JP6104794B2 - 抗ｉｔｍ２ａ抗体を用いる癌の診断および治療 - Google Patents

Description

関連する出願
本出願は，日本特許出願２０１１−０９２４８８（２０１１年４月１８日出願）に基づく優先権を主張しており，この内容は本明細書に参照として取り込まれる。

技術分野
本発明は、ITM2Aタンパク質に結合する抗体、癌の診断方法、治療方法および抗癌剤に関する。

ITM2A分子はII型膜タンパクであり、軟骨や骨の形成にかかわる前駆細胞に発現する（非特許文献1）。軟骨形成の初期に発現し（非特許文献2）、軟骨形成を抑制することが知られている（非特許文献3）。ITM2Aは胸腺のT細胞にも発現し（非特許文献4）、抗ITM2Aポリクローナル抗体によるT細胞活性化抑制が開示されている（特許文献1）。特許文献1は抗ITM2A抗体によるT細胞性白血病/リンパ腫の治療をクレームしているものの、T細胞性白血病/リンパ腫におけるITM2Aの発現や治療に関する具体的な検討は行われていない。またユーイング肉腫や急性骨髄性白血病におけるITM2Aの遺伝子レベルでの発現が、マイクロアレイ解析により確認されたことが報告されている（非特許文献5、6及び7）。しかしながら、T細胞性白血病/リンパ腫、ユーイング肉腫又は急性骨髄性白血病が、抗ITM2A抗体によって治療され得ることはこれまで具体的に確認されていなかった。

本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書に参照として取り込まれる。

WO2008137500

J Biol Chem (1996) 271:19475 Biol Cell (2004) 96:463 Differentiation (2009) 78:108 J Exp Med (1999) 190:217 Cancer Res (2004) 64:8213 Cancer Res (2008) 68:2176 PLoS One (2010) 5:e9466

本発明は、ITM2Aタンパク質に結合する新規抗体、癌を診断する新規方法、癌を治療する新規方法、新規な細胞増殖抑制剤および抗癌剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、ITM2A mRNAがEWS-FLI1転座を有するユーイング肉腫で発現することを見出した。また抗ITM2Aモノクローナル抗体を作製し、ユーイング肉腫細胞株、急性骨髄性白血病細胞株、T細胞性リンパ腫細胞株、およびT細胞性急性リンパ性白血病細胞株においてITM2Aタンパク質が発現することを見出した。さらに抗ITM2Aモノクローナル抗体が抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ADCC）活性を奏し、またトキシン結合二次抗体の存在下で抗ITM2Aモノクローナル抗体によってユーイング肉腫細胞、急性骨髄性白血病細胞株、T細胞性リンパ腫細胞株、およびT細胞性急性リンパ性白血病細胞の増殖が抑制されることを見出した。以上から、抗ITM2A抗体がユーイング肉腫、急性骨髄性白血病、T細胞性リンパ腫、T細胞性急性リンパ性白血病などのITM2Aを発現する癌の治療および診断に有用であることを見出して、本発明者らは本発明を完成した。

すなわち、本発明はITM2Aタンパク質に結合するモノクローナル抗体を提供する。さらに本発明はITM2Aタンパク質に結合し、かつ、ITM2Aタンパク質を発現する細胞に対して細胞傷害活性を有するモノクローナル抗体を提供する。好ましくは、当該細胞傷害活性はADCC活性である。本発明はまた、細胞傷害性物質を結合した抗ITM2Aモノクローナル抗体を提供する。

さらに本発明は、ITM2Aタンパク質に結合するモノクローナル抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。本発明はまた、ITM2Aタンパク質に結合するモノクローナル抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤を提供する。本発明はまた、ITM2Aタンパク質に結合するモノクローナル抗体を有効成分として含有する抗癌剤を提供する。

さらに本発明は、ITM2Aタンパク質に結合するモノクローナル抗体と、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。より具体的には、下記〔１〕〜〔４７〕の発明を提供するものである。
〔１〕配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するITM2Aタンパク質の断片に結合するモノクローナル抗体、
〔２〕前記断片が配列番号１で表されるアミノ酸配列の75から227番目のアミノ酸からなる断片であることを特徴とする〔１〕に記載の抗体、
〔３〕細胞傷害活性を有する〔１〕又は〔２〕に記載の抗体、
〔４〕前記細胞傷害活性が、抗体依存性細胞傷害（ADCC）活性である〔３〕に記載の抗体、
〔５〕前記細胞傷害活性が、補体依存性細胞傷害（CDC）活性である〔３〕に記載の抗体、
〔６〕細胞傷害性物質が結合した抗体である〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の抗体、
〔７〕インターナライズ活性を有する抗体である〔６〕に記載の抗体、
〔８〕癌細胞の増殖を抑制する抗体である〔１〕から〔７〕のいずれかに記載の抗体、
〔９〕前記癌細胞が、ユーイング肉腫細胞である〔８〕に記載の抗体、
〔１０〕前記ユーイング肉腫細胞が、染色体転座が観察される細胞であることを特徴とする〔９〕に記載の抗体、
〔１１〕前記染色体転座がt(11;22)(q24;q12)であることを特徴とする〔１０〕に記載の抗体、
〔１２〕前記癌細胞が血液癌の細胞である〔８〕に記載の抗体、
〔１３〕前記血液癌が、T細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍、多発性骨髄腫のいずれかである〔１２〕に記載の抗体、
〔１４〕以下（１）から（２７）のいずれかに記載の抗体；
（１）CDR1として配列番号：３に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（２）CDR1として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：７に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（３）（１）に記載のH鎖、および（２）に記載のL鎖を含む抗体、
（４）CDR1として配列番号：９に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：１０に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：１１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（５）CDR1として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（６）（４）に記載のH鎖、および（５）に記載のL鎖を含む抗体、
（７）CDR1として配列番号：１５に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：１７に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（８）CDR1として配列番号：１８に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：１９に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（９）（７）に記載のH鎖、および（８）に記載のL鎖を含む抗体、
（１０）CDR1として配列番号：２１に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：２２に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：２３に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（１１）CDR1として配列番号：２４に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：２５に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：２６に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（１２）（１０）に記載のH鎖、および（１１）に記載のL鎖を含む抗体、
（１３）キメラ抗体である（１）から（１２）に記載の抗体、
（１４）ヒト化抗体である（１）から（１２）に記載の抗体、
（１５）配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む（１）又は（３）記載の抗体、
（１６）配列番号３０に記載のアミノ酸配列を含む（２）又は（３）記載の抗体、
（１７）配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含む（４）又は（６）記載の抗体、
（１８）配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む（５）又は（６）記載の抗体、
（１９）配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む（７）又は（９）記載の抗体、
（２０）配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む（８）又は（９）記載の抗体、
（２１）配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む（１０）又は（１２）記載の抗体、
（２２）配列番号４２に記載のアミノ酸配列を含む（１１）又は（１２）記載の抗体、
（２３）キメラ抗体である（１５）から（２２）に記載の抗体、
（２４）（１）〜（２３）いずれかに記載の抗体のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入され、かつ、その抗体と同等の活性又は同等の結合活性を有する抗体、
（２５）第２の抗体が結合しうるエピトープに結合することができる抗体であって、前記第２の抗体は、それぞれ（１）〜（２３）いずれかに記載の抗体であることを特徴とする抗体、
（２６）配列番号１で表されるアミノ酸配列の75から227番目のアミノ酸からなるITM2Aタンパク質の断片に対する第２の抗体の結合を阻害することができる抗体であって、前記第２の抗体は、それぞれ（１）〜（２３）いずれかに記載の抗体であることを特徴とする抗体、
〔１５〕ヒト定常領域を有する抗体である〔１〕〜〔１４〕のいずれかに記載の抗体、
〔１６〕キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である〔１５〕に記載の抗体、
〔１７〕糖鎖に付加するフコースが欠損した、または、バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体である〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の抗体、
〔１８〕〔１〕から〔１７〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する医薬組成物、
〔１９〕〔１〕から〔１７〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤、
〔２０〕〔１〕から〔１７〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する抗癌剤、
〔２１〕治療対象となる癌がユーイング肉腫である、〔２０〕に記載の抗癌剤、
〔２２〕前記ユーイング肉腫が、染色体転座が観察されることを特徴とする〔２１〕に記載の抗癌剤、
〔２３〕前記染色体転座がt(11;22)(q24;q12)であることを特徴とする〔２２〕に記載の抗癌剤、
〔２４〕前記癌細胞が血液癌の細胞である〔２０〕に記載の抗癌剤、
〔２５〕前記血液癌が、T細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍、多発性骨髄腫のいずれかである〔２４〕に記載の抗癌剤、
〔２６〕〔１〕から〔１７〕のいずれかに記載の抗体を投与することを含む癌を治療する方法、
〔２７〕治療対象となる癌がユーイング肉腫である、〔２６〕に記載の方法、
〔２８〕前記ユーイング肉腫が、染色体転座が観察されることを特徴とする〔２７〕に記載の方法、
〔２９〕前記染色体転座がt(11;22)(q24;q12)であることを特徴とする〔２８〕に記載の方法、
〔３０〕前記癌細胞が血液癌の細胞である〔２６〕に記載の方法、
〔３１〕前記血液癌が、T細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍、多発性骨髄腫のいずれかである〔３０〕に記載の方法、
〔３２〕〔１〕から〔１７〕のいずれかに記載の抗体を投与することによる癌治療の奏功性を予測する方法であって、被験者から採取された生体試料中のITM2Aの発現レベルを検出する工程を含む方法、
〔３３〕被験者から採取された試料におけるITM2Aタンパク質を検出することを特徴とする〔３２〕に記載の方法、
〔３４〕ITM2Aタンパク質の検出がITM2Aタンパク質に結合する抗体を用いて行なわれる〔３３〕に記載の診断方法、
〔３５〕治療対象となる癌がユーイング肉腫である、〔３２〕から〔３４〕のいずれかに記載の方法、
〔３６〕前記ユーイング肉腫が、染色体転座が観察されることを特徴とする〔３５〕に記載の方法、
〔３７〕前記染色体転座がt(11;22)(q24;q12)であることを特徴とする〔３６〕に記載の方法、
〔３８〕前記癌細胞が血液癌の細胞である〔３５〕に記載の方法、
〔３９〕前記血液癌が、T細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍、多発性骨髄腫のいずれかである〔３８〕に記載の方法、
〔４０〕被験者から採取された試料におけるITM2Aタンパク質を検出することを特徴とする、被験者における癌の存在を決定する方法、
〔４１〕以下の工程を含む、被験者における癌の存在を決定する方法；
（ａ） 被験者から採取された試料を提供する工程、
（ｂ） （ａ）の試料に含まれるITM2Aタンパク質を、ITM2Aタンパク質に結合する抗体を用いて検出する工程、
〔４２〕以下の工程を含む、被験者における癌の存在を決定する方法；
（ａ） ITM2Aタンパク質への結合活性を有し、かつ放射性同位元素で標識された抗体を被験者に投与する工程、
（ｂ） 前記放射性同位元素の集積を検出する工程、
〔４３〕前記存在を決定する対象となる癌がユーイング肉腫である〔４０〕から〔４２〕のいずれかに記載の方法、
〔４４〕前記ユーイング肉腫が、染色体転座が観察されることを特徴とする〔４３〕に記載の方法、
〔４５〕前記染色体転座がt(11;22)(q24;q12)であることを特徴とする〔４４〕に記載の方法、
〔４６〕前記癌細胞が血液癌の細胞である〔４３〕に記載の方法、
〔４７〕前記血液癌が、T細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍、多発性骨髄腫のいずれかである〔４６〕に記載の方法。

Human Exon 1.0 ST Arrayを用いて得られた、正常組織、ユーイング肉腫細胞株、ユーイング肉腫組織、及び、血液癌細胞株におけるITM2AのmRNAの発現プロファイルが示される。（Ａ）各種の正常組織におけるITM2AのmRNAの発現プロファイルが示される。（Ｂ）血液癌細胞株、ユーイング肉腫細胞株、ユーイング肉腫組織におけるITM2AのmRNAの発現プロファイルが示される。 ELISAアッセイを用いて得られた、GST-ITM2A-L及びGST-ITM2A-Sに対する単離された抗ITM2A抗体の結合活性が示される。（Ａ）GST-ITM2A-Lに対する抗ITM2A抗体の結合活性が示される。（Ｂ）GST-ITM2A-Sに対する抗ITM2A抗体の結合活性が示される。 FACSを用いて得られた、単離された抗ITM2A抗体の結合ドメインを調べた結果が示される。（Ａ）ITM2Aを発現するCHO細胞に対する抗ITM2A抗体の結合活性が示される。（Ｂ）ITM2A-furinを発現するCHO細胞に対する抗ITM2A抗体の結合活性が示される。（Ｃ）CHO細胞に対する抗ITM2A抗体の結合活性が示される。（Ｄ）ITM2A 又はITM2A-furinを発現するCHO細胞に対する抗HA抗体の結合活性が示される。 単離された抗ITM2A抗体の種間交差性を調べた結果が示される。（Ａ）ヒトITM2Aを発現するCHO細胞に対する抗ITM2A抗体の結合活性が示される。（Ｂ）マウスITM2Aを発現するCHO細胞に対する抗ITM2A抗体の結合活性が示される。 ウエスタンブロット法を用いてITM2Aに対する単離された抗ITM2A抗体の結合活性を評価した結果が示される。ＡレーンはITM2Aを発現するCHO細胞の全細胞溶解液、ＢレーンはITM2A-furinを発現するCHO細胞の全細胞溶解液、ＣレーンはＣＨＯ細胞の全細胞溶解液を表す。（Ａ）BE5-1抗体の結合活性が示される。（Ｂ）BE6-1抗体の結合活性が示される。（Ｃ）BE7-1-1抗体の結合活性が示される。（Ｄ）BE13-1抗体の結合活性が示される。（Ｅ）抗HA抗体の結合活性が示される。 FACSを用いて調べたヒト癌細胞株におけるITM2Aの発現が示される。（Ａ）ユーイング肉腫細胞株A-673におけるITM2Aの発現が示される。（Ｂ）ユーイング肉腫細胞株RD-ESにおけるITM2Aの発現が示される。（Ｃ）ユーイング肉腫細胞株SK-ES-1におけるITM2Aの発現が示される。（Ｄ）ユーイング肉腫細胞株SK-N-MCにおけるITM2Aの発現が示される。（Ｅ）T細胞性急性リンパ性白血病細胞株CCRF-CEMにおけるITM2Aの発現が示される。（Ｆ）T細胞性急性リンパ性白血病細胞株JurkatにおけるITM2Aの発現が示される。（Ｇ）T細胞性急性リンパ性白血病細胞株MOLT4におけるITM2Aの発現が示される。（Ｈ）T細胞性リンパ腫細胞株HuT78におけるITM2Aの発現が示される。（Ｉ）急性骨髄性白血病細胞株KG-1aにおけるITM2Aの発現が示される。（Ｊ）急性骨髄性白血病細胞株TF-1aにおけるITM2Aの発現が示される。 単離された抗ITM2A抗体が奏する各種癌細胞株に対するADCC活性が示される。（Ａ）ユーイング肉腫細胞株A-673に対するADCC活性が示される。（Ｂ）ユーイング肉腫細胞株SK-N-MCに対するADCC活性が示される。（Ｃ）T細胞性急性リンパ性白血病細胞株CCRF-CEMに対するADCC活性が示される。（Ｄ）急性骨髄性白血病細胞株KG-1aに対するADCC活性が示される。 トキシン結合二次抗体の存在下で、単離された抗ITM2A抗体が奏する各種癌細胞株に対する細胞傷害活性が示される。（Ａ）ユーイング肉腫細胞株A-673に対する細胞傷害活性が示される。（Ｂ）T細胞性急性リンパ性白血病細胞株CCRF-CEMに対する細胞傷害活性が示される。（Ｃ）T細胞性リンパ腫細胞株HuT78に対する細胞傷害活性が示される。 ユーイング肉腫の臨床検体におけるEWS-FLI1融合遺伝子及びITM2Aの発現がPCRによって評価された結果が示される。（Ａ）ユーイング肉腫の臨床検体におけるEWS-FLI1融合遺伝子の発現が示される。（Ｂ）ユーイング肉腫の臨床検体におけるITM2Aの発現が示される。

ITM2A
本発明においてITM2Aは、II型膜タンパク質である。ヒトITM2Aのアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子配列は、それぞれNCBI登録番号NP＿004858.1（配列番号：１）及びNM＿004867.4（配列番号：２）に開示されている。また、本発明で用いられるITM2Aはスプライシングバリアントや変異体であってもよい。本発明において、ITM2Aタンパク質とは、全長タンパク質およびその断片の両方を含むことを意味する。断片とは、ITM2Aタンパク質の任意の領域を含むポリペプチドであり、天然のITM2Aタンパク質の機能を有していなくてもよい。断片の例として、ITM2Aタンパク質の細胞外領域を含む断片が挙げられる。ITM2Aタンパク質の細胞外領域は配列番号：１のアミノ酸配列において75-263番目が相当する。また、別の態様において、断片の例として配列番号：１で表されるITM2Aタンパク質の75-227番目のアミノ酸からなるポリペプチドも好適な例として挙げられる。

抗ITM2A抗体の作製
本発明で用いられる抗ITM2A抗体は、ITM2Aタンパク質に結合すればよく、その由来、種類、形状などは問われない。具体的には、非ヒト動物の抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体）、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体が使用され得る。本発明においては、モノクローナル、あるいはポリクローナルが、抗体として利用され得るが、モノクローナル抗体が好適に使用され得る。抗体のITM2Aタンパク質への結合は特異的な結合であることが好ましい。又、本発明で用いられる抗ITM2A抗体がヒトITM2Aを認識する抗体である場合、ヒトITM2Aを特異的に認識する抗体が使用され得るし、他の動物由来のITM2A（例えば、マウスITM2A）を同時に認識する抗体も好適に使用され得る。

本発明で使用される抗ITM2A抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として取得され得る。本発明で使用される抗ITM2A抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるもの等が含まれる。

モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製され得る。まず、ITM2Aタンパク質が感作抗原として使用されて、これが通常の免疫方法にしたがって免疫される。免疫動物から得られる免疫細胞が、通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合されてハイブリドーマが得られる。更にこのハイブリドーマから、通常のスクリーニング法により、目的とする抗体を産生する細胞をスクリーニングすることによって、抗ITM2A抗体を産生するハイブリドーマが選択され得る。

具体的には、モノクローナル抗体の作製は例えば以下に示すように行われる。まず、ITM2A遺伝子を発現させることによって、抗体取得の感作抗原として使用されるITM2Aタンパク質が取得され得る。ITM2A遺伝子の塩基配列は、NCBI登録番号NM＿004867.4（配列番号：２）などに開示されている。すなわち、ITM2Aをコードする遺伝子配列を公知の発現ベクターに挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から、目的のヒトITM2Aタンパク質が公知の方法で精製され得る。また、精製した天然のITM2Aタンパク質もまた同様に使用できる。また、本発明で用いられるように、ITM2Aタンパク質の所望の部分ポリペプチドを異なるポリペプチドと融合した融合タンパク質が免疫原として利用され得る。免疫原とする融合タンパク質を製造するために、例えば、抗体のFc断片やペプチドタグなどが利用され得る。所望の二種類又はそれ以上のポリペプチド断片をコードする遺伝子をインフレームで融合させ、当該融合遺伝子を発現ベクターに挿入することにより、融合タンパク質を発現するベクターが作製され得る。融合タンパク質の作製方法はMolecular Cloning 2nd ed.（Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989）に記載されている。

このようにして精製されたITM2Aタンパク質が、哺乳動物に対する免疫に使用する感作抗原として使用され得る。ITM2Aの部分ペプチドもまた感作抗原として使用され得る。たとえば、次のようなペプチドが感作抗原として使用され得る。
ヒトITM2Aのアミノ酸配列に基づいて化学合成によって取得されたペプチド
ITM2A遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで発現させることによって取得されたペプチド
ITM2Aタンパク質をタンパク質分解酵素により分解することによって取得されたペプチド

部分ペプチドとして用いるITM2Aの領域および大きさは限定されない。好ましい領域はITM2Aの細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列（配列番号：２のアミノ酸配列において75-263番目）から選択され得る。感作抗原とするペプチドを構成するアミノの数は、少なくとも３以上、たとえば、５以上、あるいは６以上であることが好ましい。より具体的には、６〜２６３、好ましくは７〜２００、さらに好ましくは８〜１００、８〜５０、または、１０〜３０残基のペプチドが感作抗原として使用され得る。

該感作抗原で免疫される哺乳動物は、特に限定されない。モノクローナル抗体を細胞融合法によって得るためには、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して免疫動物を選択するのが好ましい。一般的には、げっ歯類の動物が免疫動物として好ましい。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギが免疫動物として使用され得る。その他、サル等が免疫動物として使用され得る。

公知の方法にしたがって上記の動物が感作抗原により免疫され得る。例えば、一般的方法として、感作抗原を腹腔内または皮下に注射することにより哺乳動物が免疫され得る。具体的には、該感作抗原が哺乳動物に4から21日毎に数回投与される。感作抗原は、PBS（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当な希釈倍率で希釈されて免疫に使用される。更に、感作抗原はアジュバントとともに投与され得る。例えばフロイント完全アジュバントと混合し、乳化されたものも、感作抗原として使用され得る。また、感作抗原の免疫時には適当な担体が使用され得る。特に分子量の小さい部分ペプチドが感作抗原として用いられる場合には、該感作抗原ペプチドがアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合されたものが免疫のために好適に使用され得る。

一方、モノクローナル抗体は、DNA免疫（DNA Immunization）によっても得ることが可能である。DNA免疫とは、免疫動物中で抗原タンパク質をコードする遺伝子（例えば配列番号：２）が発現できるような態様で構築されたベクターDNAを当該免疫動物に投与し、免疫抗原を免疫動物の生体内で発現させることによって、免疫刺激を与える方法である。タンパク質抗原を投与する一般的な免疫方法と比べて、DNA免疫には、次のような優位性を期待できる。
−ITM2Aのような膜タンパク質の構造を維持して免疫刺激を与えることができる
−免疫抗原を精製する必要が無い

しかし一方で、DNA免疫においては、アジュバントなどの免疫刺激手段と組み合わせることが困難である。ITM2Aはそのアミノ酸配列の種間相同性が高い。配列番号１で示されるヒト由来のITM2Aのアミノ酸配列は、例えば、アナウサギ、ウマ、マウス、ジャイアントパンダ、ラット、ブタ由来のITM2Aのアミノ酸配列と、それぞれ、99％、98％、96％、94％、94％、90％の同一性を有する。このような構造上の同一性を考慮すると、DNA免疫とアジュバントなどの免疫刺激手段を伴うタンパク質抗原の投与によって、ITM2Aに結合するモノクローナル抗体が得られたことは、予想外の成果である。

DNA免疫によって本発明のモノクローナル抗体を得るには、まず、ITM2Aタンパク質を発現するDNAを免疫動物に投与する。ITM2AをコードするDNAは、PCRなどの公知の方法によって合成することができる。得られたDNAを適切な発現ベクターに挿入し、免疫動物に投与する。発現ベクターとしては、たとえばpcDNA3.1などの市販の発現ベクターを利用することができる。ベクターを生体に投与する方法も、一般に用いられている方法を利用することができる。たとえば、発現ベクターを吸着させた金粒子を、遺伝子銃（gene gun）で細胞内に打ち込むことによってDNA免疫を行うことができる。

このように哺乳動物が免疫され、血清中における所望の抗体量の上昇が確認された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に付される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が使用され得る。

上記の免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる（あるいはできない）形質を指す。選択マーカーには、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（以下HGPRT欠損と省略される）、あるいはチミジンキナーゼ欠損（以下TK欠損と省略される）などが公知である。HGPRTやTKの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン感受性（以下HAT感受性と省略する）を有する。HAT感受性の細胞はHAT選択培地中でDNA合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞のサルベージ回路を利用してDNAの合成を継続することができるためHAT選択培地中でも増殖する。

HGPRT欠損やTK欠損の細胞は、それぞれ6チオグアニン、8アザグアニン（以下8AGと省略される）、あるいは5'ブロモデオキシウリジンを含む培地で選択され得る。正常な細胞はこれらのピリミジンアナログをDNA中に取り込むことにより死滅するが、これらの酵素を欠損した細胞は、これらのピリミジンアナログを取り込むことができないため、選択培地の中で生存することができる。ネオマイシン耐性遺伝子によりもたらされる2-デオキシストレプタミン系抗生物質（ゲンタマイシン類似体）に対する耐性を指標とする選択マーカーはG418耐性と呼ばれる。細胞融合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。例えば、以下のようなミエローマ細胞が、本発明におけるモノクローナル抗体の製造に利用され得る。
P3（P3x63Ag8.653）（J. Immunol.（1979）123, 1548-1550）
P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology（1978）81, 1-7）
NS-1（Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.（1976）6, 511-519）
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SP2/0（Shulman, M. et al., Nature（1978）276, 269-270）
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R210（Galfre, G. et al., Nature（1979）277, 131-133）等

基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等に準じて、免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合が行われる。

より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、細胞融合が実施され得る。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等が使用され得る。更に融合効率を高めるために所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤が好適に加えられる。

免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定できる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1から10倍とするのが好ましい。細胞融合に用いる培養液としては、例えば、ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液を利用することができる。さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を培養液に添加することができる。

細胞融合の手順においては、免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温したPEG溶液を混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。細胞融合の手順においては、例えば平均分子量1000から6000程度のPEGが、通常30から60％（w/v）の濃度で免疫細胞とミエローマ細胞を含む細胞懸濁液に添加され得る。続いて、上記に挙げた適切な培養液が逐次添加された細胞懸濁液の上清が遠心分離によって除去される。この除去操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等が除去される。

このようにして得られたハイブリドーマは、細胞融合に用いられたミエローマが有する選択マーカーに応じた選択培地中で生育することができる。例えばHGPRTやTKの欠損を有する細胞は、HAT培地中（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択され得る。すなわち、HAT感受性のミエローマ細胞を細胞融合に用いた場合、HAT培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞が選択的に増殖することができる。目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、上記HAT培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週間の培養によって、目的とするハイブリドーマが選択され得る。ついで、通常の限界希釈法を実施することによって、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが実施される。あるいは、ITM2Aを認識する抗体は、国際公開WO2003104453に記載された方法によって作成され得る。

目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法によって好適に実施され得る。例えば、抗原を結合させた、ポリスチレン等で作られたビーズや市販の96ウェルのマイクロタイタープレート等と、ハイブリドーマの培養上清との反応が実施される。次いで、担体が洗浄された後に、酵素で標識した二次抗体等と単体との反応が実施される。感作抗原と反応する目的とする抗体が培養上清中に含まれる場合、二次抗体が当該抗体を介して担体に結合する。担体に結合する二次抗体を最終的に検出することによって、目的とする抗体が培養上清中に存在しているかどうかが決定され得る。前記のように、抗原に対する結合能を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマが限界希釈法等によりクローニングされ得る。前記のスクリーニングおよび単一クローニングに際して、抗原としては免疫に用いられたものの他、実質的に同質なITM2Aタンパク質が好適に使用され得る。実質的に同質なITM2Aタンパク質の例として、ITM2Aを発現する細胞株、ITM2Aの細胞外ドメイン、あるいは当該ドメインを構成する部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドが、抗原として利用され得る。

また、ヒト以外の動物に抗原を免疫することによって上記ハイブリドーマを得る方法以外に、ヒトリンパ球を抗原感作することによっても所望の抗体が取得され得る。具体的には、まずインビトロでヒトリンパ球がITM2Aタンパク質で感作される。次いで、免疫感作されたリンパ球が適当な融合パートナーと融合される。融合パートナーには、たとえばヒト由来であって永久分裂能を有するミエローマ細胞が利用され得る（特公平1-59878号公報）。融合パートナーであるヒトミエローマ細胞には、例えばU266などを利用することができる。この方法によって得られる抗ITM2A抗体は、ITM2Aタンパク質への結合活性を有するヒト抗体である。

さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に対して抗原となるITM2Aタンパク質を投与するか、又はITM2Aを当該動物中において発現するように構築されたDNAによって免疫することによっても、抗ITM2Aヒト抗体が取得され得る。免疫動物の抗体産生細胞は、適当な融合パートナーとの細胞融合やエプスタインバーウイルスの感染によって、不死化形質を獲得することができる。このようにして得られた不死化細胞から、ITM2Aタンパク質に対するヒト抗体が単離され得る（WO1994025585、WO1993012227、WO1992003918、WO1994002602）。更に不死化された抗体産生細胞をクローニングすることにより、目的の反応特異性を有する抗体を産生する細胞がクローニングされ得る。トランスジェニック動物を免疫する場合、当該動物の免疫システムが、ヒトITM2Aを異物として認識する。したがって、ヒトITM2Aに対するヒト抗体は容易に取得され得る。

このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培地中で継代的に培養され得る。また、該ハイブリドーマは液体窒素中で長期にわたって保存され得る。

当該ハイブリドーマは通常の方法に従って培養され得る。その培養上清から目的とするモノクローナル抗体が取得され得る。あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させることによって、その腹水からモノクローナル抗体が取得され得る。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適している。

本発明においては、抗体産生細胞からクローニングされた抗体遺伝子によってコードされる抗体も利用され得る。クローニングした抗体遺伝子が組み込まれた適切な発現ベクターを宿主に導入することによって、当該抗体遺伝子がコードする抗体が当該宿主中で発現する。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は既に確立されている（例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur.J. Biochem.（1990）192, 767-775）。

たとえば、抗ITM2A抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、抗ITM2A抗体の可変領域（V領域）をコードするcDNAが取得され得る。当該cDNAを取得するために、通常、まずハイブリドーマから全RNAが抽出される。細胞から全RNAを抽出するための方法として、たとえば次のような方法を利用することができる。
グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry（1979）18, 5294-5299）
AGPC法（Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem.（1987）162, 156-159）

抽出された全RNAから、mRNA Purification Kit （GEヘルスケアバイオサイエンス製）等を使用してmRNAが精製され得る。あるいは、QuickPrep mRNA Purification Kit （GEヘルスケアバイオサイエンス製）などのように、細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットも市販されている。このようなキットを用いて、ハイブリドーマから全mRNAが取得され得る。このように取得されたmRNAと逆転写酵素を用いて、抗体V領域をコードするcDNAが合成され得る。マウスの抗体遺伝子に共通な配列より選び出した任意の15-30塩基の配列が、cDNA合成のためのプライマーとして用いられ得る。具体的には、配列番号：９７〜１００に示されたDNA配列を有するプライマーを用いることによって抗体V領域をコードするcDNAが取得され得る。cDNAは、逆転写酵素としてAMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化学工業社製）等を用いることによって合成され得る。また、cDNAの合成および増幅のために、5’-Ampli FINDER RACE Kit（Clontech製）およびPCRを用いた5’-RACE法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1988）85, 8998-9002、Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids Res.（1989）17, 2919-2932）もまた適宜利用され得る。更にこうしたcDNAの合成の過程においてcDNAの両末端に、後述するような適切な制限酵素サイトが導入され得る。

また、抗体の可変領域をコードする遺伝子を得るために、cDNAライブラリーもまた適宜利用され得る。まず抗体産生細胞から抽出されたmRNAを鋳型としてcDNAを合成することによって、cDNAライブラリーが取得される。cDNAライブラリーの合成には市販のキットが適宜使用され得る。実際には、少数の細胞のみから得られるmRNAは極めて微量であるため、当該mRNAを直接精製する場合には、mRNAの収率は低いことが一般的である。したがって通常は、抗体遺伝子を含まないことが明らかであるキャリアRNAが添加されたmRNA標品から精製される。あるいは一定量のRNAが抽出され得る場合には、キャリアRNAの添加なくして、抗体産生細胞から取得されたRNAのみから抗体可変領域をコードするmRNAが効率よく抽出され得る。たとえば10以上、あるいは30以上、好ましくは50以上の抗体産生細胞からRNAが抽出される場合には、キャリアRNAの添加は必要でない場合がある。

得られたcDNAライブラリーを鋳型として用いるPCR法によって、抗体遺伝子が増幅され得る。抗体遺伝子をPCR法によって増幅するための複数のプライマーが公知である。たとえば、論文（J. Mol. Biol. (1991) 222, 581-597）などの開示に基づいて、ヒト抗体遺伝子増幅用のプライマーが好適にデザインされ得る。これらのプライマーは、イムノグロブリンのサブクラスごとにそれぞれ異なる塩基配列を有する。したがって、サブクラスが不明のcDNAライブラリーを鋳型とするときには、あらゆる可能性を考慮したプライマーを用いたPCR法が実施される。

前記のように取得されたPCR産物から、所望のcDNA断片が精製される。次いで、精製されたcDNA断片がベクターDNAと連結される。このように作製された組換えベクターが大腸菌等に導入され、組換えベクターによって形質転換された大腸菌のコロニーが選択される。当該コロニーを形成した大腸菌から、組換えベクターが単離され得る。そして、単離された組換えベクターに挿入されたcDNAの塩基配列が、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認され得る。

具体的には、たとえばヒトIgGをコードする遺伝子の取得を目的とするときには、重鎖としてγ1〜γ5、軽鎖としてκ鎖とλ鎖をコードする遺伝子の増幅が可能なプライマーが利用され得る。IgGの可変領域遺伝子を増幅するためには、一般に3'側のプライマーにはヒンジ領域に相当する部分にアニールするプライマーが利用される。一方5'側のプライマーには、各サブクラスに応じたプライマーが利用される。

重鎖と軽鎖の各サブクラスに相当する遺伝子増幅用プライマーによって増幅されたPCR産物は、それぞれ独立した遺伝子ライブラリーとして合成される。こうして合成されたライブラリーを組み合わせることによって、重鎖と軽鎖の組み合せからなるイムノグロブリンが再構成され得る。このようにして再構成されたイムノグロブリンの、ITM2Aに対する結合活性を指標として、目的とする抗体がスクリーニングされ得る。

たとえばITM2Aに対する抗体を取得するために、抗体のITM2Aに対する結合が特異的であることがさらに好ましい。ITM2Aに結合する抗体は、たとえば次のようにしてスクリーニングされ得る。
(１) 得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体をITM2Aに接触させる工程、
(２) ITM2Aと抗体が結合した複合体を検出する工程、および
(３) ITM2Aに結合する抗体を選択する工程

抗体とITM2Aが結合した（抗原抗体）複合体を検出する方法は公知である。具体的には、担体に固定したITM2Aに対して被験抗体を接触させ、次に抗体を認識する標識抗体を接触させる。担体の洗浄後に、担体上に存在する標識抗体が検出されたときは、当該被験抗体のITM2Aへの結合が証明され得る。抗体の標識には、ペルオキシダーゼやβ−ガラクトシダーゼ等の酵素活性蛋白質、あるいはFITC等の蛍光物質が適宜利用され得る。抗体の結合活性を評価するためにITM2Aを発現する細胞の固定標本もまた適宜利用され得る。

結合活性を指標とする抗体のスクリーニング方法として、ファージベクターを利用したパニング法が用いられ得る。上記のように抗体遺伝子を重鎖と軽鎖のサブクラスのライブラリーとして取得した場合、ファージベクターを利用したスクリーニング方法が有利である。重鎖と軽鎖の可変領域をコードする遺伝子を適切なリンカー配列で連結することによって、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が一本鎖上に配置するシングルチェインFv(scFv)分子をコードする遺伝子が作製され得る。scFvをコードする遺伝子をファージベクターに挿入すれば、scFvをその表面に発現するファージが取得され得る。こうして取得されたファージを、目的とする抗原と接触させた後に、抗原に結合したファージを回収すれば、所望の抗原に対する結合活性を有するscFvをコードするDNAが回収され得る。この操作を必要に応じて繰り返すことによって、抗原に対する所望の結合活性を有するscFvが濃縮され得る。

本発明において抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体の全長をコードするポリヌクレオチドであり得るし、あるいは抗体の一部をコードするポリヌクレオチドでもあり得る。抗体の一部とは、抗体分子の任意の部分をいう。以下、抗体の一部を示す用語として、抗体断片を用いる場合がある。本発明における好ましい抗体断片は、抗体の相補鎖決定領域（complementarity determination region;CDR）を含む抗体断片である。好ましくは、重鎖及び軽鎖の相補鎖決定領域（complementarity determination region;CDR）を含む抗体断片である。更に好ましくは、本発明の抗体断片は、可変領域を構成する重鎖又は／及び軽鎖の３つのCDRを含む抗体断片である。

所望の抗ITM2A抗体のV領域をコードするcDNAが得られた後に、当該cDNAの両末端に挿入した制限酵素サイトを認識する制限酵素によって当該cDNAが消化される。好ましい制限酵素は、抗体遺伝子を構成する塩基配列に出現する可能性が低い塩基配列を認識して消化することができる制限酵素である。更に１コピーの消化断片を発現ベクターに正しい方向で挿入するためには、付着末端を与える制限酵素サイトが当該cDNA末端に挿入されることが好ましい。上記のように消化された抗ITM2A抗体のV領域をコードするcDNAを適切な発現ベクターに挿入することによって、抗体発現ベクターが取得され得る。この場合において、抗体定常領域（C領域）をコードする遺伝子と、上記のV領域をコードする遺伝子とがインフレームで融合されることによって、キメラ抗体が取得され得る。ここで、キメラ抗体とは、定常領域と可変領域の由来が異なることをいう。したがって、マウス−ヒトなどの異種キメラ抗体に加え、ヒト−ヒト同種キメラ抗体も、本発明におけるキメラ抗体に含まれる。予め定常領域をコードするDNAが組み込まれている発現ベクターに、V領域遺伝子をインフレームで挿入することによって、キメラ抗体発現ベクターが構築され得る。

具体的には、たとえば、所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAを保持する発現ベクターの5’側に、V領域遺伝子の両端に挿入された制限酵素末端を消化する制限酵素の制限酵素認識配列が配置され得る。当該発現ベクター及び当該V領域遺伝子が挿入されたベクターを同じ組み合わせの制限酵素で消化し、当該発現ベクターと当該V領域遺伝子をインフレームで融合させることによって、キメラ抗体発現ベクターが構築される。

本発明で使用される抗ITM2A抗体を製造するために、発現制御領域による制御の下で発現するように抗体遺伝子が発現ベクターに挿入され得る。抗体を発現するための発現制御領域には、例えば、エンハンサーやプロモーターが含まれる。次いで、この発現ベクターを用いて適切な宿主細胞を形質転換することによって、抗ITM2A抗体をコードするDNAを発現する組換え細胞が取得され得る。

抗体遺伝子の発現のために、抗体重鎖（H鎖）および軽鎖（L鎖）をコードするDNAは、それぞれ別の発現ベクターに組み込まれ得る。H鎖とL鎖が組み込まれたベクターを、同じ宿主細胞に同時に形質転換（co-transfect）することによって、H鎖とL鎖を備えた抗体分子が発現することが可能である。あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAが挿入された単一の発現ベクターによって宿主細胞を形質転換することによっても、H鎖とL鎖を備えた抗体分子が発現することが可能である。（WO1994011523）。

単離した抗体遺伝子を適切な宿主に導入することによって抗体を作製するために用いられる、宿主と発現ベクターの数多くの組み合わせの発現系が公知である。これらの発現系は、いずれも本発明に応用され得る。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、あるいは真菌細胞が使用され得る。具体的には、本発明に利用することができる動物細胞としては、次のような細胞が例示され得る。
（１）哺乳類細胞：CHO、COS、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、Hela、Vero、HEK293、Ba/F3、HL-60、Jurkat、SK-HEP1など
（２）両生類細胞：アフリカツメガエル卵母細胞など
（３）昆虫細胞：sf9、sf21、Tn5など

あるいは、本発明に利用することができる植物細胞としては、ニコティアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）などのニコティアナ（Nicotiana）属由来の細胞を用いる抗体遺伝子の発現系が公知である。植物細胞を形質転換するために、カルス培養した細胞が適宜利用され得る。

更に、本発明に利用することができる真菌細胞としては、次のような細胞が利用することができる。
酵母：サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）などのサッカロミセス（Saccharomyces ）属、メタノール資化酵母（Pichia pastoris）などのPichia属
糸状菌：アスペスギルス・ニガー（Aspergillus niger）などのアスペルギルス（Aspergillus）属

あるいは、本発明に利用することができる発現系として、原核細胞を宿主として用いる抗体遺伝子の発現系も公知である。たとえば、細菌細胞を用いる場合、大腸菌（E. coli）、枯草菌などの細菌細胞が本発明に好適に利用され得る。

哺乳類細胞を本発明に用いる場合、（エンハンサーの有無に拠らず）常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その3’側下流にポリAシグナル、を機能的に結合させることによって、当該抗体遺伝子が発現され得る。例えば、プロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（ヒト cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）が好適に挙げられる。

また、上記の他に、ウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が、抗体発現のために使用され得る。プロモーター／エンハンサーを利用することができるウイルスとして、具体的には、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス40（SV40）等が好適に摘示される。

SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法（Nature（1979）277, 108）が好適に利用され得る。また、Mizushimaらの方法（Nucleic Acids Res.（1990）18, 5322）により、HEF1αプロモーター／エンハンサーが、所望の遺伝子発現に容易に利用され得る。

大腸菌を宿主として用いる場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させることによって当該遺伝子が発現され得る。用いられるプロモーターとしては、例えばlacZプロモーター、araBプロモーターが好適に挙げられる。Wardらの方法（Nature（1989）341, 544-546 ; FASEBJ.（1992）6, 2422-2427）を利用することによって、lacZプロモーターが使用され得る。あるいはBetterらの方法（Science（1988）240, 1041-1043）を用いることによって、目的とする遺伝子の発現にaraBプロモーターが好適に利用され得る。

大腸菌のペリプラズムに抗体を産生させる場合には、抗体分泌のためのシグナル配列として、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al., J. Bacteriol.（1987）169, 4379）が使用され得る。そして、ペリプラズムに産生された抗体が単離された後、尿素のグアニジン塩酸塩の様なタンパク質変性剤を使用することによって、所望の結合活性を有するように、抗体の構造が組み直される（refolded）。

動物細胞を用いて抗体を産生させる場合に、抗体の細胞外への分泌のために必要とされるシグナル配列として、抗体の重鎖遺伝子または軽鎖遺伝子のシグナル配列が好適に用いられる。又、IL-3やIL-6などの分泌タンパク質が有するシグナル配列も好適に用いられる。

発現ベクターに挿入される複製起源としては、SV40、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（BPV）等の由来の複製起源が用いられ得る。さらに、宿主細胞において挿入された遺伝子のコピー数を増幅するために、発現ベクター中に、選択マーカーが挿入され得る。具体的には、次のような選択マーカーが利用され得る。
アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子
チミジンキナーゼ（TK）遺伝子
大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子
ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等

次いで、これらの発現ベクターが導入されることによって形質転換された宿主細胞がインビトロまたはインビボで培養される。このように宿主細胞が培養された培養液等に目的とする抗体が産生される。宿主細胞は公知の方法に従い培養される。例えば、培地として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMが使用され得るし、牛胎児血清（FCS）等の血清補液が併用され得る。

上述のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法を単独で使用することによって又は適宜組み合わせることによって精製され得る。例えば、プロテインAカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体が分離、精製され得る（Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。

また、組換え抗体の産生のためには、上記宿主細胞に加えて、トランスジェニック動物が利用され得る。すなわち目的とする抗体をコードする遺伝子が導入された動物から、当該抗体が取得され得る。例えば、乳汁中に特異的に産生されるタンパク質をコードする遺伝子の内部に、抗体遺伝子をインフレームで挿入することによって当該タンパク質と抗体との融合遺伝子が構築され得る。乳汁中に分泌されるタンパク質としては、たとえば、ヤギβカゼインなどが利用され得る。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片はヤギの胚へ注入され、このように注入された胚が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ（またはその子孫）が産生する乳汁からは、所望の抗体が乳汁タンパク質との融合タンパク質として取得され得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニックヤギに適宜投与される（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology（1994）12, 699-702）。

本発明の組換え抗体のC領域として、ヒト以外の動物の抗体由来のC領域が使用され得る。例えばマウス抗体のH鎖C領域としては、Cγ1、Cγ2a、Cγ2b、Cγ3、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cεが、L鎖C領域としてはCκ、Cλが使用され得る。また、マウス以外の動物の抗体としてラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、サル等の抗体が使用され得る。これらの配列は公知である。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、C領域が適宜修飾され得る。

本発明において、抗体がヒトに投与される場合、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え抗体が投与され得る。遺伝子組換え抗体とは、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（humanized）抗体などを含む。これらの改変抗体は、公知の方法を用いて製造され得る。

キメラ抗体とは、互いに由来の異なる可変領域と定常領域を連結した抗体をいう。例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域と、ヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体は、マウス−ヒト−異種キメラ抗体である。ヒト抗体の定常領域をコードするDNAとインフレームで連結された、マウス抗体の可変領域をコードするDNAが発現ベクターに組み込まれることによって、キメラ抗体を発現する組換えベクターが作製され得る。当該ベクターによって形質転換された組換え細胞が培養され、組み込まれたDNAが発現する。培養中に生産される当該キメラ抗体が、当該組換え細胞の培養液から取得され得る。キメラ抗体およびヒト化抗体のC領域には、ヒト抗体のC領域が好適に使用される。

例えばH鎖のC領域としては、Cγ１、Cγ２、Cγ３、Cγ４、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、およびCεが利用され得る。またL鎖のC領域としては、Cκ、およびCλが使用され得る。これらのC領域のアミノ酸配列、ならびにそれをコードする塩基配列は公知である。また、抗体そのもの、あるいは抗体の産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域が適宜修飾され得る。

一般に、キメラ抗体は、ヒト以外の動物に由来する抗体のV領域とヒト抗体に由来するC領域とから構成される。これに対してヒト化抗体は、ヒト以外の動物に由来する抗体の相補性決定領域（CDR；complementarity determining region）と、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域（FR；framework region）およびヒト抗体に由来するC領域とから構成される。ヒト化抗体はヒト体内における免疫原性が低下しているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。

抗体の可変領域は、通常、４つのフレームワーク領域(framework region; FR)と当該FRにはさまれた３つの相補性決定領域（complementarity-determining region; CDR）で構成されている。CDRは、実質的に、抗体の抗原に対する結合特異性を決定している領域である。CDRのアミノ酸配列は多様性を有する。一方、異なる抗原に対する結合特異性を有する抗体の間でも、FRを構成するアミノ酸配列は高い類似性を示すことが多い。そのため、一般に、CDRのFRへの移植によって、ある抗体の結合特異性を、他の抗体に移植することができるといわれている。

ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される。具体的には、ヒト以外の動物、たとえばマウス抗体のCDRをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。

具体的には、マウスの抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、たとえばOverlap Extension PCR法が公知である。Overlap Extension PCR法では、ヒト抗体のFRを合成するために用いられるプライマーの配列に、移植されるマウス抗体のCDRをコードする塩基配列が付加される。４つのFRのそれぞれに用いられるプライマーが用意される。一般に、マウスCDRをヒトFRへ移植するためには、マウスCDRの由来するマウス抗体のFRと相同性の高いヒトFRを選択することが、CDRの機能を維持するために有利であるといわれている。すなわち、一般に、移植すべきマウスCDRに隣接しているマウスFRのアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列からなるヒトFRに当該マウスCDRを移植することが好ましい。

前記のように連結される塩基配列は、互いにインフレームで連結されるようにデザインされる。それぞれのプライマーを用いたPCRによってヒトFRが個別に合成される。その結果、各ヒトFRにマウスCDRをコードするDNAが付加されたPCR産物が得られる。各産物のマウスCDRをコードする塩基配列は、互いにオーバーラップするようにデザインされている。続いて、ヒト抗体遺伝子を鋳型として合成されたPCR産物のオーバーラップされたCDR部分が互いにアニールされて相補鎖合成反応が行われる。この反応によって、ヒトFRがマウスCDRの配列を介して連結される。

最終的に３つのCDRと４つのFRが連結されたV領域遺伝子は、その5’末端と3'末端にアニールする適切な制限酵素認識配列が付加されたプライマーを用いるPCRによってその全長が増幅される。上記のように得られたV領域遺伝子のDNAとヒト抗体C領域をコードするDNAがインフレームで融合されるように発現ベクター中に挿入することによって、ヒト型抗体発現用ベクターが作成され得る。当該発現ベクターが宿主に導入されて組換え細胞が樹立される。ヒト化抗体をコードするDNAが発現するように当該組換え細胞を培養することによって、ヒト化抗体が培養細胞の培養物中に産生される（EP239400、WO1996002576）。

上記のように作製されたヒト化抗体の抗原への結合活性を定性的又は定量的に測定し、評価することによって、CDRを介して連結されたときに当該CDRが良好な抗原結合部位を形成するようなヒト抗体のFRが好適に選択され得る。必要に応じ、再構成ヒト抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するようにヒト抗体のFRのアミノ酸残基が置換され得る。たとえば、マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用することによって、ヒトFRのアミノ酸配列に所望の変異が導入され得る。具体的には、ヒトFRにアニーリングするプライマーに部分的な塩基配列の変異が導入され得る。このようなプライマーを用いて合成されたヒトFRには、所望のアミノ酸置換をもたらす塩基配列の変異が導入される。アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を上記の方法で測定し評価することによって、所望の性質を有する変異FR配列が選択され得る（Sato, K.et al., Cancer Res, 1993, 53, 851-856）。

また、上に記載されるように、ヒト抗体の取得方法も公知である。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いたパンニングを行うことによって、ヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体のＶ領域が一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現される。抗原に対する結合活性を指標に選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結合するヒト抗体のV領域をコードするDNA配列が決定され得る。抗原に結合するscFvのDNA配列が決定された後、所望のヒト抗体C領域の配列とインフレームで融合された当該V領域配列が、適切な発現ベクターに挿入されることによってヒト抗体を発現するベクターが作製される。当該発現ベクターが上記に挙げたような好適な発現細胞中に導入される。当該発現細胞を培養して当該ヒト抗体をコードする遺伝子を発現することによって、当該ヒト抗体が取得される。これらの方法は既に公知である（WO1992001047, WO19992020791, WO1993006213, WO1993011236, WO1993019172, WO1995001438, WO1995015388）。

上記に挙げたように、本発明で用いられる抗体の好ましい態様の一つとして、ヒト定常領域を有する抗体もまた挙げられる。

本発明の抗体には、ITM2Aタンパク質に結合する限り、IgGに代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはIgMに代表される多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。本発明の抗体は、抗体の全長分子に限られず、ITM2Aタンパク質に結合する限り、低分子抗体またはその修飾物も好適に使用され得る。

低分子抗体は、全長抗体（whole antibody、例えばwhole IgG等）の一部分が欠損している抗体断片を含む。ITM2A抗原への結合能を有する限り、抗体分子の部分的な欠損は許容される。本発明における抗体断片は、重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）のいずれか、または両方を含んでいることが好ましい。また、本発明における抗体断片はCDRを含んでいることが好ましい。VHまたはVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入を有し得る。さらにITM2A抗原への結合能を有する限り、VHおよびVLのいずれか、または両方の一部が欠損し得る。又、キメラ化またはヒト化された可変領域が使用され得る。抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどが好適に挙げられる。また、低分子抗体の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（single chain Fv）、ダイアボディー、sc(Fv)2（single chain (Fv)2）、scFv-Fcなどが好適に挙げられる。これら抗体の多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も、本発明の低分子抗体に含まれる。

全長抗体を酵素で処理することによって、抗体断片が取得され得る。抗体断片を生成する酵素として、例えばパパイン、ペプシン、あるいはプラスミンなどが公知である。あるいは、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入することによって、適切な宿主細胞で当該抗体断片が発現し得る（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol.（1994）152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496、Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496、Lamoyi, E., Methods in Enzymology（1989）121, 652-663、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology（1989）121, 663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH（1991）9, 132-137）。

消化酵素は、全長抗体の特定のアミノ酸配列を認識し、次のような特定の構造の抗体断片に切断する。
パパイン消化：F(ab)2またはFab
ペプシン消化：F(ab’)2またはFab’
プラスミン消化：Facb
このような酵素的に得られた抗体断片に対して、遺伝子工学的手法を利用することによって、抗体の任意の部分が欠失される。

したがって、本発明における低分子抗体は、ITM2Aに対する結合親和性を有する限り、任意の領域を欠失した抗体断片を含む。

ダイアボディーとは、遺伝子融合により構築された二価（bivalent）の抗体断片をいう（Holliger P et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1993) 90, 6444-6448、EP404097、WO1993011161等）。ダイアボディーは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーである。通常、ダイマーを形成する各ポリペプチド鎖中でVL及びVHがリンカーを挟んでインフレームで結合されている。ダイアボディー中のリンカーは、一般には、同一のポリペプチド鎖中のVLとVHが互いに会合した抗原結合部位を有する単鎖可変領域フラグメントを形成することができない程度に短い。具体的には、リンカーを構成するアミノ酸残基は、例えば、5残基程度である。そのため、同一ポリペプチド鎖上にコードされるVLとVHが、別のポリペプチド鎖に存在するVHとVLと各々会合された二量体が形成される。その結果、ダイアボディーは2つの抗原結合部位を有する。

scFvは、抗体のVHとVLとを連結することにより得られる。scFvにおいて、VHとVLは、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを挟んで連結される（Huston, J. S. et al., Proc. Natl.Acad.Sci.USA (1988), 85, 5879-5883）。scFvにおけるVHおよびVLは、本明細書に記載されたいずれの抗体由来であってもよい。VHとVLを連結するペプチドリンカーの構造は、特に制限が課されない。例えば、３から25残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドがリンカーとして使用され得る。具体的には、たとえば後述のペプチドリンカー等が使用され得る。

VL及びVHは、たとえば上記で記載されるPCR法を用いることによって連結され得る。PCR法によるVL及びVHの連結のために、まず次のDNAのうち、全部あるいは所望の部分アミノ酸配列をコードするDNAが鋳型として利用される。
抗体のH鎖またはVHをコードするDNA配列、および
抗体のL鎖またはVLをコードするDNA配列

増幅すべきDNAの両端の部分配列を有するプライマーの一対を用いたPCR法によって、VL及びVHをコードするDNAがそれぞれ増幅される。次いで、ペプチドリンカー部分をコードするDNAが用意される。ペプチドリンカーをコードするDNAもPCRを利用して合成され得る。すなわち、利用するプライマーの5'側に、別に合成されたVL及びVHの増幅産物と連結することが可能な塩基配列が予め付加される。次いで、［VHをコードするDNA］−［ペプチドリンカーをコードするDNA］−［VLをコードするDNA］の各DNAと、アセンブリーPCR用のプライマーを利用してPCRを行う。

アセンブリーPCR用のプライマーは、［VHをコードするDNA］の5’側にアニールするプライマーと、［VLをコードするDNA］の3'側にアニールするプライマーとの組み合わせからなる。すなわち、アセンブリーPCR用プライマーとは、合成されるscFvの全長配列をコードするDNAがPCRによって増幅することを可能とするプライマーセットである。一方［ペプチドリンカーをコードするDNA］には、VH及びVLをコードするDNAと連結することが可能な塩基配列が予め付加されている。その結果、これらのDNAが連結され、さらにアセンブリーPCR用のプライマーを用いるPCRによって、最終的にscFvの全長が増幅産物として生成される。一旦、scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および当該発現ベクターによって形質転換された組換え細胞が常法に従って取得され得る。また、その結果得られる組換え細胞を培養して当該scFvをコードするDNAを発現させることにより、当該細胞の培養液から当該scFvが取得され得る。

scFv-Fcは抗体のVHとVLからなるscFvがFc領域とインフレームで融合された低分子抗体である（Cellular & Molecular Immunology (2006) 3, 439-443）。scFv-Fcの作製に用いられるscFvの由来は特に限定されないが、例えばIgM由来のscFvが好適に使用され得る。又、Fcの由来は特に限定されないが、例えばマウスIgG（マウスIgG2aなど）、ヒトIgG（ヒトIgG1など）が適宜使用され得る。従って、scFv-Fcの好ましい態様の例として、IgM抗体のscFv断片と、マウスIgG2aのCH2（たとえば、Cγ2）及びCH3（たとえば、Cγ3）とがマウスIgG2aのヒンジ領域（Hγ）を介して連結されたscFv-Fcや、IgM抗体のscFv断片と、ヒトIgG1のCH2及びCH3とがヒトIgG1のヒンジ領域を介して連結されたscFv-Fcが好適に挙げられる。

sc(Fv)2は、2つのVH及び2つのVLがリンカー等で結合され一本鎖のポリペプチドを形成する低分子抗体である（Hudson et al、J.Immunol.Methods (1999) 231, 177-189）。sc(Fv)2は、例えば、２つのscFvをリンカーで結ぶことによって作製され得る。

sc(Fv)2としては、例えば、２つのVH及び２つのVLが、一本鎖のポリペプチドのN末端側を起点としてVH、VL、VH、VL（［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が挙げられる。

2つのVHと2つのVLの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような配置も挙げることができる。
［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］
［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］
［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］
［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］

抗体の可変領域を結合するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、または合成化合物リンカー（例えば、Protein Engineering (1996) 9(3), 299-305）に開示されるリンカー等が好適に使用され得る。本発明においてはペプチドリンカーがリンカーとして好適に使用され得る。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能である。通常、ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基は、1から100アミノ酸、好ましくは3から50アミノ酸、更に好ましくは5から30アミノ酸、特に好ましくは12から18アミノ酸（例えば、15アミノ酸）である。

ペプチドリンカーを構成するアミノ酸配列は、scFvの結合作用を阻害しない限り、任意の配列が適宜採用され得る。例えば、ペプチドリンカーの場合次のようなアミノ酸配列が使用され得る。
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser (配列番号：７９）
Ser・Gly・Gly・Gly (配列番号：８０）
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser (配列番号：８１）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly (配列番号：８２）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser (配列番号：８３）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly (配列番号：８４）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser (配列番号：８５）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly (配列番号：８６）
（Gly・Gly・Gly・Gly・Ser）_ｎ
（Ser・Gly・Gly・Gly・Gly）_ｎ
［ｎは１以上の整数である］

ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。たとえば上記のペプチドリンカーの長さを決定するｎは、通常１〜５、好ましくは１〜３、より好ましくは１または２である。

よって本発明において特に好ましいsc(Fv)2の態様としては、例えば、以下のsc(Fv)2を挙げることができる。
［VH］ペプチドリンカー（15アミノ酸）［VL］ペプチドリンカー（15アミノ酸）［VH］ペプチドリンカー（15アミノ酸）［VL］

あるいは、合成化学物リンカー（化学架橋剤）を利用することによってV領域が連結され得る。ペプチド化合物などの架橋に通常用いられている架橋剤が本発明に好適に使用され得る。例えば次のような化学架橋剤が公知である。これらの架橋剤は市販されている。
N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、
ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、
ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、
ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、
ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、
エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、
エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−EGS）、
ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−DST）、
ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、および
ビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-BSOCOES）など

4つの抗体可変領域を連結するためには、通常、3つのリンカーが必要となる。複数のリンカーの配列は、同じ配列を有するリンカーが使用され得るし、異なる配列を有するリンカーも好適に使用され得る。本発明において好ましい低分子抗体はダイアボディー又はsc(Fv)2である。このような低分子抗体は、前述のように、全長抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理することによって、生成される。又は、これら抗体断片をコードするDNAが挿入された発現ベクターが導入された適切な宿主細胞の培養液から、このような低分子抗体が単離される（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137）。

また、本発明の抗体には、一価抗体だけでなく、多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。

抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子と結合した抗体も使用され得る。又、化学療法剤、毒性ペプチド或いは放射性化学物質などの細胞傷害性物質が結合された抗体も抗体修飾物として使用され得る。このような抗体修飾物（以下、抗体コンジュゲートと称する。）は、得られた抗体を化学的に修飾することによって取得され得る。尚、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。また、毒性ペプチドが結合された抗体修飾物は、当該毒性ペプチドをコードする遺伝子と抗体遺伝子がインフレームで連結された融合遺伝子を、適切な宿主細胞中で発現させた後に、当該細胞の培養液から単離することによって、取得され得る。さらに、後に述べるように、ITM2Aタンパク質を認識するのみならず、化学療法剤、毒性ペプチド、放射性化学物質などの細胞傷害性物質を認識するように遺伝子組換え技術を用いて設計された二重特異性抗体（bispecific antibody）のような分子型としても、本発明の抗修飾物は取得され得る。本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。

ITM2A抗体に結合させて細胞傷害活性を機能させる化学療法剤としては、たとえば次のような化学療法剤が例示できる：アザリビン（azaribine）、アナストロゾール（anastrozole）、アザシチジン（azacytidine）、ブレオマイシン（bleomycin）、ボルテゾミブ（bortezomib）、ブリオスタチン-1（bryostatin-1）、ブスルファン（busulfan）、カンプトテシン（camptothecin）、10-ヒドロキシカンプトテシン（10-hydroxycamptothecin）、カルムスチン（carmustine）、セレブレックス（celebrex）、クロラムブシル（chlorambucil）、シスプラチン（cisplatin）、イリノテカン（irinotecan）、カルボプラチン（carboplatin）、クラドリビン（cladribine）、シクロホスファミド（cyclophosphamide）、シタラビン（cytarabine）、ダカルバジン（dacarbazine）、ドセタキセル（docetaxel）、ダクチノマイシン（dactinomycin）、ダウノマイシングルクロニド（daunomycin glucuronide）、ダウノルビシン（daunorubicin）、デキサメタゾン（dexamethasone）、ジエチルスチルベストロール（diethylstilbestrol）、ドキソルビシン（doxorubicin）、ドキソルビシンブルクロニド（doxorubicin glucuronide）、エピルビシン（epirubicin）、エチニルエストラジオール（ethinyl estradiol）、エストラムスチン（estramustine）、エトポシド（etoposide）、エトポシドグルクロニド（etoposide glucuronide）、フロキシウリジン（floxuridine）、フルダラビン（fludarabine）、フルタミド（flutamide）、フルオロウラシル（fluorouracil）、フルオキシメステロン（fluoxymesterone）、ゲムシタビン（gemcitabine）、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート（hydroxyprogesterone caproate）、ヒドロキシウレア（hydroxyurea）、イダルビシン（idarubicin）、イフォスファミド（ifosfamide）、ロイコボリン（leucovorin）、ロムスチン（lomustine）、マイタンシノイド（maytansinoid）、メクロレタミン（mechlorethamine）、メドロキシプロゲステロンアセテート（medroxyprogesterone acetate）、メゲストロールアセテート（megestrol acetate）、メルファラン（melphalan）、メルカプトプリン（mercaptopurine）、メトトレキセート（methotrexate）、ミトキサントロン（mitoxantrone）、ミトラマイシン（mithramycin）、ミトマイシン（mitomycin）、ミトタン（mitotane）、フェニルブチレート（phenylbutyrate）、プレドニゾン（prednisone）、プロカルバジン（procarbazine）、パクリタキセル（paclitaxel）、ペントスタチン（pentostatin）、セムスチン（semustine）、ストレプトゾシン（streptozocin）、タモキシフェン（tamoxifen）、タキサン類（taxanes）、タキソール（taxol）、テストステロンプロピオネート（testosterone propionate）、サリドマイド（thalidomide）、チオグアニン（thioguanine）、チオテパ（thiotepa）、テニポシド（teniposide）、トポテカン（topotecan）、ウラシルマスタード（uracil mustard）、ビンブラスチン（vinblastine）、ビノレルビン（vinorelbine）、ビンクリスチン（vincristine）。

本発明において、好ましい化学療法剤は、低分子の化学療法剤である。低分子の化学療法剤は、抗体への結合の後も、抗体の機能に干渉する可能性が低い。本発明において、低分子の化学療法剤は、通常100〜2000、好ましくは200〜1000の分子量を有する。ここに例示した化学療法剤は、いずれも低分子の化学療法剤である。これらの本発明における化学療法剤は、生体内で活性な化学療法剤に変換されるプロドラッグを含む。プロドラッグの活性化は酵素的な変換であり得るし、非酵素的な変換でもあり得る。

また、抗体は毒性ペプチド（トキシン）で修飾され得る。毒性ペプチドの例としては、例えば、次のものが好適に挙げられる。
ジフテリアトキシンＡ鎖（Diphtheria toxin A Chain）（Langone J.J.,et al., Methods in Enzymology (1983) 93, 307-308）
シュードモナスエンドトキシン（Pseudomonas Exotoxin）（Nature Medicine (1996) 2, 350-353）
リシン鎖（Ricin A Chain）（Fulton R.J. et al., J.Biol.Chem. (1986) 261, 5314-5319; Sivam G. et al., Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173; Cumber A.J. et al., J.Immunol.Methods (1990) 135,15-24; Wawrzynczak E.J. et al., Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562; Gheeite V. et al., J.Immunol.Methods (1991) 142,223-230）
無糖鎖リシンＡ鎖（Deglicosylated Ricin A Chain）（Thorpe P.E. et al., Cancer Res. (1987) 47, 5924-5931）
アブリンＡ鎖（Abrin A Chain）（Wawrzynczak E.J. et al., Br.J.Cancer (1992) 66, 361-366; Wawrzynczak E.J.,et al. Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562; Sivam G.,et al. Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173; Thorpe P.E. et al., Cancer Res. (1987) 47, 5924-5931）
ゲロニン（Gelonin）（Sivam G. et al., Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173; Cumber A.J. et al., J.Immunol.Methods (1990) 135, 15-24; WawrzynczakE.J. et al. Cancer Res., (1990) 50, 7519-7562; Bolognesi A. et al., Clin.exp.Immunol. (1992) 89, 341-346）
ポークウイード抗ウィルス蛋白（PAP-s; Pokeweed anti-viral protein fromseeds）（Bolognesi A. et al., Clin.exp.Immunol. (1992) 89, 341-346）
ブリオジン（Briodin）（Bolognesi A. et al., Clin.exp.Immunol. (1992) 89, 341-346）
サポリン（Saporin）（Bolognesi A.,et al., Clin.exp.Immunol. (1992) 89, 341-346）
モモルジン（Momordin）（Cumber A.J. et al., J.Immunol.Methods (1990) 135, 15-24; Wawrzynczak E.J. et al., Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562; Bolognesi A. et al., Clin.exp.Immunol. (1992) 89, 341-346）
モモルコキン（Momorcochin）（Bolognesi A. et al., Clin.exp.Immunol. (1992) 89, 341-346）
ジアンシン３２（Dianthin 32）（Bolognesi A. et al., Clin.exp.Immunol. (1992) 89, 341-346）
ジアンシン３０（Dianthin 30）（Stirpe F.,Barbieri L., FEBS letter (1986) 195, 1-8）
モデッシン（Modeccin）（Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter (1986) 195, 1-8）
ビスカミン（Viscumin）（Stirpe F., Barbieri L.,FEBS letter (1986) 195, 1-8）
ボルケシン（Volkesin）（Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter (1986) 195, 1-8)
ドデカンドリン（Dodecandrin）（Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter (1986) 195,1-8）
トリチン（Tritin）（Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter (1986) 195,1-8）
ルフィン（Luffin）（Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter (1986) 195,1-8）
トリコキリン（Trichokirin）（Casellas P., et al., Eur.J.Biochem. (1988) 176, 581-588; Bolognesi A., et al., Clin.exp.Immunol., (1992) 89, 341-346)。

本発明において放射性化学物質とは、放射性同位体を含む化学物質のことをいう。使用される放射性同位体は特に限定されず、如何なる放射性同位体が使用され得るが、例えば、³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H、¹³¹I、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Reなどが好適に例示され得る。

また別の態様では、一または二以上の低分子化学療法剤と毒性ペプチドをそれぞれ組み合わせることによって、抗体が修飾され得る。抗ITM2A抗体と上記の低分子化学療法剤との結合は共有結合または非共有結合が利用され得る。これら化学療法剤を結合した抗体の作製方法は公知である。

更に、タンパク質性の薬剤や毒素は、遺伝子工学的な手法によって抗体と結合され得る。具体的には、たとえば上記毒性ペプチドをコードするDNAと抗ITM2A抗体をコードするDNAをインフレームで融合させて発現ベクター中に組み込んだ組換えベクターが構築され得る。当該ベクターを適切な宿主細胞に導入することにより得られる形質転換細胞が培養され、組み込んだDNAが発現される。こうして、毒性ペプチドを結合した抗ITM2A抗体が融合タンパク質として取得され得る。抗体との融合タンパク質を得る場合、一般に、抗体のC末端側にタンパク質性の薬剤や毒素が結合される。抗体と、タンパク質性の薬剤や毒素の間には、ペプチドリンカーが介在され得る。

さらに、本発明の抗体には二重特異性抗体（bispecific antibody）も包含される。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域が、同一の抗体分子内に包含される抗体をいう。本発明において、二重特異性抗体はITM2A分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有することができる。このような二重特異性抗体がITM2Aに結合する場合、１分子のITM2Aに対して２分子以上の二重特異性抗体が結合することが可能である。その結果、当該二重特異性抗体が細胞傷害活性を有する場合には、より多くのエフェクター細胞をリクルートすることが可能となり、その結果、より強力な細胞傷害作用を奏することが期待され得る。

あるいは、一方の抗原結合部位がITM2Aに結合し、他方の抗原結合部位が細胞傷害性物質に結合する二重特異性抗体も、本発明に使用され得る。細胞傷害性物質には、具体的には、化学療法剤、毒性ペプチド或いは放射性化学物質等が含まれる。このような二重特異性抗体は、ITM2Aを発現する細胞に結合する一方で、細胞傷害性物質を捕捉する。その結果、細胞傷害性物質がITM2Aを発現する細胞に直接作用することが可能となる。すなわちITM2Aに加えて、細胞傷害性物質を認識する二重特異性抗体を用いることによって、腫瘍細胞が特異的に傷害され、その結果、腫瘍細胞の増殖が抑制され得る。

また本発明においては、ITM2Aに結合するほか、腫瘍細胞に発現するITM2A以外の抗原にも結合する二重特異性抗体が使用され得る。たとえば、ITM2Aと同様に標的とする腫瘍細胞の表面に特異的に発現する抗原であって、ITM2Aとは異なる抗原及びITM2Aに結合する二重特異性抗体が使用され得る。

二重特異性抗体を製造するための方法は公知である。たとえば、認識抗原が異なる２種類の抗体を結合させることによって、二重特異性抗体が作製され得る。抗体を結合するに際して、それぞれがH鎖とL鎖を有する１／２分子が結合され得るし、H鎖のみからなる１／４分子が結合され得る。あるいは、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合することによって、二重特異性抗体産生融合細胞が作製され得る。さらに、遺伝子工学的手法によっても、二重特異性抗体が作製され得る。

抗体の抗原結合活性（Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）を測定するために、公知の手段が使用され得る。例えば、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）、FACS等のフローサイトメトリー法あるいは蛍光免疫法などが好適に使用され得る。

本発明の抗体には、その抗体の糖鎖が改変された抗体も含まれる。抗体の糖鎖を改変することによって、抗体の細胞傷害活性が増強されることが知られている。糖鎖が改変された抗体としては、例えば、次のような抗体が公知である；
グリコシル化が修飾された抗体（WO1999054342等）、
糖鎖に付加するフコースが欠損した抗体（WO2000061739、WO2002031140、WO2006067913等）、
バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体（WO2002079255等）。

本発明の抗体が治療目的で用いられる場合、抗体は好ましくは細胞傷害活性を有する抗体である。本発明における細胞傷害活性としては、例えば抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC）活性、補体依存性細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity：CDC）活性等が好適に例示される。また、ADCC活性とCDC活性を併せ持つ抗体もまた、細胞傷害活性を有する抗体として例示される。本発明において、CDC活性とは、補体系による細胞傷害活性をいう。一方ADCC活性とは、標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、当該抗体のFc部分にFcγ受容体を発現する細胞（免疫細胞等）がFcγ受容体を介して結合し、当該免疫細胞等が標的細胞に傷害を与える活性をいう。

抗ITM2A抗体がADCC活性を有するか否か、又はCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定され得る（例えば、Current protocols in Immunology, (1993) Chapter7. Immunologic studies in Humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.等）。

具体的には、まず、エフェクター細胞、補体溶液、標的細胞が調製される。
（１）エフェクター細胞の調製
CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、RPMI1640培地（Invitrogen社製）中で脾臓細胞が分離される。10％ウシ胎児血清（FBS、HyClone社製）を含む同培地で当該脾臓細胞が洗浄された後、細胞濃度を5x10⁶/mlに調製することによって、エフェクター細胞が調製され得る。
（２）補体溶液の調製
Baby Rabbit Complement（CEDARLANE社製）を10％ FBS含有培地（Invitrogen社製）にて10倍希釈することによって、補体溶液が調製され得る。
（３）標的細胞の調製
ITM2Aタンパク質を発現する細胞を0.2 mCiの51Cr-クロム酸ナトリウム（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）とともに、10％ FBS含有DMEM培地中で37℃にて1時間培養することにより当該標的細胞が放射性標識され得る。ITM2Aタンパク質を発現する細胞としては、ITM2Aタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞、ユーイング肉腫細胞、急性骨髄性白血病細胞、T細胞性リンパ腫細胞、T細胞性リンパ性白血病細胞等が使用され得る。放射性標識後に10％ FBS含有RPMI1640培地にて３回洗浄された細胞の濃度を2x10⁵/mlに調製することによって、当該標的細胞が調製され得る。

ADCC活性、又はCDC活性は下記に述べる方法により測定され得る。ADCC活性を測定する場合、各ウエルに、標的細胞と、抗ITM2A抗体が50μlずつ加えられた96ウェルＵ底プレート（Becton Dickinson社製）が、氷上にて15分間静置させる。次に、当該プレートの各ウエルに、エフェクター細胞100μlが加えられたプレートが、炭酸ガスインキュベーター内で4時間インキュベートされる。抗体の最終濃度は0または10μg/mlに調製される。インキュベーションの後、各ウエルから回収された100μlの上清の放射活性が、ガンマカウンター（COBRAII AUTO-GAMMA、MODEL D5005、Packard Instrument Company社製）を用いて測定される。このような測定から得られた下記の値；
Aは各試料における放射活性（cpm）、
Bは1％ NP-40（nacalai tesque社製）を加えた試料における放射活性（cpm）、
Cは標的細胞のみを含む試料の放射活性（cpm）、
を使用することによって、細胞傷害活性（%）は(A-C)/(B-C)x100の計算式に基づいて計算され得る。

一方、CDC活性を測定する場合は、各ウエルに、標的細胞と、抗ITM2A抗体が50μlずつ加えられた96ウェル平底プレート（Becton Dickinson社製）が、氷上にて15分間静置される。次に、当該プレートの各ウエルに、補体溶液100μlが加えられたプレートが、炭酸ガスインキュベーター内で4時間インキュベートされる。抗体の最終濃度は0または3μg/mlに調製される。インキュベーションの後、各ウエルから回収された100μlの上清の放射活性が、ガンマカウンターを用いて測定される。ADCC活性の測定と同様の計算式に基づいて、CDC活性による細胞傷害活性が計算され得る。

一方、抗体コンジュゲートによる細胞傷害活性を測定する場合は、各ウエルに、標的細胞と、抗ITM2A抗体コンジュゲートが50μlずつ加えられた96ウェル平底プレート（Becton Dickinson社製）が、氷上にて15分間静置される。次いで、当該プレートが炭酸ガスインキュベーター内で1から4時間インキュベートされる。抗体の最終濃度は0または3μg/mlに調製される。インキュベーションの後、各ウエルから回収された100μlの上清の放射活性が、ガンマカウンターを用いて測定される。ADCC活性の測定と同様の計算式に基づいて、抗体コンジュゲートによる細胞傷害活性計算され得る。

また、本発明で用いられる抗体の他の態様の一つとしてインターナライズ活性を有する抗体も好適に例示される。本発明において「インターナライズ活性を有する抗体」とは、細胞表面上のITM2Aに結合した際に細胞内（細胞質内、小胞内、他の小器官内など）に輸送される抗体を意味する。

抗体がインターナライズ活性を有するか否かは当業者に公知の方法を用いて確認することができ、例えば、標識物質を結合した抗ITM2A抗体がITM2Aを発現する細胞に接触した場合に当該標識物質が細胞内に取り込まれたか否かを確認する方法、細胞傷害性物質を結合した抗ITM2A抗体がITM2Aを発現する細胞に接触した場合に当該ITM2A発現細胞に細胞死が誘導されたか否かを確認する方法、等により確認することができる。より具体的には下記の実施例に記載された方法等によって、抗体がインターナライズ活性を有するか否かを確認することが可能である。

例えば上述の細胞傷害性物質が結合されたインターナライズ活性を有する抗体は、抗癌剤等の医薬組成物として使用され得る。

本発明の抗体としては、ITM2Aに結合する任意の抗体を利用することができる。たとえば以下（１）から（２５）に記載の抗体が好ましい抗体として例示できる。これらの抗体は、例えば、全長抗体、低分子抗体、動物抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、あるいはヒト抗体であってよい。
（１）CDR1として配列番号：３に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（２）CDR1として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：７に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（３）（１）に記載のH鎖、および（２）に記載のL鎖を含む抗体、
（４）CDR1として配列番号：９に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：１０に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：１１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（５）CDR1として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（６）（４）に記載のH鎖、および（５）に記載のL鎖を含む抗体、
（７）CDR1として配列番号：１５に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：１７に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（８）CDR1として配列番号：１８に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：１９に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（９）（７）に記載のH鎖、および（８）に記載のL鎖を含む抗体、
（１０）CDR1として配列番号：２１に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：２２に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：２３に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（１１）CDR1として配列番号：２４に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：２５に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：２６に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（１２）（１０）に記載のH鎖、および（１１）に記載のL鎖を含む抗体、
（１３）キメラ抗体である（１）から（１２）に記載の抗体、
（１４）ヒト化抗体である（１）から（１２）に記載の抗体、
（１５）配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む（１）又は（３）記載の抗体、
（１６）配列番号３０に記載のアミノ酸配列を含む（２）又は（３）記載の抗体、
（１７）配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含む（４）又は（６）記載の抗体、
（１８）配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む（５）又は（６）記載の抗体、
（１９）配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む（７）又は（９）記載の抗体、
（２０）配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む（８）又は（９）記載の抗体、
（２１）配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む（１０）又は（１２）記載の抗体、
（２２）配列番号４２に記載のアミノ酸配列を含む（１１）又は（１２）記載の抗体、
（２３）キメラ抗体である（１５）から（２２）に記載の抗体、
（２４）（１）〜（２３）いずれかに記載の抗体のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入され、かつ、その抗体と同等の活性又は同等の結合活性を有する抗体、
（２５）第２の抗体が結合しうるエピトープに結合することができる抗体であって、前記第２の抗体は、それぞれ（１）〜（２３）いずれかに記載の抗体であることを特徴とする抗体。

本発明において、本発明の抗体と同等の活性を有するとは、ITM2Aを発現する細胞への細胞傷害活性が同等であることをいう。また、本発明において、本発明の抗体と同等の結合活性を有するとは、ITM2Aへの結合活性が同等であることをいう。

ポリペプチドに変異を導入する方法は、あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法の一つである。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. Gene (1995) 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M. Methods Enzymol., (1983) 100, 468-500、Kramer, W. et al. Nucleic Acids Res., (1984) 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ Methods. Enzymol., (1987) 154, 350-367、Kunkel,TA Proc. Natl. Acad. Sci. USA., (1985) 82, 488-492、Kunkel, Methods Enzymol., (1988) 85, 2763-2766）などを用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、当該抗体と機能的に同等な抗体が調製され得る。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じ得る。このように、本発明の抗体のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、当該抗体と機能的に同等の活性を有する抗体、又は、同等の結合活性を有する抗体もまた本発明の抗体に含まれる。

このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内である。さらに好ましくは15アミノ酸以内であるし、10アミノ酸以内（例えば、9、8、7、6、5、4、3、2又は、1アミノ酸以内）である。

変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質に基づいて、次のような分類が確立されている。
疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、
親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、
脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、
水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、
硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、
カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、
塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、
芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）
（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表す）

あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが、その生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666、Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500、Wang, A. et al., Science (1984) 224, 1431-1433、Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413）。すなわち、一般に、あるポリペプチドを構成するアミノ酸配列中、各群に分類されたアミノ酸は、相互に置換したときに、当該ポリペプチドの活性が維持される可能性が高いといわれている。本発明において、上記アミノ酸群の群内のアミノ酸間の置換を保存的置換という。

また本発明は、本発明で開示された抗ITM2A抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体もまた提供する。すなわち本発明は、BE5-1、BE6-1、BE7-1-1、BE13-1が結合するエピトープと同一のエピトープに結合する抗体と、その用途に関する。このような抗体は、例えば、以下の方法により取得され得る。

被験抗体が、ある抗体とエピトープを共有することは、両者の同じエピトープに対する競合によって確認され得る。抗体間の競合は、交叉ブロッキングアッセイなどによって検出される。例えば競合ELISAアッセイは、好ましい交叉ブロッキングアッセイである。

具体的には、交叉ブロッキングアッセイにおいては、マイクロタイタープレートのウェル上にコートしたITM2Aタンパク質が、候補の競合抗体の存在下、または非存在下でプレインキュベートされた後に、本発明の抗ITM2A抗体が当該ウエルに添加される。ウェル中のITM2Aタンパク質に結合した本発明の抗ITM2A抗体の量は、同じエピトープへの結合に対して競合する候補競合抗体（被験抗体）の結合能に間接的に相関する。すなわち同一エピトープに対する被験抗体の親和性が大きくなればなる程、本発明の抗ITM2A抗体のITM2Aタンパク質をコートしたウェルへの結合量が低下するときは、被験抗体のITM2Aタンパク質をコートしたウェルへの結合量は増加する相関関係が確認される。

ウェルに結合した抗体量は、予め当該抗体を標識しておくことによって、容易に測定され得る。たとえば、ビオチン標識された抗体量は、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲートと適切な基質を使用することによって測定され得る。ペルオキシダーゼなどの酵素標識を利用した交叉ブロッキングアッセイは、特に競合ELISAアッセイといわれる。抗体は、検出あるいは測定が可能な他の標識物質で標識され得る。具体的には、放射標識あるいは蛍光標識などが公知である。

あるいは競合FACSアッセイも好ましい交叉ブロッキングアッセイである。

具体的には、競合ELISAアッセイにおいてマイクロタイタープレートのウェルにコーティングするITM2Aタンパク質のかわりにITM2Aタンパク質を発現した細胞が使用される。候補の競合抗体の存在下、または非存在下でITM2Aタンパク質を発現した細胞がプレインキュベートされた後に、ビオチンで標識した本発明の抗ITM2A抗体が添加される。ストレプトアビジンフルオロセインコンジュゲートを使用して蛍光を検出することにより抗体間の競合が測定され得る。フローサイトメトリーを利用した交叉ブロッキングアッセイは、特に競合FACSアッセイといわれる。抗体は、検出あるいは測定が可能な他の蛍光標識物質でも好適に標識され得る。

更に、被験抗体が、本発明の抗ITM2A抗体と異なる生物種に由来する定常領域を含む場合には、ウェルに結合したいずれかの生物種に由来する抗体は、当該生物種の抗体の定常領域を認識する標識抗体によって測定され得る。あるいは同一生物種由来の抗体の結合を検出する場合であっても、当該抗体のクラスが相違するときは、各クラスの抗体に特異的に結合する抗体によって、ウェルに結合した抗体が測定され得る。

候補の競合抗体の非存在下で実施されるコントロール試験の結果得られる結合活性と比較して、候補抗体が、少なくとも20％、好ましくは少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも40％、より好ましくは50%、抗ITM2A抗体の結合をブロックすることができるならば、当該候補競合抗体は、本発明の抗ITM2A抗体と実質的に同じエピトープに結合するか、又は、同じエピトープへの結合に対して競合する抗体である。なお、エピトープを測定する際には、本発明の抗体の定常領域が、被験抗体と同一の定常領域に置換され得る。

本発明の抗ITM2A抗体が結合するエピトープは上記の方法によって適宜決定され得るが、好適なエピトープは、ITM2Aタンパク質の細胞外領域を含む断片に存在し得る。このような断片の例としては、配列番号：１で表されるITM2Aタンパク質の75-263番目のアミノ酸からなるポリペプチドも好適な例として挙げられる。また、別の態様において、断片の例として配列番号：１で表されるITM2Aタンパク質の75-227番目のアミノ酸からなるポリペプチドも好適な例として挙げられる。

医薬組成物
別の観点においては、本発明は、ITM2Aタンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。又、本発明はITM2Aタンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤、特に抗癌剤に関する。本発明の細胞増殖抑制剤および抗癌剤は、癌を罹患している対象または罹患している可能性がある対象に投与されることが好ましい。後に実施例で示されるように、ITM2Aの発現レベルは正常細胞では低い一方、癌細胞では亢進していることから、抗ITM2A抗体の投与によって、癌細胞特異的な細胞傷害作用が得られると考えられる。

本発明の医薬組成物（例えば、抗癌剤）において用いられる抗ITM2A抗体は特に限定されず、如何なる抗ITM2A抗体であってもよく、例えば上述の抗ITM2A抗体が好適に用いられる。

本発明において、「ITM2Aに結合する抗体を有効成分として含有する」とは、抗ITM2A抗体を主要な活性成分として含むという意味であり、抗ITM2A抗体の含有率を制限するものではない。

本発明の医薬組成物が対象とする疾患が癌の場合、ITM2Aタンパク質が発現している癌であれば、対象となる癌は特に限定されないが、ユーイング肉腫やT細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍や多発性骨髄腫等の血液癌であることが好ましく、ユーイング肉腫が特に好ましい。また、ユーイング肉腫の中でもt(11;22)(q24;q12)染色体転座を有するユーイング肉腫が好適な対象とされるであろう。こうした癌は原発病巣および転移病巣のいずれであってもよい。

本発明において、傷害を引き起こす方法又は細胞の増殖を抑制する対象となるユーイング肉腫細胞がt(11;22)(q24;q12)染色体転座を有するか否かを判定するために、FISH法、PCR法等の公知な方法が適宜採用され得る。

FISH法では、t(11;22)(q24;q12)染色体転座を有することを判定するために、例えば、各々異なる蛍光を発するように標識された、EWS遺伝子を検出するプローブとFLI-1遺伝子を検出するプローブが、公知の方法で固定化された被験組織試料にハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションの結果、両者の蛍光が近接した融合シグナルが検出されるか否かを判定することによって、t(11;22)(q24;q12)染色体転座の存在が確認され得る。

また、t(11;22)(q24;q12)染色体転座を有することを判定するために、当該転座によって互いに分断される染色体部分を検出する二つのプローブを用いたFISH法も適宜採用され得る。すなわち、各々異なる蛍光を発するように標識される当該二つのプローブ（例えば、当該転座によって分断されるEWS遺伝子を検出する一組のプローブ又はFLI-1遺伝子を検出する一組のプローブ）が、公知の方法で固定化された被験組織試料にハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションの結果、両者の蛍光が分断された分離シグナルが検出されるか否かを判定することによって、t(11;22)(q24;q12)染色体転座の存在が確認され得る。

PCR法では、t(11;22)(q24;q12)染色体転座を有することを判定するために、EWS遺伝子及びFLI-1遺伝子を検出可能とする一組の二つのプライマーが設計される。当該一組のプライマーを用いたPCRの結果、当該転座によって生じた融合遺伝子が増幅されるようにプライマーが設計される。PCRの結果、当該転座によって生じた融合遺伝子の増幅の検出によって、t(11;22)(q24;q12)染色体転座の存在が確認され得る。

また、t(11;22)(q24;q12)染色体転座を有することを判定するために、当該転座によって互いに分断される染色体断片を検出可能とする一組の二つのプライマーが設計される。例えば、当該転座によって分断されるEWS遺伝子を検出する一組のプライマー又はFLI-1遺伝子を検出する一組のプライマーとして、及び、被験組織試料を鋳型として用いるPCRが実施される。転座を有しない試料を鋳型として用いるPCRから生成される染色体断片が、被験組織試料を鋳型として用いるPCR産物から検出されなければ、t(11;22)(q24;q12)染色体転座の存在が確認され得る。

本発明の医薬組成物は、経口、非経口投与のいずれかによって患者に投与され得る。好ましくは非経口投与である。係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが好適に挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の医薬組成物が全身または局部的に投与され得る。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法が選択され得る。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で投与量が選択され得る。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000mg/bodyの範囲で投与量が選択され得る。しかしながら、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。

本発明の医薬組成物は、常法に従って製剤化され得る（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）。また、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものも好適に使用される。こうした担体や添加物の例としては、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられる。更にこれらに制限されず、その他常用の担体も適宜使用され得る。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等をこうした常用の担体として挙げられ得る。

また、本発明は、ITM2A発現細胞とITM2Aタンパク質に結合する抗体とを接触させることによりITM2A発現細胞に傷害を引き起こす方法又は細胞の増殖を抑制する方法を提供する。

本発明の方法において用いられる抗体は、特に限定されないが、例えば上述の抗体を用いることが可能である。抗ITM2A抗体が結合する細胞はITM2Aが発現している細胞であれば特に限定されない。本発明における好ましいITM2A発現細胞は癌細胞である。より好ましくは、ユーイング肉腫細胞やT細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍や多発性骨髄腫等の血液癌の細胞である。本発明の方法は、これらの癌の、原発病巣および転移病巣のいずれに対しても適用され得る。さらに好ましい癌細胞は、ユーイング肉腫細胞、および転移性ユーイング肉腫細胞である。また、ユーイング肉腫細胞の中でもt(11;22)(q24;q12)染色体転座を有するユーイング肉腫細胞が好適な対象とされるであろう。こうした染色体転座を有するユーイング肉腫細胞は原発病巣および転移病巣のいずれであってもよい。

本発明において、傷害を引き起こす方法又は細胞の増殖を抑制する対象となるユーイング肉腫細胞がt(11;22)(q24;q12)染色体転座を有するか否かを判定するために、FISH法、PCR法等の公知な方法が適宜採用され得る。

FISH法では、t(11;22)(q24;q12)染色体転座を有することを判定するために、例えば、各々異なる蛍光を発するように標識された、EWS遺伝子を検出するプローブとFLI-1遺伝子を検出するプローブが、公知の方法で固定化された被験組織試料にハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションの結果、両者の蛍光が近接した融合シグナルが検出されるか否かを判定することによって、t(11;22)(q24;q12)染色体転座の存在が確認され得る。

また、t(11;22)(q24;q12)染色体転座を有することを判定するために、当該転座によって互いに分断される染色体部分を検出する二つのプローブを用いたFISH法も適宜採用され得る。すなわち、各々異なる蛍光を発するように標識される当該二つのプローブ（例えば、当該転座によって分断されるEWS遺伝子を検出する一組のプローブ又はFLI-1遺伝子を検出する一組のプローブ）が、公知の方法で固定化された被験組織試料にハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションの結果、両者の蛍光が分断された分離シグナルが検出されるか否かを判定することによって、t(11;22)(q24;q12)染色体転座の存在が確認され得る。

PCR法では、t(11;22)(q24;q12)染色体転座を有することを判定するために、EWS遺伝子及びFLI-1遺伝子を検出可能とする一組の二つのプライマーが設計される。当該一組のプライマーを用いたPCRの結果、当該転座によって生じた融合遺伝子が増幅されるようにプライマーが設計される。PCRの結果、当該転座によって生じた融合遺伝子の増幅の検出によって、t(11;22)(q24;q12)染色体転座の存在が確認され得る。

また、t(11;22)(q24;q12)染色体転座を有することを判定するために、当該転座によって互いに分断される染色体断片を検出可能とする一組の二つのプライマーが設計される。例えば、当該転座によって分断されるEWS遺伝子を検出する一組のプライマー又はFLI-1遺伝子を検出する一組のプライマーとして、及び、被験組織試料を鋳型として用いるPCRが実施される。転座を有しない試料を鋳型として用いるPCRから生成される染色体断片が、被験組織試料を鋳型として用いるPCR産物から検出されなければ、t(11;22)(q24;q12)染色体転座の存在が確認され得る。

本発明において「接触」は、例えば、試験管内で培養しているITM2A発現細胞の培養液に抗体を添加することにより行われる。また本発明において「接触」は更に、ITM2A発現細胞を体内に移植した非ヒト動物や内在的にITM2Aを発現する癌細胞を有する動物に投与することによっても行われる。

抗ITM2A抗体の接触によってITM2A発現細胞に引き起こされた細胞傷害を評価又は測定する方法として、以下の方法が好適に使用される。試験管内において該細胞傷害活性を評価又は測定する方法としては、上記の抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC）活性、補体依存性細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity：CDC）活性などの測定法を挙げることができる。抗ITM2A抗体がADCC活性を有するか否か、又はCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in Humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.,(1993)等）。活性の測定に際しては、対照抗体として抗ITM2A抗体と同一のアイソタイプを有する抗体で該細胞傷害活性を有しない結合抗体を、抗ITM2A抗体と同様に使用して、抗ITM2A抗体が対照抗体よりも強い細胞傷害活性を示すことにより活性を判定することができる。

抗体のアイソタイプは、その抗体のアミノ酸配列のH鎖定常領域の配列で規定される。生体内においては、抗体産生Ｂ細胞の成熟化の際に起こる染色体上の遺伝子組み換えにより生じるクラススイッチによって抗体のアイソタイプが最終的に決定される。アイソタイプの相違が抗体の生理的・病理的機能の相違に反映される。具体的には、例えば、細胞傷害活性の強度は抗原の発現量と共に、抗体のアイソタイプによっても影響されることが知られている。従って、上記記載の細胞傷害活性の測定に際しては、対照として用いられる抗体は被験抗体と同一のアイソタイプを用いることが好ましい。

また、生体内で細胞傷害活性を評価、あるいは測定するために、例えばITM2A発現癌細胞を非ヒト被験動物の皮内又は皮下に移植後、当日又は翌日から毎日又は数日間隔で被験抗体が静脈又は腹腔内に投与される。腫瘍の大きさを経日的に測定することにより被験抗体の細胞傷害活性が判定され得る。試験管内での評価と同様に、同一のアイソタイプを有する対照抗体が投与され、被験抗ITM2A抗体投与群における腫瘍の大きさが対照抗体投与群における腫瘍の大きさよりも有意に小さいことが示されることにより、被験抗ITM2A抗体が細胞傷害活性を有すると判定され得る。非ヒト被験動物としてマウスを用いる場合には、胸腺を遺伝的に欠損してそのＴリンパ球の機能を欠失したヌード（nu/nu）マウスが好適に用いれらる。当該マウスを使用することにより、投与された抗体による細胞傷害活性の評価・測定に当たって被験動物中のTリンパ球の関与が除かれる。

本発明の方法の一つの態様においては、被験試料中のITM2Aタンパク質を検出することによる癌の診断を提供する。本態様においては、好ましくは、ITM2Aタンパク質の細胞外領域が検出される。ITM2Aタンパク質の検出は、ITM2Aタンパク質を認識する抗体が好適に使用され得る。

本発明の診断方法の具体例の一つとして、以下の工程を含む癌の診断方法を挙げることができる。
（ａ） 被験者から採取された試料を提供する工程、
（ｂ） 採取された試料に含まれるITM2Aタンパク質を、ITM2Aタンパク質に結合する抗体を用いて検出する工程。

本発明において検出とは、定量的または定性的な検出を含む。例えば、定性的な検出としては、次のような測定を挙げることができる。
単にITM2Aタンパク質が存在するか否かの測定
ITM2Aタンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定
ITM2Aタンパク質の量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定など
一方、定量的な検出とは、ITM2Aタンパク質の濃度の測定、ITM2Aタンパク質の量の測定などを挙げることができる。

本発明における被験試料は、ITM2Aタンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されない。具体的には、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましい。さらに好ましい試料は、ヒトから採取された試料である。被験試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿、組織、腹水、腹腔内洗浄液などが例示できる。好ましい試料は、生物の体から採取された組織若しくは細胞が固定化された標本又は細胞の培養液などの被験試料から得られる試料である。

本発明によって診断される癌は、特に制限されることはなく如何なる癌でもよい。具体的には、ユーイング肉腫やT細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍や多発性骨髄腫等の血液癌を挙げることができる。本発明においては、これらの癌の原発病巣、および転移病巣のいずれをも診断することができる。また、ユーイング肉腫細胞の中でもt(11;22)(q24;q12)染色体転座を有するユーイング肉腫が診断され得る。こうした染色体転座を有するユーイング肉腫は原発病巣および転移病巣のいずれであってもよい。

本発明においては、被験試料中にITM2Aタンパク質が検出された場合に、そのレベルを指標として癌が診断される。具体的には、陰性コントロールまたは健常者と比較して被験試料中に検出されるITM2Aタンパク質の量が多い場合に、被験者が癌である、または将来癌を羅患する可能性が高いことが示される。すなわち本発明は、次の工程を含む癌の診断方法に関する。
(1) 被験者から採取された生体試料中のITM2Aの発現レベルを検出する工程、および
(2) (1)で検出されたITM2Aの発現レベルが、対照と比較して高い場合に被験者が癌を有すると判定される工程。

本発明において、対照とは、比較の基準となる試料をいい、陰性コントロールや健常者の生体試料が含まれる。陰性コントロールは、健常者の生体試料を採取し、必要に応じて混合することによって取得され得る。対照のITM2Aの発現レベルは、被験者の生体試料におけるITM2Aの発現レベルと平行して検出され得る。あるいは、予め、多数の健常者の生体試料におけるITM2Aの発現レベルが検出され、健常者における標準的な発現レベルが統計学的に決定され得る。このように統計的に決定された値も、被験生体試料中のITM2Aの発現レベルの対照値として用いられる。具体的には、たとえば、平均値±２x標準偏差(S.D.)、あるいは平均値±３x標準偏差(S.D.)が標準値として使用され得る。統計学的に、平均値±２x標準偏差(S.D.)は80％の、また平均値±３x標準偏差(S.D.)は90％の健常者の値を含む。

あるいは、対照におけるITM2Aの発現レベルが、ROC曲線を利用して設定され得る。ROC曲線(receiver operating characteristic curve；受信者操作特性曲線）は、縦軸に検出感度を、横軸に擬陽性率（すなわち"１−特異度"）を示すグラフである。本発明においては、生体試料中のITM2Aの発現レベルを判定するための基準値を連続的に変化させたときの、感度と擬陽性率の変化をプロットすることによって、ROC曲線が取得され得る。

なおROC曲線を得るための「基準値」は、統計学的な解析のために一時的に利用される数値である。ROC曲線を得るための「基準値」は、一般的には、選択しうる全ての基準値をカバーできる範囲内で、連続的に変化させられる。たとえば、解析される集団のITM2Aの測定値の最小値と最大値の間で、基準値が変化され得る。

得られたROC曲線に基づいて、所望の検出感度、並びに精度を期待できる標準値が選択され得る。ROC曲線などによって統計学的に設定された標準値は、カットオフ値(cut-off value)とも呼ばれる。カットオフ値に基づく癌の検出方法においては、上記工程(2)において、(1)で検出されたITM2Aの発現レベルが、カットオフ値と比較される。そして、カットオフ値よりも(1)で検出されたITM2Aの発現レベルが高いときに、被験者の癌が検出される。

本発明において、ITM2Aの発現レベルは、任意の方法によって決定され得る。具体的には、ITM2Aタンパク質の量、そしてITM2Aタンパク質の生物学的な活性を評価することによって、ITM2Aの発現レベルを知ることができる。ITM2Aのタンパク質の量は、本明細書に記載したような方法によって決定され得る。

本発明においては、ITM2Aタンパク質を発現する任意の動物種が被験者として選択され得る。例えば、アカゲザル（Macaca mulatta）（ENSMMUG00000003564）、マーモセット（Callithrix jacchus）（ENSCJAG00000009591）、スマトラオランウータン（Pongo abelii）（LOC100431628）、アナウサギ（Oryctolagus cuniculus）（ENSOCUG00000008651）、ウマ（Equus caballus）（ENSECAG00000011335）、マウス（Mus musculus）（ENSMUSG00000031239）、ジャイアントパンダ（Ailuropoda melanoleuca）（LOC100476516）、ラット（Rattus norvegicus）（ENSRNOG00000002365）、ブタ（Sus scrofa）（ENSSSCG00000012448）、ニワトリ（Gallus gallus）（ENSGALG00000004107）、等、ヒト以外の多くの哺乳類の個体中で、ITM2Aタンパク質が発現していることが知られている。したがって、これらの動物は、本発明における被験者に含まれる。特に好適な被験者はヒトである。なおヒト以外の動物を被験者とするときは、当該動物種のITM2Aタンパク質が検出される。

ヒト以外の動物種のITM2Aタンパク質を検出する際に抗ITM2A抗体が用いられる場合には、当該動物種のITM2Aタンパク質のみに結合する抗ITM2A抗体も使用され得る。また、当該動物種由来のITM2Aタンパク質のみならず他の動物種由来のITM2Aタンパク質にも結合し得る、いわゆる交差性を有する抗ITM2A抗体も好適に使用され得る。さらに、ヒトのITM2Aタンパク質を検出する際に抗ITM2A抗体が用いられる場合には、ヒトITM2Aのみに結合する抗ITM2A抗体のみならず、他の動物種由来のITM2Aタンパク質にも結合し得る抗ITM2A抗体もまた好適に使用され得る。

被験試料に含まれるITM2Aタンパク質の検出方法は、特に限定されないが、抗ITM2A抗体を用いた、以下に例示されるような免疫学的方法により検出することが好適である；
ラジオイムノアッセイ（RIA）、
エンザイムイムノアッセイ（EIA）、
蛍光イムノアッセイ（FIA）、
発光イムノアッセイ（LIA）、
免疫沈降法（IP）、
免疫比濁法（TIA）、
ウエスタンブロット（WB）、
免疫組織化学（IHC）法、
免疫拡散法（SRID）。

これらの手法の中で、免疫組織化学（IHC）法は、癌に羅患した被験者から取得した組織若しくは細胞を固定化した切片上でITM2Aタンパク質を検出する工程を含み、癌の診断方法として好ましい免疫学的アッセイ法の一つである。免疫組織化学（IHC）法などの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法である。

すなわち、ITM2Aは、癌細胞において特異的に発現が増強している膜タンパク質であることから、抗ITM2A抗体によって、癌細胞、あるいは癌組織が検出され得る。上記の免疫組織学的な解析によって、生体から採取された細胞や組織に含まれる癌細胞が検出され得る。

別の好ましい態様では、生体内の癌組織が、抗ITM2A抗体を用いた非侵襲的方法によって検出され得る。すなわち本発明は、(1)放射性同位元素等の標識物質で標識されたITM2Aタンパク質に結合する抗体を被験者に投与する工程と、(2)該標識物質の集積を検出する工程を含む癌の検出方法に関する。生体内に投与した抗ITM2A抗体を追跡するために、抗ITM2A抗体が、検出可能に標識され得る。たとえば蛍光物質や発光物質、あるいは放射性同位元素で標識された抗体の生体における挙動が追跡され得る。蛍光物質や発光物質で標識された抗ITM2A抗体は、内視鏡や腹腔鏡を利用して観察され得る。放射性同位元素は、その放射活性を追跡することによって、抗ITM2A抗体の局在が画像化され得る。本発明において、生体内における抗ITM2A抗体の局在は、癌細胞の存在を表すこととなる。

生体内の癌を検出する目的に使用される抗ITM2A抗体を標識する放射性同位元素として、陽電子放出核種が利用され得る。たとえば¹⁸F、⁵⁵Co、⁶⁴Cu、⁶⁶Ga、⁶⁸Ga、⁷⁶Br、⁸⁹Zr、および¹²⁴Iのような陽電子放出核種で抗体が標識され得る。これらの陽電子放出核種による抗ITM2A抗体の標識には、公知の方法（Acta Oncol. 32, 825-830, 1993）が利用され得る。

陽電子放出核種で標識された抗ITM2A抗体がヒトや動物に投与された後に、PET（ポジトロン断層撮影装置）により、その放射性核種が放射する放射線が体外から計測され、計測された結果がコンピュータートモグラフィーの手法で画像に変換される。PETは、薬物の体内挙動などに関するデータを非侵襲的に得るために用いられる装置である。PETによって、シグナル強度として示される放射強度が、定量的に画像化され得る。上記のようにPETを使用することによって、患者から試料を採取することなく特定の癌で高発現する抗原分子が検出できる。すなわち本発明において、ユーイング肉腫やT細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍や多発性骨髄腫等の血液癌で高発現するITM2Aタンパク質が検出され得る。また、本発明においては、ユーイング肉腫細胞の中でもt(11;22)(q24;q12)染色体転座を有するユーイング肉腫で発現するITM2Aタンパク質が検出され得る。ユーイング肉腫や急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍や多発性骨髄腫、又は、t(11;22)(q24;q12)染色体転座を有するユーイング肉腫は原発病巣および転移病巣のいずれであってもよい。抗ITM2A抗体は、上記の核種の他に¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸F、⁴⁵Ti等の陽電子放出核種を用いた短寿命核種によって放射標識され得る。

医療用サイクロトロンによる上記核種を用いた短寿命核種の生産、短寿命放射標識化合物の製造技術等に関する研究開発が進められている。これらの技術により抗ITM2A抗体が種々の放射性同位元素によって標識され得る。患者に投与された抗ITM2A抗体は、各部位の病理組織に対する抗ITM2A抗体の特異性に従って原発病巣及び転移病巣に集積する。抗ITM2A抗体が陽電子放出核種で標識されていれば、その放射活性を検出することにより、当該原発病巣および転移病巣の存在が放射活性の局在によって検出される。当該診断用途に用いる場合には、25-4000 keVのガンマ粒子又は陽電子放射量の活性値が適切に使用され得る。また、適切な核種を選択することによって、さらに大量に投与すれば治療効果も期待され得る。放射線による抗癌作用を得るためには、70-700 keVのガンマ粒子または陽電子放射量値を与える核種が使用され得る。

また、別の態様において、本発明は、ITM2Aタンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物を投与する被験者、若しくは、ITM2A発現細胞とITM2Aタンパク質に結合する抗体とを接触させることによりITM2A発現細胞に傷害を引き起こす方法又は細胞の増殖を抑制する方法を適用する被験者を選択する方法を提供する。さらに、本発明の別の態様においては、本発明の抗ITM2A抗体による癌の治療の奏功性を予測する方法が提供される。

上述したように、ITM2Aタンパク質に結合する抗体や、当該抗体を有効成分として含有する医薬組成物が投与される対象とされる被験者、及び、これらの投与による治療の奏功性が予測される被験者として、その被験者の生体中に存在するユーイング肉腫細胞やT細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍や多発性骨髄腫等の血液癌細胞においてITM2Aタンパク質が発現している被験者が好適に選択される。本発明の方法は、これらの腫瘍又は癌が原発病巣又は転移病巣であるか否かは問われない。また、ユーイング肉腫の中でもt(11;22)(q24;q12)染色体転座を有するユーイング肉腫をその生体中に有する被験者が好適な対象として選択されるであろう。こうした染色体転座を有するユーイング肉腫は原発病巣および転移病巣のいずれであってもよい。

本発明において、傷害を引き起こす方法又は細胞の増殖を抑制する対象となるユーイング肉腫細胞がt(11;22)(q24;q12)染色体転座を有するか否かを判定するための方法は前述されている。

本発明は、被験試料中のITM2Aタンパク質を検出するための試薬を含む、癌の診断のための診断薬またはキットも提供する。本発明の診断薬は、少なくとも抗ITM2A抗体を含む。

本発明の癌の診断用試薬と、ITM2Aの検出に用いられるその他の要素を組み合わせることによって、癌の診断のためのキットとして使用され得る。すなわち本発明は、ITM2Aに結合する抗体と、当該抗体とITM2Aとの結合を検出する試薬を含み、さらにITM2Aを含む生体試料からなる対照試料をさらに含むことも可能である、癌の診断のためのキットに関する。本発明のキットには、更に測定操作を説明するための指示書もキットに添付され得る。

本明細書において用いる場合、「・・・を含む（comprising）」との表現により表される態様は、「本質的に・・・からなる（essentially consisting of）」との表現により表される態様、ならびに「・・・からなる（consisting of）」との表現により表される態様を包含する。

なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

［実施例１］ITM2A mRNAの発現解析
Human Exon 1.0 ST Array（Affymetrix）を用いて、ユーイング肉腫臨床サンプル、ユーイング肉腫細胞株、血液癌細胞株、および正常組織におけるITM2A mRNAの発現が測定された。発現解析には、図1に示される各サンプルのtotal RNA 1μgが用いられた。当該解析は、GeneChip Whole Transcript (WT) Sense Target Labeling Assay Manual（Affymetrix）に記載された方法に準じて実施された。データの数値化にはExon Array Computational Toolソフトウェア（Affymetrix）が用いられた。当該解析に用いる正常組織のtotal RNAとして、Clontech、Ambion、Stratagene、Cell Applications、Panomics、ChemiconおよびBiochain Instituteから購入した正常組織由来のtotal RNAが使用された。（インフォームドコンセントが得られた上で取得された）臨床癌組織の腫瘍部や正常部、癌細胞株から、Trizol（Invitrogen）またはIsogen（Nippon Gene）を用いてこれらの製品添付の方法に従ってtotal RNAが調製された。ITM2Aのコアプローブセット（プローブセットID; 4013550、4013551、4013552、4013553、4013554、4013557、4013559、4013560、4013561、4013564、4013565）の数値の平均値が発現データとして見積もられた。

発現解析の結果、正常組織におけるITM2A mRNAの発現量は最大でも1000前後であるのに対して、ユーイング肉腫細胞株や臨床サンプルでは2000から7000カウントであり、ユーイング肉腫でのITM2Aの発現が確認された（図1）。また、急性骨髄性白血病細胞株KG-1やHL60、B細胞腫瘍細胞株IM9、多発性骨髄腫細胞株KMS-12-BMでも2000前後のITM2Aの発現が確認された。従って、ITM2Aがユーイング肉腫やT細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍又は多発性骨髄腫等の血液癌の治療標的および診断マーカーとなることが示された。

［実施例２］ITM2Aに対するモノクローナル抗体の作製
（２−１）ITM2Aのクローニング
癌細胞株IM9からTrizolを用いて調製されたtotal RNAを鋳型として、SuperScript III Reverse Transcriptase（Invitrogen）を用いてcDNAが作製された。このcDNAを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号：４３）とリバースプライマー（配列番号４４）を用いてITM2AがPCRによって増幅された。PCRにはPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（Takara Bio）が用いられ、98℃ 10秒、55℃ 15秒、68℃ 1分からなる反応サイクルが30サイクル反復された。当該PCRから生成された増幅産物が、pCR2.1-TOPOベクター（Invitrogen）にクローニングされ、pCR2.1＿ITM2Aが得られた。pCR2.1＿ITM2Aの挿入配列をシークエンスすることによって、当該挿入配列がRefSeq Accession No. NM＿004867.4で登録された配列と同じであることが確認された。

（２−２）DNA免疫用発現ベクターの作製
（http://www.uniprot.org/を用いた解析の結果Tyr75-Glu263であると推定された）ITM2A細胞外領域が、哺乳動物細胞用発現ベクター（pMCN2i）にクローニングされた。pMCN2iはマウスCMVプロモーター（GenBank Accession No. U68299）の制御下で挿入遺伝子が発現誘導を可能とし、ネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれたベクターである。シグナル配列にはマウスインターロイキン3のシグナル配列が用いられた。まず、pCR2.1＿ITM2Aを鋳型として、SfiIサイトを有するフォワードプライマー（配列番号：４５）とNotIサイトを有するリバースプライマー（配列番号：４６）を用いてITM2A細胞外領域がPCRによって増幅された。当該PCRから生成された増幅産物がpCR2.1-TOPOベクターにクローニングされた。クローニングの結果得られたプラスミドのSfiIとNotIを用いた消化断片が、pMCN2i＿mIL3ss-mIgG2aFcベクターのSfiI-NotIサイトにクローニングされたプラスミド（pMCN2i＿mIL3ss-ITM2Aoutside）が得られた。pMCN2i＿mIL3ss-mIgG2aFcベクターには、EcoRI-SfiIサイトにマウスインターロイキン3シグナル配列がクローニングされており、CpoI-NotIサイトにマウスIgG2a抗体Fc領域がクローニングされている。pMCN2i＿mIL3ss-ITM2AoutsideのITM2A細胞外領域を含む挿入配列中の開始コドンからストップコドンまでの塩基配列が配列番号：４７に、アミノ酸配列が配列番号：４８に示される。

（２−３）免疫用タンパクの作製
ITM2A細胞外領域（Tyr75-Glu263）とマウスIgG2aのFc領域の融合タンパク（ITM2A-Fc）が作製された。まず、pCR2.1＿ITM2Aを鋳型として、SfiIサイトを有するフォワードプライマー（配列番号：４９）とCpoIサイトを有するリバースプライマー（配列番号：５０）を用いてPCRによって増幅されたITM2A細胞外領域が、pCR2.1-TOPOベクターにクローニングされた。クローニングの結果得られたプラスミドのSfiIとCpoIを用いた消化断片が、pMCN2i＿mIL3ss-mIgG2aFcベクターのSfiI-CpoIサイトにクローニングされたプラスミドpMCN2i＿mIL3ss-ITM2Aoutside-Fcが得られた。pMCN2i＿mIL3ss-ITM2Aoutside-FcのITM2A-Fcを含む挿入配列中の開始コドンからストップコドンまでの塩基配列が配列番号：５１に、アミノ酸配列が配列番号：５２に示される。

次に、PvuIで消化されたpMCN2i＿mIL3ss-ITM2Aoutside-Fcが、CHO細胞株DG44 （Invitrogen）へエレクトロポレーションにより形質導入された。ジェネティシン（Geneticin）（500μg/mL）で形質導入株を選抜することにより、ITM2A-Fcを定常的に分泌するCHO細胞株が樹立された。培養にはジェネティシン（500μg/mL）、HT Supplement（Invitrogen）、ペニシリン/ストレプトマイシン（Invitrogen）が添加されたCHO-S-SFM II培地（Invitrogen）が培地として用いられた。前記のように樹立された細胞の培養上清からITM2A-Fcタンパクが精製された。まず、培養上清がHiTrap rProtein A FFカラム（GE Healthcare）にアプライされ、当該カラムが結合バッファー（20mMリン酸ナトリウムpH 7.0）で洗浄後、抗体が溶出バッファー（0.1Mグリシン-HCl pH2.7）で溶出された。中和バッファー（1M Tris-HCl pH9.0）で中和された溶出液の緩衝液が、PD-10カラム（GE Healthcare）を用いてPBSに置換された。タンパク質の濃度はDC Protein Assay Kit I（Bio-Rad）を用いて測定された。

（２−４）ITM2A強制発現細胞株の作製
C末端にHAタグを付加されたITM2AがpMCN2iベクターにクローニングされた。まず、pCR2.1＿ITM2Aを鋳型として、EcoRIサイトを有するフォワードプライマー（配列番号：５３）とNotIサイトおよびHAタグ配列を有するリバースプライマー（配列番号：５４）を用いてPCRによって増幅されたITM2Aが、pCR2.1-TOPOベクターにクローニングされた。クローニングの結果得られたプラスミドのEcoRIとNotIを用いた消化断片が、pMCN2iベクターのEcoRI-NotIサイトにクローニングされたプラスミドpMCN2i＿ITM2A-HAが得られた。pMCN2i＿ITM2A-HAのITM2Aを含む挿入配列中の開始コドンからストップコドンまでの塩基配列が配列番号：５５に、アミノ酸配列が配列番号：５６に示される。PvuIで消化されたpMCN2i＿ITM2A-HAが、DG44細胞へエレクトロポレーションにより形質導入された。ジェネティシン（500μg/mL）で形質導入株を選抜することにより、C末端HAタグ付加ITM2Aを定常的に発現するCHO細胞株が樹立された（ITM2A＿CHO）。

（２−５）抗ITM2Aモノクローナル抗体の作製
Balb/cマウス（メス、8週令、日本チャールス・リバー株式会社）に対し、Helios Gene Gun（Bio-Rad）を用いて7回DNA免疫が行われた（day 0、7、11、14、17、21、24）。DNA免疫にはpMCN2i＿mIL3ss-ITM2Aoutsideが用いられた。DNA免疫に続いて、フロインド不完全アジュバント（Freund Incomplete Adjuvant）（BD Diagnostics）と混合された50μg のITM2A-Fcタンパク質が皮下に注射された（day 49、91、99、107）。Day 115に50μgのITM2A-Fcタンパク質がアジュバントと混合されることなく尾静脈から投与され、その3日後に摘出された脾臓を出発材料として用いてハイブリドーマが作製された。まず、摘出された脾臓細胞がマウスミエローマ細胞株P3-X63Ag8U1（P3U1、ATCC）と2:1になるように混合され、混合液に対してPEG1500（Roche Diagnostics）を徐々に加えることによって、細胞融合が行われた。ペニシリン/ストレプトマイシンが添加されたRPMI1640培地（Invitrogen）を加えられた混合液が遠心分離された後、上清を除去することによってPEG1500が当該混合液から除去された。次に、HAT培地（10% ウシ胎児血清 (FBS)、ペニシリン-ストレプトマイシン、1x HAT Media Supplement（Sigma）、0.5x BM-Condimed H1 Hybridoma Cloning Supplement（Roche Diagnostics）が添加されたRPMI1640培地）に懸濁された細胞懸濁液が、96ウェルプレート8枚にP3U1細胞が1x 10⁵細胞/ウェルになるように播種された。当該プレートが、37℃、5% CO2インキュベーター中で8日間インキュベートされた後、各ウェル中の培養上清を用いてスクリーニングが行われた。スクリーニングはITM2A＿CHO細胞および親株CHO細胞に対する結合を、フローサイトメーター（FACS Calibur、Becton Dickinson）を用いて測定することにより行われた。ITM2A＿CHO細胞に特異的に結合する抗体を産生するクローンが選択され、当該クローンから限界希釈法によりモノクローン化が行われ、ITM2Aに結合する抗体を生産するハイブリドーマが単離された。以上の実験から、抗ITM2Aモノクローナル抗体BE5-1、BE6-1、BE7-1-1、およびBE13-1が樹立された。これらの抗体のアイソタイプをIsostrip（Roche Diagnostics）を用いて測定したところ、いずれもマウスIgG1κであった。

FBSの代わりにUltra Low IgG FBS（Invitrogen）が添加されたHAT培地中で培養された、BE5-1、BE6-1、BE7-1-1、およびBE13-1の各樹立されたハイブリドーマの培養上清から、BE5-1抗体、BE6-1抗体、BE7-1-1抗体、およびBE13-1抗体の各抗ITM2A抗体が、HiTrap Protein G HPカラム（GE Healthcare）を用いて精製された。精製抗体の濃度はDC Protein Assay Kit Iを用いて測定された。

［実施例３］ELISAによる抗ITM2Aモノクローナル抗体の結合部位の解析
（３−１）ITM2A部分タンパクの作製
ITM2A細胞外領域（Tyr75-Glu263）またはその一部（Tyr75-Lys182）がGST融合タンパク質として大腸菌で発現された（Tyr75-Glu263: GST-ITM2A-L、Tyr75-Lys182: GST-ITM2A-S）。当該融合タンパク質のC末端にはHisタグが付加された。まず、pCR2.1＿ITM2Aを鋳型として、EcoRIサイトを有するフォワードプライマー（配列番号：５７）とSalIサイトおよびHisタグ配列を有するリバースプライマー（配列番号：５８、または配列番号５９）を用いてPCRによって増幅されたITM2A（Tyr75-Glu263）またはITM2A（Tyr75-Lys182）が、pCR2.1-TOPOベクターにクローニングされた。クローニングの結果得られたプラスミドのEcoRIとSalIを用いた消化断片が、pGEX6P-1ベクター（GE Healthcare）のEcoRI-SalIサイトにクローニングされたプラスミド、pGEX＿GST-ITM2A-L及びpGEX＿GST-ITM2A-Sがそれぞれ得られた。pGEX＿GST-ITM2A-Lの開始コドンからストップコドンまでの塩基配列が配列番号：６０に、アミノ酸配列が配列番号：６１に示される。pGEX＿GST-ITM2A-SのITM2Aを含む挿入配列中の開始コドンからストップコドンまでの塩基配列が配列番号：６２に、アミノ酸配列が配列番号：６３に示される。

pGEX＿GST-ITM2A-L、pGEX＿GST-ITM2A-Sによって形質転換されたBL21（DE3）Competent Cells（Takara Bio）形質転換株を用いて、イソプロピル-チオガラクトピラノシドを用いて、GST-ITM2A-L及びGST-ITM2A-Sの発現が誘導された。B-PER（Thermo Fisher Scientific）で洗浄された細胞ペレットが可溶化バッファー（8M Urea、50mM Tris-HCl (pH8.0)、300mM NaCl）で可溶化された。10mM イミダゾールを添加した可溶化バッファーで調製された細胞抽出液がHisTrap HPカラム（GE Healthcare）にアプライされた。40mM イミダゾールが添加された可溶化バッファーで洗浄された当該カラムから、GST-ITM2A-L及びGST-ITM2A-Sが 500mM イミダゾールを添加した可溶化バッファーを用いて溶出された。GST-ITM2A-L及びGST-ITM2A-Sのタンパク質濃度は280 nmの吸光度を用いて算出された。

（３−２）ELISAによる抗ITM2Aモノクローナル抗体の結合部位の解析
実施例2で作製された抗ITM2Aモノクローナル抗体のGST-ITM2A-L、GST-ITM2A-Sに対する結合がELISAで評価された。まず、3μg/mLの濃度のGST-ITM2A-LおよびGST-ITM2A-S溶液100 μLが、ELISA用96ウェルプレート（Nunc-Immuno Plate、Thermo Fisher Scientific）の各ウェルに添加され、GST-ITM2A-L及びGST-ITM2A-Sが当該各ウェルにコートされた。当該各ウェルが、1%ウシ血清アルブミンを含むバッファーでブロッキングされた後、同バッファーで希釈された100μL のBE5-1抗体、BE6-1抗体、BE7-1-1抗体およびBE13-1抗体の各溶液が、各ウェルに添加され、当該プレートが室温で1時間インキュベートされた。陽性対照には抗His抗体（マウスIgG1、Santa Cruz Biotechnology）、陰性対照にはマウスIgG1（BD Pharmingen）が用いられた。抗体濃度は1μg/mLから公比3.16で8段階に希釈された。二次抗体（アルカリホスファターゼ-ヤギ抗マウスIgG (Gamma)、Invitrogen）と反応後、基質（phosphatase substrate、Sigma）が加えられ、各ウェル中の反応液の発色が、405 nm - 655 nmの吸光度を測定することによって決定された。

その結果、BE5-1抗体、BE6-1抗体、BE7-1-1抗体及びBE13-1抗体はいずれもGST-ITM2A-Lに結合したが、GST-ITM2A-SにはBE5-1抗体とBE6-1抗体だけが結合した（図2）。従って、BE5-1抗体とBE6-1抗体はITM2AのTyr75-Lys182を認識し、BE7-1-1抗体とBE13-1抗体はITM2AのLeu183-Glu263を認識すると考えられた。

［実施例４］FACSによる抗ITM2Aモノクローナル抗体の結合部位の解析
（４−１）C末端を欠損したITM2A強制発現細胞株の作製
ITM2Aの細胞外領域にはフリン（furin）で切断されるコンセンサス配列（Arg226-Leu227-Arg228-Arg229）が存在する。そこでITM2AのMet1からLeu227までの配列の後ろにHAタグが付加されたタンパク質（ITM2A-furin）を発現する細胞株が作製された。まず、pCR2.1＿ITM2Aを鋳型として、EcoRIサイトを有するフォワードプライマー（配列番号：５３）とNotIサイトおよびHAタグ配列を有するリバースプライマー（配列番号：６４）を用いてPCRによって増幅されたITM2A（Met1-Leu227）が、pCR2.1-TOPOベクターにクローニングされた。クローニングの結果得られたプラスミドのEcoRIとNotIを用いた消化断片が、pMCN2iベクターのEcoRI-NotIサイトにクローニングされたプラスミドpMCN2i＿ITM2A-furin-HAが得られた。pMCN2i＿ITM2A-furin-HAのITM2A-furinを含む挿入配列中の開始コドンからストップコドンまでの塩基配列が配列番号：６５に、アミノ酸配列が配列番号：６６に示される。PvuIで消化されたpMCN2i＿ITM2A-furin-HAがDG44細胞へエレクトロポレーションにより形質導入された。ジェネティシン（500μg/mL）で形質導入株を選抜することにより、C末端HAタグ付加ITM2A-furinを定常的に発現するCHO細胞株（ITM2A-furin＿CHO）が樹立された。

（４−２）FACSによる抗ITM2Aモノクローナル抗体の結合部位の解析
実施例2で作製された抗ITM2Aモノクローナル抗体のITM2A-furinへの結合がフローサイトメトリー（FACS）で測定された。細胞として、（４−１）で作製されたITM2A-furin＿CHO、（２−４）で作製されたITM2A＿CHO、及び、宿主細胞CHOが用いられた。0.2%ウシ血清アルブミンおよび0.1%NaN3を添加したPBS（FACS buffer）に懸濁されたこれらの細胞懸濁液に、BE5-1抗体、BE6-1抗体、BE7-1-1抗体、BE13-1抗体、マウスIgG1または抗HA抗体（clone HA-7、マウスIgG1、Sigma）が加えられ、当該細胞懸濁液が氷上で1時間インキュベートされた。抗体濃度は10μg/mLから公比5で6段階に希釈された。細胞がFACS bufferで洗浄された後、二次抗体としてFITC標識抗マウスIgG抗体（Goat F(ab')2 Fragment Anti-mouse IgG (Fcγ)-FITC、Beckman Coulter）が添加された細胞懸濁液が氷上で1時間インキュベートされた。細胞がFACS bufferで洗浄された後、10μg/mLのヨウ化プロピジウム（PI、Sigma）が添加されたFACS bufferに懸濁されフローサイトメーターによる測定に供された。測定されたデータはCELLQuestソフトウェア（Becton Dickinson）を用いて解析され、PI陰性である生細胞集団が評価された。

BE5-1抗体、BE6-1抗体、BE7-1-1抗体およびBE13-1抗体はいずれもITM2A＿CHOに結合したが、ITM2A-furin＿CHOにはBE5-1抗体とBE6-1抗体だけが結合した（図3A、B）。従って、BE5-1抗体とBE6-1抗体は、ITM2AのTyr75-Leu227を認識し、BE7-1-1抗体とBE13-1抗体はArg228-Glu263を認識すると考えられた。BE5-1抗体、BE6-1抗体、BE7-1-1抗体およびBE13-1抗体（10μg/mL）はいずれも宿主のCHO細胞には結合しなかった（図3C）。なお、抗HA抗体（10μg/mL）を用いて各細胞におけるITM2AまたはITM2A-furinの発現が確認された（図3D）。

［実施例５］抗ITM2Aモノクローナル抗体のマウスITM2Aへの結合解析
（５−１）マウス ITM2Aのクローニング
マウス脳cDNA（Mouse MTC Panel I, Clontech）を鋳型として、フォワードプライマー（配列番号６７）とリバースプライマー（配列番号６８）を用いてPCRによって増幅されたマウスITM2Aが、pCR2.1-TOPOベクターにクローニングされ、pCR2.1＿mITM2Aが得られた。PCRにはKOD Plus（Toyobo）が用いられ、94℃ 2分で変性後、98℃ 10秒、59℃ 30秒、68℃ 1分からなる反応サイクルが30サイクル反復された。pCR2.1＿mITM2Aの挿入配列をシークエンスすることによって、当該挿入配列がRefSeq Accession No. NM＿008409で登録された配列と同じであることが確認された。

（５−２）マウスITM2A強制発現細胞株の作製
C末端にHAタグが付加されたマウスITM2AがpMCN2iベクターにクローニングされた。まず、pCR2.1＿mITM2Aを鋳型として、EcoRIサイトを有するフォワードプライマー（配列番号：６９）とNotIサイトおよびHAタグ配列を有するリバースプライマー（配列番号：７０）を用いてPCRによってマウスITM2Aが増幅された。EcoRIとNotIで消化された増幅断片が、pMCN2iベクターのEcoRI-NotIサイトにクローニングされたプラスミドpMCN2i＿mITM2A-HAが得られた。pMCN2i＿mITM2A-HAのマウスITM2Aを含む挿入配列中の開始コドンからストップコドンまでの塩基配列が配列番号：７１に、アミノ酸配列が配列番号：７２に示される。PvuIで消化されたpMCN2i＿mITM2A-HAがDG44細胞へエレクトロポレーションにより形質導入された。ジェネティシン（500μg/mL）で形質導入株を選抜することにより、C末端HAタグ付加マウスITM2Aを定常的に発現するCHO細胞株（mITM2A＿CHO）が樹立された。

（５−３）抗ITM2Aモノクローナル抗体のマウスITM2Aへの結合解析
実施例2で作製された抗ITM2Aモノクローナル抗体のマウスITM2Aへの結合がFACSで評価された。細胞として、（２−４）で作製されたITM2A＿CHOと（５−２）で作製されたmITM2A＿CHOを用いられた。FACSを用いた結合の検出は４−２に記載された手順と同様に行われた。

BE5-1抗体、BE7-1-1抗体およびBE13-1抗体はmITM2A＿CHOに結合したが、BE6-1抗体は結合しなかった（図4）。従って、BE5-1抗体、BE7-1-1抗体およびBE13-1抗体はマウスITM2Aに交差し、BE6-1抗体は交差しないと考えられた。

［実施例６］ウェスタンブロットを用いた抗ITM2Aモノクローナル抗体のITM2Aへの結合活性の評価
実施例２で作製された抗ITM2Aモノクローナル抗体のITM2Aに対する結合が、ウェスタンブロットを用いて検出可能であるか評価された。まず、（２−４）で作製されたITM2A＿CHO、（４−１）で作製されたITM2A-furin＿CHO、宿主CHO細胞の各1x10⁷細胞がPBSで洗浄された後、1 mLのlysis buffer（50 mM Tris-HCl (pH7.4)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1% Triton X-100、Protease Inhibitor Cocktail (Sigma)）を用いて溶解され全細胞ライセートが得られた。等量の2x Sample Buffer（Sigma）と混合された当該ライセートが加熱処理された後、各5μLのライセートがSDS-PAGEに供された。泳動後SDS-PAGEゲルに含まれるタンパク質等が転写されたPVDFメンブレン（Immobilon-P, Millipore）が、10μg/mLのBE5-1抗体、BE6-1抗体、BE7-1-1抗体またはBE13-1抗体、または抗HA抗体（clone F-7、Santa Cruz Biotechnology）と室温にて1時間インキュベートされた。二次抗体としてHRP標識抗マウスIgG抗体（GE Healthcare）を用い、室温にて1時間インキュベートされた。最後に、ECL Western Blotting Detection Reagents（GE Healthcare）を用いて生じた発光がX線フィルムに露光されることによって、抗原抗体複合体を示すバンドが検出された。

ウェスタンブロットの条件下において、BE6-1抗体のみが抗原であるITM2Aとの間で抗原抗体反応複合体を形成することが可能であることが示された（図5）。

［実施例７］抗ITM2Aモノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝子配列の決定
実施例2で作製された抗ITM2Aモノクローナル抗体の可変領域の遺伝子配列が決定された。RNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いて、1x 10⁶細胞の各抗体を産生するハイブリドーマからtotal RNAが調製された。次に、Smarter Race cDNA Amplification Kit（Clontech）を用いて当該RNAを鋳型とするcDNAが合成された。プライマーとして、マウスIgG1κ抗体の重鎖定常領域に相補的なプライマー（配列番号：７３）と軽鎖定常領域に相補的なプライマー（配列番号：７４）が用いられた。pCR2.1-TOPOベクターにクローニングされた増幅産物の配列が決定された。各抗体の可変領域配列が表１、可変領域のCDR配列が表２にまとめられる。

［実施例８］ヒト癌細胞株におけるITM2Aの発現解析と抗ITM2Aモノクローナル抗体のADCC活性および細胞増殖抑制活性の評価
（８−１）ヒト癌細胞株におけるITM2Aの発現解析
ヒト癌細胞株におけるITM2Aの発現がFACSで測定された。抗体としてBE6-1抗体が10μg/mLの濃度で用いられ、実施例４に記載された手順と同様の方法でITM2Aの発現が測定された。二次抗体としてQifi-Kit（Dako）に付属したFITC標識抗マウスIg抗体（goat F(ab’)2）が用いられた。陰性対照としてマウスIgG1が10μg/mLの濃度で用いられた。測定の結果、ユーイング肉腫細胞株（A-673、RD-ES、SK-ES-1およびSK-N-MC）、T細胞性急性リンパ性白血病細胞株（CCRF-CEM、Jurkat、MOLT-4）、T細胞性リンパ腫細胞株（HuT78）、急性骨髄性白血病細胞株（KG-1a、TF-1a）の細胞上にITM2Aが発現していることが明らかとなった（図6）。

（８−２）抗ITM2Aモノクローナル抗体のADCC活性の検討
BE6-1抗体の抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ADCC）活性が測定された。ヒト癌細胞株CCRF-CEMおよびKG-1aがChromium-51（GE Healthcare）存在下で1時間培養された後に、10% ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシンが添加されたRPMI1640培地（以下RPMI培地）で3回洗浄された。RPMI培地を用いて、1x 10⁵細胞/mLの細胞懸濁液が調製された。当該細胞懸濁液が96ウェルプレートの各ウェルに100μL/ウェル加えられた。次に、BE6-1抗体またはマウスIgG1がRPMI培地で希釈され50μL/ウェル加えられた。BE6-1抗体の終濃度は10、2、0.4、0.08、0.016μg/mL、マウスIgG1の終濃度は10μg/mLに調製された。当該プレートが室温にて15分間静置された後、RPMI培地で1x10⁶細胞/mLに調製されたエフェクター細胞の細胞懸濁液が50μL/ウェル加えられた。マウスFcγレセプター III（RefSeq Accession No. NM＿010188）の細胞外領域とヒトFcεレセプター I-gamma（RefSeq Accession No. NM＿004106）の膜貫通領域及び細胞内領域とがインフレームで融合されたキメラタンパク質がNK-92細胞（ATCC）で定常発現する細胞（WO2008093688）が、エフェクター細胞として用いられた。当該プレートが37℃、5% CO2インキュベーターにて4時間インキュベートされた後に、100μL/ウェルの培養上清が回収され、培養上清中の放射活性（cpm）が、ガンマカウンター（1480 WIZARD 3’’、Wallac）を用いて測定された。測定値を以下の式に適用することによって、特異的クロム遊離率（%）が算出された。
特異的クロム遊離率（%）＝（A-C）ｘ100/（B-C）
上記の式において、Aは各ウェルにおける放射活性、Bは終濃度1% Nonidet P-40で細胞を溶解させたウェルの放射活性の平均値、Cは標的細胞のみを添加したウェルの放射活性の平均値である。実験は三重に行われ、特異的クロム遊離率の平均値と標準偏差が算出された。

ヒト癌細胞株A-673およびSK-N-MCは、プレート（Cellbind surface 96-well cell culture plate（Corning））に5x10³細胞/ウェルで播種され、当該プレートが37℃、5% CO2インキュベーターにて4日間インキュベートされた。各ウェルにChromium-51が加えられた後に、当該プレートはさらに1時間インキュベートされた。細胞が剥がれないように各ウェルが慎重に培地で洗浄された後、培地が50μL/ウェル加えられた。次に、BE6-1抗体またはマウスIgG1が各ウェルに50μL/ウェル加えられた。BE6-1抗体の終濃度は10、2、0.4、0.08、0.016μg/mL、マウスIgG1の終濃度は10μg/mLに調製された。当該プレートが室温にて15分間静置された後、培地で8x10⁵細胞/mLに調製されたエフェクター細胞が各ウェルに100μL/ウェル加えられた。上記の式に従って、特異的クロム遊離率が算出された。なお、培地として、すべて10%ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシンが添加されたDMEM培地（Invitrogen）が用いられた。

A-673、SK-N-MC、CCRF-CEM、およびKG-1aの各細胞に対してBE6-1抗体は濃度依存的にADCC活性を誘導した（図7）。

（８−３）抗ITM2Aモノクローナル抗体の細胞増殖抑制活性の検討
トキシンが結合された二次抗体の存在下でのBE6-1抗体の細胞増殖抑制活性が測定された。トキシンが結合された二次抗体として、サポリン標識抗マウスIgG抗体（Mab-Zap、Advanced Targeting Systems）が用いられた。ヒト癌細胞株CCRF-CEMが6x10³細胞/ウェルで96ウェルプレートに播種された各ウェルに、BE6-1抗体（500、100、20、4ng/mL）またはマウスIgG1（500ng/mL）が加えられた。Mab-Zapは500ng/mLの濃度で各ウェルに加えられた。当該プレートが3日間インキュベートされた後、各ウェル中の細胞の増殖がWST-8（Cell Count Reagent SF、Nacalai Tesque）を用いて測定された。実験は三重に行われ、培地のみが加えられたウェルを0%、細胞のみが加えられたウェルを100%として、平均値と標準偏差が算出された。培地として、10%ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシンが添加されたRPMI1640培地が用いられた。

ヒト癌細胞株HuT78が1x10⁴細胞/ウェルで96ウェルプレートに播種された各ウェルに、BE6-1抗体（2500、500、100、20ng/mL）またはマウスIgG1（2500ng/mL）が加えられた。Mab-Zapは2500ng/mLの濃度で各ウェルに加えられた。当該プレートが4日間インキュベートされた後、各ウェル中の細胞の増殖がWST-8を用いて測定された。培地として、20%ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシンが添加されたIMDM培地（Invitrogen）が用いられた。

ヒト癌細胞株A-673が3x10³細胞/ウェルで各ウェルに播種された96ウェルプレートは1日間インキュベートされた後、当該プレートの各ウェルにBE6-1抗体（1000、200、40、8ng/mL）またはマウスIgG1（1000ng/mL）が加えられた。Mab-Zapは1000ng/mLの濃度で各ウェルに加えられた。当該プレートが3日間インキュベートされた後、各ウェル中の細胞の増殖がWST-8を用いて測定された。培地として、10%ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシンが添加されたDMEM培地が用いられた。

トキシンが結合された二次抗体の存在下において、BE6-1抗体は濃度依存的に、各細胞に対して細胞増殖を抑制した（図8）。従って、抗ITM2Aモノクローナル抗体に直接トキシンを結合することによっても、癌細胞の増殖を抑制することが可能であると考えられた。

［実施例９］EWS-FLI1融合遺伝子とITM2Aの発現の相関
（９−１）ユーイング肉腫臨床サンプルにおけるEWS-FLI1融合遺伝子の発現解析
ユーイング肉腫の85%の症例で、t(11;22)(q24;q12)染色体転座が観察され、EWS遺伝子の5’末端とFLI-1遺伝子の3’末端が融合した融合遺伝子（EWS-FLI1）が発現することが知られている（Cancer Lett (2007) 254, 1-10）。そこで実施例1において発現解析に用いられたサンプルを含むユーイング肉腫臨床サンプル13例（ews＿2、ews＿3、ews＿4、ews＿5、ews＿6、ews＿7、ews＿8、ews＿9、ews＿10、ews＿11、ews＿12、ews＿13、ews＿15）におけるEWS-FLI1融合遺伝子の発現がPCRを用いて解析された。まず、ユーイング肉腫臨床サンプルのRNAからSuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen）を用いてcDNAが合成された。次に、このcDNAを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号75）とリバースプライマー（配列番号76）を用いてEWS-FLI1融合遺伝子がPCRによって増幅された。増幅にはKOD Plus Version 2（Toyobo）が用いられ、94℃ 2分の熱変性の後に、98℃ 10秒、68℃ 1.5分からなるサイクルが30サイクル反復された。プライマー配列は文献（N Engl J Med (1994) 331, 294-9）と同じものが用いられた。コントロールとしてキット（SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR）に付属のプライマーが用いられてβ-actinが増幅された。PCRを用いた増幅反応には、KOD Plus Version 2が用いられ、94℃ 2分の熱変性の後に、98℃ 10秒、58℃ 30秒、68℃ 30秒からなるサイクルが25サイクル反復された。なお、EWS-FLI1融合遺伝子を発現するユーイング肉腫細胞株SK-ES-1が陽性対照に用いられ、リンパ腫細胞株NK-92が陰性対照に用いられた。

PCRの結果、ユーイング肉腫臨床サンプル13例中、9例（ews＿4、ews＿5、ews＿7、ews＿8、ews＿9、ews＿11、ews＿12、ews＿13、ews＿15）において、EWS-FLI1融合遺伝子の発現が認められた（図9A）。

（９−２）ユーニング肉腫臨床サンプルにおけるITM2Aの発現解析
ユーイング肉腫の臨床サンプルにおけるITM2A遺伝子の発現がPCRで解析された。（９−１）で合成されたcDNAを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号77）とリバースプライマー（配列番号78）を用いてITM2AがPCRによって増幅された。増幅には、KOD Plus Version 2が用いられ、94℃ 2分の熱変性の後、98℃ 10秒、65℃ 30秒、68℃ 30秒からなるサイクルが25サイクル反復された。なお、（２−１）で作製されたpCR2.1＿ITM2Aが陽性対照に用いられ、リンパ腫細胞株NK-92が陰性対照に用いられた。

PCRの結果、EWS-FLI1融合遺伝子が発現していた9例でITM2Aが発現し、両者の発現に高い相関が認められた（図9B）。

Claims (27)

1. 配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するITM2Aタンパク質の75から227番目のアミノ酸からなる断片に結合する、以下（１）から（８）のいずれかに記載の細胞傷害活性を有するモノクロナール抗体；
   （１）CDR1として配列番号：９に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：１０に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号：１１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含み、CDR1として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
   （２）キメラ抗体である（１）に記載の抗体、
   （３）ヒト化抗体である（１）に記載の抗体、
   （４）配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含む（１）記載の抗体、
   （５）配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む（１）記載の抗体、
   （６）キメラ抗体である（４）又は（５）に記載の抗体、
   （７）第２の抗体が結合しうるエピトープに結合することができる抗体であって、前記第２の抗体は、それぞれ（１）〜（６）いずれかに記載の抗体であることを特徴とする抗体、
   （８）配列番号１で表されるアミノ酸配列の75から227番目のアミノ酸からなるITM2Aタンパク質の断片に対する第２の抗体の結合を阻害することができる抗体であって、前記第２の抗体は、それぞれ（１）〜（６）いずれかに記載の抗体であることを特徴とする抗体。
2. 前記細胞傷害活性が、抗体依存性細胞傷害（ADCC）活性である請求項１に記載の抗体。
3. 前記細胞傷害活性が、補体依存性細胞傷害（CDC）活性である請求項１に記載の抗体。
4. 細胞傷害性物質が結合した抗体である請求項１から３のいずれかに記載の抗体。
5. インターナライズ活性を有する抗体である請求項４に記載の抗体。
6. 癌細胞の増殖を抑制する抗体である請求項１から５のいずれかに記載の抗体。
7. 前記癌細胞が、ユーイング肉腫細胞である請求項６に記載の抗体。
8. 前記ユーイング肉腫細胞が、染色体転座が観察される細胞であることを特徴とする請求項７に記載の抗体。
9. 前記染色体転座がt(11;22)(q24;q12)であることを特徴とする請求項８に記載の抗体。
10. 前記癌細胞が血液癌の細胞である請求項６に記載の抗体。
11. 前記血液癌が、T細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍、多発性骨髄腫のいずれかである請求項１０に記載の抗体。
12. ヒト定常領域を有する抗体である請求項１から１１のいずれかに記載の抗体。
13. キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である請求項１２に記載の抗体。
14. 糖鎖に付加するフコースが欠損した、または、バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体である請求項１から１３のいずれかに記載の抗体。
15. 請求項１から１４のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
16. 請求項１から１４のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤。
17. 請求項１から１４のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、治療対象となる癌が、染色体転座t(11;22)(q24;q12)が観察されることを特徴とするユーイング肉腫である抗癌剤。
18. 請求項１から１４のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、治療対象となる細胞が血液癌の細胞である抗癌剤。
19. 前記血液癌が、T細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍、多発性骨髄腫のいずれかである請求項１８に記載の抗癌剤。
20. 請求項１から１４のいずれかに記載の抗体を投与することによる癌治療の奏功性を予測する方法であって、治療対象となる癌が染色体転座t(11;22)(q24;q12)が観察されることを特徴とするユーイング肉腫である、被験者から採取された生体試料中のITM2Aの発現レベルを検出する工程を含む方法。
21. 被験者から採取された試料におけるITM2Aタンパク質を検出することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
22. ITM2Aタンパク質の検出がITM2Aタンパク質に結合する抗体を用いて行なわれる請求項２１に記載の方法。
23. 請求項１から１４のいずれかに記載の抗体を投与することによる癌治療の奏功性を予測する方法であって、治療対象となる癌が血液癌である、被験者から採取された生体試料中のITM2Aの発現レベルを検出する工程を含む方法。
24. 前記血液癌が、T細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍、多発性骨髄腫のいずれかである請求項２３に記載の方法。
25. ユーイング肉腫と診断された被験者から採取された試料におけるITM2Aタンパク質を、請求項１から１４のいずれかに記載の抗体を用いて検出することを特徴とする被験者における染色体転座t(11;22)(q24;q12)が観察されるユーイング肉腫の存在を検出する方法。
26. 以下の工程を含む、ユーイング肉腫と診断された被験者における染色体転座t(11;22)(q24;q12)が観察されるユーイング肉腫の存在を検出する方法；
    （ａ） 被験者から採取された試料を提供する工程、
    （ｂ） （ａ）の試料に含まれるITM2Aタンパク質を、請求項１から１４のいずれかに記載の抗体を用いて検出する工程。
27. 以下の工程を含む、ユーイング肉腫と診断された被験者における染色体転座t(11;22)(q24;q12)が観察されるユーイング肉腫の存在を検出する方法；
    放射性同位元素で標識された、請求項１から１４のいずれかに記載の抗体を投与された被験者において、前記放射性同位元素の集積を検出する工程。

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