JPH11253193A - クレアチンキナーゼ活性測定用試験片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 広範囲の測定領域で高感度に定量することが
でき、さらに、保存安定性に優れた試験片を提供する。 【解決手段】 少なくとも、デヒドロゲナーゼ、ジアホ
ラーゼ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、水溶性テトラゾリウム及
び担体からなることを特徴とするクレアチンキナーゼ活
性測定用試験片。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中のクレアチ
ンキナーゼ活性を測定するための試験片に関するもので
ある。

【０００２】

【従来の技術】近年、病態の検査、診断を行うための試
薬として、従来から用いられている有機化学試薬に代わ
って、酵素反応を利用した試薬が広く利用されている。
酵素反応を利用した試薬は、酵素が生体中の特定の成分
を特異的に検出可能物質に変換する性質を利用したもの
であり、通常、測定しようとする測定対象物質（Ａ）
を、これに特異的な酵素（ａ）を用いて中間生成物（Ｉ
−１）に変換し、さらにこの中間生成物（Ｉ−１）に特
異的な酵素（ｉ−１）を作用させて中間生成物（Ｉ−
２）に変換するという反応を繰り返して、最終的に検出
可能物質（Ｆ）に変換し、この検出可能物質（Ｆ）を分
光光度計などを用いて又は肉眼等による色調の変化から
定量するものである。

【０００３】

【化１】

【０００４】このような試薬において、検出可能物質
（Ｆ）としては、ＮＡＤやその還元型（ＮＡＤＨ）及び
これらの類縁化合物であるＮＡＤＰやその還元型（ＮＡ
ＤＰＨ）等が広く利用されており（以下、これらの化合
物を総称する場合、ニコチンヌクレオチド類と称す
る）、これらのニコチンヌクレオチド類は紫外部（３４
０ｎｍ付近）で吸光度の変化が認められることから、生
成又は減少したニコチンヌクレオチド類を分光器を用い
て測定する試薬が提案されている。また、生成したＮＡ
ＤＨ又はＮＡＤＰＨにジアホラーゼを作用させること
で、テトラゾリウムをホルマザンに変換させて可視領域
で測定する試薬も数多く報告されている〔例えば、胆汁
酸（特開昭６０−２１４９００号公報、臨床化学第１９
巻、２９０〜２９９頁（１９９０））、トリグリセリド
（特開昭５５−１４８９９号公報）、アルコール（特公
平４−３９４７号公報）、アミラーゼ（特公昭６３−３
７６４０号公報）、クレアチンキナーゼ（特開昭５８−
１６６９９号公報）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（特公平４−７０
０００号公報）、ポリアミン（特公平６−６８４９０号
公報）、グルコース（特公平７−３４７５７号公報）、
ベンジルアミン（特開平７−１８４６９３号公報）〕。
また、クレアチンキナーゼ活性測定用の試験片について
も報告されている（特開昭６３−２８３６００号公報、
特公平６−９５９５９号公報、特開平１−３２０９９９
号公報）。

【０００５】しかし、これらの試薬には、発色試薬とし
てジクロロフェノールインドフェノール（以下、ＤＣＩ
Ｐと略す。）や、テトラゾリウムブルー、ネオテトラゾ
リウムブルー、ＭＴＴ、ＩＮＴ、ニトロテトラゾリウム
ブルーを用いている。上記発色試薬のうちＤＣＩＰはジ
アホラーゼの作用で着色した状態から無色の状態となる
ため、試験片の作製には不適当である。また、その他の
発色試薬として用いられているテトラゾリウムは水に対
する溶解性が低いため、試験片の作成が容易ではなく
（比較例参照）、さらに、試験片の形に加工した場合で
も、十分な測定域を得ることができず、このため測定す
る試料を希釈する等の操作が必要であった（例えば、メ
ディカルテクノロジー誌、１１巻、６号、４９６〜５０
５頁には、クレアチンキナーゼ活性を測定する場合、試
料を９倍に希釈しても１０００ユニット／ｌまでしか活
性を測定できないことが記載されている。）。また、こ
れらの試験片では、被検体である血液や尿等が水性であ
るため、被検体を試験片に直接添加して反射光を測定し
ても、高感度かつ再現性よく活性を測定することが極め
て困難であるという問題点があった。

【０００６】一方、クレアチンキナーゼのような酵素以
外の例では、無機物であるマグネシウムの測定用試験片
に還元系発色剤を用いた例があり、還元系発色剤の例と
してテトラゾリウム塩を挙げているものがあるが（例え
ば、特開平９−２６６７９６号公報、特開平９−２６６
７９７号公報）、例示されているテトラゾリウム塩とし
てはテトラゾリウムバイオレットのみが水溶性の高いテ
トラゾリウム塩であり、他はいずれも水に対する溶解性
が低いものである。また、この試験片では他の代表的な
水溶性テトラゾリウムを発色剤として用いた場合、自発
的な着色がおこることから、試験片に発色試薬として水
溶性テトラゾリウムを使用するのは不適当であるものと
考えられた。

【０００７】本発明は、反射光を測定することで、広範
囲の測定領域で高感度にクレアチンキナーゼ活性を測定
することのできる試験片を提供することを目的とするも
のである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討の結果、試験片には不適当と
考えられた水溶性テトラゾリウムを用いたクレアチンキ
ナーゼ活性測定用試験片を作製することができ、さら
に、該試験片は水溶性テトラゾリウムを用いることによ
り、広範囲の測定領域で高感度で、クレアチンキナーゼ
活性を測定することができるということを見い出し、本
発明に到達した。すなわち、第１の発明は、少なくと
も、デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ又はＮＡ
ＤＰ、水溶性テトラゾリウム及び担体からなることを特
徴とするクレアチンキナーゼ活性測定用試験片を要旨と
するものである。また、第２の発明は、水溶性テトラゾ
リウムが２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニト
ロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２
Ｈ−テトラゾリウム、２−（４−ニトロ，２−メトキシ
フェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，
４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、２，
３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム又は２，
５−ジフェニル−３−（１−ナフチル）−２Ｈ−テトラ
ゾリウムである上記の試験片を要旨とするものである。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられるデヒドロゲナーゼとしては、グルコ
ース６−リン酸に特異的に作用するデヒドロゲナーゼで
あれば特に限定はなく、例えば、グルコース６−リン酸
デヒドロゲナーゼが挙げられる。その供給源となる生物
種等は特に限定されるものではなく、例えば、乳酸菌や
ザイモモナス属等の微生物由来のもの等が挙げられる。

【００１０】本発明に用いられる水溶性テトラゾリウム
としては、水に対する溶解度が５ｍＭ以上であり、かつ
ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの存在下、ジアホラーゼの作用
により、還元されて発色するものであれば特に限定され
るものではなく、例えば、２−（４−ヨードフェニル）
−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスル
ホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、２−（４−ニト
ロ，２−メトキシフェニル）−３−（４−ニトロフェニ
ル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テト
ラゾリウム、２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラ
ゾリウム又は２，５−ジフェニル−３−（１−ナフチ
ル）−２Ｈ−テトラゾリウム、２−（４−ヨードフェニ
ル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，
４−ジスルホフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム、２−
（２−メトキシ，４−カルボキシフェニル）−３−ベン
ゾチアジル−５−（４−スルフォエチルアミノカルボニ
ルフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、３，３’−
［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−
４，４’−ジイル］−ビス［２−ベンゾチアジル−４−
（４−ジスルフォエチルアミノカルボニルフェニル）−
テトラゾリウム］等が挙げられる。これらの水溶性テト
ラゾリウムは、それぞれＷＳＴ−１、ＷＳＴ−８、テト
ラゾリウム・レッド（以下、ＴＲと略す。）、テトラゾ
リウム・バイオレット（以下、ＴＶと略す。）、ＷＳＴ
−３、ＷＳＴ−４、ＷＳＴ−５という商品名で、同人化
学研究所又はシグマ・アルドリッチ社から市販もしくは
サンプル供給されている。これらの水溶性テトラゾリウ
ムの中でもＷＳＴ−１、ＷＳＴ−８、ＴＲ、ＴＶは試験
片に均一に固定することができるので好ましい。また、
ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−８、ＴＲは溶液や溶媒に容易に溶
解し、さらに、試験片上に十分な量保持させることがで
きるので特に好ましい。以下に、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−
８、ＴＲ、ＴＶの構造式を示す。

【００１１】

【化２】

【００１２】

【化３】

【００１３】

【化４】

【００１４】

【化５】

【００１５】本発明に用いられるにジアホラーゼとして
は、上述の反応を触媒するものであれば、その供給源と
なる生物種等は特に限定されるものではなく、例えば、
バチルス・ステアロサーモフィルス、クロストリジウム
・クルイベリ等の微生物由来のものや、ブタ心臓由来の
もの等が挙げられる。なかでも、好熱性微生物由来のジ
アホラーゼは保存安定性に優れていることから好まし
く、具体的には、バチルス・ステアロサーモフィルス由
来のジアホラーゼを用いることが好ましい。

【００１６】また、本発明に用いられるジアホラーゼと
しては、クレアチンキナーゼ活性測定の精度を向上させ
るために、下式で算出されるテトラゾリウムと還元型ニ
コチンヌクレオチド（ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ）からホ
ルマザンと酸化型ニコチンヌクレオチド（ＮＡＤ又はＮ
ＡＤＰ）への方向の反応平衡定数（Ｋ値）が１以上、好
ましくは１０以上、さらに好ましくは１００以上のもの
を用いることが好ましく、例えば、バチルス・ステアロ
サーモフィルス由来のジアホラーゼＩ又はジアホラーゼ
IIを用いることが好ましい。

【００１７】

【化６】

【００１８】これらの成分は、クレアチンキナーゼの関
与する反応からホルマザンへの酵素反応が７０％以上、
好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上進
行するように配合することが好ましく、ジアホラーゼと
しては、０．１〜１００万ユニット／ｌ、好ましくは
０．１〜１万ユニット／ｌ、さらに好ましくは１〜１０
００ユニット／ｌの濃度の酵素液を試験片１００ｃｍ²
当り０．１〜１万μｌ、好ましくは１〜１０００μｌ、
さらに好ましくは１〜１００μｌ含有させればよい。ま
た、デヒドロゲナーゼとしては、ジアホラーゼの濃度と
同じ程度でよい。ＮＡＤ又はＮＡＤＰとしては、０．０
０１ｎＭ〜２００ｍＭ、さらに好ましくは０．１ｎＭ〜
５０ｍＭの溶液を、試験片１００ｃｍ² 当り０．１〜１
万μｌ、好ましくは１〜１０００μｌ、さらに好ましく
は１〜１００μｌ含有させればよい。

【００１９】水溶性テトラゾリウムの量としては、試験
片１００ｃｍ² 当り０．０１〜５００ｍｇ、好ましくは
０．１〜１００ｍｇ、さらに好ましくは０．１〜５０ｍ
ｇ含有させればよい。このとき、水溶性テトラゾリウム
の量が少なすぎると発色が低くなり、過剰であると不溶
性となって精度低下をきたすことがあるので好ましくな
い。

【００２０】具体的に、クレアチンキナーゼ活性を測定
する場合には、例えば以下の反応式（１）に従ってクレ
アチンキナーゼ活性が測定できるように酵素類や基質類
を含有させればよい。

【００２１】

【化７】

【００２２】本発明の試験片は、少なくとも、酵素類と
してはデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、基質類として
はＮＡＤ又はＮＡＤＰ、水溶性テトラゾリウムを含むも
のであるので、他の酵素類であるヘキソキナーゼ又はグ
ルコキナーゼや、他の基質類であるクレアチンリン酸、
グルコース、ＡＤＰは必要に応じて含めさせればよい。
また、上記酵素類、基質類以外のものとして、必要に応
じて、アスコルビン酸オキシダーゼ、Ｎ−アセチルシス
テイン、マグネシウムイオン等を共存させてもよい。

【００２３】本発明の試験片に上記の酵素類、基質類等
を含める場合、試験片を構成する担体に必要な酵素類、
基質類等をすべて含浸させればよい。含浸させる際、試
験片を構成する担体の同じ部分にすべての必要な酵素
類、基質類等を含浸させてもよく、また、必要な酵素
類、基質類等のうちの一部を試験片を構成する担体の一
部分に含浸させ、残りの必要な酵素類、基質類等を試験
片を構成する担体の他の部分に分けて含浸させてもよ
い。

【００２４】上記の酵素類、基質類等のうち、保存時の
安定性の点からＮ−アセチルシステインと水溶性テトラ
ゾリウムとは試験片を構成する担体の異なる部分に含浸
させる方が好ましい場合がある。また、デヒドロゲナー
ゼとしてグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用
いる際、同様の理由でグルコースとグルコース−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼとは担体の異なる部分に含浸させ
る方が好ましい場合がある。さらに、マグネシウムイオ
ンとデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤとクレアチンリン酸も同
様の理由でそれぞれ担体の異なる部分に含浸させる方が
好ましい場合がある。

【００２５】この場合、試験片に共存させる各酵素の濃
度としては、ジアホラーゼの濃度と同じ範囲でよい。ま
た、ＮＡＤ又はＮＡＤＰやＡＤＰ等の基質類の濃度とし
ては、０．１〜１００ｍＭ、好ましくは０．１〜２０ｍ
Ｍの範囲の溶液を、試験片１００ｃｍ² 当り０．１〜１
万μｌ、好ましくは１〜１０００μｌ、さらに好ましく
は１〜１００μｌ含有させればよい。

【００２６】本発明においては、ｐＨを調整するための
緩衝剤、活性化剤、安定化剤、増粘剤その他添加剤を試
験片に含有させてもよい。緩衝剤としては、リン酸カリ
ウム、イミダゾール等が挙げられ、項目によっては、２
−モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビ
ス−（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスル
ホン酸（ＢＥＳ）等のグッド緩衝液が挙げられる。

【００２７】活性化剤としては、例えばトリトンＸ−１
００、ツイン２０等のノニオン系又はアニオン系、カチ
オン系の界面活性剤が用いられる。このような活性化剤
は、試験片の保存安定性やブランク値の低下に寄与す
る。これらの活性化剤の濃度としては、０．００１〜２
０％、好ましくは０．０１〜５％の溶液を、試験片１０
０ｃｍ² 当り０．１〜１万μｌ、好ましくは１〜１００
０μｌ、さらに好ましくは１〜１００μｌ含有させれば
よい。

【００２８】また、安定化剤としては、例えばウシ血清
アルブミン等のタンパク質やマルトース、グルコース、
スクロース等の糖類、ポリエチレングリコール等の高分
子化合物、マグネシウム、カリウム、カルシウム等の金
属イオンが用いられる。また金属イオンは酵素の活性化
剤としても働く。さらに、エチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）、エチレングリコール（β−アミノエチルエー
テル）四酢酸（ＥＧＴＡ）等を用いることもできる。こ
れらの安定化剤の濃度としては、糖は０．１〜５０重量
％、好ましくは１〜２５重量％の範囲、タンパク質は
０．００１〜５０重量％、好ましくは０．１〜２５重量
％の範囲、金属イオンは０．００１〜１０ｍＭ、好まし
くは０．１〜１０ｍＭの範囲、ＥＤＴＡやＥＧＴＡは
０．００１〜１０ｍＭ、好ましくは０．１〜２ｍＭの範
囲の溶液を、試験片１００ｃｍ² 当り０．１〜１万μ
ｌ、好ましくは１〜１０００μｌ、さらに好ましくは１
〜１００μｌ含有させればよい。

【００２９】本発明の試験片に上記の活性化剤、安定化
剤等の添加剤を含有させる場合、必要な酵素類、基質類
等と共に添加剤を、試験片を構成する担体に含浸させれ
ばよい。含浸させる際、すべての必要な酵素類、基質
類、添加剤等を、試験片を構成する担体の同じ部分に含
浸させてもよく、また、必要な酵素類、基質類、添加剤
等のうちの一部を試験片を構成する担体の一部分に含浸
させ、残りの必要な酵素類、基質類、添加剤等を試験片
を構成する担体の他の部分に分けて含浸させてもよい。

【００３０】また、本発明の試験片にＥＤＴＡを含有さ
せる際、他にクレアチンリン酸又はＮ−アセチルシステ
インも含有させるのであれば、保存時の安定性の点か
ら、ＥＤＴＡとクレアチンリン酸又はＮ−アセチルシス
テインとは試験片を構成する担体の異なる部分に含浸さ
せる方が好ましい場合がある。

【００３１】本発明の試験片に用いられる担体として
は、高分子素材からなる公知の担体を用いることがで
き、具体的には、天然繊維や合成繊維からなる抄紙や不
織布、メンブレンフィルター等が挙げられる。メンブレ
ンフィルターとしては、孔径が０．１〜０．５ミクロン
程度のニトロセルロース系の膜、酢酸セルロース系の膜
やポリビニルアルコール系の膜等が挙げられる。

【００３２】本発明の試験片は、例えば、次のようにし
て作製すればよい。すなわち、上記の成分を水や緩衝液
等に溶解して担体に含浸させた後、凍結乾燥等によって
担体の水分を十分に除くことにより作製することができ
る。

【００３３】このようにして作製した試験片は、小片に
カットして用いることもできるし、また、別の担体上に
貼付してカセットのような形状にして用いることもでき
る。さらに、パッド上に加工することも可能である。

【００３４】本発明の試験片の被検体は、特に限定され
るものではない。生体成分中のクレアチンキナーゼ活性
を測定する際には、検体として血液、血漿、血清、尿等
の生体試料を用いればよい。

【００３５】本発明の試験片を用いて生体成分中のクレ
アチンキナーゼ活性を測定するには、例えば以下のよう
にして行うことができる。すなわち、（１）測定対象物
質を含む検体の一定量を試験片上へ滴下する。（２）検
体滴下から一定時間経過した後、十分に検体が試験片に
染み込むことを確認し、適当な反射光測定装置を用い
て、一定の波長の光を照射し、反射強度を測定する。
（３）標準となる量の測定対象物質を同様に測定して検
量線を作成し、この検量線から検体中の測定対象物質の
濃度を算出する。

【００３６】

【実施例】次に、本発明を実施例によって具体的に説明
する。本発明で使用したバチルス・ステアロサーモフィ
ルス由来のジアホラーゼＩ（製品番号１００４３６）、
ＩＩ（製品番号１００４３７）及びグルコキナーゼ（製
品番号１２０３８７）は生化学工業社より購入した。ク
ロストリジウム・クルイベリ由来のジアホラーゼ（製品
番号Ｄ５５４０）及びブタ心臓由来のジアホラーゼ（製
品番号Ｄ３７５２）はシグマ社より購入した。

【００３７】ヘキソキナーゼ（製品番号１４２６３６
２）、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下、
Ｇ６ＰＤＨと略す、製品番号７３７２０８）、クレアチ
ンキナーゼ（製品番号１２６９６９）はベーリンガー・
マンハイム社より購入した。それぞれの酵素活性は、購
入時の添付書又はラベルに記載してある値をそのまま用
いた。

【００３８】テトラゾリウムブルー（以下、ＴＢと略
す、製品番号１８７１−２２−３）、ネオテトラゾリウ
ムブルー（以下、ＮｅｏＴＢと略す、製品番号２９８−
９５−３）、ＭＴＴ（製品番号２３４８−７１−２）、
ＩＮＴ（製品番号１４６−６８−９）、ニトロテトラゾ
リウムブルー（以下、ＮＴＢと略す、製品番号２９８−
８３−９）、ＷＳＴ−１（製品番号１５０８４９−５２
−８）は同仁化学研究所社より購入した。ＷＳＴ−８は
同仁化学研究所からサンプルとして入手した。ニトロブ
ルーテトラゾリウム（以下、ＮＢＴと略す、製品番号Ｎ
６８７６）、ＴＶ（製品番号Ｔ０１７４）、ＴＲ（製品
番号Ｔ８４８５９）はシグマ・アルドリッチ社より購入
した。セルロース粉末（製品番号０７５−４１）はナカ
ライテスク社より購入した。その他の試薬は市販の特級
を用いた。

【００３９】参考例１５００ｍＭのイミダゾール緩衝液
（ｐＨ６．７）に、最終濃度で５０ｍＭのＷＳＴ−８と
クロストリジウム・クルイベリ由来のジアホラーゼ１０
ユニット／ｍｌとを含む溶液を調製し、この溶液をペリ
スタリックポンプを用いて５ｍｍ幅のポリウレタン製フ
ィルム上に約１ｃｍ間隔で１滴（約２０μｌ）ずつ滴下
した。このフィルムを、約５０℃の熱風乾燥ゾーンを通
過させて（通過時間約２分）乾燥した後、滴下した箇所
を中心として５×５ｍｍの大きさに切断して試験片を得
た。この試験片を３×３ｍｍの大きさの窓をあけた型枠
基板に両端で接着した。

【００４０】得られた試験片に所定の濃度のＮＡＤＨを
含む水溶液２μｌを滴下し、５分後に色彩色差計（ミノ
ルタ社製、ＣＲ−２００）を用いて５５０ｎｍの反射率
を測定した。その結果を図１に示す。図１はＮＡＤＨ濃
度と反射率の関係を示す図である。この図から、上記の
試験片を用いることにより、ＮＡＤＨを反射率から正確
に定量できることがわかる。また、この結果より、明細
書中に記載したような各種デヒドロゲナーゼを共存させ
た試験片を作製することで、任意の被測定物質の定量が
可能であることがわかる。

【００４１】実施例１ 以下のようにしてクレアチンキナーゼ定量用試験片を作
製した。すなわち、１００ｍＭのイミダゾール酢酸緩衝
液（ｐＨ６．７）に、最終濃度で３０ｍＭのクレアチン
リン酸、５０ｍＭのグルコース、５ｍＭのＮＡＤ、５ｍ
ＭのＡＤＰ、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのＥ
ＤＴＡ−２Ｎａ、２５ｍＭのＮＡＣ、４重量％のＷＳＴ
−１を溶解した。この溶液約３５０μｌに約３００００
Ｕ／ｍｌのブタ心臓由来のジアホラーゼ溶液２μｌと１
６５０ユニット／ｍｌのＧ６ＰＤＨ１０μｌ、３６００
ユニット／ｍｌのヘキソキナーゼ１μｌを添加した。こ
の溶液をピペットマンを用いて、ポリエチレンテレフタ
レート膜上に滴下し、風乾後、ビニルピロリドン酢酸ビ
ニルコポリマー（重量比で２０：８０）の１容量％メタ
ノールを塗布し、速やかにセルロース粉末を５０容量％
メタノールに懸濁し、小量塗布した。これを４０〜５０
℃で乾燥してポリエチレンテレフタレート支持膜の試験
片を得た。この試験片にクレアチンキナーゼの溶液を５
μｌ滴下し、３０秒ごとに反射率を測定した。

【００４２】ＷＳＴ−８に代えてＷＳＴ−１を用いた以
外は参考例１と同様にしてＮＡＤＨ濃度と反射率の関係
を示す検量線を作成し、この検量線を用いて、反射率よ
り、単位時間当りのＮＡＤＨに相当する変化量を計算し
た。その結果を図２に示す。図２は、クレアチンキナー
ゼの活性測定の結果を示す図であり、縦軸にＮＡＤＨに
相当する変化量を、横軸にクレアチンキナーゼ活性を示
している。この図から、本発明の試験片を用いることに
より少なくとも３０００ユニット／ｌのクレアチンキナ
ーゼの定量が可能であることがわかる。

【００４３】実施例２ 以下のようにしてクレアチンキナーゼ定量用試験片を作
製した。すなわち、１００ｍＭのイミダゾール酢酸緩衝
液（ｐＨ６．７）に、最終濃度で３０ｍＭのクレアチン
リン酸、５０ｍＭのグルコース、２０ｍＭのＮＡＤ、１
０ｍＭのＡＤＰ、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭ
のＥＤＴＡ−２Ｎａ、２５ｍＭのＮＡＣ、５重量％のＴ
Ｒを溶解した。この溶液約３５０μｌに約３００００ユ
ニット／ｍｌのバチルス・ステアロサーモフィルス由来
のジアホラーゼＩ溶液２μｌと１６５０ユニット／ｍｌ
のＧ６ＰＤＨ１０μｌ、２５００ユニット／ｍｌのグル
コキナーゼ２μｌを添加した。この溶液をアドバンテッ
ク社製のポリフロン濾紙（ＰＦ０５０）の３×３ｍｍの
小片にピペットマンを用いて２μｌ滴下し、凍結乾燥し
て試験片を得た。この試験片を台紙に両面テープで張り
つけた。この試験片にクレアチンキナーゼの溶液を５μ
ｌ滴下し、１５秒毎に反射率を測定した。

【００４４】ＷＳＴ−８に代えてＴＲを用いた以外は参
考例１と同様にしてＮＡＤＨ濃度と反射率の関係を示す
検量線を作成し、この検量線を用いて、反射率より、単
位時間当りのＮＡＤＨに相当する変化量を計算した。ま
た、この試験片（クレアチンキナーゼの希釈液を滴下す
る前のもの）にアルミホイルを巻いて、３７℃のドライ
オーブン中に１か月間放置した後、同様にしてクレアチ
ンキナーゼの濃度と、単位時間当たりのＮＡＤＨに相当
する変化量の関係を調べた。その結果を図３に示す。図
３は、作製直後及び１か月放置後の試験片を用いてクレ
アチンキナーゼの活性を測定した結果を示す図であり、
図３中の●は、作製後すぐにクレアチンキナーゼを滴下
したときの結果を、○は１か月間放置した後に測定した
ときの結果を示している。図３から、本発明の試験片を
用いることにより少なくとも３０００ユニット／ｌのク
レアチンキナーゼの定量が可能であることがわかる。ま
た、本発明の試験片は保存安定性に優れていることがわ
かる。

【００４５】参考例２〜５、比較例１〜６ １００ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ６．７）に、最
終濃度で３０ｍＭの表１に示す各テトラゾリウムとバチ
ルス・ステアロサーモフィルス由来のジアホラーゼII１
０ユニット／ｍｌを含む溶液を調製し、これを直径６ｍ
ｍのワットマン社製のろ紙（Ｎｏ．２）に３μｌ滴下
し、乾燥させて試験片を作製した。この試験片に、５ｍ
ＭのＮＡＤＨ溶液に浸した直径８ｍｍのペーパーディス
ク（アドバンテック社製、製品番号４９００５０１０）
を水平にすばやく接触させ、およそ１分後の試験片の発
色の状態を目視により観察した。その結果を表１に示
す。

【００４６】

【表１】

【００４７】表１から明らかなように、水溶性テトラゾ
リウムであるＷＳＴ−１、ＷＳＴ−８、ＴＲ、ＴＶを用
いた場合には、色素が試験片に均一に固定化されている
ことがわかる。また、試験片の作製の容易さの点では、
参考例の試験片の方が比較例の試験片より容易であっ
た。

【００４８】実施例３ 以下のようにしてクレアチンキナーゼ定量用試験片を作
製した。すなわち、１５０ｍＭのイミダゾール酢酸緩衝
液（ｐＨ６．６）に、最終濃度で２５ｍＭのクレアチン
リン酸、２５ｍＭのグルコース、２ｍＭのＮＡＤＰ、２
ｍＭのＡＤＰ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのＥ
ＤＴＡ−２Ｋ、３０ｍＭのＮＡＣ、１２重量％のツイン
２０、１重量％のＷＳＴ−１を溶解した。この溶液約３
５０μｌにバチルス・ステアロサーモフィルス由来のジ
アホラーゼＩ溶液、Ｇ６ＰＤＨ、グルコキナーゼを、最
終濃度がそれぞれ約５００ユニット／ｍｌ、１０ユニッ
ト／ｍｌ、１０ユニット／ｍｌとなるように添加した。
この溶液を直径６ｍｍのアドバンテック社製の酢酸セル
ロース膜（製品番号Ａ０４５Ａ０９０Ｃ）にピペットマ
ンを用いて２μｌ滴下し、凍結乾燥させて試験片を作製
した。この試験片に、約３０００ユニット／ｌのクレア
チンキナーゼの溶液に浸した直径８ｍｍのペーパーディ
スク（アドバンテック社製、製品番号４９００５０１
０）を水平にすばやく接触させ、以下のごとく経時的に
反射率を測定し、クレアチンキナーゼの活性値を測定し
た。

【００４９】ＷＳＴ−８に代えてＷＳＴ−１を用いた以
外は参考例１と同様にしてＮＡＤＨ濃度と反射率の関係
を示す検量線を作成し、この検量線を用いて、反射率よ
り、単位時間当りのＮＡＤＨに相当する変化量の関係を
調べ、クレアチンキナーゼの活性値を計算した。測定は
４度行い、その再現性を確認した。測定の結果、クレア
チンキナーゼの活性値は３１７６±０ユニット／ｌであ
った。

【００５０】実施例４ ＷＳＴ−１に代えてＷＳＴ−８を用いた以外は実施例３
と同様にしてクレアチンキナーゼの活性値を計算し、そ
の再現性を確認した。測定の結果、クレアチンキナーゼ
の活性値は２９４８±６１ユニット／ｌであった。

【００５１】実施例５ ＷＳＴ−１に代えてＴＲを用いた以外は実施例３と同様
にしてクレアチンキナーゼの活性値を計算し、その再現
性を確認した。測定の結果、クレアチンキナーゼの活性
値は２９０６±１０９ユニット／ｌであった。

【００５２】実施例６ ＷＳＴ−１に代えてＴＶを用いた以外は実施例３と同様
にしてクレアチンキナーゼの活性値を計算し、その再現
性を確認した。測定の結果、クレアチンキナーゼの活性
値は２９４８±６１ユニット／ｌであった。

【００５３】比較例７ ＷＳＴ−１に代えてＴＢを用いた以外は実施例３と同様
にしてクレアチンキナーゼの活性値を計算し、その再現
性を確認した。その結果、試薬に沈殿が生じて試験片を
作製することができなかった。

【００５４】比較例８ ＷＳＴ−１に代えてＮｅｏＴＢを用いた以外は実施例３
と同様にしてクレアチンキナーゼの活性値を計算し、そ
の再現性を確認した。測定の結果、クレアチンキナーゼ
の活性値は１６２３±５２４ユニット／ｌであり、測定
値のバラツキが大きかった。また、試験片の発色の状態
を目視により観察すると、ムラになっていた。

【００５５】比較例９ ＷＳＴ−１に代えてＩＮＴを用いた以外は実施例３と同
様にしてクレアチンキナーゼの活性値を計算し、その再
現性を確認した。測定の結果、クレアチンキナーゼの活
性値は１５１４±４６ユニット／ｌであり、測定値のバ
ラツキが大きかった。また、試験片の発色の状態を目視
により観察すると、着色が非常に薄く、かつムラになっ
ていた。

【００５６】比較例１０ ＷＳＴ−１に代えてＮＴＢを用いた以外は実施例３と同
様にしてクレアチンキナーゼの活性値を計算し、その再
現性を確認した。その結果、試薬に沈殿が生じて試験片
を作製することができなかった。

【００５７】比較例１１ ＷＳＴ−１に代えてＮＢＴを用いた以外は実施例３と同
様にしてクレアチンキナーゼの活性値を計算し、その再
現性を確認した。その結果、試薬に沈殿が生じて試験片
を作製することができなかった。

【００５８】比較例１２ ＷＳＴ−１に代えてＭＴＴを用いた以外は実施例３と同
様にしてクレアチンキナーゼの活性値を計算し、その再
現性を確認した。その結果、測定値のバラツキが非常に
大きく測定することができなかった。また、試験片の発
色の状態を目視により観察すると、ムラになっていた。

【００５９】実施例３〜実施例６、比較例７〜比較例１
２の結果より、水溶性テトラゾリウムを用いた本発明の
試験片ではクレアチンキナーゼの活性を測定することが
できたのに対して、他のテトラゾリウムを用いた場合で
は、試薬に沈殿が生じ、試験片を作製することができな
かったり、また、試験片を作製できても、反応が阻害さ
れるか、発色のムラが大きく、クレアチンキナーゼの活
性を測定することができないものであった。また、試験
片の作製の容易さの点では、本発明の試験片の方が比較
例の試験片より容易であった。

【００６０】

【発明の効果】本発明の試験片は、広範囲の測定領域で
測定することができる。また、本発明の試験片は保存安
定性に優れている。

【図面の簡単な説明】

【図１】テトラゾリウムとしてＷＳＴ−８を添加した試
験片を用いてＮＡＤＨの濃度を測定したときのＮＡＤＨ
濃度と反射率の関係を示す図である。

【図２】本発明の試験片を用いてクレアチンキナーゼの
活性を測定したときの結果を示す図である。

【図３】作製直後及び１か月放置後の試験片を用いてク
レアチンキナーゼの活性を測定したときの結果を示す図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 近藤 仁司 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも、デヒドロゲナーゼ、ジアホ
   ラーゼ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、水溶性テトラゾリウムを
   含むことを特徴とする、クレアチンキナーゼ活性測定用
   試験片。
2. 【請求項２】 水溶性テトラゾリウムが２−（４−ヨー
   ドフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−
   （２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウ
   ム、２−（４−ニトロ，２−メトキシフェニル）−３−
   （４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェ
   ニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、２，３，５−トリフェ
   ニル−２Ｈ−テトラゾリウム又は２，５−ジフェニル−
   ３−（１−ナフチル）−２Ｈ−テトラゾリウムである請
   求項１記載の試験片。