JP5888470B2 - テロメラーゼ活性測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、テロメラーゼ活性測定方法に関する。

テロメラーゼ活性測定方法として、Telomere repeat amplification protocolアッセイ（以下、ＴＲＡＰアッセイ）がある（非特許文献１）。ＴＲＡＰアッセイの手順は、以下のとおりである。

１．生体試料溶解液中のテロメラーゼを用いてテロメラーゼ反応を行う。

２．上記工程１で得られたテロメラーゼ反応産物をＰＣＲにより増幅し、この増幅産物を電気泳動法により解析する。

テロメラーゼ阻害剤の細胞核内での阻害効果を評価するために、テロメラーゼ反応溶液に、ゲノムＤＮＡと想定したλＤＮＡを添加することで、擬似的に細胞核内条件を構築することが報告されている（非特許文献２）。

米国特許第８１０１３５７号公報（特に第１０欄第３６行目〜第１１欄第２５行目）

Nam W. Kim, et al., "Specific Association of Human Telomerase Activity with Immortal Cells and Cancer",Science, 266巻, 1994年, p.2011-2015 Hidenobu Yaku, et al., "Anionic phthalocyanines targeting G-quadruplexes and inhibiting telomerase activity in the presence of excessive DNA duplexes", Chem. Commun., 2010, 46, 5740-5742 Schmidt, P.M.; Lehmann, C.; Matthes, E.; Bier, F.F. Detection of activity of telomerase in tumor cells using fiber optical biosensors. Biosens. Bioelectron. 2002,17, 1081-1087. Grimm, J.; Perez, J. M.; Josephson, L.; Weissleder, R. Novelnanosensors for rapid analysis of telomerase activity. Cancer Res. 2004, 64, (2), 639-643.

非特許文献１および非特許文献２に開示されているテロメラーゼ活性測定方法よりも、さらに高精度なテロメラーゼ活性測定方法が望まれていた。本発明は、従来のテロメラーゼ活性測定方法より高精度である、新規なテロメラーゼ活性測定方法の提供を目的とする。

本願第１発明に係るテロメラーゼ活性測定方法は、
テロメラーゼの活性を測定するテロメラーゼ活性測定方法であって、
テロメラーゼを含有する溶液と、テロメラーゼの基質とならない非プライマーＤＮＡを含有する溶液との第１混合溶液を準備する工程（ａ）と、
工程（ａ）の後に、前記第１混合溶液と、テロメラーゼの基質となるプライマーＤＮＡを含有する溶液とを混合する工程（ｂ）と、
工程（ｂ）の後に、前記テロメラーゼにより前記プライマーＤＮＡを伸長させる工程（ｃ）と、
工程（ｃ）の後に、伸長された前記プライマーＤＮＡを検出する工程（ｄ）と、
を含むテロメラーゼ活性測定方法に関する。

前記工程（ｄ）は、
伸長された前記プライマーＤＮＡをＰＣＲ法により増幅する工程（ｅ）と、
前記ＰＣＲ法により得られるＤＮＡ増幅産物を電気泳動する工程（ｆ）と、
前記電気泳動の結果を測定する工程（ｇ）と、
であることが好ましい。

本願第２発明に係るテロメラーゼ活性測定方法は、
テロメラーゼの活性を測定するテロメラーゼ活性測定方法であって、
テロメラーゼの基質となるプライマーＤＮＡを含有する溶液と、テロメラーゼの基質とならない非プライマーＤＮＡを含有する溶液との第２混合溶液を準備する工程（ｈ）と、
工程（ｈ）の後に、前記第２混合溶液と、テロメラーゼを含有する溶液とを混合する工程（ｉ）と、
工程（ｉ）の後に、前記テロメラーゼにより前記プライマーＤＮＡを伸長させる工程（ｊ）と、
工程（ｊ）の後に、伸長された前記プライマーＤＮＡを検出する工程（ｋ）と、
を含むテロメラーゼ活性測定方法に関する。

前記工程（ｋ）は、
伸長された前記プライマーＤＮＡをＰＣＲ法により増幅する工程（ｌ）と、
前記ＰＣＲ法により得られるＤＮＡ増幅産物を電気泳動する工程（ｍ）と、
前記電気泳動の結果を測定する工程（ｎ）と、
であることが好ましい。

前記非プライマーＤＮＡは、テロメラーゼＲＮＡの４６番目〜５６番目の塩基配列（５’−ＣＵＡＡＣＣＣＵＡＡＣ-３’：配列番号１）に対して非相補的な非プライマーＤＮＡであること
が好ましい。

前記非プライマーＤＮＡは、λＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはＭ１３ＤＮＡであることが特に好ましい。

前記非プライマーＤＮＡは、プラスミドＤＮＡまたはＭ１３ＤＮＡであることがさらにより好ましい。

本願第３発明に係る方法は、テロメラーゼによりプライマーＤＮＡを伸張させる方法であって、以下の方法を具備する：
（ａ） テロメラーゼおよびＤＮａｓｅを含有する溶液を、テロメラーゼの基質とならない非プライマーＤＮＡと混合して、混合液を得る工程、および
（ｂ） 工程（ａ）の後に、前記ＤＮａｓｅによって前記非プライマーＤＮＡが分解されている間に、テロメラーゼの基質となる前記プライマーＤＮＡを前記混合液に添加して、前記テロメラーゼにより前記プライマーＤＮＡを伸張させる工程。

前記非プライマーＤＮＡは、λＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはＭ１３ＤＮＡであることが好ましい。

本願第４発明に係る方法は、テロメラーゼの活性度を測定する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ） テロメラーゼおよびＤＮａｓｅを含有する溶液を、テロメラーゼの基質とならない非プライマーＤＮＡと混合して、混合液を得る工程、
（ｂ） 工程（ａ）の後に、前記ＤＮａｓｅによって前記非プライマーＤＮＡが分解されている間に、テロメラーゼの基質となるプライマーＤＮＡを前記混合液に添加して、前記テロメラーゼによりプライマーＤＮＡを伸張させる工程、および
（ｃ） 工程（ｂ）において伸張された前記プライマーＤＮＡの伸張度を元に前記テロメラーゼの活性を決定する工程。

前記工程（ｃ）は、
（ｃ１） 工程（ｂ）において伸張された前記プライマーＤＮＡをＰＣＲ法により増幅する工程、
（ｃ２） 工程（ｃ１）において増幅された前記プライマーＤＮＡを電気泳動に供する工程、および
（ｃ３） 工程（ｃ２）における電気泳動の結果を元に、前記テロメラーゼの活性度を決定する工程
を含むことが好ましい。

前記非プライマーＤＮＡは、λＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはＭ１３ＤＮＡであることが好ましい。

本願第５発明に係る方法は、テロメラーゼによりプライマーＤＮＡを伸張させる方法であって、以下の方法を具備する：
（ａ） テロメラーゼの基質とならない非プライマーＤＮＡ、およびテロメラーゼの基質となるプライマーＤＮＡを含有する混合液を用意する工程、および
（ｂ） 前記工程（ａ）の後に、テロメラーゼおよびＤＮａｓｅを含有する溶液を、前記混合液に添加して、前記ＤＮａｓｅが前記非プライマーＤＮＡを分解しながら前記テロメラーゼにより前記プライマーＤＮＡを伸張させる工程。

前記非プライマーＤＮＡは、λＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはＭ１３ＤＮＡであることが好ましい。

本願第６発明に係る方法は、テロメラーゼの活性度を測定する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ） テロメラーゼの基質とならない非プライマーＤＮＡ、およびテロメラーゼの基質となるプライマーＤＮＡを含有する混合液を用意する工程、
（ｂ） 前記工程（ａ）の後に、テロメラーゼおよびＤＮａｓｅを含有する溶液を、前記混合液に添加して、前記ＤＮａｓｅが前記非プライマーＤＮＡを分解しながら前記テロメラーゼにより前記プライマーＤＮＡを伸張させる工程、および
（ｃ） 工程（ｂ）において伸張された前記プライマーＤＮＡの伸張度を元に前記テロメラーゼの活性を決定する工程。

前記工程（ｃ）は、
（ｃ１） 工程（ｂ）において伸張された前記プライマーＤＮＡをＰＣＲ法により増幅する工程、
（ｃ２） 工程（ｃ１）において増幅された前記プライマーＤＮＡを電気泳動に供する工程、および
（ｃ３） 工程（ｃ２）における電気泳動の結果を元に、前記テロメラーゼの活性度を決定する工程
を含むことが好ましい。

前記非プライマーＤＮＡは、λＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはＭ１３ＤＮＡであることが好ましい。

本発明の方法によれば、従来の測定方法と比較して、より高精度にテロメラーゼ活性を測定することが可能である。

本願第１発明のテロメラーゼ活性測定方法のフローチャートを示す。 本願第２発明のテロメラーゼ活性測定方法のフローチャートを示す。 実施例１(a)および比較例１(b)の電気泳動結果の写真を表す図である。 実施例１(a)および比較例１(b)のHeLa細胞数とバンドの濃さとの関係を示すグラフである。 実施例３および４の電気泳動結果の写真を表す図を示す。 実施例１においてλＤＮＡの濃度を変化させた場合の電気泳動結果の写真を表す図を示す。 図７は、実施例７の電気泳動の実験結果の写真を表す図である。 図８は、保温開始からの時間および分解されていないλＤＮＡバンドの輝度量の関係を表すグラフである。

本願第１発明に係るテロメラーゼ活性測定方法は、
テロメラーゼの活性を測定するテロメラーゼ活性測定方法であって、
テロメラーゼを含有する溶液と、テロメラーゼの基質とならない非プライマーＤＮＡを含有する溶液との第１混合溶液を準備する工程（ａ）と、
工程（ａ）の後に、前記第１混合溶液と、テロメラーゼの基質となるプライマーＤＮＡを含有する溶液とを混合する工程（ｂ）と、
工程（ｂ）の後に、前記テロメラーゼにより前記プライマーＤＮＡを伸長させる工程（ｃ）と、
工程（ｃ）の後に、伸長された前記プライマーＤＮＡを検出する工程（ｄ）と、
を含むテロメラーゼ活性測定方法に関する。

本願第２発明に係るテロメラーゼ活性測定方法は、
テロメラーゼの活性を測定するテロメラーゼ活性測定方法であって、
テロメラーゼの基質となるプライマーＤＮＡを含有する溶液と、テロメラーゼの基質とならない非プライマーＤＮＡを含有する溶液との第２混合溶液を準備する工程（ｈ）と、
工程（ｈ）の後に、前記第２混合溶液と、テロメラーゼを含有する溶液とを混合する工程（ｉ）と、
工程（ｊ）の後に、前記テロメラーゼにより前記プライマーＤＮＡを伸長させる工程（ｊ）と、
工程（ｋ）の後に、伸長された前記プライマーＤＮＡを検出する工程（ｋ）と、
を含むテロメラーゼ活性測定方法に関する。

本願第３発明に係る方法は、テロメラーゼによりプライマーＤＮＡを伸張させる方法であって、以下の方法を具備する：
（ａ） テロメラーゼおよびＤＮａｓｅを含有する溶液を、テロメラーゼの基質とならない非プライマーＤＮＡと混合して、混合液を得る工程、および
（ｂ） 工程（ａ）の後に、前記ＤＮａｓｅによって前記非プライマーＤＮＡが分解されている間に、テロメラーゼの基質となる前記プライマーＤＮＡを前記混合液に添加して、前記テロメラーゼにより前記プライマーＤＮＡを伸張させる工程。

本願第４発明に係る方法は、テロメラーゼの活性度を測定する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ） テロメラーゼおよびＤＮａｓｅを含有する溶液を、テロメラーゼの基質とならない非プライマーＤＮＡと混合して、混合液を得る工程、
（ｂ） 工程（ａ）の後に、前記ＤＮａｓｅによって前記非プライマーＤＮＡが分解されている間に、テロメラーゼの基質となるプライマーＤＮＡを前記混合液に添加して、前記テロメラーゼによりプライマーＤＮＡを伸張させる工程、および
（ｃ） 工程（ｂ）において伸張された前記プライマーＤＮＡの伸張度を元に前記テロメラーゼの活性を決定する工程。

本願第５発明に係る方法は、テロメラーゼによりプライマーＤＮＡを伸張させる方法であって、以下の方法を具備する：
（ａ） テロメラーゼの基質とならない非プライマーＤＮＡ、およびテロメラーゼの基質となるプライマーＤＮＡを含有する混合液を用意する工程、および
（ｂ） 前記工程（ａ）の後に、テロメラーゼおよびＤＮａｓｅを含有する溶液を、前記混合液に添加して、前記ＤＮａｓｅが前記非プライマーＤＮＡを分解しながら前記テロメラーゼにより前記プライマーＤＮＡを伸張させる工程。

本願第６発明に係る方法は、テロメラーゼの活性度を測定する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ） テロメラーゼの基質とならない非プライマーＤＮＡ、およびテロメラーゼの基質となるプライマーＤＮＡを含有する混合液を用意する工程、
（ｂ） 前記工程（ａ）の後に、テロメラーゼおよびＤＮａｓｅを含有する溶液を、前記混合液に添加して、前記ＤＮａｓｅが前記非プライマーＤＮＡを分解しながら前記テロメラーゼにより前記プライマーＤＮＡを伸張させる工程、および
（ｃ） 工程（ｂ）において伸張された前記プライマーＤＮＡの伸張度を元に前記テロメラーゼの活性を決定する工程。

＜本発明を開発するに至った経緯＞
正常な体細胞中のテロメアＤＮＡは、細胞分裂毎に短縮化し、一定回数の細胞分裂が行われると細胞分裂が停止する。これに対して、癌細胞においてはテロメラーゼが活性化しており、癌細胞中のテロメアＤＮＡは、ＤＮＡを伸長させる反応が停止することなく継続するため、細胞の異常増殖が引き起こされる。テロメラーゼ活性の測定は、癌診断における有用な検査技術となり得るため、非常に注目されてきた。

非特許文献１または２に開示されているような従来のテロメラーゼ活性測定方法は、細胞溶解液中のテロメラーゼとＴＳプライマー（テロメラーゼの基質となるプライマーＤＮＡ）を反応させ、テロメラーゼ反応（テロメアＤＮＡを伸長させる反応）の反応産物であるＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって増幅し、塩基泳動によってＤＮＡ断片を検出することを原理としている。テロメラーゼ活性測定用のサンプル溶液は、細胞のような生体試料を界面活性剤又は界面活性剤を含有する細胞溶解用緩衝液によって溶解するか、あるいは、細胞のような生体試料をホモジナイズまたは超音波振動のような物理的手段によって溶液中で破砕し、得られた溶液である。

サンプル中のテロメラーゼ濃度が高いほど、電気泳動の際には、濃いラダー状バンドが広い範囲で確認されるはずである。しかし、テロメラーゼ濃度が高いサンプルのラダー状バンドが、濃度が低いサンプルのラダー状バンドよりも薄くなったり、狭い範囲でしかバンドが確認されなかったりする場合があることが知られていた。すなわち、従来のテロメラーゼ活性測定方法には、感度が低く、偽陰性を示す場合があるという問題があった。

サンプル溶液には、テロメラーゼの基質とならない非プライマーＤＮＡが混在している。非特許文献２に示されるように、本発明者等は、従来のテロメラーゼ活性測定方法において、サンプル中に混在し、細胞由来のテロメラーゼの基質とならない非プライマーＤＮＡとしてλＤＮＡを反応系に添加して、λＤＮＡが測定に与える影響について検討した。その結果、λＤＮＡを混在させることによって、テロメラーゼとＴＳプライマーとの反応が妨害されることはなかった。

そこで、本発明者等は、サンプル溶液には、ＤＮＡを分解する酵素デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）も含有されていることに注目した。ＤＮａｓｅがテロメラーゼ反応系に混在すると、ＴＳプライマーおよびテロメラーゼ反応の反応産物であるＤＮＡ断片が分解されてしまう。そこで、本発明者等は、ＤＮａｓｅを含有するサンプル溶液とテロメラーゼの基質となるプライマーＤＮＡとを混合する前に、テロメラーゼの基質とならない非プライマーＤＮＡを反応系に共存させることにより、ＤＮａｓｅによる影響を排除してテロメラーゼ活性測定における感度を向上させ、偽陰性も生じなくすることが可能であると推察し、本発明を完成させるに至った。

以下、本開示の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。

（実施の形態１）
図１は、本願第１発明に係るテロメラーゼ活性測定方法のフローチャートを示す。始めに、テロメラーゼを含有する生体試料溶解液と、テロメラーゼの基質とならないＤＮＡ（非プライマーＤＮＡ）を混合して混合液Ａ（第１混合溶液）を調製する（ステップＳ１０）。ここで、本発明において「生体試料溶解液」とは細胞若しくは生体組織試料を溶解した溶液、又はこれに類する溶液である。

テロメラーゼの基質とならないＤＮＡ（非プライマーＤＮＡ）の例は、
（ｉ） λＤＮＡ
（ｉｉ） プラスミドＤＮＡ、または
（ｉｉｉ） Ｍ１３ＤＮＡ
である。

（ｉ） λＤＮＡは、線状の二本鎖ＤＮＡである。代表的なλＤＮＡは、４８５０２個の塩基対を有し、かつタカラバイオ株式会社より入手可能である。

（ｉｉ） プラスミドＤＮＡは、環状の二本鎖ＤＮＡから構成される。

（ｉｉｉ） Ｍ１３ＤＮＡは環状の一本鎖ＤＮＡから構成される。

このように、テロメラーゼの基質とならないＤＮＡ（非プライマーＤＮＡ）の例は、
（ｉ）’線状の二本鎖ＤＮＡ
（ｉｉ）’環状の二本鎖ＤＮＡ、または
（ｉｉｉ）’ 環状の一本鎖ＤＮＡ
である。

次に、混合液Ａとテロメラーゼの基質となるＤＮＡ（プライマーＤＮＡ）を混合して混合液Ｂを調製する（ステップＳ１１）。ここで、本発明において「テロメラーゼの基質となるＤＮＡ」とは、テロメラーゼ反応の起点として機能するプライマーＤＮＡである。具体的には、テロメアＤＮＡ若しくはＴＳプライマー（５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’：配列番号２）又はこれらに類するＤＮＡである。

次に、混合液Ｂをテロメラーゼ反応が起こる条件下に置く（ステップＳ１２）。具体的には、テロメラーゼ反応が進む温度帯で混合液Ｂをインキュベートすればよい。例えば、混合液Ｂを３０℃〜４０℃程度でインキュベートすればテロメラーゼ反応は効率よく進む。

次に、テロメラーゼ反応産物を検出する（ステップＳ１３）。具体的には、テロメラーゼ反応産物（ＤＮＡ断片）をＰＣＲ法により増幅し、この増幅産物を電気泳動法で解析すればよい。しかし、テロメラーゼ反応産物の検出方法は、このＰＣＲ法と電気泳動法を組み合わせた方法に限られず、例えば、Optical fiberを使用する方法（非特許文献３）、またはMagnetic resonance readerを使用する方法（非特許文献４）も使用し得る。

本実施形態においては、少なくとも混合液Ｂ中にＭｇイオン、デオキシアデノシン三リン酸（以下、ｄＡＴＰと呼ぶ）、デオキシグアノシン三リン酸（以下、ｄＧＴＰと呼ぶ）、およびデオキシチミジン三リン酸（以下、ｄＴＴＰと呼ぶ）が含まれている必要がある。これらは、ステップＳ１１までの工程で添加されればよい。

本実施の形態においては、混合液Ｂ中に緩衝液成分またはＫＣｌのような塩類が含まれることでテロメラーゼ反応が効率よく進む。これら塩類についても、ステップＳ１１までの工程で添加されればよい。

以上の一連の工程（ステップＳ１０〜Ｓ１３）によって、偽陰性を生じず、かつ定量的にテロメラーゼ活性を測定することができる。

（実施の形態２）
図２は、本願第２発明に係るテロメラーゼ活性測定方法のフローチャートを示す。図２に示されるフローチャートは、生体試料溶解液とテロメラーゼの基質となるＤＮＡ（プライマーＤＮＡ）とを混合する前に、テロメラーゼの基質とならないＤＮＡ（非プライマーＤＮＡ）を共存させる点においてのみ異なり、それ以外は同じである。

本実施形態においては、始めに、テロメラーゼの基質となるＤＮＡ（プライマーＤＮＡ）と、テロメラーゼの基質とならないＤＮＡ（非プライマーＤＮＡ）とを混合し、混合液Ｃ（第２混合溶液）を調製する（ステップＳ２０）。

次に、テロメラーゼを含有する生体試料溶解液と混合液Ｃとを混合し、混合液Ｄを調製する（ステップＳ２１）。

次に、混合液Ｄをテロメラーゼ反応が起こる条件下に置く（ステップＳ２２）。ステップＳ２２は、図１のステップＳ１２と同じである。

次に、テロメラーゼ反応産物を検出する（ステップＳ２３）。ステップＳ２３は、図１のステップＳ１３と同じである。

本実施形態においても、少なくとも混合液Ｂ中にＭｇイオン、デオキシアデノシン三リン酸（以下、ｄＡＴＰと呼ぶ）、デオキシグアノシン三リン酸（以下、ｄＧＴＰと呼ぶ）、およびデオキシチミジン三リン酸（以下、ｄＴＴＰと呼ぶ）が含まれている必要がある。これらは、ステップＳ２１までの工程で添加されればよい。

以上の一連の工程（ステップＳ２０〜Ｓ２３）によって、偽陰性を生じず、かつ定量的にテロメラーゼ活性を測定することができる。

［実施例１／実施の形態１］
テロメラーゼを含有する生体試料溶解液として、HeLa細胞（メルクミリポア社より入手）をCHAPS lysis緩衝液によって溶解した溶解液（以下、HeLa細胞溶解液と呼ぶ）を用い
た。HeLa細胞は、がん細胞の一種であり、その細胞内ではテロメラーゼが活性化されていることが知られている。テロメラーゼの基質ＤＮＡとならないＤＮＡとして、λＤＮＡ（タカラバイオ株式会社より入手）を用いた。λＤＮＡは、線状の二本鎖ＤＮＡである。

以下に、実施例１の実験手順を記した。始めに、表１に示される混合液Ａ１（第１混合溶液）を調製した。

テロメラーゼ反応用緩衝液として、TRAPEZE Telomerase Detection Kit（メルクミリポア社より入手）の10×TRAP Reaction Buffer（200mM Tris-HCl (pH8.3）、15mM MgCl₂、630mM KCl、0.5％Tween20、および10mM EGTAを含有する）を用いた。ｄＮＴＰ混合液とし
て、TRAPEZE Telomerase Detection Kitの50×dNTP Mix（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＣＴＰを、それぞれ2.5mMの濃度で含有する）を用いた。ＴＳプライマーは、
つくばオリゴサービス株式会社より入手された。混合液Ａを調製する際には、ＴＳプライマーとλＤＮＡが混合された後に、HeLa細胞溶解液が添加および混合された。

次に、混合液Ａ１中でテロメラーゼ反応を進めるために、混合液Ａ１を37℃にて60分間インキュベートした。

次に、テロメラーゼ反応を停止させるために、混合液Ａ１を95℃にて10分間インキュベートした後、4℃に冷やした。

次に、混合液Ａ１に水を190μL添加し、希釈混合液Ａ１を得た。

次に、表２に示される混合液Ｂ１を調製した。

ＰＣＲ反応用緩衝液として、TaKaRa LA Taq Hot Start Version（タカラバイオ株式会社より入手）の10×LA PCR Buffer II（Mg²⁺plus）を用いた。ｄＮＴＰ混合液として、TRAPEZE Telomerase Detection Kitの50×dNTP Mixを用いた。ＴＳプライマーは、つくばオリゴサービス株式会社より入手された。プライマー混合液として、TRAPEZE Telomerase Detection KitのPrimer Mixを用いた。Primer Mixは、テロメラーゼ反応産物をＰＣＲによって増幅するためのリバースプライマーを含有する（フォワードプライマーは、ＴＳプライマー）。ＰＣＲ用酵素として、TaKaRa LA Taq Hot Start VersionのTaKaRa LA Taq HSを用いた。

次に、テロメラーゼ反応産物をＰＣＲにより増幅するために、混合液Ｂについて、95℃／30秒、59℃／30秒、および72℃／30秒のインキュベーションを30サイクル行った。

次に、ＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動法により解析した。用いたゲルは、10％ポリアクリルアミドゲルであった。電気泳動に用いられたバッファーは、Tris-Brate-EDTAバッファー（以下、「ＴＢＥバッファー」と呼ぶ）であった。電気泳動において印加された電圧は、400Vであった。

［比較例１］
λＤＮＡを用いなかったこと以外は、実施例１と同様の実験を行なった。以下、比較例１の実験手順を具体的に記す。

始めに、表３に示される混合液Ａ２を調製した。

次に、混合液Ａ２中でテロメラーゼ反応を行った後、停止させた。テロメラーゼ反応条件および停止条件は、実施例１と同じとした。

次に、混合液Ａ２を４℃に冷やした。

次に、混合液Ａ２に水を190μL添加し、希釈混合液Ａ２を得た。

次に、表２に示される混合液Ｂ２を調製した。

次に、溶液Ｂ２中のテロメラーゼ反応産物をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ条件は、実施例１と同じとした。

次に、ＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動法により解析した。電気泳動条件は、実施例１と同じとした。

図３(a)および図３(b)は、実施例１および比較例１の電気泳動結果をそれぞれ示す。図中のラダー状のバンドは、テロメラーゼ反応産物由来のバンドである。図中の「ＩＣ」（Internal Controlの略）と示されたバンドは、Primer Mix中に含有されたテンプレートＤＮＡのＰＣＲ産物由来のバンドであり、テロメラーゼ反応に対しては非依存的である。したがって、ＩＣのバンドはＰＣＲが行われたかどうかを判断する指標のためのバンドである。

図３(a)において、レーン１、２、３および４は、それぞれ、実施例１の溶液Ａ中のHeLa細胞の数が0個、500個、2500個および5000個の場合の実験結果を示している。図３(a)より、実施例１においては、HeLa細胞の増加にともない、テロメラーゼ反応産物量が増加したことを示している。本来、HeLa細胞が増加すればテロメラーゼ量も増加するため、その結果、全体的にテロメラーゼ反応産物量が増加する。したがって、図３(a)は、実施例１によってHeLa細胞中のテロメラーゼ活性が正確に検出されたことを示している。

一方、図３(b)において、レーン１、２、３および４は、それぞれ、比較例１の溶液Ａ２中のHeLa細胞の数が0個、500個、2500個および5000個の場合の実験結果を示している。図３(a)のレーン２〜４と比較すると、図３(b)のレーン２〜４は、長いテロメラーゼ反応産物の量が少なかった。しかも、図３(b)は、HeLa細胞数が増加するほど、長いテロメラーゼ反応産物量が著しく減少することを示している。本来、HeLa細胞数が増加すれば、長いテロメラーゼ反応産物量も増加するはずであることから、図３(b)は、比較例１のテロメラーゼ活性測定においては、偽陰性が生じ得ることを示している。

図３(a)と図３(b)のＩＣのバンドの濃さは、ほとんど同じであった。このことは、実施例１と比較例１において認められた電気泳動結果の違いは、ＰＣＲ工程とは関係なく、テロメラーゼ反応工程に由来するものであることを示している。言い換えれば、実施例１ではテロメラーゼ反応が正常に行われたのに対して、比較例１では正常に行われなかったことを意味している。したがって、本実施例１と比較例１においては、テロメラーゼ反応産物の検出方法として、ＰＣＲと電気泳動法を用いたが、それ以外の手法によってテロメラーゼ反応産物を検出しても、同様の結果が得られるはずである。

以上の結果より、本願第１発明に係るテロメラーゼ活性測定方法により、偽陰性を生じずにテロメラーゼ活性を測定できることが確認された。

図４(a)は、図３(a)におけるテロメラーゼ産物由来のバンドの濃さとHeLa細胞数との関係を示す。図４(b)は、図３(b)のテロメラーゼ産物由来のバンドの濃さとHeLa細胞数との関係を示す。これらのグラフを比較すると、実施例１の方が比較例２と比べて、Hela細胞数が同じである場合に、より高感度に検出できることが分かる。これらのグラフを比較すると、実施例１の測定方法が、比較例１の測定方法よりも定量性が高いことが分かる。

以上の結果より、本願第１発明に係るテロメラーゼ活性測定方法により、高感度かつ高い定量性で細胞のテロメラーゼ活性を測定できることが確認された。

［実施例２／実施の形態２］
実施例１では、混合液Ａを調製する際に、ＴＳプライマーとλＤＮＡとが混合された後に、HeLa細胞溶解液を添加及び混合した。そこで、HeLa細胞溶解液とλＤＮＡが混合された後に、ＴＳプライマーを添加及び混合し、それ以外はすべて実施例１と同様に操作した。その結果、実施例１と同様の実験結果が得られた。

［比較例２］
実施例２と異なり、HeLa細胞溶解液とＴＳプライマーとを混合した後に、λＤＮＡを添加及び混合した場合においては、テロメラーゼ反応産物量が少なかった。

［実施例３／実施の形態１］
λＤＮＡの代わりにプラスミドＤＮＡ（ｐＢＲ３２２：タカラバイオ株式会社より入手）を用いたこと以外は、すべて実施例１と同様に操作した。ｐＢＲ３２２は環状の二本鎖ＤＮＡである。

以下に、実施例３の実験手順を具体的に記す。

始めに、表５に示される混合液Ａ３を調製した。

次に、混合液Ａ３中でテロメラーゼ反応を行った後、停止させた。テロメラーゼ反応条件および停止条件は、実施例１と同じとして。

次に、混合液Ａ３を４℃に冷やした。

次に、混合液Ａ３に水を190μL添加し、希釈混合液Ａ３を得た。

次に、表６に示される混合液Ｂ３を調製した。

次に、溶液Ｂ３中のテロメラーゼ反応産物をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ条件は、実施例１と同じとした。

次に、ＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動法により解析した。電気泳動条件は、実施例１と同じとした。

［実施例４／実施の形態１］
λＤＮＡの代わりにＭ１３ファージ由来のＤＮＡ（以下、Ｍ１３ＤＮＡと呼ぶ。New England Biolabs社より入手。）を用いたこと以外は、すべて実施例３と同様の操作を行った。Ｍ１３ＤＮＡは、環状の一本鎖ＤＮＡである。

図５(a)および図５(b)は、それぞれ実施例３および実施例４の電気泳動の結果を示す。図５（a）および図５(b)いずれの場合も、レーン１は溶液Ａ３中のHeLa細胞数が0の場合、レーン２は溶液Ａ３中のHeLa細胞数が5000の場合の結果である。

図５(a)および図５(b)より、テロメラーゼの基質とならないＤＮＡとして、ｐＢＲ３２２およびＭ１３ＤＮＡのいずれを用いた場合も、HeLa細胞数が0の場合には、テロメラーゼ反応産物は確認されなかった。一方で、HeLa細胞数が5000の場合には、図３(a)のレーン４と同様の結果が得られた。以上の結果は、実施例１で認められたλＤＮＡの効果は、ｐＢＲ３２２およびＭ１３ＤＮＡのいずれにも認められることを示している。

上述したとおり、λＤＮＡは線状の二本鎖ＤＮＡであり、ｐＢＲ３２２は環状の二本鎖ＤＮＡであり、Ｍ１３ＤＮＡは環状の一本鎖ＤＮＡである。したがって、本発明に係るテロメラーゼ活性測定方法において用いられる「テロメラーゼの基質とならないＤＮＡ」は、線状であっても環状であっても構わない。また本発明に係るテロメラーゼ活性測定方法において用いられる「テロメラーゼの基質とならないＤＮＡ」は、一本鎖ＤＮＡであっても二本鎖ＤＮＡであっても構わない。

「テロメラーゼの基質とならないＤＮＡ」は、テロメラーゼＲＮＡの４６番目〜５６番目の塩基配列に対して非相補的な非プライマーＤＮＡであれば足りる。このようなＤＮＡは、テロメラーゼと結合せず、テロメラーゼ反応の起点として機能しないと考えられる。

［実施例５／実施の形態２］
λＤＮＡの代わりにｐＢＲ３２２を使用する以外、すべて実施例２と同様に操作した。その結果、実施例１および２と同様の実験結果が得られた。

［実施例５／実施の形態２］
λＤＮＡの代わりにＭ１３ＤＮＡを使用する以外、すべて実施例２と同様に操作した。その結果、実施例１および２と同様の実験結果が得られた。

以上の結果より、本願第１発明および第２発明に係るテロメラーゼ活性測定方法は、いずれも偽陰性を生じずに、かつ定量的にテロメラーゼ活性を測定し得ることが確認された。

＜テロメラーゼの基質とならないＤＮＡの濃度の影響＞
実施例１においては、混合液Ａ１の調製に32.0μg/mLのλＤＮＡを使用したが、使用するλＤＮＡの濃度を0、1.06、3.20、10.6、32.0、106.0、および320μg/mLの範囲で変更する以外、すべて実施例１と同様の操作を行なった。

図６は、実施例１においてλＤＮＡの濃度を変化させた場合の電気泳動結果を示す。図６のレーン１、２、３、４、５、６および７は、それぞれ混合液Ａ１中に添加したλＤＮＡの濃度が0、1.06、3.20、10.6、32.0、106.0および320μg/mLの場合の結果を示す。したがって、図６のレーン１、２、３、４、５、６、７は、混合液Ａ１中におけるλＤＮＡの濃度（反応時における最終濃度）が、0、0.2756、0.832、2.756、8.32、27.56および83.2μg/mLの場合の結果を示す。溶液Ａ１中のＨｅＬａ細胞数は、いずれの場合も5000個であった。

図６より、混合液Ａ１中のλＤＮＡの濃度が0μg/mLおよび0.2756μg/mLの場合には、長いテロメラーゼ産物が確認されなかった。一方、混合液Ａ１中のλＤＮＡの濃度が0.832μg/mL以上の場合には、長いテロメラーゼ産物が確認された。以上の結果より、テロメラーゼ反応溶液中におけるλＤＮＡの濃度（最終濃度）が0.832μg/mL以上の場合に、偽陰性が生じないことが確認された。

実施例１〜６の結果より、テロメラーゼ反応溶液中に添加されるλＤＮＡ、ｐＢＲ３２２またはＭ１３ＤＮＡの濃度が同程度であれば、同程度のテロメラーゼ反応産物が得られた。したがって、ｐＢＲ３２２やＭ１３ＤＮＡについても、テロメラーゼ反応溶液中に0.832μg/mL以上となるように添加されることで、偽陰性が生じないと考えることが妥当である。

［実施例７］
２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）、４０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３２０μｇ／ｍＬ λＤＮＡおよびＨｅＬａ細胞溶解液を含む反応液（１００μＬ）を３７℃で保温した。次に、保温開始より０、５、１０、３０、６０、および１２００分後に１０μＬ分を取り出し、５００ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ ８．０）溶液１μＬと混合した。これにより反応液中のＤＮＡ分解反応は停止した。最後に、ＥＤＴＡを含む各反応液を電気泳動法により解析した。電気泳動に用いたゲルは１５％のポリアクリルアミドゲルであった。また電気泳動は２０ｍＡで６０分行った。電気泳動後のゲル染色剤として、ＧｅｌＳｔａｒ 核酸ゲル染色（ロンザジャパン株式会社製）が用いられた。染色後のゲルの解析には、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ３５０（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）が用いられた。図７は、実施例７の電気泳動の実験結果を示す写真を表す図である。図８は、保温開始からの時間および分解されていないλＤＮＡバンドの輝度量の関係を表すグラフである。

図７および図８から明らかなように、保温開始からの時間が６０分以内であれば、５％程度のλＤＮＡしか分解されなかったが、保温開始からの時間が２０時間であれば、３０％程度のλＤＮＡが分解された。

実施例７の結果から導出される発明が、以下の項目（ｉ）〜（ｉｖ）に記述される。

（ｉ） テロメラーゼによりプライマーＤＮＡを伸張させる方法であって、以下の方法を具備する：
（ａ） テロメラーゼおよびＤＮａｓｅを含有する溶液を、テロメラーゼの基質とならない非プライマーＤＮＡ（例えば、λＤＮＡ）と混合して、混合液を得る工程、および
ここで、工程（ａ）では、ＤＮａｓｅは、λＤＮＡを分解し始め、
（ｂ） 工程（ａ）の後に、前記ＤＮａｓｅによって前記非プライマーＤＮＡ（例えば、λＤＮＡ）が分解されている間に、テロメラーゼの基質となる前記プライマーＤＮＡ（例えば、ＴＳプライマー）を、前記混合液に添加して、テロメラーゼによりプライマーＤＮＡを伸張させる。

ここで、工程（ｂ）では、ＤＮａｓｅが、非プライマーＤＮＡ（例えば、λＤＮＡ）を分解しているので、ＴＳプライマーを分解するＤＮａｓｅの量は減る。

（ｉｉ） テロメラーゼの活性度を測定する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ） テロメラーゼおよびＤＮａｓｅを含有する溶液を、テロメラーゼの基質とならない非プライマーＤＮＡ（例えば、λＤＮＡ）と混合して、混合液を得る工程、
工程（ａ）では、ＤＮａｓｅは、λＤＮＡを分解し始め、
（ｂ） 工程（ａ）の後に、前記ＤＮａｓｅによって前記非プライマーＤＮＡ（例えば、λＤＮＡ）が分解されている間に、テロメラーゼの基質となる前記プライマーＤＮＡ（例えば、ＴＳプライマー）を、前記混合液に添加して、テロメラーゼによりプライマーＤＮＡを伸張させる工程、
ここで、工程（ｂ）では、ＤＮａｓｅが、非プライマーＤＮＡ（例えば、λＤＮＡ）を分解しているので、ＴＳプライマーを分解するＤＮａｓｅの量は減り、
（ｃ） 工程（ｂ）において伸張されたプライマーＤＮＡの伸張度を元にテロメラーゼの活性を決定する工程。

前記工程（ｃ）は、
（ｃ１）工程（ｂ）において伸張されたプライマーＤＮＡをＰＣＲ法により増幅する工程、
（ｃ２）工程（ｃ１）において増幅されたプライマーＤＮＡを電気泳動に供する工程、
（ｃ３）工程（ｃ２）における電気泳動の結果を元に、テロメラーゼの活性度を決定する工程を含むことが望ましい。

（ｉｉｉ） テロメラーゼによりプライマーＤＮＡを伸張させる方法であって、以下の方法を具備する：
（ａ） テロメラーゼの基質とならない非プライマーＤＮＡ（例えば、λＤＮＡ）、およびテロメラーゼの基質となるプライマーＤＮＡ（例えば、ＴＳプライマー）を含有する混合液を用意する工程、および
ここで、工程（ａ）では反応は生じず、
（ｂ） 前記工程（ａ）の後に、テロメラーゼおよびＤＮａｓｅを含有する溶液を、前記混合液に添加して、前記ＤＮａｓｅが前記非プライマーＤＮＡを分解しながら前記テロメラーゼにより前記プライマーＤＮＡを伸張させる工程。

ここで、非プライマーＤＮＡが用いられない場合と比較して、工程（ｂ）では、プライマーＤＮＡを分解するＤＮａｓｅの量が減る。

（ｉｖ） テロメラーゼの活性度を測定する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ） テロメラーゼの基質とならない非プライマーＤＮＡ（例えば、λＤＮＡ）、およびテロメラーゼの基質となるプライマーＤＮＡ（例えば、ＴＳプライマー）を含有する混合液を用意する工程、
ここで、工程（ａ）では反応は生じず、
（ｂ） 前記工程（ａ）の後に、テロメラーゼおよびＤＮａｓｅを含有する溶液を、前記混合液に添加して、前記ＤＮａｓｅが前記非プライマーＤＮＡを分解しながら前記テロメラーゼにより前記プライマーＤＮＡを伸張させる工程、および
ここで、非プライマーＤＮＡが用いられない場合と比較して、工程（ｂ）では、プライマーＤＮＡを分解するＤＮａｓｅの量が減り、
（ｃ） 工程（ｂ）において伸張された前記プライマーＤＮＡの伸張度を元に前記テロメラーゼの活性を決定する工程。

前記工程（ｃ）は、
（ｃ１） 工程（ｂ）において伸張された前記プライマーＤＮＡをＰＣＲ法により増幅する工程、
（ｃ２） 工程（ｃ１）において増幅された前記プライマーＤＮＡを電気泳動に供する工程、および
（ｃ３） 工程（ｃ２）における電気泳動の結果を元に、前記テロメラーゼの活性度を決定する工程
を含むことが望ましい。

本発明のテロメラーゼ活性測定方法は、精度および定量性が高いテロメラーゼ活性測定方法として、生化学、バイオまたは医学のような技術分野において有用である。

Claims (5)

1. テロメラーゼによりプライマーＤＮＡを伸張させる方法であって、以下の方法を具備する：
   （ａ） テロメラーゼおよびＤＮａｓｅを含むがん細胞溶解液を含有する溶液を、テロメラーゼの基質とならない非プライマーＤＮＡと混合して、混合液を得る工程、および
   （ｂ） 工程（ａ）の後に、前記ＤＮａｓｅによって前記非プライマーＤＮＡが分解されている間に、テロメラーゼの基質となる前記プライマーＤＮＡを前記混合液に添加して、前記テロメラーゼにより前記プライマーＤＮＡを伸張させる工程、
   ここで、
   前記細胞溶解液に含まれる前記がん細胞の数は、５０００個以下であり、
   前記非プライマーＤＮＡの濃度は、０．８３２μｇ／ｍＬ以上である。
2. 請求項１に記載の方法であって、
   前記非プライマーＤＮＡは、λＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはＭ１３ＤＮＡである。
3. テロメラーゼの活性度を測定する方法であって、以下の工程を具備する：
   （ａ） テロメラーゼおよびＤＮａｓｅを含むがん細胞溶解液を含有する溶液を、テロメラーゼの基質とならない非プライマーＤＮＡと混合して、混合液を得る工程、
   （ｂ） 工程（ａ）の後に、前記ＤＮａｓｅによって前記非プライマーＤＮＡが分解されている間に、テロメラーゼの基質となるプライマーＤＮＡを前記混合液に添加して、前記テロメラーゼによりプライマーＤＮＡを伸張させる工程、および
   （ｃ） 工程（ｂ）において伸張された前記プライマーＤＮＡの伸張度を元に前記テロメラーゼの活性を決定する工程、
   ここで、
   前記細胞溶解液に含まれる前記がん細胞の数は、５０００個以下であり、
   前記非プライマーＤＮＡの濃度は、０．８３２μｇ／ｍＬ以上である。
4. 請求項３に記載の方法であって、
   前記工程（ｃ）は、
   （ｃ１） 工程（ｂ）において伸張された前記プライマーＤＮＡをＰＣＲ法により増幅する工程、
   （ｃ２） 工程（ｃ１）において増幅された前記プライマーＤＮＡを電気泳動に供する工程、および
   （ｃ３） 工程（ｃ２）における電気泳動の結果を元に、前記テロメラーゼの活性度を決定する工程
   を含む。
5. 請求項３に記載の方法であって、
   前記非プライマーＤＮＡは、λＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはＭ１３ＤＮＡである。
   

Images