JP6052432B2 - 温度応答性細胞培養基材及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞培養の技術に関し、具体的には、培養した細胞をトリプシンなどの薬剤を使用せず温度変化のみで容易に剥離、回収できる細胞培養基材、及びその製造方法に関する。

従来、動物組織等の細胞培養基材としては、主にプラスチック（例えばポリスチレン）製容器が使用されてきた。これら容器は、細胞培養を有効に行わせるために、その表面にプラズマ処理や、シリコンや細胞接着因子等のコーティングなどの表面処理が施されている。これら細胞培養容器を培養基材として用いた場合には、培養（増殖）した細胞が容器表面に接着しており、細胞を単離・回収するためには、トリプシン等のタンパク質加水分解酵素や化学薬品を用いて、容器表面から剥離する必要があった。このような酵素や化学薬品により細胞を剥離する操作は工程が煩雑であるほか、雑菌やＤＮＡあるいはＲＮＡ等の不純物が混入する恐れがあった。また、細胞と基材の結合部分が切断されるだけではなく、細胞同士の結合も切断されるため、細胞を増殖している形状（例えばシート状）のままで取り出すことができなかったり、ダメージを受けたり、細胞の性質が変化してしまう問題があった。

近年、細胞培養容器の表面にポリＮ−イソプロピルアクリルアミドのような下限臨界溶解温度を有するポリマーを極薄く被覆した基材を使用して、細胞培養温度ではポリマーが疎水性を示し細胞がポリマーに接着し、培養後にポリマーを低温処理して親水性状態にすることにより、細胞とポリマーとの接着性を低下させ、細胞を加水分解酵素や化学薬品を使用せずに基材から細胞をシート状に剥離する技術が報告されている（例えば特許文献１及び２参照）。

しかし、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミドのようなポリマーはポリスチレンのようなプラスチック表面との間に接着性が低く、水に触れると、塗布されたポリマー層が容易に剥離してしまう。このようなポリマー層を水に触れてもプラスチック表面から剥離させないためには、ポリマーを固定する必要がある。その方法の一つとしては、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（モノマー）の溶液を細胞培養基材表面に塗布して電子線照射によるグラフト重合を行う方法がある（例えば、特許文献３参照）。

電子線照射によるグラフト重合は、重合と同時に、ポリマー間の架橋反応も必ず起こり、ポリマーの温度応答速度が架橋度合の進行につれ大きく低下してしまい、ポリマーを親水性にするために低温を保持する時間を長く要する問題があり、且つ、その間、細胞も低温状態に長時間晒され、ダメージを受ける問題があった。また、この方法で製造された細胞培養基材は、放射線（例えばγ線）滅菌処理を行うと、ポリマーの温度応答性が大きく低下してしまい、本来の細胞の剥離しやすさが無くなる問題があった。

一方、（メタ）アクリル酸エステル系モノマー（ａ）の重合体（Ａ）と、無機材料（Ｃ）と、下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）とを含有する細胞培養基材が各種細胞に対する良好な培養性、及び培養された細胞を、環境温度を低下させることにより容易に剥離できる特性、更に、細胞種類に応じて、その培養性と剥離性を容易に調製できる技術が報告されている（例えば特許文献４参照）。

上記発明で使用された下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）は、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミドを中心とした単一重合体であり、下限臨界溶解温度も単一で、下限臨界溶解温度を任意に変化させる（制御する）ことはできない。

特公平６−１０４０６１公報 特開平５−１９２１３８公報 特開平５−１９２１３０公報 特許第４４３０１２３号

本発明が解決しようとする課題は、基材中に含まれる下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）が、架橋せず、且つ単独重合では疎水性重合体となるモノマー（ａ）と、単独重合で親水性重合体になるモノマー（ｂまたはｃ、またはｄ）との共重合体であり、得られる共重合体（Ｂ）の下限臨界溶解温度が、両モノマーの種類や比率により幅広く制御でき、更に、培養細胞の種類により、適宜両モノマーの種類や比率を変え、より良好な細胞接着性と増殖性を持って細胞を培養できること、更に、環境温度に対する培養基材表面の疎水性と親水性の変化が敏速で、培養した細胞を分離回収する際にトリプシン等のタンパク質加水分解酵素などを使用することなく、細胞へのダメージがなく、迅速に培養した細胞を培養基材表面から容易に剥離、回収できる細胞培養基材を提供することにある。

また、本発明の細胞培養基材中の重合体（Ｂ）が、無機材料（Ｃ）との間、多点相互作用を有しているため、耐放射線滅菌性を有している。

また、本発明の他の課題は、上記の細胞培養基材を製造する方法であって、基材中に含まれる下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）が架橋されることがなく、且つ電子線照射のような方法を使用することなく、該細胞培養基材をプラスチック製容器の表面に容易に接着させることができ、更に、培養される細胞の種類（接着性）に応じて、重合体（Ｂ）の長さ、密度も容易に調節することができる、簡便な装置と工程とによる製造方法を提供することにある。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、（メタ）アクリル酸エステル系モノマー（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）と、下限臨界溶解温度を有し、モノマー（ａ）とモノマー（ｂまたはｃ、またはｄ）からなる重合体（Ｂ）とを含有する細胞培養基材が各種細胞に対する良好な培養性、及び培養された細胞を、環境温度を低下させることにより容易に剥離できる特性、更に、細胞種類に応じて、モノマーの種類や比率を調整することにより、その培養性と剥離性を容易に調整できることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、下記式（１）で表されるモノマー（ａ）の重合体（Ａ）と、下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有し、
前記重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０１〜３の範囲にあり、
前記重合体（Ｂ）が、モノマー（ａ）と親水性のアミド系ビニルモノマー（ｂ）との共重合体（Ｂ１）、またはモノマー（ａ）と下記式（２）表されるモノマー（ｃ）との共重合体（Ｂ２）、またはモノマー（ａ）と下記式（３）表されるポリエチレングリコール鎖含有モノマー（ｄ）との共重合体（Ｂ３）であり、
細胞培養基材全体に対する前記重合体（Ｂ）の含有率が０．１質量％〜４０質量％である細胞培養基材を提供する。

（式中、Ｒ_１は水素原子またはメチル基、Ｒ_２は炭素原子数２〜３のアルキレン基、Ｒ_３は炭素原子数１〜２のアルキル基を表す。）

（式中、Ｒ_４は水素原子またはメチル基、Ｒ_５は炭素原子数２〜３のアルキレン基を表す。）

（式中、ｎは２〜２０の整数を表す。）

また、本発明は、上記親水性のアミド系ビニルモノマー（ｂ）が、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミド誘導体、Ｎ,Ｎ−ジ置換（メタ）アクリルアミド誘導体及びＮ−ビニルピロリドンからなる群から選ばれる少なくとも一種のモノマーである細胞培養基材の製造方法であって、
前記水媒体（Ｗ）中の前記無機材料（Ｃ）の濃度が下記式（４）又は式（５）で表される範囲となるように、前記モノマー（ａ）と前記無機材料（Ｃ）と重合開始剤（Ｄ）とを水媒体（Ｗ）に混合した後、前記モノマー（ａ）を重合させることにより、重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）を製造する第１工程、
前記分散液（Ｌ）に、前記重合体（Ｂ）を添加し、混合して、支持体に塗布した後、乾燥させる第２工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法を提供する。
式（４） Ｒａ＜０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜１２．４Ｒａ＋０．０５
式（５） Ｒａ≧０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜０．８７Ｒａ＋２．１７
（式中、無機材料（Ｃ）の濃度（質量％）は、無機材料（Ｃ）の質量を水媒体（Ｗ）と無機材料（Ｃ）の合計質量で除して１００を掛けた数値、Ｒａは無機材料（Ｃ）と重合体（Ａ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））である。）

本発明の細胞培養基材の最大の特徴は、下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）が、単独重合では疎水性重合体となるモノマー（ａ）と単独重合で親水性重合体になるモノマー（ｂまたはc、またはｄ）との共重合体であり、得られる共重合体（Ｂ）の下限臨界溶解温度が、モノマーの種類や比率により幅広く制御でき、更に、細胞の種類に応じて、適宜モノマーの種類や比率を変え、より良好な細胞接着性と増殖性を持って細胞を培養できることにある。例えば、同じモノマー比率で得られる重合体（Ｂ）の下限臨界溶解温度が、モノマーの種類により異なり、より親水性が高く、水との親和性の強いモノマーの方が、下限臨界溶解温度がより高温側になる。また、モノマー（ａ）に対し、モノマー（ｂまたはc、またはｄ）の比率を増えるにつれ、得られる重合体（Ｂ）の下限臨界溶解温度が高温側へシフトし、この比率と下限臨界溶解温度がほぼ直線関係にある。細胞培養温度は通常３７℃であるため、本発明の重合体Ｂの下限臨界溶解温度は２０〜３２℃付近になるようにモノマー種と共重合比率を調整している。

また、本発明のモノマー（ａ）は水溶性であるが、重合体（Ａ）は疎水性で水には溶解しないものである。更に、本発明の細胞培養基材の基本特徴は、上記重合体（Ａ）と無機材料（Ｃ）の構成部分が主に細胞の接着と増殖を担い、下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）は温度変化による細胞の剥離を担い、この二つの部分を細胞の種類に応じてそれぞれ単独に制御できることにある。例えば、培養時、培養温度（３７℃）が重合体（Ｂ）の下限臨界溶解温度より高いため、重合体（Ｂ）が水不溶（疎水性）状態になり、細胞が基材の表面で接着・増殖するが、培養終了後、温度を下限臨界溶解温度以下に下げると（例えば１０℃）、重合体（Ｂ）が水溶性になり、基材表面から水溶液（培地）へと伸展し、それに伴い細胞が基材表面から脱離しながら剥離していく。

重合体（Ａ）及び重合体（Ｂ）は主にイオン結合や水素結合などにより無機材料（Ｃ）と相互作用し結合している。この結合力は強く、容易にポリマーと無機材料（Ｃ）を引き離すことはできない。その相互作用のため、滅菌用の放射線（γ線、電子線）に晒されても重合体（Ａ）及び（Ｂ）が架橋しにくく、耐放射線滅菌性を有するわけである。

本発明の細胞培養基材は、無機材料（Ｃ）と重合体（Ａ）がほぼ均一な層状構造になっている複合体（Ｘ）の薄層と、該薄層の中から表面に向かって伸び出ている重合体（Ｂ）とから構成されている。

重合体（Ｂ）の含有量を適宜調整することにより、細胞培養基材表面が重合体（Ｂ）に完全に覆われることなく適宜露出することで、良好な細胞接着・増殖性と細胞剥離性を維持できる。

本発明の細胞培養基材は、環境温度に対する疎水性と親水性の変化速度が速く、培養される細胞の種類（接着性）に応じて、下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）を構成するモノマー種や比率、及びその含有量を容易に調節することができ、培養した細胞を、薬剤（トリプシン等）を使用することなく、迅速に培養基材表面から剥離、回収できる特徴を有する。

また、本発明の製造方法は、基材中に含まれる下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）が架橋されることがなく（より敏速な温度応答性を維持できる）、且つ電子線照射のような重合方法を使用することなく、該細胞培養基材を（プラスチック製培養容器のような）支持体に容易に接着させることができ、更に、培養される細胞の種類（接着性）に応じて、重合体（Ｂ）の組成や含有量（密度）も容易に調節することができ、製造装置と工程が簡便である特徴を有する。

本発明で用いるモノマー（ａ）は、その重合体が無機材料（Ｃ）と相互作用し、重合により有機無機複合体を形成できるものであれば、好適に使用できる（例えば、ジアセトンアクリルアミドが挙げられる）が、好ましくは下記式（１）のモノマー（ａ）が用いられる。

（式中、Ｒ_１は水素原子またはメチル基、Ｒ_２は炭素原子数２〜３のアルキレン基、Ｒ_３は炭素原子数１〜２のアルキル基を表す。）

これらのモノマー（ａ）の使用により、細胞の初期接着性を容易に調節でき、細胞増殖性と剥離性が良好な細胞培養基材が得られる。また、この細胞培養基材をポリスチレンなどのプラスチック製等の支持体の表面に積層させる場合は、両者間の接着性が強く、製造が簡便にできる。

上記のモノマー（ａ）は、要求される力学物性や表面性質、基材との接着性などにより、一種以上を混合して使用してもよい。また、細胞培養基材の培養性や物性に影響を及ぼさない程度に、必要に応じてその他の共重合モノマーとして、例えば、スルホン基やカルボキシル基のようなアニオン基を有するアクリル系モノマー、４級アンモニウム基のようなカチオン基を有するアクリル系モノマー、４級アンモニウム基と燐酸基とを持つ両性イオン基を有するアクリル系モノマー、カルボキシル基とアミノ基とをもつアミノ酸残基を有するアクリル系モノマー、糖残基を有するアクリル系モノマー、また、水酸基を有するアクリル系モノマー、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール鎖を有するアクリル系モノマー、更にポリエチレングリコールのような親水性鎖とノニルフェニル基のような疎水基を合わせ持つ両親媒性アクリル系モノマー、ポリエチレングリコールジアクリレート、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジ置換（メタ）アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドなどを併用することができる。ここでいうアクリル系モノマーとはアクリルアミド系モノマーを含むものである。

本発明に用いる無機材料（Ｃ）は、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料である。水膨潤性粘土鉱物としては、層状に剥離可能な水膨潤性粘土鉱物が挙げられ、好ましくは水または水と有機溶剤との混合溶液中で膨潤し均一に分散可能な粘土鉱物、特に好ましくは水中で分子状（単一層）またはそれに近いレベルで均一分散可能な無機粘土鉱物が用いられる。具体的にはナトリウムを層間イオンとして含む水膨潤性ヘクトライト、水膨潤性モンモリライト、水膨潤性サポナイト、水膨潤性合成雲母、等が挙げられる。これらの粘土鉱物を混合して用いても良い。

本発明に用いるシリカ（ＳｉＯ_２）としては、コロイダルシリカが挙げられ、好ましくは水溶液中で均一に分散可能で、粒径が１０ｎｍ〜５００ｎｍのコロイダルシリカ、特に好ましくは粒径が１０〜５０ｎｍのコロイダルシリカが用いられる。

本発明の細胞培養基材において、重合体（Ａ）と無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０１〜３であることが好ましく、０．０３〜１がより好ましく、０．０５〜０．５が特に好ましい。質量比（（Ｃ）／（Ａ））がこの範囲であると、粘土鉱物またはシリカと重合体（Ａ）との複合体の粒径がより均一で、その水分散液の安定性が高く得られる塗膜の表面特性（例えば親疎水性度合いや細胞培養性）や塗膜物性が良好であり、均一な塗膜が得られ、支持体との接着性が良好で、脆さも無く好ましい。

また、本発明の細胞培養基材において、基材全体に対する重合体（Ｂ）の含有率が０．１質量％〜４０質量％であることが好ましく、１〜３０質量％であることがより好ましく、５〜２５質量％であることが特に好ましい。重合体（Ｂ）の含有率がこの範囲であると、培養基材の細胞接着性と増殖性及び温度低下時の剥離性が良好であり、培養基材の表面平滑性もよく、また、プラスチック製基材の表面に積層するときの塗布性や基材表面との接着性がよく、好ましい。

本発明で用いられる下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）は、単独重合して疎水性重合体となるモノマーと、単独重合して親水性重合体になるモノマーとの共重合体で、温度変化により親水／疎水転移できるものであれば好適に使用できるが、中でも、モノマー（ａ）と親水性のアミド系ビニルモノマー（ｂ）との共重合体（Ｂ１）、またはモノマー（ａ）と下記式（２）表されるモノマー（ｃ）との共重合体（Ｂ２）、またはモノマー（ａ）と下記式（３）表されるポリエチレングリコール鎖含有モノマー（ｄ）との共重合体（Ｂ３）であることが好ましい。アミド系ビニルモノマー（ｂ）については、Ｎ−メトキシメチル（メタ）アクリルアミドのようなＮ−置換（メタ）アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミドや（メタ）アクリロイルモルホリンのようなＮ,Ｎ−ジ置換（メタ）アクリルアミド誘導体、およびＮ−ビニルピロリドンからなる群から選ばれる少なくとも一種のモノマーであることが好ましい。
また、モノマー（ｃ）については、下記式（２）に示すモノマーが好適に用いられる。

（式中、Ｒ_４は水素原子またはメチル基、Ｒ_５は炭素原子数２〜３のアルキレン基を表す。）

更に、モノマー（ｄ）については、下記式（３）に示すモノマーが好適に用いられる。

（式中、ｎは２〜２０の整数を表す。）

これらの共重合体（Ｂ１またはＢ２、またはＢ３）を用いることにより、下限臨界溶解温度が、両モノマーの種類や比率により幅広く制御でき、更に、培養細胞の種類により、適宜両モノマーの種類や比率を変え、より良好な細胞接着性と増殖性を持って細胞を培養できること、更に、環境温度に対する培養基材表面の疎水性と親水性の変化が敏速で、培養した細胞を分離回収する際にトリプシン等のタンパク質加水分解酵素などを使用することなく、細胞へのダメージがなく、迅速に培養した細胞を培養基材表面から容易に剥離、回収できる利点がある。また、該重合体（Ｂ１またはＢ２、またはＢ３）が無機材料（Ｃ）と相互作用が強く、細胞培養中や培養細胞の剥離操作時に、細胞培養基材自身の剥離が起きにくく好ましい。

上記の下限臨界溶解温度とは、この温度以上になると、該ポリマー（Ｂ）が水中で不溶となり（疎水性を示す）、この温度以下になると、水溶性になる（親水性を示す）温度のことである。例えば、２−メトキシエチルアクリレート（モノマー（ａ））とＮ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド（モノマー（ｂ））との共重合体について、両者の比率が８０：２０（モル比）時の下限臨界溶解温度が１５℃で、７０：３０（モル比）時の下限臨界溶解温度が２６℃、６４：３６（モル比）時の下限臨界溶解温度が３２℃、そして６０：４０（モル比）時の下限臨界溶解温度が３７℃になる。Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド（モノマー（ｂ））の含有量（ｍｏｌ％）に対し、下限臨界溶解温度をプロットすると、良好な直線関係を示す（相関係数Ｒ^２＝０．９９９１）。

次いで、本発明の製造方法について説明する。
水媒体（Ｗ）中の前記無機材料（Ｃ）の濃度が下記式（４）又は式（５）で表される範囲となるように、前記モノマー（ａ）と前記無機材料（Ｃ）と重合開始剤（Ｄ）とを水媒体（Ｗ）に混合した後、モノマー（ａ）を重合させることにより、重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）を製造する第１工程、
前記分散液（Ｌ）に、前記重合体（Ｂ）を添加し、均一に混合して、支持体に塗布した後、乾燥させる第２工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法である。
式（４） Ｒａ＜０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜１２．４Ｒａ＋０．０５
式（５） Ｒａ≧０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜０．８７Ｒａ＋２．１７
（式中、無機材料（Ｃ）の濃度（質量％）は、無機材料（Ｃ）の質量を水媒体（Ｗ）と無機材料（Ｃ）の合計質量で除して１００を掛けた数値、Ｒａは無機材料（Ｃ）と重合体（Ａ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））である。）

この製造方法に用いられるモノマー（ａ）と無機材料（Ｃ）及び重合体（Ｂ）は、前記細胞培養基材の説明で述べたのと同じものを使用できるので、省略する。

本発明の製造方法に用いる水媒体（Ｗ）は、モノマー（ａ）や無機材料（Ｃ）などを含むことができ、重合によって、物性のよい有機無機複合体分散液が得られれば良く、特に限定されない。例えば水、または水と混和性を有する溶剤及び／またはその他の化合物を含む水溶液であってよく、その中には更に、防腐剤や抗菌剤、着色料、香料、酵素、たんぱく質、コラーゲン、糖類、ペプチド類、アミノ酸類、細胞、ＤＮＡ類、塩類、水溶性有機溶剤類、界面活性剤、高分子化合物、レベリング剤などを含むことができる。

本発明に用いられる重合開始剤（Ｄ）としては、公知のラジカル重合開始剤を適時選択して用いることができる。好ましくは水溶性または水分散性を有し、系全体に均一に含まれるものが好ましく用いられる。具体的には、重合開始剤として、水溶性の過酸化物、例えばペルオキソ二硫酸カリウムやペルオキソ二硫酸アンモニウム、水溶性のアゾ化合物、例えばＶＡ−０４４、Ｖ−５０、Ｖ−５０１（いずれも和光純薬工業株式会社製）の他、Ｆｅ^２＋と過酸化水素との混合物などが例示される。

触媒としては、３級アミン化合物であるＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンなどは好ましく用いられる。但し、触媒は必ずしも用いなくてもよい。重合温度は、重合触媒や開始剤の種類に合わせて例えば０℃〜１００℃が用いられる。重合時間も数十秒〜数十時間の間で行うことが出来る。

一方、光重合開始剤は、酸素阻害の影響を受けにくく、重合速度が速いため、重合開始剤（Ｄ）として好適に用いられる。具体的には、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルトリクロロアセトフェノンなどのアセトフェノン類、４，４’−ビスジメチルアミノベンゾフェノンなどのベンゾフェノン類、２−メチルチオキサントンなどのケトン類、ベンゾインメチルエーテルなどのベンゾインエーテル類、ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトンなどのα−ヒドロキシケトン類、メチルベンゾイルホルメートなどのフェニルグリオキシレート類、メタロセン類などが挙げられる。

前記光重合開始剤は非水溶性のものである。ここで言う非水溶性とは、重合開始剤の水に対する溶解量が０．５質量％以下であることを意味する。非水溶性の重合開始剤を使用することにより、開始剤がより粘土鉱物の近傍に存在しやすく、粘土鉱物近傍からの開始反応点が多くなり、得られる重合体（Ａ）と無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の粒径分布が狭く、分散液（Ｌ）の安定性が高く、好ましい。

前記光重合開始剤を、水媒体（Ｗ）と相溶する溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液を前記水媒体（Ｗ）中に添加することが好ましい。この方法によって光重合開始剤がより均一に分散でき、より粒径の揃った複合体（Ｘ）が得られる。

光重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液中における光重合開始剤（Ｄ）と溶媒（Ｅ）の質量比（Ｄ）／（Ｅ）は、０．００１〜０．１であることが好ましく、０．０１〜０．０５が更に好ましい。０．００１以上であると、紫外線の照射によるラジカルの発生量が十分に得られるため好適に重合反応を進行させることができ、０．１以下であれば、開始剤による発色や、臭気を実質的に生じることがなく、またコストの低減が可能である。

本発明の溶媒（Ｅ）としては、光重合開始剤（Ｄ）と非水溶性重合開始剤（Ｄ）を溶解でき、且つ一定以上の水溶性を有する溶剤を用いることができる。ここで言う水溶性を有する溶剤とは、水１００ｇに対し５０ｇ以上溶解できる溶剤であることが好ましい。水への溶解性が５０ｇ以上であると、非水溶性の重合開始剤（Ｄ）の水媒体（Ｗ）への分散性が良く、得られる複合体（Ｘ）の粒径が揃いやすくなり、分散液（Ｌ）の安定性が高く好ましい。

例えば、水溶性溶剤としては、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミドなどのアミド類、メタノール、エタノール、２−プロパノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフランなどが挙げられる。これらの溶剤を混合して用いても良い

光重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液の添加量が、モノマー（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｗ）、重合開始剤（Ｄ）及び溶媒（Ｅ）の総質量に対し、０．１質量％〜５質量％であることが好ましく、０．２質量％〜２質量％であることが更に好ましい。該分散量が０．１質量％以上であると、重合が十分に開始され、５質量％以下であると、複合体（Ｘ）中の重合開始剤の増加による臭気の発生、更には一旦分散された光重合開始剤が再び凝集する等の問題を低減でき、均一な複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）を得ることができるため好ましい。

無機材料（Ｃ）の水媒体に対する濃度（質量％）は式（４）又は式（５）で表される範囲であることが本発明の細胞培養基材製造法の特徴である。無機材料（Ｃ）の水媒体に対する濃度（質量％）が上記範囲内であると、良好な複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）が得られ、支持体への塗布が容易で、平滑で均一な薄い塗膜が得られ、好ましい。

本発明の製造方法で製造される分散液（Ｌ）は、そのまま使用してもよいし、水洗などによる精製工程を経てから使用してもよい。また該分散液（Ｌ）に更にレベリング剤や界面活性剤、ペプチド、たんぱく質、コラーゲン、アミノ酸類、ペプチド類、多糖類、高分子化合物などを添加して使用してもよい。

本製造方法の第１工程に用いられる重合用光としては、電子線、γ線、Ｘ線、紫外線、可視光などを用いることができるが、中でも装置や取り扱いの簡便さから紫外線を用いることが好ましい。照射する紫外線の強度は１０〜５００ｍＷ／ｃｍ^２が好ましく、照射時間は一般に０．１秒〜２００秒程度である。通常の加熱によるラジカル重合においては、酸素が重合の阻害因子として働くが、本発明では、必ずしも酸素を遮断した雰囲気で溶液の調製および紫外線照射による重合を行う必要がなく、空気雰囲気でこれらを行うことが可能である。但し、紫外線照射を不活性ガス雰囲気下で行うことによって、更に重合速度を速めることが可能で、望ましい場合がある。

本製造方法の第２工程に用いられる塗布方法は、公知慣用の方法でよく、例えば、流延法分散液を支持体に流延させる方法やバーコーターやスピンコーターによる塗布法、または噴霧などのスプレー法が挙げられ、また、パターン状に塗布する場合は、模様のあるゴム版に分散液をつけてから支持体に転写する方法、また支持体に塗布しない部分を予め遮蔽して塗布後遮蔽部分を取り除く方法、インクジェットプリンター方式による塗布方法が挙げられる。

乾燥方法も、分散液（Ｌ）中の揮発成分が揮発し、複合体（Ｘ）の薄層ができれば、任意の方法でよい。例えば、室温自然乾燥、室温の風や加熱または熱風による乾燥、遠赤外線乾燥などがあげられる。或いは分散液をスピンコーターで回転しながら熱風を当てたり加熱したりする方法も挙げられる。

本製造方法における重合体（Ｂ）は、その重量平均分子量Ｍｗが１×１０^４〜２×１０^７であることが好ましく、１×１０^５〜５×１０^６であることが更に好ましい。１×１０^４以上であれば、十分な細胞剥離性が維持でき、また、２×１０^７以下であれば、十分な細胞増殖性が維持でき、性能のよい細胞培養基材を製造できる。

本製造方法は、モノマー（ａ）と無機材料（Ｃ）の比率を調整することにより、細胞の増殖速度を幅広く調整することができ、また、重合体（Ｂ）の種類や下限臨界溶解温度、及び含有量を調整することにより、温度変化による細胞の剥離速度を制御できるという特徴を有する。

本製造方法で得た細胞培養基材の表面は、重合体（Ｂ）が一層覆っているものではなく、複合体（Ｘ）の薄層の中から重合体（Ｂ）が伸び出て、該薄層の表面も適宜露出しているような構造になっている。重合体（Ｂ）は、複合体（Ｘ）の薄層中から表面までイオン結合や水素結合などにより粘土鉱物またはシリカに結合しており、物理的な力や水中でもその結合が切れることなく、安定な構造になっている。

本製造方法で得た細胞培養基材の形状は、細胞培養でき、低温処理により培養細胞を容易に剥離できるものであれば、特に限定されない。例えば、皿状のもの、ボトル（ビン）状のもの、チューブ状のもの、バッグ（袋）状のもの、マルチウエルプレート状のもの、マイクロ流路状のもの、多孔質膜状または網状のもの（例えばトランスウエル、セルストレイナー）、粒径が好ましくは１０〜５００μｍ、より好ましくは１００〜３００μｍの球状のものなどが挙げられる。

本製造方法で用いられた支持体の材質は、培養基材が十分接着でき、且つ接着された培養基材上で細胞培養ができ、低温処理により培養細胞を容易に剥離できるものであれば、特に限定されない。例えば、ポリスチレンのようなスチレン系樹脂、ポリプロピレンのようなポリオレフィン系樹脂、ポリウレタン系樹脂、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスルホン系樹脂、フッ素系樹脂、セルロースのような多糖類天然高分子、ガラスやセラミックスのような無機材料、ステンレス、チタンのような金属類材料が好適に用いられる。

更に、本発明の細胞培養基材が、支持体と一体化して使用されるのは勿論のこと、支持体から剥がして単独に使用してもよい。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲がこれらの実施例にのみ限定されるものではない。

（参考例）
この参考例は重合体（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３）を合成し、下限臨界溶解温度を測定した例である。

ガラス容器に、表１に示す量（単位ｇ）のアクリル酸２メトキシエチル（モノマー（ａ）、東亞合成株式会社製）と、モノマー（ｂ）（株式会社興人製）または（ｃ）（和光純薬工業株式会社製）、または（ｄ）（新中村化学工業株式会社製））、触媒としてＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（和光純薬工業株式会社製）２４μＬ、熱重合開始剤として、２ｗｔ％のペルオキソ二硫酸カリウム（和光純薬工業株式会社製）水溶液３００μＬ、水媒体（Ｗ）として水３０ｇ、を入れ、窒素置換しながら均一に混合した後、ガラス容器を密封して反応溶液（０）を調製した。

［重合体（Ｂ）水溶液の調製］
上記反応溶液（０）を２０℃の恒温水槽に１５時間静置して、重合体（Ｂ）の水溶液を調製した。重合体（Ｂ）の下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）は、重合体（Ｂ）水溶液を１０ｍｍ×１０ｍｍ×４５ｍｍ（高さ）のガラスセルに入れ、紫外可視分光光度計Ｖ−５３０（日本分光株式会社製）を用いて、１０℃〜６０℃の温度範囲で、水溶液の光（波長６００ｎｍ）透過率変化を測定して求めた（LCST以下の温度では水溶液が透明、LCST以上の温度では水溶液白濁、LCSTは透明と白濁の中間点での温度をLCSTとした）。結果を表２に示す。表２の結果より、得られた重合体（Ｂ）のＬＣＳＴが成分組成（モノマー（ｂまたはｃまたはｄ））と良好な直線関係を示すことが理解できる。即ち、成分組成より逆に得られる共重合体ＢのＬＣＳＴを容易に推定できることである。

次に、各反応液のモノマー組成を示す。

次に、各組成の重合体（Ｂ）の下限臨界溶解温度を示す。

（実施例１）
この実施例は重合体（Ｂ１）を用いた細胞培養基材の製造例である。

［モノマー（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｗ）を含む反応溶液の調製］
モノマー（ａ）としてアクリル酸２メトキシエチル（東亞合成株式会社製）０．３２５４ｇ、無機材料（Ｃ）として水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG（水膨潤性ヘクトライト、Rockwood Additives Ltd.社製）０．０２ｇ、水媒体（Ｗ）として水１０ｇ、を均一に混合して反応溶液（１）を調製した。

［重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液の調整］
溶媒（Ｅ）として、メタノール９．８ｇ、重合開始剤（Ｄ）として１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン「イルガキュアー１８４」（チバガイギー社製）０．２ｇを、均一に混合して溶液（ＤＥ）を調製した。

［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（１）全量に、溶液（ＤＥ）を５０μＬ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ^２の紫外線を１８０秒照射し淡い乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ１）を作製した。

この反応系のＲａ＝０．０６１、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝０．２０（％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５＝０．８１

［細胞培養基材の作製（第２工程）］
分散液（Ｌ１）全量に、上記参考例で得た重合体（B1-3）「ＭＥＡ(a)／ＤＭＡＡ(b)（(b)の含有量＝36mol%、LCST＝29℃、表２参照）」の水溶液（重合体濃度＝2.32重量%）を３．０１７２ｇ、２０重量％ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム水溶液を１５０μＬ入れ、均一に混合した後、３５ｍｍポリスチレン製培養シャーレ(Treated Cell Culture Dish、品番430165、Corning Incorporated社製）に入れ、スピンコーターを用いてシャーレの表面に薄く塗布し、８０℃の熱風乾燥器中で３０分間乾燥させた。次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時乾燥して、細胞培養基材１を得た。

該細胞培養基材１中の重合体（Ａ）と無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が０．０６１であり、細胞培養基材全体に対する重合体（Ｂ）の含有率が１６．９質量％であった。

［細胞培養及び温度変化による剥離回収試験］
上記得られた細胞培養基材１に、１０％血清を含有するHam’S F-12培地（和光純薬工業株式会社制）を適量入れ、CHO-K1細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）を播種して（播種濃度は２×１０^５個／シャーレ）、５％二酸化炭素中、３７℃で三日間培養を行った。次いで、（３７℃の）培地を吸い取り、４℃のＰＢＳ水溶液（リン酸緩衝液）を入れ、約１０分間静置させた後、ピペットで培地を吸ったり出したりするピペッティング操作を数回行ったところ、大部分の細胞が培養基材１の表面から剥離されたことが観察された。自然剥離された細胞を回収し、試薬Reagent AとReagent B（chemometec社製）を加え、chemometec社製のヌクレオカウンターを用いて細胞数を計測した。更に細胞回収後の培養基材１にもReagent AとReagent Bを加え、残存した未剥離の細胞もヌクレオカウンターで細胞数を計測した。低温処理で自然剥離・回収された細胞数は９．２×１０^５個で、残存した未剥離の細胞数は１．５×１０^５個であった。下記式（６）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率は約８６％であった。

式（６） 細胞回収率（％）＝｛低温処理で回収した細胞の数／（低温処理で回収した細胞の数＋残存した未剥離細胞の数）｝×１００

また、上記培養基材１から回収された細胞の総数（１０．７×１０^５個）が、未コートシャーレ（Treated Cell Culture Dish、品番430165、Corning Incorporated社製）を用いた場合（１０．８×１０^５個）の約０．９９倍で、細胞増殖性が未コートシャーレとほぼ同等であった。

また、上記低温処理による自然剥離及び基材に残存した未剥離の細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。

この実施例より、重合体（Ａ）と温度応答性を有する重合体（Ｂ）、及び無機材料（Ｃ）を含有する細胞培養基材が、良好な培養性を有すると同時に、低温処理による細胞の回収率が高いことが理解できる。

（実施例２）
この実施例も重合体（Ｂ１）を用いた細胞培養基材の製造例である。

実施例１の第２工程「重合体（B1-3）水溶液（重合体濃度＝2.32重量%）３．０１７２ｇ」の代わりに、「重合体（B1-10）水溶液（重合体濃度＝2.45重量%）２．０４０８ｇ」を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、細胞培養基材２を作製した。

該細胞培養基材２中の重合体（Ａ）と無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が０．０６１であり、細胞培養基材全体に対する重合体（Ｂ）の含有率が１２．６質量％であった。

［細胞培養及び温度変化による剥離回収試験］
実施例１と同様にして、細胞を培養した後、冷ＰＢＳ処理により自然剥離した細胞の数は１３．１×１０^５個で、残存した未剥離の細胞数は１．０×１０^５個であった。式（６）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率は約９３％であった。

また、上記培養基材２から回収された細胞の総数（１４．１×１０^５個）が、未コートシャーレ（Treated Cell Culture Dish、品番430165、Corning Incorporated社製）を用いた場合（１０．８×１０^５個）の約１．３１倍で、細胞増殖性が未コートシャーレよりも高かった。

また、上記低温処理による自然剥離及び基材に残存した未剥離の細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。

この実施例より、重合体（Ａ）と温度応答性を有する重合体（Ｂ）、及び無機材料（Ｃ）を含有する細胞培養基材が、良好な培養性を有すると同時に、低温処理による細胞の回収率が高いことが理解できる。

（実施例３）
この実施例も重合体（Ｂ１）を用いた細胞培養基材の製造例である。

［重合体（Ｂ１）水溶液の調製］
ガラス容器に、アクリル酸２メトキシエチル（モノマー（ａ）、東亞合成株式会社製）０．７８０９ｇ、モノマー（ｂ）としてＮ−メトキシメチルメタクリルアミド（和光純薬工業株式会社製）０．１９３８ｇ、触媒としてＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（和光純薬工業株式会社製）２４μＬ、熱重合開始剤として、２ｗｔ％のペルオキソ二硫酸カリウム（和光純薬工業株式会社製）水溶液３００μＬ、水媒体（Ｗ）として水３０ｇ、を入れ、窒素置換しながら均一に混合した後、ガラス容器を密封した。次いで、該ガラス容器を２０℃の恒温水槽に１５時間静置して、重合体（Ｂ１）の水溶液を調製した。重合体（Ｂ１）のＬＣＳＴは２８℃であった。

［細胞培養基材の作製（第２工程）］
実施例１の第２工程「重合体（B1-3）水溶液（重合体濃度＝2.32重量%）３．０１７２ｇ」の代わりに、「重合体（Ｂ１）水溶液（重合体濃度＝3.15重量%）３．１７４６ｇ」を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、細胞培養基材３を作製した。

該細胞培養基材３中の重合体（Ａ）と無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が０．０６１であり、細胞培養基材全体に対する重合体（Ｂ）の含有率が２２．５質量％であった。

［細胞培養及び温度変化による剥離回収試験］
実施例１と同様にして、細胞を培養した後、冷ＰＢＳ処理により自然剥離した細胞の数は１０．７×１０^５個で、残存した未剥離の細胞数は０．６×１０^５個であった。式（６）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率は約９５％であった。

また、上記培養基材３から回収された細胞の総数（１１．３×１０^５個）が、未コートシャーレ（Treated Cell Culture Dish、品番430165、Corning Incorporated社製）を用いた場合（１０．８×１０^５個）の約１．０５倍で、細胞増殖性が未コートシャーレとほぼ同等であった。

また、上記低温処理による自然剥離及び基材に残存した未剥離の細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。

この実施例より、重合体（Ａ）と温度応答性を有する重合体（Ｂ）、及び無機材料（Ｃ）を含有する細胞培養基材が、良好な培養性を有すると同時に、低温処理による細胞の回収率が高いことが理解できる。

（実施例４）
この実施例は重合体（Ｂ２）を用いた細胞培養基材の製造例である。

［モノマー（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｗ）を含む反応溶液の調製］
モノマー（ａ）としてアクリル酸２エトキシエチル（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）０．３６０４ｇ、無機材料（Ｃ）として水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG（Rockwood Additives Ltd.社製）０．０８ｇ、水媒体（Ｗ）として水１０ｇ、を均一に混合して反応溶液（４）を調製した。

［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（４）全量に、溶液（ＤＥ）を５０μＬ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ^２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ４）を作製した。

この反応系のＲａ＝０．２２、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝０．７９（％）＜０．８７Ｒａ＋２．１７＝２．３６

［細胞培養基材の作製（第２工程）］
分散液（Ｌ４）全量に、上記参考例で得た重合体（B2-3）「ＭＥＡ(a)／ＨＥＡ(c)（(c)の含有量＝60mol%、LCST＝23℃、表２参照）」の水溶液（重合体濃度＝2.95重量%）を２．３７２９ｇ、２０重量％ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム水溶液を１５０μＬ入れ、均一に混合した後、３５ｍｍポリスチレン製培養シャーレ（Treated Cell Culture Dish、品番430165、Corning Incorporated社製）に入れ、スピンコーターを用いてシャーレの表面に薄く塗布し、８０℃の熱風乾燥器中で３０分間乾燥させた。次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時乾燥して、細胞培養基材４を得た。

該細胞培養基材４中の重合体（Ａ）と無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が０．２２であり、細胞培養基材全体に対する重合体（Ｂ）の含有率が１３．７質量％であった。

［細胞培養及び温度変化による剥離回収試験］
実施例１と同様にして、細胞を培養した後、冷ＰＢＳ処理により自然剥離した細胞の数は１１．６×１０^５個で、残存した未剥離の細胞数は０．２×１０^５個であった。式（６）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率は約９８％であった。

また、上記培養基材３から回収された細胞の総数（１１．８×１０^５個）が、未コートシャーレ（Treated Cell Culture Dish、品番430165、Corning Incorporated社製）を用いた場合（１０．８×１０^５個）の約１．０９倍で、細胞増殖性が未コートシャーレとほぼ同等であった。

また、上記低温処理による自然剥離及び基材に残存した未剥離の細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。

この実施例より、重合体（Ａ）と温度応答性を有する重合体（Ｂ）、及び無機材料（Ｃ）を含有する細胞培養基材が、良好な培養性を有すると同時に、低温処理による細胞の回収率が高いことが理解できる。

（実施例５）
この実施例は重合体（Ｂ３）を用いた細胞培養基材の製造例である。

実施例１の「無機材料（Ｃ）として水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG ０．０２ｇ」を「０．１６ｇ」に変え、また、第２工程「重合体（B1-3）水溶液３．０１７２ｇ」の代わりに、「重合体（B3-2）水溶液（重合体濃度＝3.77重量%）１．３２６３ｇ」を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、細胞培養基材５を作製した。

該細胞培養基材５中の重合体（Ａ）と無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が０．４９であり、細胞培養基材全体に対する重合体（Ｂ）の含有率が９．３質量％であった。

この反応系のＲａ＝０．４９、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝１．５７（％）＜０．８７Ｒａ＋２．１７＝２．６０

［細胞培養及び温度変化による剥離回収試験］
実施例１と同様にして、細胞を培養した後、冷ＰＢＳ処理により自然剥離した細胞の数は１０．９×１０^５個で、残存した未剥離の細胞数は０．３×１０^５個であった。式（６）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率は約９７％であった。

また、上記培養基材５から回収された細胞の総数（１１．２×１０^５個）が、未コートシャーレ（Treated Cell Culture Dish、品番430165、Corning Incorporated社製）を用いた場合（１０．８×１０^５個）の約１．０４倍で、細胞増殖性が未コートシャーレとほぼ同等であった。

また、上記低温処理による自然剥離及び基材に残存した未剥離の細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。

この実施例より、重合体（Ａ）と温度応答性を有する重合体（Ｂ）、及び無機材料（Ｃ）を含有する細胞培養基材が、良好な培養性を有すると同時に、低温処理による細胞の回収率が高いことが理解できる。

（実施例６）
この実施例も重合体（Ｂ３）を用いて細胞培養基材を製造する例である。

［重合体（Ｂ３）水溶液の調製］
ガラス容器に、アクリル酸２メトキシエチル（モノマー（ａ）、東亞合成株式会社製）０．８７８４ｇ、モノマー（ｄ）としてメトキシポリエチレングリコール４００アクリレート（商品名：NKエステルAM90G、新中村化学工業株式会社製）０．３６１５ｇ、触媒としてＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（和光純薬工業株式会社製）２４μＬ、熱重合開始剤として、２ｗｔ％のペルオキソ二硫酸カリウム（和光純薬工業株式会社製）水溶液３００μＬ、水媒体（Ｗ）として水３０ｇ、を入れ、窒素置換しながら均一に混合した後、ガラス容器を密封した。次いで、該ガラス容器を２０℃の恒温水槽に１５時間静置して、重合体（Ｂ３）の水溶液を調製した。重合体（Ｂ３）のＬＣＳＴは２３℃であった。

［細胞培養基材の作製（第２工程）］
実施例１の第２工程「重合体（B1-3）水溶液（重合体濃度＝2.32重量%）３．０１７２ｇ」の代わりに、「重合体（Ｂ３）水溶液（重合体濃度＝3.97重量%）１．２５９４ｇ」を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、細胞培養基材６を作製した。

該細胞培養基材６中の重合体（Ａ）と無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が０．０６１であり、細胞培養基材全体に対する重合体（Ｂ）の含有率が９．３質量％であった。

［細胞培養及び温度変化による剥離回収試験］
実施例１と同様にして、細胞を培養した後、冷ＰＢＳ処理により自然剥離した細胞の数は１０．４×１０^５個で、残存した未剥離の細胞数は０．４×１０^５個であった。式（６）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率は約９６％であった。

また、上記培養基材６から回収された細胞の総数（１０．８×１０^５個）が、未コートシャーレ（Treated Cell Culture Dish、品番430165、Corning Incorporated社製）を用いた場合（１０．８×１０^５個）の約１．００倍で、細胞増殖性が未コートシャーレとほぼ同等であった。

また、上記低温処理による自然剥離及び基材に残存した未剥離の細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。

この実施例より、重合体（Ａ）と温度応答性を有する重合体（Ｂ）、及び無機材料（Ｃ）を含有する細胞培養基材が、良好な培養性を有すると同時に、低温処理による細胞の回収率が高いことが理解できる。

実施例１〜６で得られた結果を下記表３および４に示す。

（実施例７）
この実施例は実施例１〜６で作製した培養基材１〜６を用いた間葉系幹細胞の培養及び温度変化による剥離回収試験例である。

［細胞培養及び温度変化による剥離回収試験］
上記実施例１〜６で得られた細胞培養基材１〜６に、１０％血清を含有するＭＥＭ-α培地（和光純薬工業株式会社制）を適量入れ、骨髄由来間葉系幹細胞を播種して（播種濃度は１×１０^５個／シャーレ）、５％二酸化炭素中、３７℃で三日間培養を行った。次いで、（３７℃の）培地を吸い取り、４℃のＰＢＳ水溶液（リン酸緩衝液）を入れ、約１０分間静置させた後、ピペットで培地を吸ったり出したりするピペッティング操作を数回程行ったところ、大部分の細胞が培養基材（１〜６）の表面から剥離されたことが観察された。自然剥離された細胞の回収率及び未コートシャーレとの細胞数の比（細胞増殖性）を表３に示した。

また、上記低温処理による自然剥離及び基材に残存した未剥離の細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。

この実施例より、重合体（Ａ）と温度応答性を有する重合体（Ｂ）、及び無機材料（Ｃ）を含有する細胞培養基材が、幹細胞に対しても良好な培養性を有すると同時に、低温処理による細胞の回収率が高いことが理解できる。

（実施例８）
この実施例は実施例１で作製した培養基材１を用いた細胞薄膜の培養・回収例である。

培養基材１に、ＣＳ-Ｃ complete medium（Cell Systems社製培地）を適量入れ、正常ヒト真皮線維芽細胞を播種して（播種濃度は１．２×１０^４個／ｃｍ^２）、５％二酸化炭素中、３７℃で培養を行った。細胞が十分増殖したのを確認して、その（３７℃の）培地を吸い取り、４℃のＰＢＳ水溶液（リン酸緩衝液）を入れ、数分間静置させたところ、増殖した薄膜状細胞が自然に剥がれた。

また、上記低温処理による自然剥離した細胞薄膜を、顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。

この実施例より、重合体（Ａ）と温度応答性を有する重合体（Ｂ）、及び無機材料（Ｃ）を含有する細胞培養基材が、良好な培養性を有すると同時に、低温処理により薄膜状の細胞を容易に得られることが理解できる。

（実施例９）
この実施例は実施例１の塗布液を用いた培養バッグの作製例である。

［細胞培養基材の作製（第２工程）］
分散液（Ｌ１）全量に、上記参考例で得た重合体（B1-3）（表２参照）の水溶液を３．０１７２ｇ、２０重量％ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム水溶液を１５０μＬ入れ、均一に混合した後、培養バッグ（CultiLife215、内表面積215ｃｍ^２、コージンバイオ株式会社製）に適量入れ、内表面全体を馴染ませた後、余分の液を十分除去し、７０℃の熱風乾燥器中で６０分間乾燥させた。次いで、滅菌水によりバッグ内部を十分洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、一晩乾燥して、細胞培養基材（培養バッグ）９を得た。

［細胞培養及び温度変化による剥離回収試験］
実施例１と同様にして（細胞播種濃度は35mmシャーレ換算で実施例１と同じ濃度）、細胞を培養した後、冷ＰＢＳ処理により自然剥離した細胞の数は１３．１×１０^５個／ｃｍ^２で、残存した未剥離の細胞数は０．０４×１０^５個／ｃｍ^２であった。式（６）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率は約９７％であった。

また、上記培養基材９から回収された細胞の総数（１．３４×１０^５個／ｃｍ^２）が、未コートシャーレ（Treated Cell Culture Dish、品番430165、表面積８ｃｍ^２、Corning Incorporated社製）を用いた場合（１．３５×１０^５個／ｃｍ^２）の約０．９９倍で、細胞増殖性が未コートシャーレとほぼ同等であった。

また、上記低温処理による自然剥離及び基材に残存した未剥離の細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。

この実施例より、重合体（Ａ）と温度応答性を有する重合体（Ｂ）、及び無機材料（Ｃ）を含有する細胞培養基材（培養バッグ）が、良好な培養性を有すると同時に、低温処理による細胞の回収率が高いことが理解できる。

（実施例１０）
この実施例は無機材料（Ｃ）としてシリカを用いた細胞培養基材の製造例である。

実施例１の「水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG ０．０２ｇ」の代わりに、「コロイダルシリカ（商品名：スノーテックス２０（シリカ濃度２０重量％、日産化学工業株式会社製））０．１ｇ」を用いたこと以外は、実施例１と同様にして細胞培養基材１０を作製した。

［細胞培養及び温度変化による剥離回収試験］
実施例１と同様にして、細胞を培養した後、冷ＰＢＳ処理により自然剥離した細胞の数は９．４５×１０^５個で、残存した未剥離の細胞数は１．０５×１０^５個であった。式（６）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率は約９０％であった。 また、上記培養基材１０から回収された細胞の総数（１０．５×１０^５個）が、未コートシャーレ（Treated Cell Culture Dish、品番430165、Corning Incorporated社製）を用いた場合（１０．８×１０^５個）の約０．９７倍で、細胞増殖性が未コートシャーレと同等であった。

また、上記低温処理による自然剥離及び基材に残存した未剥離の細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。

この実施例より、重合体（Ａ）と温度応答性を有する重合体（Ｂ）、及びシリカ（無機材料（Ｃ））を含有する細胞培養基材が、良好な培養性を有すると同時に、低温処理による細胞の回収率が高いことが理解できる。

（実施例１１）
この実施例は細胞培養基材の耐滅菌性を示した例である。

実施例で作製した細胞培養基材６を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）。次いで、実施例１と同様にして、細胞を培養した後、冷ＰＢＳ処理により自然剥離した細胞の数は１０．６９×１０^５個で、残存した未剥離の細胞数は０．３３×１０^５個であった。式（６）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率は約９７％であった。

また、上記培養基材６から回収された細胞の総数（１１．０２×１０^５個）が、未コートシャーレ（Treated Cell Culture Dish、品番430165、Corning Incorporated社製）を用いた場合（１０．８×１０^５個）の約１．０２倍で、細胞増殖性が未コートシャーレとほぼ同等であった。

また、上記低温処理による自然剥離及び基材に残存した未剥離の細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。

この実施例より、重合体（Ａ）と温度応答性を有する重合体（Ｂ）、及び無機材料（Ｃ）を含有する細胞培養基材が、放射線による滅菌を行っても、良好な培養性と低温処理による細胞の高回収率が変化しないことが理解できる。

（実施例１２）
この実施例は実施例１の塗布液を用いた培養マイクロキャリアビーズの作製例である。

［細胞培養基材の作製（第２工程）］
分散液（Ｌ１）全量に、上記参考例で得た重合体（B1-3）（表２参照）の水溶液を３．０１７２ｇ、２０重量％ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム水溶液を１５０μＬ入れ、均一に混合して、塗布液を得た。
７０μｍの孔を有するナイロンメッシュ製セルストレエナー（Cell Strainer、BD Falcon製）に、平均粒径が３００μｍのポリスチレン製ビーズ（商品名：PolyBeads、ポリサイエンス社製）を少量入れ、その上に上記で調製した塗布液を適量滴下し、ビーズ表面を塗布液で濡らした。次いで該セルストレエナーを６ウエルプレートに入れ、２０００ｒｐｍの条件で、遠心機によりビーズ表面の過剰な塗布液を落とし、７０℃の熱風乾燥器中で３０分間乾燥させた。次いで、５０℃の滅菌水でコートビーズを十分洗浄して、培養マイクロキャリアビーズ１２を得た。

［細胞培養及び温度変化による剥離回収試験］
上記得られた培養マイクロキャリアビーズ１２を３５ｍｍポリスチレン製シャーレ（６０ｍｍ／Non-Treated Dish、旭テクノグラス株式会社製）に入れ、Doulbecco's modified Eagle's Medium（ＤＭＥＭ）培地（ＦＢＳを１０％添加）（日水製薬株式会社製）を適量添加した。次いで、Ｂａｌｂ３Ｔ３細胞（マウス腫瘍線維芽細胞）を播種して（播種濃度は１．０×１０^４個／ｃｍ^２）、５％二酸化炭素中、３７℃で培養を行った。培養開始４時間後、細胞がビーズの表面に接着しているのが顕微鏡で確認された。更に、培養３日後、ビーズの表面がほぼすべて細胞に覆われていることが観察された。次いで、培養３日後の培養マイクロキャリアビーズの３７℃の培地を４℃の培地に交換し、数分静置したところ、一部の細胞がビーズ表面から剥離したことが観察された。更に、ピペットで培地を吸ったり出したりする「ピペッティング」操作を数回行ったところ、ビーズ表面の細胞が全て剥離したことが観察された（細胞の剥離回収率＝１００％であった）。

また、上記低温処理及びピペッティング操作により剥離した細胞を、顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。

この実施例より、重合体（Ａ）と温度応答性を有する重合体（Ｂ）、及び無機材料（Ｃ）を含有する細胞培養基材（培養マイクロキャリアビーズ）が、良好な培養性を有すると同時に、低温処理及びピペッティング操作による細胞の回収率が高いことが理解できる。

（比較例１）
この比較例は市販の細胞培養シャーレを用いた細胞培養・低温処理による自然剥離の例である。

市販の細胞培養シャーレ（Treated Cell Culture Dish、品番430165、Corning Incorporated社製）を用いて、実施例１と同様にして、細胞を培養した後、冷ＰＢＳ処理により自然剥離した細胞の数は２．２×１０^５個で、残存した未剥離の細胞数は８．６×１０^５個であった。式（６）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率は約２０％であった。

この比較例から、市販の培養基材は、本発明の培養基材に比べ、細胞増殖性は変わらないが、低温処理による細胞の自然剥離性は殆どないことが理解できる。

（比較例２）
この比較例は重合体（Ｂ）を含有しない細胞培養基材の例である。

実施例５の製法において、第２工程の「重合体（B3-2）水溶液」を添加しないこと以外は、実施例５と同様にして、細胞培養基材２’を作製した。

［細胞培養及び温度変化による剥離回収試験］
実施例１と同様にして、細胞を培養した後、冷ＰＢＳ処理により自然剥離した細胞の数は０．９９×１０^５個で、残存した未剥離の細胞数は１０．０１×１０^５個であった。式（６）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率は約９％であった。

また、上記培養基材５から回収された細胞の総数（１１．０×１０^５個）が、未コートシャーレ（Treated Cell Culture Dish、品番430165、Corning Incorporated社製）を用いた場合（１０．８×１０^５個）の約１．０２倍で、細胞増殖性が未コートシャーレとほぼ同等であった。

この比較例から、重合体（Ｂ）を含まない場合、細胞の増殖性は変わらないが、細胞回収率は大きく低下したことが理解できる。

（比較例３）
この比較例は重合体（Ｂ）を過剰に含有した細胞培養基材の例である。

［細胞培養基材の作製（第２工程）］
実施例１の分散液（Ｌ１）全量に配合する重合体（B1-3）水溶液の量「３．０１７２ｇ」の代わりに、「１０．３４４８ｇ」を用いること以外は、実施例１と同様にして細胞培養基材３’を作製した。

該細胞培養基材３’全体に対する重合体（Ｂ）の含有率が４１．０質量％であった。

［細胞培養及び温度変化による剥離回収試験］
実施例８と同様にして、正常ヒト真皮線維芽細胞を培養したところ、細胞が基材に接着せず、播種した細胞が死滅し、増殖は全く見られなかった。

この比較例から、重合体（Ｂ）を過剰に含有すると、細胞の接着・増殖が阻害され、細胞培養ができなくなることが理解できる。

（比較例４）
この比較例は市販のポリスチレン製ビーズを用いた細胞培養の例である。

市販のポリスチレン製ビーズ（商品名：PolyBeads、ポリサイエンス社製）を用いて、実施例１２と同様にして、Ｂａｌｂ３Ｔ３細胞を培養したところ、培地中で凝集した細胞塊が見られたものの、ビーズ表面には細胞が全く観察されなかった。

この比較例から、市販のポリスチレン製ビーズは、本発明の培養マイクロキャリアビーズ１２に比べ、細胞の接着・増殖性を有しないことが理解できる。

（比較例５）
この比較例は無機材料（Ｃ）の濃度が式（５）の範囲を超えた例である。

［モノマー（ａ）、水膨潤性無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｗ）を含む反応液の調製］
モノマー（ａ）としてアクリル酸２メトキシエチル（東亞合成株式会社製）１．３２ｇ、無機材料（Ｃ）として水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG（Rockwood Additives Ltd.社製）０．３２ｇ、重合開始剤として溶液（ＤＥ）５０μＬ、水媒体（Ｗ）として水１０ｇを均一に混合して反応液（４′）を調製した。次いで、該反応液（４′）を３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ^２の紫外線を１８０秒照射したところ、反応液（４′）全体がゲル化した。このゲルを大量の水に入れても溶解や分散せずゲルのままであった。

この反応系のＲａ＝０．２４、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝３．１０％＞０．８７Ｒａ＋２．１７＝２．３８

この比較例から、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）が式（５）の範囲を超えると、反応液全体がゲル化してしまい、複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）が得られず、シャーレへのコーティングによる細胞培養基材の製造ができないことが理解できる。

上記実施例及び比較例から、本発明の細胞培養基材は、他の材質の支持体との間、良好な接着性を有し、優れた細胞培養と温度変化による自然剥離機能を有している。また、この細胞培養基材は、短時間で、容易に製造できることが明らかであった。

本発明の細胞培養基材は、生化学、創薬及び再生医療分野で、コロニー状細胞群や２次元のシート状細胞、３次元の立体細胞増殖物の調製に利用できる。

Claims (3)

1. 下記式（１）で表されるモノマー（ａ）の重合体（Ａ）と、下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有し、
   前記重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０１〜３の範囲にあり、
   前記重合体（Ｂ）が、モノマー（ａ）と親水性のアミド系ビニルモノマー（ｂ）との共重合体（Ｂ１）、またはモノマー（ａ）と下記式（２）で表されるモノマー（ｃ）との共重合体（Ｂ２）、またはモノマー（ａ）と下記式（３）で表されるポリエチレングリコール鎖含有モノマー（ｄ）との共重合体（Ｂ３）であり、
   前記親水性のアミド系ビニルモノマー（ｂ）が、Ｎ−メトキシメチル（メタ）アクリルアミド、およびＮ−ビニルピロリドンからなる群から選ばれる少なくとも一種であり、
   細胞培養基材全体に対する前記重合体（Ｂ）の含有率が０．１質量％〜４０質量％である細胞培養基材。
   

   

   （式中、Ｒ_１は水素原子またはメチル基、Ｒ_２は炭素原子数２〜３のアルキレン基、Ｒ_３は炭素原子数１〜２のアルキル基を表す。）
   

   

   （式中、Ｒ_４は水素原子またはメチル基、Ｒ_５は炭素原子数２〜３のアルキレン基を表す。）
   

   

   （式中、ｎは２〜２０の整数を表す。）
2. 形状が、皿状、ボトル状、チューブ状、バッグ状、マルチウエルプレート状、マイクロ流路状、多孔質膜状、網状、または球状である、請求項１に記載の細胞培養基材。
3. 請求項１または２に記載の細胞培養基材の製造方法であって、
   前記水媒体（Ｗ）中の前記無機材料（Ｃ）の濃度が下記式（４）又は式（５）で表される範囲となるように、前記モノマー（ａ）と前記無機材料（Ｃ）と重合開始剤（Ｄ）とを水媒体（Ｗ）に混合した後、前記モノマー（ａ）を重合させることにより、重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）を製造する第１工程、
   前記分散液（Ｌ）に、前記重合体（Ｂ）を添加し、混合して、支持体に塗布した後、乾燥させる第２工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
   式（４） Ｒａ＜０．１９のとき
   無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜１２．４Ｒａ＋０．０５
   式（５） Ｒａ≧０．１９のとき
   無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜０．８７Ｒａ＋２．１７
   （式中、無機材料（Ｃ）の濃度（質量％）は、無機材料（Ｃ）の質量を水媒体（Ｗ）と無機材料（Ｃ）の合計質量で除して１００を掛けた数値、Ｒａは無機材料（Ｃ）と重合体（Ａ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））である。）