体、またはそれらの任意の組合せが含まれる。

場合により、上記方法はまた、患者が肺がんを発現させる危険性があるかどうかを決定するために、分割加重スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＷｅｉｇｈｔｅｄＳｃｏｒｉｎｇＭｅｔｈｏｄ）を利用可能である。上記方法が、そのような分割加重スコア法を利用する場合、前記方法にて、段階ｃが、パネル中の各バイオマーカーの量を、前記バイオマーカーに対する所定のカットオフの数に対して比較して、前記比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てる段階を含み、段階ｄが、段階ｃにて定量した各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアを統合して、前記被験者に対する総スコアを見つけ出す段階、を含み、段階ｅが、段階ｄで決定した総スコアを、所定の総スコアの数と比較する段階を含み、段階ｆが、段階ｅで決定された総スコアに基づいて、前記被験者が肺がんを有するかどうかを決定する段階を含む。

場合により、上記方法はさらに、被験者から少なくとも１つのバイオメトリックパラメーターを得る段階を含み得る。被験者から得られるバイオメトリックパラメーターは、被験者の喫煙歴、年齢、発がん物質への暴露および性別からなる群より選択される。好ましくは、バイオメトリックパラメーターは、被験者の喫煙のパックイヤーである。上記方法がさらに、被験者から少なくとも１つのバイオメトリックパラメーターを得る段階を含む場合、方法にはさらに、少なくとも１つのバイオメトリックパラメーターを、各前記バイオメトリックパラメーターに対して所定のカットオフに対して比較する段階、および前記比較に基づいて、各バイオメトリックパラメーターに対してスコアを割り当てる段階、各バイオメトリックパラメーターに対して割り当てられたスコアを、段階ｃにて定量された各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアと統合して、前記被験者中の総スコアを見つけ出す段階と、総スコアを、段階ｅでの所定の総スコアと比較する段階、および段階ｆでの総スコアに基づいて、前記被験者が肺がんの危険性を有するかどうかを決定する段階、が含まれうる。

他の態様において、方法には、
ａ．被験者から試験試料を得る段階、
ｂ．パネル中、少なくとも１つのバイオマーカーを試験試料中で定量し、パネルには、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、ｐｒｏＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−抗−トリプシンおよびアポリポタンパク質ＣＩＩＩからなる群より選択される少なくとも１つのバイオマーカーを含む段階、
ｃ．パネル中で定量した各バイオマーカーの量を、前記バイオマーカーに対する所定のカットオフと比較する段階、および前記比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てる段階、
ｄ．段階ｃにて定量した各バイオマーカーに対する割り当てたスコアを統合し、前記被験者に対する総スコアを見つけ出す段階、
ｅ．段階ｄにて定量した総スコアを、所定の総スコアと比較する段階、および
ｆ．総スコアに基づいて、前記被験者が肺がんを有するかどうか決定する段階、
が含まれうる。

場合により、上記方法はさらに、試験試料中、少なくとも１つの抗体を定量する段階が含まれうる。その結果、パネルにはさらに、抗−ｐ５３、抗−ＴＭＰ２１、抗−ＮＰＣ１Ｌ１Ｃ−ドメイン、抗−ＴＭＯＤ１、抗−ＣＡＭＫ１、抗−ＲＧＳ１、抗−ＰＡＣＳＩＮ１、抗−ＲＣＶ１、抗−ＭＡＰＫＡＰＫ３、および免疫反応性サイクリンＥ２に対する少なくとも１つの抗体、または任意のこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１つの抗体が含まれうる。

場合により、方法にはさらに、試験試料中、少なくとも１つの関心領域を定量する段階が含まれる。関心領域が定量される場合、パネルにはさらに、Ａｃｎ６３９９、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ６４５３、Ｐｕｂ２９５１、Ｐｕｂ２４３３、Ｐｕｂ１７３３８、ＴＦＡ６４５３およびＨＩＣ３９５９からなる群より選択される少なくとも１つの関心領域が含まれうる。

場合により、上記方法はまた、患者が肺がんを発現させる危険性があるかどうかを決定するために、分割加重スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＷｅｉｇｈｔｅｄＳｃｏｒｉｎｇＭｅｔｈｏｄ）を利用可能である。上記方法が、そのような分割加重スコア法を利用する場合、前記方法にて、段階ｃが、パネル中の各バイオマーカーの量を、前記バイオマーカーに対する所定のカットオフの数を比較する段階、および前記比較にもとづいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てる段階を含み、段階ｄが、段階ｃにて定量された各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアを統合して、前記被験者に対する総スコアを見つけ出す段階を含み、段階ｅは、段階ｄで決定された総スコアを、所定の総スコアの数を比較する段階を含み、段階ｆは、段階ｅにて決定された総スコアに基づいて、前記被験者が肺がんを有するかどうかを決定する段階を含む。

場合により、上記方法はさらに、被験者から少なくとも１つのバイオメトリックパラメーターを得る段階を含み得る。被験者から選られうるバイオメトリックパラメーターは、被験者の喫煙歴、年齢、発がん物質への暴露および性別からなる群より選択される。好ましくは、バイオメトリックパラメーターは、喫煙のパックイヤーである。上記方法がさらに、被験者から少なくとも１つのバイオメトリックパラメーターを得る段階を含む場合、方法にはさらに、少なくとも１つのバイオメトリックパラメーターを、各前記バイオメトリックパラメーターに対して所定のカットオフに対して比較する段階、および前記比較に基づいて、各バイオメトリックパラメーターに対してスコアを割り当てる段階、各バイオメトリックパラメーターに対して割り当てられたスコアを、段階ｃにて定量された各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアと統合して、前記被験者中の総スコアを見つけ打差宇個と、総スコアを、段階ｅでの所定の総スコアと比較する段階、および段階ｆでの総スコアに基づいて、前記被験者が肺がんの危険性を有するかどうかを決定する段階、が含まれうる。

他の態様において、方法には、
ａ．被験者から試験試料を得る段階、
ｂ．パネル中、少なくとも１つのバイオマーカーを、試験試料中で定量し、パネルは、少なくとも１つのバイオマーカーを含み段階で、バイオマーカーは、Ａｃｎ６３９９、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ６４５３、Ｐｕｂ２９５１、Ｐｕｂ２４３３、Ｐｕｂ１７３３８、ＴＦＡ６４５３およびＨＩＣ３９５９からなる群より選択される、関心領域である、
ｃ．パネル中で定量した各バイオマーカーの量を、前記バイオマーカーに対して所定のカットオフと比較する段階、および前記比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てる段階、
ｄ．段階ｃで定量した各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアを統合して、前記被験者に対する総スコアを見つけ出す段階、
ｅ．段階ｄにて定量した総スコアを、所定の総スコアと比較する段階、
ｆ．段階ｅにて決定した総スコアに基づいて、前記被験者が肺がんを有するかどうかを決定する段階、
が含まれうる。

場合により、上記方法にはさらに、試験試料中の少なくとも１つの抗原を定量する段階、試験試料中の少なくとも１つの抗体を定量する段階、または試験試料中の少なくとも１つの抗原と少なくとも１つの抗体の組合せを定量する段階、が含まれうる。その結果、少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの抗体、または少なくとも１つの抗原または抗体の組合せが、試験試料中で定量されるべき場合、パネルにはさらに、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、ｐｒｏＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−抗−トリプシンおよびアポリポタンパク質ＣＩＩＩからなる群から選択される少なくとも１つの抗原、抗−ｐ５３、抗−ＴＭＰ２１、抗−ＮＰＣ１Ｌ１Ｃ−ドメイン、抗−ＴＭＯＤ１、抗−ＣＡＭＫ１、抗−ＲＧＳ１、抗−ＰＡＣＳＩＮ１、抗−ＲＣＶ１、抗−ＭＡＰＫＡＰＫ３および免疫反応性サイクリンＥ２に対する少なくとも１つの抗体からなる群より選択される少なくとも１つの抗体、またはそれらの任意の組合せが含まれる。

場合により、上記方法はさらに、被験者から少なくとも１つのバイオメトリックパラメーターを得る段階を含み得る。被験者から選られうるバイオメトリックパラメーターは、被験者の喫煙歴、年齢、発がん物質への暴露および性別からなる群より選択される。好ましくは、バイオメトリックパラメーターは、喫煙のパックイヤーである。上記方法がさらに、被験者から少なくとも１つのバイオメトリックパラメーターを得る段階を含む場合、方法にはさらに、少なくとも１つのバイオメトリックパラメーターを、各前記バイオメトリックパラメーターに対して所定のカットオフに対して比較する段階、および前記比較に基づいて、各バイオメトリックパラメーターに対してスコアを割り当てる段階、各バイオメトリックパラメーターに対して割り当てられたスコアを、段階ｃにて定量された各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアと統合して、前記被験者中の総スコアを見つけ出す段階と、総スコアを、段階ｅでの所定の総スコアと比較する段階、および段階ｆでの総スコアに基づいて、前記被験者が肺がんの危険性を有するかどうかを決定する段階、が含まれうる。

他の態様において、発明は、
ａ．被験者から試験試料を得る段階、
ｂ．パネル中、２つ又はそれ以上のバイオマーカーの量を試験試料中で定量し、パネルは、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、ｐｒｏＧＲＰ、ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｔｆａ６４５３およびＨｉｃ３９５９の２つ以上を含む段階、
ｃ．パネル中の各バイオマーカーの量を、前記バイオマーカーに対する所定のカットオフに対して比較し、前記比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てる段階、
ｄ．段階ｃにて決定された各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアを統合し、前記被験者に対する総スコアを見つけ出す段階、
ｅ．段階ｄで決定された総スコアを、所定の総スコアと比較する段階、および
ｆ．段階ｅにて決定された総スコアに基づいて、前記被験者が肺がんを有するかどうかを決定する段階、
を含み得る。

上記方法において、肺がんに関連するバイオマーカーのＤＦＩは、好ましくは約０．４未満である。
場合により、上記方法でのパネルは、サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９およびＴＦＡ２７５９、サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９およびＴＦＡ９１３３、サイトケラチン１９、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、サイトケラチン１８およびＰｒｏＧＲＰ、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｔｆａ６４５３およびＨｉｃ３９５９またはサイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、サイトケラチン１８、ＰｒｏＧＲＰ、ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３を含み得る。

場合により、上記方法はまた、患者が肺がんを発現させる危険性があるかどうかを決定するために、分割加重スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＷｅｉｇｈｔｅｄＳｃｏｒｉｎｇＭｅｔｈｏｄ）を利用可能である。上記方法が、そのような分割加重スコア法を利用する場合、前記方法にて、段階ｃが、パネル中の各バイオマーカーの量を、前記バイオマーカーに対する所定のカットオフの数と比較する段階、および前記比較に基づいて各バイオマーカーに対してスコアを割り当てる段階、を含み、段階ｄが、段階ｃにて定量した各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアを統合して、前記被験者に対する総スコアを見つけ出す段階を含み、段階ｅが、段階ｄにて決定した総スコアを、所定の総スコアの数と比較することを含む段階、および段階ｆが、段階ｅにて決定された総スコアに基づいて、全被験者が肺がんを有するかどうかを決定する段階を含む。

本発明は、以上で記述した方法にて使用されうる種々の異なるキットにも関する。１つの態様において、キットは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５またはこれらの任意の組合せからなる群より選択されるペプチドを含み得る。他の態様において、キットは、免疫反応性サイクリンＥ２に対する少なくとも１つの抗体、またはそれらの任意の組合せを含み得る。さらなる態様において、キットは、（ａ）試験試料中１つ以上の抗原を定量するための、少なくとも１つの抗体を含む試薬で、前記抗原は、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、ｐｒｏＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−抗−トリプシンおよびアポリポタンパク質ＣＩＩＩである、（ｂ）試験試料中の少なくとも１つの抗体を定量するための、１つ以上の抗体を含む試薬で、前記抗体は、抗−ｐ５３、抗−ＴＭＰ２１、抗−ＮＰＣ１Ｌ１Ｃ−ドメイン、抗−ＴＭＯＤ１、抗−ＣＡＭＫ１、抗−ＲＧＳ１、抗−ＰＡＣＳＩＮ１、抗−ＲＣＶ１、抗−ＭＡＰＫＡＰＫ３および免疫反応性サイクリンＥ２に対する少なくとも１つの抗体である、（ｃ）ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｔｆａ６４５３およびＨＩＣ３９５９からなる群から選択される、１つ以上の関心領域を定量するための試薬、および（ｄ）試験試料中で定量した各抗原、抗体および関心領域の量を、所定のカットオフに対して比較すること、および前記比較に基づいて、定量された各抗原、抗体および関心領域に対してスコアを割り当てること、定量した各抗原、抗体および関心領域に対する割り当てられたスコアを統合して、総スコアを得ること、総スコアを、所定の総スコアと比較すること、および前記比較を被験者が肺がんを有するかどうかを決定することにおける補助として使用することのための１つ以上のアルゴリズム、を含み得る。またさらに他の態様において、キットは、（ａ）試験試料中、１つ以上の抗原を定量するための、少なくとも１つの抗体を含む試薬で、前記抗原は、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、ＳＣＣおよびｐｒｏＧＲＰである、（ｂ）Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｔｆａ６４５３およびＨｉｃ３９５９からなる群から選択される、１つ以上の関心領域を定量するための試薬、および
（ｃ）試験試料にて定量された、各抗原、抗体および関心の域の量を統合し、所定のカットオフに対して比較するため、前記比較に基づいて定量した、各抗原およびバイオマーカーに対してスコアを割り当てるため、総スコアを得るために定量した各抗原および関心領域に対して割り当てられたスコアを統合すること、総スコアを所定の総スコアと比較すること、および被験者が肺がんを有するかどうか決定することにおける補助として、前記比較を用いるための、１つ以上のアルゴリズム、を含み得る。定量可能な抗原および関心領域の例は、（ａ）サイトケラチン１９、ＣＥＡおよびＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９およびＴｆａ２７５９、（ｂ）サイトケラチン１９およびＣＥＡおよびＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、Ｔｆａ２７５９およびＴｆａ９１３３、および（ｃ）サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、サイトケラチン１８、およびＰｒｏＧＲＰおよびＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９およびＴｆａ２７５９である。他の態様において、キットは、（ａ）試験試料中、１つ以上の抗原を定量するための、少なくとも１つの抗体を含む試薬で、前記抗原は、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、ＳＣＣおよびｐｒｏＧＲＰである、および（ｂ）試験試料にて定量された、各抗原の量を統合し、所定のカットオフに対して比較するため、および前記比較に基づいて定量した、各抗原に対してスコアを割り当てるため、総スコアを得るために定量した各抗原に対して割り当てられたスコアを統合すること、総スコアを所定の総スコアと比較すること、および被験者が肺がんを有するかどうか決定することにおける補助として、前記比較を用いるための、１つ以上のアルゴリズム、を含み得る。キットを用いて定量可能な抗体の例は、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、ＳＣＣおよびＰｒｏＧＲＰである。他の態様において、キットは、（ａ）１つ以上のバイオマーカーを定量するための試薬で、前記バイオマーカーが、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｔｆａ６４５３およびＨｉｃ３９５９からなる群から選択される、関心領域である、および（ｂ）試験試料にて定量された、各バイオマーカーの量を統合し、所定のカットオフに対して比較するため、および前記比較に基づいて定量した、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てるため、総スコアを得るために定量した各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアを統合すること、総スコアを所定の総スコアと比較すること、および被験者が肺がんを有するかどうか決定することにおける補助として、前記比較を用いるための、１つ以上のアルゴリズム、を含む。キットを使用して定量されうる関心領域の例は、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｔｆａ６４５３およびＨｉｃ３９５９からなる群から選択可能である。

本発明は、単離または精製ポリペプチドにも関する。本発明によって企図される単離または精製ポリペプチドは、（ａ）配列番号３および配列番号３のアミノ酸配列に対して６０％相同性を有するポリペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列を有する（含む）単離または精製ポリペプチド、（ｂ）配列番号３および配列番号３のアミノ酸配列に対して６０％相同性を有するポリペプチドからなる群より選択されたアミノ酸配列から本質的になる単離または精製ポリペプチド、（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列からなる単離または精製ポリペプチド、（ｄ）配列番号４および配列番号４のアミノ酸配列に対して６０％相同性を有するポリペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列を有する単離または精製ポリペプチド、（ｅ）配列番号４および配列番号４のアミノ酸配列に対して６０％相同性を有するポリペプチドからなる群より選択されたアミノ酸配列から本質的になる単離または精製ポリペプチド、（ｆ）配列番号４のアミノ酸配列からなる単離または精製ポリペプチド、（ｇ）配列番号５および配列番号５のアミノ酸配列に対して６０％相同性を有するポリペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列を有する単離または精製ポリペプチド、（ｈ）配列番号５および配列番号５のアミノ酸配列に対して６０％相同性を有するポリペプチドからなる群より選択されたアミノ酸配列から本質的になる単離または精製ポリペプチド、（ｉ）配列番号５のアミノ酸配列からなる単離または精製ポリペプチド、である。

本発明はまた、固有の分割加重スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＷｅｉｇｈｔｅｄＳｃｏｒｉｎｇＭｅｔｈｏｄ）に関する。本方法は、被験者から得た１つ以上のマーカーをスコア化するために使用可能である。本方法は、
ａ．被験者から少なくとも１つのマーカーを得る段階、
ｂ．前記被験者からのマーカーの量を定量する段階、
ｃ．定量した各マーカーの量を、前記マーカーに対して所定のカットオフの数に対して比較する段階、および前記比較に基づいて、各マーカーに対してスコアを割り当てる段階、および、
ｄ．段階ｃにて定量した各マーカーに対する割り当てられたスコアを統合して、前記被験者に対する総スコアを見つけ出す段階、
を含み得る。

上記方法において、所定のカットオフは、ＲＯＣ曲線に基づき、各マーカーに対するスコアは、マーカーの特異性に基づいて計算する。さらに、上記方法におけるマーカーは、バイオマーカー、バイオメトリックパラメーター、またはバイオマーカーとバイオメトリックパラメーターの組合せでありうる。

さらに、本発明は、分割加重スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＷｅｉｇｈｔｅｄＳｃｏｒｉｎｇＭｅｔｈｏｄ）を用いる、病状を発現させる患者の危険性を決定するための方法を提供する。本方法には、
ａ．被験者から少なくとも１つのマーカーを得る段階、
ｂ．前記被験者からのマーカーの量を定量する段階、
ｃ．定量した各マーカーの量を、前記マーカーに対して所定のカットオフの数に対して比較する段階、および前記比較に基づいて、各マーカーに対してスコアを割り当てる段階、
ｄ．段階ｃにて定量した各マーカーに対する割り当てられたスコアを統合して、前記被験者に対する総スコアを見つけ出す段階、
ｅ．段階ｄにて決定された総スコアを、所定の総スコアと比較する段階、および、
ｆ．段階ｅにて決定した総スコアに基づいて、病状を発現させる危険性を前記被験者が有するかどうかを決定する段階、
が含まれうる。

バイオ−インフォマティックス・ワークフローのダイアグラムである。特に、ＭＳデータおよびＩＡデータを、種々の統計学的方法にかけた。ロジスティック回帰を使用して、受信者動作特性（ＲｅｃｅｉｖｅｒＯｐｅｒａｔｏｒＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ））曲線を産出し、各マーカーに関して、曲線化面積（ＡｒｅａＵｎｄｅｒｔｈｅＣｕｒｖｅ（ＡＵＣ））を得た。最も高いＡＵＣを持つトップのマーカーを候補マーカーとして選択した。判別分析（ＤｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔＡｎａｌｙｓｉｓ（ＤＡ））、主成分分析（ＰｒｉｎｃｉｐａｌＣｏｍｐｏｎｅｎｔＡｎａｌｙｓｉｓ（ＰＣＡ））、および決定木解析（ＤｅｃｉｓｉｏｎＴｒｅｅｓ（ＤＴ）のような多重変数解析が、モデルへの入力に関して、さらなるマーカーを同定した。バイオメトリックパラメーターをまた含めることができる。少なくとも５０％のトレーニングセット中で発生する強固なマーカーを、分割スコア（ＳｐｌｉｔａｎｄＳｃｏｒｅ）法／アルゴリズム（ＳＳＭ）によって同定し、推定バイオマーカーとして選別する。工程を、最終予測モデルのために公的な数のマーカーが得られるまで、ｎ回繰り返す。ａ）プールしたＨＰＬＣ画分を濃縮した後、およびｂ）濃縮工程前の、Ｐｕｂ１１５９７バイオマーカー候補を示しているＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳプロファイルである。試料は、ＨＰＬＣ画分化後でさえ、複合体混合物である。ゲルにのせた種々の試料の成分を示している染色ゲルである。レーンａ、ｆおよびｇは、較正目的のための、公知の分子量の標準タンパク質の混合物を示している。さらに、レーンｂおよびｅは、市販されている、ヒト血清アミロイドＡ（ＨＳＡＡ）として知られる推定されるタンパク質の非所運異性制された形態を示している。レーンｃおよびｄは、推定バイオマーカーを含む画分化試料を示している。ＨＳＡＡ標準と同一の距離を遊走する混合液中の成分が存在する。ＨＳＡＡと同一の誘導距離を持つバンドをゲルより切り出し、ゲル内消化およびＭＳ／ＭＳ解析にかけて、その同一性を確認した。Ｐｕｂ１１５９７のトリプシン消化のＬＣ−ＭＳ／ＭＳである。パネルａからｄは、４つの主要な前駆体イオンのＭＳ／ＭＳを示している。ｂおよびｙ産物イオンは、注釈が施されており、誘導アミノ酸配列が、４つの前駆体イオンのそれぞれに与えられる。産出されたｂおよびｙイオンの分子量を用いたデータベース検索により、ＨＳＡＡとして供給タンパク質が同定された。観察された断片（ＭＷ＝１１５２６．５１）の完全配列が、配列番号６にて提供されている。Ｐｕｂ１１５９７のトリプシン消化のＬＣ−ＭＳ／ＭＳである。パネルａからｄは、４つの主要な前駆体イオンのＭＳ／ＭＳを示している。ｂおよびｙ産物イオンは、注釈が施されており、誘導アミノ酸配列が、４つの前駆体イオンのそれぞれに与えられる。産出されたｂおよびｙイオンの分子量を用いたデータベース検索により、ＨＳＡＡとして供給タンパク質が同定された。観察された断片（ＭＷ＝１１５２６．５１）の完全配列が、配列番号６にて提供されている。Ｐｕｂ１１５９７のトリプシン消化のＬＣ−ＭＳ／ＭＳである。パネルａからｄは、４つの主要な前駆体イオンのＭＳ／ＭＳを示している。ｂおよびｙ産物イオンは、注釈が施されており、誘導アミノ酸配列が、４つの前駆体イオンのそれぞれに与えられる。産出されたｂおよびｙイオンの分子量を用いたデータベース検索により、ＨＳＡＡとして供給タンパク質が同定された。観察された断片（ＭＷ＝１１５２６．５１）の完全配列が、配列番号６にて提供されている。Ｐｕｂ１１５９７のトリプシン消化のＬＣ−ＭＳ／ＭＳである。パネルａからｄは、４つの主要な前駆体イオンのＭＳ／ＭＳを示している。ｂおよびｙ産物イオンは、注釈が施されており、誘導アミノ酸配列が、４つの前駆体イオンのそれぞれに与えられる。産出されたｂおよびｙイオンの分子量を用いたデータベース検索により、ＨＳＡＡとして供給タンパク質が同定された。観察された断片（ＭＷ＝１１５２６．５１）の完全配列が、配列番号６にて提供されている。実施例１にて記述された７５１の患者試料にて実施された、８つの免疫アッセイバイオマーカーパネルから産出されたＲＯＣ曲線を与える。黒ダイアモンドは、分割加重スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＷｅｉｇｈｔｅｄＳｃｏｒｉｎｇＭｅｔｈｏｄ）を用いて総スコアより産出されたＲＯＣ曲線を表している。四角形は、大コホートスプリット点を用いる二元スコアリング法を用いて総スコアより産出されたＲＯＣ曲線を表している。三角形は、小コホートスプリット点を用いる二元スコアリング法を用いて総スコアより産出されたＲＯＣ曲線を表している。

（発明の詳細な記述）
定義
本明細書で使用するように、以下の語句は以下の意味を有する。すべての他の技術的および科学的語句が、当業者に一般的に理解される意味を有する。

語句「吸着剤（ａｄｓｏｒｂｅｎｔ）」は、生体分子を集積（結合）可能な任意の物質を意味する。吸着剤は典型的に、生物学的に活性な表面を被覆し、それらの物理的特性に基づいて、生体分子または種々の生体分子に結合可能である、単一物質または多数の異なる物質からなる。そのような物質には、限定はしないが、アニオン交換物質、カチオン交換物質、金属キレーター、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、抗体、ポリマー（合成または天然）、紙などが含まれる。

本明細書で使用するところの語句「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、免疫グロブリン分子またはその免疫学的に活性な部分、すなわち抗原結合部分を意味する。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例には、ペプシンのような酵素で抗体を処理することによって産出可能な、Ｆ（ａｂ）および）Ｆ（ａｂ’）_２断片が含まれる。抗体の例には、限定はしないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、組換え体抗体、一本鎖Ｆｖｓ（「ｓｃＦｖ」）、アフィニティー飽和抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド−結合Ｆｖｓ（「ｓｄＦｖ」）および抗イデオタイプ（「抗−Ｉｄ」）抗体および以上の任意の機能的に活性なエピトープ−結合断片が含まれる。本明細書で使用するところの語句「抗体」にはまた、自己抗体（自己抗体は、被験者または患者が合成する、たとえば、限定はしないが、ｐ５３、カルレチクリン、α−エノラーゼおよびＨＯＸＢ７のような、正常の自己タンパク質（または自己抗原）に対して指向する抗体である）が含まれる。広範囲の自己抗原に対する自己抗体が当業者に周知であり、特に肺がん、乳がん、前立腺がん、および膵臓がんなどを含む、多くの悪性疾患中で記述されてきている。抗体はバイオマーカーの１つの型である。

本明細書で使用するところの語句「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）」は、抗体によって結合されうる分子を意味し、さらに動物が、その抗原の少なくとも１つのエピトープに結合可能な抗体を産出するように誘導可能である。さらに、関心領域が、抗原であり得る（言い換えれば、最終的に抗原であると決定されうる）。抗原はバイオマーカーの１つの型である。

語句「ＡＵＣ」は、ＲＯＣ曲線の、曲線下面積（ＡｒｅａＵｎｄｅｒｔｈｅＣｕｒｖｅ）を意味する。これは、所与の試料集団における試験のためのメリットの図として使用され、完全な試験に対して１から、試験が試験被験者を分類することにおける完全なランダム応答を与える０．５までの範囲の値を与える。ＡＵＣの範囲が、０．５から１．０だけであるため、ＡＵＣ中の小さな変化が、０から１または０から１００％の範囲である計量中の同様の変化よりもより有意である。ＡＵＣにて％変化が与えられる場合、計量の全範囲が、０．５から１．０である事実に基づいて計算される。ＪＭＰ（商標）統計パッケージが、産出された各ＲＯＣ曲線に対するＡＵＣを報告する。ＡＵＣ測定は、完全データ範囲にわたる分類アルゴリズムの精度を比較するための価値のある手段である。より大きなＡＵＣを有する分類アルゴリズムは定義によって、２つの関心の群（疾患および非疾患）間で正しく未知を分類するより大きな能力を有する。分類アルゴリズムは、単一分子の測定と同様に単純であってよく、または多数の分子の測定および統合と同様に複雑であってよい。

語句「良性肺疾患（ｂｅｎｉｇｎｌｕｎｇｄｉｓｅａｓｅ）」または「良性（ｂｅｎｉｇｎ）」は、任意の所与の被験者の肺系と関連した疾患状態を意味する。本発明の文脈において、良性肺疾患には、限定はしないが、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性または慢性炎症、良性小結節、良性新生組織形成、異形成症、過形成、異型性、気管支拡張症、ヒストプラスマ症、サルコイドーシス、線維症、肉芽腫、血腫、肺気腫、肺拡張不全、組織球増殖症および他の非がん性疾患が含まれる。

語句「生物学的に活性な表面（ｂｉｏｌｏｇｉｄｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅｓｕｒｆａｃｅ）」は、物質および生体分子の特異的な生化学的特性のために、生体分子が結合、または相互作用可能な物質の任意に二次元または三次元伸展を意味する。そのような生化学的特性には、限定はしないが、イオン性特性（荷電）、疎水性または親水性が含まれる。

語句「生物学的試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓａｍｐｌｅ）」および「試験試料（ｔｅｓｔｓａｍｐｌｅ）」は、任意の所与の被験者から単離されたすべての生物学的液体および排せつ物を意味する。本発明の文脈において、そのような試料には、限定はしないが、血液、血清、血漿、乳頭吸引液、尿、精液（ｓｅｍｅｎ）、精液（ｓｅｍｉｎａｌｆｌｕｉｄ）、精漿、前立腺液、排泄物、涙、唾液、汗、生検、腹水、脳脊髄液、乳、リンパ液、気管支および他の洗浄液試料、または組織抽出試料が含まれる。典型的に、血液、血清、血漿および気管支洗浄液が、本発明の文脈における使用のために好ましい試験試料である。

語句「バイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）」は、生理的状態と相関する生体分子（または生体分子の断片）を意味する。たとえば、本発明のバイオマーカーはがん、好ましくは肺がんに相関し、肺がんの存在または不在の検出における補助として使用可能である。そのようなバイオマーカーには、限定はしないが、ヌクレオチド、アミノ酸、糖、脂肪酸、ステロイド、代謝物、ポリペプチド、（限定はしないが、抗原および抗体のような）タンパク質、糖質、脂質、ホルモン、抗体、生体分子に対する代用として役目を果たす関心領域、これらの組合せ（たとえば糖タンパク質、リボヌクレオタンパク質、リポタンパク質）、および限定はしないが、抗原と、前記抗原上の利用可能なエピトープに結合する自己抗体間で形成される複合体のような、任意のそのような生体分子を含む任意の複合体が含まれる。語句「バイオマーカー」はまた、少なくとも５個の保存アミノ酸残基、好ましくは少なくとも１０個の保存アミノ酸残基、より好ましくは１５個の保存アミノ酸残基を含み、親ポリペプチドの生物学的活性および／またはいくつかの機能特性、たとえば抗原性または構造ドメイン特性を維持する、ポリペプチド（親）配列の一部分も意味する。

語句「バイオメトリックパラメーター（ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒ）」は、よく定義された群または集団に属しているような患者を一意的に同定するために使用する、１つ以上の固有の生理学的または行動特性を意味する。本発明の文脈において、「バイオメトリックパラメーター」には、限定はしないが、患者の理学的記述子が含まれる。バイオメトリックパラメーターの例には、限定はしないが、患者の身長、患者の体重、患者の性別、喫煙歴、職業歴、発がん性物質に対する暴露、受動喫煙への暴露、肺がんの家族歴などが含まれる。喫煙歴は通常、パックイヤー（Ｐｋｙｒｓ）において定量される。本明細書で使用するところの語句「パックイヤー（ＰａｃｋＹｅａｒｓ）」は、一日あたりで喫煙したパックの平均数でわった、個人の喫煙した年数を意味する。平均で、３５年間、一日あたり１パックのたばこを吸った個人は、３５パックイヤーの喫煙歴を有するとされる。バイオメトリックパラメーター情報は、患者の日常質問書または健康歴質問書などの利用によって、被験者自身からのような、当技術分野で公知の日常の技術を用いて、被験者より得られる。あるいは、バイオメトリックパラメーターは、看護士、ナース・プラクティショナー、医師のアシスタントまたは医師より、被験者から得ることができる。

「保存アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」は、アミノ酸残基が、類似側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（たとえばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえばアスパラギン酸、グルタミン酸）、未荷電極性側鎖（たとえばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（たとえばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖（たとえばスレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（たとえばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、タンパク質内の予想非必須アミノ酸残基が好ましくは、同一の側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と置換される。

語句「決定木解析（ＤｅｃｉｓｉｏｎＴｒｅｅＡｎａｌｙｓｉｓ）」は、連続した単一二股ルール（または症状）が、決定木を介して、最終分類出力または木の末端節へのガイドを提供する、古典的アプローチを意味する。その本質的に単純で、直感的な性質が、帰納的な分割を診断工程に非常に従順にする。

この方法は、２つの型の変数、因子変数（Ｘ’ｓ）および応答変数（Ｙ’ｓ）を必要とする。実行されるように、Ｘ変数が連続的であり、Ｙ変数が絶対的である（名目上）。そのような場合、ＪＭＰ統計パッケージは、多数の節を最大化する、カットオフ値を産出するアルゴリズムを利用する。試料を、このカットオフ値より上および下である値に基づいて、枝または節に分割する。

絶対的応答変数に関して、この場合でのように、フィットした値が、各応答レベルに対する推定可能性となる。この場合、スプリットを、もっとも大きな尤度比カイ二乗統計（Ｇ^２）によって決定される。これは、２つのスプリットの枝間の応答における差を最大化する効果を有する。本方法のより詳細な議論およびその実施が、ＪＭＰ統計およびグラフィックスガイドで見ることができる。

しかしながら、木を構築することは、それに関連したその固有の懸案事項を有する。共通の懸案事項は、データを過剰フィッティングすることなしに、もっともよい予測モデルを提供する木の最適な大きさを決定することである。このことを考慮に入れて、ＲＯＣ曲線を構築するために、種々の木の節にて抽出可能な情報の利用を作成するように、方法が開発された。実施されたように、本方法は、モデルされているデータ組を確実に過剰フィットされる十分な節で、参照木を構築することを含む。結果として、木が切り戻され、引き続いて、節の最小数が到達するまで（２末端節）、各段階でもっとも悪い節を除去する。これによって、複雑性が減少した（節が少ない）一連の木、または木のファミリーが作製される。

帰納的分割プログラムは、純粋な末端節を作製することを試み、すなわち１つの分類型の標本のみが含まれる。しかしながら、常に可能ではない。しばしば、末端節は、混合集団を有する。したがって、各末端節は、がんに対する異なる可能性を持ちうる。がんに対する純粋な末端節において、がん標本である可能性は１００％でありえ、反対に、非がんに対する純粋な末端節に対して、がん標本である可能性は、０％でありうる。各末端節でのがんの可能性は、各節にて、（１−非がんの可能性）に対してプロットされる。

これらの値を、特定の木の代表である、ＲＯＣ曲線を発生するためにプロットする。各木に対して計算したＡＵＣは、木またはモデルの「有益な部分（ｇｏｏｄｎｅｓｓ）」を表している。任意の診断適用と同様に、ＡＵＣが高ければ高いほど、アッセイが、またはこの場合モデルがよりよい。木の大きさ（節の数）に対するＡＵＣのプロットが、その最大として、トレーニング組に対してもっともよいモデルを持ちうる。同様の手順を第二の、しかしより小さなデータのサブセットで実施して、結果を認証する。トレーニングおよび認証組両方での同様の実施のモデルが、さらなる解析および／または認証のために最適であり、したがって選択されると考えられる。

語句「開発データ組（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｄａｔａｓｅｔ）」または「データ組（ｄａｔａｓｅｔ）」は、生体試料の組に対して回収した、完全バイオマーカーまたはバイオマーカーおよびバイオメトリックパラメーターを含む特徴を意味する。これらの試料自体が、公知の診断結果で患者から引き出される。特徴または特徴の組を統計解析にかけ、公知の患者予後に相関する、２つ以上の異なる試料群（たとえばがんおよび非がん）への試料の分類を意図する。質量スペクトルを使用する場合、組内の質量スペクトルが、それらの強度において異なりえるが、器具類の精度内の、それらの見かけ分子質量内ではない。

語句「分類子（ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）」は、試料に関連した疾患を決定するために、試料の組に対して由来した特徴を用いる任意のアルゴリズムを意味する。分類子の１つの型が、トレーニング組からのデータで、アルゴリズムを「トレーニングすること（ｔｒａｉｎｉｎｇ）」によって作製し、その性能は、試験組データで評価する。本発明に関して使用する分類子の例は、判別分析、決定木解析、受信者動作曲線または分割スコア解析である。

語句「決定木（ｄｅｃｉｓｉｏｎｔｒｅｅ）」は、分類のために使用される、フローチャート様木構造を有する分類子を意味する。決定木は、サブセット内へのデータ組の繰り返しスプリットからなる。各スプリットは、１つの変数に適用した単一のルールからなり、たとえば「変数１」の値が「閾値１」よりも大きい場合、左にいき、それ以外の場合右に行く」である。したがって、所与の特徴スペースを、１つのクラスに割り当てた各長方形を有する、長方形の組に分割する。

語句「診断アッセイ（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａｓｓａｙ）」および「診断法（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｍｅｔｈｏｄ）」は、病的状態の存在または性質の決定を意味する。診断アッセイは、これらの感度および特異性で異なる。肺がんに対して試験陽性であり、実際に疾患である患者が、「真の陽性（ｔｒｕｅｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）」と考えられる。本発明の文脈内で、診断アッセイの感度は、疾患集団内の真の陽性の割合として定義される。肺がんを患っているが、診断アッセイによって検出されていない被験者が、「偽陰性（ｆａｌｓｅｎｅｇａｔｉｖｅｓ）」と考えられる。疾患をもっておらず、診断アッセイで試験陰性である被験者は、「真の陰性（ｔｒｕｅｎｅｇａｔｉｖｅｓ）」と考えられる。本明細書で使用するところの語句診断アッセイの特異性は、非疾患集団における真の陰性の割合として定義される。

語句「判別分析（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔａｎａｌｙｓｉｓ）」は、２つ以上の天然に存在する群間を最適に判別する特徴を選別するために使用する統計法の組を意味する。判別分析のデータ組への適用によって、利用者は、さらなる解析のために、もっとも判別する特徴に焦点をあてることができる。

語句「理想からの距離（ＤｉｓｔａｎｃｅＦｒｏｍＩｄｅａｌ）」または「ＤＦＩ」は、感度および特異性両方を組み込み、［（１−感度）^２＋（１−特異性）^２］^１／２として定義される、理想からの距離である、ＲＯＣ曲線からとるパラメーターを意味する。ＤＦＩは、１００％感度および１００％特異性の性能のアッセイに対して０であり、０％感度および０％特異性を有するアッセイに対すて１．４１４まで増加する。その決定に対して完全データ範囲を使用するＡＵＣとは異なって、ＤＦＩが、ＲＯＣ曲線上の特定の点における試験の性能を測定する。より低いＤＦＩ値を有する試験は、より高いＤＦＩ値を有するものより良好に機能する。ＤＦＩは、米国特許明細書番号第２００６／０２１１０１９Ａ１号にて詳細に議論されている。

語句「アンサンブル（ｅｎｓｅｍｂｌｅ）」、「木アンサンブル（ｔｒｅｅｅｎｓｅｍｂｌｅ）」または「アンサンブル分類子（ｅｎｓｅｍｂｌｅｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）」が、相互互換的に使用可能であり、多くの単一の要素分類子からなる分類子を意味し、たとえば、決定木のアンサンブルは、決定木からなる分類子である。アンサンブル分類子の結果は、たとえば、すべての構成要素分類子を等しく重みを加える過半数投票によって、その構成要素分類子の結果のすべてを統合することによって得られる。過半数投票は、構成要素分類子を、これらが発生される頻度によって天然に重みを加える場合に、とりわけ道理にかなっている。

語句「エプトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、また抗体によって認識されうる抗体によって結合されうる抗原の部分を引用することを意味する。エプトープ決定因子は通常、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面グルーピングからなり、特定の三次元構造特性ならびに特定の荷電特性を有する。

語句「特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）」および「変数（ｖａｒｉａｂｌｅ）」は、相互互換的に使用してよく、試料の特性の測定の値を意味する。これらの測定は、試料の物理的、化学的または生物学的特徴から由来してよい。測定の例には、限定はしないが、質量スペクトルピーク、質量スペクトルシグナル、ＲＯＩの強度の関数が含まれる。

配列間の相同性または配列同一性の計算（語句は本明細書で相互互換的に使用される）は以下のように実施する。

２つのアミノ酸配列の、または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列を、最適な比較目的のために並べる（たとえば、ギャップを、最適なアライメントのために、第一および第二アミノ酸または核酸配列の１つまたは両方に導入可能であり、非相同配列を比較の目的のために無視可能である）。好ましい実施形態において、比較目的のために並べた参照配列の長さは、並べる参照アミノ酸残基配列の長さの、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、およびより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％である。ついで、相当するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置における、アミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一配列中の位置が、第二配列中の相当する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、分子がその位置で同一である（本明細書で使用するように、アミノ酸または核酸「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、アミノ酸または核酸「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」と等価である）。２つの配列間のパーセント同一性は、２つのアライメントの最適な配列のために導入される必要のある、ギャップの数、および各ギャップの長さを考慮にいれて、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。

配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成可能である。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５、または６の長さウェイトを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム内に組み込まれた、ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムを用いて決定する。また他の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０、または８０のギャップウェイトと１、２、３、４、５、または６の長さウェイトを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて決定する。パラメーターの特に好ましい組（および分子が本発明の配列同一性または相同性限界内であるかどうかを決定するために何のパラメーターを適用すべきかについて、実施者が不確かである場合に使用すべきもの）は、１２のギャップオープンペナルティー、４のギャップエクステンドペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティーでの、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリックスを用いることである。

２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０ウェイト残余表、１２のギャップ長さペナルティおよび４のギャップペナルティを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれた、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓａｎｄＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムを用いて決定可能である。

本明細書で記述された核酸およびタンパク質配列を、たとえば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために、公的なデータベースに対する検索を実施するために、「クエリー配列（ｑｕｅｒｙｓｅｑｕｅｎｃｅ）」として使用可能である。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実施可能である。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明の免疫反応性サイクリンＥ２に相同性のアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施可能である。比較の目的のためのギャップアライメントを得るために、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２（１９９７）にて記述されたように利用可能である。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを利用可能である。

本明細書で使用するところの語句「免疫反応性サイクリンＥ２（ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅサイクリンＥ２）」は、（１）配列番号１、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の任意のアミノ酸を有するポリペプチド、（２）配列番号１、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の任意の組合せ、（３）配列番号１に対して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号３に対して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号４に対して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号５に対して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、およびこれらの任意の組合せ、（４）配列番号１、配列番号３、配列番号４または配列番号５と同様の免疫反応性を示すサイクリンＥ２ポリペプチド、および（５）配列番号１、配列番号３、配列番号４、または配列番号５と同様の免疫反応性を示すポリペプチド、を意味する。

「単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」または「精製（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」ポリペプチドまたはタンパク質は、このタンパク質が由来する細胞または細胞起源からの細胞物質または他の汚染細胞を本質的に含まず、または化学的に合成された場合、化学的前駆体または他の化学物質を本質的に含まない。タンパク質またはその生物学的活性な部分を組換え体的に産出する場合、培養培地を本質的に含まないことも好ましく、すなわち、培養培地が、タンパク質調製物の容量の、約２０％未満、より好ましくは、約１０％未満、もっとも好ましくは約５％未満であることを表す。

本明細書で使用するところの語句「直線区別解析（ＬｉｎｅａｒＤｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅＡｎａｌｙｓｉｓ）」は、試料を正しくカテゴリー化する際にもっともよいそれらの変数または特徴を同定するためのツールを提供し、たとえばＪＭＰ（商標）統計パッケージによって実施可能である、解析の１つの型を意味する。ソフトウェアの段階的特徴を用いて、変数を、すべての試料を正しく分類するまで、モデルに加えてよい。一般的に、この様式で選別された変数の組は、データ組中の変数の本来の数よりも、本質的に小さい。特徴の数のこの減少が、任意の次の解析、たとえば、決定木、人工神経ネットワークなどを用いる、より一般的な分類エンジンの開発を単純化する。

語句「肺がん（ｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ）」は、任意の所与の被験者の肺系に関連したがん状態を意味する。本発明の文脈において、肺がんには、限定はしないが、腺がん、扁平上皮がん、扁平上皮細胞がん、大細胞がん、小細胞がん、非小細胞がんおよび細気管支肺胞上皮がんが含まれる。本発明の文脈内で、肺がんは、異なるステージであってよく、グレードの程度は様々であってよい。肺がんのステージ、またはそのグレード程度を決定するための方法が、当業者に周知である。

語句「質量分析法（ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」は、表面上、試料からの気体相イオンを産出させるためのイオン源の利用、および質量分析器で気体相イオンを検出すること、を意味する。語句「レーザー脱着質量分析法（ｌａｓｅｒｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」は、表面上、試料からの気体相イオンを産出させるために、イオン源としてレーザーを利用し、および質量分析器で気体相イオンを検出することを意味する。生体分子のための質量分析法の好ましい方法は、マトリックス補助レーザー脱着／イオン化質量分析法、またはＭＡＬＤＩである。ＭＡＬＤＩにおいて、解析物を典型的に、乾燥に際して、解析物と共結晶化する、マトリックス物質と混合する。マトリックス物質は、さもなければ不安定な生体分子または解析物を断片化する、エネルギー供給源からエネルギーを吸収する。他の好ましい方法は、表面増強レーザー脱着／イオン化質量分析法またはＳＥＬＤＩである。ＳＥＬＤＩにおいて、解析物を適用する表面が、解析物捕獲および／または脱着において活性な役割を果たす。本発明の文脈において、試料には、クロマトグラフィーまたは他の化学的処理を受けうる生物学的試料と、適切なマトリックス基質が含まれる。

質量分析法において、「見かけの分子量（ａｐｐａｒｅｎｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｓｓ）」は、検出されたイオンの、分子量（ダルトン）対電荷値、ｍ／ｚを意味する。どのように見かけの分子量が由来するかは、使用する質量分析法の型に依存する。飛行時間質量分析法にて、見かけの分子量は、イオン化から検出までの時間の関数である。

語句「マトリックス（ｍａｔｏｒｉｘ）」は、質量分析器中、適切な光源、たとえばＵＶ／ＶｉｓまたはＩＲレーザーからの光子としてエネルギーを吸着し、それによって、表面からの生体分子の脱着を可能にする分子を意味する。α−シアノ桂皮酸、シナピン酸およびジヒドロ安息香酸を含む桂皮酸誘導体が、生体分子のレーザー脱着において、エネルギー吸着分子としてよく使用される。エネルギー吸着分子は、参照によって本明細書に組み込まれている、米国特許第５，７１９，０６０号にて記述されている。

語句「正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）」およびその誘導語は、質量スペクトルに関連して使用する場合、スペクトルの全体的な強度における、おもに機器パラメーターが原因の、差を除去または最小化するために、質量スペクトルの組に適用する、数学的方法を意味する。

語句「関心領域（ｒｅｇｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｅｓｔ）」または「ＲＯＩ」は、質量スペクトルのサブセットの統計学的適合を意味する。ＲＯＩは、連続したシグナルの固定化された最小長を有する。連続シグナルは、どのようにＲＯＩが選ばれるかに依存して、固定最大長のギャップを含んでよい。関心領域は、バイオマーカーに関し、バイオマーカーに対する代用として働きうる。関心領域は、後で、タンパク質、ポリペプチド、抗原、抗体、脂質、ホルモン、糖質などであると決定されてよい。

語句「受信者動作特性曲線（ＲｅｃｅｉｖｅｒＯｐｅｒａｔｏｒＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃＣｕｒｖｅ）」または「ＲＯＣ曲線（ＲＯＣｃｕｒｖｅ）は、そのもっとも単純な適用において、２つの集団（たとえば、症例（すなわち、肺がんを患っている被験者）および対照（すなわち、肺がんに対して正常であるか、または良性である被験者））間を区別することにおける、特定の特徴（たとえば、バイオマーカーまたはバイオメトリックパラメーター）の性能のプロットを意味する。全集団（すなわち症例および対照）に渡る特徴データを、単一の特徴の値に基づいて、昇順で仕分ける。ついで、その特徴に対する各値に対して、各データに関して真の陽性および偽陽性率を計算する。真の陽性率は、検討中の特徴に対する値以上の症例の数を計数して、ついで、症例の総数によって割ることによって決定する。偽陽性率は、検討して、特徴に対する値以上の対照の数を計数して、対照の総数によってわることによって決定する。この定義が、対照と比較して、症例にて特徴が上昇するシナリオを記述している一方で、この定義はまた、対照と比較して、症例にて特徴が抑制されるシナリオも企図している。本シナリオにおいて、検討中の特徴の値以下の試料を計算しうる。

ＲＯＣ曲線は、単一特徴に対して、ならびに他の単一出力に対して産出可能であり、たとえば、２つ以上の特徴の組合せが、数学的に一緒に（加えられる、引かれる、かけられるなどのように）統合されて、単一の合計値が提供され、この単一合計値をＲＯＣ曲線中でプロット可能である。さらに、それによって組合せが単一の出力値を誘導する、多数の特徴の任意の組合せが、ＲＯＣ曲線中でプロット可能である。特徴のこれらの組合せが試験を含んでよい。ＲＯＣ曲線は、試験の偽陽性率（１−特異性）に対する試験の真の陽性率（感度）のプロットである。ＲＯＣ曲線下面積は、所与の試料集団に対する特徴に関するメリットの図であり得、試験が、試験被験者を分類することにおいて、完全に無作為な応答を与える完全な試験に対して１から０．５の範囲の値を与える。ＲＯＣ曲線は、データ組を迅速に検査するための他の手段を提供する。診断的であると見られる特徴を、大きな特徴スペースの大きさを減少させるために好ましく使用可能である。

語句「スクリーニング（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）」は、肺がんへの患者の傾向に関する診断決定を意味する。患者は、陽性「スクリーニング試験」で高い肺がんの危険性であると決定される。結果として、患者は、所与の追加試験、たとえば撮像、唾液試験、肺機能試験、気管支鏡検査法および／または生検手順を実施して、および最終診断を下すことが可能である。

語句「シグナル（ｓｉｇｎａｌ）」は、調査している生体分子によって産出される任意の応答を意味する。たとえば、語句シグナルは、質量分析器の検出器にぶつかる生体分子によって産出される応答を意味する。シグナル強度は、生体分子の量または濃度と比例する。シグナルは、２つの値、見かけ分子量値と、以上で記述したように産出された強度値によって定義される。質量値は、生体分子の要素特性であり、一方で強度値は、相当する見かけ分子量値を有する生体分子の特定の量または濃度に一致する。したがって「シグナル」はいつも、生体分子の特性を意味する。

語句「分割スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＳｃｏｒｅＭｅｔｈｏｄ）」は、Ｍｏｒｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，１０２（２１）：７６７７−７６８２（２００５）から適合した方法を意味する。本方法において、多数の測定をすべての試料で実施する。カットオフ値を各測定に対して決定する。このカットオフ値を、関心の群間（たとえば疾患および非疾患）の正確な分類の精度を最大化するために設定してよく、または１つの群の感度または特異性を最大化するために設定してよい。各測定のために、関心の群、たとえば疾患が、カットオフ値より上、またはカットオフ値より下であるかどうかを決定する。各測定に対して、その測定の値が、カットオフ値の疾患側において発見される時はいつでも、その試料にスコアを割り当てる。すべての測定を１つの試料で実施した後、スコアを合計して、測定のパネルに対する総スコアを産出する。１０の測定のパネルが、最大スコア１０をもち（各測定は１または０のいずれかのスコアを有する）、最小スコア０を有するように、すべての測定に等しく重みをかけることが一般的である。しかしながら、より有意な測定のために、より高い個々のスコアで測定に不均等に重みをかけることが価値がありうる。

総スコアを決定した後、測定のパネルに基づいて、非疾患試料から疾患を分類するために、もう一度カットオフを決定する。ここで再び、最大スコア１０および最小スコア０の測定のパネルに対して、カットオフを、感度（カットオフとしてスコア０）を最大化するため、または特異性（カットオフとしてスコア１０）を最大化するため、または分類の精度（カットオフとして０から１０の間のスコア）を最大化するために選択してよい。

本明細書で使用するところの、語句「分割加重スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＷｅｉｇｈｔｅｄＳｃｏｒｉｎｇＭｅｔｈｏｄ）」は、試験試料中で同定および定量される１つのバイオマーカーまたはバイオメトリックパラメーター（本明細書にて、「マーカー（類）」（ｍａｒｋｅｒ（ｓ））と集合的によぶ）の測定を、多くの可能性あるスコアの１つに変換することを含む方法を意味する。スコアは、以下の等式を用いて得る。
スコア＝ＡＵＣ^＊因子／（１−特異性）
式中「因子（ｆａｃｔｏｒ）」は（０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５などのような）整数であり、「特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」は、１以下である値の選択値である。「因子」の程度は、限定はしないが、より高いＡＵＣ値、相対的に小さな標準偏差、高い特異性または感度または低いＤＦＩのような、改善された臨床性能を有するマーカーに対して増加する。その結果、１つのマーカーの測定を、所望の多くの、または少ないスコアに変換可能である。本方法は、関心の集団におけるマーカー／試験性能を反映する、受信者動作特性曲線に基づいている。ＲＯＣ曲線は、試験の真の陽性率（感度）の、試験の偽陽性率（１−特異性）に対するプロットである。曲線上の各点は、測定している特徴／試験（マーカー）の単一の値を表している。したがって、いくつかの値が、関心の集団（すなわち、肺がんを発現させる危険性である被験者）において、低い偽陽性率を持ち、一方、特徴の他の値が、その集団で高い偽陽性率を持ちうる。本方法は、関心の被験者の集団に対して、低い偽陽性率を有する（それによって高い特異性を有する）特徴値（すなわち、バイオマーカーまたはバイオメトリックパラメーター）に対して、より高いスコアを提供する。本方法は、それよりも低いと試験の結果がスコアの増加となる、偽陽性（１−特異性）の所望のレベルを選択することを含む。言い換えると、高い特異性のマーカーが、特異性の低いマーカーより大きなスコア、またはより大きな範囲のスコアを与える。

本明細書で使用するところの語句「被験者（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、ヒトまたは非ヒトを含む、動物、好ましくは哺乳動物を意味する。語句患者および被験者は、本明細書で相互互換的に使用されてよい。

語句「ＤＴモデルの１０倍検証（Ｔｅｎ−ｆｏｌｄＶａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆＤＴＭｏｄｅｌｓ）」は、良好な解析実施が、モデルをそれらの予測値を査定するために、２つの集団に対して検証されることを必要とする。新規の集団のかわりに、データを独立したトレーニング組と検証組に分けることができる。１０のランダム亜組を、検証組としての利用のために産出する。各検証組に対して、共通して試料を含まない、相当する独立トレーニング組が存在する。１０のＤＴモデルを、上述のように、１０トレーニング組から産出し、検証組と問い合わせを行う。

語句「試験組（ｔｅｓｔｓｅｔ）」または「未知（ｕｎｋｎｏｗｎ）」または「検証組（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎｓｅｔ）」は、トレーニング組中に含まれない登録からなる全利用可能データ組の亜組を意味する。試験データを、分類子性能を評価するために適用する。

語句「トレーニング組（ｔｒａｉｎｉｎｇｓｅｔ）」または「公知組（ｋｎｏｗｎｓｅｔ）」または「参照組（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｅｔ）」は、それぞれの全利用可能データ組の亜組を意味する。この亜組は典型的に、無作為に選択され、分類子構築の目的のためにのみ使用される。

語句「変換ロジスティック回帰（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｄＬｏｇｉｓｔｉｃＲｅｇｒｅｓｓｉｏｎＭｏｄｅｌ）」は、ＪＭＰＴＭ統計パッケージに組み込まれてもいる、特徴の数を統合し、ＲＯＣ曲線解析を可能にする方法を提供するモデルを意味する。このアプローチは、特徴の他の１つとの関係に関して、単純かモデルを仮定するので、減少した特徴の組にもっともよく適用される。陽性結果は、より洗練された分類方法が良好であるべきであることを示唆する。残念であるが、陰性結果は、他の方法に対して必ずしも失敗を暗示しない。

サイクリンＥ２ポリペプチド
１つの実施形態において、本発明は、単離または精製免疫反応性サイクリンＥ２ポリペプチド、または本明細書で記述した方法にて使用可能である抗体を発生させる、または試験する（またはより一般的に、結合する）免疫原または抗原として使用可能な、それらの生物学的に活性な断片に関する。本発明の免疫反応性サイクリンＥ２ポリペプチドは、標準のタンパク質精製技術を用いて、細胞または組織起源より単離可能である。あるいは、単離または精製免疫反応性サイクリンＥ２ポリペプチおよびその生物学的に活性な断片は、組換えＤＮＡ技術によって産出可能であり、または化学的に合成可能である。本発明の単離または精製免疫反応性サイクリンＥ２ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５にて示されたアミノ酸配列を有する。配列番号１は、ヒトサイクリンＥ２のｃＤＮＡ発現形態のアミノ酸配列である（Ｇｅｎｂａｎｋ受入ＢＣ００７０１５．１）。配列番号３は、ＢＣ００７０１５．１のＣ−末端＋１アミノ酸（システイン）を含む３８アミノ酸配列であり、本明細書ではまた「Ｅ２−１」とも呼ばれる。配列番号４は、長さにして３７アミノ酸であり、配列番号４がそのアミノ末端で、配列番号３の非常に初期のシステインを含まないことを除いて、配列番号３と同一である。配列番号５は、ＢＣ００７０１５．１のＣ−末端を含む１９アミノ酸配列であり、本明細書で「Ｅ２−２」と呼ばれる。実施例にてより詳細に記述するが、免疫反応性配列番号１を、配列番号２の免疫反応性と比較した。配列番号２は、ヒトサイクリンＥ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受入ＢＣ０２０７２９．１）の他のｃＤＮＡ発現形態である。配列番号１が、がん試料のいくつかのプールと強力な免疫反応性をしめすことがわかり、良性および正常（非がん）プールとは非常に低い反応性を示した。反対に、配列番号２は、がんまたは非がんプール試料とほとんど反応を示さなかった。配列番号１の免疫反応性は、配列番号２には存在しない、配列番号１のＣ−末端に存在する、最初の３７アミノ酸の結果であると決定された。両方とも配列番号１のＣ−末端から由来する、配列番号３および５は、がんまたは非がんプール間で強力な免疫反応性を示すことがわかった。したがって、任意の配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５、または（配列番号１および配列番号３に対して産出された抗体、配列番号１および配列番号４に対して産出された抗体、配列番号１および配列番号５に対して産出された抗体、配列番号１、配列番号３および配列番号４に対して産出された抗体、配列番号１、配列番号３および配列番号５に対して産出された抗体、配列番号１、配列番号４および配列番号５に対して産出された抗体、配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５に対して産出された抗体、配列番号３および配列番号４に対して産出された抗体、配列番号３および配列番号５に対して産出された抗体、配列番号３、配列番号４および配列番号５に対して産出された抗体、配列番号４および配列番号５に対して産出された抗体のような）これらの配列の任意の組合せに対して産出された抗体を、本明細書で記述した方法において利用可能である。たとえば、そのような抗体は、任意の配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５またはこれらの配列の任意の組合せに対して産出された被験者抗体であり得る。そのような抗体は、本明細書で記述された本発明の方法における利用のための、１つ以上のキット内に含まれてよい。

本発明はまた、１つ以上の保存アミノ酸置換によって、本明細書で記述されたポリペプチド（すなわち配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５）とは異なるポリペプチドも含む。さらに、本発明はまた、配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５のアミノ酸配列をもつポリペプチドと、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％以上の総配列類似性（同一性）または相同性を有するポリペプチドも含む。

肺がんの存在を検出することにおける、バイオマーカーおよびバイオメトリックパラメーターの利用
他の実施形態において、本発明は、正常被験者と、がんの被験者、または病状、好ましくはがん、より好ましくは肺がんを発現させる危険性にある被験者を区別することにおいて効果的に補助する方法に関する。正常被験者は、がんのような任意の病状で診断されないもの、より好ましくは肺がんと診断されないものと考えられる。

本発明は、病状、好ましくはがん、より好ましくは肺がんの診断において補助するための、迅速で、感度がよく、利用が簡単な方法を有利に提供する。さらに、本発明は、病状を発現させる危険性にある個体を同定するため、病状の危険性にある被験者を検査するため、および病状と診断された、またはそのために治療されている患者をモニタするために利用可能である。本発明はまた、病状のために治療されている患者の治療の効果をモニタするために利用可能である。好ましくは、病状はがんであり、より好ましくは肺がんである。

一般的に、本発明の方法には、被験者より試験試料を得ることが含まれる。典型的に、試験試料は、被験者より得、当業者に公知の標準の方法を用いて処理する。血液標本および血清またはそれらから由来する血漿に関して、試料は従来より、静脈穿刺によって肘正中静脈より得ることができ、またはより少量の容量が必要である場合は、手掌での採血によって得ることができる。両方の場合で、形成された要素および固まりを遠心によって除去する。尿または排泄物は、迅速に処理されるか、処理が即時にできない場合に保存剤で安定化するという条件で、患者から直接回収できる。気管支洗浄液または胸膜液のようなより特定の試料は、気管支鏡検査法の間、または経皮またはオープン生検によって回収可能であり、微粒子物質が遠心によって除去されたならば、血清または血漿と同様に処理可能である。

処理の後、被験者から得た試験試料を、肺がんの診断と相関可能である１つ以上のバイオマーカーの存在および量に関して問い合わせをおこなう。とくに、本出願者らは、１つ以上のバイオマーカー、または（少なくとも１つのバイオマーカー、少なくとも１つのバイオマーカーおよび少なくとも１つのバイオメトリックパラメーター、少なくとも２つのバイオマーカー、少なくとも２つのバイオマーカーおよび１つのバイオメトリックパラメーター、少なくとも１つのバイオマーカーおよび少なくとも２つのバイオメトリックパラメーター、少なくとも２つのバイオマーカーおよび少なくとも２つのバイオメトリックパラメーター、少なくとも３つのバイオマーカーなどのような）バイオマーカーとバイオメトリックパラメーターの組合せの検出および定量化が、患者において肺がんを診断することにおける補助として有用であることを発見した。本明細書で記述された方法にて同定および定量された１つ以上のバイオマーカーを、１つ以上のパネル内に含めることができる。パネルを含むバイオマーカーの数は重要ではなく、限定はしないが、１つのバイオマーカー、２つのバイオマーカー、３つのバイオマーカー、４つのバイオマーカー、５つのバイオマーカー、６つのバイオマーカー、７つのバイオマーカー、８つのバイオマーカー、９つのバイオマーカー、１０つのバイオマーカー、１１つのバイオマーカー、１２つのバイオマーカー、１３つのバイオマーカー、１４つのバイオマーカー、１５つのバイオマーカー、１６つのバイオマーカー、１７つのバイオマーカー、１８つのバイオマーカー、１９つのバイオマーカー、２０つのバイオマーカー、などでありうる。

以上で言及したように、試験試料を得た後、本発明の方法には、試験試料中の１つ以上のバイオマーカーの存在を同定し、ついで定量することが含まれる。肺がんの危険性にあると疑われる患者の診断において、有用であるか、または有用であると信じられている任意のバイオマーカーを、本明細書で記述している方法にて定量可能であり、１つ以上のパネル内に含めることができる。その結果、１つの態様において、パネルは、１つ以上のバイオマーカーを含んでよい。パネルに含めることができるバイオマーカーの例には、限定はしないが、抗−ｐ５３、抗−ＴＭＰ２１、抗−ニーマン−ピックＣ１−様タンパク質１、Ｃ末端ペプチド−ドメイン（抗−ＮＰＣ１Ｌ１Ｃ−ドメイン）、抗−ＴＭＯＤ１、抗−ＣＡＭＫ１、抗−ＲＧＳ１、抗−ＰＡＣＳＩＮ１、抗−ＲＣＶ１、抗−ＭＡＰＫＡＰＫ３、（配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、またはそれらの任意の組合せに対する抗体のような）免疫反応性サイクリンＥ２に対する少なくとも１つの抗体、限定はしないが、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、がん抗原１２５（ＣＡ１２５）、がん抗原１５−３（ＣＡ１５−３）、プロガストリン放出ペプチド（ｐｒｏＧＲＰ）、扁平上皮細胞抗原（ＳＣＣ）、サイトケラチン８、サイトケラチン１９ペプチドまたはタンパク質（本明細書で、単に「ＣＫ−１９、ＣＹＦＲＡ２１−１、Ｃｙｆｒａ」とも呼ばれる）およびサイトケラチン１８ペプチドまたはタンパク質（ＣＫ１８、ＴＰＳ）、シアル酸残基が追加された、ＬｅｗｉｓＡ血液集団であるがん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）のような糖質抗原、血清アミロイドＡ、α−１−抗−トリプシンおよびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ、および限定はしないが、Ａｃｎ６３９９、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ６４５３、Ｐｕｂ２９５１、Ｐｕｂ２４３３、Ｐｕｂ１７３３８、ＴＦＡ６４５３およびＨＩＣ３９５９のような関心領域のような抗原が含まれる。

他の態様において、パネルは、少なくとも１つの抗体、少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの関心領域、少なくとも１つの抗原および少なくとも１つの抗体、少なくとも１つの抗原および少なくとも１つの関心領域、少なくとも１つの抗体および少なくとも１つの関心領域および少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの抗体および少なくとも１つの関心領域を含んでよい。パネル中に含めることができる少なくとも１つの抗体の例には、限定はしないが、抗−ｐ５３、抗−ＴＭＰ２１、抗−ＮＰＣ１Ｌ１Ｃ−ドメイン、抗−ＴＭＯＤ１、抗−ＣＡＭＫ１、抗−ＲＧＳ１、抗−ＰＡＣＳＩＮ１、抗−ＲＣＶ１、抗−ＭＡＰＫＡＰＫ３、免疫反応性サイクリンＥ２に対する少なくとも１つの抗体が含まれる。パネル中に含めることができる少なくとも１つの抗原には、限定はしないが、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、ｐｒｏＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−抗−トリプシンおよびアポリポタンパク質ＣＩＩＩが含まれる。パネル内に含めることができる少なくとも１つの関心領域の例には、限定はしないが、Ａｃｎ６３９９、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ６４５３、Ｐｕｂ２９５１、Ｐｕｂ２４３３、Ｐｕｂ１７３３８、ＴＦＡ６４５３およびＨＩＣ３９５９が含まれる。さらに、特定の関心領域が、特定の他の関心領域と非常に相関し（これらの関心領域が、相互間で高い相関係数を有することを意味する）、したがって、本発明の文脈内で、相互に置換可能である。特に、これらの非常に相関した関心領域が、特定の相関しているファミリーまたは「群」へと組み立てられる。これらの「群」内に含まれる関心領域を、本発明の方法およびキット内で相互に置換可能である。これらの相関している関心領域のファミリーまたは「群」を以下に記述している。

群Ａ：関心領域：Ｐｕｂ３４４８およびＰｕｂ３４９３。

群Ｂ：関心領域：Ｐｕｂ４４８７およびＰｕｂ４６８２。

群Ｃ：関心領域：Ｐｕｂ８７６６、Ｐｕｂ８９３０、Ｐｕｂ９１４２、Ｐｕｂ９２１６、Ｐｕｂ９３６３、Ｐｕｂ９４３３、Ｐｕｂ９４９５、Ｐｕｂ９６４８およびＰｕｂ９７２２。

群Ｄ：関心領域：Ｐｕｂ５０３６、Ｐｕｂ５１３９、Ｐｕｂ５２６４、Ｐｕｂ５３５７、Ｐｕｂ５４８３、Ｐｕｂ５５７３、Ｐｕｂ５５９３、Ｐｕｂ５６１５、Ｐｕｂ６７０２、Ｐｕｂ６７１８、Ｐｕｂ１０７５９、Ｐｕｂ１１０６６、Ｐｕｂ１２１９３、Ｐｕｂ１３４１２、Ａｃｎ１０６７９およびＡｃｎ１０８７７。

群Ｅ：関心領域：Ｐｕｂ６３９１、Ｐｕｂ６５３３、Ｐｕｂ６５８７、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ９３１７およびＰｕｂ１３５７１。

群Ｆ：関心領域：Ｐｕｂ７２１８、Ｐｕｂ７２５５、Ｐｕｂ７３１７、Ｐｕｂ７４１３、Ｐｕｂ７４９９、Ｐｕｂ７７１１、Ｐｕｂ１４４３０およびＰｕｂ１５５９９。

群Ｇ：関心領域：Ｐｕｂ８４９６、Ｐｕｂ８５４６、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ８６６２、Ｐｕｂ８７３４、Ｐｕｂ１７１２１およびＰｕｂ１７３３８。

群Ｈ：関心領域：Ｐｕｂ６２４９、Ｐｕｂ１２５０１およびＰｕｂ１２７１７。

群Ｉ：関心領域：Ｐｕｂ５６６２、Ｐｕｂ５７７７、Ｐｕｂ５８９８、Ｐｕｂ１１５９７およびＡｃｎ１１５５９。

群Ｊ：関心領域：Ｐｕｂ７７７５、Ｐｕｂ７９４４、Ｐｕｂ７９８０、Ｐｕｂ８００２およびＰｕｂ１５８９５。

群Ｋ：関心領域：Ｐｕｂ１７８５８、Ｐｕｂ１８４２２、Ｐｕｂ１８７６６およびＰｕｂ１８９８６。

群Ｌ：関心領域：Ｐｕｂ３０１８、Ｐｕｂ３６４０、Ｐｕｂ３６５８、Ｐｕｂ３６８２、Ｐｕｂ３７０５、Ｐｕｂ３８３９、Ｈｉｃ２４５１、Ｈｉｃ２６４６、Ｈｉｃ３０５５、Ｔｆａ３０１６、Ｔｆａ３６３５およびＴｆａ４３２１。

群Ｍ：関心領域：Ｐｕｂ２３３１およびＴｆａ２３３１。

群Ｎ：関心領域：Ｐｕｂ４５５７およびＰｕｂ４５９２。

群Ｏ：関心領域：Ａｃｎ４６３１、Ａｃｎ５０８２、Ａｃｎ５２６２、Ａｃｎ５３５５、Ａｃｎ５４４９およびＡｃｎ５４５５。

群Ｐ：関心領域：Ａｃｎ６３９９、Ａｃｎ６５９２、Ａｃｎ８８７１、Ａｃｎ９０８０、Ａｃｎ９３７１およびＡｃｎ９６６２。

群Ｑ：関心領域：Ａｃｎ９４５９およびＡｃｎ９４７１。

群Ｒ：関心領域：Ｈｉｃ２５０６、Ｈｉｃ２９８０、Ｈｉｃ３１７６およびＴｆａ２９８４。

群Ｓ：関心領域：Ｈｉｃ２７２８およびＨｉｃ３２７６。

群Ｔ：関心領域：Ｈｉｃ６３８１、Ｈｉｃ６３８７、Ｈｉｃ６４５０、Ｈｉｃ６６４９、Ｈｉｃ６８１６およびＨｉｃ６８２３。

群Ｕ：関心領域：Ｈｉｃ８７９１およびＨｉｃ８８９７。

群Ｖ：関心領域：Ｔｆａ６４５３およびＴｆａ６６５２。

群Ｗ：関心領域：Ｈｉｃ６００５およびＨｉｃ５３７６。

群Ｘ：関心領域：Ｐｕｂ４７１３、Ｐｕｂ４７５０およびＰｕｂ４８６１。

本発明の方法にて使用可能な好ましいパネルには、限定はしないが、
１．少なくとも１つのバイオマーカーを含むパネルで、前記バイオマーカーが、少なくとも１つの抗体と少なくとも１つの抗原である。本パネルはまたさらに、少なくとも１つの関心領域のようなさらなるバイオマーカーを含み得る。

２．少なくとも１つのバイオマーカーを含むパネルで、前記バイオマーカーが、免疫反応性サイクリンＥ２に対する少なくとも１つの抗体を含む。さらに、本パネルはまた場合によりさらに、試験試料中の、少なくとも１つの抗体、少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの抗原および少なくとも１つの抗体、少なくとも１つの関心領域、少なくとも１つの抗原および少なくとも１つの関心領域および少なくとも１つの抗体および少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの抗体および少なくとも１つの関心領域のような、さらなるバイオマーカーを含み得る。

３．少なくとも１つのバイオマーカーを含むパネルで、バイオマーカーが、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、ｐｒｏＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−抗−トリプシンおよびアポリポタンパク質ＣＩＩＩからなる群より選択される。本パネルは場合によりさらに、試験試料中の、少なくとも１つの抗体、少なくとも１つの関心領域、少なくとも１つの関心領域と少なくとも１つの抗体のようなさらなるバイオマーカーを含み得る。

４．少なくとも１つのバイオマーカーを含むパネルで、バイオマーカーが、Ａｃｎ６３９９、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ６４５３、Ｐｕｂ２９５１、Ｐｕｂ２４３３、Ｐｕｂ１７３３８、ＴＦＡ６４５３およびＨＩＣ３９５９からなる群より選択される、少なくとも１つの関心領域である。パネルはまた場合によりさらに、試験試料中の、少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの抗体および少なくとも１つの抗原と少なくとも１つの抗体のような、さらなるバイオマーカーを含み得る。

５．パネル中の少なくとも１つのバイオマーカーを含むパネルで、少なくとも１つのバイオマーカーが、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、ｐｒｏＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−抗−トリプシンおよびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ、Ａｃｎ６３９９、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ６４５３、Ｐｕｂ２９５１、Ｐｕｂ２４３３、Ｐｕｂ１７３３８、ＴＦＡ６４５３およびＨＩＣ３９５９からなる群より選択される。パネルはまた場合によりさらに、少なくとも１つの抗体のようなさらなるバイオマーカーを含み得る。好ましいパネルは、サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９およびＴＦＡ２７５９；サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９およびＴＦＡ９１３３；サイトケラチン１９、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、サイトケラチン１８およびＰｒｏＧＲＰ；Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｔｆａ６４５３およびＨｉｃ３９５９；およびサイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、サイトケラチン１８、ＰｒｏＧＲＰ、ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３を含むパネルである。

試験試料中の１つ以上のバイオマーカーの存在および量を、当業者に公知の日常の技術を用いて得ること、および定量が可能である。たとえば、試験試料中の抗原または抗体を定量するための方法が、当業者に周知である。たとえば、試験試料中の１つ以上の抗原または抗体の存在および定量化を、当技術分野で公知の１つ以上の免疫アッセイを用いて決定可能である。免疫アッセイには典型的に、（ａ）バイオマーカー（すなわち抗原または抗体）に特異的に結合する抗体（または抗原）を提供すること、（ｂ）試験試料を抗体または抗原に接触させること、および（ｃ）試験試料中の抗原に結合した抗体の複合体、または試験試料中の抗体に結合した抗原の複合体の存在を検出すること、が含まれる。

抗原に特異的に結合する抗体を調製するために、精製抗原または精製抗原の核酸配列を使用可能である。抗原の核酸およびアミノ酸配列は、これらの抗原のさらなる特性化によって得ることができる。たとえば、抗原は、多数の酵素（たとえばトリプシン、Ｖ８プロテアーゼなど）でマップしたペプチドでありうる。各抗原からの消化断片の分子量を、種々の酵素によって産出された消化断片の分子量と一致する配列に関して、ＳｗｉｓｓＰｏｒｔデータベースのようなデータベースを検索するために使用可能である。本方法を用いて、他の抗原の核酸およびアミノ酸配列を、これらの抗原がデータベース中の公知のタンパク質であるかどうか同定可能である。

あるいは、タンパク質を、タンパク質ラダーシークエンシングを用いて配列決定可能である。タンパク質ラダーは、たとえば分子を断片化し、断片を酵素消化にかけることによって、または断片の末端から単一アミノ酸を連続して除去する他の方法によって、産出可能である。タンパク質ラダーを調整する方法は、たとえば国際公開番号第ＷＯ９３／２４８３４号および米国特許第５，７９２，６６４号にて記述されている。ついでラダーを質量分析によって解析する。ラダー断片の質量における差違が、分子の末端から除去したアミノ酸を同定する。

抗原がデータベース中で未知である場合、核酸およびアミノ酸配列は、抗原のアミノ酸配列の一部分の知識で決定可能である。たとえば、変性プローブを、抗原のＮ−末端アミノ酸配列に基づいて作製可能である。これらのプローブをついで、抗原が最初に検出された試料から作製されるゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを検査するために使用可能である。陽性クローンを同定し、増幅し、それらの組換えＤＮＡ配列を、周知の技術を用いてサブクローン化可能である。たとえばＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｆｏｒＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＧｒｅｅｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃ．ａｎｄＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ１９８９）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄＥｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ１９８９）を参照のこと。

精製した抗原またはその核酸配列を用いて、抗原に特異的に結合した抗体を、当分野で公知の任意の適切な方法を用いて調製可能である（たとえば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）；Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（１９８８）；Ｇｏｄｉｎｇ，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ（２ｄｅｄ．１９８６）およびＫｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７（１９７５）を参照のこと）。そのような技術には、限定はしないが、ファージまたは同様のベクター中の組換え抗体のライブラリーからの抗体の選別による抗体の調製、ならびにウサギまたはマウスを免疫化することによるポリクローナルおよびモノクローナル抗体の調製が含まれる（たとえば、Ｈｕｓｅｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）、Ｗａｒｄｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６（１９８９）を参照のこと）。

抗体が提供された後、抗原を、任意の多数のよく認識されている免疫学的結合アッセイを用いて検出および／または定量可能である（たとえば、米国特許番号第４，３６６，２４１号、第４，３７６，１１０号、第４，５１７，２８８号、および第４，８３７，１６８号を参照のこと）。本発明の使用可能なアッセイには、たとえば、「サンドイッチアッセイ」としても公知である酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、化学発光免疫アッツセイ（ＣＬＩＡ）、カウンティング免疫アッセイ（ＣＩＡ）、フィルターメディア酵素免疫アッセイ（ＭＥＩＡ）、蛍光連結免疫吸着アッセイ（ＦＬＩＳＡ）、凝集免疫アッセイおよび（Ｌｕｍｉｎｅｘ(商標) ＬａｂＭＰＡのような）多重蛍光免疫アッセイなどが含まれる。一般的な免疫アッセイの総説として、また、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ：ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ、３７巻（Ａｓａｉ，ｅｄ．１９９３）、ＢａｓｉｃａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｉｔｅｓ＆Ｔｅｒｒ，ｅｄｓ．，７ｔｈｅｄ．１９９１）を参照のこと。

一般的に、被験者から得た試験試料は、抗原に特異的に結合する抗体を接触させることができる。場合によって、抗体を、その抗体と試験試料を接触させる前に、複合体の洗浄および続く単離を促進するために、固体支持体に固定化可能である。固体支持体の例には、たとえば、マイクロタイタープレート、ガラス顕微鏡スライドまたはカバースリップ、スティック、ビーズまたはマイクロビーズの形態での、ガラスまたはプラスチックが含まれる。抗体はまた、以上のように記述されたプローブ基質またはＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ(商標)アレイに結合させることも可能である（たとえば、Ｘｉａｏｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ６２：６０２９−６０３３（２００１）を参照のこと）。

抗体との試料のインキュベートしたの後、混合液を洗浄し、形成した抗体−抗原複合体を検出可能である。このことは、洗浄した混合液を、検出試薬と一緒にインキュベートすることによって達成可能である。本検出試薬は、たとえば、検出可能な標識で標識化された二次抗体であってよい。検出可能な標識に関して、当分野で公知の任意の検出可能な標識を使用可能である。たとえば、検出可能な標識は、（たとえば、^３Ｈ、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、^３２Ｐおよび^３３Ｐのような）放射活性標識、（たとえばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼなどのような）酵素標識、（たとえばアクリジニウムエステル類、アクリジニウムチオエステル類、アクリジニウムスルホンアミド類、フェナンスリジニウムエステル類、ルミナール、イソルミノールなどのような）化学発光標識、（たとえばフルオレセイン（たとえば５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートなど）のような蛍光標識、ローダミン、ヒコビリタンパク質、Ｒ−フィコエリスリン、量子ドット（たとえば硫化亜鉛キャップカドミウムセレナイド）、温度標識、または免疫−ポリメラーゼ連鎖反応標識であってよい。標識への導入、標識化手順および標識の検出は、モレキュラープローブス社（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓＩｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）によって発行された混合ハンドブックおよびカタログである、ＰｏｌａｋａｎｄＶａｎＮｏｏｒｄｅｎ，ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏＩｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄｅｄ．，ＳｐｒｉｎｇＶｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９９７）およびＨａｕｇｌａｎｄ，ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｂｅｓａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９６）で見つけられる。あるいは、試料中のマーカーを、間接的アッセイを用いて、たとえば二次、標識化抗体を用いて、結合したマーカー−特異的抗体を検出する、および／またはたとえば抗原の異なるエプトープに結合するモノクローナル抗体を混合液と同時にインキュベートする、競合または阻害アッセイにて検出可能である。

アッセイを通じて、インキュベーションおよび／または洗浄段階が、試薬の各混合の後に必要となりうる。インキュベーション段階は、約５病間〜数時間で変化可能であり、好ましくは、約５分間〜約２４時間である。しかしながら、インキュベーション時間は、アッセイの形式、バイオマーカー（抗原）、溶液の容量、濃度などに依存しうる。１０℃〜４０℃のような温度の範囲で実施可能であるけれども、通常、アッセイは、室温にて実施する。

免疫アッセイ技術は当分野で周知であり、適用可能な技術の一般的総説が、上記Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅにて見ることができる。

免疫アッセイを、被験者からの試料中の抗原の試験量を決定するために使用可能である。まず、試料中の抗原の試験量を、以上で記述した免疫アッセイ法を用いて検出可能である。抗原が試料中に存在したならば、以上で記述した適切なインキュベーション条件下、抗原に特異的に結合する抗体との抗体−抗原複合体を形成する。抗体−抗原複合体の量を、標準と比較して決定可能である。抗原に対するＡＵＣをついで、限定はしないが、ＲＯＣ解析のような、公知の技術を用いて計算可能である。あるいは、ＤＦＩを計算可能である。ＡＵＣが約０．５より大きいか、またはＤＦＩが約０．５未満の場合、免疫アッセイを使用して、（がん、好ましくは肺がんのような）疾患の被験者を、正常（または良性）被験者から判別可能である。

多数の抗原に対する免疫アッセイキットが市販されている。たとえば、サイトケラチン１９を定量化するためのキットが、Ｈ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅＬｔｄ，（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＡｋｉｔｅｎｇｅｓｃｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙより入手可能であり、サイトケラチン１８を定量化するためのキットが、ＩＤＬＢｉｏｔｅｃｈＡＤ、Ｂｒｏｍｍａ，Ｓｗｅｄｅｎより、ＣＡ１２５ｋ、ＣＥＡＳＣＣおよびＣＡ１９−９を定量化するためのキットが、それぞれＡｂｂｏｔｔＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ，ＩＬ、およびＨ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅＬｔｄ．から、血清アミロイドＡおよびアポリポタンパク質ＣＩＩＩを定量化するためのキットが、ＬｉｎｃｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＯから、ＰｒｏＧＲＰを定量化するためのキットが、アドバンスドライフサイエンスインスティテュート社（ＡｄｖａｎｃｅｄＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）（和光、日本）、およびＩＢＬイムノ−バイオロジカルラボラトリーズ（ＩＢＬＩｍｍｕｏ−ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から、そしてα１抗トリプシンを定量化するためのキットが、オートイムノダイアグノスティカＧＭＢＨ（ＡｕｔｏｉｍｍｕｎｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａＧＭＢＨ、Ｓｔｒａｓｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびゲンウェイバイオテック社（ＧｅｎＷａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能である。

試験試料中の１つ以上の抗体の存在および定量化を、以上で記述したようなものと同様の免疫アッセイを用いて決定可能である。そのような免疫アッセイは、以上で記述した抗体および抗原の役割が逆であるという事実を除いて、上記免疫アッセイと同様の様式で実施する。たとえば、実施可能である免疫アッセイの１つの型は、自己抗体ビーズアッセイである。本アッセイにおいて、（バイオモルインターナショナルＬ．Ｐ．（ＢｉｏＭｏｌＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＬ．Ｐ．、ＰｌｙｍｏｕｔｈＬａｎｄｉｎｇ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から購入可能な）市販されているｐ５３のような抗原を、固体支持体、たとえばビーズ、プラスチックマイクロプレート、ガラス顕微鏡スライドまたはカバースリップ、またはタンパク質抗原に結合するニトロセルロースのような物質からなる膜に、当分野で公知の日常の技術を用いて、または本明細書実施例３で記述した技術および方法を用いて、固定化可能である。あるいは、抗原が市販されていない場合、がん細胞株（好ましくは肺がん細胞株）、または被験者の自身のがん組織（好ましくは肺がん組織）から抗原を精製してよく（Ｓ−ＨＨｏｎｇ，ｅｔａｌ．、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ６４：５５０４−５５１０（２００４）を参照のこと）、またはｃＤＮＡクローンより発現させてよい（Ｙ−ＬＬｅｅ，ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ３４９：８７−９６（２００４）を参照のこと）。抗原を含むビーズをついで、試験試料と接触させる。試験試料を、結合した抗原を含むビーズとともにインキュベートした後、ビーズを洗浄し、形成した任意の抗体−抗原複合体を検出する。この検出は、以上で記述したように実施可能であり、すなわち、洗浄したビーズを検出試薬とともにインキュベートすることによって実施可能である。本検出試薬は、たとえば検出可能標識によって標識化した、（限定はしないが、抗−ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、抗−ヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、抗−ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）のような）二次抗体であってよい。検出の後、抗体−抗原複合体の量を、以上で記述したように、シグナルを、標準によって産出されたものと比較することによって決定可能である。あるいは、抗体−抗原複合体を、免疫グロブリンの多価特性の利点を利用することによって決定可能である。抗体−抗原複合体を、抗−ヒト抗体と反応させる代わりに、抗体−抗原複合体を、固体相に結合した抗原と同一のエピトープを含む、検出可能な標識で標識化した可溶性抗原に暴露可能である。任意の占有されていない抗体結合部位が、（検出可能な標識にて標識化された）可溶性抗原に結合する。洗浄の後、検出可能標識を、当業者に公知の日常の技術を用いて検出する。上記方法のいずれかによって、試験試料中の特異的抗体の、感度がよく、特異的な定量化が可能になる。抗体（およびしたがって、被験者の肺がんの検出のための、自己抗体のような抗体の利用）に対するＡＵＣをついで、限定はしないがＲＯＣ解析のような、当業者に公知の日常の方法を用いて計算可能である。あるいは、ＤＦＩを計算可能である。ＡＵＣが約０．５より大きいか、またはＤＦＩが約０．５未満の場合、免疫アッセイを使用して、（がん、好ましくは肺がんのような）疾患の被験者を、正常（または良性）被験者から判別可能である。

関心領域の存在および量を、質量スペクトル技術を用いて決定可能である。質量分析を用いて、本発明者らは、試験試料中の肺がんの診断およびスクリーニングにおける補助として有用である、２１２の関心領域を発見した。特に、質量スペクトル技術を、試験試料中の１つ以上のバイオマーカーを検出および定量するために使用する場合、試験試料はまず質量スペクトル解析のために調製されなければならない。試料調製を、種々の方法、しかしもっとも一般的に使用される、固相に結合した１つ以上の吸着剤と試料を接触させることを含む方法で実施可能である。吸着剤は、アニオン性またはカチオン性基、疎水性基、金属リガンドありまたはなしの金属キレーティング基、ポリクローナルまたはモノクローナルいずれかの抗体、または同族抗体に結合するのに好適な抗原であってよい。固相は、金属、ガラスまたはプラスチックからなる平面表面であってよい。固相はまた、マイクロ粒子性質を有するもの、表面積を増加させるための、マイクロビーズ、非結晶質性粒子、または不溶性ポリマーのいずれか、であってよい。さらに、マイクロ粒子物質は、操作の簡便性のために磁気的でありうる。関心のバイオマーカーを、固相に吸着させ、バルク分子を洗浄によって除去する。質量解析のために、関心のバイオマーカーを、吸着剤に対するバイオマーカーの親和力を減少させる溶媒で、固相より溶出する。ついでバイオマーカーを解析のために質量分析器に導入する。好ましくは、異常スペクトルが同定され、スペクトルを評価する場合に無視する。さらに、上記のような免疫アッセイも使用可能である。免疫アッセイの完了に際して、解析物を、免疫学的表面から溶出して、解析のために質量分析器に導入可能である。

一旦試験試料が調製されたならば、質量解析器に導入する。レーザー脱着イオン化（たとえばＭＡＬＤＩまたはＳＥＬＤＩ）が、固体形態で存在する試料に対する一般的な技術である。本技術において、試料を、標的プレート上で、レーザーエネルギーを吸収し、試料に伝達することにおいて効果的なマトリックスとともに共結晶化する。作製されたイオンを分離し、計数し、公知の質量と電荷のイオンに対して較正する。任意の試料に対して回収した質量データは、特定の質量／電荷（ｍ／ｚ）比でのイオン計数である。異なる試料調製法および異なるイオン化技術が異なるスペクトルを産出することが予想される。

質量スペクトルデータに対する認定試験は一般的に、本来のデータの最小限の前処理での外れ値解析の正確な処理を含む。外れ値の同定の工程は、生スペクトルの総イオン電流（ＴＩＣ）の計算で開始される。ＴＩＣ計算の前に、スムーシングまたはベースライン補正アルゴリズムは、生スペクトルに対して適用しない。ＴＩＣは、検出した質量（ｍ／ｚ）範囲にわたる、各ｍ／ｚ値での強度を合計することによって計算する。これにより、器具不具合、試料スポッティング問題、および他の同様の欠陥が選別される。ＴＩＣに加えて、それぞれの試料の全スペクトルにわたる平均％ＣＶ（パーセント変動係数）を計算する。それぞれの試料に対する反復測定の回数を用いて、検出された質量範囲にわたり、ｍ／ｚ値ごとに％ＣＶを計算する。次いでこれらの％ＣＶを平均して、特定の試料を代表する平均％ＣＶを得る。平均％ＣＶは異常値を特定するための第一の選別工程として用いてもよいし、そのように用いなくともよい。一般に、平均％ＣＶが高い反復（３０％以上またはその他の任意の許容範囲の値）は再現性が乏しい。
上記のように、それぞれのスペクトルの計算されたＴＩＣおよび平均％ＣＶは再現性およびスペクトルの有益な部分を限定するための予測因子として用いることができる。しかし、これらの測定によって、スペクトルのバルク特性に関する良い記述子が得られる一方、それぞれのｍ／ｚ値での個々の強度などのスペクトルの顕著な特性の再現性についての情報は少しも得られない。この障害は、Ｗａｎｅｔ．ａｌ．（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．２００２，１３，８５−８８）に報告されたＳｐｅｃｔｒａｌＣｏｎｔｒａｓｔＡｎｇｌｅ（ＳＣＡ）計算の適合によって克服された。ＳＣＡ計算では、全スペクトルを、個々のｍ／ｚ値から成るベクターとして扱う。この解釈では、標準的な数式から２つのベクター間のシータ（θ）角が得られる。

同じようなスペクトルでは、シータは小さく、０に近くなる。

使用する際、試料複製についてかまたは特定の群（例えば、がん群）の中の全試料についての平均スペクトルを最初に計算することによって計算と比較の総数を減らす。次に、それぞれのスペクトルと計算された平均スペクトルとの間のＳＣＡを計算する。平均スペクトルと大幅に異なるスペクトルは、もし下記の基準に合致すれば、異常値と見なす。

１つの予測因子では質量スペクトルを完全に説明するのに不十分であるので、異常値を選択するためには１つ以上の予測因子を用いることが好ましい。多変量異常値分析は多数の予測因子を用いて行なうことができる。これらの予測因子は、ＴＩＣ、平均％ＣＶ、およびＳＣＡであってよいが、これらに限定されない。ＪＭＰ（商標）統計パッケージ（ＳＡＳＩｎｓｔｉｔｕｔｅＩｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用い、群（例えば、がん群）中のそれぞれの反復測定について、マハラノビスの距離を計算した。基準値（信頼限界ではない）は、観測値の約９５％がその値を下回るように算出することができる。基準値を上回る残りの５％は異常値と見なし、さらなる分析からは除外する。

質量スペクトルデータの限定後、通常スペクトルを正規化し、ＴＩＣがデータセット中の全てのスペクトルに対して同じになるように強度を見積もるか、全スペクトルにおける１つのピークに応じて強度を見積もる。

正規化した後、質量スペクトルを一連の強度特性に減少する。他の応用では、ｍ／ｚ値におけるスペクトル強度一覧へのこれらの限定は生体分子と関連する。別種の特性、関心領域またはＲＯＩを用いることが好ましい。

関心領域は、被験者の２つ以上のデータセット間の比較の産物である。データセットは、関心の群（例えば、罹患群、非罹患群）を表す。全試料について、各々のｍ／ｚ値における強度値に対してｔ検定を行なう。ｔ検定のｐ値が技師指定の基準値未満であるｍ／ｚ値を特定する。特定されたｍ／ｚ値の、連続しているものをグループ化して被験者領域として定義する。ＲＯＩおよび連続した群の任意の許容間隙を形成するために必要な連続ｍ／ｚ値の最小数は、使用者が規定することができる。ＲＯＩを限定する他の因子は、２つの群の平均値の比率の対数の絶対値である。この値がある基準のカットオフ値（１０進法の対数を用いた場合、約０．６）を上回る場合、質量対電荷の場所はＲＯＩに含める被験者になる。ＲＯＩ法を用いる利点は、２種類のスペクトル間の高強度のパターンの違いのフラグになるだけでなく、肩などのよりわずかな違いや、ピーク発見法では見逃してしまうであろう非常に低い強度も発見することができることである。

被験者領域が決定されたら、ＲＯＩの範囲内のｍ／ｚ値の平均値または中央値をその領域の特定因子として用いることが多い。それぞれの領域はデータセットを識別する潜在的マーカーである。さまざまなパラメーター（例えば、総強度、最大強度、中央強度、または平均強度）は、試料データから抽出することができ、ＲＯＩと関連する。このように、それぞれの試料スペクトルは何千ものｍ／ｚ、２１２のＲＯＩに対する強度対およびその特定因子、強度関数対から限定された。これらの記述子はデータ分析法の入力変数として用いる。

本発明の方法には、場合により、試験試料を得る前かまたは試験試料を得た後、そして試験試料中の１つ以上のバイオマーカーを同定し定量化する前または、試験試料中の１つ以上のバイオマーカーを同定して定量化した後に、被験者から少なくとも１つの生物測定パラメーターを得る段階を含むことができる。被験者から得る生物測定パラメーターの数は決定的に重要ではない。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０などの生物測定パラメーターを被験者から得ることができる。あるいは、本発明の方法に被験者から任意の生物測定パラメーターを得る段階を含む必要はない。被験者から得る好ましい生物測定パラメーターは被験者の喫煙歴、具体的には被験者の喫煙パックイヤー（ｐａｃｋ−ｙｅａｒｓ）である。被験者から得ることができる他の生物測定パラメーターとしては、年齢、発がん物質への暴露、性、家族の喫煙歴などが挙げられるが、それらに限定されない。

前記のように、本発明の方法においては、試験試料を分析してパネル中に含まれる１つ以上のバイオマーカーの存在を判定する。試験試料中にバイオマーカーが存在すると判定されたら、その検出されたバイオマーカーを定量化する（本明細書で前述した手法を用いて行なう）。試験試料中のそれぞれのバイオマーカーの量が定量化されたら、次に定量化されたそれぞれのバイオマーカーの量を特定のバイオマーカーに対する所定のカットオフ（通常は整数などの値または数字、あるいは本明細書では「分割点」（“ｓｐｌｉｔｐｏｉｎｔ”）と称する）と比較する。本発明の方法において採用される所定のカットオフは、当技術分野で公知の日常の手法（例えば、多変量解析（図１を参照されたい）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄロジスティック回帰分析、分割スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＳｃｏｒｅＭｅｔｈｏｄ）、またはそれらの任意の組合せなどが挙げられるが、それらに限定されない）を用いて決めることができる。例えば、分割スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＳｃｏｒｅＭｅｔｈｏｄ）を用いた場合、規定のカットオフの値または数字は得られるべき所望の結果次第で決められる。得られるべき所望の結果が、関心の群のそれぞれのマーカーの正分類の正確さを最大にする、すなわち、肺がん発症の危険性がある被験者と肺がん発症の危険性がない被験者を正確に識別する目的のものであれば、そうした所望の結果に基づいたバイオマーカーに対する所定のカットオフのために、特定の値または数字が選択される。一方、所望の結果が、それぞれのマーカーの感度を最大にする目的のものであれば、所定のカットオフのための異なる値または数値が、その所望の結果に基づくバイオマーカーに対して選択される。同様に、所望の結果がそれぞれのマーカーの特異性を最大にする目的のものであれば、所定のカットオフのための異なる値または数値が、その所望の結果に基づくバイオマーカーに対して選択される。試験試料中に存在する任意のバイオマーカーの量が定量化されれば、この情報は、当業者が所望の結果次第で決まるそれぞれのバイオマーカーに対する適切な所定のカットオフを所定の手法を用いて決定するために使用するＲＯＣ曲線、ＡＵＣおよびの他の情報を作成するために用いることができる。それぞれのバイオマーカーの量を所定のカットオフと比較した後、スコア（すなわち数字で、例えば０から１００などの任意の整数であってよい）を、その比較に基づいてそれぞれのバイオマーカーに割り当てる。さらに、１つ以上のバイオマーカーに加え、被験者に対して１つ以上の生物測定パラメーターを得た場合、それぞれの生物測定パラメーターを、その生物測定パラメーターに対する所定のカットオフと比較する。任意の生物測定パラメーターに対する所定のカットオフは、１つ以上のバイオマーカーに対する所定のカットオフの決定に関して本明細書に記載したものと同様の手法を用いて決定することができる。バイオマーカーの比較と同様に、スコア（すなわち数字で、例えば０から１００などの任意の整数であってよい）を前述の比較に基づいて生物測定パラメーターに割り当てる。

あるいは、上記のスコア法を用いる代わりに、分割加重スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＷｅｉｇｈｔｅｄＳｃｏｒｉｎｇＭｅｔｈｏｄ）を用いることができる。分割加重スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＷｅｉｇｈｔｅｄＳｃｏｒｉｎｇＭｅｔｈｏｄ）を用いた場合、試験試料中のそれぞれのバイオマーカーの量を定量化したら、その、試験試料中に検出されたそれぞれのバイオマーカーの量をその特定のバイオマーカーに対する多数の所定のカットオフと比較する。得られる種々のカットオフ全てから、１つのスコア（すなわち数字で、例えば０から１００などの任意の整数であってよい）をそのバイオマーカーに割り当てる。この分割加重スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＷｅｉｇｈｔｅｄＳｃｏｒｉｎｇＭｅｔｈｏｄ）はまた、１つ以上の生物測定パラメーター（ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒ）にも同様に使用できる。

定量化したそれぞれのバイオマーカーに対して、または場合によっては被験者から得られた任意の生物測定パラメーターに対して、スコアが割り当てられたら、それぞれのバイオマーカー、またはそれぞれのバイオマーカーおよびそれぞれの生物測定パラメーターに対するスコアを総合して被験者の総スコアを出す。次にこの総スコアを既定の総スコアと比較する。この比較に基づいて、被験者に肺がんの危険性があるか否かを決定することができる。この、被験者に肺がんを発症する危険性があるか否かの決定は、総スコアが既定の総スコアよりも高いか、または低いか、否かに基づいてよい。例えば、既定の総スコアに割り当てられた値に基づいて、規定の総スコアよりも総スコアが高い被験者は、危険性が高いと考えてよく、よってさらなる試験または追加処置へと差し向けられうる。本方法で用いる既定の総スコア（あるいは、本明細書において「基準点（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）」と称する）は、バイオマーカーに対する既定のスコアに関して前記したものと同様の手法を用いて決定することができる。例えば、図５は３つのＲＯＣ曲線である。これらのＲＯＣ曲線はそれぞれ組み合わせたマーカーからの単一の出力を示すが、しかし、ただひとつのマーカーからも同様のＲＯＣ曲線ができると思われる。ＲＯＣ曲線は、一方の端、低感度および低擬陽性率（１特異性）から他方の端、高感度および高偽陽性率までにわたる。これらの２端間の曲線の形状は大きく変化しうる。感度が少なくとも９０％であることが求められる方法の場合、図５に示すＲＯＣ曲線に基づき、選択した曲線によって偽陽性率は６０〜７０％になると思われる。偽陽性が多くとも１０％であることが求められる方法の場合には、選択した曲線によって、感度は４０〜５０％になると思われる。これらの方法はどちらもマーカーの同じパネルから得られるがしかし、異なる臨床成績特性を規定するために、パネルの基準点（または既定の総スコア）を変更する。計算上、ＲＯＣ曲線上のそれぞれの点の下にあるのがデータ範囲の一方の端からデータ範囲の他方の端まで動く基準点（または既定の総スコア）である。基準点（または既定の総スコア）がデータ範囲の下端にある場合、全ての試料は陽性であり、ＲＯＣ曲線上に高感度かつ高偽陽性率の点が生じる。基準点（または既定の総スコア）がデータ範囲の上端にある場合、全ての試料は陰性であり、ＲＯＣ曲線上に低感度かつ低擬陽性の点が生じる。方法は所望の臨床特性、例えば感度の最小値（すなわち、９０％）、特異性の最小値（すなわち９０％）、またはその両方などを有することを求められることが多い。マーカーの基準点（または既定の総スコア）を変えることが、所望の臨床特性を得る助けになる。

上記の工程、（ａ）所定のカットオフとパネル中のそれぞれのバイオマーカーの量（または、分割加重スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＷｅｉｇｈｔｅｄＳｃｏｒｉｎｇＭｅｔｈｏｄ）を用いる場合には多数の所定のカットオフ）との比較、その比較に基づいてそれぞれのバイオマーカーにスコア（または、分割加重スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＷｅｉｇｈｔｅｄＳｃｏｒｉｎｇＭｅｔｈｏｄ）を用いる場合には可能性のある多数のスコアの１つから得たスコア）の割り当てること、パネル中のそれぞれの生物測定パラメーターに対して割り当てられたスコアを総合して被験者の総スコアを出すこと、その総スコアを既定の総スコアと比較し、そして総スコアに基づいて被験者が肺がんの危険性を有するかどうかを決定すること、または（ｂ）少なくとも１つの生物測定パラメーターと所定のカットオフ（または、分割加重スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＷｅｉｇｈｔｅｄＳｃｏｒｉｎｇＭｅｔｈｏｄ）を用いる場合には多数のカトットオフ）との比較、およびその比較に基づいてそれぞれの生物測定パラメーターにスコア（または、分割加重スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＷｅｉｇｈｔｅｄＳｃｏｒｉｎｇＭｅｔｈｏｄ）を用いる場合には可能性のある多数のスコアの１つから得たスコア）を割り当てること、パネル中のそれぞれのバイオマーカーの量と所定のカットオフとの比較、その比較に基づいてそれぞれのバイオマーカーにスコアを割り当てること、それぞれの生物測定パラメーターに割り当てられたスコアと定量化したそれぞれのバイオマーカーに割り当てられたスコアを総合して被験者の総スコアを出すこと、総スコアを既定の総スコアと比較し、そして総スコアに基づいて被験者が肺がんの危険性を有するかどうかを決定すること、は、例えばヒトによって手動で行なうことができ、またはコンピュータプログラムもしくはアルゴリズムを、入力装置、記憶装置、処理装置、表示装置、および出力装置などの必要なハードウェアを一緒に用いて完全にまたは部分的に行なうことができる。

例示のみの目的で、本発明の方法がどのように実行されるかをここで示す。この実施例においては、８つのバイオマーカーを含むパネルと分割スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＳｃｏｒｅＭｅｔｈｏｄ）を用いて、患者を試験し、その患者が肺がんを有する尤度を決定する。パネル中のバイオマーカーは、サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＳＣＣ、ｐｒｏＧＲＰ、およびサイトケラチン１８である。パネルに対する既定の総スコア（または基準点（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ））は３である。患者から試験試料を得た後、その患者の試験試料中の８つのバイオマーカー（サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＳＣＣ、ｐｒｏＧＲＰ、およびサイトケラチン１８）それぞれの量を定量化する。この実施例のために、試験試料中の８つのバイオマーカーそれぞれの量を以下の通り決定した。サイトケラチン１９：１．９５、ＣＥＡ：２．７５、ＣＡ１２５：１５．２６、ＣＡ１５−３：１１．９２、ＣＡ１９−９：９．２４、ＳＣＣ：１．０６、ｐｒｏＧＲＰ：２５．２９、サイトケラチン１８：６１．１３。次いでこれらのバイオマーカーそれぞれの量を対応する所定のカットオフ（または分割点）と比較する。バイオマーカーそれぞれに対する所定のカットオフは、サイトケラチン１９：１．８９、ＣＥＡ：４．８２、ＣＡ１２５：１３．６５、ＣＡ１５−３；１３．０７、ＣＡ１９−９：１０．８１、ＳＣＣ：０．９２、ｐｒｏＧＲＰ：１４．６２、そしてサイトケラチン１８：５７．３７である。対応する所定のカットオフ（分割点）よりも量が多いバイオマーカーそれぞれに対して、スコア１を与えることができる。対応する所定のカットオフよりも量が少ないかまたは同量であるバイオマーカーにたいしてはスコア０を与えることができる。その結果、前述の比較に基づいて、それぞれのバイオマーカーには以下の通りスコアが割り当てられることになる。サイトケラチン１９：１、ＣＥＡ：０、ＣＡ１２５：１、ＣＡ１５−３：０、ＣＡ１９−９：０、ＳＣＣ：１、ｐｒｏＧＲＰ：１、そしてサイトケラチン１８：１。次いで８つのバイオマーカーそれぞれのスコアを数学的に（すなわち、バイオマーカーそれぞれのスコアを合計することによって）総合して患者の総スコアにたどり着く。本患者の総スコアは５（この総スコアは以下のように計算される。１＋０＋１＋０＋０＋１＋１＋１＝５）。この患者の総スコアを既定の総スコア、３と比較する。既定のスコア３よりも大きい総スコアは、その患者について陽性の結果であると示すことになる。３よりも小さい、または同じ総スコアは、その患者について陰性の結果であると示すことになる。本実施例では、患者の総スコアは３よりも大きいので、この患者は陽性の結果であると考えられ、よって肺がんの兆候または疑いに対するさらなる試験に回されることになる。一方、患者の総スコアが２であったら、その患者は陰性の結果であると考えられ、それ以上のどんな試験にも回されないことになる。

別の実施例においては、前述の８つのバイオマーカーパネルを再度用いるが、しかし本実施例では、分割加重スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＷｅｉｇｈｔｅｄＳｃｏｒｉｎｇＭｅｔｈｏｄ）を採用する。本実施例においては、パネルに対する既定の総スコア（または基準点（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ））は１１．２であり、試験試料中の定量化されたバイオマーカーの量は前述したものと同じである。次いでそれぞれのバイオマーカーの量を、そのバイオマーカーそれぞれに対する３つの異なる所定のカットオフと比較する。例えば、それぞれのバイオマーカーに対する所定のカットオフを表Ａに示す。

したがって、それぞれのバイオマーカーに対して４つの可能性のあるスコアが得られる。定量化されたそれぞれのバイオマーカーの量を上記表Ａに示される所定のカットオフ（分割点）と比較する。例えばＣＥＡについてみると、試験試料中の定量化されたＣＥＡ量は２．７５であるから、表Ａ中の５０％特異性に対する所定のカットオフ値２．０２と７５％特異性に対する所定のカットオフ値３．３との間に収まる。故に、ＣＥＡにはスコア２．６８が割り当てられる。このことを残るバイオマーカーについても繰り返し、同様に評価してそれぞれに以下のスコアを割り当てる。サイトケラチン１８：２．６、ｐｒｏＧＲＰ：４．９６、ＣＡ１５−３：０、ＣＡ１２５：０、ＳＣＣ：２．４８、サイトケラチン１９：８．４、ＣＡ１９−９：０。次いで８つのバイオマーカーそれぞれのスコアを数学的に（すなわち、バイオマーカーそれぞれのスコアを合計することにより）総合して患者の総スコアにたどり着く。患者の総スコアは２１．１２（この総スコアは次のように計算される。２．６８＋２．６＋４．９６＋０＋０＋２．４８？８．４＋０＝２１．１２）。次に患者の総スコアを既定の総スコア、１１．２と比較する。既定の総スコア１１．２よりも大きい総スコアは、その患者については陽性の結果であると示すことになる。１１．２よりも小さいかまたは等しい総スコアは、その患者については陰性の結果であると示すことになる。本実施例では、患者の総スコアは１１．２よりも大きいので、この患者は陽性の結果を有すると考えられ、したがって、肺がんの兆候または疑いに対するさらなる試験に回されることになる。

さらに、本明細書に記載の分割加重スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＷｅｉｇｈｔｅｄＳｃｏｒｉｎｇＭｅｔｈｏｄ）はまた、被験者から得られた１つ以上のマーカーにスコアをつけるためにも使用できる。好ましくは、そのようなマーカー（１つ以上のバイオマーカー、１つ以上の生物測定パラメーター、またはバイオマーカーと生物測定パラメーターとの組合せのいずれにせよ）は、被験者にがんまたは他のなんらかの疾病などの病状を発症する危険性があるかどうかを診断または評価するための補助として用いることができる。危険性を評価する為にマーカーを用いる、または用いることが可能な病状を本明細書の方法で用いることができる。そのような方法には、下記の段階が含まれる。

ａ．被験者から少なくとも１つのマーカーを得ること、
ｂ．該被験者から得たマーカーの量の定量化、
ｃ．定量化されたそれぞれのマーカーの量を該マーカーに対するいくつかの所定のカットオフと比較し、その比較に基づいてそれぞれのマーカーのスコアを割り当てること、および
ｄ．段階Ｃにおいて、定量化されたそれぞれのマーカーに対して割り当てたスコアを総合して該被験者の総スコアを出すこと。

好ましくは、この方法には下記の段階が含まれる。

ａ．被験者から少なくとも１つのマーカーを得ること、
ｂ．該被験者から得たマーカーの量の定量化、
ｃ．定量化されたそれぞれのマーカーの量を該マーカーに対するいくつかの所定のカットオフと比較し、その比較に基づいてそれぞれのマーカーのスコアを割り当てること、
ｄ．段階Ｃにおいて、定量化されたそれぞれのマーカーに割り当てたスコアを総合して
該被験者の総スコアを出すこと、
ｅ．段階ｄにおいて決定した総スコアを既定の総スコアと比較すること、および、
ｆ．段階ｅにおいて決定した総スコアに基づいて、該被験者が病状を発症する危険性を有するかどうかを決定すること。

ＤＦＩ
本明細書において前述のように、出願者らは、１つ以上のバイオマーカー、またはバイオマーカーと生物測定パラメーターの組合せを検出および定量化することが、患者の肺がんを診断する補助として有効であることを見いだした。さらに発明者らは、本明細書に記載の１つ以上のバイオマーカー、および１つ以上のバイオマーカーと１つ以上の生物測定パラメーターの組合せで、肺がんに関連するＤＦＩを有するものが約０．５未満、好ましくは約０．４未満、さらに好ましくは約０．３未満、そしてさらに好ましくは約０．２未満であることを見いだした。表２５〜２９は、ＤＦＩが約０．５未満、約０．４未満、約０．３未満、および約０．２未満である、さまざまなバイオマーカーまたはバイオマーカーと生物測定パラメーターの組合せを含むパネルの例を示す。

キット
本発明の方法を実行する際に使用するために、１つ以上のバイオマーカー、１つ以上の免疫反応性サイクリンＥ２ポリペプチド、生物測定パラメーター、およびそれらの任意の組合せをキット（パネルなどの）形成に適用できる。一態様においては、キットには配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、またはそれらの組合せからなる群から選択されたペプチドを含めることができる。

別の態様においては、キットには免疫反応性サイクリンＥ２またはその任意の組合せに対する少なくとも１種の抗体を含めることができる。

また別の態様においては、キットには下記を含めることができる。

（ａ）試験試料中の１種以上種の抗原を定量化するための少なくとも１種の抗体を含む試薬（ただし、上記抗原としては、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５，ＣＡ１５−３、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、ｐｒｏＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１抗トリプシン、およびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ）、
（ｂ）試験試料中の少なくとも１種の抗体を定量化するための１種以上種の抗原を含む試薬（ただし、上記抗体としては、抗ｐ５３、抗ＴＭＰ２１、抗ＮＰＣＩＬＩＣドメイン、抗ＴＭＯＤＩ、抗ＣＡＭＫＩ、抗ＲＧＳＩ、抗ＰＡＣＳＩＮＩ、抗ＲＣＶＩ、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３、および免疫反応性サイクリンＥ２に対する少なくとも１つの抗体）、
（ｃ）ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｔｆａ６４５３、およびＨｉｃ３９５９からなる群から選択された１つ以上の関心領域を定量化するための試薬、および
（ｄ）試験試料中の、定量化されたそれぞれの抗原、抗体、および関心領域の量を総合して所定のカットオフ（または、多数の所定のカットオフ）に対する比較を行い、その比較に基づいて、定量化されたそれぞれの抗原、抗体、および関心領域に対するスコア（または、いくつか可能性のあるスコアの１つから得たスコア）を割り当て、定量化されたそれぞれの抗原、抗体、および関心領域に対して割り当てられたスコアを総合して総スコアを得て、その総スコアを既定の総スコアと比較し、患者が肺がんに罹患しているかどうかを決定する一補助としてその比較を用いる、という段階を行なうための１つ以上のアルゴリズムまたはコンピュータプログラム。

あるいは、１つ以上のコンピュータプログラムの代わりに、人間が上記段階を手動で行なうための１つ以上の説明書を備えることもできる。

１つ以上の関心領域を定量化するためにキットに含まれる試薬には、パネルに含まれる少なくとも１つの関心領域に結合して保持する吸着剤、その吸着剤に関連して用いる固体担体（ビーズなど）、１つ以上の検出可能な標識などを含めることができる。吸着剤は、分析化学および免疫化学において使用される多くの吸着剤のうち任意のものでよく、金属キレート、陽イオン基、陰イオン基、疎水基、抗原、および抗体が挙げられる。

さらに別の態様においては、キットには下記を含めることができる。

（ａ）試験試料中の１種以上種の抗原を定量化するための少なくとも１種の抗体を含む試薬（ただし、上記抗原としては、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、およびｐｒｏＧＲＰ）、
（ｂ）ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｔｆａ６４５３、およびＨｉｃ３９５９からなる群から選択された１つ以上の関心領域を定量化するための試薬、および
（ｃ）試験試料中の、定量化されたそれぞれの抗原および被験者領域の量を総合して所定のカットオフ（または、いくつかの所定のカットオフ）に対する比較を行い、その比較に基づいて、定量化されたそれぞれの抗原および被験者領域に対するスコア（または、いくつかの可能性のあるスコアの１つから得たスコア）を割り当て、定量化されたそれぞれの抗原および被験者領域に対して割り当てられたスコアを総合して総スコアを得て、その総スコアを既定の総スコアと比較し、患者が肺がんに罹患しているかどうかを決定する一補助としてその比較を用いる、という段階を行なうための１つ以上のアルゴリズムまたはコンピュータプログラム。あるいは、１つ以上のコンピュータプログラムの代わりに、人間が上記段階を手動で行なうための１つ以上の説明書を備えることもできる。１つ以上の関心領域を定量化するためにキットに含まれる試薬には、パネルに含まれる少なくとも１つの関心領域に結合して保持する吸着剤、その吸着剤に関連して用いる固体担体（ビーズなど）、１つ以上の検出可能な標識などを含めることができる。

キットには下記の抗原および関心領域を定量化するために必要な試薬が含まれることが好ましい。（ａ）サイトケラチン１９およびＣＥＡと、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９およびＴｆａ２７５９、（ｂ）サイトケラチン１９およびＣＡＥと、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、Ｔｆａ２７５９、およびＡＣＮ９４５９、および（ｃ）サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、サイトケラチン１８、およびｐｒｏＧＲＰと、ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、およびＴｆａ２７５９。

別の態様においては、キットには下記を含めることができる。（ａ）試験試料中の１種以上種の抗原を定量化するための少なくとも１種の抗体を含む試薬（ただし、上記抗原としては、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、およびＰｒｏＧＲＰ）、（ｂ）試験試料中の、定量化されたそれぞれの抗原の量を総合して所定のカットオフ（または、いくつかの所定のカットオフ）に対する比較を行い、その比較に基づいて、定量化されたそれぞれの抗原に対するスコア（または、いくつかの可能性のあるスコアの１つから得たスコア）を割り当て、定量化されたそれぞれの抗原に対して割り当てられたスコアを総合して総スコアを得て、その総スコアを既定の総スコアと比較し、患者が肺がんに罹患しているかどうかを決定する一補助としてその比較を用いる、という段階を行なうための１つ以上のアルゴリズムまたはコンピュータプログラム。

あるいは、１つ以上のコンピュータプログラムの代わりに、人間が上記段階を手動で行なうための１つ以上の説明書を備えることもできる。キットには１つ以上の検出可能な標識も含めることができる。キットには下記の抗原を定量化するために必要な試薬が含まれることが好ましい。サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、およびＰｒｏＧＲＰ。

別の態様においては、キットには下記を含めることができる。（ａ）１つ以上のバイオマーカーを定量化する試薬（ただし、上記バイオマーカーは、ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｔｆａ６４５３、およびＨｉｃ３９５９からなる群から選択される被験者領域）、および、（ｂ）試験試料中の、定量化されたそれぞれのバイオマーカーの量を総合して所定のカットオフ（または、いくつかの所定のカットオフ）に対する比較を行い、その比較に基づいて、定量化されたそれぞれのバイオマーカーに対するスコア（または、いくつかの可能性のあるスコアの１つから得たスコア）を割り当て、定量化されたそれぞれのバイオマーカーに対して割り当てられたスコアを総合して総スコアを得て、その総スコアを既定の総スコアと比較し、患者が肺がんに罹患しているかどうかを決定する一補助としてその比較を用いる、という段階を行なうための１つ以上のアルゴリズムまたはコンピュータプログラム。あるいは、１つ以上のコンピュータプログラムの代わりに、人間が上記工程を手動で行なうための１つ以上の説明書を備えることもできる。キット中の定量化されるべき関心領域は、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｔｆａ６４５３、およびＨｉｃ３９５９からなる群から選択されることが好ましい。１つ以上の関心領域を定量化するためにキットに含まれる試薬には、パネルに含まれる少なくとも１つの関心領域に結合して保持する吸着剤、その吸着剤と関連して用いる個体担体（ビーズなど）、１つ以上の検出可能な標識などを含めることができる。

バイオマーカーの同定
本発明のバイオマーカーは、当技術分野の技術者に周知の技術によって単離、精製、および同定することができる。その技術としては、クロマトグラフ法、電気泳動技術、および遠心分離法が挙げられる。これらの技術はＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ、Ｊ．ＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ，Ｃｏｌｉｇａｎｅｔａｌ．（Ｅｄｓ）（２００２）およびＨａｒｒｉｓ，Ｅ．Ｌ．Ｖ．，Ｓ．ＡｎｇａｌｉｎＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ（１９９０）などに記載されている。

ここで本発明の実施例を、それに限定するものではなく、一例として示す。

（実施例）
患者の血清の臨床試料を採取し（実施例１）、マーカー抗原免疫測定の分析をし（実施例２）、ビーズを用いてマーカー抗体免疫測定の分析（実施例３）またはスライドを用いてマーカー抗体免疫測定の分析をして（実施例４）、質量分析によりバイオマーカーを同定する（実施例５）。同定されたマーカーをさまざまなアルゴリズムを用いて分類し優先順位をつける（実施例６）。これらの優先順位をつけたマーカーを、スコア法を用いて総合し（実施例７）、予測モデルを同定して（実施例８）、臨床的有用性を評価する。肺がん罹患が疑われる患者における肺がん検出を補助する方法を用いた実施例を実施例９に例証している。対象領域の質量分析によって同定されたバイオマーカーは、分析しこの組成を決定して同定した（実施例１０）。実施例１１は、本発明に従って同定したバイオマーカーを、免疫測定法および免疫‐質量分析法を用いて検出、測定する方法が記載されている、机上実施例である。

臨床標本
患者の血清の臨床試料を、施設内倫理委員会（ＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＲｅｖｉｅｗＢｏａｒｄ）で承認されたプロトコールの下で採取した。標本を提供した全ての患者は、採取され本研究に使用される標本についてインフォームド・コンセントを受けた。血清試料は、血清分離管中に入れて室温で１５分間、凝固させた。この血餅を遠沈させて試料を２ｍＬアリコートとした。２４時間以内にこの試料を−８０℃で凍結させ、さらに先の処理を行なうまでこの温度で維持した。受領次第、試料を解凍し、便宜上、より少ない量に再等分して再凍結させた。この試料は最終的に分析の直前に解凍した。したがって、ひとそろいの試料すべては、分析の前に２度凍結および解凍された。

全部で７５１標本を採取、分析した。群は、生検で肺がんが確認された２５０患者、生検で良性の肺疾患であると確認された２７４患者、および明らかに正常である２２７の被験者から構成される。がんおよび良性の患者は全て最終的な生検による診断で確認された。正常な被験者には、このような最終的な診断方法は行なわず、顕性悪性疾患が見られないことにより正常と判断された。最終的な診断方法の後、５０歳以上の患者のみを選択した。この選択の後には、がん２３１、良性１８２、および正常１５５が残った。このがんの大コホート、良性肺疾患、および明らかに正常な被験者をまとめて以下「大コホート」と証する。良性肺疾患と肺がんとの区別に焦点を当てるために大コホートのサブセットを用いる。このコホートを以下「小コホート」と称し、これは肺がん１３８、良性１０６、および明らかに正常な被験者１３からなる。大コホートから小コホートを除いた後には、肺がん１０７、良性７４、および明らかに正常な被験者１４２が残った。このコホートは、小コホートに無関係で、発生した予測モデルを検証するために用いたもので、以下「検証コホート」と称する。記載のように調製した臨床試料は実施例２から１０で用いた。

バイオマーカーの免疫測定検出
Ａ．ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ，ＩＬ，以下「Ａｂｂｏｔｔ」）Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ（商標）分析
以下の抗原、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、およびＣＡ１５−３のためにＡｒｃｈｉｔｅｃｔ（商標）キットを入手した。分析は全てメーカーの説明書に従って行った。試料中の検体濃度は、Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ（商標）計器によって得た。これらの濃度を用いて下記表１に示すＡＵＣデータを作成した。

Ｂ．ＲｏｃｈｅＥｌｅｃｓｙｓ（商標）分析
Ｅｌｅｃｓｙｓ（商標）２０１０ｓｙｓｔｅｍ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で、メーカーの説明書に従ってシフラ２１−１（Ｃｙｆｒａ２１−１）（サイトケラチン１９、ＣＫ−１９）測定を行った。シフラ２１−１（Ｃｙｆｒａ２１−１）の濃度はＥｌｅｃｓｙｓ（商標）計器によって得た。このデータによってＲＯＣ曲線を作成し、大コホートおよび小コホートについてのＡＵＣを下記表２に記録した。

Ｃ．マイクロタイタープレート分析
以下のＥＬＩＳＡキットを購入した。ＡｄｖａｎｃｅｄＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｊａｐａｎ）のＰｒｏＧＲＰ、ＩＤＬＢｉｏｔｅｃｈＡＢ（Ｂｒｏｍｍａ，Ｓｗｅｄｅｎ）のＴＰＳ（サイトケラチン１８、ＣＫ−１８）、およびＩＢＬＩｍｍｕｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）のパラインフルエンザ１／２／３ＩｇＧＥＬＩＳＡ。メーカーの説明書に従って分析を行った。検体の濃度は、メーカーのプロトコールで指示、規定されている計算から導いた。個々の分析で得られたＡＵＣを下記の表３に示す。

自己抗体ビーズアレイ
Ａ．市販のヒトタンパク質（下記の表４を参照されたい）をＬｕｍｉｎｅＸ（商標）ＳｅｒｏＭａｐ（商標）ビーズ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）に付着させ、個々のビーズセットを合わせて試薬を調製した。試薬の一部を、存在する任意の抗体がタンパク質に結合できる条件下でヒト血清試料にさらした。結合していない物質を洗い落とし、次いでビーズを、ヒトＩｇＧに特異的に結合する抗体にＲ−フィコエリトリンを結びつけた蛍光複合体にさらした。洗浄後、ビーズを、内部の色素に従ってそれぞれのビーズを同定するＬｕｍｉｎｅｘ（商標）１００計器に通して、ビーズに結合した蛍光発光（ビーズに結合した抗体の量に対応する）を測定した。このようにして、７７２の試料（肺がん２５１、正常２４４、良性２７７）について、２１のヒトタンパク質、ならびに、対照としていくつかの非ヒトタンパク質（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および破傷風毒素）に対する免疫応答を評価した。

抗原ＭＵＣ−１（ＦｕｊｉｒｅｂｉｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＩＮＣ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）、サイトケラチン１９（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｓａｃｏ，ＭＥ）、およびＣＡ−１２５（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｓａｃｏ，ＭＥ）を、細胞培養物のイオン交換画分として入手した（下記の表４を参照されたい）。これらの比較的粗い調製物を、サイズ排除カラム（ＢｉｏＲａｄＳＥＣ−２５０，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、移動相がＰＢＳ０．４ｍＬ／分のＨＰＬＣを用いた、分子量によるさらなる分別にかけた。１５分から始めてそれぞれ１分ごとの画分を、それぞれの抗原に対して全部で２３画分を集めた。ＭＵＣ−１については２５０ｕＬを注入し、サイトケラチン１９およびＣＡ−１２５については１５０ｕＬを注入した。３つの試料全てが、１５から２４分に溶出する高分子量のタンパク質のさまざまな濃度を表す信号を示し、２４分以降の時間においては測定できない程高信号、低分子量の物質の濃度が高いことを示した。ビーズを被覆するために、以下の画分を合わせた。ＭＵＣ−１−Ａ画分６、７；ＭＵＣ−１−Ｂ画分１０、１１；ＭＵＣ−１−Ｃ画分１２、１３；サイトケラチン１９−Ａ画分４、５；サイトケラチン１９−Ｂ画分８、９；サイトケラチン１９−Ｃ画分１６、１７；ＣＡ１２５−Ａ画分５、６；ＣＡ１２５−Ｂ画分１２、１３

Ｂ．抗原のＬｕｍｉｎｅｘＳｅｒｏＭａｐ（商標）ビーズへの被覆
Ｏｍｅｇａ１０Ｋ限外ろ過プレート（ＰａｌｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＡｎｎＡｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）のウェルに水５０ｕＬを加えた。１０分後にプレートを真空状態に置いた。ウェルが空になった際には、水１０ｕＬを加えて水和状態を保った。それぞれのウェルに５ｍＭのモルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ５．６）を５０から１００ｕＬ、指示されたＬｕｍｉｎｅｘ（商標）ＳｅｒｏＭＡＰ（商標）ビーズ、および１０から２０ｕｇに相当する適切な量の表４に指示されたそれぞれの抗原を加えた。ビーズをピペットで懸濁した。ビーズにＥＤＡＣ（２．０ｍｇ／５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．６）１．０ｍＬ）１０ｕＬを加えた。プレートに蓋をして暗所の振とう機に置いた。１４時間後にプレートを真空吸引し、水で洗浄し、最後にビーズを２０ｍＭのトリエタノールアミン（ＴＥＡ）（ｐＨ５．６）５０ｕＬ中に懸濁させた。プレートを暗所で振とう機で攪拌した。２度目のＥＤＡＣ（２．０ｍｇ／５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．６）１．０ｍＬ）をそれぞれのウェルに加え、プレートを暗所の振とう機に１時間置いた。洗浄後、１％ＢＳＡおよび０．０８％アジ化ナトリウム（ＰＢＮ）を含有するＰＢＳ緩衝液２００ｕＬをそれぞれのウェルに加え、続いてプローブで超音波処理して、暗所に置いた。

Ｄ．ビーズで覆われた血清試料の試験
血清試料を、以下のようにマイクロプレート中に調製した。ＰＢＮ中１：２０希釈、各マイクロプレートあたり８０試料。上記のビーズセット５０ｕＬにウサギ血清（本件で試験したものとは関係ない抗原の免疫を有するウサギ由来）５ｕＬを加えた。ビーズセットをボルテックスして３７℃下に置いた。３５分後に、５％ウサギ血清および１％ＣＨＡＰＳ（ＢＲＣ）を含有するＰＢＮ１ｍＬを加えた。ビーズセットをボルテックスし、遠沈させて、ＢＲＣ１．０５ｍＬ中に再懸濁させた。Ｓｕｐｏｒ１．２ｕｆｉｌｔｅｒｐｌａｔｅ（ＰａｌｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のウェルをＰＢＮ１００ｕＬで洗浄した。それぞれのウェルにＢＲＣ５０ｕＬ、それぞれの１：２０の血清試料１０ｕＬ、および再懸濁させたビーズ１０ｕＬを加えた。プレートを室温、暗所にて１時間振とうし、ろ過して、ＢＲＣ１００ｕＬで１０分間、３回洗浄を行った。検出複合体（ＲＰＥ抗ヒトＩｇＧ２０ｕＬ／ＢＲＣ５．０ｍＬ）５０ｕＬを加えてピペットでビーズを再懸濁させた後、プレートを暗所で３０分間振とうした。次いでＢＲＣ１００ｕＬを加え、ビーズをピペットで攪拌して、試料をＬｕｍｉｎｅｘ（商標）１００計器で分析した。

結果（各試料および抗原に対するビーズの中間値強度）を、表５で以下に示した大および小コホートに対する以下の結果で、ＲＯＣ解析によって評価した。

自己抗体スライドアレイ
Ａ．抗原調製物
インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＵｌｔｉｍａｔｅＯＲＦＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（商標）（インビトロジェン、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）から由来した、およそ５０００タンパク質を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）配列の全長ヒトタンパク質との組換え体融合物として調製した。ＧＳＴタグによって、タンパク質の他の特徴に依存せずに、アレイに結合する各タンパク質の量の査定が可能になる。

Ｂ．スライドの抗原コーティング
ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙは、以上で言及したおよそ５０００タンパク質でスポットしたニトロセルロースでコートしたガラス表面（スライド）、ならびに多数の対照特徴からなる。

Ｃ．コートスライドでの血清試料の試験
アレイをまず、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で、４℃にて１時間ブロックした。次いで、プロファイリング緩衝液（ＰｒｏｆｉｌｉｎｇＢｕｆｆｅｒ）（本明細書で議論した「プロファイリング緩衝液」は、ＰＢＳ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭジチオスレイトール、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５％グリセロール、１％ＢＳＡを含む）中１：１２０で希釈した血清試料に、４℃にて９０分間暴露した。アレイを次いで、プロファイリング緩衝液にて３回、洗浄あたり８分間洗浄した。次いでアレイを、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−共役抗−ヒトＩｇＧ、プロファイリング緩衝液中０．５ｕｇ／ｍＬ、４４℃にて９０分間暴露した。次いでアレイを、プロファイリング緩衝液中で３回、１洗浄あたり８分間洗浄した。遠心での乾燥後、ＡｘｏｎＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ蛍光マイクロアレイスキャナー（モレキュラーデバイゼス（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いてスキャンした。

Ｄ．バイオマーカー選別
がん患者からの血清の陽性シグナルの分布を、正常患者からのものと比較することによって、がん患者の自己抗体特性を削除しているタンパク質の同定を決定した。制限された数のアレイでの、がん特異的自己抗体を発見する可能性を増加させるために、以下の試料のプールを使用した。それぞれ４から５人の肺がん患者の血清を含む１０プール、それぞれ４または５人の正常患者の血清を含む１０プール、それぞれ良性肺疾患を有する４から５人の患者からの血清を含む１０プール。これらのプールを、以上で記述したように、処理のためにインビトロジェンに送付した。各プローブに対する各タンパク質に相当する蛍光強度を、スプレッドシートにて表した。各タンパク質は２回表され、アレイ上の二重スポットに相当する。

特定のタンパク質に対する免疫応答のがん特異性の査定に対する１つのアルゴリズムにおいて、カットオフ値が、がん試料のシグナル強度を非がん試料のものから最もよく区別した、製造業者（インビトロジェン）によって供給された。本カットオフより高い強度を有する各群からの試料の数（それぞれがんカウントおよび非がんカウント）を決定し、パラメーターとしてスプレッドシートに配置した。さらに、ｐ−値を計算し、これは、他と比較した１つの群において、シグナル増加がない可能性を表している。ついでデータを、非がん群において最も低い陽性、またがん群において最も陽性であるトップタンパク質を提供するようにソートし、さらにｐ−値にて低から高でソートした。本式によるソートが、以下の表７に提供された以下の情報を提供した。

第二のアルゴリズムが、非がん試料のシグナル強度の標準偏差で割った、がんに対する平均シグナルと、非がん試料に対する平均シグナル間の差として、タンパク質に対する免疫応答のがん特異性を計算した。これは、強い免疫応答が、弱いものよりも結果に影響を与えるという長所を有する。次いでデータを、最も高い値のトップタンパク質を与えるようにソートする。本ソートによって同定したトップ１００リスティングを、以下表８にて示している。

表７および８のソート結果を比較し、各タンパク質に対して、がんおよび非がん試料によって産出されたシグナルを試験することによって、以下表９で示した以下の２５個のタンパク質を、さらなる調査のために選別した。

Ｅ．サイクリンＥ２
サイクリンＥ２の２つの形態が、ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（商標）上で存在していることが分かった。Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＢＣ００７０１５．１（配列番号１）として同定された形態が、がん試料のプールのいくつかと、強力な免疫反応性を示し、良性および正常（非がん）プールと非常に低い応答性を示した。反対に、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＣ０２０７２９．１（配列番号２）として同定された形態は、任意のがんまたは非がんプール試料とほとんど反応性を示さなかった。以下に示したように、２つの形態の配列アライメントが、２５９アミノ酸にわたる同一性を示しており、Ｎ−末端およびＣ−末端領域両方で差がある。ＢＣ０２０７２９．１は、Ｎ−末端に１１０アミノ酸、Ｃ−末端に７アミノ酸を持ち、ＢＣ００７０１５．１には存在しない。ＢＣ００７０１５．１は、Ｃ−末端に、ＢＣ０２０７２９．１には存在しない３７アミノ酸を有する。形態ＢＣ００７０１５．１のみが免疫応答性を示しているので、この免疫応答性は、Ｃ−末端の３７アミノ酸部分に起因する。

ＢＣ００７０１５．１のＣ−末端からの２つのペプチドを合成し、Ｅ２−１（配列番号３）は、ＢＣ００７０１５．１のＣ−末端３７アミノ酸を含む。Ｅ２−２（配列番号５）は、ＢＣ００７０１５．１のＣ−末端１８アミノ酸を含む。両方のペプチドを、Ｎ末端にてシステインを含むように合成し、担体タンパク質または表面への特異的共有結合のための反応性の部位を提供する。

ＢＣ００７０１５．１（配列番号１）およびＢＣ０２０７２９．１（配列番号２）の配列アライメント

ペプチドＥ２−１およびＥ２−２は、ＢＳＡをマレイミドで活性化し、続いてペプチドの共役によって、ＢＳＡにそれぞれ連結した。活性化ＢＳＡを、以下のプロトコールに従って調製した。２００ｕＬＰＢＳ中のＢＳＡ８．０ｍｇに、２０ｕＬＤＭＲＦおよび１０ｕＬ１ＭトリエタノールアミンｐＨ８．４中のＧＭＢＳ（Ｎ−（ガンマ−マレイミド−ブチリル−オキシ）スクシンイミド、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、ＲｏｃｋｆｏｒｄＩＬ）１ｍｇを加えた。６０分後、混合液を、ＰＢＳ緩衝液でＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０カラムを通して、４００ｕＬ画分を回収した。活性化ＢＳＡ−Ｍａｌ（１００ｕＬ）に、ペプチドＥ２−１、２．５ｍｇまたはペプチドＥ２−２、３．２ｍｇを加えた。両方の場合で、混合液をボルテックスして、氷上に１５分間おき、その後混合液を、２５分間室温まで動かした。結合産物、ＢＳＡ−Ｍａｌ−Ｅ２−１（ＢＭ−Ｅ２−１）およびＢＳＡ−Ｍａｌ−Ｅ２−２（ＢＭ−Ｅ２−２）を、浄化のために、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０カラムを通した。

タンパク質およびペプチドを、２つの方法を用いて、Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）マイクロスフィアに結合させた。第一の方法が、実施例１０Ｃにて記述されており、「直接法（ｄｉｒｅｃｔｍｅｔｈｏｄｓ）」と呼ばれる。第二の方法は、「前活性化法（ｐｒｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｍｅｔｈｏｄ）」と呼ばれ、以下のプロトコールを使用する。オメガ（Ｏｍｅｇａ）１０ｋ超遠心プレートのウェル中に、水１００ｕＬを加え、１０分後に真空状態に置いた。ウェルが空になったら、２０ｕＬＭＥＳ（１００ｍＭ）ｐＨ５．６および５０ｕＬ各Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）ＳｅｒｏＭａｐ（商標）ビーズセットを、以下表１０にて示したように加えた。カラム１列Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ中のウェルに、およびカラム２列Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ中のウェルに、ＭＥＳ中のＮＨＳ（２０ｍｇ／ｍＬ）１０ｕＬ、およびＭＥＳ中ＥＤＡＣ（１０ｍｇ／ｍＬ）１０ｕＬを加えた。暗所での振盪４５分後に、プレートを真空状態に置き、緩衝液と未反応試薬を吸い上げた。プレートをバキュームから取り除き、２０ｕＬＭＥＳおよび５０ｕＬ水を加えた。表１０にて示唆したプレートに、各タンパク質またはペプチド（２ｕＬを加えた、ＤＮＡＪＢ１以外）４ｕＬを加え、ピペットで攪拌して、ビーズを分散させた。プレートを３０分間、シェーカー上で攪拌し、ついでＭＥＳ中１０ｍｇ／ｍＬＥＤＡＣ５ｕＬを（直接結合のために）カラム１、列ＥＦＧＨに加え、プレートをシェーカー上で３０分間攪拌し、ついで真空状態に置いて、緩衝液および未反応試薬を除去した。ウェルが空になったら、５０ｕＬＰＢＳを加え、混合液を攪拌し、プレートを真空状態に置いた。ウェルが空になったら、５０ｕＬＰＢＳを加え、ピペットで混合液を攪拌して、ビーズを分散させ、シェーカー上で６０分間インキュベートした。反応を停止するために、２００ｕＬＰＢＮを加えて、反応液を超音波処理した。

以下の表１０は、異なるビーズセット上での、サイクリンＥ２ペプチドおよびタンパク質の異なる提示を要約している。ペプチドＥ２−１およびＥ２−２をＢＳＡに結合し、ついで前活性化法（ビーズＩＤ２５および２６）、または直接法（ビーズＩＤ３０および３１）を用いてビーズに結合させた。ペプチド、Ｅ２−１およびＥ２−２をまた、前活性化法（ビーズＩＤ２８および２９）または直接法（ビーズＩＤ３３および３４）を用いて、ＢＳＡなしにビーズに結合させた。ビーズ３５、３７、３８、３９および４０を、前活性化法を用いてタンパク質でコートした。

ビーズを、以下の様式にて、患者血清で処理した。１ｍＬＰＢＮに、各ビーズ調製物５ｕＬを加えた。混合液を超音波処理して遠心し、ペレットビーズを、ＰＢＳ中のＢＳＡ１％１ｍＬで洗浄し、同一の緩衝液１ｍＬ中に再懸濁させた。１．２ｕＳｕｐｏｒフィルタープレート（パルコーポレーション（ＰａｌｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＥａｓｔＨｉｌｌｓ，ＮＹ）に、１００ｕＬＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中１％ＢＳＡ）を加えた。１０分後、プレートをろ過し、５０ｕＬＰＢＳ０．２％Ｔｗｅｅｎ（０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中１％ＢＳＡ）を加えた。各ウェルに、表１１で示したように、２０ｕＬビーズ混合物および２０ｕＬ血清（１：５０）を加えた。血清は、ヒト患者血清またはウサギ抗−ＧＳＴ血清のいずれかであった。プレートを暗所にてシェーカー上に配置した。１時間後、プレートをろ過し、１００ｕＬＰＢＮ／Ｔｗｅｅｎにて三回洗浄した。ＲＰＥ−抗ヒト−ＩｇＧ（１：４００）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）５０ｕＬを加えて、ヒト抗体を検出し、ＲＰＥ−抗ウサギ−ＩｇＧ（１：２００）を加えて、ウサギ抗−ＧＳＴ抗体を検出した。プレートを暗所にて３０分間、シェーカー上に配置して、その後ビーズをろ過し、洗浄して、Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）上で走らせた。

６つの血清試料とウサギ抗−ＧＳＴの結果を、以下表１１で示している。

ＢＳＡに連結し、それぞれビーズに（直接法を用いて）直接、または前活性化（または前活性化法）を介して結合したペプチドＥ２−１を含む、ビーズ２５および３０が、最も強力なシグナルを与えたことが、以上表１１より明らかである。約半分だけがＢＳＡ担体を介したが、ＢＳＡ担体なしで結合したペプチドＥ２−１がまた、強力なシグナルを与えた。ペプチドＥ２−２は、ＢＳＡ担体を介して結合した場合に、非常に低いシグナルを与え、ＢＳＡ担体なしではほぼ検出不能なシグナルであった。（Ｎ−末端ＧＳＴ融合タグを含む）全長タンパク質ＣＣＮＥ２は、ペプチドＥ２−２の任意の形態のもの以上の、しかしペプチドＥ２−１のものより非常に低いシグナルを示し、これは、配列の免疫応答性部分を含むが、ビーズ上より低い密度であることを示唆している。ウサギ抗−ＧＳＴでのこのシグナルは、本ＧＳＴ融合タンパク質が、ミクロスフィアに対して成功裏に結合したことを示している。

以下表１２で示されたタンパク質を、以上で記述したような前活性化および直接法によって、および受動的コーティングによって、ＬｕｍｉｎｅｘＳｅｒｏＭａｐ（商標）上にコートした。受動的コーティングのために、供給メーカーから受け取ったままの溶液中、タンパク質５ｕｇを、ＳｅｒｏＭａｐ（商標）ビーズ２００ｕＬに加え、混合液をボルテックスし、室温にて５時間、次いで４℃にて１８時間インキュベートし、次いで沈殿するまで遠心し、ペレットを洗浄して、ＰＢＮ中に再懸濁させた。

２３４人の患者（８７人がん、７０人良性、および７７人正常）からの血清試料を試験した。本試験からの結果を、ＲＯＣ曲線によって解析した。各抗原に対する計算されたＡＵＣを、以下表１３で示している。

質量分析法
Ａ．混合磁気ビーズ（ＭＭＢ）の連続希釈による試料調製
血清試料を融解し、当量のインビトロジェンゾルＢ緩衝液と混合した。この混合液をボルテックスし、０．８μｍフィルター（サルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通してろ過して、さらなる処理の前に残余物を精製し取り除いた。自動化試料調製を、Ｄｙｎａｌ（登録商標）（インビトロジェン）強アニオン交換およびアボットラボラトリーズ（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（アボット、ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ，ＩＬ）弱カチオン交換磁気ビーズの混合物を用いて、９６−ウェルプレートＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃ．）、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）上で実施した。典型的に、アニオン交換ビーズは、アミンに基づく炭化水素、四級アミンまたはジエチルアミン基を、官能末端基として持ち、弱カチオン交換ビーズは典型的に、スルホン酸（カルボキシル酸）に基づく官能基を有する。アボットのカチオン交換ビーズ（ＣＸビーズ）は、濃度２．５％（質量／容量）であり、Ｄｙｎａｌ（登録商標）強アニオン交換ビーズ（ＡＸビーズ）は、１０ｍｇ／ｍｌ濃度であった。試料調製の直前に、カチオン交換ビーズを、２０ｍＭＴｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１％還元ＴｒｉｔｏｎＸ１００（Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｔｏｎ緩衝液）で一回洗浄した。本試料調製で使用する他の試薬、２０ｍＭＴｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５（Ｔｒｉｓ緩衝液）、０．５％トリフルオロ酢酸（本明細書以下「ＴＦＡ溶液（ＴＦＡｓｏｌｕｔｉｏｎ）」および５０％アセトニトリル（本明細書以下「アセトニトリル溶液（Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）」は自ら調製した。試薬および試料は以下のように９６−ウェルプレートで準備した。

列Ａは、ＡＸビーズ３０ｕｌ、ＣＸビーズ２０ｕｌおよびＴｒｉｓ緩衝液５０ｕＬの混合液を含んだ。

列Ｂは、Ｔｒｉｓ緩衝液１００ｕｌを含んだ。

列Ｃは、Ｔｒｉｓ緩衝液１２０ｕｌと試料３０ｕｌを含んだ。

列Ｄは、Ｔｒｉｓ緩衝液１００ｕｌを含んだ。

列Ｅは、脱イオン水１００ｕｌを含んだ。

列Ｆは、ＴＦＡ溶液５０ｕｌを含んだ。

列Ｇは、アセトニトリル溶液５０ｕｌを含んだ。

列Ｈは空だった。

列Ａのビーズおよび緩衝液を先に混合し、ビーズをＣｏｌｌｅｃｔカウント３（何回磁気プローブが溶液内に入り、磁気ビーズを回収したかを示唆する器具パラメーター）で回収し、Ｔｒｉｓ緩衝液中、放出設定「ｆａｓｔ」、洗浄設定−ｍｅｄｉｕｍ、２０秒間の洗浄時間で、洗浄のために列Ｂ上へ移した。ビーズ洗浄段階の最後に、ビーズをＣｏｌｌｅｃｔカウント３で回収し、列Ｃ上へ移して試料と合わせた。ビーズ放出設定はｆａｓｔである。試料結合を、５分間の結合時間で、「ｓｌｏｗ」設定にて実施した。結合段階の最後に、ビーズをＣｏｌｌｅｃｔカウント３で回収する。回収したビーズを、放出設定「ｆａｓｔ」、洗浄設定−ｍｅｄｉｕｍ、２０秒間の洗浄時間で、第一洗浄段階のために列Ｄ上に移した。第一洗浄段階の最後に、ビーズをＣｏｌｌｅｃｔカウント３で回収する。回収したビーズを、放出設定「ｆａｓｔ」、洗浄設定−ｍｅｄｉｕｍ、２０秒間の洗浄時間で、第二洗浄段階のために、列Ｅ上に移した。第二洗浄段階の最後に、ビーズをＣｏｌｌｅｃｔカウント３で回収した。回収したビーズを、放出設定「ｆａｓｔ」、溶出設定−ｆａｓｔおよび２分間の溶出時間で、ＴＦＡ溶液中での溶出のために列Ｆに移した。ＴＦＡ溶出段階の最後に、ビーズをＣｏｌｌｅｃｔカウント３で回収した。このＴＦＡ溶出液を回収し、質量分析によって解析した。回収したビーズを、放出設定「ｆａｓｔ」、溶出設定−ｆａｓｔおよび２分間の溶出時間で、アセトニトリル溶液中での溶出のために列Ｇに移した。溶出後、ビーズをＣｏｌｌｅｃｔカウント３で除去し、列Ａに捨てた。アセトニトリル（ＡｃＮ）溶出液を回収して、質量分析によって解析した。

すべての試料を二回ずつ、しかしシステムエラーを避けるために異なるプレート上で行った。溶出した試料を手動で吸引し、自動化ＭＡＬＤＩ標的化試料調製のために９６−ウェルプレート中に配置した。したがって、各試料は、質量分析解析のために２つの溶出液を提供した。

ＣＬＩＮＰＲＯＴロボット（ブルッカーダルトニックス社（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓＩｎｃ．）、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を、ＭＳ照合の前に、ＭＡＬＤＩ標的を調製するために使用した。簡単に記すと、処理には、溶出した血清試料を含む試料プレート、およびＭＡＬＤＩマトリックス溶液（７０％アセトニトリル中の１０ｍｇ／ｍＬシナピン酸）を含むバイアルをロボット上の設計された位置にロードすることが含まれる。ロボットを制御するコンピュータからスポッティング手順を含むファイルをロードして、開始した。この場合、スポッティング手順には、５μＬのマトリックス溶液を吸引すること、およびマトリックスプレート中に分配し、続いて５μＬ試料を分配することが含まれる。試料およびマトリックスの前混合を、混合液５μＬを吸引し、マトリックスプレート中で数回分配することによって実施した。前混合前に、混合液５μＬを吸引し、０．５μＬを、アンカーチップ標的（ブルッカーダルトニックス社、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上、４連続スポットに沈着させた。溶液の残り３μＬをゴミ箱容器中に捨てた。必要以上の試料を吸引することで、アンカーチップ標的上への試料沈着の間に誤ったスポットを導き得るディスポーザブルチップ中の空気バブルの形成を最小化した。

Ｂ．Ｃ８磁気ビーズ水性相互作用クロマトグラフィー（Ｃ８ＭＢ−ＨＩＣ）による試料調製
血清試料を、ＳＯＬＢ緩衝液と混合し、実施例５Ａにて記述したようなフィルターで精製した。自己試料調製を、１００ＭＢ−ＨＩＣ８（ブルッカーダルトニックス社、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）として公知のＣＬＩＮＰＲＯＴＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔｓを用いて、９６−ウェルプレートＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（登録商標）上で実施した。キットには、Ｃ８磁気ビーズ、結合溶液および洗浄溶液が含まれる。すべての他の試薬は、他に言及がない限り、シグマケミカル社（ＳｉｇｍａＣｈｅｍ．Ｃｏ．）から購入した。試薬および試料を、以下のように９６−ウェルプレート中で設定した。

列Ａは、ブルカーのＣ８磁気ビーズ２０μＬとＤＩ水８０μＬの混合液を含んだ。

列Ｂは、血清試料１０μＬと結合溶液４０μＬの混合液を含んだ。

列ＣからＥは、洗浄溶液１００μＬを含んだ。

列Ｆは、（有機溶媒の蒸発を最小にするために溶出段階の直前に加えた）７０％アセトニトリル５０μＬを含んだ。

列Ｇは、ＤＩ水１００μＬを含んだ。

列Ｈは空であった。

列Ａ中のビーズを前混合して、「Ｃｏｌｌｅｃｔカウント」３で回収し、列Ｂ上に移して試料に結合させた。ビーズ放出設定を、１０秒間の放出時間で「ｆａｓｔ」に設定した。試料結合を、５分間の「ｓｌｏｗ」設定で実施した。結合段階の最後に、ビーズを「Ｃｏｌｌｅｃｔカウント」３で回収して、第一洗浄段階（放出設定＝ｆａｓｔ、時間＝１０秒間、洗浄設定＝ｍｅｄｉｕｍ、時間＝２０秒間）のために、列Ｃ上に移した。第一洗浄段階の終わりに、ビーズを「Ｃｏｌｌｅｃｔカウント」３で回収し、第一洗浄段階でと同一のパラメーターでの第二洗浄段階のために、列Ｄ上に移した。第二洗浄段階の終わりに、ビーズをもう一度回収して、先に記述したように第三および最終洗浄段階のために、列Ｅ上に移した。第三洗浄段階の終わりに、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）を、列Ｅから列Ｆの移行段階の間に中断し、７０％アセトニトリル５０μＬを列Ｆに加えた。アセトニトリルの添加後、処理を再開した。列Ｅからの回収したビーズを、溶出段階（放出設定＝ｆａｓｔ、時間＝１０秒間、溶出設定＝ｆａｓｔ、時間＝２分間）のために、列Ｆに移した。溶出段階の後、ビーズを除去し、列Ｇ中に捨てた。すべての試料を、実施例５ａにて以上で記述したように、二回ずつ行った。

ＣＬＩＮＰＲＯＴロボット（ブルッカーダルトニックス社、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を、使用したＭＡＬＤＩマトリックス中で多少の改変をしただけの、先の項目で記述したようなＭＳ照合の前に、ＭＡＬＤＩ標的を調製するために使用した。この場合、ＳＡの代わりに、ＨＣＣＡを使用した（４０％ＡＣＮ／５０％ＭｅＯＨ／１０％水、ｖ／ｖ／ｖ中、１ｍｇ／ｍＬＨＣＣＡ）。すべての他のパラメーターは同じままであった。

Ｃ．ＳＥＬＤＩチップを用いた試料調製
以下の試薬を使用した。

１．１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０、２５０ｍＬ脱イオン水を、２００ｍＭリン酸二ナトリウム溶液１５２．５ｍＬと、２００ｍＭリン酸一ナトリウム溶液９７．５ｍＭと混合することによって調製した。

２．１０ｍｇ／ｍＬシナピン酸溶液、等容量のアセトニトリルおよび０．４％水性トリフル酢酸（ｖ／ｖ）を混合して、最終濃度１０ｍｇシナピン酸／ｍＬ溶液を作製することによって調製した、十分な量の溶液中に、計量した量のシナピン酸を溶解することによって調製した。

３．脱イオン水、シナピン酸およびトリフルオロ酢酸は、フルカケミカルズ（ＦｌｕｋａＣｈｅｍｉｃａｌｓ）からであった。アセトニトリルは、ブルディック（Ｂｕｒｄｉｃｋ）およびジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）からであった。

８スポット配座中のＱ１０ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイと、標準のマイクロプレートと同一のフットプリントを有する、１２×８アレイ中でアレイを維持するために使用したＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒｓを、シフェルゲン（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ）より得た。Ｑ１０活性表面は、四級アミン強アニオン交換器である。ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＳｙｓｔｅｍ、Ｓｅｒｉｅｓ４０００ＭａｔｒｉｘＡｓｓｉｓｔｅｄＬａｓｅｒＤｅｓｏｒｐｔｉｏｎＩｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＭＡＬＤＩ）飛行時間質量分析器を使用して、チップ表面に結合したペプチドを解析した。すべてのＣｉｐｈｅｒｇｅｎ産物を、ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｕｍｂａｒｔｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａより得た。

すべての液体輸送、希釈液および洗浄液を、ハミルトン社（ＨａｍｉｌｔｏｎＣｏｍｐａｎｙ）、Ｒｅｎｏ，Ｎｅｖａｄａからの、ＨａｍｉｌｔｏｎＭｉｃｒｏｌａｂＳＴＡＲロボットピペッターによって実施した。

血清試料を室温にて融解し、穏やかにボルテックスすることで混合した。試料を含むバイアルを、ハミルトンピペッター上の２４位試料ホルダー内にロードし、合計９６試料を含む４試料ホルダーをロードした。２つのＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒｓホールディングＱ１０チップ（１９２総スポット）を、ハミルトンピペッターのデッキ上に配置した。１００ｍＭリン酸緩衝液と脱イオン水を含む容器を、ハミルトンピペッター上にロードした。使い捨てピペットチップをまた、器具のデッキ上に配置した。

すべての試料処理は、総合的に自動化した。各試料を、ハミルトンピペッターのデッキ上のマイクロプレートの２つの別々のウェル中で、血清５マイクロリットルを、リン酸緩衝液４５マイクロリットルと混合することによって、２つの別々の分液内に、１から１０希釈した。Ｑ１０チップを、各スポットを、２つのリン酸緩衝液の１５０マイクロリットル分液に暴露することによって活性化した。緩衝液が、各添加後５分間、表面を活性化させた。第二分液を各スポットより吸引した後、希釈血清２５マイクロリットルを各スポットに加え、室温にて３０分間インキュベートした。各試料を、Ｑ１０チップのスポット上に配置した各希釈からの単一分液で２回希釈した。希釈血清の吸引に続いて、各スポットを、リン酸緩衝液１５０マイクロリットルで、および最後に脱イオン水１５０μリットルで４回洗浄した。処理したチップを風乾し、シナピン酸で処理し、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ４０００中でのＭＡＬＤＩ処理を可能にするようにマトリックスを使用した。シナピン酸マトリックス溶液を、それぞれシナピン酸溶液で十分満たされた、９６ウェルマイクロプレートを器具のデッキ上に配置することによって、ハミルトンピペッター上にロードした。９６ヘッドピペッターを使用して、シナピン酸マトリックス１マイクロリットルを、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒ上の各スポットに同時に加えた。１５分間の乾燥期間の後、第二の１マイクロリットル分液を各スポットに加えて、乾燥させた。

Ｄ．混合ビーズ試料プレップのＡｕｔｏＦｌｅｘＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータ獲得
器具の捕獲範囲を、ｍ／ｚ４００から１００，０００に設定した。器具を、２から１７ｋＤａの範囲の質量をカバーしているブルッカーの較正標準を用いて、直線モードにて外部にて較正した。高品質スペクトルを回収するために、捕獲を、レーザーを除いて、ファジー制御にて完全に自動化した。レーザーのファジー制御を、レーザー出力が実験の間、一定のままになるようにとめた。器具は一般的に、固定レーザー出力にて較正するので、精度が、一定のレーザー出力を維持することより利益を受ける。他のファジー制御設定は、２から１０ｋＤａの質量範囲にて、ピークの分解能およびＳ／Ｎを制御した。これらの値は、各捕獲の前に最適化し、試料から試料への、またはスポットからスポットへの失敗した捕獲の数を最小化する一方で、スペクトルの品質を最大化するために選択した。偏向板をまた、低分子量イオン（＜４００ｍ／ｚ）を偏向するためにオンにし、マトリックスイオンでの検出器の飽和と、試料から発生するシグナルの最大化を防止する。さらに、レーザービームが試料表面を介してラスターしたので、各捕獲の前に、５つのワーニングショット（ＬＰ閾値の約５から１０％上）を発射して、任意の過剰なマトリックスを除去した。各分子量スペクトルに対して、６００レーザーショットを、以上で設定した分解およびＳ／Ｎ基準を満たす場合にのみ、一緒に加えた。すべての他の粗悪な品質のスペクトルを無視し、廃棄し、ベースライン補正または平滑化アルゴリズムは、生スペクトルの捕獲の間使用しなかった。

データを保存し、共通のｍ／ｚ軸に変換して、比較を促進し、種々の統計学的ソフトウェアパッケージによって解析可能なポータブルＡＳＣＩＩフォーマットにて出力した。共通のｍ／ｚ軸への変換は、組織内で開発した補間アルゴリズムを用いることによって達成した。

Ｅ．Ｃ８ＭＢ−ＨＩＣのＡｕｔｏＦｌｅｘＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータ捕獲
器具の捕獲範囲を、ｍ／ｚ１０００から２０，０００に設定し、感度および分解能に対して最適化した。すべての他の捕獲パラメーターおよび較正法を、４００レーザーショットを各質量スペクトルに対して一緒に加えたことを除いて、実施例５ｄにて以上で記述したように設定した。Ｆ．Ｑ−１０チップのＣｉｐｈｅｒｇｅｎ４０００ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦデータ捕獲
Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒｓを、質量範囲０から５０，０００Ｄａに対する最適化パラメーターを用いて、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ４０００ＭＡＬＤＩ飛行時間質量分析器上にロードした。データをデジタル化し、５３０捕獲／スポット上で平均化して、イオン電流対質量／電荷（ｍ／ｚ）の単一スペクトルを得た。各スペクトルをサーバーに出力して、続いて捕獲後解析のために、ＡＳＣＩＩファイルとして読み出した。

Ｇ．質量分析データの関心領域解析
質量分析データは、０から５０，０００の質量／電荷値と、これらの相当する強度値からなる。がんおよび非がんデータ組を構築した。がんデータ組は、すべてのがん試料からの質量スペクトルからなり、一方で、非がんデータ組は、正常被験者および良性肺疾患の患者を含む、各非がん試料からの質量スペクトルからなる。がんおよび非がんデータ組を、以下を実施するソフトウェアプログラム内で別々にアップロードした。

ａ）スチューデントｔ−検定を、各記録質量／電荷値にて決定し、ｐ−値を与える。

ｂ）がんおよび非がんスペクトルを、各群に対して１つの代表に平均化する。

ｃ）平均がんスペクトルおよび平均非がんスペクトルの強度の対数比（ＬｏｇＲａｔｉｏ）を決定する。

ＲＯＩｓを、０．０１より小さなｐ−値、および０．１より大きな絶対ＬｏｇＲａｔｉｏを１０以上の連続質量値を有するように特定化し、１８、３６および２６ＲＯＩｓが、それぞれＭＭＢ−ＴＦＡ、ＭＭＢ−ＡｃＮおよびＭＢ−ＨＩＣデータ組にて発見された（表１４ａ−１４ｃ）。さらに、１２４ＲＯＩｓ（＜２０ｋＤａ）が、表１４ｄにて示したＳＥＬＤＩデータにて見られた。表１４ａから１４ｄは、平均質量値を昇順に並べた、本発明のＲＯＩｓを列記している。本表中で提供されたＲＯＩは、計算された間隔に対する平均質量値である（所与の間隔に対する開始および終了質量値の平均）。平均ＲＯＩ質量は今後、単純化のためにＲＯＩと呼ぶ。各試料に対する各ＲＯＩの強度を、ＲＯＣ解析にかけた。各マーカーに対するＡＵＣをまた、以下の表１４ａから１４ｄ中で報告している。以下表１４ａから１４ｃにおいて、計算ＲＯＩが、疾患および非疾患群のＭＳプロファイルの解析から得られた。個々の試料を、３つの異なる方法を用いて処理した。ａ）ＴＦＡ（ｔｆａ）での溶出、およびｂ）アセトニトリル（ａｃｎ）で連続溶出した、ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ｈｉｃ）を用いる混合磁気ビーズアニオン／カチオン交換クロマトグラフィー。各試料調製法を、ＲＯＩを得る目的のために独立して解析した。すべてのスペクトルを、ブルッカーＡｕｔｏＦｌｅｘＭＡＬＤＯ−ＴＯＦ質量分析器で回収した。以下表１４ｄにて、計算ＲＯＩを、疾患および非疾患群のＭＳプロファイルの解析から得た。すべての試料を、Ｑ−１０チップを用いて処理した。すべてのスペクトルを、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ４０００ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器を用いて回収した。

Ｈ．ＲＯＩｓファミリーの同定：ＪＭＰ（商標）統計パッケージ（ＳＡＳインスティテュート社（ＳＡＳＩｎｓｔｉｔｕｔｅＩｎｃ．）、Ｃａｒｙ，ＮＣ）プログラムの他変数解析機能を使用して、非常に相関したＲＯＩｓを同定した。二次元相関係数マトリックスを、ＪＭＰプログラムから抽出し、マイクロソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）Ｅｘｃｅｌによってさらに解析した。各ＲＯＩに対して、相関係数が０．８を超えるＲＯＩｓの組を同定した。これらのＲＯＩｓが一緒に、相関ＲＯＩｓのファミリーになる。表１５は、相関ファミリー、これらの相関メンバーＲＯＩｓ、大コホートでの、メンバーＲＯＩｓに対するＡＵＣ値、およびファミリーの他のメンバーに対する相関係数の平均を示している。したがって、３４４９と３４９４の質量を有するＲＯＩｓが非常に相関しており、本発明の文脈内で、互いに対して代用可能であることが分かる。

判別解析、決定木解析および主成分分析を用いた、バイオマーカーの多変数解析
多変数解析を、免疫アッセイバイオマーカーおよび関心領域上で実施した。すべての異なる解析を、ＪＭＰ統計学的パッケージを用いて実施した。目的を単純化するために、判別解析（ＤＡ）、主成分分析（ＰＣＡ）および決定木（ＤＴ）を一般的に、本明細書で多変数法（ＭＶＭ）と呼ぶ。ＰＣＡにおいて、データ中の総変数の９０％超に相当する、たった最初の１５の主成分が抽出されたということは注目に値する。因子ローディングおよび／または平等分配を使用して、各主成分に最も寄与した１つの因子のみ（バイオマーカー）を抽出した。因子ローディングの平方が、各主成分における各因子の相対的寄与を反映するので、これらの値を、各主成分に最も寄与したマーカーの選別のための基礎として使用した。したがって、最初の１５主成分に最も寄与している１５因子（バイオマーカー）を抽出した。ＤＡにおいて、マーカーを選別する工程を、より多くのマーカーの添加が、分類出力に影響を与えなくなるまで実施した。一般的に、ＤＡは５から８バイオマーカーを使用した。ＤＴｓの場合に、約５つのバイオマーカーを有する６−結節木を構築して、評価した。

バイオマーカーを、既知のブートストラッピングおよびリーブ−ワン−アウトバリデーション法（ＲｉｃｈａｒｄＯ．Ｄｕｄａｅｔａｌ．ＩｎＰａｔｔｅｒｎＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２^ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．４８５，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（２０００））を使用することにより評価した。１０倍トレーニング工程を使用して、定期的に現れる強固なバイオマーカーを同定した。強固なバイオマーカーは、トレーニング組の少なくとも５０％にて出現するマーカーとして定義した。したがって、本発明者らの１０倍トレーニング工程において、５以上の頻度でのバイオマーカーを、さらなる評価のために選別した。以下表１６は、各コホートでの各方法において、定期的に現れるバイオマーカーを要約している。

種々の統計方法を用いたバイオマーカー探索のためのアプローチによって、より広い候補バイオマーカーのレパートリーを提供することによる、異なった利点が提供される（図１）。ＤＡおよびＰＣＡのようないくつかの方法が、正常に分布したデータでよく機能する一方で、対数回帰および決定木のような他の非パラメーター法は、分離した、均一に分散していない、または著しい変動を有するデータでよりよく機能する。マーカーが、集団内で正常に分散していてよく、またはしていなくてもよいため、このようなアプローチは、異なる供給源（質量分析器、免疫アッセイ、臨床歴など）からの（バイオマーカーおよびバイオメトリックパラメーターのような）マーカーが、単一のパネルに統合されることが理想的である。

分割スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＳｃｏｒｅＭｅｔｈｏｄ）（本明細書以下「ＳＳＭ」）
Ａ．改善分割スコア法（ＳＳＭ）
Ｍｏｒｅｔａｌ．（ＰＮＡＳ，１０２（２１）：７６７７（２００５）を参照のこと）によって記述されたスプリットポイントスコアリング法を実行するためのインタラクティブソフトウェアが、マイクロソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）（登録商標）ウィンドウズ（登録商標）下で実行すると記述された。本ソフトウェアは、試料の組に対するマーカー（バイオマーカーおよびバイオメトリックパラメーター）解析の結果を保存するための普通の媒体である、マイクロソフト（登録商標）Ｅｘｃｅｌスプレッドシートを読む。データを、試料の疾患を指定するための領域を有する単一ワークシート上に保存可能であり、１つが疾患試料に対して、他が非疾患試料に対しての、２つのワークシート上に、および１対がトレーニング試料、疾患および非疾患で、他の対がトレーニング試料、疾患および非疾患に対してである、４つのワークシート上に保存可能である。最初の２つの場合、ユーザーは、入力からの無作為に選別したトレーニングおよび試験対を自動的に産出するために、本ソフトウェアを使用してよい。最後の場合、多数のＥｘｃｅｌファイルを、一度に読み出して、単一の履行で解析してよい。

ソフトウェアは、データ上で回収したマーカーすべてのリストを表している。ユーザーは、このリストから解析にて使用すべきマーカーの組を選別する。ソフトウェアが自動的に、疾患および非疾患トレーニングデータ組からの各マーカーに対するスプリット点を計算し、疾患群が非疾患に対して上昇したか、または減少したかどうかを決定する。スプリット点は、各単一マーカーの精度を最大化するために選択する。スプリット点はまた、手動で設定し、調節してよい。

すべての解析において、選択したマーカーの組を用いて、各可能性のある閾値での精度、特異性および感度を、トレーニングおよび試験組両方に対して計算する。多数の結果を産出する解析において、これらの結果を、トレーニング組精度によって順序づける。

３つの様式の解析が利用可能である。最も単純な様式は、選択したマーカーのみを用いて標準の結果を計算する。第二の様式は、選択したリスト中の、価値が最小のマーカーを決定する。多重計算を実施して、それぞれの可能性のあるマーカーのサブセットに対するものを、単一マーカーを除去することによって形成した。最もよい精度を有するサブセットによって、サブセットを作製するために除去したマーカーが、全組中、最小の寄与を作ることが示唆されている。これらの最初の２つのモードに対する結果は、本質的に即時である。最も関与した計算は、選択したマーカーのすべての可能性のある組合せを探索する。２０の最もよい出力が報告されている。この最終選択肢は、多数の候補に関与し得る。したがって、これは計算的に非常に強く、しばしば完了してよい。使用した各追加マーカーは操作時間を倍にした。

およそ２０マーカーに対して、２０の最もよい結果のすべてにおいて見られる、通常６から１０マーカーが存在することがしばしば分かった。次いでこれらは、組からの２から４の他のマーカーと適合する。このことは、診断パネルのためにマーカーを選択することにおいて、自由度が存在し得ることを指摘している。トップ２０の最もよい出力が、精度において、一般的に同様であるが、感度および特異性において、有意に異なってよい。この方法でのマーカーのすべての可能性のある組合せを見ることによって、臨床的に最も有用であり得る組合せの洞察を提供する。

Ｂ．分割加重スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＷｅｉｇｈｔｅｄＳｃｏｒｉｎｇＭｅｔｈｏｄ）（本明細書以下「ＳＷＳＭ」）
本明細書で先に議論したように、本方法は、１つのマーカーの測定を、１つの多くの可能性のあるスコアに変換することに関与する、加重スコアリング法である。これらのスコアは、等式：
スコア＝ＡＵＣ＊因子／（１−特異性）
を用いて誘導される。

マーカーサイトケラチン１９を、具体例として使用可能である。サイトケラチン１９レベルは、小コホート中で、０．４から８９．２ｎｇ／ｍＬの範囲である。解析ソフトウェアを用いて、ＲＯＣ曲線を、がんが陽性であるように、サイトケラチン１９データで産出した。擬陽性率（１−特異性）をｘ−軸にプロットし、真の陽性率（感度）をｙ−軸にプロットし、曲線上の各点に相当するサイトケラチン１９値を含むスプレッドシートを作成した。カットオフ３．３ｎｇ／ｍＬにて、特異性は９０％であり、擬陽性率は１０％であった。このＡＵＣが０．７より大きく、０．８より小さかったので（表２を参照のこと）、このマーカーに対して、３つの因子が任意に与えられた。しかしながら、任意の整数を因子として使用可能である。この場合、数を増やすことで、よりよい臨床性能を示唆している、より高いＡＵＣを有するバイオマーカーとともに使用する。したがって、３．３ｎｇ／ｍＬ以上のサイトケラチン１９を有する個体に対するスコアを計算した。
スコア＝ＡＵＣ＊因子／（１−特異性）
スコア＝０．７０＊３／（１−０．９０）
スコア＝２１
３．３ｎｇ／ｍＬ超のサイトケラチン１９の任意の値に対して、このようにスコア２１を与えた。１．９より大きいが、３．３より小さいサイトケラチン１９の任意の値に対して、スコア８．４を与え、以下同様である（以下の表１７ａを参照のこと）。

特異性レベルが増加するにつれて、スコアの値が増加する。選択した特異性の値を、任意の１つのマーカーに対して調整可能である。任意の１つのマーカーに対して選択した特異性レベルの数を調整可能である。本方法によって、特異性はバイオマーカーのパネルへの寄与を改善することができる。

加重スコアリング法の比較を、上の実施例７Ａで記述した二成分スコアリング法に対して実施した。本実施例において、パネルは、８つの免疫アッセイバイオマーカー、ＣＥＡ、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ｐｒｏＧＲＰおよびＳＣＣからなった。ＡＵＣｓ、因子、選択した特異性レベル、これらの特異性レベルのそれぞれにおけるスコアを、以下表１７ｂ中、各マーカーに対して表で示している。これらの個々のカットオフおよびスコアを用いて、各試料を８つのバイオマーカーに対して表で示した。各試料の総スコアを合計し、ＲＯＣ曲線中にプロットした。本ＲＯＣ曲線を、表１８にて提供された小コホートスプリット点または大コホートスプリット点いずれかでの二成分スコアリング方を用いて産出されたＲＯＣ曲線と比較した（実施例８Ａを参照のこと）。加重スコアリング法、二成分スコアリング法大コホートスプリット点、および二成分スコアリング法小コホートスプリット点に対するＡＵＣ値はそれぞれ、０．７８、０．７６および０．７３であった。ＡＵＣ値によって示唆されたようなパネルの総合性能の改善は別として、加重スコアリング法は、パネルに対して、多数の可能性のあるスコア値を提供する。より多数の可能性のあるパネルスコアの１つの利点は、陽性試験に対して、カットオフを設定するために、より多くの選択肢が存在することである（図５を参照のこと）。８バイオマーカーパネルに適用した二成分スコアリング法は、増分１をともなう、０から８の範囲のパネル出力値を持ち得る（図５を参照のこと）。

スプリット＆スコア法（ＳＳＭ）を用いる、肺がんに対する予測法
Ａ．免疫アッセイバイオマーカーのＳＳＭ
実施例２にて議論したように、いくつかのバイオマーカーを、免疫学的アッセイによって検出した。これらには、サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、ｐｒｏＧＲＰ、サイトケラチン１８、ＣＡ１９−９およびＣＡ１５−３が含まれた。これらのデータを、ＳＳＭを用いて評価した。一緒に示されたこれらのバイオマーカーが臨床利用を制限した。良性肺疾患および肺がんを表している小コホートにおいて、陽性結果として４以上の閾値を有する、８つのバイオマーカーパネルの精度が、１０小コホート試験組にわたり、平均６４．８％精度（ＡＵＣ０．６９）を達成した。正常ならびに良性肺疾患および肺がんを表している、大コホートにおいて、陽性結果として４以上の閾値を有する、８つのバイオマーカーパネルの精度は、１０大コホート試験組にわたり、平均７７．４％精度（ＡＵＣ０．７９）を達成した。

パックイヤーのバイオメトリックパラメーターを含むことが、大体５％分
のこれらのバイオマーカーの予想精度を改善した。したがって、４以上の閾値を陽性結果として有する、８つのバイオマーカーおよび１つのバイオメトリックパラメーターパネルの精度が、１０小コホート試験組にわたり、平均６９．６％精度（ＡＵＣ０．７５）を達成した。

Ｂ．ＲＯＣ／ＡＵＣによって選別されたバイオマーカーおよびバイオメトリックパラメーターのＳＳＭ
推定バイオマーカーを、多変数統計学的方法を用いて同定した、実施例６とは反対に、ＲＯＣ／ＡＵＣ解析が関与する、単純な、非パラメトリー法をこの場合に使用して、推定バイオマーカーを同定した。本方法を適用することによって、許容可能な臨床性能を有する（ＡＵＣ＞０．６）個々のマーカーをさらなる解析のために選択した。トップ１５のバイオマーカーとバイオメトリックパラメーター（ピークイヤー）のみが、選択され、群は、本明細書以下で、１６ＡＵＣ群（小および大）と意味される。

１６ＡＵＣ小コホートマーカーの最適化組合せ（パネル）を、１０のトレーニングサブセットのそれぞれにおいて、ＳＳＭを用いて決定した。この工程は、ＳＳＭを用いて、バイオメトリックパラメーター喫煙歴（パックイヤー）のない状態（表２０ａ）、およびある状態（表２０ｂ）両方で実施した。したがって、（バイオメトリックパラメーターパック−年を除く）１５バイオマーカーまたは１５バイオマーカーと１バイオメトリックパラメーター（パックイヤー）（１６ＡＵＣ）が、分割スコア法に対する入力変数であった。１０トレーニング組のそれぞれに対数する最適パネルを、総精度に基づいて決定した。各パネルを残っている、処理していない試料に対して試験し、性能統計解析を記録した。１０のパネルを次いで比較して、各バイオマーカーの頻度を記録した。処理を、バイオメトリックパックイヤーを含む、および含まない、で２回実施した。これら２つの処理の結果を、以下表２０ａおよび２０ｂにて表している。今一度、５以上の頻度での強固なマーカーを、さらなる考慮のために選択した。処理を、大コホートのために繰り返し、結果を表２０ｃにて示している。表２０ａおよび２０ｂには、ａ）１５ＡＵＣバイオマーカーのみ、およびｂ）１５ＡＵＣバイオマーカーおよびバイオメトリックパラメーターパックイヤーに対するマーカーの頻度を示している小コホートのＳＳＭの結果の部分リストが含まれる。第一の表（２０ａ）において、５つのマーカーのみが、５以上の頻度であることに注意すること。表２０ｂにおいて、７マーカーがこの基準に適合する。表２０ｃは、大コホートのＳＳＭ結果の部分リストを含み、１５ＡＵＣマーカーに対するマーカーの頻度を示している。１１マーカーが、５以上の頻度を有することに注意すること。

Ｃ．ＭＶＭによって選択されたバイオマーカーのＳＳＭ
１つの多変数法の例は、決定木解析である。決定木解析のみを用いて同定されたバイオマーカーを、ひとまとめにして考え、ＳＳＭにて使用した。この群のバイオマーカーは、１６ＡＵＣとして指定されたバイオマーカーの群と同様の臨床利用性を示した。例として、試験組１（１０のうち）は、バイオメトリックパラメーターパックイヤーなしで、０．９０、バイオメトリックパラメーターパックイヤーありで、０．９１（試験）のＡＵＣ（試験）を有する。

ＤＴバイオマーカーを、ＰＣＡおよびＤＡを用いて同定したバイオマーカーと組み合わせて、ＭＶＭ群を産出した。１４ＭＶＭ群を、ＳＳＭを用いて、バイオメトリックパラメーター喫煙歴（パックピーク）あり、またはなしで評価した。もう一度、５以上の頻度を有する強固なマーカーを、さらなる考慮のために選択した（結果は示していない）。以上の表中で分かるように、パックイヤー（喫煙歴）は、強固なマーカーとして出現するバイオマーカーの数および型において効果を有する。このことは、バイオマーカーが他のバイオマーカーにおいて、相乗的または欠損効果を持ち得るので、全く予想されなかったことではない。本発明の１つの態様は、モデルの予想能力を改善することにおいて、パネルとして一緒に機能するマーカーを発見することに関与する。同様の筋にそって、両方の方法（ＡＵＣおよびＭＶＭ）において、バイオメトリックパラメーターパックイヤーと相乗的に機能すると同定されたバイオマーカーを、なんとか統合して、マーカーのよりよいパネルを同定した（実施例８Ｄを参照のこと）。

大コホートに対して同定した多変数マーカーを、ＳＳＭで評価した。再度、５以上の頻度を有するマーカーのみを、さらなる考慮のために選択した。以下の表２１は、大コホートに対するＳＳＭ結果を要約している。

Ｄ．統合マーカーのＳＳＭ（ＡＵＣ＋ＭＶＭ＋パックイヤー）
続く段階において、（１０トレーニング組中）５以上の頻度を有するすべてのマーカー（バイオマーカーおよびバイオメトリックパラメーター）を統合して、両コホートに対する、ＡＵＣおよびＭＶＭ群両方からのマーカーを含むマーカーの第二リストを産出した。ＳＳＭ結果より、５以上の頻度を有する、小コホートから１６の固有マーカー、大コホートから１５の固有マーカーを選択した。以下の表２２は、選択したマーカーを要約している。

マーカーの以上のリストを、ＳＳＭでの最終評価周期を通して得た。先に言及したように、マーカーの組合せを、１０トレーニングサブセットに対して最適化し、各バイオマーカーおよびバイオメトリックパラメーターの頻度を決定した。マーカーがトレーニング組の少なくとも５０％で存在するという選択基準を適用することによって、小コホートに対して１６マーカーのうち１３個を選択し、大コホートに対して１５マーカーのうち９個を選択した。

各マーカーに対して、マーカーのレベルを最適化した時、スプリット点を、各トレーニングデータ組を、分類における最も高い精度に関して評価することによって決定した。小コホートにて使用した８つの最も頻度の高いマーカーに対するスプリット点を以下に列記している。

表２３ｂは、これらの平均（Ａｖｅ）スプリット点（それぞれ所定のカットオフ）を有する８つの最も頻度の高いマーカーのリストを示している。各スプリット点に対する標準偏差もまた含む（Ｓｔｄｅｖ）。スプリット点に関する対照群の位置は、左から第二カラムにて与えられる。例として、サイトケラチン１９において、正常群または対照群（非がん）は、１．８９以下のスプリット点値を有する。

予測モデルの検証
小コホートに対する１３バイオマーカーおよびバイオメトリックパラメーターのリストのサブセット（以上表２３ａを参照のこと）が、良好な臨床利用性を提供する。たとえば、分割スコア法におけるパネルとして一緒に利用する８つの最も頻度の高いバイオマーカーおよびバイオメトリックパラメーターは、試験サブセット１に対して、ＡＵＣ０．９０を有する（以上表２３ｂを参照のこと）。

７−マーカーパネル（マーカー１から７、表２３ｂ）および８−マーカーパネル（マーカー１から８、表２３ｂ）を含む予測モデルを、１０ランダム試験組を用いて検証した。以下表２４ａおよび２４ｂは、２つのモデルの結果を要約している。すべての条件および計算パラメーターは、各モデルにおけるマーカーの数を除いて、両方の場合で同一であった。

表２４ａは、１０タンデム試験組を含む７−マーカーパネルの臨床性能を示している。計算にて使用した７つのマーカーおよび平均スプリット点を表１６ｂにて示した。３の閾値を、疾患群を非疾患群から分けるために使用した。本モデルに対する平均ＡＵＣは０．９０であり、平均精度８３．９％、およびそれぞれ７９．１％および８９．４％の感度および特異性に相当する。

表２４ｂは、１０ランダム試験組を含む８−マーカーパネルの臨床性能を示している。計算にて使用した８つのマーカーおよび平均スプリット点を表１６ｂにて示した。３の閾値（所定の総スコア）を、疾患群を非疾患群から分けるために使用した。本モデルに対する平均ＡＵＣは０．９１であり、平均精度８４．１％、およびそれぞれ９１．５％および７１．５％の感度および特異性に相当する。

表２４ａおよび２４ｂの比較は、両モデルが、ＡＵＣおよび精度に関して同程度であり、感度および特異性においてのみ異なる。表２４ａにおいて見ることができるように、７−マーカーパネルは、より高い特性を示している（８９．４％対７５．１％）。反対に、８−マーカーパネルは、これらの平均値（Ａｖｅ）から判断できるように、よりよい感度を示している（９１．５％対７９．１％）。分類の精度を最大化する閾値（または所定の総スコア）を選択し、ＲＯＣ曲線のＡＵＣを最大化することに類似することに注意すべきである。したがって、３の選択した閾値（所定の総スコア）は、精度を最大化するだけでなく、モデルの感度および特異性間の最もよい比較を提供した。実際、このことが何を意味するかは、正常の個体が、前記個体が本モデルにおける７つの可能性のあるマーカーのうち３つ以下（または第二モデルに関して、８のうち３つ以下）に対して陽性であると試験される場合、肺がんを発症させる低「危険性」であると考えられる。設定閾値（または所定の総スコア）より大きなスコア（総スコア）を有する個体が、より高い危険性であると考えられ、さらなる試験または追跡手順の候補となったことに注意されたい。モデルの閾値（すなわち、所定の総スコア）を、（精度を犠牲にして）このモデルの感度または特異性を最大化するために、増加または減少いずれかが可能である。この柔軟性は、異なる診断上の質問および／または危険性のあるある集団に対処するためにモデルを適合可能である、たとえば正常個体を、症候性および／または無症状個体から差別化可能であるので、都合がよい。

種々の予測モデルを、以下表２５ａおよび２５ｂにて要約している。各予測モデルに対して、１０試験組を介して、これらの相当する標準偏差（角括弧中で開示された）を含む閾値（すなわち所定の総スコア）、平均ＡＵＣ、精度、感度および特異性として、モデルを構成するバイオマーカーおよびバイオメトリックパラメーターを示唆する。以上で概説した８つのマーカーパネルは、混合モデル２であり、以上で概説した７つのマーカーパネルは、混合モデル３である。混合モデル１Ａおよび混合モデル１Ｂは同一のマーカーを含む。混合モデル１Ａと混合モデル１Ｂ間の唯一の差は、閾値（すなわち、所定の総スコア）中である。同様に、混合モデル１０Ａと混合モデル１０Ｂは同一のマーカーを含む。混合モデル１０Ａと混合モデル１０Ｂ間の唯一の差は、閾値（すなわち、所定の総スコア）中である。

同様に、大コホートに対して、種々の予測モデルを、総精度、感度または特異性に対して最適化可能である。４つの可能性のあるモデルを以下表２６にて要約している。

同様に、サイクリンコホート（測定した抗サイクリンＥ２タンパク質抗体および抗サイクリンＥ２ペプチド抗体を有する個体のサブセット）に対する予測モデルを、以下表２７ａおよび２７ｂにて要約している。

同様に、自己抗体アッセイを用いる予測モデルを、以下表２８にて要約している。

これらのモデルの５つを、検証コホートに対して使用した。以下表２９は、独立コホート、小コホートおよび検証コホートに対するそれぞれの予測モデルの臨床性能を様隠している。

バイオマーカー同定
Ａ．ＨＰＬＣ画分化
表２２中のＭＳバイオマーカー候補の同定を得るために、まずプールされた、および／または個々の血清試料を、標準のプロトコールを用いて、逆相ＨＰＬＣによって画分化する必要があった。ゲル電気泳動のため、およびＭＳ解析のために十分な物質を得ることは、いくつかの画分化サイクルを必要とした。個々の画分を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによって特性化し、関心のピークを含む画分を一緒にプールし、スピードバック内で濃縮した。すべての他のバイオマーカー候補を以上で記述したように処理した。

図２は、濃縮前後の推定バイオマーカー（ｐｕｂ１１５９７）を示している。開始試料中の１１ｋＤａでのバイオマーカー候補が非常に低濃度であることに注意すること。濃縮の後、強度がより高いが、試料は解析のために十分な純度ではなく、関心のバイオマーカーを単離するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるさらなる分離を必要とした。

Ｂ．ゲル内消化およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析
濃縮後、候補バイオマーカーを含む画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、候補バイオマーカーに相当する分子量を有する所望のタンパク質／ペプチドを単離した。ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を、製造業者（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ，Ｉｎｃ．））によって提供された標準の方法を用いて実施した。簡単に記すと、手順には、候補バイオマーカーと公知の分子量の標準タンパク質を含む試料を、図３で示したような同一のゲル中、異なるウェル内にロードすることが含まれる。標準タンパク質の遊走距離を、「未知」試料のものと比較することによって、所望の分子量を有するバンドを同定し、ゲルより切り出した。

切り出したゲルバンドを次いで、ＷａｔｅｒｓＭａｓｓＰＲＥＰ（商標）ステーションを用いて、自動化ゲル内トリプシン消化にかけた。続いて、消化した試料をゲルより抽出し、オンライン逆相ＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＣにかけた。産物イオンスペクトルを次いで、データベース検索のために使用した。可能である場合、同定したタンパク質は市販されており、先に記述したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲル内消化にかけた。２つの試料間のゲル電気泳動、ＭＳ／ＭＳ結果およびデータベース検索における良好な一致が、バイオマーカーが正しく同定されたというさらなる証拠であった。図３にて見ることができるように、１１．５ｋＤａでの画分化試料中の市販されているヒト血清アミロイドＡ（ＨＳＡＡ）と推定バイオマーカー間で良好な一致が存在する。ＭＳ／ＭＳ解析およびデータ検索によって、両方の試料が同一のタンパク質であることが確認された。図４は、候補バイオマーカーＰｕｂ１１５９７のＭＳ／ＭＳスペクトルを示している。ｂおよびｙイオンから由来したアミノ酸配列を、各パネルのトップに注釈をつける。バイオマーカー候補を、ヒト血清アミロイドＡ（ＨＳＡＡ）タンパク質の断片として同定した。

消化の影響を受けにくい小候補バイオマーカーを、ＥＳＩ−ｑ−ＴＯＦおよび／またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ断片化、続いてｄｅ−ｎｏｖｏシークエンシングおよびデータベース検索（ＢＬＡＳＴ）にかけて、配列情報とタンパク質ＩＤを得た。

Ｃ．データベース検索およびタンパク質ＩＤ
バイオマーカー候補を完全に特性化するために、そこから由来するタンパク質を同定することが必須であった。未知タンパク質の同定は、ゲル内消化と、続くトリプシン断片のタンデム質量分析が関与した。ＭＳ／ＭＳ処理の結果である産物イオンを、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔタンパク質データベースに対して検索して、供給源タンパク質を同定した。低分子量を有するバイオマーカー候補に対して、タンデム質量分析と、続くｄｅ−ｎｏｖｏシークエンシング、およびデータベース検索が、供給源タンパク質を同定するための選択の方法であった。検索によって、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）ゲノムのみを考慮し、前駆体イオンに対して±１．２Ｄａの質量精度、および産物イオンに対して±０．８Ｄａの質量精度が考慮された（ＭＳ／ＭＳ）。１つの見逃された開裂のみがトリプシンに対して許可された。２つの可変改変のみが、データベース検索に対して許容され、カルバミドメチル化（Ｃ）および酸化（Ｍ）であった。Ｍａｓｃｏｔ検索エンジン結果および関連ＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルの手動解釈を調整した後、最終タンパク質ＩＤを帰した。結果の精度を、反復測定によって検証した。

上記表３０は、これらのタンパク質ＩＤを有する、種々の候補バイオマーカーのタンパク質源を与える。マーカーを、ゲル内消化およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよび／またはｄｅ−ｎｏｖｏシークエンシングによって同定した。観察された断片のアミノ酸配列のみが示されており、平均ＭＷには、示唆した場所でＰＴＭを含むことに注意すること。アクセッション番号を、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースから得、参照のみとして与えた。ＡＣＮ９４５９およびＴＦＡ９１３３は、後者が糖付加部分からシアル酸を欠く（−２９１．３Ｄａ）ことを除いて同一のタンパク質断片であることに注意することが興味深い。ＡＣＮ９４５９およびＴＦＡ９１３３両方が、アポリポタンパク質ＣＩＩＩのバリアントとして同定された。本発明者らの発見は、本タンパク質の発行されている公知の配列および分子量（Ｂｏｎｄａｒｅｎｋｏｅｔａｌ．，Ｊ．ＬｉｐｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ、４０：５４３−５５５（１９９９））と一致している。Ｐｕｂ４７８９は、アルファ−１−抗トリプシンタンパク質として同定された。産物イオンスペクトルの近接実験が、表３０で示唆した部位で、ＫからＥへの置換が存在し得ることを示唆している。質量精度における不確実性が課題を不可能にした。

肺がんの検出
Ａ．ペプチドまたはタンパク質の免疫アッセイ：上記実施例９にて記述したバイオマーカーを、免疫アッセイ技術によって検出および測定可能である。たとえば、アボットダイアグノスティックス（ＡｂｂｏｔｔＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）からのＡｒｃｈｉｔｅｃｔ（商標）免疫アッセイ系を、本発明のバイオマーカーを含むことが予想される試料中、未知の自己アッセイのために使用する。当分野で公知のように、本システムは、抗体でコートした磁気マイクロ粒子を利用し、関心のバイオマーカーに結合可能である。器具制御下、試料の分液を、当量の抗体−コート磁気マイクロ粒子と混合し、緩衝液、塩、界面活性剤および可溶性タンパク質を含む、標本希釈液の容量の２倍と混合した。インキュベーション後、マイクロ粒子を、緩衝液、塩、界面活性剤および保存剤を含む洗浄緩衝液で洗浄した。アクリジニウム標識共役物の分液を、当量の標本希釈液にそって加え、粒子を再分散させた。混合液をインキュベートし、洗浄緩衝液で洗浄した。洗浄した粒子を、硝酸および過酸化水素を含む酸性プレトリガー中に再分散させて、アクリジニウム共役物をマイクロ粒子から分離した。ＮａＯＨの溶液をついで加えて、化学発光反応をトリガーした。光を、光電子増倍管によって測定し、未知の結果は、標準曲線を構築するために使用した公知の量のバイオマーカーペプチドを含む一連の試料によって放射される光との比較によって定量する。次いで標準曲線を使用して、同一の様式で処理した臨床試料中のバイオマーカーの濃度を推測する。結果は、それ自身によって、または以下で記述したような他のマーカーとの組合せで、使用可能である。

Ｂ．ペプチドまたはタンパク質の多重免疫アッセイ：単一試料から本発明の多重バイオマーカーを検出する必要がある場合、多重アッセイを実施することがより経済的であり、簡便である。問題になっている各解析物に対して、一組の特異的抗体が必要であり、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００（商標）解析器上での利用のために、独自に染色したマイクロ粒子が必要である。対の各捕獲抗体は個々に固有マイクロ粒子上にコートする。対の他の抗体を、ｒＰｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎのような蛍光団に共役させる。マイクロ粒子をプールし、約０．０１％ｗ／ｃに相当する、約１０００固有粒子／マイクロタイターの濃度まで希釈する。希釈液には、緩衝液、塩および界面活性剤が含まれる。１０マーカーがパネル中である場合、総固体は、約１０，０００粒子／マイクロタイター、または０．１％固体ｗ／ｖである。共役物をプールし、マイクロ粒子希釈液中各最終濃度約１から１０ｎＭに調整した。アッセイを実施するために、１以上の解析物が含まれることが予想される試料の分液を、インキュベーションンウェル中に配置し、続いて、プールしたマイクロ粒子の半量を配置した。懸濁液を３０分間インキュベートし、プールした共役物溶液の半量を添加した。３０分間のさらなるインキュベーションの後、反応液を、２容量の塩および界面活性剤を含む緩衝化溶液の添加によって希釈した。懸濁液を混合し、試料のおよそ二倍の容量をＬｕｍｉｎｅｘ１００（商標）器具によって解析のために吸引した。場合により、マイクロ粒子を各インキュベーション後に洗浄し、次いで解析のために再懸濁させることができる。各個々の粒子の蛍光を、３波長にて測定し、２つを粒子とこの関連解析物を同定するために使用し、３つ目を、粒子に結合した解析物の量を定量するために使用した。各型の少なくとも１００マイクロ粒子を測定し、各解析物に対する中央値蛍光を計算した。試料中の解析物の量を、公知の量のペプチドまたはタンパク質を含む一連の試料において同様の解析を実施し、公知の濃度に対して公知の試料の中央値蛍光をプロットすることによって産出した標準曲線に対して比較することによって計算する。未知試料を、実施例７でのように、分割スコア法（ＳｐｌｉｔａｎｄＳｃｏｒｅＭｅｔｈｏｄ）または分割加重スコア法（ＳｐｉｌｔａｎｄＷｅｉｇｈｔｅｄＳｃｏｒｅＭｅｔｈｏｄ）のようなモデルを用いる、公知がんまたは非がん標本に関する、解析物（上昇したかまたは弱まったか）の濃度に基づいて、がんであるかまたは非がんであるか分類する。

たとえば、患者を、表１８の８免疫アッセイ（ＩＡ）パネルおよび分割スコア法を用いて、肺がんを有する患者の可能性を決定するために試験してよい。患者より試験試料を得た後、患者の試験試料（すなわち血清）中の８バイオマーカーのそれぞれの量を定量し、バイオマーカーそれぞれの量を次いで、表１８にて列記されたもののような、バイオマーカーに対する相当する所定のスプリット点（所定のカットオフ）と比較する（すなわちサイトケラチン１９に対して使用可能な所定のカットオフは１．８９または２．９である）。この相当する所定のスピリット点（所定のカットオフ）より大きい量を有する各バイオマーカーに対して、スコア１が与えられ得る。この相当する所定のスプリット点（所定のカットオフ）以下である量を有する各バイオマーカーに対して、スコア０が与えられ得る。８バイオマーカーのそれぞれに対するスコアを次いで数学的に（すなわちバイオマーカーのスコアのそれぞれを一緒に加えることによって）統合し、患者に対する総スコアに行き着く。本総スコアがパネルスコアとなる。パネルスコアを、表２５ａの８ＩＡモデルの所定の閾値（所定の総スコア）、すなわち１と比較する。１より大きなパネルスコアが患者に対する陽性結果である。１以下のパネルスコアが、患者に対して陰性結果である。先の集団研究において、本パネルは、特異性３０％、擬陽性率７０％、および感度９０％を示した。患者に対する陽性パネル結果は、擬陽性になる可能性が７０％ある。さらに、９０％の肺がん患者が、陽性パネル結果を持ち得る。したがって、陽性パネル結果を有する患者を、肺がんの示唆または疑念に対するさらなる試験に対して参照し得る。

さらなる例によって、再び８ＩＡパネルおよび分割加重スコア法を用いて、患者より試験試料を得たのち、患者の試験試料（すなわち血清）中の８つのバイオマーカーそれぞれの量を定量し、次いでバイオマーカーのそれぞれの量を、表１７ｂにて列記したスプリット点のような、所定のスプリット点（所定のカットオフ）と比較する（すなわち、サイトケラチン１９のために使用可能な所定のカットオフは、１．２、１．９および３．３である）。本例において、各バイオマーカーは、３つの所定のスプリット点（所定のカットオフ）である。したがって、４つの可能性のあるスコアが、各バイオマーカーに対して与えられ得る。次いで８つのバイオマーカーのそれぞれに対するスコアを、数学的に（すなわちバイオマーカーのスコアのそれぞれを一緒に加えることによって）合わせ、患者に対する総スコアに行き着く。次いで、総スコアがパネルスコアになる。パネルスコアを、１１．２であると計算された、８ＩＡモデルに対する所定の閾値（または所定の総スコア）と比較可能である。１１．２より大きな患者パネルスコアが陽性結果である。１１．２以下の患者パネルスコアが、陰性結果である。先の集団研究において、本パネルが、特異性３４％、擬陽性率６６％および感度９０％を示した。陽性パネル結果が、擬陽性である可能性６６％を有する。さらに９０％の肺がん患者が陽性パネル結果を有する。したがって、陽性パネル結果を有する患者が、肺がんの示唆または疑念のためのさらなる試験のために参照され得る。

Ｃ．免疫質量分光分析：質量分析のための試料調製はまた、免疫学的方法ならびにクロマトグラフィーまたは電位測定法も使用可能である。ペプチドバイオマーカーに対して特異的な抗体でコートされた超常磁性マイクロ粒子を、塩を含む緩衝溶液中、および０．１％ｗ／ｖの濃度まで調整する。患者血清試料の分液を当量の抗体コートマイクロ粒子と混合し、２倍容量の希釈液と混合する。インキュベーションの後、マイクロ粒子を、緩衝塩および場合により塩と界面活性剤を含む洗浄緩衝液で洗浄する。マイクロ粒子を次いで脱イオン水で洗浄する。免疫精製解析物を、トリフルオロ酢酸を含む、当量の水性アセトニトリルを加えることによって、マイクロ粒子から溶出する。ついで試料を当量のシナピン酸マトリックス溶液と混合し、少量（およそ１から３マイクロリットル）を、飛行時間質量解析のために、ＭＡＬＤＩ標的に適用する。所望のｍ／ｚでのイオン電流を、同一の様式で処理した公知の量のペプチドバイオマーカーを含む試料から得たイオン電流と比較する。

イオン電流が、濃度と直接関連すること、および特定のｍ／ｚ値（またはＲＯＩ）でのイオン電流（または強度）を望むのならば濃度に変換可能であることに注意すべきである。そのような濃度または強度を次いで、実施例７で記述した任意のモデル構築アルゴリズムへの入力として使用可能である。

Ｄ．ＲＯＩｓに対する質量分析：血液試料を患者より得、凝血塊を許容して血清試料を形成する。試料をＳＥＬＤＩ質量分光分析のために調製し、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒ中のＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ上にロードし、実施例２にて提供されたように処理する。ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐを、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ４０００ＭＡＬＤＩ飛行時間質量分析上にロードし、実施例３でのように解析する。各スペクトルを、多変数解析を用いて受入に対して試験する。たとえば、（未知試料と公知の参照集団間の）総イオン電流およびスペクトルコントラスト角を計算する。次いでマハラノビスの距離を決定する。マハラノビスの距離が確立された臨界値より小さいスペクトルに対して、スペクトルを定量する。マハラノビスの距離が、確立された臨界値より大きなスペクトルに対して、スペクトルをさらなる解析から排除し、試料を再度実行するべきである。適格後、質量スペクトルを正規化する。

得られる質量スペクトルを、選択したデータ解析モデルに対して適切な関心領域内のイオン電流を測定することによって評価する。解析の結果に基づいて、患者が、肺がんを有する危険性があるか、または高い可能性を有するか判断し、さらなる診断手順を通して解釈すべきである。

分割スコア法の利用のために、表５で与えられたｍ／ｚ値でのＲＯＩｓにおける強度を患者に対して測定する。患者結果を、患者値が、表６で与えられた平均スプリット点値のがん側であるか、または非がん側であるかを注意することによってスコア化する。スコア１が、スプリット点のがん側であると分かった各ＲＯＩ値に与えられる、スコア３およびそれ以上が、患者ががんの危険性が上昇していることを示唆しており、さらなる診断手順が参照されるべきである。

当業者は、本発明が目的を実行し、言及された、末端および有利な点ならびにここで本来そなわっているものを得るために十分適合することを簡単に理解するであろう。本明細書で記述された組成物、処方、方法、手順、処置、分子、特異的化合物が、好ましい実施形態の現在代表であり、例示であり、本発明の目的において制限である意図はない。置換および改変を、本発明の範囲および精神から逸脱することなしに、本明細書で開示された本発明に対して実施してよい。

本明細書で言及されたすべての特許および発行物が、本発明が関連する技術分野の当業者のレベルの示唆である。すべての特許および発行物が、各個々の発行物が参照により組み込まれていると特に、および個々に示唆された場合と同程度に、参照により本明細書で組み込まれる。

Claims

肺がんの疑いのある被験者の診断を補助する方法であり、
a．被験者から得た試験試料において、パネル中の２つ以上のバイオマーカーの量を定量する段階、
ｂ．パネル中の各バイオマーカーの量を前記バイオマーカーに対する所定のカットオフと比較し、および前記比較に基づいて各バイオマーカーに対するスコアを割り当てる段階、
ｃ．段階ｂにおいて決定された各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアを統合して、前記被験者に関する総スコアを見つけ出す段階、
ｄ．段階ｃにて決定された総スコアを、所定の総スコアと比較する段階、ならびに
e．総スコアに基づいて、前記被験者が肺がんの危険性を有するかどうか決定することの補助として、段階ｄにおける比較を用いる段階、
を含む、方法であって、
定量されるバイオマーカーは少なくとも抗−ｐ５３抗体及び抗−ＴＭＰ２１抗体である方法。
被験者から少なくとも１つのバイオメトリックパラメーターを得ることをさらに含む、請求項１の方法。
少なくとも１つのバイオメトリックパラメーターが、被験者の喫煙歴に基づく、請求項２の方法。
少なくとも１つのバイオメトリックパラメーターを、前記バイオメトリックパラメーターのそれぞれに対する所定のカットオフと比較し、および前記比較に基づき各バイオメトリックパラメーターに対してスコアを割り当てる段階をさらに含み、各バイオメトリックパラメーターに対して割り当てられたスコアを、段階ｂにて定量した各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアと統合して、段階ｃでの前記被験者に対する総スコアを見つけ出し、段階ｄで総スコアを所定の総スコアと比較し、および段階eにおいて、総スコアに基づいて、前記被験者が肺がんの危険性を有するかどうかを決定することの補助として、段階ｄにおける比較を用いる、請求項２の方法。
パネルがさらに、抗−ＮＰＣ１Ｌ１Ｃ−ドメイン抗体、抗−ＴＭＯＤ１抗体、抗−ＣＡＭＫ１抗体、抗−ＲＧＳ１抗体、抗−ＰＡＣＳＩＮ１抗体、抗−ＲＣＶ１抗体、抗−ＭＡＰＫＡＰＫ３抗体および少なくとも１つの抗−サイクリンＥ２抗体、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ、ｐｒｏＧＲＰ、ＣＡ１９−９、血清アミロイドＡ、α−１−抗−トリプシン、ヒトアルブミンぺプチド及びアポリポタンパク質ＣＩＩＩからなる群より選択される少なくとも１つのバイオマーカーを含む、請求項１の方法。
バイオメトリックパラメーターが、被験者の喫煙のパックイヤー、年齢、発がん物質への暴露および性別からなる群より選択される、請求項２の方法。
バイオメトリックパラメーターが、喫煙のパックイヤーである、請求項６の方法。
パネルがさらに、少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの抗体、又は少なくとも１つの抗原及び少なくとも１つの抗体の組み合わせを含む請求項１の方法。
少なくとも１つの抗体が、抗−ＮＰＣ１Ｌ１Ｃ−ドメイン抗体、抗−ＴＭＯＤ１抗体、抗−ＣＡＭＫ１抗体、抗−ＲＧＳ１抗体、抗−ＰＡＣＳＩＮ１抗体、抗−ＲＣＶ１抗体、抗−ＭＡＰＫＡＰＫ３抗体および少なくとも１つの抗−サイクリンＥ２抗体からなる群より選択される少なくとも１つの抗体を含む、請求項８の方法。
少なくとも１つの抗原が、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ、ｐｒｏＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−抗−トリプシン、アポリポタンパク質ＣＩＩＩおよびヒトアルブミンペプチドからなる群から選択される少なくとも１つの抗原である、請求項８の方法。
肺がんに関連したバイオマーカーの理想からの距離（ＤｉｓｔａｎｃｅＦｒｏｍＩｄｅａｌ）であるＤＦＩは［（１−感度） ^２＋（１−特異性） ^２］ ^１／２で表され、該ＤＦＩが、０．４未満である、請求項１の方法。
所定のカットオフが、ＲＯＣ曲線に基づく、請求項１の方法。
各バイオマーカーに対するスコアが、バイオマーカーの特異性に基づいて計算される、請求項１の方法。
ａ．抗−ｐ５３抗体を定量するための１つ以上の抗原を含む第１の試薬、
ｂ．抗−ＴＭＰ２１抗体を定量するための１つ以上の抗原を含む第２の試薬、
ｃ．試験試料において、１つ以上の抗原を定量するための、少なくとも１つの抗体を含む試薬であって、前記１つ以上の抗原はサイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、ｐｒｏＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−抗−トリプシンおよびアポリポタンパク質ＣＩＩＩまたはヒトアルブミンペプチドである試薬、及び
ｄ．試験試料において、少なくとも１つの抗体を定量するための、１つまたはそれ以上の抗原を含む試薬であって、前記少なくとも１つの抗体は、抗−ＮＰＣ１Ｌ１Ｃ−ドメイン抗体、抗−ＴＭＯＤ１抗体、抗−ＣＡＭＫ１抗体、抗−ＲＧＳ１抗体、抗−ＰＡＣＳＩＮ１抗体、抗−ＲＣＶ１抗体、抗−ＭＡＰＫＡＰＫ３抗体、または少なくとも１つの抗−サイクリンＥ２抗体である、試薬
を含むキット。
配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチドをさらに含む、請求項１４のキット。