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CN110099996A - 细胞培养基材 - Google Patents

细胞培养基材 Download PDF

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CN110099996A
CN110099996A CN201780079493.4A CN201780079493A CN110099996A CN 110099996 A CN110099996 A CN 110099996A CN 201780079493 A CN201780079493 A CN 201780079493A CN 110099996 A CN110099996 A CN 110099996A
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cell culture
culture substrate
cells
segment
block polymer
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CN201780079493.4A
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中熊大英
一色绫子
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Fujifilm Corp
Original Assignee
Dainippon Ink and Chemicals Co Ltd
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Publication date
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Application filed by Dainippon Ink and Chemicals Co Ltd filed Critical Dainippon Ink and Chemicals Co Ltd
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Abstract

本发明提供一种细胞培养基材，其特征在于，所述细胞培养基材含有具有最低临界溶解温度的链段与疏水性链段的嵌段聚合物，该具有最低临界溶解温度的链段的聚合度为400‑10000。还提供一种细胞培养基材，其中，疏水性链段是使具有特定结构的单体聚合而得到的。另外提供一种细胞培养基材，其特征在于，其层叠在支撑体上。还提供一种细胞培养基材，其平均膜厚为1000nm以下。

Description

细胞培养基材
技术领域
本发明涉及细胞培养用的基材。
背景技术
近年来，动物细胞培养技术显著进步，动物细胞本身及其产物等被广泛用于研究用途、医疗用途。在想要对动物细胞进行体外培养时，需要使其附着于成为支架的某种基材，这种情况下，细胞与基材之间通过由细胞释放出的粘附性蛋白或事先涂布的支架剂而粘附在一起。因此，在将该细胞从基材剥离时，需要例如使用酶处理等破坏细胞与基材之间的蛋白质，对细胞的损伤等成为问题。
基于这样的背景，提出了在基材表面固定化有温度响应性的聚合物的细胞培养基材。这种基材在细胞培养温度下显示蛋白粘附性，通过降至低温来改变细胞培养基材的表面状态、使蛋白粘附性下降，因此能够在不进行酶处理的情况下将细胞剥离。(例如，专利文献1)
另外，专利文献2提出了下述方案：通过使用一种在基材表面覆盖有嵌段共聚物的基材，所述嵌段共聚物采取水不溶性聚合物链段与温度响应性聚合物链段键合的结构，从而不需要如电子束照射那样的庞大装置也能将温感响应性聚合物固定化在基材表面。
但是，专利文献2中公开的嵌段共聚物的耐水性不足，存在发生从基材表面溶出的问题、和细胞剥离性不充分的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开平2-211865号公报
专利文献2:WO2012/029882
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于，提供能够高效率地培养动物细胞且能够使培养后的细胞以存活状态剥离而回收的细胞培养基材。
用于解决问题的方案
发明人们进行了深入研究，结果发现，通过提供下述细胞培养基材可以解决上述课题，所述细胞培养基材的特征在于，其含有具有最低临界溶解温度的链段与疏水性链段的嵌段聚合物，该具有最低临界溶解温度的链段的聚合度为400-10000。
另外，提供一种细胞培养基材，其中，上述疏水性链段是使下述式(1)所示的单体聚合而得到的。
(上述式(1)中，R1为氢原子或甲基，R2表示苯基、烷基碳数为1～8的羧基烷基、芳烷基碳数为7～8的羧基芳烷基、下述式(2)所示的基团、下述式(3)所示的基团中的任意一者。
(上述式(2)中，n表示2或3，R3表示碳数1～3的烷基。)
(上述式(2)中，R4和R5分别独立地表示氢原子或碳数1～6的烷基，R4和R5的合计碳数为5以上。))
发明的效果
本发明的细胞培养基材能够高效率地培养动物细胞，且可以使培养后的细胞以存活状态从基材剥离而回收。
具体实施方式
本发明提供一种细胞培养基材，其特征在于，其含有具有最低临界溶解温度的链段与疏水性链段的嵌段聚合物，该具有最低临界溶解温度的链段的聚合度为400-10000。
[具有最低临界溶解温度的链段]
本发明中的具有最低临界溶解温度的链段是指：嵌段聚合物中的链段，该链段由若达到某一定温度以下则溶解的聚合物构成。
本发明中的具有最低临界溶解温度的链段是指：如下所述的达到某一定温度以下则溶解于水的聚合物。作为具有最低临界溶解温度的聚合物，可列举下述1)和2)。
1)使均聚物具有最低临界溶解温度的单体聚合而得到的聚合物
2)疏水化单体与亲水性单体的共聚物
1)是仅使均聚物具有最低临界溶解温度的单体聚合而得到的聚合物链段。作为均聚物具有最低临界溶解温度的单体，可例示例如：N-异丙基(甲基)丙烯酰胺、N-正丙基(甲基)丙烯酰胺、N-环丙基(甲基)丙烯酰胺、N-乙氧基乙基(甲基)丙烯酰胺、N-四氢糠基(甲基)丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N-乙基-N-甲基丙烯酰胺、N,N-二乙基丙烯酰胺、N-甲基-N-正丙基丙烯酰胺、N-甲基-N-异丙基丙烯酰胺、N-丙烯酰基哌啶和N-丙烯酰基吡咯烷。这些单体可以单独使用，也可以同时使用多种。
对于1)、即、使均聚物具有最低临界溶解温度的单体聚合而得到的链段而言，可以简便地制造具有最低临界溶解温度的聚合物。但是，这些单体存在下述问题：与塑料表面之间的粘接性低，如果与水接触则所涂布的聚合物层容易剥离，但本申请的细胞培养基材含有疏水性链段，因此耐水性优异，因此培养基材不会剥离，可以使用。
2)是疏水化单体与亲水性单体的共聚物。为了使疏水化单体与亲水性单体的共聚物具有最低临界溶解温度，可列举：
2-1)亲水性单体为均聚物具有最低临界溶解温度的单体的情况；和
2-2)下述式(1)所示的单体(a)与亲水性的酰胺系乙烯基单体(b)的共聚物(B1)、上述单体(a)与下述式(2)所示的单体(c)的共聚物(B2)或者单体(a)与下述式(3)所示的含有聚乙二醇链的单体(d)的共聚物(B3)。
(式中，R1表示氢原子或甲基，R2表示碳原子数2～3的亚烷基，R3表示碳原子数1～2的烷基。)
(式中，R4表示氢原子或甲基，R5表示碳原子数2～3的亚烷基。)
(式中，n表示2～20的整数)
作为亲水性的酰胺系单体(b)，可例示二甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、乙基丙烯酰胺等。
疏水化单体是指：单体时为水溶性、但若聚合则不溶于水性溶剂的单体。当共聚物中含有这样的单体时，可以制成耐水性优异、不易从支撑体剥离的细胞培养基材。
作为疏水化单体，可列举：上述式(1)所示的化合物；二丙酮丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸聚丙二醇酯、甲氧基二乙二醇丙烯酸酯、甲氧基三乙二醇丙烯酸酯。这些可以单独使用，也可以同时使用多种。其中，优选丙烯酸2-甲氧基乙酯、丙烯酸2-乙氧基乙酯、丙烯酸3-甲氧基丙酯，特别优选丙烯酸2-甲氧基乙酯、丙烯酸2-乙氧基乙酯。
在为2-2)中公开的共聚物链段时，可通过单体的种类、比率将得到的共聚物链段的最低临界溶解温度控制在较宽范围内，另外可以根据细胞的种类适当改变单体的种类、比率，可以以更良好的细胞粘附性和增殖性来培养细胞，因此优选。例如，随着单体(b或c、或d)相对于单体(a)的比率的增加，所得到的共聚物的最低临界溶解温度向高温侧移动。该比率与最低临界溶解温度几乎呈直线关系。细胞培养温度通常为37℃，因此优选按照所得到的共聚物的最低临界溶解温度在20～32℃℃附近的方式进行制备。
本发明的嵌段聚合物中，上述具有最低临界溶解温度的链段的聚合度为400-10000。小于400的情况下，细胞剥离性变得不良；大于10000的情况下，细胞培养基材的耐水性差，因此基材容易从支撑体剥离。
作为优选的聚合度，为1000-8000，如果为该范围，则细胞剥离性和培养效率均衡性优异。特别优选为3000-6000。
[疏水性链段]
本发明的嵌段聚合物的特征在于，具有疏水性链段。需要说明的是，本说明书中，嵌段聚合物的链段中的“疏水性”是指：对于由链段构成的聚合物而言，水中的25℃下的溶解度小于0.5g/100mL。疏水性链段至少包含疏水性单体的单体单元。
本发明的嵌段聚合物由于具有疏水性链段，因此即使具有耐水性差的、具有最低临界溶解温度的链段，也耐水性优异、与支撑体的密合性优异。
作为疏水性单体，只要是聚合后实现了疏水化的单体则没有特别限制，优选列举下述式(1)～(3)所示的单体。需要说明的是，这些疏水性单体可以单独使用，也可以将2种以上组合使用。
(上述式(1)中，R1为氢原子或甲基，R2表示苯基、烷基碳数为1～8的羧基烷基、芳烷基碳数为7～8的羧基芳烷基、下述式(2)所示的基团、下述式(3)所示的基团中的任意一者。
(上述式(2)中，n表示2或3，R3表示碳数1～3的烷基。)
(上述式(2)中，R4和R5分别独立地表示氢原子或碳数1～6的烷基，R4和R5的合计碳数为5以上。))
其中，如果为上述式(1)所示的单体，则得到的聚合物链段为疏水性，细胞培养基材的耐水性和支撑体密合性优异，因此是优选的。
其中优选为丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、苯乙烯，特别优选丙烯酸丁酯。
[嵌段聚合物]
本发明的嵌段聚合物是含有上述具有最低临界溶解温度的链段、和疏水性链段的聚合物。在将具有最低临界溶解温度的链段设为A、将疏水性链段设为B时，本发明的嵌段聚合物可以是AB的二嵌段型，也可以是ABA或BAB的三嵌段型，还可以是具有三以上的链段数的聚合物。优选为二嵌段型或三嵌段型，特别优选为二嵌段型。
[嵌段聚合物的制造方法]
嵌段聚合物的制造方法没有特别限制，可以采用公知的方法。其中，优选精密自由基聚合，更优选可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合、原子转移自由基聚合(ATRP)、氮氧化物介导的聚合(NMP)，进一步优选RAFT聚合。
[其它配混物]
本发明的细胞培养基材除了嵌段聚合物以外，还可以具有配混物。可以包含例如防腐剂、抗菌剂、着色料、香料、酶、糖类、蛋白质、肽类、氨基酸类、细胞、DNA类、盐类、水溶性有机溶剂类、表面活性剂、高分子化合物、流平剂等。
[细胞培养基材]
本发明的细胞培养基材的形状只要是可以进行细胞培养、可以通过低温处理容易地剥离培养细胞的形状则没有特别限定。可列举例如：薄膜状、皿状、瓶(bin)状、管状、粗细为5nm～5mm的线状或棒状、袋(bag)状、多孔板状、微流路状、多孔膜状或网状(例如Transwell、细胞过滤器)以及粒径优选为10～2000μm、更优选为100～500μm的球状等。
另外，作为本发明的细胞培养基材的膜厚，在以最低临界温度以上的温度充分干燥的状态下优选为1000nm以下，进一步优选为500nm以下。
本发明的细胞培养基材可以单独使用，优选以在支撑体上形成有基材的细胞培养器材形式使用。这是由于，在制成细胞培养器材的情况下，除了运输、保管等的便利性优异以外，还可以直接作为培养容器、培养用载体使用。
关于层叠本发明的细胞培养基材的支撑体的材质，只要能充分粘接培养基材且可以在所粘接的培养基材上进行细胞培养、可以通过低温处理容易地剥离培养细胞则没有特别限定。优选使用例如：聚苯乙烯之类的苯乙烯系树脂；聚丙烯之类的聚烯烃系树脂；聚氨酯系树脂；聚碳酸酯；聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)；聚砜系树脂；氟系树脂；纤维素之类的多糖类天然高分子；玻璃、陶瓷之类的无机材料；不锈钢、钛之类的金属类材料。
支撑体的形状没有特别限定，为可成为本发明的细胞培养基材的支撑体的形状即可。可列举例如：薄膜状、膜状、板状、球状、多边形、棒状、皿状、瓶(bin)状、管状、针/线状、纤维状、袋(bag)状、多孔板状、微流路状、多孔膜状或网状(例如Transwell、细胞过滤器)等。可以是将这些组合而成的形状，也可以是不具有特定的形状的无定形的支撑体。
另外，本发明的细胞培养基材可与支撑体一体化而以细胞培养器材形式使用，这是不言而喻的，也可以从支撑体剥下后单独使用。
作为形成本发明的细胞培养基材的优选方法，可列举在上述支撑体上涂布包含本发明的嵌段聚合物的涂层剂的方法。
＜涂层剂＞
上述涂层剂包含嵌段聚合物和溶剂。此外可根据需要包含添加剂等。
[嵌段聚合物]
作为嵌段聚合物，使用上述嵌段聚合物，因此这里省略说明。
需要说明的是，嵌段聚合物可以仅包含1种，也可以包含具有不同构成的2种以上嵌段聚合物。
嵌段聚合物的含量相对于涂层剂的总质量优选为0.01～90质量％，更优选为0.1～50质量％。当嵌段聚合物的含量为0.01质量％以上时，所得到的涂膜容易表现表面亲水性，因此是优选的。另一方面，当嵌段聚合物的含量为90质量％以下时，由于粘度低因而涂覆适应性提高，因此是优选的。
[溶剂]
作为涂层剂中可含有的溶剂，没有特别限定，可使用公知的溶剂。
作为溶剂的具体例子，可列举水或有机溶剂。
作为上述有机溶剂，可列举：甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、异丁醇、叔丁醇等醇系溶剂；四氢呋喃、1,4-二噁烷等醚系溶剂；环己酮、甲基异丁基酮等酮系溶剂；乙腈等腈系溶剂；二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺等酰胺系溶剂；二甲基亚砜；二氧杂环丙烷；吡咯烷酮等。这些中，优选使用醇系溶剂作为有机溶剂，更优选使用甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、叔丁醇。
上述中，溶剂优选为水、醇系溶剂，更优选为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、叔丁醇。
上述溶剂可以单独使用，也可以将2种以上组合使用。
涂层剂中的溶剂的含量相对于涂层剂的总质量优选为10～99.99质量％，更优选为50～99.9质量％，进一步优选为80～99.5质量％。当溶剂的含量为10质量％以上时，涂层剂溶液的粘度降低，因而涂覆适应性优异，因此是优选的。另一方面，当溶剂的含量为99.99质量％以下时，涂布后的涂膜厚度不会过度变薄，因此是优选的。
[添加剂]
涂层剂可以根据使用目的而含有添加剂。
作为该添加剂，没有特别限定，可使用公知的添加剂。具体而言，可列举赋形剂、表面活性剂、增塑剂、消泡剂、颜料、抗氧化剂、抗生素、紫外线吸收剂、结晶成核剂、结晶促进剂、稳定剂、抗菌剂等。这些添加剂可以单独使用，也可以将两种以上混合使用。
涂层剂的涂布方法没有特别限制，可列举喷涂法、流涂法、浸渍法等。
另外，在基材为管状时，可列举使涂层剂通入的方法等。此时，通入后通常会通入溶剂，从而将管内部的多余的涂层剂除去。
对干燥条件也没有特别限定，可以是自然干燥，也可以是加热干燥。在加热干燥的情况下，干燥温度根据所使用的涂层剂而不同，优选为30～70℃，更优选为40～60℃。需要说明的是，通过控制干燥，可以得到残留有部分溶剂的涂膜。
〔动物细胞〕
本发明的细胞培养基材可适合培养动物细胞。作为动物细胞，只要来源为动物即可，可列举人、小鼠、猴子等。作为细胞种类，没有特别限定，可列举上皮细胞(角膜上皮细胞等)、内皮细胞(人脐带静脉内皮细胞等)、成纤维细胞(人皮肤成纤维细胞、小鼠成纤维细胞等)、血细胞、收缩性细胞(骨骼肌细胞、心肌细胞等)、血液与免疫细胞(红细胞、巨噬细胞等)、神经细胞(神经元、神经胶质细胞等)、色素细胞(视网膜色素细胞等)、肝细胞、软骨细胞、成骨细胞、干细胞(ES细胞、iPS细胞、造血干细胞、皮肤干细胞、生殖干细胞、EC细胞、EG细胞、神经干细胞)等。
在用本细胞培养基材培养动物细胞时，可以通过使培养基和细胞共存于本细胞培养基材、保持适合于培养的温度从而进行培养。作为培养基，选择适合于细胞种类的培养基即可。在培养中，根据培养期，培养基可以进行更换也可以不进行，适当选择即可。另外，培养基为静置状态或灌流状态均可，选择适合于培养细胞的方法即可。
实施例
以下通过实施例具体说明本发明，但本发明的范围并非仅限于这些实施例。
＜合成例1＞
嵌段聚合物1的合成
对丙烯酸丁酯(和光纯药株式会社制)0.59g、作为RAFT剂的2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)丙酸0.0065g、2,2’-偶氮二(2-甲基丙酸)二甲酯0.0036g、叔丁醇9.0g、水1.0g充分进行氮气鼓泡而除去氧后，在70℃下搅拌7小时，得到第1反应液。该阶段的丙烯酸丁酯的转化率为81％。
接着，对N-异丙基丙烯酰胺(以下记作NIPAM、株式会社KJ Chemical制)10.53g、叔丁醇49.86g、水5.54g的混合物充分进行氮气鼓泡后，添加到上述反应液中，再在70℃下搅拌20小时。反应结束后，向反应液中加入甲醇66.7g，得到AB型的温度响应性嵌段聚合物溶液。用NMR测定该嵌段聚合物的转化率，结果丙烯酸丁酯的转化率为100％，NIPAM的转化率为99％。另外，测定该嵌段聚合物的分子量分布的结果是Mn＝220000、Mw＝760000。将用后述试验方法测定该嵌段聚合物的水凝胶分数的结果示于表1。
[实施例1]
将上述合成例1中得到的嵌段聚合物1用甲醇稀释而制作0.5％溶液，将60ul添加到35mm聚苯乙烯培养皿(TCPS、IWAKI制)中。然后，将在80℃下干燥30分钟、再在纯水中浸渍10分钟的操作重复三次，洗涤，在40℃下干燥一晚，从而得到细胞培养基材1。对于该细胞培养基材，用后述的试验方法进行细胞培养性、剥离性的评价，将结果示于表1。
(水凝胶分数)
对于将上述培养基材0.1g用200目的不锈钢网包裹并在4℃的水中放置20小时前后的样品，分别测定在130℃的热风干燥机中干燥2小时情况下的重量，调查在冷水中静置前后的重量减少率。该值越高则培养基材的耐水性越高，可以说越不易发生培养基材的由水导致的溶出。
(细胞培养性的评价)
关于培养基，向Eagle’s最小必需培养基(E-MEM、GIBCO公司制)500mL中添加50mL胎牛血清、MEM非必需氨基酸溶液、100X(GIBCO公司制)1mL、L-谷氨酰胺，200mM液(GIBCO公司制)。与该培养基2mL一起按照细胞密度1.0×104cell/cm2的方式播种小鼠Balb3T3细胞(JCRB细胞库)，在显微镜下观察、评价播种3天后的培养性。
○：与无基材、仅TCPS的培养结果为同等培养性。
△：与基材、仅TCPS的培养结果相比，培养性差。
×：细胞完全不生长。
[细胞剥离性的评价]
在上述细胞培养基材1上培养Balb3T3细胞，播种3天后进行细胞剥离试验。将培养中的培养基除去后，加入4℃的冷培养基1mL，在25℃的室温下放置20分钟。将培养基连同剥离下来的细胞一起除去后，用磷酸缓冲生理盐水(PBS(-))洗涤培养基材。对于洗涤后的细胞培养基材，加入HistoChoice MB Tissue Fixative(amresco制)1mL，在室温下对残存细胞进行30分钟的固定化后，除去。然后，加入10％吉姆萨染色液1mL，在室温下染色1小时，除去染色液后，用自来水洗涤，干燥。目视测量发生了吉姆萨染色的细胞。
○：细胞完全剥离。
△：细胞部分剥离。
×：细胞完全没有剥离。
[比较嵌段聚合物1的合成]
对甲基丙烯酸丁酯(和光纯药制)1.92g、作为RAFT剂的2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)丙酸0.06g、2,2’-偶氮二(2-甲基丙酸)二甲酯0.012g、叔丁醇10.8g、水1.2g充分进行氮气鼓泡而除去氧后，在70℃下搅拌7小时，得到第1反应液。该阶段的甲基丙烯酸丁酯的转化率为88％。
接着，对N-异丙基丙烯酰胺(株式会社KJ Chemical制)6.12g、叔丁醇18g、水2.18g的混合物充分进行氮气鼓泡后，添加到上述反应液中，再在70℃下搅拌20小时，得到AB型的温度响应性嵌段聚合物溶液。用NMR测定该嵌段聚合物的转化率，结果甲基丙烯酸丁酯的转化率为100％，NIPAM的转化率为100％。另外，测定该嵌段聚合物的分子量分布的结果是Mn＝34000、Mw＝51000。将该聚合物的水凝胶分数的测定结果示于表1。
[比较例1]
按照与实施例1同样的方法将比较嵌段聚合物1涂布于TCPS，制作比较细胞培养基材1。与实施例1同样地评价其细胞培养性·剥离性，结果如表1所示。
[比较例2]
对于未涂布细胞培养基材的状态的35mm聚苯乙烯培养皿(TCPS、IWAKI制)，与实施例1同样地进行细胞培养性·剥离性的评价，结果如表1所示。
[表1]
产业上的可利用性
本发明的细胞培养基材在于，提供能够高效率地培养动物细胞且能够使培养后的细胞以存活状态剥离而回收的细胞培养基材。

Claims (5)

1.一种细胞培养基材，其特征在于，其含有具有最低临界溶解温度的链段与疏水性链段的嵌段聚合物，该具有最低临界溶解温度的链段的聚合度为400-10000。
2.根据权利要求1所述的细胞培养基材，其中，所述疏水性链段是使下述式(1)所示的单体聚合而得到的，
所述式(1)中，R1为氢原子或甲基，R2表示苯基、烷基碳数为1～8的羧基烷基、芳烷基碳数为7～8的羧基芳烷基、下述式(2)所示的基团、下述式(3)所示的基团中的任意一者，
所述式(2)中，n表示2或3，R3表示碳数1～3的烷基，
所述式(2)中，R4和R5分别独立地表示氢原子或碳数1～6的烷基，R4和R5的合计碳数为5以上。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养基材，其特征在于，其层叠在支撑体上。
4.根据权利要求3所述的细胞培养基材，其平均膜厚为1000nm以下。
5.一种细胞培养容器，其具有支撑体和权利要求1～4中任一项所述的细胞培养基材。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112831005A (zh) * 2019-11-25 2021-05-25 青岛金典生化器材有限公司 细胞培养用的温敏性智能型基材及其制备方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7293683B2 (ja) * 2018-07-13 2023-06-20 東ソー株式会社 ブロック共重合体及び培養基材、幹細胞の製造方法
JP2020014453A (ja) * 2018-07-13 2020-01-30 東ソー株式会社 幹細胞の培養基材及び幹細胞の製造方法

Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101092471A (zh) * 2007-06-15 2007-12-26 北京化工大学 一种超分子结构温度敏感性水凝胶的制备方法
CN101205302A (zh) * 2007-11-09 2008-06-25 中国科学技术大学 一种聚磷酸酯-聚己内酯三嵌段共聚物及其应用
CN101293943A (zh) * 2008-06-23 2008-10-29 天津工业大学 半乳糖基温度敏感型高分子水凝胶及其制备方法
CN101307123A (zh) * 2008-07-02 2008-11-19 天津大学 温度诱导原位凝胶化的三嵌段共聚物及制备方法和应用
EP2292691A1 (en) * 2008-06-12 2011-03-09 Kawamura Institute Of Chemical Research Organic-inorganic complex dispersion, cell culture substratum manufactured by using the dispersion, and manufacturing methods for same
EP2330182A1 (en) * 2008-09-08 2011-06-08 Tokyo University Of Science Educational Foundation Administrative Organization Spheroid composite, spheroid-containing hydrogel and processes for production of same
CN103080295A (zh) * 2010-08-31 2013-05-01 学校法人东京女子医科大学 细胞培养用温度应答性基材及其制造方法
CN103781812A (zh) * 2011-08-15 2014-05-07 一般财团法人川村理化学研究所 嵌段共聚物、以及抗血栓涂层剂
WO2015093393A1 (ja) * 2013-12-20 2015-06-25 Dic株式会社 温度応答性細胞培養基材及びその製造方法
WO2016106033A1 (en) * 2014-12-22 2016-06-30 Corning Incorporated Proteinase-free coatings for colony passaging
CN106317297A (zh) * 2016-09-20 2017-01-11 顺德职业技术学院 应用于3d打印的温敏培养表面复合材料
CN108929412A (zh) * 2018-07-10 2018-12-04 南昌大学 一种温度响应的粘附性可注射水凝胶的制备方法
CN110121552A (zh) * 2016-12-22 2019-08-13 Dic株式会社 细胞培养基材

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06104061B2 (ja) 1989-02-10 1994-12-21 花王株式会社 細胞培養支持体材料
JP5849806B2 (ja) 2012-03-22 2016-02-03 大日本印刷株式会社 細胞培養基材の検査方法及び検査装置、並びに細胞培養基材の製造方法
US9539338B2 (en) * 2013-04-22 2017-01-10 Carnegie Mellon University Polymer-based protein engineering methods to rationally tune enzyme activity, pH-dependence and stability
JP5926764B2 (ja) 2014-04-30 2016-05-25 株式会社セルシード 培養細胞移動治具、及びその利用方法
JP2018139497A (ja) 2015-06-10 2018-09-13 株式会社日立製作所 細胞培養容器及び細胞培養方法

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101092471A (zh) * 2007-06-15 2007-12-26 北京化工大学 一种超分子结构温度敏感性水凝胶的制备方法
CN101205302A (zh) * 2007-11-09 2008-06-25 中国科学技术大学 一种聚磷酸酯-聚己内酯三嵌段共聚物及其应用
EP2292691A1 (en) * 2008-06-12 2011-03-09 Kawamura Institute Of Chemical Research Organic-inorganic complex dispersion, cell culture substratum manufactured by using the dispersion, and manufacturing methods for same
CN102056983A (zh) * 2008-06-12 2011-05-11 Dic株式会社 有机无机复合物分散液及使用该分散液制造的细胞培养基材以及它们的制造方法
CN101293943A (zh) * 2008-06-23 2008-10-29 天津工业大学 半乳糖基温度敏感型高分子水凝胶及其制备方法
CN101307123A (zh) * 2008-07-02 2008-11-19 天津大学 温度诱导原位凝胶化的三嵌段共聚物及制备方法和应用
EP2330182A1 (en) * 2008-09-08 2011-06-08 Tokyo University Of Science Educational Foundation Administrative Organization Spheroid composite, spheroid-containing hydrogel and processes for production of same
CN103080295A (zh) * 2010-08-31 2013-05-01 学校法人东京女子医科大学 细胞培养用温度应答性基材及其制造方法
US20140212973A1 (en) * 2010-08-31 2014-07-31 Tokyo Women's Medical University Temperature-responsive substrate for cell culture and production method thereof
CN103781812A (zh) * 2011-08-15 2014-05-07 一般财团法人川村理化学研究所 嵌段共聚物、以及抗血栓涂层剂
WO2015093393A1 (ja) * 2013-12-20 2015-06-25 Dic株式会社 温度応答性細胞培養基材及びその製造方法
WO2016106033A1 (en) * 2014-12-22 2016-06-30 Corning Incorporated Proteinase-free coatings for colony passaging
CN106317297A (zh) * 2016-09-20 2017-01-11 顺德职业技术学院 应用于3d打印的温敏培养表面复合材料
CN110121552A (zh) * 2016-12-22 2019-08-13 Dic株式会社 细胞培养基材
CN108929412A (zh) * 2018-07-10 2018-12-04 南昌大学 一种温度响应的粘附性可注射水凝胶的制备方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112831005A (zh) * 2019-11-25 2021-05-25 青岛金典生化器材有限公司 细胞培养用的温敏性智能型基材及其制备方法
CN112831005B (zh) * 2019-11-25 2022-08-12 青岛金典生化器材有限公司 细胞培养用的温敏性智能型基材及其制备方法

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