JP5951634B2 - マイコバクテリウム抗原性組成物 - Google Patents

Description

本発明は、Rv1196関連抗原を含み、低いイオン強度を有する免疫原性組成物に関する。本発明は、1以上の免疫賦活薬を更に含む、そのような免疫原性組成物にも関する。そのような免疫原性組成物の調製方法及び関連するキットも提供される。

結核(TB)は、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)及び他のマイコバクテリウム(Mycobacterium)種の感染によって引き起こされる慢性感染症である。それは、発展途上国の主要な疾患であり、世界の先進地域においても増加している問題である。20億人超が結核菌(TB bacilli)に感染し、毎年約940万例がTBの新規症例であり、170万人が死亡すると考えられている。結核菌感染者の10％は活動性TBを発症し、活動性TBの各人が1年につき平均して10〜15人の他人を感染させる。世界的に年間発生率はピークに達したが、人口増加により死亡及び症例数はなお上昇している(World Health Organisation Tuberculosis Facts 2010)。

マイコバクテリウムタンパク質Rv1196(例えば、Dillonら、Infection and Immunity、1999、67(6): 2941〜2950頁にMtb39aという名称で記載されている)又はその断片若しくは誘導体は、結核の治療又は予防に対して潜在的効果があるタンパク質抗原である。Rv1196は高度に保存されており、H37Rv、C、Haarlem、CDC1551、94-M4241A、98-R604INH-RIF-EM、KZN605、KZN1435、KZN4207、KZNR506株にわたって100％配列同一性を有し、F11株は単一点突然変異Q30Kを有する。Rv1196は融合タンパク質抗原Mtb72f及びM72(例えば、国際特許出願第2006/117240号に記載されている)の成分である。

確実に免疫原性を維持するには、タンパク質抗原の製剤化が極めて重要である。免疫賦活薬を使用して、いずれかの所与の抗原に対して引き起こされる免疫応答が改善される場合もある。しかし、免疫原性組成物中にアジュバントを含めることは、成分調製の複雑さ並びに組成物の配分及び製剤化の複雑さを増大させる。製剤者は、アジュバント成分及び抗原成分の各々の調製を考慮しなければならない。特に、アジュバント成分と抗原成分との適合性を考慮すべきである。これは、凍結乾燥した抗原又は抗原性調製物をアジュバント調製物と一緒に再構成するよう意図する場合に特に当てはまる。そのような状況では、アジュバント調製物の緩衝液が抗原に対して適切であり、抗原の免疫原性又は可溶性がアジュバントによる影響を受けないことが重要である。

本発明者らは、Rv1196関連抗原が塩の存在に対して特に感受性であることを初めて同定した。理論に限定されるものではないが、Rv1196関連抗原は、「塩析」として公知の現象によって有害な影響を受けると考えられており、塩析は塩化ナトリウムなどの塩との相互作用により、溶液からタンパク質が沈殿することとして定義できる。本発明者らは、これらの抗原が、150mMほどの低い塩化ナトリウム濃度で凝集し沈殿することを見出した。結果的に、Rv1196関連抗原を含む免疫原性組成物の安定性は、塩化ナトリウム濃度を減少させることによって驚くほど改善できる。

したがって、本発明はRv1196関連抗原を含む免疫原性組成物であって、組成物の導電率が13mS/cm以下である、免疫原性組成物を提供する。

加えて、Rv1196関連抗原を含む免疫原性組成物であって、前記組成物中の塩濃度が130mM以下である、免疫原性組成物が提供される。

本発明はまた、Rv1196関連抗原を含む免疫原性組成物であって、前記組成物中の塩化ナトリウム濃度が130mM以下である、免疫原性組成物を提供する。
本発明はまた以下に関する。
[項目１]
Rv1196関連抗原を含む免疫原性組成物であって、
(i)組成物の導電率が13mS/cm以下である;及び/又は
(ii)前記組成物中の塩濃度が130mM以下である;及び/又は
(iii)前記組成物中の塩化ナトリウム濃度が130mM以下である、免疫原性組成物。
[項目２]
組成物の導電率が10mS/cm以下である、項目1に記載の免疫原性組成物。
[項目３]
組成物の導電率が3mS/cm以下である、項目2に記載の免疫原性組成物。
[項目４]
前記組成物中の塩濃度が100mM以下である、項目1〜3のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目５]
前記組成物中の塩濃度が40mM以下である、項目4に記載の免疫原性組成物。
[項目６]
前記組成物中の塩化ナトリウム濃度が100mM以下である、項目1〜5のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目７]
前記組成物中の塩化ナトリウム濃度が40mM以下である、項目6に記載の免疫原性組成物。
[項目８]
免疫原性組成物中のCaCl ₂ 濃度が30mM以下である、項目1〜7のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目９]
免疫原性組成物中のMgSO ₄ 濃度が60mM以下である、項目1〜8のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目１０]
NH ₄ ⁺ 、Mg ²⁺ 及びCa ²⁺ イオンの合計濃度が40mM以下である、項目1〜9のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目１１]
非イオン性等張化剤を更に含む、項目1〜10のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目１２]
非イオン性等張化剤が多価アルコールである、項目11に記載の免疫原性組成物。
[項目１３]
多価アルコールがソルビトールである、項目12に記載の免疫原性組成物。
[項目１４]
ソルビトール濃度が約4〜約6％(w/v)である、項目13に記載の免疫原性組成物。
[項目１５]
スクロース濃度が約4〜約6％(w/v)である、項目1〜13のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目１６]
1以上の免疫賦活薬を更に含む、項目1〜15のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目１７]
免疫賦活薬がサポニン及び/又はTLR4作動薬である、項目16に記載の免疫原性組成物。
[項目１８]
免疫賦活薬がリポソームの形態である、項目17に記載の免疫原性組成物。
[項目１９]
サポニンがQS21である、項目17又は18に記載の免疫原性組成物。
[項目２０]
TLR4作動薬が3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドAである、項目17〜19のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目２１]
モル浸透圧濃度が250〜750mOsm/kgである、項目1〜20のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目２２]
組成物が50μL〜1mLの単位用量として提供される、項目1〜21のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目２３]
単位用量が100μL〜750μLである、項目22に記載の免疫原性組成物。
[項目２４]
単位用量が1〜100μgのRv1196関連タンパク質を含有する、項目22又は23に記載の免疫原性組成物。
[項目２５]
単位用量が5〜50μgのRv1196関連タンパク質を含有する、項目24に記載の免疫原性組成物。
[項目２６]
前記組成物のpHが7.0〜9.0の範囲にある、項目1〜25のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目２７]
Rv1196関連抗原が配列番号1と少なくとも70％の同一性を有する配列を含む、項目1〜26のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目２８]
Rv1196関連抗原が配列番号1と少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、項目27に記載の免疫原性組成物。
[項目２９]
Rv1196関連抗原が長さ少なくとも350アミノ酸である配列番号1の断片を含む、項目1〜26のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目３０]
Rv1196関連抗原が配列番号7と少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、項目1〜26のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目３１]
Rv1196関連抗原が配列番号7と少なくとも90％の同一性を有する配列からなる、項目1〜26のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目３２]
Rv1196関連抗原が配列番号7のアミノ酸配列を含む、項目31に記載の免疫原性組成物。
[項目３３]
Rv1196関連抗原が配列番号7のアミノ酸配列からなる、項目32に記載の免疫原性組成物。
[項目３４]
免疫原性組成物の抗原性の少なくとも80％が、25℃で24時間貯蔵した後に残っている、項目1〜33のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目３５]
医薬で使用するための、項目1〜34のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目３６]
医薬品の製造における、項目1〜34のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用。
[項目３７]
安全且つ有効な量の項目1〜34のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、ヒト型結核菌による感染などマイコバクテリウムによる感染を予防、治療又は改善する方法。
[項目３８]
項目1〜34のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を作製する方法であって、
a)Rv1196関連抗原を凍結乾燥するステップと、
b)ステップa)の凍結乾燥したRv1196関連抗原を水溶液を用いて再構成するステップであって、
(i)該溶液の導電率が13mS/cm以下である;及び/又は、
(ii)該溶液中の塩濃度が130mM以下である;及び/又は、
(iii)該溶液中の塩化ナトリウム濃度が130mM以下である
ステップと
を含む方法。
[項目３９]
項目1〜34のいずれか一項に記載の安定な免疫原性組成物を作製する方法であって、
a)Rv1196関連抗原を凍結乾燥するステップと、
b)ステップa)の凍結乾燥したRv1196関連抗原を水溶液を用いて再構成するステップであって、
(i)該溶液の導電率が13mS/cm以下である;及び/又は、
(ii)該溶液中の塩濃度が130mM以下である;及び/又は、
(iii)該溶液中の塩化ナトリウム濃度が130mM以下である
ステップと
を含み、免疫原性組成物の抗原性の少なくとも80％が、25℃で24時間貯蔵した後に残っている、方法。
[項目４０]
以下、
a)凍結乾燥したRv1196関連抗原と、
b)水溶液であって、
(i)該溶液の導電率が13mS/cm以下である;及び/又は、
(ii)該溶液中の塩濃度が130mM以下である;及び/又は、
(iii)該溶液中の塩化ナトリウム濃度が130mM以下である
水溶液と
を含むキット。
[項目４１]
水溶液が免疫賦活薬を含む、項目38若しくは39に記載の方法又は項目40に記載のキット。
[項目４２]
水溶液がリポソーム製剤中のサポニン及びTLR4作動薬、並びに非イオン性等張化剤を含む、項目41に記載の方法又はキット。
[項目４３]
非イオン性等張化剤がソルビトールである、項目42に記載の方法又はキット。
[項目４４]
ソルビトール濃度が約2.5〜約15％(w/v)である、項目43に記載の方法又はキット。
[項目４５]
サポニンがQS21である、項目42〜44のいずれか一項に記載の方法又はキット。
[項目４６]
TLR4作動薬が3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドAである、項目42〜45のいずれか一項に記載の方法又はキット。

QS21溶解活性曲線を表す図である。 異なるASA製剤における各3D-MPL同族体のパーセンテージを表す図である。 様々なpH及びNaCl濃度を持つ免疫原性組成物の、貯蔵後の比濁分析を表す図である。 様々なpH及びNaCl濃度を持つ免疫原性組成物の、貯蔵後のDLSを表す図である。 様々なpH及びNaCl濃度を持つ免疫原性組成物の、貯蔵後のDLSを表す図である。 様々なpH及びNaCl濃度を持つ免疫原性組成物の、貯蔵後の比濁分析を表す図である。 様々なpH及びNaCl濃度を持つ免疫原性組成物の、貯蔵後の抗原性安定性を表す図である。 様々なpH及びNaCl濃度を持つ免疫原性組成物の、貯蔵後のSEC-HPLC分析を表す図である。 様々なpH及びNaCl濃度を持つ免疫原性組成物の、貯蔵後のSEC-HPLC分析を表す図である。 様々なpH及びNaCl濃度を持つ免疫原性組成物の、貯蔵後のSEC-HPLC分析を表す図である。 様々なpH及びNaCl濃度を持つ免疫原性組成物の、貯蔵後のSEC-HPLC分析を表す図である。 様々なpH及びNaCl濃度を持つ免疫原性組成物の、貯蔵後の抗原性を表す図である。 NaCl標準溶液の導電率を表す図である。 本発明の免疫原性組成物を使用するマウスにおけるCD4 T細胞応答の誘発を表す図である。 本発明の免疫原性組成物を使用するマウスにおけるCD8 T細胞応答の誘発を表す図である。 様々なpH及びNaCl濃度を持つ免疫原性組成物の、貯蔵後の比濁分析を表す図である。 様々なpH及びNaCl濃度を持つ免疫原性組成物の、貯蔵後のDLSを表す図である。 様々なNaCl濃度を持つ免疫原性組成物の、貯蔵後の抗原性を表す図である。

配列識別子の簡単な説明
配列番号1 ヒト型結核菌H37Rv由来のRv1196タンパク質のアミノ酸配列
配列番号2 ヒト型結核菌H37Rv由来のRv1196タンパク質をコードしているヌクレオチド配列
配列番号3 ヒト型結核菌F11由来のRv1196タンパク質のアミノ酸配列
配列番号4 ヒト型結核菌F11由来のRv1196タンパク質をコードしているヌクレオチド配列
配列番号5 M72タンパク質のアミノ酸配列
配列番号6 M72タンパク質をコードしているヌクレオチド配列
配列番号7 二つのN末端His残基を持つM72タンパク質のアミノ酸配列
配列番号8 二つのN末端His残基を持つM72タンパク質をコードしているヌクレオチド配列
配列番号9 Mtb72fタンパク質のアミノ酸配列
配列番号10 Mtb72fタンパク質をコードしているヌクレオチド配列
配列番号11 六つのN末端His残基を持つMtb72fタンパク質のアミノ酸配列
配列番号12 六つのN末端His残基を持つMtb72fタンパク質をコードしているヌクレオチド配列
配列番号13 CpGオリゴ1(CpG 1826)のヌクレオチド配列
配列番号14 CpGオリゴ2(CpG 1758)のヌクレオチド配列
配列番号15 CpGオリゴ3のヌクレオチド配列
配列番号16 CpGオリゴ4(CpG 2006)のヌクレオチド配列
配列番号17 CpGオリゴ5(CpG 1686)のヌクレオチド配列
発明の詳細な説明
第一の態様において、本発明はRv1196関連抗原を含む免疫原性組成物であって、組成物の導電率が13mS/cm以下である、免疫原性組成物を提供する。特に、本発明はRv1196関連抗原を含む免疫原性組成物であって、免疫原性組成物の導電率が12mS/cm以下、例えば10mS/cm以下、8mS/cm以下、6mS/cm以下、5mS/cm以下、4mS/cm以下又は3mS/cm以下である、免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態において、免疫原性組成物の導電率は、2.5mS/cm以下、例えば2.25mS/cm以下又は2.0mS/cm以下である。更なる特定の実施形態において、免疫原性組成物の導電率は、1.5〜2.5mS/cmである。

第二の態様において、本発明はRv1196関連抗原を含む免疫原性組成物であって、前記組成物中の塩濃度が130mM以下である、免疫原性組成物を提供する。特に、本発明はRv1196関連抗原を含む免疫原性組成物であって、前記組成物中の塩濃度が100mM以下、例えば90mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下、50mM以下又は40mM以下である、免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態において、前記組成物中の塩濃度は35mM以下、例えば30mM以下又は25mM以下である。更なる特定の実施形態において、前記組成物中の塩濃度は20〜40mM、例えば25〜35mMである。

第三の態様において、本発明はRv1196関連抗原を含む免疫原性組成物であって、塩化ナトリウム濃度が130mM以下である、免疫原性組成物を提供する。特に、本発明はRv1196関連抗原を含む免疫原性組成物であって、塩化ナトリウム濃度が100mM以下、例えば、90mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下、50mM以下、40mM以下、30mM以下、20mM以下又は15mM以下である、免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態において、免疫原性組成物中の塩化ナトリウム濃度は、10mM以下、例えば7.5mM以下である。適切には、免疫原性組成物中の塩化ナトリウム濃度は、5mM又はそれ未満である。更なる特定の実施形態において、免疫原性組成物は、本質的に塩化ナトリウムを含まない。本質的に含まないとは、塩化ナトリウム濃度が0mM又はほぼ0mM(例えば3mM以下、2mM以下若しくは1mM以下)であることを意味している。

適切には、免疫原性組成物中のCaCl₂濃度は、40mM以下、30mM以下、20mM以下、15mM以下又は10mM以下である。

適切には、免疫原性組成物中のMgSO₄濃度は、80mM以下、60mM以下、40mM以下、30mM以下、20mM以下又は10mM以下である。

適切には、免疫原性組成物中のNH₄ ⁺、Mg²⁺及びCa²⁺イオンの合計濃度は、80mM以下、60mM以下、40mM以下、30mM以下、20mM以下又は10mM以下である。

本発明の免疫原性組成物は、水溶性調製物である。

本発明の免疫原性組成物の導電率は、当該技術分野において公知の技術を使用して(例えば専用の導電率計又は導電率を測定できる他の機器を使用して)測定できる。一つの適切な機器は、Malvern Instruments(UK)製のZetasizer Nano ZSである。

当業者は、公知の技術及びキットを使用して、ナトリウム(Na⁺)及び塩化物(Cl^-)イオン両方の濃度を容易に試験できる。例えば、ナトリウムは、Biosupply製のSodium Enzymatic Assay Kit (カタログ番号: BQ011EAEL)などのキットを使用して測定できる。塩化物は、Biosupply製のChloride Enzymatic Assay Kit(カタログ番号:BQ006EAEL)などのキットを使用して測定できる。

結核(TB)は、ヒト型結核菌及び他のマイコバクテリウム種の感染によって引き起こされる慢性感染症である。それは、発展途上国の主要な疾患であり、世界の先進地域においても増加している問題である。20億人超が結核菌に感染し、毎年約940万例がTBの新規症例であり、170万人が死亡すると考えられている。結核菌感染者の10％は活動性TBを発症し、活動性TBの各人が1年につき平均して10〜15人の他人を感染させる。世界的に年間発生率はピークに達したが、人口増加により死亡及び症例数はなお上昇している(World Health Organisation Tuberculosis Facts 2010)。

ヒト型結核菌は、呼吸経路を経由して個体に感染する。肺胞マクロファージは細菌を貪食するが、細菌は酸性リソソームとのファゴソーム融合を阻害することによって生存し、増殖することができる。CD4+及びCD8+ T細胞が関与する複雑な免疫応答が続いて起こり、結果として最終的に肉芽腫の形成を起こす。ヒト型結核菌の病原体としての成功に重要なことは、分離されたが根絶されなかった細菌が長期間残存することができ、後に活動性TBを発症するまで個体を脆弱なままにするという事実である。

感染個体の5％未満が感染後一年以内に活動性TBを発症する。肉芽腫は数十年間残存する場合があり、酸素及び栄養分を奪われた休止状態で生きているヒト型結核菌を含有すると考えられている。しかし、休止状態の細菌の大多数は、全身に拡散している非マクロファージ細胞型の中に位置していることが最近示唆されている(Lochtら、Expert Opin. Biol. Ther.、2007 7(11):1665〜1677頁)。例えば免疫抑制性の事象の結果として、宿主の自然免疫と病原体の間のバランスが変化する場合に、活動性TBの発症が起こる(Anderson P、Trends in Microbiology、2007 15(1):7〜13頁; Ehlers S、Infection、2009 37(2):87〜95頁)。

潜伏TBと活動性TBとのバランスについて記載している動的な仮説も提案されてきた
(Cardana P-J、Inflammation & Allergy - Drug Targets、2006 6:27〜39頁; Cardana P-J、Infection、2009 37(2):80〜86頁)。

感染は相当な期間無症状である場合があるが、活動性疾患は通常急性肺炎を示し、疲労、体重減少、発熱及び持続性の咳をもたらす。治療しない場合、通常は重篤な合併症及び死亡をもたらす。

結核は、長期にわたる抗生物質療法を使用して一般に管理できる。しかしそのような治療は疾患の蔓延を防止するには不十分である。活動性感染した個体は、しばらくの間ほとんど無症状だが、伝染性である可能性はある。加えて、治療計画の遵守は重要だが、患者の挙動をモニタリングすることは困難である。一部の患者は治療過程を完了しないため、効果が無い治療になったり薬物抵抗性の発生をもたらしたりする場合がある。

多剤耐性TB(MDR-TB)は、第一選択薬に応答しない形態である。全TB症例の3.3％がMDR-TBであり、推定で440,000例の新規MDR-TB症例が毎年発生している。第一選択薬に対する抵抗性に加えて第二選択薬に対する抵抗性が発生する場合、広範な薬物抵抗性TB(XDR-TB)が現れる。実質的に処置不能のXDR-TBが、58カ国で確認されている(World Health Organisation Tuberculosis Facts 2010)。

抗生物質治療の全過程を完了した場合であっても、ヒト型結核菌感染を感染個体から根絶することはできず、再活性化される可能性がある潜伏感染として残る場合がある。結核の蔓延を管理するには、有効なワクチン接種プログラム及び疾患の正確な早期診断が何より重要である。

現在では、生細菌を用いるワクチン接種が、防御免疫を誘導するために最も広く使用されている方法である。この目的に利用されている最も一般的なマイコバクテリウムは、カルメットゲラン菌(Bacillus Calmette-Guerin)(BCG)であり、60年以上前に初めて開発されたウシ型結核菌(M. bovis)の無毒株である。しかし、BCGの安全性及び有効性は論争の元であり-小児における重症疾患の徴候に対して防御する一方で、BCGは潜伏TBの確立又は成人期における肺疾患の再活性化を防止しない。加えて、米国などいくつかの国はこの薬剤を用いて公衆に予防接種を行わない。

マイコバクテリウム感染の初期段階に強く発現するタンパク質のいくつかが、動物のワクチン接種モデルにおいて予防効果をもたらすことが示された。しかし、感染の初期段階に高発現する抗原を用いるワクチン接種は、感染の後期段階に対する最適な免疫応答を生じることができない。潜伏感染中の適切な管理は、その時に発現している特定の抗原に対して特異的なT細胞を必要とし得る。休眠中の持続性細菌を直接標的にする感染後投与ワクチンは、TBの再活性化の防止に役立ち、それによってTBの管理が強化され、又は感染の除去さえ可能になる。したがって潜伏TBを標的にするワクチンは、世界的なTB感染率を著しく及び経済的に減少させる可能性がある。

後期抗原に基づくサブユニットワクチンを初期抗原と組み合わせて利用して、多相ワクチン(multiphase vaccine)を提供することもできる。別法として、初期及び/又は後期抗原を使用して、BCGワクチン接種を補充及び改善することができる(BCG応答を促進することによって又は高度な組換えBCG株の開発によって)。

タンパク質抗原Rv1196は、結核の治療又は予防に対して潜在的な利点がある。Rv1196は、例えば、Dillonら、Infection and Immunity、1999、67(6): 2941〜2950頁にMtb39aという名称で記載されている。Rv1196タンパク質は高度に保存されており、H37Rv、C、Haarlem、CDC1551、KZN605、KZN1435及びKZN4207株にわたって100％配列同一性を有し、F11株は単一点突然変異(Q30K)を有する。

タンパク質抗原Mtb72f及びM72は、Rv1196を含む融合タンパク質であり、結核の治療又は予防に対して潜在的な利点がある。Mtb72fは、いくつかの動物モデルにおいて予防を可能にすることが示されてきた(例えば:Brandtら、Infect. Immun.、2004 72(11):6622〜6632頁; Skeikyら、J. Immunol.、2004 172:7618〜7628頁; Tsenovaら、Infect. Immun.、2006 74(4):2392〜2401頁; Reedら、PNAS、2009 106(7):2301〜2306頁を参照のこと)。Mtb72fは、臨床試験の対象にもなった(Von Eschenら、2009、Human Vaccines、5(7):475〜482頁)。M72は改善された抗原であり、この抗原はMtb72fと比較して単一のセリンからアラニンへの変異を組み込んでおり、その結果安定特性が改善されている。M72関連抗原は、潜伏TBモデルにおいても有用性があるものであることが示されている(国際特許出願第2006/117240号)。

本明細書では用語「Rv1196関連抗原」は、配列番号1で示されるRv1196タンパク質又はその免疫原性誘導体を意味している。本明細書では用語「誘導体」は、参照配列に対して改変された抗原を意味している。免疫原性誘導体は、参照配列に十分類似しており、参照配列の免疫特性を保持しており、参照配列に対する免疫応答が引き起こされる能力を残している。誘導体は、例えば、参照配列の改変版を含むことができ、又は参照配列の改変版からなることができる。

Rv1196関連抗原は、例えば1000アミノ酸残基未満、例えば900アミノ酸残基未満、特に800アミノ酸残基未満を含有し得る。

T細胞エピトープは、T細胞(例えばCD4+又はCD8+ T細胞)によって認識される連続するアミノ酸の短い領域である。T細胞エピトープの同定は、当業者に公知であるエピトープマッピング実験によって達成され得る(例えば、Paul、Fundamental Immunology、第3版、243〜247頁(1993); Beissbarthら、Bioinformatics、2005 21(Suppl.1):i29〜i37頁を参照のこと)。ヒトなど非近交系の多様な集団において、異なるHLA型は、特定のエピトープが集団の全てのメンバーに認識されるとは限らないことを意味している。結核においてT細胞の応答が大きく関与するため、認識レベル及び免疫応答の程度を最大化するには、Rv1196の免疫原性誘導体は、望ましくは大部分(又は適切には全て)のT細胞エピトープを完全なまま含有するものである。

単一のアミノ酸若しくは少しのパーセンテージのアミノ酸を変更、追加又は欠失する、Rv1196タンパク質に対する個別の置換、欠失又は付加は、「免疫原性誘導体」であることを当業者は認識することになり、その変更(複数可)は、機能的に類似しているアミノ酸によるアミノ酸の置換、又は免疫原性機能に実質的に影響を与えない残基の置換/欠失/付加をもたらす。

機能的に類似しているアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。一般に、そのような保存的置換は、以下に指定したアミノ酸グループの一つに分類されることになるが、状況によっては、他の置換が、抗原の免疫原特性に実質的に影響を及ぼすことなく可能である場合もある。以下の八つの各群は、典型的に互いに保存的に置換されるアミノ酸を含有する:
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リシン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、トレオニン(T);及び
8)システイン(C)、メチオニン(M)
(例えば、Creighton、Proteins、1984を参照のこと)。

適切には、そのような置換はエピトープ領域に起こらず、したがって抗原の免疫特性に著しい影響を与えない。

免疫原性誘導体は、参照配列と比較して追加的なアミノ酸が挿入されているものも含み得る。適切には、そのような挿入はエピトープ領域に起こらず、したがって抗原の免疫特性に著しい影響を与えない。挿入の一つの例には、問題の抗原の発現及び/又は精製に役立つヒスチジン残基の短い領域(例えば2〜6残基)がある。

免疫原性誘導体は、参照配列と比較してアミノ酸が欠失しているものを含む。適切には、そのような欠失はエピトープ領域に起こらず、したがって抗原の免疫特性に著しい影響を与えない。

特定の免疫原性誘導体は、置換、欠失及び付加(又は、その任意の組合せ)を含み得ることを、当業者は認識する。

二つ以上のポリペプチド配列において、用語「同一」又はパーセンテージ「同一性」とは、以下の配列比較アルゴリズムの一つを使用して又は手作業によるアライメントと目視検査によって測定されるように、比較ウィンドウ若しくは指定された領域上で比較及び整列させ、最大限一致させたときに、同じ又は指定されたパーセンテージの同じアミノ酸残基を有する(すなわち、指定された領域上で70％同一性、場合によっては75％、80％、85％、90％、95％、98％若しくは99％同一性)二つ以上の配列若しくは部分配列を意味している。この定義は試験配列の相補体も意味している。場合によっては、同一性は、長さ少なくとも250アミノ酸、例えば300アミノ酸又は350アミノ酸の領域にわたって存在する。適切には、この比較は、(誘導体配列と対照的に)参照配列の全長に相当するウィンドウにわたって実施される。

配列比較の場合、一つの配列が参照配列になり、これに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムのプログラムパラメータが指定される。初期設定プログラムパラメータを使用でき、又は代わりのパラメータを指定することができる。次いで配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセンテージを算出する。

本明細書では「比較ウィンドウ」は部分を意味し、その部分において、二つの配列を最適に整列させた後に、配列は連続する位置にある同数の参照配列と比較され得る。比較するために配列を整列させる方法は、当技術分野で周知である。比較するための配列の最適なアライメントは、例えば、Smith & Waterman、Adv. Appl. Math.、2:482頁(1981)の局所的相同性アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch、J. Mol. Biol.、48:443頁(1970)の相同性アライメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA、85:2444頁(1988)の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムをコンピュータ化して実行することによって(Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、WIのGAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA)、又は手作業によるアライメントと目視検査によって(例えば、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubelら編、1995捕足)を参照のこと)実行できる。

有用なアルゴリズムの一例は、PILEUPである。PILEUPは、漸進性ペアワイズアライメントを使用して、関連配列の群から多重配列のアライメントを作成し、関係性及び配列同一性パーセントを示す。アライメントを作成するために使用されたクラスタリング関係を示す樹形図又は系統図(dendogram)も表示する。PILEUPは、Feng & Doolittle、J. Mol. Evol.、35:351〜360頁(1987)の漸進性整列方法を簡略化したものを使用している。使用されている方法は、Higgins & Sharp、CABIOS、5:151〜153頁(1989)によって記載されている方法に類似している。このプログラムは、最大長5,000ヌクレオチド又はアミノ酸の各々を300配列まで整列させることができる。多重アライメントの手順は、二つの最も類似している配列のペアワイズアライメントから始まり、二つの配列が整列したクラスターを作製する。次いでこのクラスターが、次に最も相関する配列又は整列した配列クラスターと整列される。二つの配列クラスターは、二つの個々の配列のペアワイズアライメントを単純に拡張することによって整列される。最終的なアライメントは、一連の漸進性ペアワイズアライメントによって達成される。プログラムは、配列を比較する領域に対する特定の配列及びそのアミノ酸座標を指定することによって、並びにプログラムパラメータを指定することによって実行される。PILEUPを使用して、以下のパラメータ:初期設定ギャップ加重(3.00)、初期設定ギャップ長さ加重(0.10)及び加重末端ギャップを使用して、参照配列を他の試験配列と比較し、配列同一性パーセント関係を決定する。PILEUPは、GCG配列分析ソフトウェアパッケージ、例えば7.0版(Devereauxら、Nuc. Acids Res.、12:387〜395頁(1984))から入手できる。

配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの別の例は、BLAST及びBLAST2.0アルゴリズムであり、それぞれ、Altschulら、Nuc. Acids Res.、25:3389〜3402頁(1977)及びAltschulら、J. Mol. Biol.、215:403〜410頁(1990)に記載されている。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、米国立バイオテクノロジー情報センターによって一般公開されている(ウェブサイトwww.ncbi.nlm.nih.gov/)。このアルゴリズムでは、データベース配列中にある同じ長さのワードと整列したときに一致する又はいくつかの正の値の閾値スコアTを満たす、問い合わせ配列内にある長さWの短いワードを同定することによって高スコア配列対(HSP)を最初に同定する。Tは、近傍ワードスコア閾値(上記、Altschulら)と呼ばれている。これらの最初の近傍ワードヒットは、それを含有する更に長いHSPを見出す検索を開始するためのシードの働きをする。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加できる限り、各配列に沿って両方向に広げられる。ヌクレオチド配列の場合、累積スコアは、パラメータM(一対の一致している残基に対する報酬スコア(reward score);常に>0)及びN(ミスマッチ残基に対するペナルティスコア;常に<0)を使用して算出される。アミノ酸配列の場合、スコアマトリックスを使用して累積スコアを算出する。各方向に拡張するワードヒットは、次の場合に停止する:累積アライメントスコアが最大達成値から量Xだけ低下する場合;1以上の負のスコアになる残基のアライメントが蓄積することにより、累積スコアが0以下になる場合;又は、いずれかの配列の末端に達する場合。BLASTアルゴリズムパラメータW、T及びXは、アライメントの感度及び速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)は、初期設定としてワード長(W)11、期待値(E)又は10、M=5、N=-4及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムは、初期設定としてワード長3及び期待値(E)10、及びBLOSUM62スコアマトリックス(Henikoff & Henikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:10915頁(1989)を参照のこと)アライメント(B)50、期待値(E)10、M=5、N=-4及び両鎖の比較を使用する。

BLASTアルゴリズムも、二つの配列間の類似性の統計分析を実施する(例えば、Karlin & Altschul、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA、90:5873〜5787頁(1993)を参照のこと)。BLASTアルゴリズムによって提示される類似性の一つの尺度は、最小合計確率(smallest sum probability)(P(N))であり、二つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を与える。例えば、参照核酸と試験核酸との比較において、最小合計確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合、核酸は参照配列に類似していると見なされる。

いずれにしても、ポリペプチド配列の免疫原性誘導体は、参照配列と本質的に同じ活性を有する。本質的に同じ活性とは、リンパ増殖、培養上清中にあるサイトカインの産生(ELISA、CBAなどによって測定される)、又は(例えば、CD3、CD4、CD8、IL2、TNF-α、IFN-γ、CD40L、CD69などの免疫マーカーに特異的な抗体を使用して)細胞内外を染色しその後フローサイトメータで分析することによるT及びB細胞応答の特徴付けにより細胞の活性化を測定する、特定の抗原を用いるPBMC又は全血の、in vitro再刺激アッセイ(例えば数時間〜最大で2週間まで、例えば最大で1日、1日〜1週間又は1〜2週間までの再刺激)における、少なくとも50％、適切には少なくとも75％、特に少なくとも90％の参照配列の活性を意味している。適切には、本質的に同じ活性とは、T細胞増殖及び/又はIFN-γ産生アッセイにおける、少なくとも50％、適切には少なくとも75％、特に少なくとも90％の参照配列の活性を意味している。

適切には、Rv1196関連抗原は、配列番号1に対して少なくとも70％の同一性を有する配列、例えば少なくとも80％、特に少なくとも90％、特別に少なくとも95％、例えば少なくとも98％、例えば少なくとも99％の同一性を有する配列を含む、例えばその配列からなる。

Rv1196関連抗原の具体例は、配列番号1で示されるヒト型結核菌H37Rv株由来のRv1196である。したがって、本発明の一実施形態において、Rv1196関連抗原は配列番号1を含むタンパク質である。本発明の第二の実施形態において、Rv1196関連抗原は配列番号1からなるタンパク質である。

Rv1196関連抗原のさらなる例は、配列番号3で示されるヒト型結核菌F11株由来のRv1196である。本発明の一実施形態において、Rv1196関連抗原は配列番号3を含むタンパク質である。本発明の第二の実施形態において、Rv1196関連抗原は配列番号3からなるタンパク質である。

典型的なRv1196関連抗原は、少数の欠失、挿入及び/又は置換を有する配列番号1の免疫原性誘導体を含む、例えばそれからなる。例えば、0〜5個所に最大5残基までの欠失、0〜5個所に最大5残基までの挿入及び最大20残基までの置換を有するものがある。

Rv1196の他の免疫原性誘導体は、長さ少なくとも250アミノ酸、例えば長さ少なくとも300アミノ酸又は長さ少なくとも350アミノ酸である配列番号1の断片を含む、例えばそれからなる。

Rv1196のさらなる免疫原性誘導体は、長さ少なくとも250アミノ酸、例えば長さ少なくとも300アミノ酸、長さ少なくとも350アミノ酸又は長さ少なくとも380アミノ酸である配列番号3の断片を含む、例えばそれからなる。

Rv1196関連抗原は、以前に記載されている方法(Dillonら、Infection and Immunity、1999、67(6): 2941〜2950頁; 国際公開第2006/117240号)、実施例に提供されている方法、又はそれに類似した方法によって調製できる。

免疫原性組成物は、1以上の更なる抗原成分を含んでもよい。そのような追加的な抗原成分は、組成物中の塩の存在に対してそれ自身必ずしも感受性である必要はない。

追加的な抗原成分は、結核の予防及び治療の分野においてRv1196関連抗原に応答する免疫応答の強化若しくは補充を目的とすることができ、又は追加的な抗原は他の病原体に関連するものであり得、便利さ故にRv1196関連抗原と一緒に投与することを目的としている。いくつかの抗原成分が製剤中に存在する場合、これらは、個別のポリペプチド又は融合タンパク質の形態で提供され得る。状況によっては、追加的な抗原成分を、ポリヌクレオチド(又は、ポリヌクレオチド(複数))として提供できる。

Rv1196タンパク質の特定の免疫原性誘導体としては、配列番号1に対して少なくとも70％の同一性を有する配列、例えば少なくとも80％、特に少なくとも90％、特別に少なくとも95％、例えば少なくとも98％、例えば少なくとも99％の同一性を有する配列を含む融合タンパク質が挙げられる。

Rv1196タンパク質を含有する例示的な融合タンパク質としては、M72(配列番号5)及びその変異体、例えばN末端に追加的なHis残基(例えば、ニッケルアフィニティ精製に使用し得る、配列番号7で示されるように二つのHis残基;又は五つ若しくは特に六つのHis残基のポリヒスチジンタグ)を持つもの;N末端に追加的なHis残基(例えば、ニッケルアフィニティ精製に使用し得る、二つのHis残基;又は五つ若しくは特に六つのHis残基のポリヒスチジンタグ)を持つMtb72fタンパク質のように、M72において突然変異されている元のセリン残基を含有するMtb72f(配列番号9)が挙げられる。

特定の実施形態において、Rv1196関連抗原は、配列番号5に対して少なくとも90％の同一性を有する配列、特別に少なくとも95％、例えば少なくとも98％、例えば少なくとも99％の同一性を有する配列を含む、例えばそれからなる。他の実施形態において、Rv1196関連抗原は、配列番号7に対して少なくとも90％の同一性を有する配列、特別に少なくとも95％、例えば少なくとも98％、例えば少なくとも99％の同一性を有する配列を含む、例えばそれからなる。

非経口投与の場合、溶液が細胞の変形又は溶解を避けるために製薬上許容できるモル浸透圧濃度を有するべきであることは周知である。製薬上許容できるモル浸透圧濃度とは、溶液がほぼ等張又は少し高張であるモル浸透圧濃度を有することを一般に意味している。適切には、本発明の免疫原性組成物は、250〜750mOsm/kgの範囲のモル浸透圧濃度を有し、例えばそのモル浸透圧濃度は、250〜550mOsm/kgの範囲、例えば280〜500mOsm/kgの範囲であり得る。

モル浸透圧濃度は、市販の浸透圧計、例えばAdvanced Instruments Inc.(USA)製Advanced(登録商標)Model 2020の使用によってなど、当該技術分野において公知の技術によって測定できる。

「等張化剤」とは、生理的に許容され、製剤に適切な張度を付与して、その製剤と接触している細胞膜を跨いだ正味の水の流れを防止する化合物である。

一般に、塩化ナトリウム(NaCl)が等張化剤として使用される。本発明者らは、溶液中にあるタンパク質が、高濃度の塩を含有する溶液中にある場合に凝集又は凝固する工程である「塩析」に対して、Rv1196関連抗原が特に感受性であることを初めて示した。したがって、本発明の免疫原性組成物が製薬上許容できるモル浸透圧濃度を有することを確保するために、代替手段が提供される。

特定の実施形態において、非イオン性等張化剤を更に含む免疫原性組成物が提供される。免疫原性組成物に使用するための非イオン性等張化剤は、それ自身が製薬上許容できるものである必要があり、例えばヒトでの使用に適しており、Rv1196関連抗原と適合性があり更に免疫賦活薬(複数可)など他の成分とも適合性がある必要がある。

本発明の一実施形態において、適切な非イオン性等張化剤は、多価アルコール、糖(特にスクロース、フルクトース、デキストロース若しくはグルコース)又はグリシンなどのアミノ酸である。一実施形態において、多価アルコールは、糖アルコール、特にC3〜6糖アルコールである。例示的な糖アルコールには、グリセロール、エリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、ソルビトール、マンニトール、ズルシトール及びイジトールがある。この実施形態の具体例において、適切な非イオン性等張化剤はソルビトールである。当業者は、異なる等張化剤の混合物を使用することにより、適切なモル浸透圧濃度を得られることを認識する。本発明の特定の実施形態において、本発明の組成物中の非イオン性等張化剤は、スクロース及び/又はソルビトールを組み込んでいる。

一実施形態において、免疫原性組成物中の多価アルコールの適切な濃度は、約2.5〜約15％(w/v)、特に約2.5〜約10％(w/v)、例えば約3〜約7％(w/v)、約4〜約6％(w/v)などである。この実施形態の具体例において、多価アルコールはソルビトールである。

別の実施形態において、免疫原性組成物は、スクロース及びソルビトールを含む。そのような状況において、免疫原性組成物は、約2.5〜約15％(w/v)スクロース及び約2.5〜約15％(w/v)ソルビトール、特に約2.5〜約10％(w/v)スクロース及び約2.5〜約10％(w/v)ソルビトール、例えば、約3〜約7％(w/v)スクロース及び約3〜約7％(w/v)ソルビトール、例えば約4〜約6％(w/v)スクロース及び約4〜約6％(w/v)ソルビトールを適切に含有し得る。

免疫原性組成物のpHは、非経口投与に適切であるべきである。典型的には、pHは6.0〜9.0の範囲である。適切には、pHは7.0〜9.0の範囲、特に7.25〜8.75、例えば7.5〜8.5、特にpH7.75〜8.25である。約8.0のpHは、特に興味深い。

pHは、例えばTris又はリン酸塩緩衝液を含めた緩衝液を使用することによって制御し得る。

本発明の特定の実施形態において、免疫原性組成物は1以上の免疫賦活薬を含む。

一実施形態において、免疫賦活薬はサポニンであってよい。本発明に使用するのに特に適切なサポニンは、Quil A及びその誘導体である。Quil Aは、南米の樹木キラジャ・サポナリア・モリナ(Quillaja saponaria Molina)から単離されるサポニン調製物であり、Dalsgaardら、1974(「Saponin adjuvants」、Archiv. fuer die gesamte Virusforschung、44巻、Springer Verlag、Berlin、243〜254頁)によってアジュバント活性を有することが最初に記載された。Quil Aの精製画分、例えばQS7及びQS21(別名QA7及びQA21)がHPLCによって単離され、この画分はQuil Aに関連する毒性無しにアジュバント活性を保持していた(国際公開第88/09336号)。QS21はキラジャ・サポナリア・モリナの樹皮から得られる天然のサポニンであり、CD8+細胞障害性T細胞(CTL)、Th1細胞及び優勢IgG2a抗体応答を誘導する。QS21は、本発明において好ましいサポニンである。

本発明の適切な形態において、免疫原性組成物中のサポニンアジュバントは、サポナリア・モリナ(saponaria Molina)Quil A誘導体、特にQS17又はQS21、適切にはQS21などQuil Aの免疫学的な活性画分である。

望ましくは、QS21は反応原性(reactogenic)が低い組成物中に提供され、例えばコレステロールなど外因性ステロールで失活する。コレステロールでQS21が失活する反応原性が低い組成物のいくつかの特定の形態が存在する。特定の実施形態において、サポニン/ステロールは、リポソーム構造の形態をとる(例えば国際公開第96/33739号、実施例1に記載されている)。この実施形態において、リポソームは中性脂質、例えばホスファチジルコリンを適切に含有し、これは適切には室温で非晶質であり、例えば卵黄ホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)又はジラウリルホスファチジルコリンである。リポソームは、飽和脂質から構成されるリポソームのリポソーム-QS21構造の安定性を高める荷電脂質を含有することもできる。これらの場合、荷電脂質の量は1〜20％w/w、例えば5〜10％が適切である。ステロールのリン脂質に対する比率は、1〜50％(mol/mol)、最適には20〜25％である。

適切なステロールには、β-シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール及びコレステロールがある。特定の一実施形態において、免疫原性組成物はステロールとしてコレステロールを含む。これらのステロールは当技術分野で周知であり、例えば、コレステロールは、動物性脂肪に見られる天然に存在するステロールとしてMerck Index、第11版、341頁に開示されている。

活性サポニン画分がQS21である場合、QS21:ステロールの比率は、典型的には1:100〜1:1(w/w)、適切には1:10〜1:1(w/w)、特に1:5〜1:1(w/w)程度である。適切には、過剰なステロールが存在し、QS21:ステロールの比は少なくとも1:2(w/w)である。一実施形態において、QS21:ステロールの比は、1:5(w/w)である。ステロールは、適切にはコレステロールである。

別の実施形態において、免疫原性組成物はToll様受容体4(TLR4)作動薬である免疫賦活薬を含む。「TLR作動薬」とは、直接的なリガンドとして、又は内因性若しくは外因性リガンドを生成することによって間接的に、TLRシグナル伝達経路を通じてシグナル応答を引き起こすことが可能な成分を意味している(Sabroeら、J Immunol、2003 1630〜5頁)。TLR4作動薬は、TLR-4シグナル伝達経路を通じてシグナル応答を引き起こすことが可能である。TLR4作動薬の適切な例には、リポ多糖類、適切には脂質Aの非毒性誘導体、具体的にはモノホスホリルリピドA又はより具体的には3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)がある。

3D-MPLはGlaxoSmithKline Biologicals N.A.からMPLという名称で販売されており、本文書の全体にわたってMPL又は3D-MPLと呼ぶ、例えば、米国特許第4,436,727号;第4,877,611号;第4,866,034号及び第4,912,094号を参照のこと。3D-MPLは、主にIFN-γ(Th1)表現型を伴うCD4+ T細胞の応答を促進する。3D-MPLは、英国特許出願第2220211A号に開示されている方法に従って作製できる。化学的には、それは、3、4、5又は6個所アシル化された鎖を持つ3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドAの混合物である。本発明の組成物において、小粒子3D-MPLを使用して、免疫原性組成物を調製することができる。小粒子3D-MPLは、0.22μmフィルタを通して濾過滅菌できるような粒径を有する。そのような調製物は、国際公開第94/21292号に記載されている。適切には、粉末状の3D-MPLを使用して、本発明の免疫原性組成物を調製する。

使用できる他のTLR4作動薬は、国際公開第98/50399号若しくは米国特許第6,303,347号(AGPの調製工程も開示されている)に開示されているものなどアルキルグルコサミニドリン酸(AGP)、適切にはRC527若しくはRC529又は米国特許第6,764,840号に開示されているAGPの製薬上許容できる塩である。いくつかのAGPはTLR4作動薬であり、いくつかはTLR4拮抗薬である。

他の適切なTLR4作動薬は、国際公開第2003/011223号及び同第2003/099195号に記載されており、例えば国際公開第2003/011223号の4〜5頁又は同第2003/099195号の3〜4頁に開示されている化合物I、化合物II及び化合物III、並びに特にER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057m ER804058、ER804059、ER804442、ER804680及びER804764として国際公開第2003/011223号に開示されている化合物である。例えば、一つの適切なTLR-4作動薬はER804057である。

特定の実施形態において、免疫原性組成物はサポニン及びTLR4作動薬の両方を含む。具体的な例において、免疫原性組成物はQS21及び3D-MPLを含む。

3D-MPLなどのリポ多糖類などTLR-4作動薬は、免疫原性組成物のヒト用量当たり1〜100μgの量で使用できる。3D-MPLは約50μgのレベル、例えば、40〜60μg、適切には45〜55μg又は49〜51μg又は50μgのレベルで使用できる。更なる実施形態において、免疫原性組成物のヒト用量は約25μgのレベル、例えば、20〜30μg、適切には21〜29μg又は22〜28μg又は23〜27μg又は24〜26μg又は25μgのレベルで3D-MPLを含む。

QS21などのサポニンは、免疫原性組成物のヒト用量当たり1〜100μgの量で使用できる。QS21は約50μgのレベル、例えば、40〜60μg、適切には45〜55μg又は49〜51μg又は50μgのレベルで使用できる。更なる実施形態において、免疫原性組成物のヒト用量は約25μgのレベル、例えば、20〜30μg、適切には21〜29μg又は22〜28μg又は23〜27μg又は24〜26μg又は25μgのレベルでQS21を含む。

TLR4作動薬及びサポニンの両方が免疫原性組成物中に存在する場合、サポニンに対するTLR4作動薬の重量比率は、適切には1:5〜5:1、適切には1:2〜2:1、例えば約1:1である。例えば、3D-MPLが50μg又は25μgの量で存在する場合、適切にはQS21も免疫原性組成物のヒト用量当たりそれぞれ50μg又は25μgの量で存在できる。本発明の特定の免疫原性組成物は、ヒト用量当たり各々1〜100μgの量、例えばヒト用量当たり各々10〜75μgの量でQS21及び3D-MPLを含む。本発明の免疫原性組成物は、ヒト用量当たり各々15〜35μgの量で、例えばヒト用量当たり各々20〜30μgの量でQS21及び3D-MPLを適切に含むことができる。

一実施形態において、免疫賦活薬は、例えば国際公開第2008/142133号に提示されているTLR9作動薬である。具体的な例において、前記TLR9作動薬は免疫賦活性オリゴヌクレオチド、特に非メチル化CpGモチーフを含有するオリゴヌクレオチドである。そのようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、国際公開第96/02555号、同第99/33488号及び米国特許第5,865,462号に記載されている。本明細書に記載されている免疫原性組成物に使用される適切なTLR9作動薬は、CpG含有オリゴヌクレオチドであり、場合によっては少なくとも3個、適切には少なくとも6個以上のヌクレオチドによって分離されている、二つ以上のジヌクレオチドCpGモチーフを含有している。CpGモチーフとは、シトシンヌクレオチドとその後に続くグアニンヌクレオチドである。

一実施形態において、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間結合は、ホスホロジチオエート、場合によってホスホロチオエート結合であるが、混合したヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドを含めて、ホスホジエステル及び他のヌクレオチド間結合も使用できる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又はホスホロジチオエートを作製する方法は、米国特許第5,666,153号、米国特許第5,278,302号及び国際公開第95/26204号に記載されている。異なるヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドが意図されており、例えば混合ホスホロチオエートホスホジエステルである。オリゴヌクレオチドを安定化する他のヌクレオチド間結合が使用できる。

本明細書に記載されている免疫原性組成物に含めるのに適しているCpGオリゴヌクレオチドの例は、以下の配列を有している。一実施形態において、これらの配列はホスホロチオエート修飾ヌクレオチド間結合を含有する。

オリゴ1(配列番号9):TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)
オリゴ2(配列番号10):TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)
オリゴ3(配列番号11):ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
オリゴ4(配列番号12):TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)
オリゴ5(配列番号13):TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)
代替のCpGオリゴヌクレオチドは、上記の配列中に、重要度が低い欠失又は付加を有する配列を含み得る。

一実施形態において、免疫賦活薬はトコールである。トコールは、当技術分野で周知であり、欧州特許第0382271号に記載されている。特定の実施形態において、トコールはα-トコフェロールスクシネート(別名ビタミンEスクシネート)などα-トコフェロール又はその誘導体である。

本発明は、本発明の免疫原性組成物を作製する方法であって、
a.Rv1196関連抗原を凍結乾燥するステップと、
b.ステップa)の凍結乾燥したRv1196関連抗原を水溶液を用いて再構成するステップであって、該溶液の導電率が13mS/cm以下である、ステップと
を含む方法も提供する。

特定の実施形態において、水溶液の導電率は、12mS/cm以下、例えば10mS/cm以下、8mS/cm以下、6mS/cm以下、5mS/cm以下、4mS/cm以下又は3mS/cm以下である。特定の実施形態において、水溶液の導電率は、2.5mS/cm以下、例えば2.25mS/cm以下又は2.0mS/cm以下である。

適切には、水溶液の導電率は、凍結乾燥した抗原が再構成されるときに得られる溶液が13mS/cm以下、例えば12mS/cm以下、例えば10mS/cm以下、8mS/cm以下、6mS/cm以下、5mS/cm以下、4mS/cm以下又は3mS/cm以下の導電率を有するものである。特定の実施形態において、得られる溶液の導電率は、2.5mS/cm以下、例えば2.25mS/cm以下又は2.0mS/cm以下である。

更に、本発明の免疫原性組成物を作製する方法であって、
a.Rv1196関連抗原を凍結乾燥するステップと、
b.ステップa)の凍結乾燥したRv1196関連抗原を水溶液を用いて再構成するステップであって、該溶液中の塩濃度が130mM以下である、ステップと
を含む方法が提供される。

特定の実施形態において、前記水溶液中の塩濃度は、100mM以下、例えば、90mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下、50mM以下又は40mM以下である。特定の実施形態において、前記水溶液中の塩濃度は、35mM以下、例えば30mM以下又は25mM以下である。

適切には、水溶液中の塩濃度は、凍結乾燥した抗原が再構成されるときに得られる溶液が、130mM以下、例えば100mM以下、例えば90mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下、50mM以下又は40mM以下の塩濃度を有するものである。特定の実施形態において、得られる溶液中の塩濃度は、35mM以下、例えば30mM以下又は25mM以下である。

加えて、本発明の免疫原性組成物を作製する方法であって、
a.Rv1196関連抗原を凍結乾燥するステップと、
b.ステップa)の凍結乾燥したRv1196関連抗原を水溶液を用いて再構成するステップであって、該溶液中の塩化ナトリウム濃度が130mM以下である、ステップと
を含む方法が提供される。

特定の実施形態において、前記水溶液中の塩化ナトリウム濃度は、100mM以下、例えば、90mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下、50mM以下又は40mM以下である。特定の実施形態において、前記水溶液中の塩濃度は、35mM以下、例えば30mM以下、20mM以下又は15mM以下である。適切には、水溶液中の塩化ナトリウム濃度は5mM又はそれ未満である。

適切には、水溶液中の塩化ナトリウム濃度は、凍結乾燥した抗原が再構成されるときに得られる溶液が、130mM以下、例えば100mM以下、例えば90mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下、50mM以下又は40mM以下の塩化ナトリウム濃度を有するものである。特定の実施形態において、得られる溶液中の塩化ナトリウム濃度は、35mM以下、例えば30mM以下又は25mM以下である。

一実施形態において、ステップb)(上記)の水溶液は、サポニン及び/又はTLR4作動薬、例えばQS21及び/又は3D-MPLを含む。更なる実施形態において、サポニン及び/又はTLR4作動薬はリポソーム製剤中にある。一実施形態において、水溶液はリポソーム製剤中のTLR4作動薬及びサポニン、並びに多価アルコールなど本明細書に記載の非イオン性等張化剤を含む。特に、水溶液は、ソルビトールを含み得る。

また、
a.凍結乾燥したRv1196関連抗原と、
b.溶液の導電率が13mS/cm以下である、水溶液と
を含むキットが提供される。

特定の実施形態において、水溶液の導電率は、12mS/cm以下、例えば10mS/cm以下、8mS/cm以下、6mS/cm以下、5mS/cm以下、4mS/cm以下又は3mS/cm以下である。特定の実施形態において、水溶液の導電率は、2.5mS/cm以下、例えば2.25mS/cm以下又は2.0mS/cm以下である。

適切には、水溶液の導電率は、凍結乾燥した抗原が再構成されるときに得られる溶液が、13mS/cm以下、例えば12mS/cm以下、例えば10mS/cm以下、8mS/cm以下、6mS/cm以下、5mS/cm以下、4mS/cm以下又は3mS/cm以下の導電率を有するものである。特定の実施形態において、得られる溶液の導電率は、2.5mS/cm以下、例えば2.25mS/cm以下又は2.0mS/cm以下である。

加えて、
a.凍結乾燥したRv1196関連抗原と、
b.溶液中の塩濃度が130mM以下である、水溶液と
を含むキットが提供される。

特定の実施形態において、前記水溶液中の塩濃度は、100mM以下、例えば、90mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下、50mM以下又は40mM以下である。特定の実施形態において、前記水溶液中の塩濃度は、35mM以下、例えば30mM以下又は25mM以下である。

適切には、水溶液中の塩濃度は、凍結乾燥した抗原が再構成されるときに得られる溶液が、130mM以下、例えば100mM以下、例えば90mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下、50mM以下又は40mM以下の塩濃度を有するものである。特定の実施形態において、得られる溶液中の塩濃度は、35mM以下、例えば30mM以下又は25mM以下である。

更に、
a.凍結乾燥したRv1196関連抗原と、
b.溶液中の塩化ナトリウム濃度が130mM以下である、水溶液と
を含むキットが提供される。

特定の実施形態において、前記水溶液中の塩化ナトリウム濃度は、100mM以下、例えば、90mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下、50mM以下又は40mM以下である。特定の実施形態において、前記水溶液中の塩濃度は、35mM以下、例えば30mM以下、20mM以下又は15mM以下である。適切には、溶液中の塩化ナトリウム濃度は5mM又はそれ未満である。

適切には、水溶液中の塩化ナトリウム濃度は、凍結乾燥した抗原が再構成されるときに得られる溶液が、130mM以下、例えば100mM以下、例えば90mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下、50mM以下又は40mM以下の塩化ナトリウム濃度を有するものである。特定の実施形態において、得られる溶液中の塩化ナトリウム濃度は、35mM以下、例えば30mM以下又は25mM以下である。

キットは、ヒト単回用量など、免疫原性組成物の単回用量又は免疫原性組成物の複数回用量を提供するように適合してよい。

本発明のキットで使用される水溶液は、本明細書で定義されるいずれかの水溶液でよい。本発明の特定の実施形態において、水溶液は、リポソーム形態におけるTLR4作動薬及び/又はサポニンを含む。特定の実施形態において、TLR4作動薬は3D-MPLであり、サポニンはQS21である。本明細書において使用される水溶液は、等張化剤、例えばソルビトールなどの多価アルコールを含むことができる。

上述したキット及び本発明の免疫原性組成物を作製する方法に関して、免疫賦活薬(複数可)及び等張化剤(複数可)(それらが存在する場合)を、抗原と一緒に共凍結乾燥させる又は要望通り水溶液に含有させることができることに留意されたい。水溶液は単なる注射剤用の水であってよく、免疫原性組成物の他の全ての成分が抗原と一緒に共凍結乾燥される。典型的には、少なくともいくつかの免疫賦活薬(複数可)及び等張化剤(複数可)が水溶液で提供され、これはリポソームなど特定の成分が凍結乾燥に適合していない場合に、特に適している。一実施形態において、水溶液は免疫賦活薬を含む。第二の実施形態において、水溶液は等張化剤、例えば多価アルコールなどの非イオン性等張化剤、特にソルビトールを含む。第三の実施形態において、水溶液は免疫賦活薬及び等張化剤、例えば多価アルコール、特にソルビトールを含む。

キットは、水溶液を使用する凍結乾燥したRv1196関連抗原の再構成を指示する説明書を更に含むことができる。

本発明による免疫原性組成物は、医薬で、特にヒト型結核菌による感染などマイコバクテリウムによる感染を予防、治療又は改善するために使用され得る。免疫原性組成物は、ウシへの投与用など獣医学でも有用であり得るが、一般にヒトへの投与用に提供される。

医薬品、特にヒト型結核菌による感染などマイコバクテリウムによる感染を予防、治療又は改善するための医薬品の製造における、本発明による免疫原性組成物の使用が提供される。

本発明による免疫原性組成物の安全且つ有効な量を投与することを含む、ヒト型結核菌による感染などマイコバクテリウムによる感染を予防、治療又は改善する方法も提供される。

免疫原性組成物は、
- 活動性結核を治療する目的;
- 例えば感染していない被験体又は潜伏感染している被験体に投与することによって活動性結核を予防する目的;
- 潜伏結核を治療する目的;
- 例えば感染していない被験体に投与することによって潜伏結核を予防する目的;又は
- 例えば月、年の間、更には無期限に、結核の再活性化を防止又は遅延させる、特にTBの再活性化を遅延させる目的で提供され得る。

用語「活動性感染」とは、発現した疾患の症状及び/又は病変を伴う、適切には発現した疾患の症状を伴う感染、例えばヒト型結核菌による感染を意味している。

用語「不活性感染」、「休止感染」又は「潜伏感染」とは、発現した疾患の症状及び/又は病変が無い、適切には発現した疾患の症状が無い感染、例えばヒト型結核菌による感染を意味している。適切には、潜伏感染被験体とは、例えばPPD又はT細胞に基づくアッセイによって感染に陽性反応を示すが、活動性感染に関連する疾患の症状及び/又は病変を示していない被験体である。

用語「初感染結核」とは、臨床的疾患、例えば感染(例えばヒト型結核菌による感染)直後の疾患の症状の発現を意味している。Harrison's Principles of Internal Medicine、第150章、953〜966頁(第16版、Braunwaldら編、2005)を参照のこと。

用語「二次結核」又は「初感染後結核」とは、休止、不活性又は潜伏感染(例えばヒト型結核菌による感染)の再活性化を意味している。Harrison's Principles of Internal Medicine、第150章、953〜966頁(第16版、Braunwaldら編、2005)を参照のこと。

用語「結核再活性化」とは、(例えば、ツベルクリン皮膚試験、適切にはin vitroでのT細胞に基づくアッセイ試験において)感染に陽性反応を示すが明瞭な疾患の症状が無い個体において、後から疾患の症状が現れることを意味している。適切には、その個体は感染に再曝露されていない。陽性診断試験は個体が感染していることを示すが、その個体は、十分に治療されて結核が不活性又は潜伏状態になっている、以前に発現した活動性の疾患の症状を有する又は有さない可能性がある。

適切には、免疫原性組成物は、ヒト型結核菌による感染などマイコバクテリウムによる感染が無い又は潜伏感染している被験体に投与される。

投与される免疫原性組成物の容量は、特定の送達経路(例えば筋肉内、皮下又は皮内)など他のいくつかの因子によって変わり得る。典型的には、ヒトに対する単回注射において投与される容量(単位用量)は、50μL〜1mLの範囲、例えば100μL〜750μL、特に400〜600μLなど、例えば約500μLである。

単回用量中に含有されるRv1196関連抗原の量は、臨床的な必要性によって決まるが、ヒトの単回用量は典型的には1〜100μgの範囲、例えば5〜50μgなど、例えば5〜20μgである。ヒト単回用量は、約10μgのRv1196関連抗原を含有し得る。

適切には、本発明の組成物は安定であり、安定とは、25℃で24時間貯蔵している間に本明細書に記載されている技術で測定した抗原性が、貯蔵前の抗原性の少なくとも80％残っていることを意味している。望ましくは、抗原性が、25℃で24時間貯蔵した後に少なくとも85％、例えば少なくとも90％、特に少なくとも95％残っている。特に興味深い組成物の場合、30℃で24時間貯蔵した後に、組成物の抗原性の少なくとも80％、例えば少なくとも85％、少なくとも90％、特に少なくとも95％が残っている。

本発明は、ここで以下の非限定的な実施例によって更に記載される。

[実施例1]
アジュバント組成物ASA(ソルビトール)の調製
等張化剤としてソルビトールを使用して、3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドA及びQS21をリポソーム製剤に含むアジュバント組成物を調製した。これは、以下の通りに調製された:
A.リポソームの調製方法:
有機溶剤中にある脂質(DOPC)、コレステロール及び3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドAの混合物を真空下で乾燥させた。次いで水溶液(リン酸緩衝食塩水[100mM NaCl、50mMリン酸塩pH6.1])を添加し、全ての脂質が懸濁されるまで容器をかき混ぜた。次いでこの懸濁液を、高剪断ミキサーを用いてプレホモジナイズ(prehomogenised)し、次いでDLSによる測定でリポソームサイズがおよそ90nm±10nmに減少するまで高圧でホモジナイズした。次いでリポソームを濾過滅菌した。

B. ASA製剤:
ステップ1:濃縮リポソームの希釈
10倍に希釈した場合、Na₂/Kリン酸緩衝液100mM pH6.1を注射用の水に添加して、最終製剤において10mMリン酸緩衝液濃度にした。次いで注射用の水(WFI)中の30％(w/v)ソルビトール溶液を添加して、最終製剤において4.7％の濃度にし、-これを室温で15〜45分間撹拌した。

次いで濃縮リポソーム(それぞれ40mg/mL、10mg/mL及び2mg/mLのDOPC、コレステロール及び3D-MPLで作製した)を混合物に添加して、最終製剤において3D-MPLを100μg/mLの濃度にした。

その後、混合物を室温で15〜45分間、撹拌した。

ステップ2:QS21の添加
蠕動ポンプを使用して、希釈したリポソームにQS21バルクストックを磁気撹拌しながら添加して、最終製剤において100μg/mL濃度にした。混合物を15〜45分間、撹拌した。

最終的なASA(ソルビトール)製剤は、2mg DOPC/mL、500μgコレステロール/mL、100μg 3D-MPL/mL及び100μg QS21/mL、4.7％ソルビトール並びに5mM塩化ナトリウム及び10mMリン酸塩を含有した。

ステップ3:pHを、6.1±0.1になるよう確認した。

ステップ4:濾過滅菌
PALL Corporation製ポリエーテルスルホン(PES)フィルタを使用して、濾過滅菌を実施した。

ステップ5:+2℃〜+8℃での貯蔵
リポソーム製剤中に3-脱O-アシル化MPL及びQS21を含み、等張化剤としてソルビトールを含有する、得られたアジュバント組成物(ASA(ソルビトール)と呼ぶ)を、次いで4℃で貯蔵した。

[実施例2]
アジュバント組成物ASA(150mM NaCl)の調製
等張化剤として塩化ナトリウムを使用して、3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドA及びQS21をリポソーム製剤に含むアジュバント組成物を調製した。

A.リポソームの調製方法:
有機溶剤中にある脂質(DOPC)、コレステロール及び3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)の混合物を真空下で乾燥させた。次いでリン酸緩衝食塩水(100mM NaCl、50mMリン酸塩pH6.1)を添加し、全ての脂質が懸濁されるまで容器をかき混ぜた。次いでこの懸濁液を、高剪断ミキサーを用いてプレホモジナイズし、次いでDLSによる測定でリポソームサイズがおよそ90nm±10nmに減少するまで高圧でホモジナイズした。次いでリポソームを、0.22μm PES膜で濾過滅菌した。

B. ASA製剤:
ステップ1:濃縮リポソームの希釈
10倍に希釈した場合、Na₂/Kリン酸緩衝液100mM pH6.45及びNaCl 1.5Mを注射用の水に添加して、最終製剤においてそれぞれリン酸塩10mM及びNaCl 150mMの濃度にした。この混合物を室温で5分間、撹拌した。次いで濃縮リポソーム(それぞれ40mg/mL、10mg/mL及び2mg/mLのDOPC、コレステロール及び3D-MPLで作製した)を混合物に添加して、最終製剤において3D-MPLを100μg/mLの濃度にした。その後混合物を室温で5〜15分間、撹拌した。

ステップ2:QS21の添加
希釈したリポソームにQS21バルクストックを磁気撹拌しながら添加して、最終製剤において100μg/mL濃度にした。混合物を室温で撹拌した。

ステップ3:pHを、6.1±0.1になるよう確認した。

ステップ4:濾過滅菌
PALL Corporation製ポリエーテルスルホン(PES)フィルタを使用して、濾過滅菌を実施した。

ステップ5:+2℃〜+8℃での貯蔵
ASA(150mM NaCl)の最終組成は、1mL当たり、2mg DOPC、500μgコレステロール、100μg 3-脱O-アシル化MPL、100μg QS21、並びに10mMリン酸塩及び150mM NaClであった。

[実施例3]
QS21の溶解活性
QS21は、赤血球(RBC)を溶解させることが公知である。実施例1の通り調製したASA(ソルビトール)アジュバント組成物を試験して、QS21溶解活性を、150mM NaClを含む同等アジュバント組成物(ASA(150mM NaCl))で見られるのと同じ様に失活させたことを確認した。

ニワトリ赤血球(RBC)を使用する溶血アッセイによってQS21溶解活性を測定した。RBCを4℃、550gで遠心分離した。上清を廃棄した。ペレットを慎重にPBS緩衝液に再懸濁して、当初の体積にし、上清が赤くなくなるまで同じ操作を繰り返した(通常3回)。直ちに使用しない場合、ペレットを4℃で最大3〜4日間貯蔵した(そして、使用する日に再び洗浄した)、又は同じ日に使用する場合、緩衝液で約10倍に希釈した。

QS21用量範囲曲線を、ASA緩衝液で(ASAサンプルを試験した後、塩又はソルビトール緩衝液で)用時作製し、アジュバントサンプル(500μL又は900μL ASAの同等物を意味するQS21の50μg又は90μg同等物を含有する)を調製した。適切な緩衝液(試験するサンプルの緩衝液に応じてソルビトールを含有する又は含有しない)を用いて、標準及びサンプルの最終容量を900μLに調整した。ASAは乳白色のため、光学密度(OD)に干渉する。したがって、ASA「ブランク」を調製し、そのODをASA試験したサンプルのODから減算した。これらのブランクはサンプルにおいて試験された体積と同じASA体積に相当したが、緩衝液を用いて1mLに調整した。これらのブランクにRBCは添加しなかった。次いで標準及びサンプルを、RBCと一緒に(900μLの標準及びサンプルに希釈したRBC 100μLを添加した)室温(RT)で30分間インキュベートした。次いでサンプルを900gで5分間遠心分離した。遠心分離後に540nmでの光学密度を測定した。

限界試験によって溶解活性の決定を実施した。

1.検出限界(LOD)は、
- 基準レベルより高く(OD>0.1)
- OD緩衝液(「0μg」QS21)より約3倍高く
- 曲線の上昇部分にあり
- 各試験について決定される、
ODをもたらすQS21の最低濃度として定義された。

2.アジュバントサンプルに対するODがOD_LODより大きい場合、QS21溶解活性はアジュバントサンプル中で陽性に保持された。

上記のデータを、図1にグラフで示している。

このアッセイにおける検出限界は、0.9μg QS21及びOD 0.12である。

150mM塩化ナトリウムを含むアジュバント組成物のQS21失活は、試験した50μg QS21の同等物について98.2％を上回ると推定された。試験した90μgの同等物の場合、判定は99％を超えている。

次いでQS21の失活を、ソルビトール及びわずかに5mMの塩化ナトリウムを含む同等アジュバント組成物と比較した。ASAを4℃で貯蔵した後、又は安定性を促進させた後(37℃で7日間)にデータを生成した。ソルビトール中のASAの場合、ソルビトール含有緩衝液においてQS21標準曲線を実現した。

QS21は低塩化ナトリウム緩衝液中において十分に失活したと結論された。

[実施例4]
MPL同族体
化学的には、3D-MPLは、主に4、5又は6個所アシル化された鎖を持つ3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドAの混合物である。別々の各3D-MPL分子は同族体と呼ばれる。同族体の組成は、同族体の比率に変化がなく一定のままであることが重要である。使用されるいずれの緩衝液によっても、同族体の組成が、アジュバント組成物を作製するために使用される濃縮リポソーム中の組成と同じになることができる、ということも重要である。

図2に示すように、3D-MPL濃縮リポソーム(濃縮リポソームLIP07-217、図2の第一カラム)、150mM NaCl緩衝液中に3D-MPLリポソームとQS21を含むアジュバント組成物(アジュバント150mM NaCl又はASA(150mM NaCl)、第二カラム)、並びにソルビトール及び5mM NaCl緩衝液中に3D-MPLリポソームとQS21を含むアジュバント組成物(アジュバントソルビトール又はASA(ソルビトール)、第三〜七カラム)において、同族体の組成を検査した。

同族体の組成を、0日目及び調製してから37℃で7日間維持した後に、二つのロットのASA(ソルビトール)アジュバントにおいても検査して、経時的な漸進的変化が無いことを確認した(図2の最後の4つのカラムを参照のこと)。

濃縮リポソーム又はASA(ソルビトール)サンプル中にあるMPLのテトラ-、ペンタ-及びヘキサアシル化同族体の相対的な配分をIP-HPLC-Fluo検出(ARD)によって決定した。標準及びサンプル両方を、ダンシルヒドラジンを用いて誘導体化し、二糖類主鎖にFluo活性がある発色団を誘導した。誘導体化したサンプルを、イオン対試薬として水酸化テトラブチルアンモニウム(TBAOH)を使用して、C18逆相カラムで分析した。脂肪族アシル基を同数含有する同族体は、はっきりと異なる基(テトラアシル、ペンタアシル及びヘキサアシル)に溶出された。全てのMPL同族体の合計ピーク面積と各基のピーク面積を比較することによって、同族体の配分が導き出される。

各同族体のパーセンテージを図2に示す。アジュバント緩衝液間で同族体組成に著しい相違は見られず、同族体組成はソルビトール緩衝液中で経時的に一定であった。

[実施例5]
アジュバント組成物ASA(ソルビトール-2)の調製
等張化剤としてソルビトールを使用して、リポソーム製剤に実施例1に比べて少ないレベルで3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドA及びQS21を含む、アジュバント組成物を調製した。これは、以下の通りに調製された:
アジュバントは、10mMリン酸塩、5mM NaCl、4.7％ソルビトールpH6.1を含有する溶液を用いて実施例1に従って調製されたASA(ソルビトール)を1:1に希釈することによって、調製された。

最終的なASA(ソルビトール-2)製剤は、1mg DOPC/mL、250μgコレステロール/mL、50μg 3D-MPL/mL及び50μg QS21/mL、4.7％ソルビトール並びに5mM塩化ナトリウム及び10mMリン酸塩を含有した。

[実施例6]
アジュバント組成物ASA(ソルビトール-3)の調製
等張化剤としてソルビトールを使用して、リポソーム製剤に実施例1に比べて少ないレベルで3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドA及びQS21を含む、アジュバント組成物を調製した。これは、以下の通りに調製された:
A.リポソームの調製方法:
有機溶剤中にある脂質(DOPC)、コレステロール及び3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドAの混合物を真空下で乾燥させた。次いで水溶液(リン酸緩衝食塩水[100mM NaCl、50mMリン酸塩pH6.1])を添加し、全ての脂質が懸濁されるまで容器をかき混ぜた。次いでこの懸濁液を、高剪断ミキサーを用いてプレホモジナイズし、次いでDLSによる測定でリポソームサイズがおよそ90nm±10nmに減少するまで高圧でホモジナイズした。次いでリポソームを濾過滅菌した。

B. ASA製剤:
ステップ1:濃縮リポソームの希釈
10倍に希釈した場合、Na₂/Kリン酸緩衝液100mM pH6.1を注射用の水に添加して、最終製剤において10mMリン酸緩衝液濃度にした。次いで注射用の水(WFI)中の30％(w/v)ソルビトール溶液を添加して、最終製剤において4.7％の濃度にし、-これを室温で15〜45分間撹拌した。

次いで濃縮リポソーム(それぞれ40mg/mL、10mg/mL及び2mg/mLのDOPC、コレステロール及び3D-MPLで作製した)を混合物に添加して、最終製剤において3D-MPLを50μg/mLの濃度にした。

その後、混合物を室温で15〜45分間、撹拌した。

ステップ2:QS21の添加
蠕動ポンプを使用して、希釈したリポソームにQS21バルクストックを磁気撹拌しながら添加して、最終製剤において50μg/mL濃度にした。混合物を15分間、撹拌した。

最終的なASA製剤は、1mg DOPC/mL、250μgコレステロール/mL、50μg 3D-MPL/mL及び50μg QS21/mL、4.7％ソルビトール並びに2.5mM塩化ナトリウム及び10mMリン酸塩を含有した。

ステップ3:pHを、6.1±0.1になるよう確認した。

ステップ4:濾過滅菌
PALL Corporation製ポリエーテルスルホン(PES)フィルタを使用して、濾過滅菌を実施した。

ステップ5:+2℃〜+8℃での貯蔵
リポソーム製剤中に3-脱O-アシル化MPL及びQS21を含み、等張化剤としてソルビトールを含有する、得られたアジュバント組成物(ASA(ソルビトール-3)と呼ぶ)を、次いで4℃で貯蔵した。

[実施例7]
アジュバント組成物ASA(150mM NaCl-2)の調製
等張化剤として塩化ナトリウムを使用して、リポソーム製剤に実施例2と比べて少ないレベルで3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドA及びQS21を含むアジュバント組成物を調製した。これは、以下の通りに調製された:
A.リポソームの調製方法:
有機溶剤中にある脂質(DOPC)、コレステロール及び3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)の混合物を真空下で乾燥させた。次いでリン酸緩衝食塩水(100mM NaCl、50mMリン酸塩pH6.1)を添加し、全ての脂質が懸濁されるまで容器をかき混ぜた。次いでこの懸濁液を、高剪断ミキサーを用いてプレホモジナイズし、次いでDLSによる測定でリポソームサイズがおよそ90nm±10nmに減少するまで高圧でホモジナイズした。次いでリポソームを、0.22μm PES膜で濾過滅菌した。

B. ASA製剤:
ステップ1:濃縮リポソームの希釈
10倍に希釈した場合、Na₂/Kリン酸緩衝液100mM pH6.45及びNaCl 1.5Mを注射用の水に添加して、最終製剤においてそれぞれリン酸塩10mM及びNaCl 150mMの濃度にした。この混合物を室温で5分間、撹拌した。次いで濃縮リポソーム(それぞれ40mg/mL、10mg/mL及び2mg/mLのDOPC、コレステロール及び3D-MPLで作製した)を混合物に添加して、最終製剤において3D-MPLを50μg/mLの濃度にした。その後混合物を室温で5〜15分間、撹拌した。

ステップ2:QS21の添加
希釈したリポソームにQS21バルクストックを磁気撹拌しながら添加して、最終製剤において50μg/mL濃度にした。混合物を室温で撹拌した。

ステップ3:pHを、6.1±0.1になるよう確認した。

ステップ4:濾過滅菌
PALL Corporation製ポリエーテルスルホン(PES)フィルタを使用して、濾過滅菌を実施した。

ステップ5:+2℃〜+8℃での貯蔵
ASA(150mM NaCl-2)の最終組成は、1mL当たり、1mg DOPC、250μgコレステロール、50μg 3-脱O-アシル化MPL、50μg QS21、並びに10mMリン酸塩及び150mM NaClであった。

[実施例8]
pH6.1、7.5及び8.5において異なる塩濃度を持つRv1196を含む組成物における「塩析」の検討
塩化ナトリウム濃度及びpHのRv1196抗原安定性に対する影響を、サイズによる評価として検討した。

方法
Rv1196タンパク質(配列番号1)をCorixa Corporationから得て、最終塩化ナトリウム濃度0、150及び450mMを含有する異なる三種の緩衝液(10mMリン酸塩緩衝液pH6.1、20mM Tris緩衝液pH7.5及び20mM Tris緩衝液pH8.5)中に100μg/mLの濃度になるよう希釈した。

サンプルを分析の前に4℃又は25℃で24時間貯蔵した。

比濁法は、Thermo Fischer Scientificから市販されているNepheloskan(登録商標)Ascentを使用して実施された。分析は、Corning Inc(USA)から市販されている紫外線を透過するCostar(登録商標)マイクロプレート中で実施された。

Wyatt Instruments製のDynapro Plate Readerを使用して、DLSを実施した。機器を、レーザ波長830nm及び50mWの出力を使用して動作させた。散乱光を、150°で22℃の温度で検出した。平均流体力学直径及び多分散性指数(pI)は、機器のソフトウェアで算出される。

結果
この実験の成果を図3及び4に提示する。

比濁法は、塩濃度の増加に伴う透明度の減少の一般的傾向を実証し、これはRv1196が塩濃度に対して感受性であることを示している。

DLSサンプルの大多数において、測定器は具体的な粒径を決定できなかった(図4においてNVと示す)。にもかかわらず、比較可能なデータが得られた場合には(すなわち0又は150nM NaClを有するpH8.5)、塩化ナトリウム濃度が、Rv1196免疫原性組成物において測定される粒径に影響を与えることが明らかである。

[実施例9]
タンパク質抗原の調製
二つのN末端His残基を持つM72(配列番号7)
M72発現ベクターの構築
N末端に追加的な6-Hisタグを持つMtb72fのアミノ酸配列をコードしているプラスミドは、Mtb32aのC末端断片をコードしているオープンリーディングフレーム(ORF)を、C末端にMtb32aのN末端部分が続く完全長Mtb39a ORFに一列に連続して結合することによって生成した。これは、ヒト型結核菌H37Rv株由来のゲノムDNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に際して、唯一の制限部位(EcoRI及びEcoRV)を含有し、(Mtb32a及びMtb39aのC末端断片の場合)C末端に停止コドンを欠いた配列特異的オリゴヌクレオチドを使用することにより達成した。鋳型としてのこのベクターを使用して、Ser706からAlaへの変異を部位特異的突然変異誘発によって実施した。挿入断片の正しい方向並びにSer706Ala変異を、DNA配列決定によって確認した。

N末端に二つだけHis残基を有するM72をコードするベクターを得るために、市販の部位特異的突然変異誘発システムを使用して四つのHisを欠失させた。配列を確認した後、M72コード配列を酵素反応によってプラスミドから切り出し、ゲル精製し、pETベクターにライゲーションした。次いで組換えプラスミドを配列確認した。このプラスミドは、T7プロモータの制御下にM72をコードしている。T7 RNAポリメラーゼの発現は、発現宿主中のゲノム成分から駆動され、ラクトースオペロンに基づくシステム(lacI)及びIPTG化学的誘発シグナルを使用して誘導される。発現プラスミドは、カナマイシン耐性を備えている。

T7プロモータの制御下にM72融合タンパク質をコードしているプラスミドを、エレクトロポレーション法を用いて大腸菌(E.coli)HMS174(DE3)株に形質転換した。M72挿入断片のコード配列及びフランキング領域を両方の鎖について配列決定し、元々のプラスミド構築物から決定した配列と同一であることを認めた。

発酵
ペレット化したワーキングシード(working seed)のバイアルを、室温で解凍した。前培養培地4.9mLとワーキングシードを混合することによって、前希釈物を調製した。前希釈物1mLを使用して、50mg/L硫酸カナマイシン及び10g/Lグルコースを補充した前培養培地400mLからなる液体前培養物を植菌した。

前培養を、2リットルの振とうフラスコでOD_650nmが2〜4の値に達するまで、かき混ぜながら(200RPM)30℃でインキュベートした(おおよそのインキュベーション時間:16時間)。その段階で、34mg/L硫酸カナマイシンを補充した45リットルの培養培地を含有する72リットル(合計体積)の発酵槽を、52mLの液体前培養物を用いて植菌した。

増殖期の間、25％(v/v)NH₄OH及び25％(v/v)H₃PO₄を定期的に添加することによって、pHを6.8±0.2に維持した。30℃で16時間インキュベーションした後、流加培地を用いて流加回分培養を開始した。

更に2時間温度を30℃に維持し、次いで発酵が終了するまで37℃に上昇させた。気流を75L/分で一定に設定し、溶存酸素量を、かき混ぜ及び圧力のフィードバック制御によって17％飽和に保った。小量の消泡剤溶液を必要に応じて自動的に添加した。OD_650nmが50(±5)の値に達するまでに、1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加して、M72の発現を誘導した。誘導開始時点から5時間後に発酵を終えた。細胞培養物を、わずかにかき混ぜながら15℃まで冷却し、遠心分離(4℃)して細胞ペレットを得て、その後それを一定分量で-20℃で貯蔵した。

封入体の単離
集菌物から捕集した細胞ペレットを室温で解凍し、高圧ホモジナイザを用いて溶解緩衝液(10mM Tris、50mM NaCl、pH8.0)中で破壊した。その後、細胞溶解物を遠心分離し、得られた細胞ペレット(又は封入体、IB)を尿素、Tris及びNaClを含有する洗浄緩衝液を用いて洗浄した。IBを、8M尿素を含有する可溶化緩衝液で可溶化し、0.2μm膜を通して濾過した。このろ液を、Q Sepharose Fast Flow(QSFF)カラムを使用する陰イオン交換クロマトグラフィーによって先ず精製した。6M尿素、20mMビストリスプロパン、90mM NaCl、pH7.0溶液を用いて、M72の溶出を行う。

捕集したM72をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー(HA)によって更に精製し、6M尿素、20mMビストリスプロパン、250mM NaCl、pH7.0溶液を用いてそこから溶出させた。捕集した画分を、30kDaの膜カセットを用いて濃縮し、20mM Tris、pH7.5に対して限外濾過した。次いでM72を0.22μmフィルタを通して滅菌した。次いで精製したバルクを等分し、-70℃で貯蔵した。

[実施例10]
pH6.1、7.5及び8.5において異なる塩濃度を持つM72を含む組成物における「塩析」の検討
塩化ナトリウム濃度及びpHのM72抗原安定性に対する影響を、サイズ及び抗原性による評価として検討した。

方法
精製したバルク抗原(実施例9において調製した二つのN末端His残基を持つM72、配列番号7)を、最終塩化ナトリウム濃度0、50、150、300及び450mMを含有する異なる三種の緩衝液(10mMリン酸塩緩衝液pH6.1、20mM Tris緩衝液pH7.5及び20mM Tris緩衝液pH8.5)中に100μg/mLの濃度になるよう希釈した。

サンプルを、直ちに分析した(T0)、分析の前に4℃で一晩貯蔵した(T0 O/N)、又は分析の前に25℃で24時間貯蔵した(T24h25℃)。

Malvern Instruments(UK)製のMalvern Zetasizer Nano ZSを使用して、DLSを実施した。機器を、レーザ波長633nm及び4mWの出力を使用して動作させた。散乱光を、173°で22℃の温度で検出した。Z平均直径(Zav)及び多分散性指数(pI)は、機器のソフトウェアで算出される。

比濁法は、Thermo Fischer Scientificから市販されているNepheloskan(登録商標)Ascentを使用して実施された。分析は、Corning Inc(USA)から市販されている紫外線を透過するCostar(登録商標)マイクロプレート中で実施された。

抗原性をサンドイッチELISAによって定量化した。このELISAにおいて、抗原はM72特異的ウサギポリクローナル抗体に捕捉され、その後M72(Mtb39)特異的マウスモノクローナル抗体によって示される。全ての測定値は、試験された製剤を調製するために使用した精製バルクタンパク質に基づいて期待される抗原性と比較して提示されている。

結果
この実験の成果を図5〜7に提示する。

本結果は、Rv1196関連抗原、特にM72を含有する溶液の安定性がpH及び塩化ナトリウム濃度の両方に感受性であることを、初めて実証している。抗原サイズ及び抗原性に対する塩化ナトリウムの影響は、pHが低下するにつれていっそう顕著になる。

抗原サイズ及び抗原性は、塩化ナトリウムが無くてもpH6.1において不安定である。pH6.1で50mM塩化ナトリウムを添加することにより、35nm(T0において0mM塩化ナトリウム)から最大58nm(T0)又は25℃で24時間後に79nmまでサイズが増加した。

抗原サイズ及び抗原性は、pH7.5又は8.5では、特に塩化ナトリウムが無い若しくは50mM塩化ナトリウム濃度において、25℃で24時間にわたって比較的安定である。にもかかわらず、塩化ナトリウムの濃度を150mM以上に高めることにより、抗原サイズの明らかな増加及び抗原性の減少がもたらされる。

したがって、本発明の利点は、Rv1196抗原配列自体のみではなく、Rv1196関連抗原を含有する配列に拡張される。

[実施例11]
M72及び免疫賦活薬を含み、等張化剤としてソルビトールを使用している組成物における「塩析」の防止
150mM NaClを含有する免疫原性組成物の安定性を、等張化剤としてソルビトールを使用している組成物と比較するために、いくつかのサンプルを、SEC-HPLC及びELISAを使用してモニタリングした。

方法
実施例5及び7の適切なアジュバント製剤と併用したときに所望のpHが得られるような三つの異なる凍結乾燥ケーキを調製した:
(a)二つのN末端His残基を持つM72 - 再構成されたワクチンにおいて標的pH8.5
15.75％(w/v)スクロース溶液(注射用の水に調製されている)を注射用の水に添加して、スクロース濃度を6.3％にした。3％(w/v)Tween80溶液(注射用の水に調製されている)を次いで添加して、濃度を0.025％にした。1M Tris-HCl緩衝液pH8.8を次いで添加して、50mM Tris緩衝液濃度にした。混合物を、室温で5分間、磁気的に撹拌した。精製したバルク抗原(実施例9において調製した二つのN末端His残基を持つM72、配列番号7)を次いで添加して、タンパク質濃度を25μg/mLにした。混合物を、室温で10分間、磁気的に撹拌した。pHを点検し、8.8であることを認めた。

得られた混合物0.5mLを3mLガラスバイアルに充填し、次いで凍結乾燥した。

(b)二つのN末端His残基を持つM72 - 再構成されたワクチンにおいて標的pH8.0
15.75％(w/v)スクロース溶液(注射用の水に調製されている)を注射用の水に添加して、スクロース濃度を6.3％にした。3％(w/v)Tween80溶液(注射用の水に調製されている)を次いで添加して、濃度を0.025％にした。1M Tris-HCl緩衝液pH8.8を次いで添加して、20mM Tris緩衝液濃度にした。混合物を、室温で5分間、磁気的に撹拌した。精製したバルク抗原(実施例9において調製した二つのN末端His残基を持つM72、配列番号7)を次いで添加して、タンパク質濃度を25μg/mLにした。混合物を、室温で10分間、磁気的に撹拌した。pHを点検し、8.8であることを認めた。

得られた混合物0.5mLを3mLガラスバイアルに充填し、次いで凍結乾燥した。

(c)二つのN末端His残基を持つM72 - 再構成されたワクチンにおいて標的pH7.5
15.75％(w/v)スクロース溶液(注射用の水に調製されている)を注射用の水に添加して、スクロース濃度を6.3％にした。3％(w/v)Tween80溶液(注射用の水に調製されている)を次いで添加して、濃度を0.025％にした。1M Tris-HCl緩衝液pH8.8を次いで添加して、12.5mM Tris緩衝液濃度にした。混合物を、室温で5分間、磁気的に撹拌した。精製したバルク抗原(実施例9において調製した二つのN末端His残基を持つM72、配列番号7)を次いで添加して、タンパク質濃度を25μg/mLにした。混合物を、室温で10分間、磁気的に撹拌した。pHを点検し、8.8であることを認めた。

得られた混合物0.5mLを3mLガラスバイアルに充填し、次いで凍結乾燥した。

上述の凍結乾燥ケーキを、実施例5及び7において調製した625μLのアジュバント溶液を用いて再構成した。アジュバント溶液を用いる再構成によって以下の免疫原性組成物が得られた:
(i)二つのN末端His残基を持つM72 - ASA(150mM NaCl-2)pH8.5
10μg抗原(20μg/mL)
5％ w/vスクロース
40mM Tris
0.02％ w/v Tween80
500μg DOPC
125μgコレステロール
25μg 3D-MPL
25μg QS21
150mM NaCl
10mMリン酸塩
pH8.5
(ii)二つのN末端His残基を持つM72 - ASA(150mM NaCl-2)pH8.0
10μg抗原(20μg/mL)
5％ w/vスクロース
16mM Tris
0.02％ w/v Tween80
500μg DOPC
125μgコレステロール
25μg 3D-MPL
25μg QS21
150mM NaCl
10mMリン酸塩
pH8.0
(iii)二つのN末端His残基を持つM72 - ASA(150mM NaCl-2)pH7.5
10μg抗原(20μg/mL)
5％ w/vスクロース
12.5mM Tris
0.02％ w/v Tween80
500μg DOPC
125μgコレステロール
25μg 3D-MPL
25μg QS21
150mM NaCl
10mMリン酸塩
pH7.5
(iv)二つのN末端His残基を持つM72 - ASA(ソルビトール-2)pH8.5
10μg抗原(20μg/mL)
5％ w/vスクロース
40mM Tris
0.02％ w/v Tween80
500μg DOPC
125μgコレステロール
25μg 3D-MPL
25μg QS21
5mM NaCl
4.7％ w/vソルビトール
10mMリン酸塩
pH8.5
(v)二つのN末端His残基を持つM72 - ASA(ソルビトール-2)pH8.0
10μg抗原(20μg/mL)
5％ w/vスクロース
16mM Tris
0.02％ w/v Tween80
500μg DOPC
125μgコレステロール
25μg 3D-MPL
25μg QS21
5mM NaCl
4.7％ w/vソルビトール
10mMリン酸塩
pH8.0
(vi)二つのN末端His残基を持つM72 - ASA(ソルビトール-2)pH7.5
10μg抗原(20μg/mL)
5％ w/vスクロース
12.5mM Tris
0.02％ w/v Tween80
500μg DOPC
125μgコレステロール
25μg 3D-MPL
25μg QS21
5mM NaCl
4.7％ w/vソルビトール
10mMリン酸塩
pH7.5
サンプル分析
上述の再構成された免疫原性組成物が、25℃又は30℃(T0、T6h及びT24h)で貯蔵された後に特徴付けられた。

SEC-HPLC分析を、20mM Tris緩衝液pH8.5で平衡化したTOSOH TSK-Gel5000Pwxl(ID 7.8mm×30cm)への注入、210nmの紫外線による検出、流速0.5mL/分により実施した。

抗原性をサンドイッチELISAによって定量化した。このELISAにおいて、抗原はM72特異的ウサギポリクローナル抗体に捕捉され、その後M72(Mtb39)特異的マウスモノクローナル抗体によって示される。全ての測定値は、試験された製剤を調製するために使用した精製バルクタンパク質に基づいて期待される抗原性と比較して提示されている。

結果
結果を、図8a〜8d及び9に示す。

各pH(すなわちpH7.5、8.0及び8.5)で、等張化剤としてソルビトールを使用している低塩組成物中に再構成した後では、SEC-HPLCプロファイルは安定している。これは150mM NaClを含有する免疫原性組成物のSEC-HPLCプロファイルと対比されることができ、得られた初期プロファイルと25℃又は30℃で貯蔵した後のそれとの間に明らかな変化を示している。150mM NaCl組成物のpHが低下するとき、この漸進的変化はより強くなる。

各pH(すなわちpH7.5、8.0及び8.5)で、等張化剤としてソルビトールを使用している低塩組成物中に再構成した後、30℃で最大24時間まで回収物は大部分が安定なままであり、抗原性に関して同じ結論を導き出すことができる。

[実施例12]
本発明の免疫原性組成物の導電率の決定
本発明による一連の免疫原性組成物の導電率を測定し、対照塩化ナトリウム溶液の導電率と及び通常量の塩化ナトリウムを含有する免疫原性組成物と比較した。

方法
1500mM塩化ナトリウム原液から注射用の水に希釈することによって、0、75、100、150、250及び300mMの塩化ナトリウム濃度を有する一連の標準液を調製した。

免疫原性組成物を、実施例9に提供される手順に従って二つのN末端His残基を持つM72を使用して調製した。精製したバルク中の抗原自体及びあらゆる残留物の寄与を検討するために、抗原成分を除くことによるプラセボ凍結乾燥ケーキも調製した。

Malvern Zetasizer Nano及び折り曲がったキャピラリーセル中の各1.5mLのサンプルを使用して、30〜150V(機器によって自動的に決定される)の電圧を印加し、導電率を決定した。

結果

このデータに基づく標準曲線を、図10に提示する。

上記のデータから分かるように、150mM NaClを利用している溶液の導電率は、最小限のNaClを使用する溶液の導電率より著しく大きい。

プラセボ調製物が、Rv1196関連抗原を含有する対応物と同等の導電率を有するので、抗原及び精製されたバルク中にある任意の成分の影響は最小限である。

[実施例13]
本発明の免疫原性組成物の免疫原性試験
この実施例の目的は、タンパク質の安定性を改善する目的で本発明の免疫原性組成物中の塩の量を減らす製剤の変化が、in vivo免疫原性に影響を与えるか否か、決定しようとするものであった。

方法
四種の免疫原性組成物を評価した:
1.二つのN末端His残基を持つM72 pH8.5/ASA(150mM NaCl-2)
2.二つのN末端His残基を持つM72 pH8.5/ASA(ソルビトール-2)
3.二つのN末端His残基を持つM72 pH8/ASA(ソルビトール-2)
4.二つのN末端His残基を持つM72 pH7.5/ASA(ソルビトール-2)。

これら抗原を含有する組成物の免疫原性を、C57BL/6マウスにおいて評価した。四種の各組成物について、30匹のC57BL/6マウスに、50μLのアジュバント溶液中に1μgの抗原(実施例11に提供される手順によって調製した)を用いて0、14及び28日目の3回、筋肉内に注射した。誘発されたM72特異的T細胞応答(CD4及びCD8の両方)を、最後の免疫化の6日後(6dPIII)に測定した。

M72特異的細胞応答を決定するために、30匹マウス/群から末梢血リンパ球を採血し、プールした(5匹マウス/群を6プール)。in vitroで細胞を播種する前に、赤血球溶解を実施した。(N末端His残基の無い)M72配列をカバーする重複ペプチド(11アミノ酸が重複している15マーペプチド、1μg/mL/ペプチド)のプールを用いて、細胞をin vitroで再刺激した。培地中に残っている細胞(ペプチド刺激していない)を使用してバックグラウンド応答を決定した。ペプチドプールと一緒に2時間共培養した後に、ブレフェルジンAをウェルに添加し(サイトカイン分泌を阻害するため)、細胞を4℃で一晩貯蔵した。細胞を、その後以下のマーカーに対して染色した:CD4、CD8、IL-2、IFN-γ及びTNF-α。

結果
図11及び12内の各データポイントは、三次免疫の6日後の5匹のマウスに由来する末梢血リンパ球のプールの、バックグラウンドを減算したM72特異的CD4又はCD8 T細胞応答をそれぞれ表している。応答は、M72ペプチドプールを用いた刺激に応答してIFN-γ及び/又はIL-2及び/又はTNF-αを産生するCD4 T細胞のパーセンテージとして表示されている。棒は、各群について応答の中央値を表している。

図11及び12の結果は、各試験製剤を用いて3回免疫化した後に、同程度のCD4及びCD8 T細胞応答が誘導されることを示している。したがって、本発明の免疫原性組成物中に存在する塩の量の減少は、誘導されるT細胞応答に障害をもたらさないと結論できる。

[実施例14]
pH6.1及び8.0でCaCl₂又はMgSO₄を含んだM72を含む組成物における「塩析」の検討
M72抗原安定性に対する他の塩の影響を検討するために、溶液を、異なるpHレベルにおいて一連のCaCl₂又はMgSO₄濃度で調製した。目視検査を、安定性の示度として使用した。

方法
精製したバルク抗原(二つのN末端His残基を持つM72、配列番号7)を、指定量の塩(0mM; 150mM又は300mM NaCl; 40mM、80mM又は160mM CaCl₂; 87.5mM、175mM又は430mM MgSO₄)を含有する異なる二種の緩衝液(10mMコハク酸緩衝液pH6.1及び10mM Tris緩衝液pH8.0)に100μg/mLの濃度になるよう希釈した。

サンプルは、調製後直ちに分析された。

Mettler Toledo導電率計及びシリコン処理していないガラスバイアル中の各サンプル6mLを使用して、導電率を決定した。

結果

結果は、Rv1196関連抗原を含有する溶液が、塩化ナトリウム以外の塩に対して感受性になり得ることを実証している。CaCl₂又はMgSO₄の影響は、同等の濃度又は導電率の塩化ナトリウムより顕著であるように見える。

[実施例15]
pH6.1、7.5及び8.5において異なる塩濃度を持つMtb72fを含む組成物における「塩析」の検討
塩化ナトリウム濃度及びpHのMtb72f抗原安定性に対する影響を、サイズによる評価として検討した。

方法
精製したバルク抗原(六つのHis残基を持つMtb72f、配列番号11)を、最終塩化ナトリウム濃度0、150及び450mMを含有する異なる三種の緩衝液(10mMリン酸塩緩衝液pH6.1、20mM Tris緩衝液pH7.5及び20mM Tris緩衝液pH8.5)中に100μg/mLの濃度になるよう希釈した。

サンプルを、分析の前に4℃又は25℃で24時間貯蔵した。

比濁法は、Thermo Fischer Scientificから市販されているNepheloskan(登録商標)Ascentを使用して実施された。分析は、Corning Inc(USA)から市販されている紫外線を透過するCostar(登録商標)マイクロプレート中で実施された。

Wyatt Instruments製のDynapro Plate Readerを使用してDLSを実施した。機器を、レーザ波長830nm及び50mWの出力を使用して動作させた。散乱光を、150°で22℃の温度で検出した。平均流体力学直径及び多分散性指数(pI)は、機器のソフトウェアで算出される。

結果
この実験の成果を、図13及び14に提示する。

Mtb72fが、前の実施例に示されるM72と類似の方式で塩濃度及びpHに対して感受性であるという一般的な傾向を、DLS及び比濁法の両方が実証している。したがって、本発明の利点は、Rv1196配列自体だけでなくRv1196関連抗原にも適用される。

いくつかのDLSサンプルにおいて、測定器は具体的な粒径を決定できなかった(図14においてNVと示す)。

[実施例16]
M72と免疫賦活薬を含み、等張化剤としてソルビトールを使用している組成物における「塩析」の防止
150mM NaClを含有する免疫原性組成物の安定性を、等張化剤としてソルビトールを使用している組成物と比較するために、サンプルを別のELISAを使用してモニタリングした。

方法
実施例7由来の適切なアジュバント製剤と併用したときにpH8.5が得られるような凍結乾燥ケーキを、実施例11(特に方法(a))に記載の通り調製した。

上述の凍結乾燥ケーキを、実施例7において調製した625μLのアジュバント溶液を用いて再構成した。アジュバント溶液を用いる再構成によって、以下の免疫原性組成物が得られた:
(i)二つのN末端His残基を持つM72 - ASA(150mM NaCl-2)pH8.5
10μg抗原(20μg/mL)
5％ w/vスクロース
40mM Tris
0.02％ w/v Tween80
500μg DOPC
125μgコレステロール
25μg 3D-MPL
25μg QS21
150mM NaCl
10mMリン酸塩
pH8.5
(ii)二つのN末端His残基を持つM72 - ASA(ソルビトール-2)pH8.5
10μg抗原(20μg/mL)
5％ w/vスクロース
40mM Tris
0.02％ w/v Tween80
500μg DOPC
125μgコレステロール
25μg 3D-MPL
25μg QS21
5mM NaCl
4.7％ w/vソルビトール
10mMリン酸塩
pH8.5
上述の再構成された免疫原性組成物は、30℃(T24h)で貯蔵された後に特徴付けられ、用時調製されたサンプル(T0)と比較された。

抗原性を間接サンドイッチELISAによって定量化した。このELISAにおいて、抗原はM72特異的ウサギポリクローナル抗体に捕捉され、その後M72(Mtb39)特異的マウスモノクローナル抗体によって示される。簡潔には、プレートを、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水に1/8000希釈した抗M72ウサギポリクローナル抗体を用いて4℃で一晩コーティングし、4回洗浄した後、プレートを飽和緩衝液(PBS、0.1％ Tween20、1％ BSA)を用いて37℃で1時間ブロッキングした。洗浄ステップの後、タンパク質標準(M72精製バルク:1950μg/mL)、内部対照(M72:1768μg/mL)及びサンプルを、およそ0.25μg/mLの濃度でプレートの第一列からウェルにロードし、次いでウェル1から12へと飽和緩衝液(PBS、0.025％ Tween20)に2倍連続希釈を実施し、37℃で1時間30分間インキュベートする。洗浄ステップの後、免疫複合体を、次いで飽和緩衝液(PBS、0.025％ Tween20)に1/1000希釈した抗M72マウスモノクローナル抗体と一緒に37℃で1時間インキュベートする。4回洗浄した後、ビオチン化ウサギ抗マウスポリクローナル抗体を、飽和緩衝液(PBS、0.025％ Tween20)に1/1000希釈で添加した。4回洗浄した後、飽和緩衝液(PBS、0.025％ Tween20)に1/4000希釈したストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼを添加することによって、シグナルを増幅した。4回洗浄した後、室温で15分間、o-フェニレンジアミン二塩酸塩(OPDA)によってシグナルを呈し、1M HClを添加することにより反応を停止させた。呈色は、結合している抗M72抗体の量に比例しており、490nm及び620nmで測定される。全ての洗浄ステップは、PBS、0.025％ Tween20を使用して実施された。

全ての測定値は、試験された製剤を調製するために使用した精製バルクタンパク質に基づいて期待される抗原性と比較して提示されている。

結果
結果を、図15に示す。ひし形は、三つの試験サンプル各々に固有の測定値を示しており、線は平均値を示している。

抗原回収率は、pH8.5で、等張化剤としてソルビトールを使用している低塩組成物中に再構成した後、30℃で最大24時間までほぼ安定している。24時間後のASA(ソルビトール-2)の回収率は、83.5％であった(T0 87.1％、相対的抗原性が95.9％維持されたことを意味している)が、24時間後のASA(NaCl-2)の回収率は54.5％であった(T0 81.0％、貯蔵後に、相対的抗原性が67.3％しか維持されなかったことを意味している)。

要約すると、実施例8は、Rv1196関連抗原を含有する免疫原性組成物の安定性に対するpH及びNaCl濃度に起因する有害な影響を、初めて実証している。実施例14はこの研究を拡大して、他の塩にも、Rv1196関連抗原を含有する免疫原性組成物の安定性に対する有害な影響が有り得ることを示しており、実施例10、11、12、15及び16は、その効果が他の配列にも適用できることを実証している。

非イオン性等張化剤を用いる免疫原性組成物の組成変更は、抗原安定性の問題を解決する。加えて、実施例3、4、13及び16は、実質的に全てのNaClを免疫原性製剤から除去すること及びNaClを等張化剤であるソルビトールと置きかえることが、T細胞応答の刺激に対して有害な影響を持たないことを実証している。

免疫原性組成物の安定性は重要であり、冷凍が容易に利用できない遠隔地の場合は特に困難になる場合がある。免疫原性組成物中の塩の存在量を減少させることによって、本発明者らは、免疫原性組成物を貯蔵するときに観察される変化の程度を減少させることができた。

本明細書及びそれに続く特許請求の範囲全体にわたって、文脈上別段の解釈を要する場合を除き、「含む(comprise)」という単語、並びに「含む(comprises)」及び「含んでいる(comprising)」などその変化形は、記載されている整数、ステップ、整数の群又はステップの群を包含するが、他のどんな整数、ステップ、整数の群又はステップの群も除外しないことを意味すると理解される。

特許及び特許出願を含めて本明細書において引用される全ての文書は、その全体を参照により組み込む。

Claims (21)

1. Rv1196関連抗原を含む免疫原性組成物であって、該Rv1196関連抗原は、(a)配列番号1と少なくとも90％の同一性を有する配列、又は(b)長さ少なくとも350アミノ酸である配列番号1の断片を含み、該組成物のpHは7.0〜9.0の範囲にあり、さらに、
   (i)組成物の導電率が5mS/cm以下である;及び/又は
   (ii)前記組成物中の塩濃度が50mM以下である、免疫原性組成物。
2. 組成物の導電率が4mS/cm以下である、請求項1に記載の免疫原性組成物。
3. 組成物の導電率が3mS/cm以下である、請求項2に記載の免疫原性組成物。
4. 前記組成物中の塩濃度が40mM以下である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
5. 非イオン性等張化剤を更に含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
6. 非イオン性等張化剤が多価アルコールである、請求項5に記載の免疫原性組成物。
7. 多価アルコールがソルビトールであり、かつソルビトール濃度が4〜6％(w/v)である、請求項6に記載の免疫原性組成物。
8. スクロース濃度が4〜6％(w/v)である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
9. 1以上の免疫賦活薬を更に含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
10. 免疫原性組成物がQS21を含む、請求項9に記載の免疫原性組成物。
11. 免疫原性組成物がリポ多糖類を含む、請求項9又は10に記載の免疫原性組成物。
12. リポ多糖類が3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドAである、請求項11に記載の免疫原性組成物。
13. モル浸透圧濃度が250〜750mOsm/kgである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
14. 組成物が50μL〜1mLの単位用量として提供され、かつ単位用量が1〜100μgのRv1196関連タンパク質を含有する、請求項1〜13のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
15. 前記組成物のpHが7.5〜8.5の範囲にある、請求項1〜14のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
16. Rv1196関連抗原が配列番号1と少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
17. Rv1196関連抗原が長さ少なくとも350アミノ酸である配列番号1の断片を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
18. 医薬で使用するための、請求項1〜17のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
19. 医薬品の製造における、請求項1〜17のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用。
20. マイコバクテリウムによる感染の予防、治療又は改善に使用するための、請求項1〜18のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
21. ヒトへの投与に使用するための、請求項18又は20に記載の免疫原性組成物。

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