JP6001974B2 - アポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープを含むＤＮＡワクチン - Google Patents

Description

本発明は、動脈硬化症の治療や予防に有効なＤＮＡワクチンに関する。

リポプロテイン（ａ）［Ｌｐ（ａ）］は、単一のジスルフィド結合を介して結合した、１分子のアポリポプロテインＢ−１００（ａｐｏＢ）とアポリポプロテイン（ａ）［ａｐｏ（ａ）］、並びにコレステロールリッチな低密度リポプロテイン（ＬＤＬ）粒子からなる血清リポプロテインであり（非特許文献１）、ヒト、霊長類及びハリネズミにおいてのみ見つかっている。ａｐｏ（ａ）は、プラスミノゲンの相同物であり（非特許文献２）、１０個の異なる型（クリングル−４ タイプ１〜１０）のプラスミノゲンクリングル−４様リピートや、クリングル−５及び不活性プロテアーゼ領域に相同な領域を含む（非特許文献３）。Ｌｐ（ａ）は、独立した心血管リスクファクターと考えられてきており、多くの研究が血漿Ｌｐ（ａ）レベルと心血管疾患（ＣＶＤ）／冠動脈心疾患（ＣＨＤ）との関連性を示している。上昇したＬｐ（ａ）レベルは、内膜におけるＬｐ（ａ）由来コレステロール捕捉を介して；炎症性細胞リクルートメントを介して；及び／又は炎症促進性の酸化リン脂質の結合を介して、アテローム性動脈硬化症を促進する（非特許文献４）。脂質低下剤は、血漿Ｌｐ（ａ）レベルにほとんど又は全く効果を示さない（非特許文献５）。ナイアシン又はエストロゲンの投与がＬｐ（ａ）レベルを減少するかもしれないことが報告されているが、血漿Ｌｐ（ａ）の低下のための特異的薬剤はない（非特許文献６〜８）。

非特許文献９には、ａｐｏ（ａ）の多型に影響されない、Ｌｐ（ａ）の測定方法が開示されている。

ワクチンは、感染症等の外来性因子により発症する疾患の予防や治療のために頻繁に使用されるが、アルツハイマー病や高血圧症などの内在性の増悪因子に起因する疾患についても、該増悪因子、該増悪因子に含まれるエピトープ、或いはこれらをコードする発現ベクターを患者に対して投与し、該増悪因子に対する抗体を患者の体内に誘導することにより、該増悪因子の機能を中和し、標的疾患の症状を緩和するワクチン療法が試みられている（非特許文献１０〜１２）。プラスミドＤＮＡワクチン接種は、アジュバントの併処理なしで液性及び細胞性免疫を誘導するツールの１つである。なぜなら、プラスミドＤＮＡの場合、プラスミド骨格内部で発現された非メチル化ＣｐＧモチーフが、ＴＬＲ９によって自然免疫系を活性化する能力を有するため、「組み込まれた」アジュバントになると考えられるからである（非特許文献１３）。また、ＤＮＡの二本鎖構造が、サイトゾルに導入された時、又は恒常的クリアランスが妨害された時に、ＣｐＧモチーフとは独立して、免疫調節効果を有することを示唆する証拠が最近蓄積されつつある。

しかしながら、増悪因子が内在性の場合、当該因子はそもそも患者自身の成分であるため、通常は当該因子に対する免疫寛容が成立している。そのため、これらの内在性増悪因子やその部分ペプチドをそのまま患者に投与しても、当該因子に対する抗体を患者の体内に効率的に誘導することは困難である。そこで、これらの自己抗原を患者の免疫系に認識させ、これに対する抗体産生を誘導するための技術的な工夫が必要である。

Ｂ型肝炎ウイルスコア（ＨＢｃ）抗原タンパク質は、自己集合して球状のコア粒子を構成する。このコア粒子は非常に免疫原性が高い。このＨＢｃ抗原タンパク質の特定の部位に、所望のエピトープを挿入するか、ＨＢｃ抗原タンパク質の末端に所望のエピトープを連結することにより得られる融合ポリペプチドを用いると、自己集合により形成される粒子の表面に当該エピトープが提示される。そのため、この融合ポリペプチドを用いると、挿入したエピトープが免疫系に認識され易くなり、当該エピトープを認識する抗体産生を効率的に誘導することができる。そこで、ＨＢｃ抗原タンパク質をワクチンのプラットフォームとして利用して、免疫系に認識されにくい抗原に対する抗体産生を誘導する試みがなされている（非特許文献１４、非特許文献１５）。

特許文献１には、エピトープを有する外来アミノ酸配列を含むキメラＨＢｃ抗原タンパク質から構成される粒子であって、外来アミノ酸配列がＨＢｃ抗原のアミノ酸残基８０−８１の間に挿入された粒子が開示されている。

非特許文献１６には、２６アミノ酸からなるＣＥＴＰのエピトープが挿入されたＨＢｃ抗原及びＩＳＳをコードするＤＮＡワクチンで筋肉内に免疫接種することにより、アテローム性動脈硬化症のウサギモデルにおいて、アテローム性動脈硬化が阻害されたことが記載されている。

しかしながら、仮に内在性増悪因子に対する抗体産生を誘導できたとしても、当該因子に対する細胞性免疫が同時に誘導されてしまうと、自己免疫反応による副作用を生じることになってしまう。そこで、自己反応性のＴ細胞の誘導を抑制しつつ、内在性増悪因子に対する抗体産生を効率的に誘導する必要がある。

以上のような状況の下、動脈硬化症に対して十分に満足できる有効性を示すＤＮＡワクチンは未だ開発されていない。

特許第３２２８７３７号公報

Acta Pathologica Microbiologica Scandinavica, 1963, 59: 369-382 Proceedings of the National Academy of Sciences, 1987, 84: 3224 Nature, 1987, 330: 132-137 Nature, 1989 May 25;339(6222):301-303 Journal of Clinical Investigation, 1990, 85: 1709 New England journal of medicine, 1990, 323: 1289-1298 New England journal of medicine, 2009, 361: 2113-2122 Atherosclerosis, 2010, 211: 41-47 Clinica chimica acta, 1999, 287: 29-43 Nature, 2000, 408: 982-985 Nat Rev Neurosci, 2002, 3: 824-828 The Lancet, 2008, 371: 821-827 Nature, 2008, 451: 725-729 Expert Rev. Vaccines, vol.8, no.11, pp.1565-1573, 2009 Nature, vol.330, pp.381-384, 1987 Vaccine, 2006, 24: 4942-4950

本発明は、自己反応性のＴ細胞誘導を回避しつつ、動脈硬化症を治療又は予防することができるＤＮＡワクチンを提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意検討の結果、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのアミノ酸残基８０と８１の間に、アポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープを挿入することにより得られるキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドの発現ベクターを投与すると、アポリポプロテイン（ａ）へ反応するＴ細胞の誘導を抑制しつつ、アポリポプロテイン（ａ）に対する液性免疫が優勢に誘導され、リポプロテイン（ａ）の沈着や血管内膜の肥厚を効果的に抑制し得ることを見出した。これらの知見に基づき、更に検討を加え、本発明を完成させた。

即ち、本発明は以下に関する。
［１］アポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープを含むアミノ酸配列が挿入されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターを含む、動脈硬化症の治療又は予防剤であって、該特異的エピトープを含むアミノ酸配列が、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのアミノ酸残基８０と８１の間に挿入されている、治療又は予防剤。
［２］動脈硬化症がアテローム性動脈硬化症である、［１］記載の治療又は予防剤。
［３］挿入アミノ酸配列が配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、［１］又は［２］記載の治療又は予防剤。
［４］挿入アミノ酸配列が更に１以上の特異的エピトープを含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の治療又は予防剤。
［５］更なる特異的エピトープが、アポリポプロテインＢの特異的エピトープである、［４］記載の治療又は予防剤。
［６］複数回投与されることを特徴とする、［１］〜［５］のいずれかに記載の治療又は予防剤。
［７］投与回数が２、３又は４回である、［６］記載の治療又は予防剤。
［８］動脈硬化症の治療又は予防において使用するための、アポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープを含むアミノ酸配列が挿入されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターであって、該特異的エピトープを含むアミノ酸配列が、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのアミノ酸残基８０と８１の間に挿入されている、発現ベクター。
［９］動脈硬化症がアテローム性動脈硬化症である、［８］記載の発現ベクター。
［１０］挿入アミノ酸配列が配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、［８］又は［９］記載の発現ベクター。
［１１］挿入アミノ酸配列が更に１以上の特異的エピトープを含む、［８］〜［１０］のいずれかに記載の発現ベクター。

本発明により、自己反応性のＴ細胞誘導を回避しつつ、動脈硬化症を治療又は予防することができるＤＮＡワクチンが提供される。
本発明のワクチンにより、細胞性免疫よりも、アポリポプロテイン（ａ）に対する液性免疫の方が優勢に誘導されるので、自己反応性の細胞性免疫による悪影響のリスクが低減される。

ワクチン接種のためのプラスミドＤＮＡ構築。ａ）ｐｃＤＮＡ３．１−ＨＢｃ（コントロールベクター）及びｐｃＤＮＡ３．１−ＨＢｃ−ａｐｏ（ａ）（ワクチンベクター）のプラスミドマップ。ＨＢｃはＨＢｃの全長配列を示す。ＨＢｃ−ＮはＨＢｃのＮ末端（１〜８０ａ．ａ．）を、ＨＢｃ−ＣはＨＢｃのＣ末端（８１〜１８３ａ．ａ．）を示す。ｂ）Ａｐｏ（ａ）ワクチンのためのプラスミドデザインの詳細情報。Ａｐｏ（ａ）の抗原としての１２アミノ酸（ＥＡＰＳＥＱＡＰＴＥＱＲ：配列番号１）及びリンカー（Ｎ末端Ｉ−Ｔジペプチドリンカー及びＣ末端Ｇ−Ａ−Ｔトリペプチド）を、ＨＢｃへインフレームで融合し、ＨＢｃ粒子の表面上に露出したときに、ａｐｏ（ａ）エピトープのコンフォメーションに可動性が備わるようにデザインした。ａｐｏ（ａ）及びリンカーを一文字表記で表した。ｃ）標的化したエピトープを示すためのＬｐ（ａ）の模式図。Ａｐｏ（ａ）は、主にはクリングルＩＶ様ドメイン（１−１０）及びクリングルＶ様ドメインからなり、繰り返されたクリングルＩＶドメイン タイプ２（ＩＶ ｔｙｐｅ２）は可変性の繰り返しである。黒箱は、ａｐｏ（ａ）のクリングル−４タイプ２の繰り返し配列及び繰り返されたクリングルＩＶドメインタイプ２ドメイン中に多重に存在するエピトープ（ＥＡＰＳＥＱＡＰＴＥＱＲ：配列番号１）を示す。 ＦＶＢマウスへのＡｐｏ（ａ）のＤＮＡワクチン接種。ａ）ＤＮＡワクチン接種の時間経過。ワクチン接種は８週齢（０Ｗ）のとき、並びに１回目のワクチン接種の２週後（２Ｗ）、４週後（４Ｗ）、１０週後（１０Ｗ）に行った。１回目のワクチン接種から６週後及び１２週後に力価を定量し、１回目のワクチン接種から１６週後にＴ細胞活性を評価した。ｂ）及びｃ）６週及び１２週における抗ａｐｏ（ａ）抗体の力価。ａｐｏ（ａ）に対する全ＩｇＧ力価は、ＨＢｃ−ａｐｏ（ａ）群のマウス血清（１００倍希釈）においてのみ上昇した（左パネル）。ＨＢｃ−ａｐｏ（ａ）群のマウス血清（１００倍希釈）におけるＩｇＧサブタイプ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ）を、各ＩｇＧに特異的な抗体を用いて評価した（右パネル）。ｄ）ＥＬＩＳＡによりアッセイしたマウスにおける抗プラスミノゲン抗体。プラスミノゲンに対する全ＩｇＧ力価を、１回目の免疫接種から６週後及び１２週後に、ＨＢｃ−ａｐｏ（ａ）群のマウス血清（１００倍希釈）について評価し、抗プラスミノゲン抗体（ＰＬＧ Ａｂ）を陽性コントロールとして用いた。 ＦＶＢマウスにおけるＤＮＡワクチンによるＴ細胞反応。ａ）［^３Ｈ］チミジン取り込みによるＴ細胞増殖アッセイ。ＨＢｃ−ａｐｏ（ａ）により免疫接種したマウスからの培養脾細胞をエピトープ配列（ａｐｏ（ａ）１２ａ．ａ．；ＥＡＰＳＥＱＡＰＴＥＱＲ：配列番号１）からなるペプチドとともに、あるいは当該ペプチドなしで刺激した。ＰＨＡを非特異的Ｔ細胞活性化剤の陽性コントロールとして用いた。ｂ）酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイ。ＨＢｃ−ａｐｏ（ａ）、ＨＢｃ又は生理食塩水で免疫接種したマウスから得た脾細胞を、エピトープ配列ペプチド又はＰＨＡと共に、あるいはなしで、刺激した。青色のドットはＩＦＮ−γ（左パネル）及びＩＬ−４（右パネル）の陽性スポットである。ｃ）ＥＬＩＳｐｏｔアッセイの定量化。各ウェルについて１ウェル当たりのスポット数をカウントすることにより定量化を行った。 Ｌｐ（ａ）トランスジェニックマウスへのａｐｏ（ａ）ＤＮＡワクチン接種。ａ）ＤＮＡワクチン接種の時間経過。雌のＬｐ（ａ）トランスジェニックマウスを、８週齢で卵巣摘出した。２週後、ＤＮＡワクチン接種を行い（１０週齢、０Ｗ）、更に、１回目のワクチン接種から２週後（２Ｗ）、４週後（４Ｗ）及び１０週後（１０Ｗ）にもワクチン接種を行った。１回目のワクチン接種から６週後及び１２週後に力価を定量し、１回目のワクチン接種から１６週後にＴ細胞活性を評価した。ｂ）及びｃ）ａｐｏ（ａ）に対する全ＩｇＧ力価は、ＨＢｃ−ａｐｏ（ａ）群のマウス血清（１００倍希釈）においてのみ上昇した。ｄ）ＥＬＩＳＡによりアッセイしたマウスにおける抗プラスミノゲン抗体。プラスミノゲンに対する全ＩｇＧ力価を、１回目の免疫接種から６週後及び１２週後に、ＨＢｃ−ａｐｏ（ａ）群のマウス血清（１００倍希釈）について評価し、抗プラスミノゲン抗体（ＰＬＧ Ａｂ）を陽性コントロールとして用いた。 Ｌｐ（ａ）トランスジェニックマウスにおける頚動脈結紮モデル。ａ）結紮した血管におけるＨ＆Ｅ染色の代表的な像。左パネルは免疫接種したマウス（ＨＢｃ−ａｐｏ（ａ）群）を示し、右パネルは非免疫接種マウス（生理食塩水及びＨＢｃ）を示す。１回目の免疫接種から１３週後に頚動脈結紮を実施し、血管リモデリングを１６週において評価した。ｂ）免疫接種マウス及び非免疫接種マウスにおける、内膜及び中膜面積、並びに中膜に対する内膜の比率の定量。ｃ）抗Ｌｐ（ａ）抗体による免疫染色。結紮した血管におけるＬｐ（ａ）沈着（ピンク）は、非免疫接種群においてのみ観察された。

本発明は、アポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープを含むアミノ酸配列が挿入されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターを含む、動脈硬化症の治療又は予防剤であって、該特異的エピトープを含むアミノ酸配列が、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのアミノ酸残基８０と８１の間に挿入されている、治療又は予防剤を提供するものである。

アポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープを含むアミノ酸配列が挿入されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターを投与すると、発現されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチド中のアポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープに対する免疫反応（好ましくは抗体産生等の液性免疫反応）が誘導され、アポリポプロテイン（ａ）に対する抗体によりリポプロテイン（ａ）の産生が抑制されることにより、新生内膜形成及び血管内膜肥厚が抑制される。

本発明の治療又は予防剤の対象となる動脈硬化症の種類は限定されないが、好ましくはアテローム性動脈硬化症である。

本発明においては、本発明の治療又は予防剤の適用対象である哺乳動物由来のアポリポプロテイン（ａ）の使用が意図されるが限定されない。本発明の治療又は予防剤の適用対象は、アポリポプロテイン（ａ）を発現する哺乳動物である。アポリポプロテイン（ａ）を発現する哺乳動物としては、ヒト等の霊長類及びハリネズミのみが知られている。本発明の治療又は予防剤の適用対象は、好ましくはヒト等の霊長類である。従って、例えば、本発明の治療又は治療剤をヒトへ適用する場合、ヒト由来のアポリポプロテイン（ａ）の使用が意図されるが限定されない。

本明細書において、特定の因子Ｘ（ポリペプチド又はポリヌクレオチド）について、「生物Ｙ由来の因子Ｘ」又は「生物Ｙ因子Ｘ」とは、該因子Ｘのアミノ酸配列又は核酸配列が、生物Ｙにおいて天然に発現している該因子Ｘのアミノ酸配列又は核酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列又は核酸配列を有することを意味する。「実質的に同一」とは、着目したアミノ酸配列又は核酸配列が、生物Ｘにおいて天然に発現している因子Ｘのアミノ酸配列又は核酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上）の同一性を有しており、且つ当該因子Ｘの機能が維持されていることを意味する。

アポリポプロテイン（ａ）は、公知の血管新生因子であり、そのアミノ酸配列やｃＤＮＡ配列も公知である。アポリポプロテイン（ａ）には、クリングル−ＩＶ タイプ２の繰り返し配列が含まれ、その繰り返し数が多様であることが知られているが、いずれの繰り返し数のものもアポリポプロテイン（ａ）に包含される。ヒトアポリポプロテイン（ａ）の代表的なアミノ酸配列としては配列番号２（NP_005568.2）で表されるアミノ酸配列を挙げることができるが、これに限定されない。また、ヒトアポリポプロテイン（ａ）の部分アミノ酸配列として、配列番号１７（AAB49909、AAB66587）が報告されている。

本明細書において、「エピトープ」とは、個々の抗体又はＴ細胞受容体による認識の基本要素又は最小単位であって、前記抗体又はＴ細胞受容体が結合する特定のドメイン、領域又は分子構造をいう。

本発明に使用されるアポリポプロテイン（ａ）のエピトープは、当該アポリポプロテイン（ａ）に特異的である。「特異的」とは、当該アポリポプロテイン（ａ）が由来する哺乳動物において天然に発現している当該アポリポプロテイン（ａ）以外の遺伝子産物（但し、イムノグロブリンおよびＴ細胞受容体の可変領域を除く）が当該エピトープを含まないことを意味する。

本発明において使用されるアポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープは、当該エピトープを認識する抗体が該エピトープに結合した場合に、リポプロテイン（ａ）の血管内膜へ沈着を阻害する位置にあるものが好適に選択される。そのようなエピトープは、例えば、クリングル−ＩＶ タイプ２の繰り返し配列内にあり得る。シグナル配列等、アポリポプロテイン（ａ）の成熟過程で除去される部位に含まれるエピトープは、好ましくは、本発明において使用するエピトープから除外される。

当該エピトープのアミノ酸配列の長さは、通常５〜３０アミノ酸、好ましくは６〜２５アミノ酸、より好ましくは１０〜１８アミノ酸、更により好ましくは１１〜１６アミノ酸である。該アミノ酸配列が短すぎるとエピトープとしての抗原性が失われる可能性ある。また該アミノ酸配列が長すぎると、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドが自己集合によりコア粒子を形成し難くなり、結果として当該エピトープを特異的に認識する抗体が産生されず、動脈硬化症に対する良好な治療又は改善効果が得られなくなる可能性がある。

アポリポプロテイン（ａ）の好適なエピトープの具体例として、以下のものを挙げることができる。

ＥＡＰＳＥＱＡＰＴＥＱＲ（配列番号１）

配列番号１は、ヒトアポリポプロテイン（ａ）の部分アミノ酸配列である。

本発明において使用されるＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドは、
（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、更に好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ自己集合によりコア粒子を形成する活性を有するポリペプチド
である。

自己集合とは、溶液中に溶けている分子が会合することによって集合体を形成する現象をいう。コア粒子とは、固有の反復性の構成を有する剛性構造をいう。本明細書中のコア粒子は合成工程の産物又は生物的工程の産物であってよい。

（２）の態様のポリペプチドとして、ＷＯ２００３／０３１４６６に開示された配列番号５で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの位置４８、６１、１０７及び１８５に対応する位置の１つ又は複数のシステイン残基を欠失させた、又は他のアミノ酸残基（例えば、セリン残基）で置換したポリペプチドも、（２）の態様のポリペプチドとして好ましい。当業者が認識しているように、配列番号５に示されているものと異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドにおける同様な位置にあるシステイン残基も欠失させ、又は他のアミノ酸残基で置換することができ、これらの欠失、置換により得られるポリペプチドも（２）の態様のポリペプチドに包含される。

また、（２）の態様のポリペプチドには、配列番号５における位置９７に対応する位置のイソロイシン残基がロイシン残基又はフェニルアラニン残基で置換されている変異体ポリペプチドが包含される（Ｙｕａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第７３巻、１０１２２〜１０１２８頁（１９９９））。また、多くのＨＢｃＡｇ変異体ならびに数種のＢ型肝炎コア抗原前駆変異体のアミノ酸配列がＧｅｎＢａｎｋ報告ＡＡＦ１２１２４０、ＡＦ１２１２３９、Ｘ８５２９７、Ｘ０２４９６、Ｘ８５３０５、Ｘ８５３０３、ＡＦ１５１７３５、Ｘ８５２５９、Ｘ８５２８６、Ｘ８５２６０、Ｘ８５３１７、Ｘ８５２９８、ＡＦ０４３５９３、Ｍ２０７０６、Ｘ８５２９５、Ｘ８０９２５、Ｘ８５２８４、Ｘ８５２７５、Ｘ７２７０２、Ｘ８５２９１、Ｘ６５２５８、Ｘ８５３０２、Ｍ３２１３８、Ｘ８５２９３、Ｘ８５３１５、Ｕ９５５５１、Ｘ８５２５６、Ｘ８５３１６、Ｘ８５２９６、ＡＢ０３３５５９、Ｘ５９７９５、Ｘ８５２９、Ｘ８５３０７、Ｘ６５２５７、Ｘ８５３１１、Ｘ８５３０１、Ｘ８５３１４、Ｘ８５２８７、Ｘ８５２７２、Ｘ８５３１９、ＡＢ０１０２８９、Ｘ８５２８５、ＡＢ０１０２８９、ＡＦ１２１２４２、Ｍ９０５２０、Ｐ０３１５３、ＡＦ１１０９９９及びＭ９５５８９に開示されており（この開示のそれぞれが参照により本明細書に組込まれる）、これらの変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドも（２）の態様のポリペプチドに包含される。上記変異体は、配列番号５における位置１２、１３、２１、２２、２４、２９、３２、３３、３５、３８、４０、４２、４４、４５、４９、５１、５７、５８、５９、６４、６６、６７、６９、７４、７７、８０、８１、８７、９２、９３、９７、９８、１００、１０３、１０５、１０６、１０９、１１３、１１６、１２１、１２６、１３０、１３３、１３５、１４１、１４７、１４９、１５７、１７６、１７８、１８２及び１８３に存在するアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を含む多くの位置におけるアミノ酸配列が異なっている。

更に、全部が参照により本明細書に組込まれる国際公開第０１／９８３３３号、国際公開第０１／７７１５８号及び国際公開第０２／１４４７８号に記載されたＨＢｃＡｇ変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドも、（２）の態様のポリペプチドに包含される。

本明細書において、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸残基の位置は、特にことわりのない限り、配列番号４で表されるアミノ酸配列を基準として特定される。配列番号４で表されるアミノ酸配列を含まないポリペプチドの場合には、当該ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号４で表されるアミノ酸配列と並び合わせ、対応するアミノ酸残基の位置が採用される。

本発明において使用されるＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドは、好ましくは、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。

本発明に用いられるキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドにおいては、アポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープを含むアミノ酸配列が、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのアミノ酸残基８０と８１の間に挿入されている。即ち、本発明に用いられるキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドは、以下の（ａ）〜（ｃ）の構成要素：
（ａ）Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのＮ末端部分ポリペプチド残基（Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのＮ末端からアミノ酸残基８０までの連続する部位アミノ酸配列からなる）、
（ｂ）アポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープからなるアミノ酸配列、及び
（ｃ）Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのＣ末端部分ポリペプチド残基（Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのアミノ酸残基８１からＣ末端までの連続する部位アミノ酸配列からなる）
をＮ末端側から（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の順序で含む。

本発明に用いられるキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドは、上記構成により、自己集合によりコア粒子を形成し、その粒子の外側にアポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープが提示される。

構成要素（ａ）と構成要素（ｃ）との間の挿入アミノ酸配列には、構成要素（ｂ）（アポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープからなるアミノ酸配列）に加えて、更に１以上（好ましくは１〜３個、より好ましくは１個）の特異的エピトープが含まれていてもよい。更なる特異的エピトープとしては、アポリポプロテイン（ａ）以外の、動脈硬化症の増悪因子の特異的エピトープが用いられる。更なる特異的エピトープとしては、アポリポプロテインＢ等を例示することが出来るが、これらに限定されない。更なる特異的エピトープは、構成要素（ａ）と構成要素（ｂ）の間、構成要素（ｂ）と構成要素（ｃ）の間のいずれの位置に挿入されてもよい。更なる特異的エピトープのアミノ酸配列の長さは、通常５〜３０アミノ酸、好ましくは６〜２５アミノ酸、より好ましくは１０〜１８アミノ酸、更により好ましくは１１〜１６アミノ酸である。

構成要素（ａ）と構成要素（ｃ）との間に、複数個の特異的エピトープが挿入される場合、特異的エピトープ間は、直接共有結合により連結されていてもよいし、スペーサー配列を介して連結されていてもよい。スペーサー配列とは、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドに含まれる２つの近接した構成要素の間に挿入される１以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を意味する。複数の特異的エピトープがその構造を維持しながら安定に提示され得るように、特異的エピトープ間は、スペーサー配列を介して連結されていることが好ましい。スペーサー配列の長さは、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドが自己集合によりコア粒子を形成し、その粒子の外側に挿入された全ての特異的エピトープが提示される限り限定されないが、通常１〜１０アミノ酸、好ましくは１〜５アミノ酸、より好ましくは１〜３アミノ酸、最も好ましくは２又は３アミノ酸である。

構成要素（ａ）と構成要素（ｃ）との間の最もＮ末端側の特異的エピトープと、構成要素（ａ）とは、直接共有結合により連結されていてもよいし、スペーサー配列を介して連結されていてもよい。キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドが自己集合して形成するコア粒子の外側に、アポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープがその構造を維持しながら安定に提示され得るように、構成要素（ａ）と最もＮ末端側の特異的エピトープとは、スペーサー配列を介して連結されていることが好ましい。スペーサー配列の長さは、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドが自己集合によりコア粒子を形成し、その粒子の外側にアポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープが提示される限り限定されないが、通常１〜１０アミノ酸、好ましくは１〜５アミノ酸、より好ましくは１〜３アミノ酸、最も好ましくは２又は３アミノ酸である。スペーサー配列の種類も、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドが自己集合によりコア粒子を形成し、その粒子の外側にアポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープが提示される限り限定されない。好ましいスペーサー配列として、ＩＴ、ＧＡＴ、ＣＧＧ等を例示することができるが、これらに限定されない。

構成要素（ａ）と構成要素（ｃ）との間の最もＣ末端側の特異的エピトープと、構成要素（ｃ）とは、直接共有結合により連結されていてもよいし、スペーサー配列を介して連結されていてもよい。キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドが自己集合して形成するコア粒子の外側に、アポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープがその構造を維持しながら安定に提示され得るように、構成要素（ｂ）と構成要素（ｃ）とは、スペーサー配列を介して連結されていることが好ましい。スペーサー配列の長さは、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドが自己集合によりコア粒子を形成し、その粒子の外側にアポリポプロテイン（ａ）のエピトープが提示される限り限定されないが、通常１〜１０アミノ酸、好ましくは１〜５アミノ酸、より好ましくは１〜３アミノ酸、最も好ましくは２又は３アミノ酸である。スペーサー配列の種類も、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドが自己集合によりコア粒子を形成し、その粒子の外側にアポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープが提示される限り限定されない。好ましいスペーサー配列として、ＩＴ、ＧＡＴ、ＣＧＧ等を例示することができるが、これらに限定されない。

構成要素（ａ）と構成要素（ｃ）との間の挿入アミノ酸配列の長さは、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドが自己集合によりコア粒子を形成し、その粒子の外側にアポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープが提示され、動脈硬化症が治療又は予防できる限り特に限定されないが、通常５〜８０アミノ酸である。挿入アミノ酸配列が短すぎるとエピトープとしての抗原性が失われる可能性ある。また挿入アミノ酸配列が長すぎると、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドが自己集合によりコア粒子を形成し難くなり、結果として挿入したエピトープを特異的に認識する抗体が産生されず、動脈硬化症に対する良好な治療又は改善効果が得られなくなる可能性がある。

本発明において用いられる発現ベクターは、上記キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組込んだ組換えベクターである。当該発現ベクターを対象哺乳動物に投与すると、当該対象哺乳動物の細胞内に該発現ベクターが取り込まれ、該細胞が上記キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドを発現する。キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入する発現ベクターとしてはプラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド、及び、当分野において従来用いられるその他のベクターを例示することができる。プラスミドベクターとしては、pCAGGS（Gene 108：193〜199（1991））、pCR-X8（Vaccine 24：4942〜4950（2006））、pcDNA3.1(商品名、Invitrogen）、pZeoSV(商品名、Invitrogen）、及びpBK-CMV(商品名、Stratagene）等を例示することができるがこれらに限定されない。ウイルスベクターは、DNAウイルス又はRNAウイルスである。ウイルスベクターとしては、無毒化レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス（HVJ）、SV40、及びヒト免疫不全ウイルス（HIV）等を例示することができるがこれらに限定されない。さらにセンダイウイルスエンベロープ（HVJ-E）等も利用できる。

上記発現ベクターにおいては、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）が、投与対象である哺乳動物（好ましくはヒト）の細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されている。

使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物の細胞内で機能し得るものであれば特に制限はない。プロモーターとしては、ｐｏｌＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーター等を使用することができる。具体的には、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ等のウイルスプロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター、並びにｔＲＮＡプロモーター等のＲＮＡプロモーター等が用いられる。

上記発現ベクターは、好ましくはキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。

一態様において、上記発現ベクターは、免疫効果を増強するため、免疫刺激性配列（ＩＳＳ）（ＣｐＧともいう）を含んでいてもよい。免疫刺激性配列は、細菌の非メチル化CpGモチーフを含むDNAであり、特定の受容体（Toll-like receptor 9）のリガンドとして働くことが知られている（詳細はBiochim. Biophys. Acta 1489, 107-116 (1999) 及び Curr. Opin. Microbiol. 6, 472-477 (2003)参照）。免疫刺激性配列の好適な例として、以下を挙げることができる。
CpG-B1018 22bp
5’-tga ctg tga acg ttc gag atg a-3’（配列番号６）
CpG-A D19 20bp (D type)
5’-ggt gca tcg atg cag ggg gg-3’（配列番号７）
CpG-CC274 21bp
5’-tcg tcg aac gtt cga gat gat-3’（配列番号８）
CpG-CC695 25bp
5’-tcg aac gtt cga acg ttc gaa cgt t-3’（配列番号９）

或いはこれらのＩＳＳのうちの２、３又は４個を連結して使用してもよい。連結したＩＳＳ配列の好適な例として以下を挙げることができる。
5’-ggt gca tcg atg cag ggg gg tga ctg tga acg ttc gag atg a tcg tcg aac gtt cgagat gat tcg aac gtt cga acg ttc gaa cgt t-3’（配列番号１０）

当業者であれば、例えば、“ｅｄｉｔ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．”、及び、“ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ” 等に記載の周知の遺伝子工学的技術により上述の発現ベクターを構築することが可能である。

本発明の治療又は改善剤は、治療的有効量の上記発現ベクターに加え、任意の担体、例えば医薬上許容される担体を含む医薬組成物として提供することができる。

医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑沢剤、クエン酸、メントール、グリチルリチン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。

本発明の治療又は改善剤は、その効果を増強するため、アジュバントを更に含有してもよい。アジュバントとしては、水酸化アルミニウム、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、百日咳菌アジュバント、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＣｐＧ−ＤＮＡ等が挙げられる。

発現ベクターの細胞内への導入を促進するために、本発明の治療又は予防剤は、核酸導入用試薬を更に含有してもよい。核酸導入用試薬としては、リポフェクチン(商品名、Invitrogen）、リポフェクタミン(商品名、Invitrogen）、トランスフェクタム（商品名、Promega）、ＤＯＴＡＰ（商品名、Roche Applied Science）、dioctadecylamidoglycyl spermine（ＤＯＧＳ）、L-dioleoyl phosphatidyl-ethanolamine（ＤＯＰＥ）、dimethyldioctadecyl-ammonium bromide（ＤＤＡＢ）、N,N-di-n-hexadecyl-N,N-dihydroxyethylammonium bromide（ＤＨＤＥＡＢ）、N-n-hexadecyl-N,N-dihydroxyethylammonium bromide（ＨＤＥＡＢ）、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）等の陽イオン性脂質、を用いることが出来る。また、発現ベクターを静電気的リポソームのような脂質二重層で構成される任意の既知のリポソームに封入してもよい。該リポソームは、不活化センダイウイルス（Hemagglutinating virus of Japan；HVJ）のようなウイルスに融合させてもよい。HVJ-リポソームは、通常のリポソームと比較して細胞膜に対して非常に高い融合活性を有する。また、発現ベクターとしてレトロウイルスを用いる場合には、導入試薬としてレトロネクチン、ファイブロネクチン、ポリブレン等を用いることができる。

当該医薬組成物中の上記発現ベクターの含有量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、通常、医薬組成物全体の約０．００００１ないし１００重量％である。

本発明の治療又は予防剤は、適用対象である哺乳動物の組織（又は細胞）内への上記発現ベクターの導入により、上記キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ発現を誘導し、該キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドに含まれるアポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープに対する抗体産生を誘導し、誘導された抗体がリポプロテイン（ａ）の産生を抑制することにより、新生内膜形成及び血管内膜肥厚を抑制するものである。発現ベクター等の核酸を生体内へ導入する種々の方法が知られており（Ｔ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２７５−１２８１（１９８９））、上記キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ発現を誘導し、該キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドに含まれるアポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープに対する抗体産生を誘導し、動脈硬化症を治療又は予防する限り、どのような導入方法を採用することも可能である。

ｉｎ ｖｉｖｏで哺乳動物の組織（又は細胞）内に発現ベクターを導入する方法としては、内部型リポソーム法、静電気型リポソーム法、HVJ-リポソーム法、HVJ-AVEリポソーム法、受容体媒介遺伝子導入、パーティクルガン法、裸のDNA法、陽性荷電ポリマーによる導入法、エレクトロポレーション法等が挙げられるが、これらに限定されない。

或いは、適用対象である哺乳動物から、血液細胞、骨髄細胞等の細胞を単離し、該細胞へｅｘ ｖｉｖｏで上記発現ベクターを導入し、その後、得られた上記発現ベクターを含む細胞を適用対象の哺乳動物へ戻してもよい。

ｅｘ ｖｉｖｏで哺乳動物の細胞内に発現ベクターを導入する方法としては、リポフェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAE-デキストラン法、微小ガラス管を用いる直接DNA導入法、エレクトロポレーション法等が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の治療又は予防剤は、投与対象哺乳動物に、上記キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ発現を誘導し、該キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドに含まれるアポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープに対する抗体産生を誘導し、動脈硬化症を治療又は予防する限り、いかなる方法により投与してもよい。好ましくは、本発明の治療又は予防剤は非経口的に、投与対象哺乳動物にキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドに含まれるアポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープに対する抗体産生を誘導し、動脈硬化症を治療又は予防するのに十分な量が投与される。例えば、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、又は筋肉内の経路を介しての注射；ガス誘導性粒子衝撃法（電子銃等による）；点鼻薬等の形態での粘膜経路を介する方法等が投与方法として例示される。一態様において、本発明の治療又は予防剤は、好ましくは皮下又は筋肉内に注射される。

一実施態様において、本発明の治療又は予防剤は、針無注射器により皮下に投与される。針無注射器は、好ましくは圧力注射器である。針無注射器としては、シマジェット(商品名、島津製作所)、ツインジェクターＥＺＩＩ（商品名、日本ケミカルリサーチ）、シリジェット（商品名、キーストン）、ＺＥＮＥＯ(商品名、クロスジェクト)等を挙げることができるが、これらに限定されない。この場合、本発明の治療又は治療剤は、上記発現ベクター及び針無注射器を含み、該発現ベクターが該針無注射器に封入された、注射製剤として提供することができる。

一実施態様において、本発明の治療又は予防剤は、遺伝子銃により皮下、皮内又は筋肉内へ投与される。この場合、上記発現ベクターを、生体内に導入されるコロイド金粒子等の担体粒子上に被覆して、投与に用いることができる。ポリヌクレオチドで担体粒子をコートする技術は公知である（例えば、ＷＯ９３／１７７０６参照）。最終的に発現ベクターは、生体への投与に適する生理的食塩水等の水溶液中に調製することができる。

良好な免疫応答を誘導するため、本発明の治療又は改善剤は、一定の間隔をあけて複数回投与することが好ましい。該回数は、免疫応答の強さをモニターしながら適宜設定することができるが、通常２〜１０回、好ましくは２〜６回、より好ましくは２、３又は４回、である。

投与頻度は、通常１週間〜１年に１回、好ましくは１〜６ヶ月に１回である。

本発明の治療又は改善剤の投与量は、有効成分である発現ベクターがコードするキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドに含まれるアポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープの投与対象哺乳動物における免疫原性に依存するが、一定量の発現ベクターを投与対象である哺乳動物に投与し、ＥＬＩＳＡ等の検定法により当該エピトープに特異的な抗体価を測定して、免疫応答を観察することにより当業者であれば良好な免疫応答に必要な用量を決定することができる。本発明の治療又は予防剤の免疫原性が、有効成分である発現ベクターで用いるプロモーター等の制御配列の強さにも依存するものであることが当業者には理解される。そして当業者であれば、使用する発現ベクターの種類に応じ本発明の治療又は予防剤の投与量を調節することも容易に行い得る。

アポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープを含むアミノ酸配列が挿入されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターを投与すると、発現されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチド中のアポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープに対する免疫反応（好ましくは抗体産生等の液性免疫反応）が誘導され、アポリポプロテイン（ａ）に対する抗体によりリポプロテイン（ａ）の産生が抑制されることにより、新生内膜形成及び血管内膜肥厚が抑制される。従って、本発明の治療又は予防剤の投与対象としては、動脈硬化症（好ましくは、アテローム性動脈硬化症）の患者、動脈硬化症（好ましくは、アテローム性動脈硬化症）の発症リスクを有する非動脈硬化症患者（例えば、健常人；血液中のアポリポプロテイン（ａ）レベル又はリポプロテイン（ａ）レベルが健常人よりも高いが、動脈硬化症の発症には至っていないもの；高脂血症患者等）等を挙げることができる。アポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープを含むアミノ酸配列が挿入されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターを動脈硬化症の患者に投与することにより、該癌患者の動脈硬化部位へのリポプロテイン（ａ）の更なる沈着を抑制し、新生内膜形成及び血管内膜肥厚を抑制することにより、動脈硬化症の進行を妨げることができる。また、アポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープを含むアミノ酸配列が挿入されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターを動脈硬化症の発症リスクを有する非動脈硬化症患者に投与することにより、該非動脈硬化症患者における動脈硬化症の発症を予防することが出来る。

刊行物、特許文献等を含む、本明細書に引用されたすべての参考文献は、引用により、それらが個々に具体的に参考として援用されかつその内容全体が具体的に記載されているのと同程度まで、本明細書に援用される。

以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。

［材料及び方法］
動物
本試験は、大阪大学医学系大学院の動物実験倫理委員会で許可されたものである。マウスは、試験期間を通じて、水及び餌に自由にアクセスできた。メスＦＶＢマウスはチャールズリバーから購入した。Ｌｐ（ａ）トランスジェニックマウスは、ヒトａｐｏ（ａ）トランスジェニックマウスとヒトａｐｏＢトランスジェニックマウスとをかけ合わせることにより作出した（Nature genetics, 1995, 9: 424-431; Nature, 1992, 360: 670-672; Proceedings of the National Academy of Sciences, 1994, 91: 2130; Circulation, 2002, 105: 1491-1496）。ヒトａｐｏ（ａ）ＹＡＣトランスジェニックマウスは、ａｐｏ（ａ）遺伝子、７０ｋｂ ａｐｏ（ａ）様遺伝子、及び２６０ｋｂゲノムＤＮＡ（ＹＡＣ ＤＮＡ）を含む、ヒトａｐｏ（ａ）ＹＡＣの挿入により作出した（Nature, 1992, 360: 670-672）。ヒトａｐｏＢトランスジェニックマウスは、インタクトなａｐｏＢ遺伝子を含む７６ｋｂゲノムＤＮＡ（Ｐ１ ファージミドＤＮＡ）の挿入により作出した（Proceedings of the National Academy of Sciences, 1994, 91: 2130）。両マウスのバックグラウンドはＦＶＢマウスであった。

ＨＢｃ−ａｐｏ（ａ）融合遺伝子発現ベクターの構築
サイトメガロウイルスプロモーターを含むプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ、インビトロジェン）を用いた。ＨＢｃ遺伝子はＰＣＲにより得て、ｐｃＤＮＡ３．１［ＨＢｃ］中へ組み込んだ。Ｎ末端Ｉｌｅ−Ｔｈｒジペプチドリンカー及びＣ末端Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｈｒトリペプチド伸長を伴うａｐｏ（ａ）中の１２アミノ酸（a．a．）の配列（ＥＡＰＳＥＱＡＰＴＥＱＲ：配列番号１）を以下のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより合成した：

（ＰＣＲ１）
フォワードプライマー：ＨＢｃ−１
5’GCCATGGATATCGATCCTTATAAAGAATTCGGAGC3’（配列番号１１）、
リバースプライマー：Ｌｐ（ａ）−１
5’GTTAACTTGGAAGATCCAGCTATCACTGAGGCTCCTTCCGAACAAGCACCGACT3’（配列番号１２）、及び
テンプレート：ｐＰＬｃ３（ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ）；

（ＰＣＲ２）
フォワードプライマー：ＨＢｃ−２
5’GGCCTCTCACTAACATTGAGATTCCCGAGATTGAGA3’（配列番号１３）、
リバースプライマー：Ｌｐ（ａ）−２
5’TTCCGAACAAGCACCGACTGAGCAAAGGGGTGCTACTAGCAGGGACCTGGTAGTC3’（配列番号１４）、及び
テンプレート：ｐＰＬｃ３

ＰＣＲ１及びＰＣＲ２からのＰＣＲ産物をＰＣＲ３のテンプレートとして用いた。尚、ＰＣＲ３においては、フォワードプライマーとしてＨＢｃ−１を、リバースプライマーとしてＨＢｃ−２を用いた。ＰＣＲ３からのＰＣＲ産物を、ｐｃＤＮＡ３．１［ＨＢｃ−ａｐｏ（ａ）］中へ組み込んだ。

ワクチン接種プロトコール
雌のＦＶＢマウス又はＬｐ（ａ）トランスジェニックマウスを、２週間間隔で３回（それぞれ、８週齢、１０週齢、１２週齢）、１２０μｇのＨＢｃ−ａｐｏ（ａ）又はＨＢｃを含有する６０μＬのＴＥ、或いは６０μＬの生理食塩水で、筋肉内にワクチン接種した。ワクチン接種には、２本の長さ１０ｍｍ直径０．３ｍｍのステンレス鋼針が３ｍｍの間隔で固定されたスイッチボックスへ連結された、電気パルス発生器（ＮＥＰＡ ＧＥＮＥ）を用いた。パルス継続の間、電圧は７０Ｖで一定に維持した。指示した電圧で３回パルスの後、反対の極性のパルスを更に３回、１パルス／秒の速さ、各パルスの継続時間５０ｍｓで、各注入部位へ施した。３回目の免疫接種から６週間後（１８週齢）、マウスへ追加免疫を施した。１回目の免疫接種の前に、Ｌｐ（ａ）トランスジェニックマウスは、両側の卵巣を摘出した。

血清中ａｐｏ（ａ）抗体の測定
３回目の免疫接種及び最後の免疫接種のそれぞれ２週間後、全ての群の免疫接種したマウスから血清を採取した。ＥＬＩＳＡにより、それらのマウスにおけるａｐｏ（ａ）特異的抗体の血清レベルを測定した。即ち、ＥＬＩＳＡプレートを、炭酸緩衝液中の５μｇ／ｍＬのａｐｏ（ａ）１２ａ．ａ．ペプチド（配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド）で、４℃にて終夜コートした。プレートを３％スキムミルク含有ＰＢＳＴで、室温にて２時間ブロックし、免疫接種したマウスからの血清試料の系列希釈（１：１００から１：３１２５００）をウェルに加えた。更に、プレートを４℃で終夜インキュベートし、ＰＢＳＴで７回洗浄し、ＨＲＰ接合抗マウスＩｇＧ（全又は各サブタイプ）を加え、室温にて３時間インキュベートした。ＰＢＳＴにて４回洗浄後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、シグマ−アルドリッチ）を加え、青色反応産物を０．５ｍｏｌ／Ｌの硫酸でストップし、得られた最終産物を４５０ｎｍにて測定した。

Ｔ細胞増殖アッセイ
Ｔ細胞増殖アッセイを既述のように実施した。同系のＴ細胞（マウス脾細胞、５ｘ１０^５個／ウェル）を、１０μｇ／ｍｌの組換えａｐｏ（ａ）１２ａ．ａ．ペプチド、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ，５０μｇ／ｍＬ 陽性コントロールとして）、及び培地と共に、個別に、３７℃、５％ＣＯ_２にて４０時間培養した。更に、１μＣｉの［^３Ｈ］チミジン（パーキンエルマー）を、８時間に亘り、各ウェルに加えた。細胞を回収し、［^３Ｈ］チミジンの取り込みをＭｉｃｒｏＢｅｔａ １４５０ Ｔｒｉｌｕｘシンチレーターカウンター（Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ）を用いて測定した。刺激インデックスを、刺激していない細胞に対する刺激した細胞の割合で表した。

酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイ
マウスＩＦＮ−γ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｍｏｄｕｌｅ及びマウスＩＬ−４ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をそれぞれ用いて、製造者の指示書に従い、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行った。即ち、ＥＬＩＳｐｏｔ用９６穴フィルタープレートを抗マウスＩＦＮ−γ抗体又は抗マウスＩＬ−４と共に、４℃にて終夜プレインキュベートし、１％ＢＳＡ及び５％シュクロースを含有するＰＢＳで、室温にて２時間ブロックした。免疫接種した各マウスからの脾細胞を１ウェルあたり５ｘ１０^５個加え、１０μｇ／ｍｌの組換えａｐｏ（ａ）１２ａ．ａ．ペプチド、ＰＨＡ（５０μｇ／ｍＬ 陽性コントロールとして）、及び培地と共に、個別に、３７℃、５％ＣＯ_２にて４８時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ビオチン化抗マウスＩＦＮ−γ抗体又はビオチン化抗マウスＩＬ−４抗体と共に４℃にて終夜インキュベートし、再度ＰＢＳＴにより３回洗浄した。ＥＬＩＳｐｏｔ ｃｏｌｏｒ ｍｏｄｕｌｅ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を発色に用いた。１％ＢＳＡ複合体を含有するＰＢＳにて希釈したストレプトアビジン−ＡＰ濃縮物を各ウェルに加え、室温にて２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔ及び脱イオン化水にて洗浄後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴを各ウェルに加え、暗所にて３０分間、室温にてインキュベートした。プレートを脱イオン化水にて洗浄し、室温にて風乾した。手術用顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて、発色したスポットを手作業で計測した。

頚動脈結紮モデル
既述のように、雌のＬｐ（ａ）トランスジェニックマウスに対して頚動脈結紮モデルを実施した。免疫接種の１週間後、雌のＬｐ（ａ）トランスジェニックマウスの左総頚動脈を、頚部の正中線の小さな切れ込みを通して露出させ、動脈を、頚動脈分岐部の直近位で６−０絹糸により完全に結紮し、血流を中断させた。総頚動脈の結紮の後、血管は典型的には、炎症性変化及び新生内膜形成を生じる。

病理学的解析
血管リモデリングの定量を、頚動脈結紮モデルの３週間後に実施した。左総頚動脈を摘出し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、１０％シュクロースを含有するＰＢＳ、ＰＢＳ／２０％シュクロース、及びＰＢＳ／３０％シュクロースで平衡化した。急凍結のため試料を包埋した。横断切片をスライドに載せ染色した；そのうちの幾つかは−８０℃にて凍結した。新生内膜形成の評価のため、スライドをヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）で染色した。各５枚のスライドについて、新生内膜の面積及び中膜の面積を測定することにより定量した（イメージＪ）。抗Ｌｐ（ａ）抗体による免疫染色をＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣ−ＡＰ ａｎｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）により可視化した。

統計学的解析
全ての値は平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表した。データはｔ検定により比較するか、或いはＡＮＯＶＡ及びそれに引き続くフィッシャーの多重比較検定を用いて比較した。全ての統計学的解析は、ＳｔａｔＶｉｅｗ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｉｎｃ．）を用いて実施した。ｐ＜０．０５の値を統計学的有意差を表すものとした。

［結果］
プラスミドＤＮＡ構築物のインビトロ発現
Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質（ＨＢｃ）を含むプラスミドＤＮＡを用いた。なぜなら、ＨＢｃはキャリアタンパク質であり、異種性の発現系において、自己集合し、正十二面体のウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）を形成する能力を有しているからである。プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＨＢｃ（コントロールベクター）及びｐｃＤＮＡ３．１−ＨＢｃ−ａｐｏ（ａ）を構築した（図１ａ）。我々は標的エピトープとしてａｐｏ（ａ）の１２ａ．ａ．（ＥＡＰＳＥＱＡＰＴＥＱＲ：配列番号１）を選択した。このエピトープは、ａｐｏ（ａ）のクリングル−４タイプ２の繰り返し配列間にまたがって存在し、繰り返しのクリングル−４タイプ２ドメインにおいて多重に存在する（図１ｂ及び１ｃ）。ａｐｏ（ａ）は、複数コピーのクリングル−４、単一コピーのクリングル−５及び不活性のプロテアーゼドメインを含むプラスミノゲンと高度に相同であるが、選択されたエピトープ配列は、プラスミノゲンとホモロジーは高くない。当該エピトープ配列は親水性ドメインであり、既述のように（Clinica chimica acta, 1999, 287: 29-43）、Ｂ細胞エピトープの潜在力を有することが知られている。

ＦＶＢマウスへのＤＮＡワクチン接種
雌のＦＶＢマウスを、２週間毎に３回、エレクトロポレーターを用いた筋肉内投与によりｐｃＤＮＡ３．１−ＨＢｃ−ａｐｏ（ａ）［ＨＢｃ−ａｐｏ（ａ）］、ｐｃＤＮＡ３．１−ＨＢｃ［ＨＢｃ］及び生理食塩水で、それぞれ免疫接種した（図２ａ）。ＦＶＢは内在性のａｐｏ（ａ）を有していないため、このＤＮＡワクチンの抗原は外来性物質として認識され得る。抗ａｐｏ（ａ）抗体の力価は、ＨＢｃ−ａｐｏ（ａ）群においてのみ認められた（図２ｂ左）。ＩｇＧサブタイプの解析から、この免疫接種は、ＩｇＧ２ａ産生優性なＴｈ１へ偏った免疫系を導いたと推測された（図２ｂ右）。３回目の免疫接種の６週間後に、追加免疫をマウスへ施すと、抗ａｐｏ（ａ）抗体の力価が上昇した（図２ｃ左）。この免疫接種も、ＩｇＧ２ａ産生優性なＴｈ１へ偏った免疫系を導いたと推測された（図２ｃ右）。更に、ａｐｏ（ａ）はプラスミノゲンと高度に相同であるにも係わらず、これらの免疫接種後に抗プラスミノゲン抗体は検出されなかった（図２ｄ）。このことは、これらの免疫接種は線溶系にほとんど影響を与えないことを示唆する。

ａｐｏ（ａ）１２ａ．ａ．エピトープの安全性及び有効性を評価するため、Ｔ細胞増殖アッセイ及びＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行った。免疫接種した雌のＦＶＢマウスにおいて、Ｔ細胞増殖アッセイは、ａｐｏ（ａ）１２ａ．ａ．ペプチド（配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド）による刺激は、免疫接種したマウスからの脾細胞の増殖を誘導しないことを示した（図３ａ）。また、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、ａｐｏ（ａ）１２ａ．ａ．ペプチドはＩＦＮ−γ及びＩＬ−４のいずれの産生をも誘導しなかった（図３ｂ及び３ｃ）。これらのデータから、配列番号１で表されるアミノ酸配列は、Ｔ細胞活性化を誘導するＴ細胞エピトープを含有しないことが示された。

Ｌｐ（ａ）トランスジェニックマウスへのＤＮＡワクチン接種
ａｐｏ（ａ）は、ヒト、霊長類及びハリネズミのみに存在するため、ヒトａｐｏ（ａ）トランスジェニックマウス及びヒトａｐｏＢトランスジェニックマウスを交配することにより作出したＬｐ（ａ）トランスジェニックマウスを使用した（Nature genetics, 1995, 9: 424-431; Nature, 1992, 360: 670-672; Proceedings of the National Academy of Sciences, 1994, 91: 2130; Circulation, 2002, 105: 1491-1496）。Ｌｐ（ａ）トランスジェニックマウスにおいては、血清Ｌｐ（ａ）レベルは、雄マウスよびも雌マウスの方が高い（Atherosclerosis, 211: 41-47）。Ｌｐ（ａ）トランスジェニックマウスにおいて両方の卵巣を摘出することにより血清Ｌｐ（ａ）レベルが上昇するため、１回目の免疫接種の２週間前に、Ｌｐ（ａ）トランスジェニックマウスに卵巣摘出手術を施した。同様に、Ｌｐ（ａ）トランスジェニックマウスへ免疫接種した（図４ａ）。３回目及び４回目の免疫接種から２週間後、抗ａｐｏ（ａ）抗体の力価はＨＢｃ−ａｐｏ（ａ）群においてのみ観察された（図４ｂ及び４ｃ）。Ｌｐ（ａ）トランスジェニックマウスにおいては、この免疫接種の結果、抗プラスミノゲン抗体は産生されなかった（図４ｄ）。

Ｌｐ（ａ）トランスジェニックマウスへのＤＮＡワクチン接種について、Ｔ細胞増殖アッセイ及びＥＬＩＳｐｏｔアッセイを実施した。免疫接種したＬｐ（ａ）トランスジェニックマウスにおいては、Ｔ細胞増殖アッセイは、ａｐｏ（ａ）１２ａ．ａ．ペプチドによる刺激は、免疫接種したマウスからの脾細胞の増殖を誘導しないことを示した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、ａｐｏ（ａ）１２ａ．ａ．ペプチドはＩＦＮ−γ及びＩＬ−４のいずれの産生をも誘導しなかった。これらのデータからも、配列番号１で表されるアミノ酸配列は、Ｔ細胞活性化を誘導するＴ細胞エピトープを含有しないことが示された。

Ｌｐ（ａ）トランスジェニックマウスにおける頚動脈結紮モデル
左総頚動脈の結紮により生じた血流停止のため、ＨＢｃ−ａｐｏ（ａ）で免疫接種したＬｐ（ａ）トランスジェニックマウスと比較して、ＨＢｃ又は生理食塩水で免疫接種したＬｐ（ａ）トランスジェニックマウスにおいて、より高度に新生内膜形成の増加が引き起こされた（図５ａ）。ＨＢｃ−ａｐｏ（ａ）、ＨＢｃ又は生理食塩水により免疫接種したＬｐ（ａ）トランスジェニックマウスの間で、中膜形成における差はなかった。中膜に対する内膜の割合は、ＨＢｃ−ａｐｏ（ａ）群よりも、ＨＢｃ及び生理食塩水群の方が有意に高かった（図５ｂ）。このことから、Ｌｐ（ａ）トランスジェニックマウスへのＨＢｃ−ａｐｏ（ａ）ワクチン接種により新生内膜形成が減弱されたことが示唆された（図５ｂ）。更に、免疫組織化学により、Ｌｐ（ａ）トランスジェニックマウスの結紮血管におけるＬｐ（ａ）の発現を評価した。アテローム性動脈硬化により冒された動脈におけるＬｐ（ａ）の沈着を実証する多数の研究がある。Ｌｐ（ａ）の沈着は、免疫接種群よりも非免疫接種群において、はるかに強く認められた（図５ｃ）。予想外なことに、ＨＢｃ−ａｐｏ（ａ）ワクチン接種は、血清Ｌｐ（ａ）レベルを減少させなかった。
作製した、HBc-apo(a)のアミノ酸配列を配列番号１６に、当該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を配列番号１５に示す。以下の領域が挿入配列に相当する。
配列場号１５のヌクレオチドＮｏ．２４４〜２９４（このうち、ヌクレオチドＮｏ．２５０〜２８５が配列番号１をコードする）
配列番号１６のアミノ酸Ｎｏ．８１〜９７（このうち、アミノ酸Ｎｏ．８３〜９４が配列番号１に相当する）

本発明により、自己反応性のＴ細胞誘導を回避しつつ、動脈硬化症を治療又は予防することができるＤＮＡワクチンが提供される。

Claims (9)

1. アポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープを含むアミノ酸配列が挿入されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターを含む、動脈硬化症の治療又は予防剤であって、該特異的エピトープを含むアミノ酸配列が、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのアミノ酸残基８０と８１の間に挿入されており、挿入アミノ酸配列が配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、治療又は予防剤。
2. 動脈硬化症がアテローム性動脈硬化症である、請求項１記載の治療又は予防剤。
3. 挿入アミノ酸配列が更に１以上の特異的エピトープを含む、請求項１又は２記載の治療又は予防剤。
4. 更なる特異的エピトープが、アポリポプロテインＢの特異的エピトープである、請求項３記載の治療又は予防剤。
5. 複数回投与されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の治療又は予防剤。
6. 投与回数が２、３又は４回である、請求項５記載の治療又は予防剤。
7. 動脈硬化症の治療又は予防において使用するための、アポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープを含むアミノ酸配列が挿入されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターであって、該特異的エピトープを含むアミノ酸配列が、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのアミノ酸残基８０と８１の間に挿入されており、挿入アミノ酸配列が配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、発現ベクター。
8. 動脈硬化症がアテローム性動脈硬化症である、請求項７記載の発現ベクター。
9. 挿入アミノ酸配列が更に１以上の特異的エピトープを含む、請求項７又は８記載の発現ベクター。