JP6128808B2

JP6128808B2 - 酵素活性の検出、測定方法およびこれを利用したキット

Info

Publication number: JP6128808B2
Application number: JP2012249903A
Authority: JP
Inventors: 敏明阿部; 厚文和田; 幹人大山
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 2011-11-15
Filing date: 2012-11-14
Publication date: 2017-05-17
Anticipated expiration: 2032-11-14
Also published as: JP2013126410A

Description

本発明は、被験物質に含まれる酵素、被験物質から抽出した酵素、被験物質に標識した酵素等の酵素活性を検出、測定することによって被験物質を検出、測定する際に使用する、酵素活性の検出、測定方法およびこれを利用したキットに関する。

近年、医療現場において、時機を逸しない的確な診療行為を実施するために、患者検体を用いた臨床検査の結果が迅速に求められるようになった。そこで、ＰｏｉｎｔｏｆＣａｒｅＴｅｓｔｉｎｇ（ＰＯＣＴ）と呼ばれる簡便な装置や器具を用いる臨床検査法が開発され（特許文献１、特許文献２）医療の現場に供されるようになって来た。

一方、被験物質に含まれる酵素、被験物質から抽出した酵素、被験物質に標識した酵素等の酵素活性（以下、酵素等の活性という。）を指標として患者検体中の被験物質を検出、測定する際には、発色基質等の酵素活性によってシグナルを生じさせる化合物を用いる。この場合、酵素活性による発色基質等のシグナルの発生は継続的に行われ、シグナル量が増加し続けることになる。しかし、忙しい医療現場においては、的確な時間において酵素活性によって生じたシグナル量を判定することは困難であると言わざるを得ない。

そこで、自動分析装置を用いて、一定時間後に自動的に酵素活性を阻害する化合物を分注し、シグナルの発生を停止させることによって、その後の判定までの時間経過に影響を受けずに、精確にシグナル量を判定することが可能となる。しかしながら、たとえ小型であっても、自動分析装置を医療現場に持ち込むことは、費用の増大とともに装置の設置に嵩が張ることは否めない。

それゆえ、酵素等の活性を指標として患者検体中の被験物質を検出、測定する際に、簡便な方法を用いて一定時間後に酵素反応を停止させ、酵素活性による発色基質等のシグナル量を精確に判定出来る技術が望まれている。

特開２００８−８９３８２号公報特表２００９−５２２５５６号公報

忙しい医療現場において、反応開始から一定時間後に酵素活性によるシグナル量の判定、もしくは酵素活性阻害剤の添加を行うことは困難と言わざるを得ない。それゆえ、反応開始から一定時間後に、検査者の手を煩わすことなく、酵素活性による発色基質等のシグナルの発生を停止することが重要な課題となっている。

発明者は、酵素が存在する部位に、その酵素の反応に関与する溶液（反応液）と酵素の活性阻害剤を含む溶液（停止液）を用手法で順次添加することにより、反応液のみが酵素が存在する部位に浸透している間は酵素活性によるシグナルの発生が認められ、停止液が酵素が存在する部位に浸透するとシグナルの発生が停止することが認められることを見出し、発明の完成に至った。

すなわち、反応液を添加した後に停止液を重層して添加することにより、短時間に作業を行うことが可能となる上、酵素が存在する部位に順次到達することによって、シグナルの発生が認められた後にその発生を停止することが可能となった。

さらに、増粘剤を反応液に添加してその粘性度を高めることにより、反応液を添加した後に停止液を重層して添加しても、反応液と停止液の界面は融合することなく、酵素が存在する部位に順次到達し、反応開始から一定時間後に酵素の活性阻害剤により反応を停止することが可能となった。

すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）試料中の被験物質を検出、測定する際に、前記被験物質に関連した酵素の活性を前記酵素に特異的に反応する基質のシグナルの変化で捉える試験方法において、反応溶液と前記酵素の活性阻害剤を含む溶液が、前記酵素の存在部位に順次添加されることを特徴とする、被験物質の検出、測定方法。
（２）前記反応溶液と前記酵素の活性阻害剤を含む溶液が、重層されて前記酵素の存在部位に順次添加されることを特徴とする、（１）記載の被験物質の検出、測定方法。
（３）前記反応溶液が、さらに増粘剤を含むことを特徴とする（１）または（２）記載の被験物質の検出、測定方法。
（４）前記増粘剤が、アルギン酸ナトリウム、カラギーナン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールから選ばれる少なくとも１である、（１）〜（３）記載の被験物質の検出、測定方法。
（５）前記被験物質に関連した酵素が、被験物質に含まれる酵素である、（１）〜（４）記載の被験物質の検出、測定方法。
（６）前記被験物質に関連した酵素が、被験物質から抽出した酵素である、（１）〜（４）記載の被験物質の検出、測定方法。
（７）前記被験物質に関連した酵素が、被験物質に標識した酵素である、（１）〜（４）記載の被験物質の検出、測定方法。
（８）前記基質が、発色基質である、（１）〜（７）記載の被験物質の検出、測定方法。
（９）前記基質が、蛍光基質である、（１）〜（７）記載の被験物質の検出、測定方法。
（１０）前記基質が、発光基質である、（１）〜（７）記載の被験物質の検出、測定方法。
（１１）前記基質が、前記酵素の存在部位にある、（１）〜（１０）記載の被験物質の検出、測定方法。
（１２）前記基質が、前記反応液に含まれる、（１）〜（１０）記載の被験物質の検出、測定方法。
（１３）（１）〜（１２）記載の被験物質の検出、測定方法を用いた、被験物質の検出、測定キット。

本発明を、一例として全血中の白血球数を測定する際に、簡易な測定装置を用いて白血球が有するエステラーゼ活性を測定して、末梢血中の白血球数を間接的に測定する方法で説明するが、本例に限定されることはない。

測定装置として、その筺体内に３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニロシキ）インドールを含浸させた白血球捕捉膜を収容したものを用いる。全血検体を測定装置の上方に開口している添加部に添加する。その後、アルギン酸ナトリウムを含む反応液を測定装置の添加部に添加し、さらにエステラーゼの阻害剤であるクエン酸トリエチルを含む停止液を反応液の上に重層させる。

反応液を添加した後より、赤血球は血漿成分とともに白血球捕捉膜内を移動して添加部近辺より離れる。一方、白血球は添加部近辺に留まり、白血球エステラーゼが溶出することにより、白血球捕捉膜に含まれる３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニロシキ）インドールを加水分解してインドキシルを生成し、このインドキシルが空気中の酸素で酸化され、青色のインジゴを生成する。

ここで、アルギン酸ナトリウムを含む反応液と停止液は混ざらず、停止液はすぐには浸透しない。その結果、青色の発色反応は停止液が白血球捕捉膜に到達するまで続く。停止液が白血球捕捉膜に到達すると、停止液に含まれるクエン酸トリエチルによりエステラーゼによる発色はその時点で停止する。その結果、その後の青色の強さは変化せず、判定時間が多少ずれても同じ結果を得ることが出来る。

酵素活性を指標として用いる試料検体中に含まれる被験物質を検出、測定する場合、精確な結果を得るためには厳格な反応時間や試薬の添加時間が必要となる。しかしながら、本発明の増粘剤を含む反応液と停止液を重層することにより、一定時間の反応が得られた後に反応が停止するため、時間に縛られることなく、精確な結果を得ることが可能となる。

図１は増粘剤としてアルギン酸ナトリウムを用いた反応液添加後５〜２０分の反射率の推移を示す（停止液なし）。（比較例１）図２は増粘剤としてアルギン酸ナトリウムを用いた反応液添加後５〜２０分の反射率の推移を示す（停止液あり）。（実施例１）図３は増粘剤としてカラギーナンを用いた反応液添加後５〜２０分の反射率の推移を示す。（実施例２）図４は増粘剤としてポリビニルピロリドンを用いた反応液添加後５〜２０分の反射率の推移を示す。（実施例３）図５は増粘剤としてポリビニルアルコールを用いた反応液添加後５〜２０分の反射率の推移を示す。（実施例４）

測定装置の筺体内の担体上に酵素反応の部位を設ける。この酵素反応の部位には、担体の孔径による排除、抗原抗体反応等の特異的結合等により被験物質を捕捉する機能を有しており、捕捉された被験物質の量を酵素等の活性を指標として測定する。このとき、筐体に酵素反応の部位の上方に開口している添加部を設けて、その添加部に反応液を添加し、さらに反応液の上に停止液を添加する。このことにより、酵素反応の開始後、一定時間が経過すると、後から添加させた停止液によって反応が停止する。反応の停止後は酵素反応の部位での変化が認められず、精確な判定が出来る。

なお、この測定装置の様式としては、フロースルー式やラテラルフロー式等が例示される。また、試験結果は、目視による測定、検出が可能であるが、より精確な結果を得るために読取装置を用いることもある。

１．増粘剤としてアルギン酸ナトリウムを用いたときの白血球エステラーゼの活性測定
［比較例１］停止液を用いなかったときの白血球エステラーゼの活性測定。
白血球捕捉膜としてグラスファイバー濾紙（ＧＦ／ＤＶＡ：Ｗｈａｔｍａｎ社製）を用い、３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニロキシ）インドールを含浸させて、上方に開口している添加部を有するデバイス内に装着した。

０．０３％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％ショ糖、０．２％エチレンジアミン四酢酸・二ナトリウム、および０．４７５％アルギン酸ナトリウムを含む０．２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．６）作製し、反応液とした。

白血球捕捉膜を装着したデバイスの添加口に、白血球数が１５，０００個／μＬに相当する検体を添加した。検体が白血球捕捉膜に十分浸透した後に、反応液を３滴（約１００μＬ）添加した。

反応液の添加後５分から２０分にかけて、デバイスの添加口から観察できる反応部位を、色差計を用いて６１０ｎｍの反射率を測定した。その結果を図１に示すが、反応液の添加後５分から２０分にかけて、６１０ｎｍの反射率は約１５％に至るまで低下し続けた。すなわち、時間の経過とともにその反射率が低下するため、判定のために反射率を測定する時期に制限が生じる。

［実施例１］停止液を用いた白血球エステラーゼの活性測定
比較例１のデバイスおよび反応液を用い、停止液として、クエン酸トリエチルを用いた。

白血球捕捉膜を装着したデバイスの添加口に、白血球数が５，０００個／μＬ、１０，０００個／μＬ、および１５，０００個／μＬに相当する検体を添加した。検体が白血球捕捉膜に十分浸透した後に、反応液を３滴（約１００μＬ）添加し、その直後に停止液を１滴（約３０μＬ）添加した。

反応液の添加後５分から２０分にかけて、デバイスの添加口から観察できる反応部位を、色差計を用いて６１０ｎｍの反射率を測定した。その結果を図２に示すが、反応液の添加後５分から２０分にかけて、添加した白血球数が５，０００個／μＬ、１０，０００個／μＬ、および１５，０００個／μＬに相当する検体の全てにおいて、６１０ｎｍの反射率の変化は認められず、その濃度に依存して低下していた。

２．増粘剤としてカラギーナンを用いたときの白血球エステラーゼの活性測定
［実施例２］停止液を用いた白血球エステラーゼの活性測定
白血球数が１５，０００個／μＬに相当する検体のみを用い、反応液のアルギン酸ナトリウムを０．１％カラギーナンに替えたことを除き、実施例１と同様の試験を実施した。

反応液の添加後５分から２０分にかけて、デバイスの添加口から観察できる反応部位を、色差計を用いて６１０ｎｍの反射率を測定した。その結果を図３に示すが、反応液の添加後５分から２０分にかけて、６１０ｎｍの反射率の変化は認められなかった。

３．増粘剤としてポリビニルピロリドンを用いたときの白血球エステラーゼの活性測定
［実施例３］停止液を用いた白血球エステラーゼの活性測定
白血球数が１５，０００個／μＬに相当する検体のみを用い、反応液のアルギン酸ナトリウムを１０％ポリビニルピロリドンに替えたことを除き、実施例１と同様の試験を実施した。

反応液の添加後５分から２０分にかけて、デバイスの添加口から観察できる反応部位を、色差計を用いて６１０ｎｍの反射率を測定した。その結果を図４に示すが、反応液の添加後５分から２０分にかけて、６１０ｎｍの反射率の変化は認められなかった。

４．増粘剤としてポリビニルアルコールを用いたときの白血球エステラーゼの活性測定
［実施例４］停止液を用いた白血球エステラーゼの活性測定
白血球数が１５，０００個／μＬに相当する検体のみを用い、反応液のアルギン酸ナトリウムを１５％ポリビニルアルコールに替えたことを除き、実施例１と同様の試験を実施した。

反応液の添加後５分から２０分にかけて、デバイスの添加口から観察できる反応部位を、色差計を用いて６１０ｎｍの反射率を測定した。その結果を図５に示すが、反応液の添加後５分から２０分にかけて、６１０ｎｍの反射率の変化は認められなかった。

以上の結果より、反応液に含まれる増粘剤としてアルギン酸ナトリウム、カラギーナン、ポリビニルピロリドン、およびポリビニルアルコールの何れを用いても、酵素反応の部位に反応液を添加した後に酵素活性阻害剤を含む停止液を添加することにより、一定時間後に酵素反応が停止し、その後の酵素活性によって得られるシグナル量の増加は認められず、判定を行える期間が比較的長いものとなった。

５．増粘剤としてポリビニルピロリドンを用いたときのヘモグロビンＰＯＤ様活性測定
［実施例５］停止液を用いたヘモグロビンＰＯＤ様活性測定
幅４ｍｍ、長さ２５ｍｍのニトロセルロース膜（ミリポア社製）の下端から１５ｍｍの位置に１ｍｇ／ｍＬの抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体１μＬを点着し、乾燥させ、テストストリップとした。

１ｍｇ／ｍＬのヘモグロビンを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬにテストストリップを挿入して展開させた。展開後に、テストストリップの抗体点着部から１ｃｍ手前の部位がデバイスの添加口に当たるように、テストストリップを装着させた。

１０％クメンヒドロペルオキシド−β−シクロデキストリン包接体、１％ＳＬＳ、０．３％２−アミノベンゾチアゾール硫酸塩、０．５％テトラメチルベンチジン、０．１％ポリビニルピロリドンを含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を作製し、反応液とした。また、１％アジ化ナトリウムを作製し、停止液とした。

テストストリップを装着したデバイスの添加口に反応液（３０μＬ）を添加し、その直後に停止液（５０μＬ）を添加した。なお、デバイスの添加口に反応液（３０μＬ）のみを添加し、対照とした。

発色試薬液等を添加した後に抗体点着部の着色を確認した結果を表１に示すが、停止液を添加したものは１分後に青色のラインが現れて、３分後まで呈色は強くならなかった。一方、対照では１分後に強い青色のラインが現れ、２分以降も呈色がさらに強くなった。

以上の結果より、ニトロセルロース膜に固定化した抗体や抗原等の捕捉部で捕捉した酵素活性を測定する場合でも、捕捉部に増粘剤を含む反応液を添加した後に酵素活性阻害剤を含む停止液を添加することにより、一定時間後に酵素反応が停止し、その後の判定を行える期間が延びることが判った。

医療現場において、患者検体中の被験物質を検出、測定する際に、被験物質に関連した酵素の活性を指標として行う場合がある。このとき、精確に被験物質を検出、測定するためには、反応時間を一定に保つ必要があるが、忙しい医療現場では困難となっている。そこで、本発明の技術を用いることにより酵素反応が一定時間後に停止され、それ以降であれば精確な検出、測定が可能となる。

Claims

試料中の被験物質を検出、測定する際に、前記被験物質に関連した酵素の活性を前記酵素に特異的に反応する基質のシグナルの変化で捉える試験方法において、反応溶液が増粘剤を含み、前記反応溶液と前記酵素の活性阻害剤を含む溶液が、重層されて前記酵素の存在部位に順次添加されることを特徴とする、被験物質の検出、測定方法。
前記増粘剤が、アルギン酸ナトリウム、カラギーナン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールから選ばれる少なくとも１である、請求項１記載の被験物質の検出、測定方法。
前記被験物質に関連した酵素が、被験物質に含まれる酵素である、請求項１または２記載の被験物質の検出、測定方法。
前記被験物質に関連した酵素が、被験物質から抽出した酵素である、請求項１または２記載の被験物質の検出、測定方法。
前記被験物質に関連した酵素が、被験物質に標識した酵素である、請求項１または２記載の被験物質の検出、測定方法。
前記基質が、発色基質である、請求項１〜５いずれか１項に記載の被験物質の検出、測定方法。
前記基質が、蛍光基質である、請求項１〜５いずれか１項に記載の被験物質の検出、測定方法。
前記基質が、発光基質である、請求項１〜５いずれか１項に記載の被験物質の検出、測定方法。
前記基質が、前記酵素の存在部位にある、請求項１〜８いずれか１項に記載の被験物質の検出、測定方法。
前記基質が、前記反応溶液に含まれる、請求項１〜８いずれか１項に記載の被験物質の検出、測定方法。
増粘剤を含む反応溶液と、酵素の活性阻害剤を含む溶液と、酵素に特異的に反応する基質とを含む請求項１〜１０いずれか１項に記載の被験物質の検出、測定方法に用いるための被験物質の検出、測定キット。
前記被験物質の検出、測定キットがさらに酵素反応の部位を有する担体を含む請求項１１記載の被験物質の検出、測定キット。
前記基質は、前記担体または前記反応溶液に含まれる請求項１２記載の被験物質の検出、測定キット。