JP6046348B2 - Ｒｓｖｆｖｌｐならびにその製造および使用の方法 - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、感染因子（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｇｅｎｔ）を含まない、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子（ＶＬＰ）を単離する分野に関する。好ましい例において、該分野は、エンベロープウイルスベースのＶＬＰの免疫原性に有害な影響を及ぼさない、感染因子を不活化する方法を包含する。特定の実施形態では、エンベロープウイルスベースのＶＬＰを、昆虫細胞ベースの発現系において作製する。

（発明の背景）
ＲＳウイルス（ＲＳＶ）は、乳児および１歳未満の小児において、細気管支炎および肺炎の主要原因である（ＣＤＣ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２００４年）、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ）。ＲＳＶはまた、免疫不全である成人および高齢者においても、重要な下気道病原体であり得る。ＲＳＶによる天然の感染は、防御的免疫を誘導しないので、個体は、複数回にわたり感染し得る。

ＲＳＶは、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のＰｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属に属する、ネガティブセンスの一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＲＳＶゲノムは、螺旋状のヌクレオカプシドにより取り囲まれ、少なくとも１０のタンパク質：３つの膜貫通構造タンパク質（Ｆ、Ｇ、およびＳＨ）、２つのマトリックスタンパク質（ＭおよびＭ２）、３つのヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ、Ｐ、およびＬ）、および２つの非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）をコードする（Ｃｏｌｌｉｎｓら（１９９６年）、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ、１３１３〜１３５１頁、Ｂ．Ｎ． Ｆｉｅｌｄｓ（編）、Ｆｉｅｌｄｓ ｖｉｒｏｌｏｇｙ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）。中和抗体は、Ｆタンパク質およびＧタンパク質によってのみ誘発されると考えられる。ＲＳＶが、Ｇタンパク質に基づいて、ＡおよびＢの亜群に分けられるのに対し、Ｆは、その亜群間における関連がより密接である。Ｆタンパク質に対するモノクローナル抗体は、インビトロにおいて中和効果、インビボにおいて予防効果を有することが示されている（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９８８年、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６２巻：４２３２〜４２３８頁； Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９８６年、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏ．、２３巻：４７５〜４８０頁； Ｂｅｅｌｅｒ およびＣｏｅｌｉｎｇｈ、１９８９年、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：２９４１〜５０頁； Ｇａｒｃｉａ−Ｂａｒｒｅｎｏら、１９８９年、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：９２５〜３２頁； Ｔａｙｌｏｒら、１９８４年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５２巻：１３７〜１４２頁；ならびに特許文献１）。

数十年間にわたる研究にもかかわらず、ＲＳＶに対する安全で有効なワクチンは存在していない。乳児および小児において試験されたホルマリン不活化ウイルスワクチンは、感染に対して防御せず、野生型のＲＳＶウイルスによるその後の感染において、重篤な症状が生じる危険性の増大と関連していた（Ｋａｐｉｋｉａｎら、１９６９年、Ａｍ． Ｊ． Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．、８９巻：４０５〜２１頁； Ｃｈｉｎら、１９６９年、Ａｍ． Ｊ． Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．、８９巻：４４９〜６３頁）。生の弱毒化温度感受性変異体の開発に焦点を当てたその後の試みもまた、適切な弱毒化レベルのウイルス候補を同定することができず、また、一部の候補が遺伝子的に不安定であるために失敗した（Ｈｏｄｅｓら（１９７４年）、Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ．、１４５巻、１１５８〜１１６４頁； Ｋｉｍら（１９７３年）、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、５２巻、５６〜６３頁； Ｗｒｉｇｈｔら（１９７６年）、Ｊ． Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、８８巻、９３１〜９３６頁）。

米国特許第６８１８２１６号明細書

ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、従来のワクチン技術を上回るいくつかの利点を提供する。ワクチンを開発するのに重要なＶＬＰの利点は、それらが、三次元構造との関連で天然ウイルスを模倣するということであり、また、一次エピトープおよび立体配座エピトープの両方に対する中和抗体応答を誘導する能力であり、したがって、他のワクチン処方物より免疫原性であることが示されるはずである。ウイルスベクター法と異なり、ＶＬＰは、あらかじめ存在する免疫に対して問題を示さず、したがって、繰り返しの使用を可能とする。ＲＳＶ抗原を含有するＶＬＰは、昆虫細胞内において、ＲＳＶ Ｆタンパク質を、ＲＳＶ Ｍタンパク質と、または異種Ｍタンパク質と共発現させることにより作製されてきた（ＵＳ２００８／０２３３１５０）。しかし、ＵＳ２００８／０２３３１５０は、ＲＳＶ Ｆタンパク質が単独で、互いに凝集しないかまたはＲＳＶ Ｆタンパク質を発現させるのに使用されるウイルスベクターと会合しないＶＬＰを生成できる、哺乳動物細胞系内におけるＲＳＶ Ｆタンパク質単独の実際の発現は教示していない。したがって、ＲＳＶ Ｆタンパク質を単独で発現するＶＬＰを生成する方法が必要とされている。

（概要）
本発明の好ましい実施形態は、さらなるエンベロープウイルスコア形成ポリペプチドを必要としないＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰを生成する方法、およびＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰ調製物を含む組成物のための、本明細書で開示される各種の方法および組成物を提供することにより、この必要を満たす。好ましい実施形態では、ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰは、以下のさらなる特徴のうちの１つまたは複数を有する：該ＶＬＰが、エンベロープウイルスコアを含まない；該ＶＬＰが、多形性であるか、またはサイズもしくは形状が不均一である；該ＶＬＰが、エンベロープウイルスコア形成ポリペプチドを含まない。このような好ましい実施形態は、ＲＳウイルスＦポリペプチドが、単独でＶＬＰを形成することが可能であるという、驚くべき観察に基づいている。ＲＳウイルスＦポリペプチド単独により形成されるＶＬＰは、エンベロープウイルス、およびエンベロープウイルス成分を用いて形成されるＶＬＰに典型的なタンパク質コアを有さない。

本発明の態様は、ＲＳウイルスＦポリペプチドを含む、ＲＳウイルスＦポリペプチドのウイルス様粒子調製物を包含し、該ウイルス様粒子は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を有する：該ウイルス様粒子は、エンベロープウイルスコアを含まない；該ウイルス様粒子は、多形性であるか、サイズが不均一であるか、もしくは形状が不均一である；該ウイルス様粒子は、エンベロープウイルスコア形成ポリペプチドを含まない；および／または該ウイルス様粒子は、哺乳動物グリコシル化を含む。特定の実施形態では、ウイルス様粒子は、他のウイルス様粒子と実質的に凝集しない場合がある。前出の実施形態または態様と組み合わせ得る別の実施形態では、ウイルス様粒子は、ウイルスベクター粒子と実質的に会合しない。

前出の実施形態または態様のうちのいずれかと組み合わせ得る別の実施形態では、調製物はまた、ウイルス様粒子と混合したアジュバントも含む。アジュバントを包含する前出の実施形態または態様のうちのいずれかと組み合わせ得る別の実施形態では、アジュバントは、ウイルス様粒子の外側に位置する場合もあり、ウイルス様粒子の内側に位置する場合もある。アジュバントを包含する前出の実施形態または態様のうちのいずれかと組み合わせ得る別の実施形態では、アジュバントをＲＳウイルスＦポリペプチドに共有結合させて、共有結合を形成させ得る。

前出の実施形態または態様のうちのいずれかと組み合わせ得る別の実施形態では、抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体は、ＲＳウイルスＦポリペプチドに結合し得る（これにより、該ＲＳＶ Ｆポリペプチドが、実質的に天然の立体配座にあることが裏付けられる）。このような中和抗体を包含する、前出の実施形態または態様のうちのいずれかと組み合わせ得る特定の実施形態では、抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体は９Ｃ５であり得る。

別の態様は、ＲＳウイルスＦポリペプチドのウイルス様粒子の集団を作製する方法を含み、該方法は、（ａ）ＲＳウイルスＦポリペプチドを発現する発現ベクターを供給するステップと；（ｂ）該発現ベクターを培地中の哺乳動物細胞内へと導入するステップと；（ｃ）該ＲＳウイルスＦポリペプチドを発現させて、該ＲＳウイルスＦポリペプチドのウイルス様粒子を作製するステップとを含み、該ウイルス様粒子は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を有してもよい：該ウイルス様粒子は、エンベロープウイルスコアを含まない；該ウイルス様粒子は、多形性であるか、サイズが不均一であるか、もしくは形状が不均一である；および／または該ウイルス様粒子は、エンベロープウイルスコア形成ポリペプチドを含まない。

前出の態様と組み合わせ得る別の実施形態では、該方法は、哺乳動物細胞が培養されている培地から、ＲＳウイルスＦポリペプチドのウイルス様粒子を取り出すステップをさらに含む。

前出の実施形態および態様と組み合わせ得る別の実施形態では、発現ベクターはウイルスベクターであり得る。前出の実施形態および態様と組み合わせ得る別の実施形態では、ウイルスベクターを、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびレトロウイルスからなる群より選択することができる。前出の実施形態および態様と組み合わせ得る別の実施形態では、哺乳動物細胞を、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ ３８細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＲＤ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨＵＴ細胞、ＳＵＰＴ細胞、Ｃ８１６６細胞、ＭＯＬＴ４／クローン８細胞、ＭＴ−２細胞、ＭＴ−４細胞、Ｈ９細胞、ＰＭ１細胞、ＣＥＭ細胞、骨髄腫細胞、ＳＢ２０細胞、ＬｔＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＷＩ−３８細胞、Ｌ２細胞、ＣＭＴ−９３、およびＣＥＭＸ１７４細胞からなる群より選択することができる。

前出の実施形態および態様と組み合わせ得る別の実施形態では、抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体は、発現されたＲＳウイルスＦポリペプチドに結合し得る（これにより、該ＲＳウイルスＦポリペプチドは、実質的に天然のフォールドであることが裏付けられる）。中和抗体を包含する前出の実施形態および態様と組み合わせ得る別の実施形態では、抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体は９Ｃ５である。

別の態様は、ＲＳウイルスの感染を処置または予防する方法を含み、該方法は、免疫原性量の、本発明のこの態様の前出の実施形態のうちのいずれかによる調製物、または本発明のこの態様の前出の実施形態のうちのいずれかの方法により作製された集団を被験体に投与するステップを含む。前出の態様の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得る別の実施形態では、投与は被験体における防御的免疫化反応を誘導する。前出の態様の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得る別の実施形態では、投与を、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）送達、経皮送達、皮内送達、真皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）送達、筋肉内送達、経口による（ｐｅｒｏｒａｌ）送達、経口（ｏｒａｌ）送達、鼻腔内送達、口腔内送達、舌下送達、腹腔内送達、膣内送達、経肛門送達、および頭蓋内送達からなる群より選択することができる。

別の態様は、免疫原性量の、本発明のこの態様の前出の実施形態のうちのいずれかによる調製物、または本発明のこの態様の前出の実施形態のうちのいずれかの方法により作製された集団を含む医薬組成物を包含する。前出の態様の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得る別の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容されるキャリアをさらに含む。

別の態様は、ＲＳウイルスの感染に対する防御を提供する方法を含み、該方法は、免疫原性量の、本発明のこの態様の前出の実施形態のうちのいずれかによる調製物、または本発明のこの態様の前出の実施形態のうちのいずれかの方法により作製された集団を被験体に投与するステップを含む。前出の態様の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得る別の実施形態では、投与を、皮下送達、経皮送達、皮内送達、真皮下送達、筋肉内送達、経口による送達、経口送達、鼻腔内送達、口腔内送達、舌下送達、腹腔内送達、膣内送達、経肛門送達、および頭蓋内送達からなる群より選択することができる。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ＲＳウイルスＦポリペプチドを含むＲＳウイルスＦポリペプチドのウイルス様粒子調製物であって、前記ウイルス様粒子はエンベロープウイルスコアを含まない、調製物。
（項目２）
ＲＳウイルスＦポリペプチドを含むＲＳウイルスＦポリペプチドのウイルス様粒子調製物であって、前記ウイルス様粒子は、多形性であるか、サイズが不均一であるか、または形状が不均一である、調製物。
（項目３）
ＲＳウイルスＦポリペプチドを含むＲＳウイルスＦポリペプチドのウイルス様粒子調製物であって、前記ウイルス様粒子はエンベロープウイルスコア形成ポリペプチドを含まない、調製物。
（項目４）
前記ウイルス様粒子が哺乳動物グリコシル化を含む、項目１から３のいずれかに記載の調製物。
（項目５）
前記ウイルス様粒子が他のウイルス様粒子と実質的に凝集しない、項目１から４のいずれかに記載の調製物。
（項目６）
前記ウイルス様粒子がウイルスベクター粒子と実質的に会合しない、項目１から５のいずれかに記載の調製物。
（項目７）
前記ウイルス様粒子と混合したアジュバントをさらに含む、項目１から６のいずれかに記載の調製物。
（項目８）
前記アジュバントが前記ウイルス様粒子の外側に位置する、項目７に記載の調製物。
（項目９）
前記アジュバントが前記ウイルス様粒子の内側に位置する、項目７に記載の調製物。
（項目１０）
前記アジュバントを前記ＲＳウイルスＦポリペプチドに共有結合させて、共有結合を形成させる、項目７から９のいずれかに記載の調製物。
（項目１１）
抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体が前記ＲＳウイルスＦポリペプチドに結合する、項目１から１０のいずれかに記載の調製物。
（項目１２）
前記抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体が９Ｃ５である、項目１１に記載の調製物。
（項目１３）
ＲＳウイルスＦポリペプチドのウイルス様粒子の集団を作製する方法であって、
（ａ）ＲＳウイルスＦポリペプチドを発現する発現ベクターを供給するステップと、
（ｂ）前記発現ベクターを培地中の哺乳動物細胞内へと導入するステップと、
（ｃ）前記ＲＳウイルスＦポリペプチドを発現させて、前記ＲＳウイルスＦポリペプチドのウイルス様粒子を作製するステップと
を含み、前記ウイルス様粒子はエンベロープウイルスコアを含まない、方法。
（項目１４）
ＲＳウイルスＦポリペプチドのウイルス様粒子の集団を作製する方法であって、
（ａ）ＲＳウイルスＦポリペプチドを発現する発現ベクターを供給するステップと、
（ｂ）前記発現ベクターを培地中の哺乳動物細胞内へと導入するステップと、
（ｃ）前記ＲＳウイルスＦポリペプチドを発現させて、前記ＲＳウイルスＦポリペプチドのウイルス様粒子を作製するステップと
を含み、前記ウイルス様粒子は、多形性であるか、サイズが不均一であるか、または形状
が不均一である、方法。
（項目１５）
ＲＳウイルスＦポリペプチドのウイルス様粒子の集団を作製する方法であって、
（ａ）ＲＳウイルスＦポリペプチドを発現する発現ベクターを供給するステップと、
（ｂ）前記発現ベクターを培地中の哺乳動物細胞内へと導入するステップと、
（ｃ）前記ＲＳウイルスＦポリペプチドを発現させて、前記ＲＳウイルスＦポリペプチドのウイルス様粒子を作製するステップと
を含み、前記ウイルス様粒子はエンベロープウイルスコア形成ポリペプチドを含まない、方法。
（項目１６）
前記哺乳動物細胞が培養されている前記培地から、前記ＲＳウイルスＦポリペプチドのウイルス様粒子を取り出すステップをさらに含む、項目１３から１５のいずれかに記載の方法。
（項目１７）
前記発現ベクターがウイルスベクターである、項目１３から１６のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびレトロウイルスからなる群より選択される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記哺乳動物細胞が、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ ３８細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＲＤ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨＵＴ細胞、ＳＵＰＴ細胞、Ｃ８１６６細胞、ＭＯＬＴ４／クローン８細胞、ＭＴ−２細胞、ＭＴ−４細胞、Ｈ９細胞、ＰＭ１細胞、ＣＥＭ細胞、黒色腫細胞、ＳＢ２０細胞、ＬｔＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＷＩ−３８細胞、Ｌ２細胞、ＣＭＴ−９３、およびＣＥＭＸ１７４細胞からなる群より選択される、項目１３から１８のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体が、前記発現されたＲＳウイルスＦポリペプチドに結合する、項目１３から１９のいずれかに記載の方法。
（項目２１）
前記抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体が９Ｃ５である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
ＲＳウイルスの感染を処置または予防する方法であって、免疫原性量の、項目１から１２のいずれかに記載の調製物、または項目１３から２１のいずれかに記載の方法により作製された集団を被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目２３）
前記投与するステップが前記被験体における防御的免疫化反応を誘導する、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記投与するステップが、皮下送達、経皮送達、皮内送達、真皮下送達、筋肉内送達、経口による送達、経口送達、鼻腔内送達、口腔内送達、舌下送達、腹腔内送達、膣内送達、経肛門送達、および頭蓋内送達からなる群より選択される、項目２２から２３のいずれかに記載の方法。
（項目２５）
免疫原性量の、項目１から１２のいずれかに記載の調製物、または項目１３から２１のいずれかに記載の方法により作製された集団を含む、医薬組成物。
（項目２６）
薬学的に許容されるキャリアをさらに含む、項目２５に記載の医薬組成物。
（項目２７）
ＲＳウイルスの感染に対する防御を提供する方法であって、免疫原性量の、項目１から１２のいずれかに記載の調製物、または項目１３から２１のいずれかに記載の方法により作製された集団を被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目２８）
前記投与するステップが、皮下送達、経皮送達、皮内送達、真皮下送達、筋肉内送達、経口による送達、経口送達、鼻腔内送達、口腔内送達、舌下送達、腹腔内送達、膣内送達、経肛門送達、および頭蓋内送達からなる群より選択される、項目２７に記載の方法。

前出の態様およびそれらの実施形態は、本明細書で開示される実施形態のうちのいずれかとさらに組み合わせることができる。前出の実施形態、および／または本明細書で開示されるさらなる実施形態のうちのいずれかと共に包含され得る、本発明のさらなる態様は、本明細書の全体において見出すことができる。

図１は、ｐ３．１−ＲＳＶＦＴのプラスミド地図を示す図である。 図２は、ｐ３．１−ｓｈＦｖ１のプラスミド地図を示す図である。 図３は、ｐ３．１−ｓｈＦｖ２のプラスミド地図を示す図である。 図４は、ｐ３．１−Ｇａｇのプラスミド地図を示す図である。 図５は、ＲＳＶ ＦおよびＧａｇ発現ベクターをトランスフェクトされた細胞上のＲＳＶ Ｆの表面発現のサイトメトリー分析を示すグラフである。トランスフェクトされていない細胞およびｐ３．１−Ｇａｇだけをトランスフェクトされた細胞は、バックグラウンド蛍光レベルを示す。ｐ３．１−Ｇａｇと共におよび共にではなくＲＳＶ Ｆ発現ベクターをトランスフェクトされた細胞は、９Ｃ５モノクローナル抗体および蛍光２次抗体によるＦ検出の結果として顕著なレベルの蛍光を示す。 図１４は、Ｇａｇ遺伝子を共トランスフェクトされておよびされずにＲＳＶ Ｆ遺伝子をトランスフェクトされた細胞の培地由来の１００，０００×ｇペレットにおけるＲＳＶ Ｆ抗原活性の検出を示すグラフである。 図７は、ｐ３．１−ＲＳＶＦＴをトランスフェクトされた２３９−Ｆ細胞の培地から収集したＶＬＰの電子顕微鏡像の代表的切片を示す図である。 図８は、ｐＦＢ−ｓｈＦｖ１のプラスミド地図を示す図である。 図９は、昆虫細胞中で発現されたｓｈＦｖ１ ＶＬＰのショ糖密度勾配を示すグラフである。 図１０は、図９に示すｓｈＦｖ１ショ糖勾配の画分９における凝集したＲＳＶ Ｆ ＶＬＰおよびバキュロウイルス粒子の代表的電子顕微鏡像を示す図である。 図１１は、ヒトカルボキシペプチダーゼＭ由来のＧＰＩアンカーシグナルに融合したキメラＦポリペプチド外部ドメインをコードするｐ３．１−Ｆ−ＧＰＩのプラスミド地図を示す図である。 図１２は、ｐ３．１−Ｇａｇを共トランスフェクトされておよびされずにｐ３．１−Ｆ−ＧＰＩをトランスフェクトされた細胞での改変Ｆ−ＧＰＩタンパク質の表面発現のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。ｐ３．１−Ｇａｇだけをトランスフェクトされた細胞は、バックグラウンド蛍光レベルを示した。ｐ３．１−Ｇａｇと共におよび共にではなくｐ３．１−Ｆ−ＧＰＩをトランスフェクトされた細胞は、９Ｃ５モノクローナル抗体および蛍光２次抗体によるＦ検出の結果として顕著なレベルの蛍光を示した。 図１３は、ｐ３．１−Ｇａｇ、ｐ３．１−Ｆ−ＧＰＩおよびｐ３．１−Ｇａｇ＋ｐ３．１−Ｆ−ＧＰＩをトランスフェクトされた細胞の培地由来の１００，０００×ｇペレットのウエスタンブロット分析を示す図である。レーンは左から右へ：Ｇ、ｐ３．１−Ｇａｇトランスフェクション由来の試料；Ｆ、ｐ３．１−Ｆ−ＧＰＩトランスフェクション由来の試料；Ｆ＋Ｇ、ｐ３．１−Ｇａｇ＋ｐ３．１−Ｆ−ＧＰＩトランスフェクション由来の試料である。データは、Ｆ発現はＧａｇ出芽に干渉するが、Ｇａｇ発現はＦ出芽に干渉しないことを示す。 図１４は、Ｇａｇ遺伝子ベクターを共トランスフェクトされておよびされずにＲＳＶ Ｆ−ＧＰＩベクターをトランスフェクトされた細胞の培地由来の１００，０００×ｇペレットにおけるＲＳＶ Ｆ抗原活性の検出を示すグラフである。生のＲＳＶビリオン粒子を含有しているＲＳＶ感染細胞由来の培地の１００，０００×ｇペレットを、Ｆ−ＧＰＩ粒子がＦ抗原に関して生のＲＳＶに抗原的に類似していることを実証する陽性対照として含めた。

（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明の好ましい実施形態には、好ましくは、哺乳動物細胞による発現系で作製された、ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰ調製物と；このようなＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰ調製物を発現させるかまたは作製する方法と；このような調製物をワクチン組成物へとさらに加工する方法と；このようなワクチン組成物を用いる方法とが含まれるがこれらに限定されない。

本発明の特定の態様および実施形態は、適切な宿主細胞内で発現させると、ｇａｇポリペプチドまたはマトリックスポリペプチドなど、任意のコアタンパク質またはコア形成タンパク質の不在下で、ＲＳウイルスＦポリペプチドは、単独でＶＬＰを生成するのに十分であるという驚くべき発見に基づいている。このようなＶＬＰは、内部におけるタンパク質コアまたはカプシドなしに、脂質またはエンベロープを有する。したがって、このようなＶＬＰは、以下の物理的な特徴のうち１つまたは複数を有する：脂質膜またはエンベロープ内にエンベロープウイルスコア、カプシド、またはヌクレオカプシドを有さない；多形性であるか、またはサイズおよび／もしくは形状が不均一である；該ＶＬＰは、互いと凝集しない；該ＶＬＰは、それを作製するのに用いられるウイルスベクターと会合しないか、またはそうでなければ凝集しない；ならびに哺乳動物グリコシル化、および／または哺乳動物膜と結合もしくは会合するタンパク質。

ＲＳウイルスＦポリペプチドを作製するのに好ましい方法は、好ましくは、さらなるポリペプチド抗原の共発現を含めた、哺乳動物細胞内における発現を介する。

開示される方法およびプロトコールを実施するには、別段に示さない限り、当業者の能力の範囲内にある、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技法を用いる。このような技法は、文献において説明されている。例えば、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＴ． Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ社； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ．ら（１９９５年、および定期的な補遺；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、９、１３、および１６章、ニューヨーク州、ニューヨーク、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社）； Ｂ． Ｒｏｅ、Ｊ． Ｃｒａｂｔｒｅｅ、およびＡ． Ｋａｈｎ、１９９６年、「ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ： Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社； Ｊ． Ｍ． ＰｏｌａｋおよびＪａｍｅｓ Ｏ’Ｄ． ＭｃＧｅｅ、１９９０年、「Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ社； Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ（編）、１９８４年、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ社；ならびにＤ． Ｍ． Ｊ． ＬｉｌｌｅｙおよびＪ． Ｅ． Ｄａｈｌｂｅｒｇ、１９９２年、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ： ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ： Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社を参照されたい。

（定義）
本明細書で用いられる「ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰ」とは、ウイルスカプシド、ヌクレオカプシド、またはコアを形成することが可能な任意のポリペプチドの不在下において発現させることが好ましい、ＲＳウイルスＦポリペプチドを用いて形成されるウイルス様粒子を指す。好ましい例には、ＲＳウイルスＦポリペプチドの細胞質部分を実質的に欠く、ＲＳウイルスＦポリペプチドを用いて生成されるＶＬＰ、またはインフルエンザＭ１ポリペプチドおよび／もしくは赤血球凝集素ポリペプチド（また、場合によってノイラミニダーゼポリペプチド）を用いて生成されるＲＳウイルスＦポリペプチドおよびＶＬＰが含まれるが、これらに限定されない。

「哺乳動物グリコシル化」とは、哺乳動物細胞の発現系により生成されるグリコシル化パターンを指す。このようなグリコシル化パターンは、哺乳動物のグリコシル化酵素を包含するように改変された昆虫細胞が、哺乳動物または哺乳動物細胞ベースの発現系により天然にもたらされるグリコシル化パターンではなく「哺乳動物様の」グリコシル化のみをもたらす場合に限り、このような改変昆虫細胞によりもたらされるグリコシル化パターンを包含しない。哺乳動物グリコシル化パターンの好ましい例には、ヒト（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、イヌ（例えば、ＭＤＣＫ）細胞、マウス（例えば、Ｈ９）細胞、ラット（例えば、ＩＥ）細胞、およびヒト以外の霊長動物（例えば、ＮＣＴＣ）細胞内における発現によりもたらされるグリコシル化が含まれる。

本明細書で用いられる「エンベロープウイルスコア形成ポリペプチド」には、エンベロープウイルスのエンベロープ内において、ウイルスカプシド、ヌクレオカプシド、またはコアを形成することが可能な、任意のウイルスポリペプチド、または任意のウイルスポリペプチドの組合せが含まれる。エンベロープウイルスコア形成ポリペプチドは、ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰの形成を干渉し得るので、本明細書で記載されるＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰの好ましい実施形態は、このようなポリペプチドを除外する。ウイルスカプシド、ヌクレオカプシド、もしくはコアを形成することが不可能な、エンベロープウイルスコア形成ポリペプチドに由来するポリペプチド、またはウイルスカプシド、ヌクレオカプシド、もしくはコアを形成することが不可能な、エンベロープウイルスコア形成ポリペプチドのサブセットは、本明細書で開示されるＶＬＰの形成を干渉しないので、このようなポリペプチドは、本明細書で開示されるＶＬＰに含まれ得る。

本明細書で記載されるウイルス様粒子を形成する一因となる、レトロウイルス由来の構造ポリペプチドであるｇａｇポリペプチドは、エンベロープウイルスコア形成ポリペプチドの例である。レトロウイルスのゲノムは、３つの主要な遺伝子産物をコードする：構造タンパク質をコードするｇａｇ遺伝子の産物；逆転写酵素および関連のタンパク質分解性ポリペプチド、ヌクレアーゼおよびインテグラーゼに関連する機能をコードするｐｏｌ遺伝子の産物；ｅｎｖの産物（それによりコードされる糖タンパク質の膜タンパク質が、感染細胞の表面上において、また、放出された成熟ウイルス粒子の表面上においても検出される）。すべてのレトロウイルスのｇａｇ遺伝子は、全体的な構造類似性を有し、レトロウイルスの各群内においても、アミノ酸レベルで保存されている。ｇａｇ遺伝子は、逆転写酵素を除くコアタンパク質をもたらす。

ＭＬＶの場合、Ｇａｇの前駆体であるポリタンパク質は、Ｐｒ６５^Ｇａｇであり、該前駆体上におけるその順序がＮＨ_２−ｐ１５−ｐｐ１２−ｐ３０−ｐ１０−ＣＯＯＨである４つのタンパク質へと切断される。これらの切断は、ウイルス性プロテアーゼを介し、また、ウイルスに応じて、ウイルス放出の前または後において生じ得る。ＭＬＶ Ｇａｇタンパク質は、グリコシル化形態および非グリコシル化形態で存在する。グリコシル化形態はｇＰｒ８０^Ｇａｇから切り出され、ｇＰｒ８０^Ｇａｇは、非グリコシル化Ｐｒ６５^Ｇａｇに対応するＡＵＧコドンの上流に位置する、インフレームの、異なる開始コドンから合成される。グリコシル化Ｇａｇを合成しない、ＭＬＶの欠失変異体がなおも感染性であり、また、非グリコシル化Ｇａｇがなおもウイルス様粒子を形成し得ることから、グリコシル化イベントの重要性について、疑問が投げかけられる。ウイルスがコードするプロテアーゼにより、ＨＩＶ−１ Ｇａｇの前駆体であるｐｒ５５^Ｇａｇが翻訳後に切断されることから、Ｎ−ミリストイル化されて内部でリン酸化されたｐ１７マトリックスタンパク質（ｐ１７ＭＡ）、リン酸化されたｐ２４カプシドタンパク質（ｐ２４ＣＡ）、ならびにヌクレオカプシドタンパク質であるｐ１５（ｐ１５ＮＣ）がもたらされ、ｐ１５は、さらにｐ９およびｐ６へと切断される。

構造面において、原型的なＧａｇポリタンパク質は、レトロウイルスのｇａｇ遺伝子において常に同じ順序で生じる３つの主要なタンパク質：マトリックスタンパク質（ＭＡ）（マトリックスという名称を共有するが、ＭＡとは異なるタンパク質である、インフルエンザマトリックスタンパク質Ｍ１と混同しないようにされたい）、カプシドタンパク質（ＣＡ）、およびヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）に分けられる。成熟タンパク質へのＧａｇポリタンパク質のプロセシングは、レトロウイルスがコードするプロテアーゼにより触媒され、新たに出芽するウイルス粒子が成熟するときに生じる。機能面において、Ｇａｇポリタンパク質は、３つのドメイン：細胞膜をＧａｇポリタンパク質の標的とする膜結合ドメインと；Ｇａｇの重合化を促進する相互作用ドメインと；宿主細胞からの新生ビリオンの放出を促進する後期ドメインとに分けられる。アセンブリーを媒介するＧａｇタンパク質の形態は、ポリタンパク質である。したがって、アセンブリードメインは、後期に形成される任意の切断産物内にもれなく収まる必要はない。これらの重要な機能的エレメントに関する最新技術の進歩は大きい。例えば、

を参照されたい。

エンベロープウイルスコア形成ポリペプチドの範囲内に包含されるｇａｇポリペプチドは、最小限において、ウイルス様粒子を形成するための機能的エレメントを、ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰとは独立して包含することになる。ＲＳウイルスＦポリペプチドと競合するか、またはこれに干渉する機能的エレメントを除外すれば、このようなｇａｇポリペプチドは、エンベロープウイルスコア形成ポリペプチドではない。

Ｇａｇポリペプチドについてのレトロウイルスの供給源の例には、マウス白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アルファレトロウイルス（トリ白血病ウイルス、またはラウス肉腫ウイルスなど）、ベータレトロウイルス（マウス乳癌ウイルス、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス、およびメーソン−ファイザーサルウイルスなど）、ガンマレトロウイルス（マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、細網内皮症ウイルス、およびテナガザル白血病ウイルスなど）、デルタレトロウイルス（ヒトＴリンパ向性ウイルス、およびウシ白血病ウイルスなど）、イプシロンレトロウイルス（ウォールアイ皮膚肉腫ウイルスなど）、またはレンチウイルス（１型ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、およびヤギ関節炎脳炎ウイルス）が含まれる。

本明細書で用いられる「エンベロープウイルスコア」には、エンベロープウイルスまたはエンベロープウイルスの成分により生成されるウイルス様粒子の脂質膜またはエンベロープの内側で見出される任意のタンパク質性コアが含まれる。タンパク質性コアは、カプシドもしくはヌクレオカプシド、またはマトリックスの全部または一部を含み得る。

本明細書で用いられる「脂質ラフト」とは、ウイルス粒子のアセンブリー過程においてｇａｇポリペプチドが濃縮される、細胞膜のマイクロドメインを指す。

本明細書で用いられる「脂質ラフト会合ポリペプチド」とは、脂質ラフトと直接的または間接的に会合する任意のポリペプチドを指すが、任意のエンベロープウイルスコア形成ポリペプチドは除外する。本発明で用いられる具体的な脂質ラフト会合ポリペプチドは、ＶＬＰの所望の使用、および該脂質ラフト会合ポリペプチドの役割（例えば、ＲＳウイルスＦタンパク質の細胞外部分を該ＶＬＰへと結合させること、または１つもしくは複数のさらなる抗原もしくはアジュバントを該ＶＬＰへと結合させること）に依存する。

脂質ラフト会合ポリペプチドは、内在性膜タンパク質もしくは脂質ラフト会合部分；脂質による修飾など、膜との会合を引き起こすタンパク質の修飾により脂質ラフトと直接的に会合するタンパク質もしくはその部分；または脂質ラフト会合ポリペプチドにより脂質ラフトと間接的に会合するポリペプチドであり得る。

脂質アンカーを有する多くのタンパク質が、脂質ラフトと会合する。このようなタンパク質の短い断片は、脂質結合に十分であることが多い。このような断片は、天然においてそれ自体では脂質ラフトと会合しないであろう他のタンパク質およびポリペプチドに容易に結合し得るので、該断片は、脂質ラフト会合に理想的となっている。ポリペプチドを脂質ラフトへと連結する脂質アンカーには、ＧＰＩアンカー、ミリストイル化、パルミトイル化、および二重アセチル化が含まれる。

多くの異なる種類のポリペプチドが、脂質ラフトと会合する。脂質ラフトは、シグナル伝達、膜輸送、ウイルスの侵入、ウイルスのアセンブリー、また、アセンブルした粒子の出芽を含めた、多くの生物学的活性のためのプラットフォームとして機能し、したがって、これらの過程に関与する各種のポリペプチドと会合する。

シグナル伝達カスケードに関与する各種のポリペプチドは、シグナル伝達プラットフォームとして機能する脂質ラフトと会合する。シグナル伝達プラットフォームとして機能する脂質ラフトの１つの種類は、カベオラと呼ばれている。それは、カベオリンファミリーに由来するポリペプチド（例えば、カベオリンおよび／またはフロチリン（ｆｌｏｔｔｉｌｌｉｎ））を含有する、細胞膜のフラスコ型の陥入部である。

膜輸送ポリペプチドは、膜輸送プラットフォームとして機能する脂質ラフトと会合する。例には、シンタクシン−１タンパク質、シンタクシン−４タンパク質、シナプシンＩタンパク質、アデューシンタンパク質、ＶＡＭＰ２タンパク質、ＶＡＭＰ／シナプトブレビンタンパク質、シナプトブレビンＩＩタンパク質、ＳＮＡＲＥタンパク質、ＳＮＡＰ−２５タンパク質、ＳＮＡＰ−２３タンパク質、シナプトタグミンＩタンパク質、およびシナプトタグミンＩＩタンパク質など、エンドサイトーシスおよびエクソサイトーシスに関与するタンパク質が含まれる。

ウイルス受容体、ウイルス受容体−共受容体複合体、ウイルス侵入過程の調節を補助する他の任意の成分は、ウイルス侵入に特化した膜輸送プラットフォームとして機能する脂質ラフトと会合する。脂質ラフトと会合するウイルス受容体の例には、崩壊促進因子（ＤＡＦまたはＣＤ５５）、多くのエンテロウイルスの受容体であるＧＰＩアンカー膜糖タンパク質；ガングリオシド、Ｈｓｃ７０タンパク質、アルファ２−ベータ１インテグリンおよびアルファ５−ベータ２インテグリンを含めた複数の成分を含有する複合体である、Ａ群ロタウイルスの受容体；ＨＩＶウイルス、ＭＬＶウイルス、麻疹ウイルス、およびＥｂｏｌａウイルスなど、複数のエンベロープウイルスの糖タンパク質；ならびにＣＤ５ポリペプチド、ＣＣＲ５ポリペプチド、およびｎｅｆポリペプチドなど、ＨＩＶの侵入に関与するポリペプチドが含まれる。ＣｈａｚａｌおよびＧｅｒｌｉｅｒ、２００３年、「Ｖｉｒｕｓ Ｅｎｔｒｙ， Ａｓｓｅｍｂｌｙ， Ｂｕｄｄｉｎｇ， ａｎｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｒａｆｔｓ」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ａｎｄ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． Ｒｅｖ．、６７巻（２号）：２２６〜２３７頁を参照されたい。

ウイルス粒子のアセンブリーに関与するポリペプチドは、ウイルスアセンブリープラットフォームとして機能する脂質ラフトと会合する。ウイルスのヌクレオカプシド、カプシド、またはコアを形成する一因となる部分を除外する限りにおいて、このようなポリペプチドまたはそれらの一部を、脂質ラフト会合ポリペプチドとして用いることができる。このようなポリペプチドの例には、ＨＡインフルエンザエンベロープ糖タンパク質およびＮＡインフルエンザエンベロープ糖タンパク質、麻疹ウイルスに由来するＨタンパク質および成熟Ｆ１−Ｆ２融合タンパク質、ならびにＨＩＶウイルスに由来するｇｐ１６０、ｇｐ４１、およびＰｒ５５ｇａｇが含まれる。ＣｈａｚａｌおよびＧｅｒｌｉｅｒ、２００３年、「Ｖｉｒｕｓ Ｅｎｔｒｙ， Ａｓｓｅｍｂｌｙ， Ｂｕｄｄｉｎｇ， ａｎｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｒａｆｔｓ」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ＆ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． Ｒｅｖ．、６７巻（２号）：２２６〜２３７頁を参照されたい。

アセンブルしたウイルスの出芽に関与するポリペプチドは、ウイルス出芽プラットフォームとして機能する脂質ラフトと会合する。宿主細胞からのＨＩＶ−１の出芽は、膜ラフト内で生じることを示唆するデータが存在する。ＣｈａｚａｌおよびＧｅｒｌｉｅｒ、２００３年、「Ｖｉｒｕｓ Ｅｎｔｒｙ， Ａｓｓｅｍｂｌｙ， Ｂｕｄｄｉｎｇ， ａｎｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｒａｆｔｓ」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ａｎｄ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． Ｒｅｖ．、６７巻（２号）：２２６〜２３７頁を参照されたい。ウイルスの出芽に関与するポリペプチドについての一般的な情報は、「Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」（第４版）、２００１年において見出すことができる。

好ましい脂質ラフト会合ポリペプチドには、赤血球凝集素ポリペプチド、ノイラミニダーゼポリペプチド、融合タンパク質ポリペプチド、糖タンパク質ポリペプチド、およびエンベロープタンパク質ポリペプチドなどのウイルスポリペプチドが含まれる。これらのポリペプチドの各々は、任意の種類のウイルスに由来し得るが、特定の実施形態は、ＨＩＶ−１ウイルスに由来するエンベロープタンパク質、ＲＳウイルスまたは麻疹ウイルスに由来する融合タンパク質、ＲＳウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはエボラウイルスに由来する糖タンパク質、また、麻疹ウイルスに由来する赤血球凝集素タンパク質を包含する。

好ましい非ウイルス性病原体の脂質ラフト会合ポリペプチドは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘなどのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ属； Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ； Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ； Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ； Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ； Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ； Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍなどが含まれるがこれらに限定されない病原性の原虫、蠕虫、また、他の真核微生物の病原体から得ることができる。このような非ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチドは、それ自体が抗原として作用するので、天然では脂質ラフトと会合しない抗原に連結することなく用いることができる。

ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチドの好ましい例は、赤血球凝集素ポリペプチドである。本明細書で用いられる「赤血球凝集素ポリペプチド」は、感染される細胞に対するウイルスの結合を媒介するインフルエンザウイルスタンパク質に由来する。赤血球凝集素ポリペプチドはまた、同等の麻疹ウイルスタンパク質にも由来し得る。このタンパク質は、単一の膜貫通ドメインにより、インフルエンザウイルスの表面へとアンカリングすることが見出される抗原性の糖タンパク質である。インフルエンザ赤血球凝集素のうち、Ｈ１〜Ｈ１６と名付けられた、少なくとも１６のサブタイプが同定されている。Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３は、ヒトインフルエンザウイルスにおいて見出される。Ｈ５またはＨ７の赤血球凝集素を有する、高病原性鳥類インフルエンザウイルスがヒトに感染する割合は低いことが判明している。鳥類ウイルス株のＨ５型赤血球凝集素内における単一のアミノ酸変化がヒト患者において見出されており、これが受容体の特異性を変化させることを可能にし、Ｈ５赤血球凝集素が鳥類Ｈ５Ｎ１ウイルスの受容体特異性を顕著に変化させることによって、これらのウイルスに、ヒト受容体に結合する能力がもたらされると報告されている（１０９および１１０）。この知見は、通常ヒトに感染しないＨ５Ｎ１ウイルスが変異し、ヒト細胞に効率的に感染できるようになることを説明する。

赤血球凝集素は、ホモ三量体の内在性膜ポリペプチドである。天然では、その膜貫通ドメインが、脂質ラフトドメインと会合し、これにより、ＲＳウイルスＦポリペプチドと会合することが可能となり、ＶＬＰ内へと組み込まれる。それは、円筒様の形状をしており、約１３５Åの長さである。ＨＡを構成する３つの同一の単量体は、中央のコイルドコイルと、ＶＬＰの表面上に露出されるシアル酸結合部位を含有する球形の頭状部分とを形成する。ＨＡの単量体は、グリコシル化され、２つのより小型のポリペプチド：ＨＡ１サブユニットおよびＨＡ２サブユニットへと切断される、単一のポリペプチド前駆体として合成される。ＨＡ２サブユニットは、膜へとアンカリングされる、三量体のコイルドコイルを形成し、ＨＡ１サブユニットは、球形の頭状部分を形成する。

本発明の特定のＶＬＰにおいて脂質ラフト会合ポリペプチドとして用いられる赤血球凝集素ポリペプチドは、最小限において、膜アンカードメインを包含するものとする。赤血球凝集素ポリペプチドは、任意のインフルエンザウイルス型、インフルエンザウイルス亜型、インフルエンザウイルス株、またはインフルエンザウイルス亜株に由来することが可能であり、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、およびＨ９赤血球凝集素に由来することが好ましい。加えて、赤血球凝集素ポリペプチドは、異なるインフルエンザ赤血球凝集素のキメラでもあり得る。赤血球凝集素ポリペプチドは、１または複数のさらなるポリペプチドのコード配列を、赤血球凝集素ポリペプチドのコード配列にスプライシングすることにより作製し得る、天然では脂質ラフトと会合しない、１または複数のさらなる抗原を包含することが好ましい。赤血球凝集素ポリペプチド内へのさらなるポリペプチドの挿入に好ましい部位は、Ｎ末端である。

ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチドの好ましい別の例は、ノイラミニダーゼポリペプチドである。本明細書で用いられる「ノイラミニダーゼポリペプチド」は、糖タンパク質から末端のシアル酸残基を切断することにより、細胞からのインフルエンザウイルスの放出を媒介する、インフルエンザウイルスタンパク質に由来する。ノイラミニダーゼ糖タンパク質は、ウイルス表面上において発現する。ノイラミニダーゼタンパク質は四量体であり、ベータ−ピンホイール構造を有する球形の頭状部分、細いストーク状領域、また、単一の膜貫通ドメインによりウイルス膜内に該タンパク質をアンカリングする小さな疎水性領域からなる共通構造を共有する。シアル酸残基を切断するための活性部位は、すべてのインフルエンザＡウイルス内に保存されている、１５の荷電アミノ酸により形成される、各サブユニット表面上のポケットを包含する。インフルエンザノイラミニダーゼのうち、Ｎ１〜Ｎ９と名付けられた、少なくとも９つのサブタイプが同定されている。

本発明の特定のＶＬＰにおいて用いられるノイラミニダーゼポリペプチドは、最小限において、膜アンカードメインを包含するものとする。機能的領域に関する最新技術は極めて高度である。例えば、Ｖａｒｇｈｅｓｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３０３巻、３５〜４０頁、１９８３年； Ｃｏｌｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３０３巻、４１〜４４頁、１９８３年； Ｌｅｎｔｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２６巻、５３２１〜５３８５頁、１９８７年； Ｗｅｂｓｔｅｒら、Ｖｉｒｏｌ．、１３５巻、３０〜４２頁、１９８４年を参照されたい。ノイラミニダーゼポリペプチドは、任意のインフルエンザウイルス型、インフルエンザウイルス亜型、インフルエンザウイルス株、またはインフルエンザウイルス亜株に由来することが可能であり、Ｎ１ノイラミニダーゼおよびＮ２ノイラミニダーゼに由来することが好ましい。加えて、ノイラミニダーゼポリペプチドは、異なるインフルエンザノイラミニダーゼのキメラでもあり得る。ノイラミニダーゼポリペプチドは、１または複数のさらなるポリペプチドのコード配列を赤血球凝集素ポリペプチドにスプライシングすることにより作製し得る、天然では脂質ラフトと会合しない１または複数のさらなる抗原を包含することが好ましい。ノイラミニダーゼポリペプチドコード配列内へのさらなるポリペプチドの挿入に好ましい部位は、Ｃ末端である。

脂質ラフト会合ポリペプチドの好ましい別の例は、ファシクリンＩ（ＦａｓＩ）と称する、昆虫由来の接着タンパク質である。本明細書で用いられる「ファシクリンＩポリペプチド」は、胚の発生に関与する昆虫タンパク質に由来する。この非ウイルス性タンパク質は、昆虫細胞内のバキュロウイルス発現系において発現させることができ、これにより、ＦａｓＩの脂質ラフト会合がもたらされる（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７７巻、６２６５〜６２７３頁、２００３年）。したがって、ファシクリンＩポリペプチドに異種抗原を結合させて、ＲＳウイルスＦポリペプチドと共に共発現させると、ＶＬＰ内にキメラ分子が組み込まれる。本発明のＶＬＰにおいて用いられるファシクリンＩポリペプチドは、最小限において、膜アンカードメインを包含するものとする。

脂質ラフト会合ポリペプチドの好ましい別の例は、Ｇ糖タンパク質と称する、ＲＳＶに由来するウイルス性付着タンパク質である。本明細書で用いられる「Ｇグリコポリペプチド」は、ＲＳＶ Ｇ糖タンパク質に由来する。近年のデータは、脂質ラフトドメインが、インフルエンザウイルスにとって重要であるのと同様に、ＲＳＶ粒子の出芽にも重要であることを示している（Ｖｉｒｏｌ、３２７巻、１７５〜１８５頁、２００４年； Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ．、１４９巻、１９９〜２１０頁、２００４年； Ｖｉｒｏｌ．、３００巻、２４４〜２５４頁、２００２年）。ＲＳＶに由来するＧ糖タンパク質は、ウイルス性付着タンパク質であり、およびＲＳＶ感染に対する防御抗原として機能する、３２．５ｋｄの内在性膜タンパク質である。インフルエンザウイルスに由来する赤血球凝集素と同様、その抗原性は、それに付着した、任意の非脂質ラフト抗原の抗原性を増強し得る。非脂質ラフト外来抗原を付着させる形での、Ｇグリコポリペプチドに対する任意の改変は、結果として、該外来抗原に対して顕著な免疫反応を誘導することが可能なＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰをもたらす。

ＶＬＰが、その文脈により、エンベロープベースのウイルスに基づかないか、または本明細書で開示される特定のエンベロープベースのウイルスの特定の成分に基づくウイルス様粒子を指す場合を除き、用語「ＲＳウイルスＦポリペプチドのウイルス様粒子」、「ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰ」および「ＶＬＰ」は、本明細書の全体において互換的に用いられる。

（抗原）
本発明の特定の態様は、ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰ調製物と会合するさらなる抗原を包含する。このようなさらなる抗原は、同じ組成物中に組み込むことができ、さらにまた、ＶＬＰと共有結合させることもでき、非共有結合させることもできる。好ましい実施形態では、ＲＳウイルスＦポリペプチド、および／または他の脂質ラフト会合ポリペプチドが、天然では脂質ラフトと会合しないであろう抗原を含有する、ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰを形成するのに容易に適合可能なプラットフォームである。本節では、開示されるＶＬＰと共に用いるのに好ましい抗原について記載する。

（抗原と脂質ラフト会合ポリペプチドとの連結）
天然では脂質ラフトと会合しない抗原を含有するＶＬＰを形成する手段として、ＲＳウイルスＦポリペプチドおよび／または別の脂質ラフト会合ポリペプチドと、該抗原との連結を形成することができる。単一の抗原または複数の抗原に脂質ラフト会合ポリペプチドを連結することにより、ＶＬＰの免疫原性を増大させるか、各種の病原体に免疫原性を付与するか、または、特定の病原体の各種の株に免疫原性を付与することができる。

抗原と脂質ラフト会合ポリペプチドとの間の連結は、該抗原を結果としてＶＬＰ内へと組み込むのに十分な任意の種類の連結であり得る。結合は、共有結合、イオン性相互作用、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、金属−配位子相互作用、または抗体−抗原相互作用であり得る。好ましい実施形態では、結合は、ペプチド結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、炭素−窒素結合、炭素−炭素結合、またはジスルフィド結合などの共有結合である。

抗原は、脂質ラフト会合ポリペプチドに対する既存の結合を伴なって組換えにより作製することもでき、単離物質として作製し、次いで、後に、脂質ラフト会合ポリペプチドに連結することもできる。

（抗原の種類）
本明細書で用いられる抗原は、免疫反応を誘発することが可能であり、また、天然では脂質ラフトと会合しない任意の物質であり得る。抗原には、タンパク質、ポリペプチド（活性タンパク質、また、タンパク質内における個々のポリペプチドエピトープを含めた）、グリコポリペプチド、リポポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖結合体、多糖のペプチド性および非ペプチド性模倣体、ならびに他の分子、低分子、脂質、糖脂質、ならびに炭水化物が含まれるが、これらに限定されない。天然において、抗原が脂質ラフトと直接的または間接的に会合しない場合、脂質ラフト会合ポリペプチドに連結しない限り、それをＶＬＰ内へと組み込むことは期待されない。抗原は、疾患または障害に関与する任意の抗原、例えば、微生物抗原（例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫抗原、蠕虫抗原、酵母抗原など）、腫瘍抗原、アレルゲンなどであり得る。

（抗原の供給源）
本明細書で記載される抗原は、化学的または酵素的に合成することもでき、組換えにより作製することもでき、天然の供給源から単離することもでき、前出の組合せでもあり得る。抗原は、精製することもでき、部分精製することもでき、粗抽出物でもあり得る。

ポリペプチド抗原は、液体クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー、高速タンパク質液体クロマトグラフィーなど）、サイズ除外クロマトグラフィー、ゲル電気泳動（一次元ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動を含めた）、アフィニティークロマトグラフィー、または他の精製法が含まれるがこれらに限定されない、当技術分野で公知の標準的なタンパク質精製法を用いて、天然の供給源から単離することができる。多くの実施形態では、抗原が、例えば、約５０％〜約７５％純粋、約７５％〜約８５％純粋、約８５％〜約９０％純粋、約９０％〜約９５％純粋、約９５％〜約９８％純粋、約９８％〜約９９％純粋、または９９％超純粋の精製抗原である。

固相ペプチド合成法を用いることができるが、このような技法は、当業者に公知である。Ｊｏｎｅｓ、「Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」（オックスフォード、Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒｅｓｓ社）（１９９４年）を参照されたい。一般に、このような方法では、活性化させた単量体のユニットを、伸長するペプチド鎖を結合させた固相へと連鎖的に付加することにより、ペプチドを作製する。

ポリペプチドを作製するには、十分に確立された組換えＤＮＡ法を、脂質ラフト会合ポリペプチドと同じベクター内において用いることもでき、この場合、例えば、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物は、適切な宿主細胞（例えば、インビトロの細胞培養物における単細胞実体として増殖させる真核宿主細胞、例えば、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞など）または、原核細胞（例えば、インビトロの細胞培養物中）中に導入され、これにより遺伝的に改変された宿主細胞を作製し、適切な培養条件下において、該遺伝的に改変された宿主細胞によりタンパク質を作製する。

（ウイルス抗原）
適切なウイルス抗原には、以下の群：Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ＨＩＶ−１などのヒト免疫不全ウイルス（また、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、もしくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも称する））；また、ＨＩＶ−ＬＰなど、他の単離物； Ｐｉｃｏｍａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）； Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ノーウォークウイルスおよび関連ウイルスを含めた、胃腸炎を引き起こすウイルス株）； Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）； Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）； Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、コロナウイルス）； Ｒｈａｂｄｏｖｉｒａｄａｅ科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）； Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、コロナウイルス）； Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）； Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、エボラウイルス）； Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス）； Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、インフルエンザウイルス）； Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ハンタンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス）； Ａｒｅｎａ ｖｉｒｉｄａｅ科（出血熱ウイルス）； Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス）； Ｂｉｍａｖｉｒｉｄａｅ科； Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科（Ｂ型肝炎ウイルス）； Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ科（パルボウイルス）； Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａ（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）； Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ科（大半のアデノウイルス）； Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科（１型および２型の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）； Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、アフリカブタコレラウイルス）；ならびに未分類のウイルス（例えば、海綿状脳症の病因因子、デルタ肝炎の因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトウイルスと思われる）、非Ａ型肝炎、非Ｂ型肝炎の因子（クラス１＝内部感染による；クラス２＝非経口感染による（すなわち、Ｃ型肝炎））；およびアストロウイルス）のうちの１または複数のウイルスと関連する（例えば、これらにより合成される）抗原が含まれる。

（ノロウイルス（Ｎｏｒｖｉｒｕｓ）抗原）
本明細書で開示されるＶＬＰには、ノロウイルス科に由来する各種の抗原が含まれ得ることが好ましい。「ノーウォーク様ウイルス」とも呼ばれるノロウイルスは、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅウイルス科内の４つの属のうちの１つを占める。ノロウイルス属内には、遺伝子群Ｉおよび遺伝子群ＩＩと名付けられた、２つの主要な遺伝子群が存在する。遺伝子群Ｉのノロウイルス株には、ノーウォークウイルス、サウサンプトンウイルス、デザートシールドウイルス、およびチバウイルスが含まれる。遺伝子群ＩＩのノロウイルス株には、ヒューストンウイルス、ハワイウイルス、ローズデールウイルス、グリムズビーウイルス、メキシコウイルス、およびスノーマウンテンエージェントが含まれる（Ｐａｒｋｅｒ， Ｔ．Ｄ．ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．（２００５年）、７９巻（１２号）：７４０２〜９頁； Ｈａｌｅ， Ａ．Ｄ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏ．（２０００年）、３８巻（４号）：１６５６〜１６６０頁）。ノーウォークウイルス（ＮＶ）は、世界中における、大半の急性ウイルス性胃腸炎の流行的発生の一因となる、ヒトカリチウイルス群の原型株である。ノーウォークウイルスのカプシドタンパク質は、２つのドメイン：殻ドメイン（Ｓ）および突出部ドメイン（Ｐ）を有する。Ｐドメイン（アミノ酸２２６〜５３０；ノーウォーク株の番号付け）は、２つのサブドメインであるＰ１およびＰ２に分けられる。Ｐ２ドメインは、Ｐ１ドメイン内における１２７アミノ酸の挿入（アミノ酸２７９〜４０５）であり、フォールディングされた単量体の最遠位面に位置する。Ｐ２ドメインは、ノロウイルス株のうちで最も保存の程度が低いＶＰ１領域であり、Ｐ２内の超可変領域は、受容体の結合および免疫反応性において重要な役割を果たすと考えられている。Ｐドメインが外部に位置することを踏まえるなら、それは、本明細書で開示されるＶＬＰワクチンのための抗原として用いるのに好ましい抗原、またはポリペプチドエピトープの供給源である。Ｐ２ドメインは、遺伝子群Ｉまたは遺伝子群ＩＩのノロウイルス株に好ましい抗原である。広範にわたるノロウイルス株を通じて保存されるＰ２ドメインのうちのある領域内に存在するエピトープとして近年になって同定されたｍＡｂ ６１．２１エピトープ、ならびにｍＡｂ ５４．６エピトープ（Ｌｏｃｈｒｉｄｇｅ， Ｖ．Ｐ．ら、Ｊ Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．（２００５年）、８６巻：２７９９〜２８０６頁）がさらにより好ましい。

（インフルエンザ抗原）
本明細書で開示されるＶＬＰは、赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ、またはさらなるインフルエンザ抗原を非制限的に含む、インフルエンザに由来する各種の抗原を包含し得る。さらなる好ましいインフルエンザ抗原は、Ｍ２ポリペプチドである。インフルエンザウイルスのＭ２ポリペプチドは、スプライシングイベント後において、ＲＮＡセグメント７（マトリックスセグメント）によりコードされる、９７アミノ酸の小型のクラスＩＩＩ内在性膜タンパク質である（８０、８１）。ウイルス粒子上に存在するＭ２は極めてわずかであり、感染細胞上においてより豊富に見出すことができる。Ｍ２は、ウイルスの侵入に必要な、プロトン選択性イオンチャネルとして用いられる（８２、８３）。感染中または従来のワクチン接種中の免疫原性は最小限であることから、その保存が説明されるが、代替的なフォーマットで存在する場合は、より免疫原性であり防御性である（８４〜８６）。これは、インビボにおけるＭ２モノクローナル抗体の受動伝達により、ウイルスクリアランスが加速化され、結果として防御がもたらされるという観察（８７）と符合する。Ｍ２の外部ドメインエピトープを、融合タンパク質として、ＨＢＶのコア粒子に連結すると、非経口接種および鼻腔内接種のいずれによっても、マウスにおいて防御性であり、３回の繰り返しコピーを該コアタンパク質のＮ末端へと融合させると、最も免疫原性となる（８８〜９０）。これは、エピトープ密度が増大すると免疫原性が増大することを示す他のキャリア−ハプテンデータ（９１）と符合する。

Ｍ２ワクチンを鼻腔内送達する場合、良好な防御を達成するにはアジュバントが必要とされ、ＬＴＲ１９２Ｇ（８８、９０）およびＣＴＡ１−ＤＤ（８９）により良好な結果が達成されている。ペプチドはまた、ＫＬＨ、またはＮ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓの外膜タンパク質複合体、またはヒトパピローマウイルスのＶＬＰなどのキャリアに化学的に結合体化することもでき、マウスおよび他の動物におけるワクチンとして防御的である（９２、９３）。

Ｍ２タンパク質は、高度に保存的ではあるが、配列の相違を全く示さないわけではない。一般的な株であるＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ａｉｃｈｉ／６８（Ｈ３Ｎ２）のＭ２外部ドメインエピトープは、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１５６／９７（Ｈ５Ｎ１）を除き、今日配列決定されている他のすべてのヒト株と、免疫学的に交差反応性であることが示された（９２）。インフルエンザデータベースの配列の検討からも、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４など、他のより近年の病原性Ｈ５Ｎ１ヒト単離物のＭ２配列内において、同様の相違が示されている。この知見は、Ｍ２エピトープを組み込む、有効なＨ５特異的汎流行ワクチンが、ヒトＨ１単離物およびＨ３単離物中において現在広まっているＭ２配列ではなく、病原性の鳥類株に固有のＭ２配列を反映する必要があることを裏付ける。

インフルエンザウイルスに由来するさらなるタンパク質（ＨＡ、ＮＡ、およびＭ２以外のタンパク質）も、共発現により、またはさらなる抗原の全部もしくは一部を、ＲＳウイルスＦポリペプチドもしくは他の脂質ラフト会合ポリペプチドに連結することにより、ＶＬＰワクチン内へと組み込むことができる。これらのさらなる抗原には、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、核タンパク質、マトリックス（Ｍ１）、ＮＳ１、およびＮＳ２が含まれる。これら後者の抗原は、一般に、中和抗体反応の標的ではなく、Ｔ細胞により認識される重要なエピトープを含有し得る。このようなエピトープに対してＶＬＰワクチンにより誘導されるＴ細胞反応が、防御的免疫性を促進するのに有益であることが判明し得る。

（他の病原性抗原）
適切な細菌性抗原には、例えば、病原性Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ属種、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属種などの病原性グラム陽性菌；また、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、およびＢａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ属のグラム陰性菌などのグラム陰性菌を含めた、各種の病原性細菌のうちのいずれかと関連する（例えば、これらにより合成され、また、これらに内因性である）抗原が含まれる。例えば、Ｓｃｈａｅｃｈｔｅｒ， Ｍ、Ｈ． Ｍｅｄｏｆｆ、Ｄ． Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ」、ボルチモア、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ社（１９８９年）を参照されたい。

感染性の病原性真菌と関連する（例えば、これらにより合成され、また、これらに内因性である）適切な抗原には、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、およびＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、およびＳｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉが含まれるがこれらに限定されない感染性真菌と関連する抗原が含まれる。

病原性原虫、蠕虫、および他の真核微生物病原体と関連する（例えば、これらにより合成され、また、これらに内因性である）適切な抗原には、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘなどのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ属； Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ； Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ； Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ； Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ； Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ； Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ等が含まれるがこれらに限定されない原虫、蠕虫、および他の真核微生物病原体と関連する抗原が含まれる。

適切な抗原には、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ属種（例えば、Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ． ａｖｉｕｍ、Ｍ． ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ． ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ． ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属のＡ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属のＢ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属（ｖｉｒｉｄａｎｓ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属（嫌気性の種）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、病原性のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属種、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属種、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ属、およびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉなどの病原性微生物と関連する（例えば、これらにより合成され、また、これらに内因性である）抗原が含まれる。病原性Ｅ． ｃｏｌｉ株の非限定的な例は、ＡＴＣＣ第３１６１８号、同第２３５０５号、同第４３８８６号、同第４３８９２号、同第３５４０１号、同第４３８９６号、同第３３９８５号、同第３１６１９号、および同第３１６１７号である。

細胞内病原体と関連する各種のポリペプチドまたは他の抗原のうちのいずれかを、ＶＬＰ内に組み込むことができる。細胞内病原体と関連するポリペプチドエピトープおよびペプチドエピトープとは、その断片が、ＭＨＣクラスＩ分子と併せて、ＣＤ８^＋リンパ球の表面上におけるＴ細胞抗原受容体により認識される、例えば、これにより結合されるように、感染細胞の表面上に提示される、細胞内病原体と関連する（例えば、これによりコードされる）任意のポリペプチドである。細胞内病原体と関連するポリペプチドエピトープおよびペプチドエピトープは当技術分野において公知であり、これらには、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ ｇｐ１２０またはその抗原性断片と関連する抗原；サイトメガロウイルス抗原； Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属抗原（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなど）；Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｃ ｃａｒｉｎｉｉ（ＰＣＰ）抗原；４１−３、ＡＭＡ−１、ＣＳＰ、ＰＦＥＭＰ−１、ＧＢＰ−１３０、ＭＳＰ−１、ＰＦＳ−１６、ＳＥＲＰなど、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍまたは他の任意のマラリア種と関連する抗原が含まれるがこれらに限定されない、マラリア抗原；真菌抗原；酵母抗原（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ属種抗原）； Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ、または他のＴｏｘｏｐｌａｓｍａ属種と関連する抗原が含まれるがこれらに限定されないトキソプラズマ抗原；エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）による抗原； Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属抗原（例えば、ｇｐ１９０／ＭＳＰ１など）などが含まれるが、これらに限定されない。

好ましいＶＬＰワクチンは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓに対するものであり得る。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓは、好気性または通性嫌気性でグラム陽性の非運動性桿菌であり、幅１．０μｍ、長さ３．０〜５．０μｍである。Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓは、悪条件下でも耐性の高い内性胞子を形成し、これは、感染した動物がかつて死亡した場所の土壌で見出すことができる。本明細書で開示されるＶＬＰワクチン内で用いるのに好ましい抗原は、哺乳動物細胞上の受容体に結合し、Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓが疾患を引き起こす能力にとって極めて重要な８３ｋＤａのタンパク質である防御抗原（ＰＡ）である。より好ましい抗原は、被験体においてＢａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓに対する防御的免疫性を誘導するのに用い得る、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ ＰＡのＣ末端における１４０アミノ酸の断片である。炭疽菌に対するＶＬＰワクチン内において用いられる他の例示的な抗原は、炭疽菌胞子に由来する抗原（例えば、ＢｃｌＡ）、該細菌の栄養期に由来する抗原（例えば、細胞壁抗原、被膜抗原（例えば、ポリ−ガンマ−Ｄ−グルタミン酸、またはＰＧＡ）、分泌抗原（例えば、防御抗原、致死性因子、または浮腫因子などの外毒素））である。ＶＬＰワクチンで用いるのに好ましい別の抗原は、Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓに固有のアントロースを含有する四糖である（Ｄａｕｂｅｎｓｐｅｃｋ Ｊ．Ｍ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（２００４年）、２７９巻：３０９４５頁）。四糖は、脂質ラフト会合ポリペプチドに連結することができ、これにより、ＶＬＰワクチンとの抗原の会合が可能となる。

（腫瘍関連抗原）
公知の各種腫瘍特異抗原または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）のうちのいずれかを、ＶＬＰに組み込むことができる。全ＴＡＡを用い得るが、その必要はない。代わりに、ＴＡＡの一部、例えば、エピトープを用いることができる。ＶＬＰ内で用い得る腫瘍関連抗原（またはそれらのエピトープを含有する断片）には、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＨＥＲ−２、高分子量黒色腫関連抗原であるＭＡＡ、ＧＤ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＴＡＧ−７２、卵巣関連抗原であるＯＶ−ＴＬ３およびＭＯＶ１８、ＴＵＡＮ、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＯＦＰ、ＣＡ−１２５、ＣＡ−５０、ＣＡ−１９−９、腎腫瘍関連抗原であるＧ２５０、ＥＧＰ−４０（ＥｐＣＡＭとしても知られる）、Ｓ１００（悪性黒色腫関連抗原）、ｐ５３、およびｐ２１ｒａｓが含まれるがこれらに限定されない。前出のうちのいずれかを含めた、任意のＴＡＡ（またはそれらのエピトープ）の合成類似体を用いることができる。さらに、１または複数のＴＡＡ（またはそれらのエピトープ）の組合せを、組成物中に組み込むことができる。

（アレルゲン）
一態様では、ＶＬＰワクチンの一部である抗原が、各種のアレルゲンのうちのいずれかであり得る。アレルゲンベースのワクチンを用い、被験体におけるアレルゲンに対する忍容性を誘導することができる。チロシンとの共沈殿（ｃｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を伴うアレルゲンワクチンの例は、米国特許第３，７９２，１５９号、同第４，０７０，４５５号、および同第６，４４０，４２６号において見出すことができる。

各種のアレルゲンのうちのいずれかをＶＬＰ内に組み込むことができる。アレルゲンには、環境空中アレルゲン；ブタクサ／花粉症などの植物の花粉；雑草花粉アレルゲン；芝草花粉アレルゲン；ジョンソングラス；樹木花粉アレルゲン；ライグラス；イエダニアレルゲン（例えば、Ｄｅｒ ｐ Ｉ、Ｄｅｒ ｆ Ｉなど）などのクモ形類動物アレルゲン；コナダニ（ｓｔｏｒａｇｅ ｍｉｔｅ）アレルゲン；スギ花粉／花粉症；カビ胞子アレルゲン；動物アレルゲン（例えば、イヌ、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ラット、マウスなどによるアレルゲン）；食物アレルゲン（例えば、甲殻類；ラッカセイなどの堅果；柑橘類によるアレルゲン）；昆虫アレルゲン；毒（膜翅目、スズメバチ（ｙｅｌｌｏｗ ｊａｃｋｅｔ）、ミツバチ、カリバチ、スズメバチ（ｈｏｒｎｅｔ）、ヒアリ）；ゴキブリ、ノミ、蚊などによる他の環境昆虫アレルゲン；連鎖球菌抗原などの細菌アレルゲン； Ａｓｃａｒｉｓ属抗原などの寄生虫アレルゲン；ウイルス抗原；真菌胞子；薬物アレルゲン；抗生剤；ペニシリンおよび関連化合物；他の抗生剤；ホルモン（インスリン）、酵素（ストレプトキナーゼ）などの全タンパク質；不完全抗原またはハプテンとして作用することが可能なすべての薬物およびそれらの代謝物；ハプテンとして作用し、アレルゲンとして機能することが可能な、産業用化学物質および代謝物（例えば、酸無水物（トリメリト酸無水物など）およびイソシアン酸塩（ジイソシアン酸トルエンなど））；小麦粉などの職業アレルゲン（例えば、パン屋喘息（Ｂａｋｅｒ’ｓ ａｓｔｈｍａ）を引き起こすアレルゲン）、トウゴマ、コーヒー豆、また、上記で記載した産業用化学物質；ノミアレルゲン；ヒト以外の動物におけるヒトタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。

アレルゲンには、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖結合体、多糖のペプチド性および非ペプチド性模倣体、ならびに他の分子、低分子、脂質、糖脂質、ならびに炭水化物が含まれるが、これらに限定されない。

特定の天然の動物アレルゲンおよび植物アレルゲンの例には、以下の属：Ｃａｎｉｎｅ属（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）； Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ属（例えば、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）； Ｆｅｌｉｓ属（Ｆｅｌｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）； Ａｍｂｒｏｓｉａ属（Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｉｓｆｏｌｉａ）； Ｌｏｌｉｕｍ属（例えば、Ｌｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅまたはＬｏｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）； Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ属（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）； Ａｌｔｅｍａｒｉａ属（Ａｌｔｅｍａｒｉａ ａｌｔｅｍａｔａ）； Ａｌｄｅｒ属； Ａｌｎｕｓ属（Ａｌｎｕｓ ｇｕｌｔｉｎｏａｓ）； Ｂｅｔｕｌａ属（Ｂｅｔｕｌａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）； Ｑｕｅｒｃｕｓ属（Ｑｕｅｒｃｕｓ ａｌｂａ）； Ｏｌｅａ属（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａ）； Ａｒｔｅｍｉｓｉａ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）； Ｐｌａｎｔａｇｏ属（例えば、Ｐｌａｎｔａｇｏ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）； Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ属（例えば、Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓまたはＰａｒｉｅｔａｒｉａ ｊｕｄａｉｃａ）； Ｂｌａｔｔｅｌｌａ属（例えば、Ｂｌａｔｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）； Ａｐｉｓ属（例えば、Ａｐｉｓ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）； Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ属（例えば、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ａｒｉｚｏｎｉｃａ、およびＣｕｐｒｅｓｓｕｓ ｍａｃｒｏｃａｒｐａ）； Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ属（例えば、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ、およびＪｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ）； Ｔｈｕｙａ属（例えば、Ｔｈｕｙａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）； Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ属（例えば、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｏｂｔｕｓａ）； Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ属（例えば、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）； Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ属（例えば、Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ ｒｅｐｅｎｓ）； Ｓｅｃａｌｅ属（例えば、Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）； Ｔｒｉｔｉｃｕｍ属（例えば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）； Ｄａｃｔｙｌｉｓ属（例えば、Ｄａｃｔｙｌｉｓ ｇｌｏｍｅｒａｔａ）； Ｆｅｓｔｕｃａ属（例えば、Ｆｅｓｔｕｃａ ｅｌａｔｉｏｒ）； Ｐｏａ属（例えば、ＰｏａｐｒａｔｅｎｓｉｓまたはＰｏａ ｃｏｍｐｒｅｓｓａ）； Ａｖｅｎａ属（例えば、Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）； Ｈｏｌｃｕｓ属（例えば、Ｈｏｌｃｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）； Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ属（例えば、Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ ｏｄｏｒａｔｕｍ）； Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ属（例えば、Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｎ ｅｌａｔｉｕｓ）； Ａｇｒｏｓｔｉｓ属（例えば、Ａｇｒｏｓｔｉｓ ａｌｂａ）； Ｐｈｌｅｕｍ属（例えば、Ｐｈｌｅｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ）； Ｐｈａｌａｒｉｓ属（例えば、Ｐｈａｌａｒｉｓ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）； Ｐａｓｐａｌｕｍ属（例えば、Ｐａｓｐａｌｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ）； Ｓｏｒｇｈｕｍ属（例えば、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｈａｌｅｐｅｎｓｉｓ）； ならびにＢｒｏｍｕｓ属（例えば、Ｂｒｏｍｕｓ ｉｎｅｒｍｉｓ）に特異的なタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。

（哺乳動物細胞からＲＳＶ Ｆ ＶＬＰを作製するのに好ましい方法）
ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰは、当業者に適用可能な任意の方法により作製することができる。ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰは、ＶＬＰを形成する一因となるＲＳウイルスＦポリペプチドを包含するが、任意のエンベロープウイルスコア形成ポリペプチドは除外する。加えて、ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰは、膜（脂質ラフトを含めた）会合ポリペプチドなど、１または複数のさらなるポリペプチドを包含することにより、（ＶＬＰを形成する一因となる１または複数のポリペプチドの一部として、天然において、または人工的に存在する抗原以外のさらなる）抗原をもたらすことができる。好ましい実施形態では、ポリペプチドを、任意の適用可能なタンパク質発現系、好ましくは、細胞膜内に脂質ラフトドメインを包含する哺乳動物細胞ベースの系において共発現させることができる。

組換えによるＶＬＰ用ポリペプチドの発現は、該ポリペプチドのうちの１または複数をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを伴う。ポリペプチドのうちの１または複数をコードするポリヌクレオチドが得られたら、当技術分野で周知の技法を用いる組換えＤＮＡ法により、該ポリペプチドを作製するためのベクターを作製することができる。このようにして、本明細書では、ＶＬＰポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のうちのいずれかを含有するポリヌクレオチドを発現することによりタンパク質を調製する方法が記載される。当業者に周知の方法を用いて、ＶＬＰポリペプチドをコードする配列と、適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルとを含有する発現ベクターを構築することができる。例えば、これらの方法には、インビトロにおける組換えＤＮＡ法、合成法、また、インビボにおける遺伝子組換えが含まれる。したがって、本発明は、すべてが１または複数のプロモーターに作動可能に連結した、ＲＳウイルスＦポリペプチドと、必要に応じて、１または複数のさらなる脂質ラフト会合ポリペプチドとをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。

本明細書で記載されるＶＬＰへとアセンブルされる配列を発現させるのに用い得るベクターの非限定的な例には、ウイルスベースのベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス）、プラスミドベクター、非ウイルス性ベクター、哺乳動物ベクター、哺乳動物による人工的染色体（例えば、リポソーム、粒子状キャリアなど）、およびこれらの組合せが含まれる。

発現ベクター（複数可）は、コード配列と、適切な宿主内において、該コード領域を発現させる発現制御エレメントとを含有することが典型的である。制御エレメントには、一般に、プロモーター、エンハンサー、エクソン、イントロン、スプライシング部位、翻訳開始コドン、ならびに翻訳終結配列および転写終結配列、ならびにベクター内に挿入を導入するための挿入部位が含まれる。翻訳制御エレメントは、Ｍ． Ｋｏｚａｋ（例えば、Ｋｏｚａｋ， Ｍ．、Ｍａｍｍ． Ｇｅｎｏｍｅ、７巻（８号）：５６３〜５７４頁、１９９６年； Ｋｏｚａｋ， Ｍ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、７６巻（９号）：８１５〜８２１頁、１９９４年； Ｋｏｚａｋ， Ｍ．、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１０８巻（２号）：２２９〜２４１頁、１９８９年； Ｋｏｚａｋ， Ｍ．およびＳｈａｔｋｉｎ， Ａ． Ｊ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、６０巻：３６０〜３７５頁、１９７９年）により総説されている。

例えば、哺乳動物細胞による発現に用いられる典型的なプロモーターには、とりわけ、ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーターなどのＣＭＶプロモーター（ＣＭＶプロモーターは、イントロンＡを包含することができる）、ＲＳＶ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、マウス乳癌細胞ウイルスＬＴＲプロモーター（ＭＭＬＶ−ＬＴＲ）、ＦＩＶ−ＬＴＲ、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、および単純ヘルペスウイルスプロモーターが含まれる。マウスメタロチオネイン遺伝子に由来するプロモーターなど、他の非ウイルス性プロモーターもまた、哺乳動物による発現に用いられる。翻訳終止コドンに対して３’側に位置する、転写終結配列およびポリアデニル化配列もまた存在することが典型的である。コード配列に対して５’側に位置する、翻訳の開始を最適化するための配列もまた存在することが好ましい。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出において記載されている、ＳＶ４０に由来するシグナル、ならびにウシ成長ホルモンターミネーター配列が含まれる。スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を含有するイントロンもまた、本明細書で記載される構築物内にデザインすることができる（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１年）、１９巻：３９７９〜３９８６頁）。

本明細書では、エンハンサーエレメントもまた、例えば、哺乳動物宿主細胞内における構築物の発現レベルを上昇させるのに用いることができる。例には、Ｄｉｊｋｅｍａら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５年）、４巻：７６１頁において記載されている、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー；Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９８２年ｂ）、７９巻：６７７７頁において記載されている、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモーター；また、ＣＭＶイントロンＡ配列内に包含されるエレメント（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１年）、１９巻：３９７９〜３９８６頁）など、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ（１９８５年）、４１巻：５２１頁において記載されている、ヒトＣＭＶに由来するエレメントが含まれる。

ベクターが、本明細書で記載される１つまたは複数の配列を含有し得ることは明らかである。例えば、単一のベクターが、ＶＬＰ内に見出されるすべてのタンパク質をコードする配列を保有し得る。代替的に、複数のベクター（例えば、各々が、単一のポリペプチドコード配列をコードする複数の構築物、または各々が１つもしくは複数のポリペプチドコード配列をコードする複数の構築物）を用いることもできる。単一のベクターが、複数のポリペプチドコード配列を含む実施形態では、該配列を、同じベクター内における、同じであるかまたは異なる転写制御エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結することができる。

加えて、免疫調節分子（例えば、以下で記載されるアジュバント）、例えば、免疫調節オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧ）、サイトカイン、弱毒化した細菌性毒素などを含む配列、および／またはこれらをコードする配列を非制限的に含む、ＲＳＶ以外のタンパク質をコードする１つまたは複数の配列も、ＶＬＰ内で発現させ、また、これに組み込むことができる。

従来の技法により、発現ベクターを宿主細胞へと移入することができ、次いで、従来の技法により、トランスフェクトされた細胞を培養して、ＶＬＰポリペプチド（複数可）を作製することができる。したがって、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結したＶＬＰポリペプチドのうちの１つまたは複数をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を包含する。ＶＬＰを作製するのに好ましい実施形態では、以下で詳述する通り、ＲＳウイルスＦポリペプチドと、場合によって、抗原またはアジュバントに連結した脂質ラフト会合ポリペプチドとをコードするベクターを、宿主細胞内で（共）発現させて、ＶＬＰを作製することができる。

トランスフェクション、継代細胞株の確立（当業者に公知の標準的なプロトコールを用いる）、および／または目的のＲＳＶ遺伝子を保有するＤＮＡ分子での感染後における真核細胞、より好ましくは哺乳動物細胞内において、ＶＬＰを作製することが好ましい。ＶＬＰを形成するのに必要とされるタンパク質の発現レベルは、選択された遺伝子の転写を駆動する真核細胞プロモーターまたはウイルスプロモーターの配列を最適化することによって最大化する。ＶＬＰは、ＲＳウイルスＦポリペプチドにより駆動されて培地内へと放出され、そこからＶＬＰを精製し、その後、ワクチンとして処方することができる。ＶＬＰは、感染性ワクチンではなく、したがって、ワクチンの不活化は不要である。

本明細書で記載される配列から発現するＲＳウイルスＦポリペプチドが、その表面上に抗原タンパク質を提示するＶＬＰへと自己アセンブルする能力は、所望の配列を共導入（ｃｏ−ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）することにより、これらのＶＬＰを、任意の宿主細胞内において作製することを可能にする。配列（複数可）（例えば、１つまたは複数の発現ベクター内における）は、多様な組合せで安定的に、および／または一過的に宿主細胞内へと組み込むことができる。

適切な宿主細胞には、細菌細胞、哺乳動物細胞、バキュロウイルス／昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、およびＸｅｎｏｐｕｓ属細胞が含まれるが、これらに限定されない。

当技術分野では、例えば、多数の哺乳動物細胞株が公知であり、これらには、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０、ＭＲＣ−５、ＷＩ ３８、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、２９３、２９３Ｔ、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ、ＳＵＰＴ、Ｃ８１６６、ＭＯＬＴ４／クローン８、ＭＴ−２、ＭＴ−４、Ｈ９、ＰＭ１、ＣＥＭ、骨髄腫細胞（例えば、ＳＢ２０細胞）、ＬｔＫ、ＨｅＬａ、ＷＩ−３８、Ｌ２、ＣＭＴ−９３、およびＣＥＭＸ１７４（このような細胞株は、例えば、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．から入手可能である）などであるがこれらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）から入手可能な初代細胞ならびに不死化細胞株が含まれる。

同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属種などの細菌宿主も、本発現構築物と共に用いられる。

本開示において有用な酵母宿主には、とりわけ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、およびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが含まれる。真菌宿主には、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属が含まれる。

バキュロウイルス発現ベクターと共に用いられる昆虫細胞には、とりわけ、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉが含まれる。ＬａｔｈａｍおよびＧａｌａｒｚａ（２００１年）、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７５巻（１３号）：６１５４〜６１６５頁； Ｇａｌａｒｚａら（２００５年）、Ｖｉｒａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８巻（１号）：２４４〜５１頁；ならびに米国特許公開第２００５５０１８６６２１号および同第２００６０２６３８０４号を参照されたい。

本明細書で示される開示を踏まえれば、ＶＬＰのＲＳウイルスＦポリペプチドをコードする１つまたは複数の配列（発現ベクター）を安定的に組み込むことにより、上記で記載した配列のうちの１つまたは複数を発現する細胞株を容易に作製することができる。安定的に組み込まれたＲＳウイルスＦポリペプチド配列（複数可）の発現を制御するプロモーターは、構成的プロモーターの場合もあり、誘導的プロモーターの場合もある。

ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰを作製する細胞株が由来する親細胞株は、例えば、哺乳動物細胞株、昆虫細胞株、酵母細胞株、細菌細胞株を含めた、上記で記載した任意の細胞から選択することができる。好ましい実施形態では、該細胞株は、哺乳動物細胞株（例えば、２９３、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＭＲＣ−５、ＨＴ１０８０、および骨髄腫細胞）である。哺乳動物細胞を用いてＲＳＶ ＶＬＰを作製することにより、（ｉ）ＶＬＰの形成；（ｉｉ）適正なミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｙｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化、および出芽；（ｉｉｉ）非哺乳動物細胞夾雑物の不在；（ｉｖ）精製の容易さがもたらされる。

細胞株を創出することに加えて、宿主細胞内において、ＲＳＶコード配列を一過的に発現させることもできる。適切な組換え発現宿主細胞系には、当技術分野で周知の、細菌発現系、哺乳動物発現系、バキュロウイルス／昆虫発現系、ワクシニア発現系、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）発現系、アルファウイルス（シンドビスウイルス、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスなど）発現系、哺乳動物発現系、酵母発現系、およびＸｅｎｏｐｕｓ属発現系が含まれるが、これらに限定されない。特に好ましい発現系は、哺乳動物細胞株、ワクシニア、シンドビス、昆虫、および酵母系である。

例えば、以下：バキュロウイルス発現（Ｒｅｉｌｌｙ， Ｐ． Ｒ．ら、ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥＣＴＯＲＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（１９９２年）； Ｂｅａｍｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１１巻：３７８頁（１９９１年）；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製；カリフォルニア州、パロアルト、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、ワクシニア発現系（Ｅａｒｌ， Ｐ． Ｌ．ら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編）、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１年）； １９９２年８月４日に発行された、Ｍｏｓｓ， Ｂ．ら、米国特許第５，１３５，８５５号）、細菌内における発現（Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ．ら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、Ｍｅｄｉａ Ｐａ．；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、酵母内における発現（１９９８年３月１７日に発行され、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， ＳおよびＴｅｋａｍｐ−Ｏｌｓｏｎ， Ｐ．、米国特許第ＲＥ３５，７４９号；１９９７年５月１３日に発行され、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｈｕｓｔｅｒ， Ｊ． Ｒ．、米国特許第５，６２９，２０３号； Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ， Ｇ． ら、Ａｎｔｏｎｉｅ Ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、６２巻（１〜２号）：７９〜９３頁（１９９２年）； Ｒｏｍａｎｏｓ， Ｍ． Ａ． ら、Ｙｅａｓｔ、８巻（６号）：４２３〜４８８頁（１９９２年）； Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｄ． Ｖ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻（１９９０年）； Ｇｕｔｈｒｉｅ， Ｃ．およびＧ． Ｒ． Ｆｉｎｋ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４巻（１９９１年））、動物細胞内における発現（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製；ニューヨーク州、グラウンドアイランド、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製；例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（Ｈａｙｎｅｓ， Ｊ． ら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．、１１巻：６８７〜７０６頁（１９８３年）； Ｌａｕ， Ｙ． Ｆ． ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、４巻：１４６９〜１４７５頁（１９８４年）； Ｋａｕｆｍａｎ， Ｒ． Ｊ．、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻、５３７〜５６６頁、カリフォルニア州、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆ．（１９９１年）））、ならびに植物細胞における発現（植物クローニングベクター；カリフォルニア州、パロアルト、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製；およびニュージャージー州、ピスケータウェイ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製； Ｈｏｏｄ， Ｅ．ら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６８巻：１２９１〜１３０１頁（１９８６年）； Ｎａｇｅｌ， Ｒ．ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．、６７巻：３２５頁（１９９０年）； Ａｎら、「Ｂｉｎａｒｙ Ｖｅｃｔｏｒｓ」、およびその他、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ、Ａ３巻：１〜１９頁（１９８８年）； Ｍｉｋｉ， Ｂ． Ｌ． Ａ．ら、２４９〜２６５頁、およびその他、Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ（Ｈｏｈｎ， Ｔ．ら編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｗｉｅｎ、Ａｕｓｔｒｉａ（１９８７年）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐ． Ｇ． ＪｏｎｅｓおよびＪ． Ｍ． Ｓｕｔｔｏｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｊ． Ｗｉｌｅｙ、１９９７年； Ｍｉｇｌａｎｉ， Ｇｕｒｂａｃｈａｎ、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｅｓｓ、１９９８年； Ｈｅｎｒｙ， Ｒ． Ｊ．、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ、１９９７年）を含めた、多くの適切な発現系が市販されている。

ＶＬＰを形成するのに必要とされるタンパク質をコードする改変遺伝子を含有する発現ベクターを宿主細胞（複数可）内へと導入し、その後、必要なレベルで発現させると、ＶＬＰがアセンブルし、次いで、細胞表面から培地内へと放出される。

選択される発現系および宿主に応じて、粒子形成ポリペプチドが発現し、ＶＬＰが形成され得る条件下において、発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を増殖させることにより、ＶＬＰを作製する。適切な増殖条件の選択は、当業者の能力の範囲内にある。

次いで、例えば、密度勾配遠心分離、例えば、スクロース勾配、ＰＥＧ沈殿、ペレット化など（例えば、Ｋｉｍｂａｕｅｒら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．（１９９３年）、６７巻：６９２９〜６９３６頁を参照されたい）、ならびに、例えば、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを含めた標準的な精製法により、その完全性を保存する方法を用いて、粒子を単離する（または実質的に精製する）。

（ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰのＶＬＰ調製物における感染因子を不活化するのに好ましい方法）
電子放射は、ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰの免疫原性を実質的に低下させることなく、感染因子を不活化することが可能なので、不活化の好ましい方法は、電子放射を介する方法である。電磁放射で好ましい３つの方式のすべて（すなわち、光反応性化合物を伴うＵＶ照射、ＵＶ照射単独、およびガンマ照射）には、血液、食品、ワクチンなど、多種多様な試料における病原体を不活化するのに用いられてきた長い歴史があるため、不活化用電磁放射を適用するための多種多様な装置が市販されており、これらは、本明細書で開示される方法を実施するのにほとんど〜まったく改変せずに用いることができる。さらに、当技術分野では、波長および線量の最適化がルーチン化しており、したがって、当業者の能力範囲内で容易に実施される。

（光反応性化合物を伴うＵＶ照射）
電磁放射による例示的な不活化法は、光反応性化合物、好ましくは、感染因子中のポリヌクレオチドと反応する光反応性化合物の存在下における、ＵＶ−Ａ照射などの紫外線照射の組合せである。

好ましい光反応性化合物には、アクチノマイシン、アントラサイクリノン、アントラマイシン、ベンゾジピロン、フルオレン、フルオレノン、フロクマリン、マイトマイシン、ｍｏｎｏｓｔｒａｌ ｆａｓｔ ｂｌｕｅ、ｎｏｒｐｈｉｌｌｉｎ Ａ、フェナントリジン、フェナザチオニウム塩、フェナジン、フェノチアジン、フェニルアジド、キノリン、およびチオキサンテノン（ｔｈｉａｘａｎｔｈｅｎｏｎｅｓ）が含まれる。好ましい種は、２つの主要なカテゴリーのうちの１つに属するフロクマリンである。第１のカテゴリーは、ソラーレン［７Ｈ−フロ（３，２−ｇ）−（１）−ベンゾピラン−７−オン、または６−ヒドロキシ−５−ベンゾフランアクリル酸のデルタ−ラクトン］であり、これらは、直鎖型であり、中央の芳香環部分に付随する２つの酸素残基が１，３の配向性を有し、またさらに、フラン環部分が二環クマリン系の６位に結合している。第２のカテゴリーは、イソソラーレン［２Ｈ−フロ（２，３−ｈ）−（１）−ベンゾピラン−２−オン、または４−ヒドロキシ−５−ベンゾフランアクリル酸のデルタ−ラクトン］であり、これらは、角度型（ａｎｇｕｌａｒ）であり、中央の芳香環部分に付随する２つの酸素残基が１，３の配向性を有し、またさらに、フラン環部分が二環クマリン系の８位に結合している。３、４、５、８、４’、または５’位において直鎖型フロクマリンを置換することによりソラーレン誘導体を作製し得る一方、３、４、５、６、４’、または５位において角度型フロクマリンを置換することによりイソソラーレン誘導体を作製し得る。ソラーレンは、二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートすることができ、長波長の紫外光（ＵＶＡ）を吸収すると、ピリミジン塩基に対する共有結合付加体を形成する。例えば、Ｇ． Ｄ． Ｃｉｍｉｎｏら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５４巻：１１５１頁（１９８５年）； Ｈｅａｒｓｔら、Ｑｕａｒｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１７巻：１頁（１９８４頁）を参照されたい。

好ましいＵＶ（または場合によって、可視光）放射の波長は、光付加体が生成される波長に依存し、これは、光反応性化学物質の化学反応に依存する。例示を目的として述べると、多くのソラーレンには、３２０〜３８０ｎｍの波長にあるＵＶ放射が最も有効であり、３３０〜３６０ｎｍが最大の有効性を示す。

（ＵＶ照射単独）
光反応性化合物の存在下におけるＵＶ照射に加え、感染因子は、ＵＶ照射単独でも不活化することができる。好ましい実施形態では、放射は、波長が、約１８０〜３２０ｎｍ、または約２２５〜２９０ｎｍ、または約２５４ｎｍ（すなわち、ポリヌクレオチドの最大吸光度ピーク）であるＵＶＣ放射である。ＵＶＣ放射は、エンベロープを形成する脂質二重層など、本明細書で開示されるＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰの成分に対して、安定性および免疫原性の両面で有害性が低い一方で、感染因子を不活化するのに十分なエネルギーを保持するので好ましい。しかし、例えば、ＵＶＡおよびＵＶＢなど、他の種類のＵＶ放射もまた用いることができる。

（ガンマ照射）
本明細書で開示される方法を実施して組成物を作製するには、ガンマ照射（すなわち、イオン化放射）もまた用いることができる。ガンマ照射は、感染因子のゲノムをコードするポリヌクレオチド内において鎖の切断を導入することにより、感染因子を不活化することもでき、または、該ポリヌクレオチドを攻撃するヒドロキシルラジカルを生成することにより、感染因子を不活化することもできる。

（ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰを用いる好ましい方法）
（処方物）
本明細書で記載されるＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰの好ましい使用は、ワクチン調製物としての使用である。典型的に、このようなワクチンは、液体溶液または懸濁物の注射剤として調製されるが、注射前に液体中に溶解させるか、または懸濁させるのに適する固体形態もまた調製することができる。このような調製物はまた、乳化させることもでき、乾燥粉末として作製することもできる。免疫原性の有効成分は、薬学的に許容され、また、有効成分に適合する、賦形剤と混合することが多い。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩液、デキストロース、グリセロール、エタノールなどであり、また、これらの組合せである。加えて、所望の場合、ワクチンは、保湿剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、または該ワクチンの有効性を増強するアジュバントなどの補助物質を含有し得る。

ワクチンは、注射、例えば、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）注射、皮内注射、真皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）注射、または筋肉内注射を介する、従来の非経口投与が可能である。他の投与方式に適する、さらなる処方物には坐剤が含まれ、場合によっては、経口処方物、鼻腔内処方物、口腔内処方物、舌下処方物、腹腔内処方物、膣内処方物、経肛門処方物、および頭蓋内処方物も含まれる。坐剤の場合、従来の結合剤およびキャリアには、例えば、ポリアルキレングリコール（ｐｏｌｙａｌｋａｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）またはトリグリセリドが含まれる場合があり、このような坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１〜２％の範囲で有効成分を含有する混合物から形成することができる。特定の実施形態では、脂肪酸グリセリドの混合物またはココアバターなどの低温溶融ワックスをまず溶融させ、本明細書で記載されるＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰを、例えば、撹拌することにより、均一に分散させる。次いで、溶融した均一の混合物を、好都合なサイズの型に流し込み、冷却して固形化させる。

鼻腔内送達に適する処方物には、液体および乾燥粉末が含まれる。処方物は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、およびキトサンなど、通常用いられる賦形剤を包含する。液体処方物または粉末処方物において、キトサンなどの粘膜付着剤を用いて、粘膜絨毛による、鼻腔内投与された処方物のクリアランスを遅延させることができる。マンニトールおよびスクロースなどの糖を、液体処方物では安定化剤として用いることができ、また、乾燥粉末処方物では安定化剤およびバルキング剤として用いることができる。加えて、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）などのアジュバントを、液体処方物および乾燥粉末処方物の両方において、免疫刺激性アジュバントとして用いることもできる。

経口送達に適する処方物には、液体、固体、半固体、ゲル、錠剤、カプセル、ロゼンジなどが含まれる。経口送達に適する処方物には、錠剤、ロゼンジ、カプセル、ゲル、液体、食品、飲料、栄養補助食品などが含まれる。処方物は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど、通常用いられる賦形剤を包含する。他のＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰワクチン組成物は、溶液、懸濁物、丸薬、持続放出処方物、または粉末の形態を取る場合があり、１０〜９５％、好ましくは２５〜７０％の有効成分を含有する場合がある。経口処方物の場合、コレラ毒素が興味深い処方物パートナー（また、可能な結合パートナー）である。

膣内投与用に処方する場合、ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰワクチンは、ペッサリー、タンポン、クリーム、ジェル、ペースト、フォーム、またはスプレーの形態であり得る。前出の処方物のうちのいずれもが、ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰに加えて、キャリアなど、当技術分野で適切であることが公知の薬剤を含有し得る。

一部の実施形態では、ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰワクチンを、全身送達用に処方する場合もあり、局所送達用に処方する場合もある。このような処方物は、当技術分野において周知である。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース液、デキストロースおよび塩化ナトリウムによる溶液、乳酸加リンゲル液、または固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体および栄養物質補給剤、電解質補給剤（リンゲルデキストロース液に基づく補給剤など）などが含まれる。全身投与経路および局所投与経路には、例えば、皮内経路、局所適用経路、静脈内経路、筋肉内経路などが含まれる。

ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰは、中性処方物または塩ベースの処方物を含めたワクチンへと処方することができる。薬学的に許容される塩には、酸添加塩（ペプチドの遊離アミノ基と共に形成され、また、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と共に形成される）が含まれる。遊離カルボキシル基と共に形成される塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄などの無機塩基、また、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来し得る。

ワクチンは、投薬処方物に適合した形で、また、治療的に有効であり免疫原性となる量で投与することができる。投与量は、例えば、個体の免疫系が免疫反応を起こす能力、また、所望される防御の程度を含め、処置される被験体に依存する。適切な用量範囲は、１回のワクチン接種当たりの有効成分が数百マイクログラムのオーダーであり、好ましい範囲は、約０．５μｇ〜１０００μｇの範囲、好ましくは１μｇ〜５００μｇの範囲、またとりわけ、約１０μｇ〜１００μｇの範囲など、約０．１μｇ〜２０００μｇの範囲である（１〜１０ｍｇの範囲にある高量も意図される）ことが好ましい。初回投与および追加投与に適するレジメンもまた可変的であるが、初回投与にその後の接種または他の投与が続く形が典型的である。

適用方式は多様に変化させることができる。従来のワクチン投与方法のうちのいずれもが適用可能である。これらには、固体の生理学的に許容されるベース上における経口適用、または注射など、生理学的に許容される分散剤による非経口適用が含まれる。ワクチンの用量は、投与経路に依存し、ワクチン接種されるヒトの年齢、および抗原処方物により変化する。

ワクチン処方物の一部は、それだけでワクチンとして十分に免疫原性であるが、他の処方物では、該ワクチンがアジュバント物質をさらに包含すると、免疫反応が増強される場合もある。

とりわけ、鼻腔内ベース、経口ベース、または肺内ベースの送達処方物の場合、送達および免疫原性を改善するには、粘膜付着を改善する送達剤もまた用いることができる。このような化合物の１つである、キチンのＮ−脱アセチル化形態であるキトサンは、多くの医薬処方物で用いられる（３２）。粘膜絨毛によるクリアランスを遅延させ、粘膜による抗原の取込みおよびプロセシングのためのより多くの時間を可能にする能力のために、キトサンは、鼻腔内におけるワクチン送達にとって魅力的な粘膜付着剤である（３３、３４）。加えて、それは、接着結合を一過的に開口させ、これにより、ＮＡＬＴへの抗原の経上皮輸送が増強され得る。近年のヒト試験では、キトサンを伴うが、さらなるアジュバントは伴わない、三価の不活化インフルエンザワクチンを鼻腔内投与したところ、筋肉内接種後に得られたセロコンバージョンおよびＨＩ力価をごくわずかに下回るセロコンバージョンおよびＨＩ力価がもたらされた（３３）。

キトサンはまた、遺伝的操作により解毒したＥ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンの変異体であるＬＴＫ６３など、鼻腔内において良好に機能するアジュバントと共に処方することもできる。これは、キトサンにより付与される送達および付着の利益の上に、免疫刺激効果を付加し、その結果、粘膜反応および全身反応の増強をもたらす（３５）。

最後に、キトサン処方物はまた、ワクチンの安定性を改善し、粘膜絨毛によるクリアランスにおいて液体処方物を上回る遅延を結果としてもたらすことが示されている乾燥粉末フォーマットでも調製することができることに注意すべきである（４２）。これは、キトサンと共に処方された、鼻腔内用乾燥粉末によるジフテリア毒素ワクチンを伴う、近年のヒト臨床試験において見られ、ここで、鼻腔内経路は、従来の筋肉内経路と同程度に有効であり、分泌性ＩｇＡ反応の利益が付加された（４３）。該ワクチンはまた、忍容性も極めて良好であった。キトサンおよびＭＰＬを含有する炭疽菌用の鼻腔内乾燥粉末ワクチンは、ウサギにおいて、筋肉内接種より強力な反応を誘導し、また、エアゾールによる胞子チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対しても防御的であった（４４）。

鼻腔内ワクチンは、下気道に対してより良好に作用する非経口投与ワクチンに対して、上気道および下気道に作用し得るので、好ましい処方物を表す。これは、アレルゲンベースのワクチンには忍容性を誘導し、また、病原体ベースのワクチンには免疫性を誘導する点で有益であり得る。

鼻腔内ワクチンは、上気道および下気道の両方において防御をもたらすのに加え、針による接種の煩雑さを回避し、また、粒子抗原および／または可溶性抗原が、鼻咽頭関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）と相互作用することを介して、粘膜および全身における体液性反応および細胞性反応の両方を誘導する手段をもたらす（１６〜１９）。歴史的に、鼻腔内経路は、非経口接種ほど有効ではなかったが、新規の送達処方物であるＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰおよびアジュバントを用いることにより、この枠組みが変わりつつある。実際、鼻腔粘膜内にはシアル酸を含有する受容体が豊富であるため、鼻腔内送達には、機能性の赤血球凝集素ポリペプチドを含有するＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰがとりわけよく適する場合があり、その結果、ＨＡ抗原の結合が増強され、粘膜絨毛によるクリアランスが低減される可能性がある。

（アジュバント）
ワクチンに対するアジュバント効果を達成する各種の方法が公知であり、本明細書で開示されるＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰと共に用いることができる。一般的な原理および方法は、「Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、１９９５年、Ｄｕｎｃａｎ Ｅ． Ｓ． Ｓｔｅｗａｒｔ−Ｔｕｌｌ（編）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社、ＩＳＢＮ ０−４７１−９５１７０−６において詳述されており、また、「Ｖａｃｃｉｎｅｓ： Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、１９９５年、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ Ｇら（編）、ニューヨーク、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ社、ＩＳＢＮ ０−３０６−４５２８３−９においても詳述されている。

一部の実施形態では、ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰワクチンが、重量ベースの比率約１０：１〜約１０^１０：１のＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰ：アジュバント、例えば、約１０：１〜約１００：１、約１００：１〜約１０^３：１、約１０^３：１〜約１０^４：１、約１０^４：１〜約１０^５：１、約１０^５：１〜約１０^６：１、約１０^６：１〜約１０^７：１、約１０^７：１〜約１０^８：１、約１０^８：１〜約１０^９：１、または約１０^９：１〜約１０^１０：１のＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰ：アジュバントで、少なくとも１つのアジュバントと混合したＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰを包含する。当業者は、アジュバントに関する情報、また、最適の比率を決定する日常的実験により、適切な比率を容易に決定することができる。

アジュバントの好ましい例は、ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰのポリペプチド成分と共発現させるか、または該ポリペプチド成分と融合させて、キメラポリペプチドを作製することにより、本明細書で記載されるＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰに容易に添加し得るポリペプチドアジュバントである。鞭毛の主要なタンパク質構成要素である細菌性フラジェリンは、それが、ｔｏｌｌ様受容体であるＴＬＲ５を介する先天性免疫系により認識されるために、アジュバントタンパク質としてますます注目を集めている、好ましいアジュバントである（６５）。ＴＬＲ５を介するフラジェリンシグナル伝達は、ＤＣの成熟化および移動の他、マクロファージ、好中球、および腸上皮細胞の活性化も誘導することにより、先天性免疫機能および後天性免疫機能の両方に影響を及ぼし、その結果、炎症促進（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）メディエーターを生成させる（６６〜７２）。

ＴＬＲ５は、フラジェリン単量体内における保存的構造（これはフラジェリン単量体タンパク質に固有であり、また、鞭毛機能に必要とされる）を認識し、このことは免疫学的圧力に応答したその変異を妨げる（７３）。該受容体は、１００ｆＭの濃度に対して感受性であるが、完全な線維は認識しない。鞭毛が単量体へと解体されることが、結合および刺激に必要とされる。

アジュバントとしてのフラジェリンは、非経口投与または鼻腔内投与された異種抗原に対する防御反応を誘導する強力な活性を有し（６６、７４〜７７）、また、ＤＮＡワクチンに対するアジュバント効果もまた報告されている（７８）。マウスまたはサルにおいてフラジェリンを用いると、Ｔｈ２バイアス（これは、インフルエンザなどの呼吸器ウイルスには適切である）は観察されるが、ＩｇＥ誘導の証拠は観察されていない。加えて、サルにおける鼻腔内投与または全身投与後における、局所炎症反応も全身炎症反応も報告されていない（７４）。ＴＬＲ５を介して、ＭｙＤ８８依存的な形でなされるフラジェリンシグナル伝達、また、ＴＬＲを介する、他のすべてのＭｙＤ８８依存的シグナルは、Ｔｈ１バイアスを結果としてもたらすことが示されている（６７、７９）ため、フラジェリンを使用した後で誘発される反応がＴｈ２特徴を示すことは、ある意味で驚くべきことである。重要なことに、フラジェリンに対して予め存在する抗体は、アジュバントの有効性に対してさほどの影響を及ぼさない（７４）ことから、フラジェリンは、複数回使用のためのアジュバントとして魅力的となっている。

多くの近年における鼻腔内ワクチン試験における共通の主題は、ワクチンの有効性を改善するアジュバントおよび／または送達系の使用である。このような一研究では、遺伝的に解毒されたＥ． ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンアジュバント（ＬＴ Ｒ１９２Ｇ）を含有するインフルエンザＨ３ワクチンが、Ｈ５チャレンジに対する異種サブタイプ的な防御を結果としてもたらしたが、これは、鼻腔内送達後に限られた。防御は、交差中和抗体の誘導に基づき、これにより、新たなワクチンの開発における鼻腔内経路についての重要な示唆が示された（２２）。

サイトカイン、コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦなど）；腫瘍壊死因子；インターロイキン２、インターロイキン７、インターロイキン１２、インターフェロン、および他の同様の増殖因子はまた、アジュバントとして用いることができ、これらは
ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰのポリペプチド成分と混合または融合させることにより、該ワクチン内に容易に組み込み得るので、これらもまた好ましい。

一部の実施形態では、本明細書で開示されるＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰワクチン組成物が、５’−ＴＣＧ−３’配列を含む、核酸のＴＬＲ９リガンド；イミダゾキノリンのＴＬＲ７リガンド；置換グアニンのＴＬＲ７／８リガンド；ロキソリビン、７−デアザデオキシグアノシン、７−チア−８−オキソデオキシグアノシン、イミキモド（Ｒ−８３７）、およびレシキモド（Ｒ−８４８）など、他のＴＬＲ７リガンドなど、Ｔｏｌｌ様受容体を介して作用する他のアジュバントを包含し得る。

特定のアジュバントは、樹状細胞などのＡＰＣによるワクチン分子の取込みを促進し、これらを活性化する。非限定的な例は、免疫標的化アジュバント；毒素、サイトカイン、およびマイコバクテリア誘導体などの免疫調節アジュバント；油処方物；ポリマー；ミセル形成アジュバント；サポニン；免疫刺激複合体マトリックス（ＩＳＣＯＭマトリックス）；粒子；ＤＤＡ；アルミニウムアジュバント；ＤＮＡアジュバント；ＭＰＬ；および封入アジュバントからなる群より選択される。

アジュバントのさらなる例には、作用物質、例えば、緩衝生理食塩液中０．０５〜０．１パーセントの溶液として一般的に用いられるアルミニウム塩、例えば、水酸化物またはリン酸塩（ミョウバン）（例えば、Ｎｉｃｋｌａｓ（１９９２年）、Ｒｅｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３巻：４８９〜４９３頁を参照されたい）、０．２５パーセントの溶液として用いられる糖の合成ポリマー（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標））との混合物、それぞれ、７０℃〜１０１℃の範囲の温度で３０秒間〜２分間にわたる熱処理によるワクチン中のタンパク質の凝集物が含まれ、また、架橋形成剤による凝集物も可能である。ペプシン処理した、アルブミンに対する抗体（Ｆａｂ断片）での再活性化による凝集物、Ｃ． ｐａｒｖｕｍなどの細菌細胞またはグラム陰性菌の内毒素もしくはリポ多糖成分との混合物、モノオレイン酸マンニド（Ａｒａｃｅｌ Ａ）などの生理学的に許容される油ビヒクルにおけるエマルジョン、または保護置換物として用いられる、ペルフルオロカーボン（Ｆｌｕｏｓｏｌ−ＤＡ）の２０パーセント溶液によるエマルジョンもまた用いることができる。スクアレンおよびＩＦＡなどの油との混合物もまた好ましい。

ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）は、アジュバントの興味深い候補物質であるが、フロイントの完全アジュバントおよびフロイントの不完全アジュバントの他、ＱｕｉｌＡおよびＱＳ２１などのキラヤサポニンもまた興味深い。さらなる可能性には、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ（登録商標））、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、およびトレオニルムラミルジペプチド（ｔＭＤＰ）など、リポ多糖のポリ［ジ（カルボキシレートフェノキシ）ホスファゼン］（ｐｏｌｙ［ｄｉ（ｅａｒｂｏｘｙｌａｔｏｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）（ＰＣＰＰ）誘導体が含まれる。例えば、アルミニウム塩と併せた、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの組合せを含めた、主にＴｈ１型の反応をもたらすリポ多糖ベースのアジュバントが好ましい。ＭＰＬ（登録商標）アジュバントは、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社から市販されている（例えば、米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号；および同第４，９１２，０９４号を参照されたい）。

リポソーム処方物もまた、アジュバント効果を付与することが知られており、したがって、リポソームアジュバントは、ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰと合わされる、好ましい例である。

免疫刺激複合体マトリックス型（ＩＳＣＯＭ（登録商標）マトリックス）アジュバントは、とりわけ、この型のアジュバントが、ＡＰＣによるＭＨＣクラスＩＩ発現を上方制御することが可能であることが示されているため、本発明に従う好ましい選択である。ＩＳＣＯＭマトリックスは、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａに由来する（場合によって分画された）サポニン（トリテルペノイド）、コレステロール、およびリン脂質からなる。ＶＬＰ中のものなどの免疫原性タンパク質と混合する場合、結果として得られる粒子状処方物は、サポニンが６０〜７０％ｗ／ｗを構成することが可能であり、コレステロールおよびリン脂質が１０〜１５％ｗ／ｗを構成することが可能であり、タンパク質が１０〜１５％ｗ／ｗを構成することが可能な、ＩＳＣＯＭ粒子として公知の処方物である。免疫刺激複合体の組成および使用に関する詳細は、例えば、アジュバントを扱う上述の教科書中に見出し得るが、また、Ｍｏｒｅｉｎ Ｂら、１９９５年、Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３巻：４６１〜４７５頁の他、Ｂａｒｒ Ｉ ＧおよびＭｉｔｃｈｅｌｌ Ｇ Ｆ、１９９６年、Ｉｍｍｕｎｏｌ． ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、７４巻：８〜２５頁も、完全な免疫刺激複合体を調製するのに有益な教示を提供している。

本明細書で開示されるＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰワクチンとアジュバントの組合せにおいて用い得るサポニンには、それらがＩＳＣＯＭ形態にある場合であれ、そうでない場合であれ、米国特許第５，０５７，５４０号；および「Ｓａｐｏｎｉｎｓ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、Ｋｅｎｓｉｌ， Ｃ． Ｒ．、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ、１９９６年、１２巻（１〜２号）：１〜５５頁；およびＥＰ０３６２２７９Ｂ１で記載される、Ｑｕｉｌ Ａと称する、Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの樹皮に由来するサポニン、また、それらの画分が含まれる。Ｑｕｉｌ Ａの特に好ましい画分は、ＱＳ２１、ＱＳ７、およびＱＳ１７である。

β−エスシンは、本発明のアジュバント組成物中で用いるのに好ましい、別の溶血性サポニンである。エスシンは、「メルクインデックス」（第１２版：エントリー３７３７）において、ラテン名： Ａｅｓｃｕｌｕｓ ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍであるトチノキの種子内で発生するサポニンの混合物として記載されている。クロマトグラフィーおよび精製（Ｆｉｅｄｌｅｒ、Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈ．、４巻、２１３頁（１９５３年））による、また、イオン交換樹脂（Ｅｒｂｒｉｎｇら、米国特許第３，２３８，１９０号）によるその単離が記載されている。エスシンの画分は精製されており、生物学的に活性であることが示されている（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｍら（Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ（東京）、１９９６年８月、４４巻（８号）：１４５４〜１４６４頁））。β−エスシン（ｅｓｃｉｎ）はまた、エスシン（ａｅｓｃｉｎ）としても公知である。

本発明において用いるのに好ましい別の溶血性サポニンは、ジギトニンである。ジギトニンは、「メルクインデックス」（第１２版：エントリー３２０４）において、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｐｕｒｐｕｒｅａの種子に由来し、また、Ｇｉｓｖｏｌｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｐｈａｒｍ．Ａｓｓｏｃ．、１９３４年、２３巻、６６４頁；およびＲｕｈｅｎｓｔｒｏｔｈ−Ｂａｕｅｒ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９５５年、３０１巻、６２１頁において記載される手順により精製されるサポニンとして記載されている。その使用は、コレステロールを判定するための臨床試薬として記載されている。

アジュバント効果を達成する別の興味深い（したがって、好ましい）可能性は、Ｇｏｓｓｅｌｉｎら、１９９２年において記載される技法を用いることである。略述すると、本発明の抗原などの関与抗原の提示は、該抗原を、単球／マクロファージ上におけるＦ_Ｃ受容体に対する抗体（または抗原に結合する抗体断片）に結合体化することにより増強することができる。とりわけ、抗原と抗Ｆ_ＣＲＩとの結合体は、ワクチン接種のための免疫原性を増強することが示されている。該抗体は、生成後において、または生成の一部として（ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰのポリペプチド成分のうちのいずれか１つに対する融合体としての発現によることを含む）、ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰに結合体化することができる。

他の可能性は、標的化物質および免疫調節物質（すなわち、サイトカイン）の使用を伴う。加えて、ポリＩ：Ｃなど、合成のサイトカイン誘導物質もまた用いることができる。

適切なマイコバクテリア誘導体は、ムラミルジペプチド、フロイントの完全アジュバント、ＲＩＢＩ（モンタナ州、ハミルトン、ＲｉＢｉ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅｒｃｈ社製）、ならびに、ＴＤＭおよびＴＤＥなど、トレハロースのジエステルからなる群より選択することができる。

適切な免疫標的化アジュバントの例には、ＣＤ４０リガンドおよびＣＤ４０抗体、またはこれらの特異的結合断片（上記の議論を参照されたい）、マンノース、Ｆａｂ断片、ならびにＣＴＬＡ−４が含まれる。

適切なポリマーアジュバントの例には、炭水化物、例えば、デキストラン、ＰＥＧ、デンプン、マンナン、およびマンノース；可塑性ポリマー；ならびにラテックスビーズなどのラテックスが含まれる。

免疫反応を調節するさらに別の興味深い方法は、「仮想リンパ節」（ＶＬＮ）（ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ， Ｉｎｃ．， ３６０ Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． １００１７−６５０１により開発された、特許品の医療デバイス）内に免疫原（場合によって、アジュバント、ならびに薬学的に許容されるキャリアおよびビヒクルと併せて）を組み込むことである。ＶＬＮ（細長型の管状デバイス）は、リンパ節の構造および機能を模倣する。ＶＬＮを皮下に挿入することにより、サイトカインおよびケモカインの急増による無菌的炎症部位が創出される。Ｔ細胞およびＢ細胞の他、ＡＰＣも、迅速に危険シグナルに応答し、炎症部位へと至り、ＶＬＮの多孔性マトリックスの内部に蓄積される。ＶＬＮを用いると、抗原に対する免疫反応を誘発するのに必要とされる抗原用量が低下し、ＶＬＮを用いるワクチン接種により付与される免疫的防御が、Ｒｉｂｉをアジュバントとして用いる従来の免疫化を凌駕することが示されている。この技法は、Ｇｅｌｂｅｒ Ｃら、１９９８年、「Ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｏｂｕｓｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｈｕｍｏｒａｌ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ Ｓｍａｌｌ Ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅ Ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ｔｈｅ Ｖｉｒｔｕａｌ Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅ」、１９９８年１０月１２〜１５日、カリフォルニア州、アプトス、シースケープリゾート、「Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃ， Ｂｏｏｋ ｏｆ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ」において略述されている。

ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰワクチンと共に、オリゴヌクレオチドをアジュバントとして用いることができ、少なくとも３つの、またはより好ましくは、少なくとも６つ以上のヌクレオチドにより隔てられた２つ以上のジヌクレオチドＣｐＧモチーフを含有することが好ましい。ＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチド（ここで、ＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化されていない）は、主にＴｈ１反応を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８、ならびに米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号において記載されている。

このようなオリゴヌクレオチドによるアジュバントは、デオキシヌクレオチドであり得る。好ましい実施形態では、該オリゴヌクレオチド内のヌクレオチド骨格は、ホスホロジチオエート結合であるか、またはより好ましくは、ホスホロチオエート結合であるが、骨格結合が混合したオリゴヌクレオチドを含め、ホスホジエステル骨格、また、ＰＮＡなど他のヌクレオチド骨格も本発明の範囲内にある。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたはホスホロジチオエートオリゴヌクレオチドを作製する方法は、米国特許第５，６６６，１５３、米国特許第５，２７８，３０２号、およびＷ０９５／２６２０４において記載されている。

好ましいオリゴヌクレオチドの例は、以下の配列を有する。配列は、ホスホロチオエート修飾されたヌクレオチド骨格を含有することが好ましい。

代替的な好ましいＣｐＧオリゴヌクレオチドには、これらに対する重要でない欠失または付加を伴う上記の配列が含まれる。アジュバントとしてのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知である任意の方法（例えば、ＥＰ４６８５２０）により合成することができる。自動合成器を用いてこのようなオリゴヌクレオチドを合成し得ることが好ましい。このようなオリゴヌクレオチドによるアジュバントは、１０〜５０塩基の長さであり得る。別のアジュバント系は、ＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチドと、サポニン誘導体との組合せを伴い、特に、ＣｐＧとＱＳ２１との組合せが、ＷＯ００／０９１５９において開示されている。

多くの単相または複相のエマルジョン系が記載されている。エマルジョンが、ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰの構造を破壊しないように、当業者は、ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰと共に用いられるこのようなエマルジョン系を容易に適合させることができる。水中油エマルジョンによるアジュバントは、それ自体で、アジュバント組成物として有用であることが示唆されており（ＥＰＯ３９９８４３Ｂ）、また、水中油エマルジョンと他の活性薬剤との組合せも、ワクチン用のアジュバントとして記載されている（ＷＯ９５／１７２１０；ＷＯ９８／５６４１４；ＷＯ９９／１２５６５；ＷＯ９９／１１２４１）。油中水エマルジョン（米国特許第５，４２２，１０９号；ＥＰ ０４８０９８２Ｂ２）、および水中油中水エマルジョン（米国特許第５，４２４，０６７；ＥＰ０４８０９８１Ｂ）など、他の油エマルジョンによるアジュバントが記載されている。

本明細書で記載されるＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰワクチンと共に用いられる油エマルジョンによるアジュバントは、天然の場合もあり、合成の場合もあり、また、鉱油性の場合もあり、有機油性の場合もある。鉱油および有機油の例は、当業者に容易に明らかである。

任意の水中油組成物が、ヒトへの投与に適するためには、エマルジョン系の油相が、代謝性油を包含することが好ましい。代謝性油という用語の意味は、当技術分野において周知である。代謝性とは、「代謝により変換可能であること」と定義することができる（「Ｄｏｒｌａｎｄ’ｓ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ」、Ｗ．Ｂ． Ｓａｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ社、第２５版（１９７４年））。油は、レシピエントに毒性でなく、代謝により変換可能な、任意の植物油、魚油、動物油、または合成油であることが可能である。堅果油（ラッカセイ油など）、種油、穀類油が、植物油の一般的な供給源である。合成油もまた本発明の一部であり、これらには、ＮＥＯＢＥＥ（登録商標）および他の油など、市販の油が含まれ得る。スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）は、サメの肝油中に高量で見出され、また、オリーブ油、コムギ胚種油、コメぬか油、および酵母中に低量で見出される不飽和油であり、本発明で用いるのに特に好ましい油である。スクアレンは、コレステロールの生合成における中間体であるという事実により、代謝性油である（「メルクインデックス」、第１０版、エントリー８６１９）。

特に好ましい油エマルジョンは水中油エマルジョンであり、特に、水中スクアレンエマルジョンである。

加えて、本発明の最も好ましい油エマルジョンによるアジュバントには、抗酸化剤が含まれ、油であるα−トコフェロール（ビタミンＥ；ＥＰ０３８２２７１Ｂ１）が好ましい。

ＷＯ９５／１７２１０およびＷＯ９９／１１２４１は、場合によって、免疫刺激剤であるＱＳ２１および／または３Ｄ−ＭＰＬと共に処方される、スクアレン、α−トコフェロール、ＴＷＥＥＮ ８０（ＴＭ）に基づくエマルジョンアジュバントを開示している。ＷＯ９９／１２５６５は、油相へのステロールの添加による、これらのスクアレンエマルジョンに対する改善を開示している。加えて、エマルジョンを安定化させるために、トリカプリリン（Ｃ２７Ｈ５０Ｏ６）などのトリグリセリドを、油相へと添加することもできる（ＷＯ９８／５６４１４）。

安定的な水中油エマルジョン中で見出される油滴のサイズは、光子相関分光分析により測定したときに、１ミクロン未満であることが好ましく、実質的に３０〜６００ｎｍの範囲内、好ましくは、実質的に直径約３０〜５００ｎｍ、また、最も好ましくは、実質的に直径１５０〜５００ｎｍ、また、特に直径約１５０ｎｍであり得る。この点で、油滴数の８０％が好ましい範囲内にあるべきであり、より好ましくは油滴数の９０％超、また、最も好ましくは油滴数の９５％超が規定のサイズ範囲内にある。本発明の油エマルジョン中に存在する成分の量は、従来、スクアレンなどの油が２〜１０％の範囲内であり；また、存在する場合、アルファトコフェロールが２〜１０％であり、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどの界面活性剤が０．３〜３％である。油：アルファトコフェロールの比率は、より安定的なエマルジョンがもたらされるため、１以下であることが好ましい。ＳＰＡＮ ８５（ＴＭ）もまた、約１％のレベルで存在し得る。一部の場合には、本明細書で開示されるＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰワクチンが、安定化剤をさらに含有することが有利であり得る。

水中油エマルジョンを作製する方法は、当業者に周知である。一般に、該方法は、油相を、ＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ８０（登録商標）溶液などの界面活性剤と混合し、その後、ホモジナイザーを用いるホモジナイゼーションを行うステップを包含するが、該混合物に、シリンジ針内を２回流過させるステップを含む方法が、少量の液体をホモジナイズするのには適切であることが、当業者には明らかである。同様に、当業者は、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍ１１０Ｓ型マイクロ流体作製器；最大入力圧６バールで２分間にわたり、最大５０回の流過（約８５０バールの出力圧））において乳化過程を適合させることで、より少量または多量のエマルジョンを作製することができる。この適合は、必要とされる直径の油滴を有する調製物が達成されるまでの、結果として得られるエマルジョンの測定を含む日常的な実験により達成し得る。

本明細書で開示されるＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰによるワクチン調製物は、該ワクチンを、鼻腔内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮内投与、経皮投与、静脈内投与、または皮下投与を介して投与することにより、ウイルス感染を受けやすいか、またはこれを患う、哺乳動物または鳥類を保護または処置するのに用いることができる。ワクチン調製物を全身投与する方法には、従来のシリンジおよび針、または固体ワクチンを弾道送達（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）するためにデザインされたデバイス（ＷＯ９９／２７９６１）、または針なしの高圧液体ジェットデバイス（米国特許第４，５９６，５５６号；米国特許第５，９９３，４１２号）、または経皮パッチ（ＷＯ９７／４８４４０；ＷＯ９８／２８０３７）が含まれ得る。ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰワクチンはまた、皮膚に適用することもできる（経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌまたはｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）送達；ＷＯ９８／２０７３４；ＷＯ９８／２８０３７）。したがって、本明細書で開示されるＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰワクチンは、ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰワクチンまたはアジュバント組成物を予め充填した全身投与用の送達デバイスを包含する。したがって、個体、好ましくは哺乳動物または鳥類において免疫反応を誘導する方法であって、本明細書で記載されるＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰ組成物のうちのいずれかを含み、また、場合によって、アジュバントおよび／またはキャリアを包含するワクチンを該個体へと投与するステップを含み、該ワクチンが、非経口経路または全身経路により投与される方法が提供される。

本発明のワクチン調製物は、該ワクチンを、経口／経消化管経路、または経鼻経路などの粘膜経路を介して投与することにより、ウイルス感染を受けやすいか、またはこれを患う、哺乳動物または鳥類を保護または処置するのに用い得ることが好ましい。代替的な粘膜経路は、膣内経路および直腸内経路である。好ましい経粘膜経路投与は、経鼻経路を介し、鼻腔内ワクチン接種と称する。免疫化される個体の鼻咽頭内へと、ワクチンの液滴形態、スプレー形態、または乾燥粉末形態を投与することを含め、鼻腔内ワクチン接種の方法は、当技術分野において周知である。したがって、噴霧化またはエアゾール化されたワクチン処方物が、本明細書で開示されるＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰワクチンの好ましい形態である。経口投与用の胃液耐性のカプセルおよび顆粒などの腸溶処方物、直腸内投与または膣内投与用の坐剤もまた、本明細書で開示されるＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰワクチンの処方物である。

本明細書で開示される、好ましいＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰによるワクチン組成物は、経粘膜ワクチン接種により全身ワクチン接種を代替するヒトにおける適用に適する経粘膜ワクチンのクラスの一例である。

ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰワクチンはまた、経口経路を介して投与することもできる。このような場合、薬学的に許容される賦形剤にはまた、アルカリ性緩衝液、または腸溶性のカプセルもしくはマイクロ顆粒も含まれ得る。ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰワクチンはまた、膣内経路によっても投与することができる。このような場合、薬学的に許容される賦形剤には、乳化剤、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）などのポリマー、また、膣内クリームおよび膣内坐剤の他の公知の安定化剤も含まれ得る。ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰワクチンはまた、直腸内経路によっても投与することができる。このような場合、賦形剤には、直腸内坐剤を形成するために当技術分野で公知のワックスおよびポリマーも含まれ得る。

代替的に、ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰによるワクチン処方物は、キトサン（上記で記載した）または他のポリカチオンポリマー、ポリラクチド粒子およびポリラクチド−コグリコリド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンベースのポリマーマトリックス、多糖または化学修飾した多糖からなる粒子、リポソームおよび脂質ベースの粒子、グリセロールモノエステルからなる粒子などからなるワクチンビヒクルと組み合わせることができる。サポニンはまた、コレステロールの存在下において処方して、リポソームまたはＩＳＣＯＭなどの粒子構造を形成することもできる。さらに、サポニンは、非粒子状の溶液もしくは懸濁物中、または小ラメラ（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌａｒ）リポソームもしくはＩＳＣＯＭなどの粒子状構造内において、ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステルと併せて処方することもできる。

本明細書で記載されるＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰを用いる医薬組成物およびワクチン組成物中で用いられる、さらなる例示的なアジュバントには、ＳＡＦ（米国、カリフォルニア州、Ｃｈｉｒｏｎ社製）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ社製、例えば、Ｇｒａｎｏｆｆら（１９９７年）、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．、６５巻（５号）：１７１０〜１７１５頁を参照されたい）、ＳＢＡＳシリーズのアジュバント（例えば、ＳＢ−ＡＳ２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ社製のアジュバントシステム♯２；ＭＰＬおよびＱＳ２１を含有する水中油エマルジョン）；ＳＢＡＳ−４（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ社製のアジュバントシステム♯４；ミョウバンおよびＭＰＬを含有する）、ベルギー、リクセンサルト、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ社から市販されている）、Ｄｅｔｏｘ（Ｅｎｈａｎｚｙｎ（登録商標））（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社製）、ＲＣ−５１２、ＲＣ−５２２、ＲＣ−５２７、ＲＣ−５２９、ＲＣ−５４４、およびＲＣ−５６０（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社製）、ならびに、係属中の米国特許出願第０８／８５３，８２６号、および同第０９／０７４，７２０号において記載されるものなどの、他のアミノアルキルグルコサミド４−ホスフェート（ＡＧＰ）が含まれる。

アジュバントの他の例には、ＨｕｎｔｅｒによるＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）アジュバント（ジョージア州、ノークロス、ＣｙｔＲｘ社製）；Ｇｅｒｂｕアジュバント（ドイツ、ガイベルク、Ｇｅｒｂｕ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ社製）；ニトロセルロース（ＮｉｌｓｓｏｎおよびＬａｒｓｓｏｎ（１９９２年）、Ｒｅｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３巻：５５３〜５５７頁）；Ｓｅｐｐｉｃ ＩＳＡシリーズのＭｏｎｔａｍｉｄｅアジュバント（例えば、ＩＳＡ−５１、ＩＳＡ−５７、ＩＳＡ−７２０、ＩＳＡ−１５１など；フランス、パリ、Ｓｅｐｐｉｃ社製）など、鉱油エマルジョン、非鉱油エマルジョン、油中水エマルジョン、または水中油エマルジョンを含めたミョウバン（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）エマルジョンベースの処方物；およびＰＲＯＶＡＸ（登録商標）（ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製）；ＯＭ−１７４（脂質Ａと関連するグルコサミンジサッカリド）； Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属の伸長因子；ＣＲＬ １００５など、ミセルを形成する非イオン性のブロックコポリマー；ならびにＳｙｎｔｅｘアジュバント処方物が含まれるがこれらに限定されない。例えば、Ｏ’Ｈａｇａｎら（２００１年）、Ｂｉｏｍｏｌ Ｅｎｇ．、１８巻（３号）：６９〜８５頁；および「Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ： Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、Ｄ． Ｏ’Ｈａｇａｎ編（２０００年）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ社を参照されたい。

他の好ましいアジュバントには、一般式
ＨＯ（ＣＨ _２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ａ−Ｒ， （Ｉ）
［式中、ｎは１〜５０であり、Ａは結合または−−Ｃ（Ｏ）−−であり、ＲはＣ_１〜５０アルキル、またはフェニルＣ_１〜５０アルキルである］のアジュバント分子が含まれる。

本発明の一実施形態は、一般式（Ｉ）［式中、ｎは１〜５０、好ましくは４〜２４、最も好ましくは９であり；Ｒ成分はＣ_１〜５０、好ましくはＣ_４〜Ｃ_２０アルキル、また最も好ましくはＣ_１２アルキルであり；また、Ａは結合である］のポリオキシエチレンエーテルを含むワクチン処方物からなる。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、また最も好ましくは０．１〜１％の範囲であるべきである。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステアリルエーテル（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−９−ｓｔｅｏｒｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ポリオキシエチレン−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテルから選択される。ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンエーテルは、「メルクインデックス」（第１２版；エントリー７７１７）で記載されている。これらのアジュバント分子は、ＷＯ９９／５２５４９で記載されている。

所望の場合、上記の一般式（Ｉ）に従うポリオキシエチレンエーテルを、別のアジュバントと組み合わせることができる。例えば、好ましいアジュバントの組合せは、上で記載したＣｐＧとの組合せであることが好ましい。

本明細書で開示されるＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰワクチンと共に用いるのに適する、薬学的に許容される賦形剤のさらなる例には、水、リン酸緩衝生理食塩液、等張性緩衝液が含まれる。

本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することにより、よりよく理解される。本明細書で記載される通り、本発明は、必要に応じて、抗原またはアジュバントに連結したさらなる脂質ラフト会合ポリペプチドを含む、ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰを包含する。以下の実施例では、ＲＳウイルスＦポリペプチドのＶＬＰを含む、本発明の代表的な実施形態が記載される。

（実施例１）
この実施例は、細胞質側末端領域を欠失しているＲＳＶ融合（Ｆ）糖タンパク質の切断型、またはインフルエンザ赤血球凝集素由来の膜貫通領域および細胞質側末端領域を含有するハイブリッドＦタンパク質の哺乳動物細胞発現が、ＲＳＶ Ｆを含有するエンベロープウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形成をもたらすことを実証する。

この実施例は、マウス白血病ウイルスＧａｇ遺伝子産物との共発現で、または共発現ではなくＲＳＶ Ｆ糖タンパク質が哺乳動物細胞において発現されるように設計された。期待されるのは、ＲＳＶ Ｆが細胞から出芽するエンベロープＧａｇ ＶＬＰに組み込まれることであった。

プラスミドｐ３．１−ＲＳＶＦＴは、細胞質側末端を欠いているが天然の膜貫通ドメインを含有しているＦ（ＲＳＶＦＴ）の切断型をコードした。ｐ３．１−ＲＳＶＦＴの地図を図１に示し、ＲＳＶＦＴのコード配列は以下の通りである。

天然ＲＳＶ Ｆ遺伝子が、細胞の細胞質で複製するパラミクソウイルス由来であり、したがって細胞の核において適切に発現されないと予測されることから、ＲＳＶＦＴコード配列は、カスタム合成ＤＮＡ断片として合成し、ウイルスからはクローニングしなかった。コードされたＲＳＶＦＴのアミノ酸配列（シグナルペプチドおよび膜貫通ドメインを大文字で示す）は以下の通りである。

プラスミドｐ３．１−ｓｈＦｖ１は、インフルエンザＡ由来のＨ５赤血球凝集素の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端に融合したＲＳＶ Ｆの外部ドメインからなるハイブリッドタンパク質をコードした。図２は、ｐ３．１−ｓｈＦｖ１の地図を示し、ｓｈＦｖ１のコード配列は以下の通りである。

ｓｈＦｖ１のアミノ酸配列（シグナルペプチドコード配列ならびにＨＡ膜貫通および細胞質側末端配列を大文字で示す）は以下の通りである。

ＲＳＶＦＴと同様にｓｈＦｖ１コード配列は、ＤＮＡ合成によって作製した。

プラスミドｐ３．１−ｓｈＦｖ２は、インフルエンザＡ由来のＨ５赤血球凝集素の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端に融合したＲＳＶ Ｆの外部ドメインからなるハイブリッドタンパク質をコードした。ｓｈＦｖ２は、インフルエンザＨＡ由来膜貫通および末端領域が４アミノ酸長いことにおいてｓｈＦｖ１と異なった。図３は、ｐ３．１−ｓｈＦｖ２のプラスミド地図を示す。ｓｈＦｖ２のコード配列は以下の通りである。

ｓｈＦｖ２のアミノ酸配列（シグナルペプチドコード配列ならびにＨＡ膜貫通および細胞質側末端配列を大文字で示す）は以下の通りである。

ｓｈＦｖ２コード配列は、ＤＮＡ合成によって作製した。

プラスミドｐ３．１−Ｇａｇは、マウス白血病ウイルス由来のＧａｇ遺伝子産物をコードした。図４は、ｐ３．１Ｇａｇのプラスミド地図を示す。プラスミドｐ３．１−Ｇａｇ由来のＧａｇのコード配列は以下の通りである。

ＭＬＶ Ｇａｇのアミノ酸配列は以下の通りである。

Ｇａｇ遺伝子は、プラスミドｐＡＭＳ（ＡＴＣＣ）において見出されたＭＬＶのゲノム由来の天然クローンを表した。

１０ｃｍ^２組織培養皿８枚に、１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地で培養した２９３−Ｆ細胞を接種した。細胞がおよそ９５％コンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）（単層培養）に達したときに、各ウエルに以下のように：

プラスミドＤＮＡ合計４μｇをトランスフェクトした。

プラスミドＤＮＡをＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＴＭ）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の推奨に従って使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの８時間後、トランスフェクション培地をＣＤ２９３無血清培地で置換し、培養を継続した。トランスフェクションの４８時間後、ＲＳＶ Ｆ発現ベクターのいずれかをトランスフェクトした細胞を含むすべての皿は、正しくフォールドしたＦの表面発現と一致して有意なレベルの合胞体（融合細胞）を示した。トランスフェクションの４８時間後、ピペッティングによって細胞を剥離し、細胞および培地を収集した。細胞の表面でのＲＳＶ Ｆ抗原活性の発現を、膜に組み込まれた（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）状態において正しくフォールドしたＦ抗原を認識するマウスモノクローナル抗体（９Ｃ５）での細胞染色後のフローサイトメトリーによってさらに実証した。細胞をＦ−陽性細胞の蛍光検出のためにフィコエリトリンに結合体化したヤギ抗マウス２次抗体とさらに反応させた。図５は、Ｇａｇベクターと共にまたは共にではなくＦ発現ベクターのいずれかをトランスフェクトした細胞でのＦの有意なレベルの表面発現を実証するフローサイトメトリー実施からのヒストグラムを示す。これらのデータは、トランスフェクトした細胞集団における合胞体の存在と一致し、細胞表面上で正しくフォールドされたＦ抗原の存在を実証する。

トランスフェクトした細胞から収集した増殖培地を合胞体およびすべての細胞細片を除去するために２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、このステップからの上清をトリス緩衝生理食塩水中の３０％ショ糖クッション上で１００，０００×ｇで１時間遠心分離して、すべてのＶＬＰ（Ｇａｇおよび／またはＦ遺伝子発現の結果として培地中に放出された可能性がある）を収集した。このステップからの１００，０００×ｇペレットを追加的分析のためにトリス緩衝生理食塩水に再懸濁した。

超遠心分離ステップ由来の再懸濁したペレットを、ＶＬＰ形成の指標としてのＧａｇ産物の存在を検出するためにウエスタンブロット分析に供した。予測外に、顕著な量のＧａｇ産物をｐ３．１−Ｇａｇベクターだけをトランスフェクトした細胞由来の試料中で検出したが、Ｆ遺伝子ベクターのいずれかとの組合せでｐ３．１−Ｇａｇをトランスフェクトした細胞由来のペレットにおいては顕著に減少した量のＧａｇが見出された。結果は、Ｆ遺伝子産物の発現がＧａｇ産物の出芽機能をある様式で干渉することと一致している。

再懸濁した超遠心分離ペレット中のＦ抗原の存在を次にＥＬＩＳＡによって以下の通り検査した：再懸濁した各超遠心分離ペレット試料をＮｕｎｃ ＭＡＸＩＳＯＲＰ（ＴＭ）平底９６ウエルＥＬＩＳＡプレートの列Ａの１つのウエルに入れ、各試料をプレートの各カラムを下がりながら連続的に２倍希釈した。４℃、１晩のコーティング後、プレートを０．０５％ＴＷＥＥＮ２０（ＴＭ）を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄し、次いでＳＴＡＲＴＩＮＧ ＢＬＯＣＫ（ＴＭ）（ＰＢＳ）（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でブロックした。ブロッキング後、ＳＴＡＲＴＩＮＧ ＢＬＯＣＫ Ｔ２０（ＴＭ）（Ｐｉｅｒｃｅ）中に１：１０００希釈したモノクローナル抗体９Ｃ５ １００μｌを各ウエルに入れ、プレートを室温で３時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、ＳＴＡＲＴＩＮＧ ＢＬＯＣＫ Ｔ２０（ＴＭ）中に１：１０００希釈したヤギ抗マウスＨＲＰ結合体化抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）１００μｌを各ウエルに添加し、室温で１．５時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔでの最終洗浄（３×）に続いて、プレートをＡＢＴＳ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）１００μｌの添加によって発色（ｄｅｖｅｌｏｐ）させ、室温、４５分間インキュベートした。

図６は、このＥＬＩＳＡの結果を示し、顕著なレベルのＲＳＶ Ｆ抗原が、Ｆ遺伝子だけおよびＦ遺伝子＋Ｇａｇ遺伝子でのトランスフェクションの両方に由来する１００，０００×ｇペレットにおいて検出されたことが観察され得る。重要かつ予測外に、より多いＲＳＶ Ｆ抗原活性がＲＳＶ Ｆ遺伝子だけをトランスフェクトした細胞由来のペレットにおいて観察された。これらのデータは、Ｆ遺伝子単独の発現（Ｇａｇ発現の非存在下）がＦ抗原を保有するＶＬＰの形成をもたらすことを実証する。これは、おそらくＦによるＧａｇ出芽の干渉によって、ＦとＧａｇとの共発現がＧａｇ出芽の抑制を生じさせるという上の観察とも一致する。

（実施例２）
この実施例は、ｐ３．１−ＲＳＶＦＴベクターだけをトランスフェクトした哺乳動物細胞の培地中に放出されたＲＳＶ Ｆ ＶＬＰの電子顕微鏡観察を記載する。

ＲＳＶ Ｆ遺伝子だけの発現が、単なるＲＳＶ Ｆ凝集物ではなくＶＬＰの放出を生じさせることを実証するために、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地中に２９３−Ｆ細胞をおよそ９５％コンフルエンスでそれぞれ含むＴ７５組織培養フラスコ５個をｐ３．１−ＲＳＶＦＴ ３０μｇおよびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＴＭ）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）７５μｌで製造者の仕様書に従ってトランスフェクトした。トランスフェクションの８時間後にトランスフェクション培地を除去し、ＣＤ２９３無血清培地で置換した。トランスフェクションの４８時間後に顕著なレベルの浮遊合胞体が培地中に観察されたが、これはＲＳＶ Ｆ遺伝子の発現と一致する。この時点で増殖培地を収集し、合胞体および細胞細片を２０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離によって除去した。次いで培地上清をトリス緩衝生理食塩水中の３０％ショ糖クッション上で１００，０００×ｇ、１時間、１０℃で遠心分離してＶＬＰを収集した。この遠心分離ステップ由来のペレットを、次いで合計３００μｌのトリス緩衝生理食塩水中に再懸濁した。再懸濁したペレットを次いで低速（およそ５０００ｐｍ）で短時間遠心分離して、超遠心分離法によって形成されたすべての不可逆的タンパク質沈殿物または凝集物を除去した。再懸濁したＶＬＰ調製物を次いで、酢酸ウラニルネガティブ染色を使用する透過型電子顕微鏡によって検査し、代表的な顕微鏡像を図７に示す。顕微鏡像の収集物は、形状およびサイズの両方での多様性を示すエンベロープ粒子または小胞粒子の顕著なアレイを示した。このような多形性の粒子集団は、タンパク質コアを欠いている出芽粒子の形成と一致する。

（実施例３）
この実施例は、バキュロウイルス粒子と高度に凝集するＲＳＶ Ｆ ＶＬＰを生じさせた、バキュロウイルス発現系を使用する昆虫細胞でのＲＳＶ Ｆ ＶＬＰの発現を記載する。

実施例２に記載した哺乳動物細胞発現系の使用の代替として昆虫細胞バキュロウイルス発現系でＲＳＶ Ｆ ＶＬＰを作製するための試みにおいて、ｓｈＦｖ１のコード配列を含有するＤＮＡ断片をプラスミドｐＦａｓｔｂａｃ１にクローニングし、プラスミドｐＦＢ−ｓｈＦｖ１を得た。ｐＦＢ−ｓｈＦｖ１の地図を図８に示す。ｓｈＦｖ１遺伝子のコード配列およびコードされたアミノ酸配列は上に記載の通りである。プラスミドｐＦＢ−ｓｈＦｖ１を、高分子量バクミド（ｂａｃｍｉｄ）中にバキュロウイルスゲノムを含有するＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞への形質転換によってバキュロウイルスゲノム中に組み換えた。形質転換されたクローンの選択に続いて、高分子量バクミドＤＮＡをこれらの細菌クローンから調製し、ｓｈＦｖ１遺伝子を含有する組換えバキュロウイルスを作製するためのＳｆ９昆虫細胞のトランスフェクションに使用した。この系を使用する組換えバキュロウイルス作製に関わる手順の詳細は、ｗｅｂｓｉｔｅ ｔｏｏｌｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍのｆｉｌｅ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｂａｃｔｏｂａｃ＿ｍａｎ．ｐｄｆのＰＤＦドキュメントに見出すことができる。

ＲＳＶ Ｆ ＶＬＰを作製するために、ＳＦ９００−ＩＩ培地中で増殖しているＳｆ９細胞の２００ｍｌスピナー培養物３個を２７℃で細胞密度が１ｍｌあたり細胞２×１０^６個に達するまでインキュベートした。その時点で２継代ｓｈＦｖ１−組換えバキュロウイルス調製物２０ｍｌを各スピナーフラスコに添加し、培養物を２７℃で細胞生存率が２０％未満に下がるまでインキュベートした。次いで培養液を収集し、２ｋ ｒｐｍで１５分間遠心分離することによって細胞および細片を清澄化した。清澄化した培地を３２ｍｌ一定分量に分け、１００，０００×ｇで１時間、１０℃で、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、ｐＨ７．４および０．０５％ＴＷＥＥＮ ２０（ＴＭ）を含有する３０％ショ糖クッション４ｍｌ上で遠心分離した。ペレットを０．０５％ＴＷＥＥＮ ２０（ＴＭ）を含有するＴＢＳ合計１２ｍｌに再懸濁し、この材料を６ｍｌ一定分量２個に分け、ＴＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ ２０（ＴＭ）中の２０〜６０％ショ糖密度勾配上で遠心分離した。勾配を底から分画した。ＲＳＶ Ｆ抗原活性を個々の勾配画分において実施例１に記載のＥＬＩＳＡ法によって９Ｃ５モノクローナル抗体を使用して、以下の変更を伴って検出した：高濃度のショ糖はＥＬＩＳＡアッセイを妨げることから、各勾配画分１．５ｍｌの試料１００μｌをＴＢＳで１０倍希釈し、存在したすべてのＶＬＰをショ糖溶液からペレット化させるために１００，０００×ｇで４０分間遠心分離した。これらの試料をＴＢＳに再懸濁し、実施例１に記載のＥＬＩＳＡアッセイに直接使用した。ＥＬＩＳＡアッセイの結果を図９にプロットし、これは、それぞれ画分５および９中の２つの可視の薄いバンドと一致するＲＳＶ Ｆ抗原活性の２つの顕著なピークを示す。凝集したＶＬＰは典型的にはより高密度（より低い画分）にバンド形成することから、画分９中のバンドは凝集していないＶＬＰを含有すると予測された。しかし画分９中の物質の電子顕微鏡検査は、高度に凝集したＶＬＰおよびバキュロウイルス粒子を明らかにした。代表的な電子顕微鏡像を図１０に示す。したがって、凝集していないＲＳＶ Ｆを含有するＶＬＰの作製および精製のためには哺乳動物細胞発現系がより適切であることが決定された。

（実施例４）
この実施例は、合胞体形成活性を欠いているがＶＬＰ出芽活性、Ｇａｇ阻害活性およびモノクローナル中和抗体９Ｃ５との反応性を保持しているＲＳＶ ＦのＧＰＩ−アンカー型の発現を実証する。

脂質ラフトドメインを標的とするがそれ自身のＶＬＰ出芽活性を欠いている改変Ｆタンパク質の作製をコードする改変ＲＳＶ Ｆ遺伝子コード配列を作製するための試みがなされた。この目的は、ハイブリッドＧａｇ−Ｆ ＶＬＰが、Ｆ遺伝子産物が位置する脂質ラフトドメインから出芽するためのＧａｇタンパク質の能力を介して作製され得るように、ＭＬＶ Ｇａｇの出芽活性と適合性があるＦ遺伝子産物を供給することであった。このために膜貫通および細胞質側末端のコード配列を切断し、それらをＧＰＩアンカーシグナルをコードする配列で置換することによってＦ遺伝子を改変した。ＧＰＩアンカーシグナルは、Ｆ糖タンパク質外部ドメインを脂質ラフト位置に方向付けるが、しかしこれらの脂質ラフト位置でＦポリペプチド配列の細胞膜貫通は無いことが予測された。この改変が、キメラＧａｇ−Ｆ ＶＬＰを形成するこれらの位置からの出芽のためのＧａｇ ＶＬＰの能力をもたらすことが予測された。しかし驚くべきことに、ＲＳＶ ＦのＧＰＩ−アンカー形態は、依然としてＶＬＰ出芽活性を示し、このことは、任意の脂質ラフト会合ポリペプチドを使用してＲＳＶ Ｆポリペプチドを脂質ラフトへ方向付けて、ＲＳＶ Ｆポリペプチド単独でのＶＬＰ出芽を可能にすることができることを実証した。

図１１は、ヒトカルボキシペプチダーゼＭのＧＰＩアンカーシグナルに融合したキメラＦタンパク質がコードされた発現ベクターｐ３．１−Ｆ−ＧＰＩの地図を示す。プラスミドｐ３．１−Ｆ−ＧＰＩ由来のＦ−ＧＰＩコード配列のヌクレオチド配列は、以下の通りである。

ヒトカルボキシペプチダーゼＭのＧＰＩアンカーシグナルに融合したＲＳＶ Ｆの外部ドメインからなるＦ−ＧＰＩキメラタンパク質のアミノ酸配列は、（ＧＰＩアンカーシグナルを大文字で示す）以下の通りである。

発現試験を、プラスミドｐ３．１−Ｇａｇもしくはｐ３．１−Ｆ−ＧＰＩまたはｐ３．１−Ｇａｇとｐ３．１−Ｆ−ＧＰＩとの組合せをトランスフェクトした２９３Ｆ細胞においてＲＳＶ Ｆ外部ドメインも保有するＧａｇ ＶＬＰが作製され得ることを実証する目的で実施した。

１０ｃｍ^２組織培養皿１２枚に、１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地で培養した２９３−Ｆ細胞を接種した。細胞がおよそ９５％コンフルエンス（単層培養）に達したときに、各ウエルに以下のように：

プラスミドＤＮＡ合計４μｇをトランスフェクトした。

プラスミドＤＮＡをＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＴＭ）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の推奨に従って使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの８時間後、トランスフェクション培地をＣＤ２９３無血清培地に置換し、培養を継続した。トランスフェクションの４８時間後、ｐ３．１−Ｆ−ＧＰＩ発現ベクターをトランスフェクトした細胞を含む皿は、顕著なレベルの合胞体（融合細胞）を示さず、このことは、Ｆ糖タンパク質のＧＰＩアンカー改変が細胞融合を促進するＦ糖タンパク質の能力に干渉したことを示唆していた。

トランスフェクションの４８時間後、ピペッティングによって細胞を剥離し、細胞および培地を収集した。細胞の表面でのＲＳＶ Ｆ抗原活性の発現を、膜に組み込まれた状態において正しくフォールドしたＦ抗原を認識するマウスモノクローナル抗体（９Ｃ５）での細胞染色後のフローサイトメトリーによって実証した。細胞をＦ−陽性細胞の蛍光検出のためにフィコエリトリンに結合体化したヤギ抗マウス２次抗体とさらに反応させた。図１２は、Ｇａｇベクターと共にまたは共にではなくｐ３．１−Ｆ−ＧＰＩベクターをトランスフェクトした細胞上での有意なレベルのＦの表面発現を実証するフローサイトメトリー実施からのヒストグラムを示す。これらのデータは、合胞体形成活性はもはや存在しないにもかかわらず、細胞表面上で正しくフォールドされたＦ抗原の存在を実証した。

トランスフェクトした細胞から収集した増殖培地を細胞および細片を除去するために２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、このステップからの上清をトリス緩衝生理食塩水中の３０％ショ糖クッション上で１００，０００×ｇで１時間遠心分離して、すべてのＶＬＰ（Ｇａｇおよび／またはＦ−ＧＰＩ遺伝子発現の結果として培地中に放出された可能性がある）を収集した。このステップからの１００，０００×ｇペレットを追加的分析のためにトリス緩衝生理食塩水に再懸濁した。

超遠心分離ステップからの再懸濁ペレットを、ＶＬＰ形成の指標としてのＧａｇ産物の存在を検出するためのウエスタンブロット分析に供した。予測外に、顕著な量のＧａｇ産物がｐ３．１−Ｇａｇベクターだけをトランスフェクトした細胞由来の試料中で検出されたが、ｐ３．１−Ｆ−ＧＰＩベクターと組み合わせてｐ３．１−Ｇａｇをトランスフェクトした細胞由来のペレットにおいてはＧａｇが見出されたとしてもこれは少量であった。これらの結果は、キメラＦ産物の脂質ラフト標的化機構が変化し、その膜貫通および細胞質側末端領域が除かれているにもかかわらず、Ｆ−ＧＰＩ遺伝子産物の発現がＧａｇタンパク質の出芽機能を依然として干渉することを実証した。これらの結果を図１３に示し、これは、ＧａｇおよびＲＳＶ Ｆについてのウエスタンブロットを示す。ＲＳＶウエスタンブロットは、Ｆ抗原活性がＦ−ＧＰＩおよびＦ−ＧＰＩ＋Ｇａｇトランスフェクションの由来のペレットにおいて見出されたことを示し、Ｇａｇの有無がＦ−ＧＰＩ媒介出芽および粒子形成に影響しないことを示した。

再懸濁した超遠心分離ペレット中のＦ抗原の存在をＥＬＩＳＡによっても以下の通り検査した：再懸濁した超遠心分離ペレットの各試料をＮｕｎｃ ＭＡＸＩＳＯＲＰ（ＴＭ）平底９６ウエルＥＬＩＳＡプレートの列Ａのウエル１つに入れ、各試料をプレートの各カラムを下がりながら連続的に２倍希釈した。４℃、１晩のコーティング後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄し、次いでＳＴＡＲＴＩＮＧ ＢＬＯＣＫ（ＴＭ）（ＰＢＳ）（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でブロックした。ブロッキング後、ＳＴＡＲＴＩＮＧ ＢＬＯＣＫ（ＴＭ）Ｔ２０（Ｐｉｅｒｃｅ）中に１：１０００希釈したモノクローナル抗体９Ｃ５ １００μｌを各ウエルに入れ、プレートを室温で３時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、ＳＴＡＲＴＩＮＧ ＢＬＯＣＫ（ＴＭ）Ｔ２０中に１：１０００希釈したヤギ抗マウスＨＲＰ結合体化抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）１００μｌを各ウエルに添加し、室温で１．５時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔでの最終洗浄（３×）に続いて、プレートをＡＢＴＳ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）１００μｌの添加によって発色させ、室温で４５分間インキュベートした。

図１４は、このＥＬＩＳＡの結果を示し、顕著なレベルのＲＳＶ Ｆ抗原活性が、Ｆ−ＧＰＩだけおよびＦ−ＧＰＩ＋Ｇａｇベクターをトランスフェクトした細胞両方に由来する１００，０００×ｇペレットにおいて検出されたことが観察され得る。重要なことに、等量のＲＳＶ Ｆ抗原活性がＦ−ＧＰＩおよびＦ−ＧＰＩ＋Ｇａｇベクターをトランスフェクトした細胞由来のペレットにおいて観察された。これらのデータは、Ｆ−ＧＰＩ遺伝子単独での発現が（Ｇａｇ発現の非存在下で）Ｆ−ＧＰＩ抗原を保有するＶＬＰの形成を生じさせるという結論と一致する。これはまた、おそらくＦ−ＧＰＩによるＧａｇ出芽の干渉により、Ｆ−ＧＰＩとＧａｇとの共発現がＧａｇ出芽の抑制を生じさせるという上の観察とも一致する。したがってＧＰＩアンカーシグナルの切断および付加によるＦポリペプチドの改変は、Ｆの出芽活性を破壊せず、Ｇａｇ出芽に対する阻害効果も無効にしない。この実験は、Ｆ−ＧＰＩ出芽粒子が、９Ｃ５モノクローナル抗体によって検出されるＦ抗原活性に関して生のＲＳＶビリオンと同様に挙動することも示す。

（さらなる参考文献）

Claims (30)

1. ＲＳウイルスＦポリペプチドを含むウイルス様粒子調製物を免疫原性量で含む、ＲＳウイルス感染を処置または予防するための組成物であって、前記ウイルス様粒子はエンベロープウイルスコアを含まず、かつ前記ウイルス様粒子が他のウイルス様粒子と凝集しておらず、ここで抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体はＲＳウイルスＦポリペプチドに結合する、組成物。
2. ＲＳウイルスＦポリペプチドを含むウイルス様粒子調製物を免疫原性量で含む、ＲＳウイルス感染に対する防御を提供するための組成物であって、前記ウイルス様粒子は、多形性であるか、サイズが不均一であるか、または形状が不均一であり、前記ウイルス様粒子はエンベロープウイルスコアを含まず、かつ前記ウイルス様粒子が他のウイルス様粒子と凝集しておらず、ここで抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体はＲＳウイルスＦポリペプチドに結合する、組成物。
3. ＲＳウイルスＦポリペプチドを含むウイルス様粒子調製物を免疫原性量で含む、ＲＳウイルス感染を処置または予防するための組成物であって、前記ウイルス様粒子はエンベロープウイルスコア形成ポリペプチドを含まず、かつ前記ウイルス様粒子が他のウイルス様粒子と凝集しておらず、ここで抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体はＲＳウイルスＦポリペプチドに結合する、組成物。
4. ＲＳウイルスＦポリペプチドを含むウイルス様粒子調製物を免疫原性量で含む、ＲＳウイルス感染に対する防御を提供するための組成物であって、前記ウイルス様粒子はエンベロープウイルスコア形成ポリペプチドを含まず、かつ前記ウイルス様粒子が他のウイルス様粒子と凝集しておらず、ここで抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体はＲＳウイルスＦポリペプチドに結合する、組成物。
5. ヒトにおけるＲＳウイルス感染を処置または予防するための、請求項１または請求項３に記載の組成物。
6. ヒトにおけるＲＳウイルス感染に対する防御を提供するための、請求項２または請求項４に記載の組成物。
7. 前記ウイルス様粒子が哺乳動物グリコシル化を含む、請求項１から６のいずれかに記載の組成物。
8. 前記ウイルス様粒子がウイルスベクター粒子と会合していない、請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
9. 前記ウイルス様粒子と混合したアジュバントをさらに含む、請求項１から８のいずれかに記載の組成物。
10. 前記アジュバントが前記ウイルス様粒子の外側に位置する、請求項９に記載の組成物。
11. 前記アジュバントが前記ウイルス様粒子の内側に位置する、請求項９に記載の組成物。
12. 前記アジュバントが前記ＲＳウイルスＦポリペプチドに共有結合されて、共有結合を形成している、請求項９から１１のいずれかに記載の組成物。
13. 前記アジュバントがリン酸アルミニウムである、請求項９から１２のいずれかに記載の組成物。
14. 前記抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体が９Ｃ５である、請求項１から１３のいずれかに記載の組成物。
15. ＲＳウイルスＦポリペプチドを含むウイルス様粒子の集団を作製する方法であって、
    （ａ）ＲＳウイルスＦポリペプチドを発現する発現ベクターを供給するステップと、
    （ｂ）前記発現ベクターを培地中の哺乳動物細胞内へと導入するステップと、
    （ｃ）前記ＲＳウイルスＦポリペプチドを発現させて、前記ＲＳウイルスＦポリペプチドを含むウイルス様粒子を作製するステップと
    を含み、前記ウイルス様粒子はエンベロープウイルスコアを含まず、かつ前記ウイルス様粒子が他のウイルス様粒子と凝集していない、方法。
16. ＲＳウイルスＦポリペプチドを含むウイルス様粒子の集団を作製する方法であって、
    （ａ）ＲＳウイルスＦポリペプチドを発現する発現ベクターを供給するステップと、
    （ｂ）前記発現ベクターを培地中の哺乳動物細胞内へと導入するステップと、
    （ｃ）前記ＲＳウイルスＦポリペプチドを発現させて、前記ＲＳウイルスＦポリペプチドを含むウイルス様粒子を作製するステップと
    を含み、前記ウイルス様粒子は、多形性であるか、サイズが不均一であるか、または形状が不均一であり、前記ウイルス様粒子は、エンベロープウイルスコアを含まず、かつ前記ウイルス様粒子が他のウイルス様粒子と凝集していない、方法。
17. ＲＳウイルスＦポリペプチドを含むウイルス様粒子の集団を作製する方法であって、
    （ａ）ＲＳウイルスＦポリペプチドを発現する発現ベクターを供給するステップと、
    （ｂ）前記発現ベクターを培地中の哺乳動物細胞内へと導入するステップと、
    （ｃ）前記ＲＳウイルスＦポリペプチドを発現させて、前記ＲＳウイルスＦポリペプチドを含むウイルス様粒子を作製するステップと
    を含み、前記ウイルス様粒子はエンベロープウイルスコア形成ポリペプチドを含まず、かつ前記ウイルス様粒子が他のウイルス様粒子と凝集していない、方法。
18. 前記哺乳動物細胞が培養されている前記培地から、前記ＲＳウイルスＦポリペプチドを含むウイルス様粒子を取り出すステップをさらに含む、請求項１５から１７のいずれかに記載の方法。
19. 前記発現ベクターがウイルスベクターである、請求項１５から１８のいずれかに記載の方法。
20. 前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびレトロウイルスからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記哺乳動物細胞が、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ ３８細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＲＤ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨＵＴ細胞、ＳＵＰＴ細胞、Ｃ８１６６細胞、ＭＯＬＴ４／クローン８細胞、ＭＴ−２細胞、ＭＴ−４細胞、Ｈ９細胞、ＰＭ１細胞、ＣＥＭ細胞、骨髄腫細胞、ＳＢ２０細胞、ＬｔＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＷＩ−３８細胞、Ｌ２細胞、ＣＭＴ−９３、およびＣＥＭＸ１７４細胞からなる群より選択される、請求項１５から２０のいずれかに記載の方法。
22. 抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体が、前記発現されたＲＳウイルスＦポリペプチドに結合する、請求項１５から２１のいずれかに記載の方法。
23. 前記抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体が９Ｃ５である、請求項２２に記載の方法。
24. 前記組成物が被験体における防御的免疫化反応を誘導する、請求項１または３に記載の組成物。
25. 前記組成物の投与が、皮下送達、経皮送達、皮内送達、真皮下送達、筋肉内送達、経口による送達、経口送達、鼻腔内送達、口腔内送達、舌下送達、腹腔内送達、膣内送達、経肛門送達、および頭蓋内送達からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１、３および２４のいずれかに記載の組成物。
26. 請求項１から１４のいずれかに記載の組成物を含む、医薬組成物。
27. 薬学的に許容される塩をさらに含む、請求項２６に記載の医薬組成物。
28. 前記薬学的に許容される塩がヒスチジンに由来する、請求項２７に記載の医薬組成物。
29. 前記組成物の投与用量が１０μｇ〜１００μｇの範囲であることを特徴とする、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
30. 前記組成物の投与が、皮下送達、経皮送達、皮内送達、真皮下送達、筋肉内送達、経口による送達、経口送達、鼻腔内送達、口腔内送達、舌下送達、腹腔内送達、膣内送達、経肛門送達、および頭蓋内送達からなる群より選択されることを特徴とする、請求項２または４に記載の組成物。