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JP5885765B2 - 延長された可溶性ｐｈ２０ポリペプチドおよびその使用 - Google Patents

延長された可溶性ｐｈ２０ポリペプチドおよびその使用 Download PDF

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Description

関連出願
２００９年１１月１３日に出願された「EXTENDED SOLUBLE PH20 POLYPEPTIDES AND USES THEREOF,」と題されたGe Wei、Krishnasamy Panneerselvam、Louis BookbinderおよびGregory I. Frostの米国仮出願番号第６１／２８１，２４０号、および２００８年１２月９日に出願された「EXTENDED SOLUBLE PH20 POLYPEPTIDES AND USES THEREOF,」と題されたGe Wei、Krishnasamy Panneerselvam、Louis BookbinderおよびGregory I. Frostの米国仮出願番号第６１／２０１，３８４号の優先権の利益を主張する。許されるとき、上記関連出願の主題は、その全体において出典明示により包含させる。
本出願は、米国仮出願番号第６１／２８１，２４０および６１／２０１，３８４号の優先権を主張する「EXTENDED SOLUBLE PH20 POLYPEPTIDES AND USES THEREOF,」と題された、これと同日に出願された米国特許出願番号第１２／６５３，２４５号に関連する。
許されるとき、上記関連出願の主題は、その全体において出典明示により包含させる。
発明の分野
可溶性ＰＨ２０ポリペプチド、例えば、延長された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドおよびそれらの使用を提供する。また、他のＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドおよび部分的に脱グリコシル化されたＰＨ２０ポリペプチドならびにそれらの使用も提供する。
背景
ヒアルロナン（ヒアルロン酸；ＨＡ）は、多数の細胞の細胞外マトリックス、とりわけ軟結合組織において見出されるポリペプチドである。ＨＡは、また、哺乳動物における皮膚、軟骨および滑液において主に見られる。ヒアルロナンは、また、眼の硝子体の主成分である。ＨＡは、種々の生理学的プロセス、例えば、水および血漿タンパク質ホメオスタシス中で役割を有する（Laurent TC et al (1992) FASEB J 6: 2397-2404）。特定の疾患は、ヒアルロナンの発現および／または生産と関連する。ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンを分解する酵素である。ＨＡを触媒することにより、ヒアルロニダーゼは、ＨＡまたは他のグリコサミノグリカンの蓄積と関連する疾患または障害を処置するために使用することができる。また、ＨＡが間質バリアの主成分であるため、ヒアルロニダーゼは組織透過性を増加させ、したがって治療剤の分散および送達を増加させるために使用することができる。種々のヒアルロニダーゼは、一般的に分散剤および展着剤として、他の治療剤と組み合わせて、治療的に使用されている（例えば、ＨｙｄａｓｅＴＭ、ＶｉｔｒａｓｅＴＭおよびＷｙｄａｓｅＴＭ）。これらの多くは、ヒトの処置に対して免疫原性であり得るヒツジまたはウシ形態である。処置のために使用することができるヒアルロニダーゼの改善された組成物が必要である。
要約
本明細書において提供されるものは、可溶性ＰＨ２０ポリペプチド、例えば、延長された可溶性ＰＨ２０（ｅｓＰＨ２０）ポリペプチドおよび組成物である。本明細書において提供されるＰＨ２０ポリペプチドは、Ｃ−末端で短縮されている可溶性タンパク質であり、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列の全てを欠いている（例えば、アミノ酸位置４５０から４９０で短縮されている）ものを含む。可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、また、対応する全長野生型ＰＨ２０ポリペプチドのＧＰＩアンカー結合シグナル配列に位置する１個以上の残基を維持する延長された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドを含む。また、本明細書において提供されるものは、Ｃ−末端切断を含む他の修飾されたＰＨ２０ポリペプチドである。あらゆるポリペプチドの部分的に脱グリコシル化された形態も提供される。また、提供されるものは、本明細書において提供されるＰＨ２０ポリペプチドを使用する処置方法である。
本明細書において提供されるものは、Ｎ−グリコシル化または部分的にＮ−グリコシル化されていてもよい単離され実質的に精製された延長された可溶性ＰＨ２０（ｅｓＰＨ２０）ヒアルロニダーゼである。いくつかの例において、部分的にＮ−グリコシル化されたｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、例えば、配列番号：１０７のアミノ酸残基３６８および３９３、または配列番号：１０７のアミノ酸残基３６８および３９３に対応する残基のような、少なくとも２つのＮ−連結部分のそれぞれに連結した少なくとも１つのＮ−アセチルグルコサミン部分を含む。いくつかの局面において、部分的にＮ−グリコシル化されたｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、少なくとも２つのＮ−連結部分のそれぞれに連結した少なくとも２つのＮ−アセチルグルコサミン部分を含む。本明細書において提供される部分的にＮ−グリコシル化されたｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、また、分岐糖を含むことができる。
本明細書において提供されるものは、配列番号：６０−６３および１０２−１０４のいずれかに記載されているアミノ酸配列を有するｅｓＰＨ２０ポリペプチドまたはそれらの対立遺伝子もしくは種変異体である。また、提供されるものは、配列番号：６０−６３および１０２−１０４のいずれかと少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を有し、対応する修飾されていない形態の、または配列番号：１０７のアミノ酸３６−４８２を有するポリペプチドをコードする核酸によってコードされるポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の少なくとも３０％を維持しているｅｓＰＨ２０ポリペプチド変異体である。このようなｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、可溶性および中性活性を維持する。１つの例において、ｅｓＰＨ２０は、ヒトｅｓＰＨ２０、例えば、配列番号：６０−６３および１０２−１０４のいずれかに記載されているアミノ酸の配列を有するもの、またはチンパンジーｅｓＰＨ２０、例えば、配列番号：１９７のアミノ酸３６−４９１、３６−４９２、３６−４９３、３６−４９４、３６−４９５、３６−４９６、３６−４９７または３６−４９８として記載されているアミノ酸配列を有するものである。
また、本明細書において提供されるものは、実質的に精製されたＰＨ２０ポリペプチドである。これらのＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号：５５−６３および６４−９５のいずれかに記載されているアミノ酸配列またはそれらの対立遺伝子もしくは種変異体を有し得る。他の例において、ＰＨ２０ポリペプチドは、対応する修飾されていない形態の、または配列番号：１０７のアミノ酸３６−４８２を有するポリペプチドをコードする核酸によってコードされるポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の少なくとも３０％を維持している、配列番号：５５−６３および６４−９５のいずれかと少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する変異体である。このようなＰＨ２０ポリペプチドは中性活性である。
本明細書において提供されるＰＨ２０ポリペプチドは、Ｎ−グリコシル化または部分的にＮ−グリコシル化され得る。いくつかの例において、部分的にＮ−グリコシル化されたｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、例えば、配列番号：１０７のアミノ酸残基３６８および３９３、または配列番号：１０７のアミノ酸残基３６８および３９３に対応する残基のような、少なくとも２つのＮ−連結部分のそれぞれに連結した少なくとも１つのＮ−アセチルグルコサミン部分を含む。いくつかの局面において、部分的にＮ−グリコシル化されたＰＨ２０ポリペプチドは、少なくとも２つのＮ−連結部分のそれぞれに連結した少なくとも２つのＮ−アセチルグルコサミン部分を含む。本明細書において提供される部分的にＮ−グリコシル化されているＰＨ２０ポリペプチドは、また、分岐糖を含むことができる。いくつかの局面において、本明細書において提供されるＰＨ２０ポリペプチドは可溶性であり、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、カニクイザル、マウス、ウサギ、モルモット、ウシまたはヒツジＰＨ２０から選択することができる。
本明細書において提供されるｅｓＰＨ２０およびＰＨ２０ポリペプチドは、例えば、シアル化、アルブミン化、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化またはリン酸化により修飾され得る。いくつかの局面において、ｅｓＰＨ２０およびＰＨ２０ポリペプチドは、ポリマー、例えば、デキストランまたはＰＥＧにより修飾される。また、本明細書において提供されるものは、ｅｓＰＨ２０またはＰＨ２０ポリペプチドを含む複合体である。典型的な複合体は、ｅｓＰＨ２０またはＰＨ２０が多重体化ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）、毒素、検出可能な標識または薬物と複合体化しているものを含む。
本明細書において提供されるものは、上記の、および本明細書において提供されるｅｓＰＨ２０およびＰＨ２０ポリペプチドをコードする核酸である。これらの核酸は、配列番号：１０７のアミノ酸３６−４５０、３６−４５１、３６−４５２、３６−４５３、３６−４５４、３６−４５５、３６−４５６、３６−４５７、３６−４５８、３６−４５９、３６−４６０、３６−４６１、３６−４６２、３６−４６３、３６−４６４、３６−４６５、３６−４８４、３６−４８５、３６−４８６、３６−４８７、３６−４８９、３６−４９１、３６−４９２、３６−４９３、３６−４９４、３６−４９５、３６−４９６または３６−４９７に対応するアミノ酸を有するｅｓＰＨ２０またはＰＨ２０ポリペプチドをコードするもの、および配列番号：１９７のアミノ酸３６−４９１、３６−４９２、３６−４９３、３６−４９４、３６−４９５、３６−４９６、３６−４９７または３６−４９８に対応するアミノ酸を有するｅｓＰＨ２０をコードするものを含む。また、本明細書において提供されるものは、これらの核酸を含むベクターおよび該ベクターを含む細胞、例えば、ＣＨＯ細胞である。
本明細書において提供されるものは、本明細書に記載されている任意の１つ以上のｅｓＰＨ２０またはＰＨ２０ポリペプチドを含む組成物である。いくつかの例において、組成物は、複数のｅｓＰＨ２０またはＰＨ２０ポリペプチドを含む。例えば、組成物は、配列番号：１０７のアミノ酸３６−４５０、３６−４５１、３６−４５２、３６−４５３、３６−４５４、３６−４５５、３６−４５６、３６−４５７、３６−４５８、３６−４５９、３６−４６０、３６−４６１、３６−４６２、３６−４６３、３６−４６４、３６−４６５、３６−４８４、３６−４８５、３６−４８６、３６−４８７、３６−４８９、３６−４９１、３６−４９２、３６−４９３、３６−４９４、３６−４９５、３６−４９６または３６−４９７に対応するアミノ酸をコードする核酸分子によってコードされる複数のｅｓＰＨ２０ポリペプチド、および配列番号：１９７のアミノ酸３６−４９１、３６−４９２、３６−４９３、３６−４９４、３６−４９５、３６−４９６、３６−４９７または３６−４９８に対応するアミノ酸を有するｅｓＰＨ２０をコードするものを含むことができる。いくつかの例において、組成物は、ＣＨＯ細胞から分泌されるｅｓＰＨ２０またはＰＨ２０ポリペプチドを含む。
本明細書において提供される組成物は医薬組成物であり得る。いくつかの例において、組成物は、組成物と共に、または別々の組成物において製剤化することができる、さらなる治療剤を含む。本明細書において提供される組成物に含むことができる典型的な治療剤は、化学療法剤、鎮痛剤、抗炎症剤、抗菌剤、殺アメーバ剤、殺トリコモナス剤(trichomonocidal agent)、抗パーキンソン病薬、抗マラリア薬、鎮痙剤、抗抑制薬、抗関節炎剤、抗真菌剤、抗高血圧剤、解熱剤、抗寄生虫薬、抗ヒスタミン剤、アルファアドレナリン作動性アゴニスト剤、アルファ遮断薬、麻酔薬、気管支拡張剤、殺生物剤、殺菌剤、静菌剤、ベータアドレナリン遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、心血管作動薬、避妊薬、充血除去剤、利尿薬、抑制薬、診断薬、電解質物質、催眠剤、ホルモン剤、血糖上昇剤、筋弛緩剤、筋肉収縮剤、眼科用剤、副交感神経作用薬、精神賦活剤、鎮静剤、交感神経様作用薬、精神安定剤、尿路剤、膣剤、殺ウイルス剤、ビタミン剤、非ステロイド系抗炎症剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、ポリペプチド、タンパク質、核酸、薬物、有機分子および睡眠導入剤である。特定の例において、治療剤は、抗体、免疫グロブリン、ビスホスホネート（例えば、ゾレドロン酸(zolentronic acid)）、サイトカイン、化学療法剤またはインスリン（例えば、即効性インスリン）である。
本明細書において提供される組成物に含むことができる他の治療剤は、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン（９−シス−レチノイン酸）、アロプリノール、アルトレタミン、アルボシジブ、アンバゾン、アンボマイシン、アメタントロン、アミホスチン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アナキシロン、アンシタビン、アントラマイシン、アパジコン、アルギメスナ、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アトリムスチン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バノキサントロン、バタブリン、バチマスタット、ＢＣＧ Ｌｉｖｅ、ベナキシビン、ベンダムスチン、ベンゾデパ、ベキサロテン、ベバシズマブ、ビカルタミド、ビエタセルピン、ビリコダル、ビサントレン、ビサントレン、ビスナフィドジメシレート、ビゼレシン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブレキナル、ブロピリミン、ブドチタン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カネルチニブ、カペシタビン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルボコン、カルモフール、ポリフェプロザンを伴うカルムスチン、カルムスチン、カルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴール、セレコキシブ、セマドチン、クロラムブシル、シオテロネル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、クランフェヌル、クロファラビン、クリスナトール、シクロホスファミド、リポゾーマルシタラビン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダルベポエチンアルファ、リポゾーマルダウノルビシン、ダウノルビシン／ダウノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、デニロイキンジフチトクス、デクスニグルジピン、デキソナプラチン、デクスラゾキサン、デザグアニン、ジアジコン、ジブロスピジウム、ジエノゲスト、ジナリン、ジセルモリド、ドセタキセル、ドフェキダル、ドキシフルリジン、リポゾーマルドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣＬ、ドコルビシンＨＣＬリポソーム注射剤、ドキソルビシン、ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エコムスチン、エダトレキサート、エドテカリン、エフロールニチン、エラクリダル、エリナフィド、エリオットＢ溶液、エルサミトルシン、エミテフル、エンロプラチン、エンプロメート、エンザスタウリン、エピプロピジン、エピルビシン、エポエチンアルファ、エプタロプロスト、エルブロゾール、エソルビシン、エストラムスチン、エタニダゾール、エトグルシド、リン酸エトポシド、エトポシドＶＰ−１６、エトポシド、エトプリン、エキセメスタン、エクシスリンド、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルロシタビン、ホスキドン、ホストリエシン、ホストリエシン、ホトレタミン、フルベストラント、ガラルビシン、ガロシタビン、ゲムシタビン、ゲムツズマブ／オゾガマイシン、ゲロキノール、ギマテカン、ギメラシル、グロキサゾン、グルホスファミド、酢酸ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ／チウキセタン、イダルビシン、イホスファミド、イルモホシン、イロマスタット、メシル酸イマチニブ、イメキソン、インプロスルファン、インジスラム、インプロコン、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロン、インターロイキン−２ｓおよび他のインターロイキン（組換えインターロイキンを含む）、イントプリシン、ヨーベングアン［１３１−Ｉ］、イプロプラチン、イリノテカン、イルソグラジン、イクサベピロン、ケトトレキサート、Ｌ−アラノシン、ランレオチド、ラパチニブ、レドキサントロン、レトロゾール、ロイコボリン、リュープロリド、リュープロレリン（リュープロレリド）、レバミソール、レキサカルシトール、リアロゾール、ロバプラチン、ロメトレキソール、ロムスチン／ＣＣＮＵ、ロムスチン、ロナファルニブ、ロソキサントロン、ルルトテカン、マホスファミド、マンノスルファン、マリマスタット、マソプロコール、メイタンシン、メクロレタミン、メクロレタミン／ナイトロジェンマスタード、酢酸メゲストロール、メゲストロール、メレンゲストロール、メルファラン、メルファランｌＬ−ＰＡＭ、メノガリル、メピチオスタン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メスナ、メテシンド、メトトレキサート、メトキサレン、メトミダート、メトプリン、メツレデパ、ミボプラチン、ミプロキシフェン、ミソニダゾール、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトフラキソン、ミトギリン、ミトグアゾン、ミトマルシン、マイトマイシンＣ、マイトマイシン、ミトナフィド、ミトキドン、ミトスペル、ミトタン、ミトキサントロン、ミトゾロミド、ミボブリン、ミゾルビン、モファロテン、モピダモール、ムブリチニブ、ミコフェノール酸、フェンプロピオン酸ナンドロロン、ネダプラチン、ネルザラビン、ネモルビシン、ニトラクリン、ノコダゾール、ノフェツモバブ、ノガラマイシン、ノラトレキセド、ノルトピキサントロン、オクトレオチド、オプレルベキン、オルマプラチン、オルタタキセル、オテラシル、オキサリプラチン、オキシスラン、オキソフェナルシン、パクリタキセル、パミドロネート、パツビロン、ペガデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペルデシン、ペリオマイシン、ペリトレキソール、ペメトレキセド、ペンタムスチン、ペントスタチン、ペプロマイシン、ペルホスファミド、ペリホシン、ピコプラチン、ピナフィド、ピポブロマン、ピポスルファン、ピルフェニドン、ピロキサントロン、ピキサントロン、プレビトレキセド、プリカミシドミトラマイシン、プリカマイシン、プロメスタン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィマー、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロカルバジン、プロパミジン、プロスピジウム、プミテパ、ピューロマイシン、ピラゾフリン、キナクリン、ラニムスチン、ラスブリカーゼ、リボプリン、リトロスルファン、リツキシマブ、ログレチミド、ロキニメックス、ルホクロモマイシン、サバルビシン、サフィンゴール、サルグラモスチム、サトラプラチン、セブリプラチン、セムスチン、シムトラゼン、シゾフィラン、ソブゾキサン、ソラフェニブ、スパルホサート、スパルホス酸、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、スピロプラチン、スクアラミン、ストレプトニグリン、ストレプトバリシン、ストレプトゾシン、スホスファミド、スロフェヌル、リンゴ酸スニチニブ、６−ＴＧ、タセジナリン、タルク、タリソマイシン、タリムスチン、タモキシフェン、タリキダール、タウロムスチン、テコガラン、テガフール、テロキサントロン、テモポルフィン、テモゾロマイド、テニポシド／ＶＭ−２６、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアミプリン、チアゾフリン、チロミソール、チロロン、チムコダル、チモナシック、チラパザミン、トピキサントロン、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラベクテジン（エクチナサイジン７４３）、トラスツマブ、トレストロン、トレチノイン／ＡＴＲＡ、トリシリビン、トリロスタン、トリメトレキセート、四硝酸トリプラチン、トリプトレリン、トロホスファミド、ツブロゾール、ウベニメクス、ウラシルマスタード、ウレデパ、バルルビシン、バルスポダル、バプレオチド、ベルテポルフィン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビネピジン、ビンフルニン、ビンホルミド、ビングリシネート、ビンロイシノール、ビンロイロシン、ビノレルビン、ビンロシジン、ビントリプトール、ビンゾリジン、ボロゾール、キサントマイシンＡ（グアメシクリン）、ゼニプラチン、ジラスコルブ［２−Ｈ］、ジノスタチン、ゾレドロネート、ゾルビシンおよびゾスキダルを含むが、これらに限定されない。
本明細書において提供されるものは、ヒアルロナン関連疾患または状態を処置するための方法であって、対象が本明細書に提供されている、および記載されているｅｓＰＨ２０もしくはＰＨ２０、またはｅｓＰＨ２０もしくはＰＨ２０を含む組成物を投与される方法である。また、提供されるものは、グリコサミノグリカン過剰を処置するための；腫瘍を処置するための；脳におけるグリコサミノグリカン蓄積を処置するための；心疾患を処置するための；眼科疾患を処置するための；肺疾患を処置するための；固形腫瘍への化学療法剤の浸透を増加させるための；セルライトを処置するための；または薬剤および他の治療剤のバイオアベイラビリティを増加させるための方法である。このような方法は、本明細書に記載されているｅｓＰＨ２０またはＰＨ２０ポリペプチドまたは組成物のいずれかを対象に投与することを含む。
本明細書において提供されるｅｓＰＨ２０およびＰＨ２０ポリペプチドは、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼが米国公開番号第ＵＳ２００４０２６８４２５、ＵＳ２００５０２６０１８６およびＵＳ２００６０１０４９６８号；ならびに米国出願第１２／３８１，８４４、１２／３８６，２４９、１２／３８７，２２５および１２／３８６，２２２号において使用される任意の処置方法または併用療法において、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼの代わりに、単独または組み合わせて使用することができる。
図１は、ヒト（配列番号：１０７）およびチンパンジー（配列番号：１９７）ＰＨ２０ポリペプチドのアミノ酸配列のアラインメントを示す（ＣｌｕｓｔａｌＷ２アラインメントプログラムを使用して行った）。ヒトＰＨ２０ ＧＰＩアンカー結合シグナル配列のアミノ酸残基およびチンパンジーＰＨ２０配列における対応するアミノ酸は、太字で下線が引かれている。「＊」は、上記残基がアラインメントにおいて両方の配列が同一であることを示す。「：」は保存された置換を示し、「．」は半保存された置換を示す。 図２は、高マンノースグリカン、ハイブリッドグリカンおよび複合型グリカンを含む脊椎動物におけるＮ−グリカンの主な型を示す。 図３は、エンドグリコシダーゼ開裂部位を示す。図３Ａは、エンドグリコシダーゼＦ１およびペプチドＮグリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）に対する開裂部位を説明する。 図３は、エンドグリコシダーゼ開裂部位を示す。図３Ｂは、エンドグリコシダーゼＦ２およびＰＮＧａｓｅＦに対する開裂部位を説明する。 図３は、エンドグリコシダーゼ開裂部位を示す。図３Ｃは、エンドグリコシダーゼＦ３およびＰＮＧａｓｅＦに対する開裂部位を説明する。 図３は、エンドグリコシダーゼ開裂部位を示す。図３Ｄは、エンドグリコシダーゼＦ４およびＰＮＧａｓｅＦに対する開裂部位を説明する。
詳細な説明
概観
Ａ．定義
Ｂ．概観
１．ＰＨ２０
ａ．グリコシル化
ｂ．ＧＰＩ固定
Ｃ．延長された可溶性ＰＨ２０ポリペプチド
１．ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチド
２．他の種のｅｓＰＨ２０ポリペプチド
Ｄ．部分的にＮ−グリコシル化されたＰＨ２０ポリペプチド
１．ＰＨ２０ポリペプチド
２．Ｃ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチド
３．さらなる修飾
ポリマーへの結合
Ｅ．延長された可溶性ＰＨ２０および他の可溶性ＰＨ２０ヒアルロニダーゼならびにそれらのポリペプチドをコードする核酸を生産する方法
１．ベクターおよび細胞
２．発現
ａ．原核細胞
ｂ．酵母細胞
ｃ．昆虫細胞
ｄ．哺乳動物細胞
ｅ．植物
３．精製技術
Ｆ．延長された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドおよび他の可溶性ＰＨ２０ポリペプチドの製造、製剤化および投与
１．注射可能物質、溶液およびエマルジョン
凍結乾燥粉末
２．局所投与
３．他の投与経路のための組成物
４．用量および投与
５．パッケージング、製品およびキット
Ｇ．アッセイ
１．ヒアルロニダーゼ活性
２．溶解度
Ｈ．延長された可溶性ＰＨ２０および他の可溶性ＰＨ２０の処置方法および使用ならびに併用療法
１．展着剤および併用療法としての使用
２．過剰のグリコサミノグリカナーゼを除去するための使用
ａ．癌の処置における使用
ｂ．脳におけるグリコサミノグリカン蓄積の処置における使用
ｃ．心臓血管疾患におけるグリコサミノグリカン蓄積の処置における使用
ｄ．硝子体切除および眼科疾患および状態における使用
ｅ．皮下注入における使用
ｆ．遺伝子治療における使用
ｇ．化粧用途
ｈ．臓器移植における使用
ｉ．肺疾患における使用
３．他の使用
Ｉ．実施例
Ａ．定義
特に定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書における全開示内容を通じて言及される、すべての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、データベース、ウェブサイトおよび他の公開された資料は、他に記載のない限り、それらの全体を出典明示により包含させる。本明細書における用語に対して複数の定義が存在する場合、このセクションにおけるものが優先される。ＵＲＬまたは他のこのような識別子もしくはアドレスが言及されるとき、このような識別子が変化し得、インターネット上の特定の情報が移り変わり得るが、同等の情報がインターネットを検索することにより見出すことができることが理解される。それらへの言及は、このような情報の有効性および公的普及を証明する。
本明細書において使用されるヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンを分解する酵素の１クラスを示す。ヒアルロニダーゼは、細菌ヒアルロニダーゼ（ＥＣ４．２．２．１またはＥＣ４．２．９９．１）、ヒル、他の寄生生物および甲殻類に由来するヒアルロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３６）ならびに哺乳動物型ヒアルロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３５）を含むが、これらに限定されない。ヒアルロニダーゼは、あらゆる非ヒト起源のもの、例えば、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、鳥類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、魚類、カエル、細菌、および、ヒル、他の寄生生物および甲殻類を含むが、これらに限定されない。典型的なヒトヒアルロニダーゼは、ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２、ＨＹＡＬ３、ＨＹＡＬ４およびＰＨ２０（配列番号：１０７）を含む。また、ヒアルロニダーゼの中に含まれるものは、可溶性ヒアルロニダーゼ、例えば、ヒツジおよびウシＰＨ２０、可溶性ヒトＰＨ２０およびｒＨｕＰＨ２０である。市販されているウシまたはヒツジの可溶性ヒアルロニダーゼの例は、Ｖｉｔｒａｓｅ（登録商標）ヒアルロニダーゼ（ヒツジヒアルロニダーゼ）およびＡｍｐｈａｄａｓｅ（登録商標）ヒアルロニダーゼ（ウシヒアルロニダーゼ）である。
本明細書において使用されるＰＨ２０は、精子中で生じ、中性活性であるヒアルロニダーゼの１つの型を示す。ＰＨ２０は、精子表面上に、およびリソソーム由来先体中に位置し、ここで、先体内膜と結合している。ＰＨ２０は、あらゆる起源のもの、ヒト、チンパンジー、カニクイザル、アカゲザル、マウス、ウシ、ヒツジ、モルモット、ウサギおよびラット起源のものを含むが、これらに限定されない。典型的なＰＨ２０ポリペプチドは、ヒト（配列番号：１０７）、チンパンジー（配列番号：１９７）、アカゲザル（配列番号：１９８）、カニクイザル（配列番号：１１４）、ウシ（例えば、配列番号：１１１および１１９）；マウス（配列番号：１１７）；ラット（配列番号：１１６）；ウサギ（配列番号：１１２）；ヒツジ（配列番号：１１３、１１８および１２０）およびモルモット（配列番号：１１５）由来のものを含む。ＰＨ２０への言及は、前駆体ＰＨ２０ポリペプチドおよび成熟体ＰＨ２０ポリペプチド（例えば、シグナル配列が除去されているもの）、活性を有するそれらの短縮された形態を含み、対立遺伝子変異体および種変異体、スプライス変異体によってコードされる変異体および他の変異体、例えば、配列番号：１０７および１０９に記載されている前駆体ポリペプチドまたはそれらの成熟形態と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ＰＨ２０ポリペプチドは、また、化学または翻訳後修飾を含むものおよび化学または翻訳後修飾を含まないものを含む。このような修飾は、ペグ化、アルブミン化、グリコシル化、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化および当該分野で知られている他のポリペプチド修飾を含むが、これらに限定されない。短縮されたＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、それらのＣ−末端を短縮されたあらゆる形態、特にＮ−グリコシル化のとき短縮され、中性活性である形態である。
本明細書において使用される可溶性ＰＨ２０は、生理学的条件下で可溶性であるＰＨ２０のあらゆる形態を示す。可溶性ＰＨ２０は、例えば、３７℃でＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４溶液の水相への分配により同定することができる（Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7)。膜に固定されたＰＨ２０、例えば、脂質に固定されたＰＨ２０、例えば、ＧＰＩに固定されたＰＨ２０は、界面活性剤リッチな相に分配するが、ホスホリパーゼＣで処理後は、界面活性剤の乏しい相または水相に分配する。可溶性ＰＨ２０の中に含まれるものは、ＰＨ２０の膜との固定と関連する１つまたはそれ以上の領域が除去または修飾されており、可溶性形態がヒアルロニダーゼ活性を維持している、膜に固定されたＰＨ２０である。可溶性ＰＨ２０は、また、組換え可溶性ＰＨ２０および、例えば、ヒツジまたはウシに由来する精巣抽出物のような天然供給源に含まれるもの、または該供給源中から精製されたものを含む。典型的なこのような可溶性ＰＨ２０は、可溶性ヒトＰＨ２０である。
本明細書において使用される可溶性ヒトＰＨ２０またはｓＨｕＰＨ２０は、発現時に生理学的条件下で可溶性であるように、Ｃ−末端のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー配列のすべてまたは一部を欠いているＰＨ２０ポリペプチドを含む。溶解度は、生理学的条件下での溶解度を証明する任意の適当な方法により評価することができる。典型的なこのような方法は、上記の、および実施例に記載されている水相への分配を評価するＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４アッセイである。加えて、可溶性ヒトＰＨ２０ポリペプチドは、ＣＨＯ細胞、例えば、ＣＨＯ−Ｓ細胞において生産されるとき、発現され、細胞培養培地に分泌されるポリペプチドである。しかしながら、可溶性ヒトＰＨ２０ポリペプチドは、ＣＨＯ細胞において生産されるものに限定されず、任意の細胞において、または組換え発現およびポリペプチド合成を含む任意の方法により生産することができる。ＣＨＯ細胞における分泌への言及において定義される。したがって、ポリペプチドがＣＨＯ細胞において発現され、分泌され、そして可溶性である、すなわち、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４で抽出されるとき水相に分配されるとき、それは、実際そのように生産されるか否かにかかわらず可溶性ＰＨ２０ポリペプチドである。ｓＨｕＰＨ２０ポリペプチドに対する前駆体ポリペプチドは、シグナル配列、例えば、異種または非異種（すなわち天然）シグナル配列を含むことができる。典型的な前駆体は、シグナル配列、例えば、アミノ酸位置１−３５の天然の３５個のアミノ酸シグナル配列（例えば、配列番号：１０７のアミノ酸１−３５参照）を含むものである。
本明細書において使用される「延長された可溶性ＰＨ２０」または「ｅｓＰＨ２０」は、ｅｓＰＨ２０が生理学的条件下で可溶性であるように、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列までの残基およびＧＰＩアンカー結合シグナル配列から１個以上の隣接する残基を含む可溶性ＰＨ２０ポリペプチドを含む。生理学的条件下での溶解度は、当業者に知られている任意の方法により測定することができる。例えば、それは、上記の、および実施例のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４アッセイにより評価することができる。加えて、上記のとおり、可溶性ＰＨ２０は、ＣＨＯ細胞、例えば、ＣＨＯ−Ｓ細胞において生産されるとき、発現され、細胞培養培地に分泌されるポリペプチドである。しかしながら、可溶性ヒトＰＨ２０ポリペプチドは、ＣＨＯ細胞において生産されるものに限定されず、任意の細胞において、または組換え発現およびポリペプチド合成を含む任意の方法により生産することができる。ＣＨＯ細胞における分泌への言及において定義される。したがって、ポリペプチドがＣＨＯ細胞において発現され、分泌され、そして可溶性である、すなわち、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４で抽出されるとき水相に分配されるとき、それは、そのように生産されるか否かにかかわらず可溶性ＰＨ２０ポリペプチドである。ヒト可溶性ｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、得られるポリペプチドが可溶性であるように、残基３６−４９０に加えて、配列番号：１０７のアミノ酸残基位置４９１（含む）から１個以上の隣接するアミノ酸を含む。典型的なヒトｅｓＰＨ２０可溶性ポリペプチドは、配列番号：１０７のアミノ酸３６−４９１、３６−４９２、３６−４９３、３６−４９４、３６−４９５、３６−４９６および３６−４９７に対応するアミノ酸残基を有するものである。典型的なこれらのものは、配列番号：６０−６３および１０２−１０４のいずれかに記載されているアミノ酸配列を有するものである。また、含まれるものは、天然の活性を維持し、可溶性である、対立遺伝子変異体および他の変異体、例えば、配列番号：６０−６３および１０２−１０４の対応するポリペプチドと４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するあらゆるものである。配列同一性への言及は、アミノ酸置換を有する変異体を示す。
本明細書において使用されるｅｓＰＨ２０への言及は、前駆体ｅｓＰＨ２０ポリペプチドおよび成熟体ｅｓＰＨ２０ポリペプチド（例えば、シグナル配列が除去されているもの）、酵素活性を有し、可溶性であるそれらの短縮された形態（全長形態の少なくとも１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上を維持している）を含み、対立遺伝子変異体および種変異体、スプライス変異体によってコードされる変異体、および他の変異体、例えば、配列番号：１０７および１０９に記載されている前駆体ポリペプチドまたはそれらの成熟形態と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
本明細書において使用されるｅｓＰＨ２０への言及は、また、化学または翻訳後修飾を含むもの、および化学または翻訳後修飾を含まないものを含む。このような修飾は、ペグ化、アルブミン化、グリコシル化、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、および当該分野で知られている他のポリペプチド修飾を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される可溶性組換えヒトＰＨ２０（ｒＨｕＰＨ２０）は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において組換え的に発現され、分泌されるヒトＰＨ２０の可溶性形態を示す。可溶性ｒＨｕＰＨ２０は、シグナル配列を含む核酸によってコードされ、配列番号：１０９に記載されている。また、含まれるものは、その対立遺伝子変異体および他の可溶性変異体であるＤＮＡ分子である。可溶性ｒＨｕＰＨ２０をコードする核酸は、成熟体ポリペプチドを分泌するＣＨＯ細胞において発現される。培養培地で生産されるとき、生成物が種々の量で配列番号：１２２から配列番号：１２７のうち１種以上を含み得る種の混合物を含むようにＣ末端で不均一性である。
同様に、ＰＨ２０の他の形態、例えば、ｅｓＰＨ２０について、組換え的に発現されるポリペプチドおよびそれらの組成物は、Ｃ−末端が不均一性を示す複数の種を含むことができる。例えば、アミノ酸３６−４９７を有するｅｓＰＨ２０をコードする、配列番号：８のポリペプチドの発現により生産される組換え的に発現されるｅｓＰＨ２０の組成物は、より少ないアミノ酸、例えば、３６−４９６、３６−４９５を有する形態を含むことができる。
本明細書において使用されるＮ−連結部分は、ポリペプチドの翻訳後修飾によりグリコシル化される可能性があるポリペプチドのアスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基を示す。典型的なヒトＰＨ２０のＮ−連結部分は、配列番号：１０７に記載されているヒトＰＨ２０のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３を含む。
本明細書において使用されるＮ−グリコシル化されたポリペプチドは、少なくとも３つのＮ−連結アミノ酸残基、例えば、配列番号：１０７のアミノ酸残基Ｎ２３５、Ｎ３６８およびＮ３９３に対応するＮ−連結部分のオリゴ糖連結を含むＰＨ２０ポリペプチドまたはその短縮された形態を示す。Ｎ−グリコシル化されたポリペプチドは、３、４、５およびすべてのＮ−連結部分がオリゴ糖に連結しているポリペプチドを含むことができる。Ｎ−連結オリゴ糖は、オリゴマンノース、複合型、ハイブリッドまたは硫酸化オリゴ糖、または他のオリゴ糖および単糖類を含むことができる。
本明細書において使用される部分的にＮ−グリコシル化されたポリペプチドは、少なくとも３つのＮ−連結部分に連結したＮ−アセチルグルコサミングリカンを最小限含むポリペプチドを示す。部分的にグリコシル化されたポリペプチドは、種々のグリカン形態、例えば、単糖類、オリゴ糖および分岐糖形態、例えば、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２および／またはＥｎｄｏＦ３でのポリペプチドの処理により形成されるものを含むことができる。このような酵素によるグリカンの開裂は、例えば、図２に記載されている。
本明細書において使用される脱グリコシル化されたＰＨ２０ポリペプチドは、すべてよりも少ない可能なグリコシル化部位がグリコシル化されている、本明細書において提供されるＰＨ２０ポリペプチドを示す。脱グリコシル化は、例えば、グリコシル化を除去することにより、それを防止することにより、またはグリコシル化部位を除去するようにポリペプチドを修飾することによりもたらすことができる。本明細書において示されているように、特定のＮ−グリコシル化部位は活性のために必要ではないが、必要なものもある。
本明細書において使用されるヒアルロナン関連疾患、障害または状態は、ヒアルロナンレベルが、疾患または状態における原因、結果または観察されるその他のことで上昇するあらゆる疾患または状態を示す。ヒアルロナン関連疾患および状態は、組織または細胞におけるヒアルロナン発現の上昇、間質液圧の増加、血管容量の減少、および／または組織における水分含有量の増加と関連する。ヒアルロナン関連疾患、障害または状態は、ヒアルロナン分解酵素、例えば、ヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ヒアルロニダーゼを含む組成物を単独または別の処置および／または薬物と組み合わせての、もしくは加えての投与により処置することができる。典型的な疾患および状態は、限定はしないが、ヒアルロナンリッチな癌、例えば、腫瘍、例えば、固形腫瘍、例えば、末期癌、転移性癌、未分化癌、卵巣癌、ｉｎ ｓｉｔｕ癌腫（ＩＳＣ）、扁平上皮癌腫（ＳＣＣ）、前立腺癌、膵臓癌、非小細胞性肺癌、乳癌、大腸癌および他の癌を含む。また、典型的なヒアルロナン関連疾患および状態は、間質液圧の上昇と関連する疾患、例えば、椎間板圧迫と関連する疾患、および浮腫、例えば、臓器移植、卒中、脳外傷または他の損傷により引き起こされる浮腫である。典型的なヒアルロナン関連疾患および状態は、間質液圧の上昇、血管容量の減少、および／または組織における水分含有量の増加と関連する疾患および状態、例えば、癌、椎間板圧迫および浮腫を含む。１つの例において、ヒアルロナン関連状態、疾患または障害の処置は、１つ以上の間質液圧（ＩＦＰ）の増加、血管容量の減少および組織における水分含有量の増加における改善、減少または他の有益な効果を含む。
本明細書において使用される複合体は、１つ以上の他のポリペプチドまたは化学部分と直接的または間接的に連結している可溶性ＰＨ２０ポリペプチドを示す。このような複合体は、融合タンパク質、化学複合体により生産されるもの、および任意の他の方法により生産されるもの（少なくとも１つの可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、複合体がヒアルロニダーゼ活性を維持する限り、別のポリペプチドまたは化学部分と直接的または間接的に連結している）を含む。典型的な本明細書において提供される複合体は、多重体化ドメイン、例えば、Ｆｃ部分、毒素、標識または薬物(drug)と直接的または間接的に連結しているＰＨ２０ポリペプチドを含む。
本明細書において使用される融合タンパク質は、一方の核酸分子由来のコード配列およびもう一方の核酸分子由来のコード配列を含む核酸配列によってコードされるポリペプチドを示す（融合構築物が宿主細胞において転写され、翻訳されるとき、タンパク質が２つのタンパク質を含むように生産されるようにコード配列は同じリーディングフレームにある）。２つの分子は、構築物中で近接していてもよく、また１、２、３個またはそれ以上であるが、一般的に１０、９、８、７または６個より少ないアミノ酸を含むリンカーポリペプチドにより分離されていてもよい。融合構築物によってコードされるタンパク質産物は、融合ポリペプチドとして示される。典型的な融合ポリペプチドは、Ｆｃ融合を含む。
本明細書において使用されるヒアルロナン分解酵素、例えば、ヒアルロニダーゼと複合体化しているポリマーは、ヒアルロナン分解酵素に直接的にまたはリンカーを介して共有結合されているか、または別の方法で安定に連結されているあらゆるポリマーを示す。このようなポリマーは、一般的に、血清半減期を増大し、シアル部分、ペグ化部分、デキストラン、ならびに、例えば、グリコシル化のための糖および他の部分を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される活性は、全長（完全）タンパク質と関連するポリペプチドまたはその一部の機能活性を示す。機能活性は、生物学的活性、触媒または酵素活性、抗原性（抗ポリペプチド抗体への結合に対するポリペプチドと結合または競合する能力）、免疫原性、多量体を形成する能力およびポリペプチドに対する受容体またはリガンドに特異的に結合する能力を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用されるヒアルロニダーゼ活性は、ヒアルロン酸の開裂を酵素的に触媒する能力を示す。ヒアルロニダーゼに対する米国薬局方（ＵＳＰ）ＸＸＩＩアッセイは、高分子量ヒアルロン酸またはヒアルロナン（ＨＡ）と３７℃で３０分間反応させた後に残存するＨＡ基質の量を測定することにより間接的にヒアルロニダーゼ活性を測定する（USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD）。参照標準溶液は、任意のヒアルロニダーゼの単位における相対活性を確認するためのアッセイにおいて使用することができる。ヒアルロニダーゼ、例えば、ＰＨ２０、例えば、可溶性ＰＨ２０およびｅｓＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性を測定するためのインビトロアッセイは、当該分野で知られており、本明細書に記載されている。典型的なアッセイは、開裂されていないヒアルロン酸が血清アルブミンと結合するときに形成される不溶性沈殿を検出することにより、間接的にヒアルロニダーゼによるヒアルロン酸の開裂を測定する、以下に記載されているマイクロ濁度(microturbidity)アッセイ（例えば、実施例１２参照）を含む。参照標準は、試験されるヒアルロニダーゼの単位における活性を決定するために、例えば、標準曲線を作成するために、使用することができる。
本明細書において使用される中性活性は、ＰＨ２０ポリペプチドが中性ｐＨでヒアルロン酸の開裂を酵素的に触媒する能力を示す。本明細書において提供される中性活性であるＣ−末端で短縮されている、または部分的にＮ−グリコシル化されているＰＨ２０は、Ｃ−末端で短縮されていないか、または部分的にＮ−グリコシル化されていない対応する中性活性であるＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性と比較して、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％またはそれ以上の活性を有する。
本明細書において使用されるＧＰＩアンカー結合シグナル配列は、ＥＲの内腔内でポリペプチドにあらかじめ形成されたＧＰＩアンカーの付加を指向するＣ−末端アミノ酸配列である。ＧＰＩアンカー結合シグナル配列は、ＧＰＩに固定されたポリペプチド、例えば、ＧＰＩに固定されたＰＨ２０ポリペプチドの前駆体ポリペプチドに存在する。Ｃ−末端ＧＰＩアンカー結合シグナル配列は、一般的に、ω−部位またはＧＰＩアンカー結合部位のすぐ下流の８−１２個のアミノ酸の親水性スペーサー領域の前に、主に８−２０個のアミノ酸の疎水性領域を含む。ＧＰＩアンカー結合シグナル配列は、当該分野でよく知られている方法を使用して同定することができる。これらは、コンピューターによる方法およびアルゴリズム（例えば、Udenfriend et al. (1995) Methods Enzymol. 250:571-582, Eisenhaber et al., (1999) J. Biol. Chem. 292: 741-758, Kronegg and Buloz, (1999), “Detection/prediction of GPI cleavage site (GPI-anchor) in a protein (DGPI)”, 例えば、ウェブサイト129.194.185.165/dgpi/, Fankhauser et al., (2005) Bioinformatics 21:1846-1852, Omaetxebarria et al., (2007) Proteomics 7:1951-1960, Pierleoni et al., (2008) BMC Bioinformatics 9:392参照）、例えば、バイオインフォマティクスウェブサイト、例えば、ＥｘＰＡＳｙ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓツールサイト（例えば、ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂサイトexpasy.ch/tools/）で容易に利用できるものを含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用されるビフコシル化(bifucosylate)されたポリペプチドは、ポリペプチド鎖におけるアスパラギン残基に連結しているＮ−アセチルグルコサミン部分で、同じ核のＮ−アセチルグルコサミン部分に連結している２つのフコース残基（一方がα１，３−連結およびもう一方がα１，６−連結）を有するポリペプチドを示す。ビフコシル化されたポリペプチドは、一般的に昆虫細胞において生産される。
本明細書において使用される核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの類似体、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびそれらの混合物を含む。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。例えば、検出可能な標識、例えば、蛍光または放射性標識で所望により標識されたプローブまたはプライマーに言及するとき、一本鎖分子が考えられる。このような分子は、一般的に、標的が統計的に独特であるような長さ、またはライブラリーのプロービングもしくはプライミングのための低コピー数（一般的に５未満、一般的に３未満）である。一般的に、プローブまたはプライマーは、興味ある遺伝子と相補的であるか、または同一である配列の少なくとも１４、１６または３０個の隣接するヌクレオチドを含む。プローブおよびプライマーは、１０、２０、３０、５０、１００またはそれ以上の核酸長であり得る。
本明細書において使用されるペプチドなる用語は、２以上のアミノ酸長および４０以下のアミノ酸長であるポリペプチドを示す。本明細書において使用される、本明細書において提供されるアミノ酸の種々の配列に生じるアミノ酸は、既知の３文字または１文字略語にしたがって同定される（表１）。種々の核酸フラグメントに生じるヌクレオチドは、当該分野で日常的に使用される標準１文字記号で指定される。
本明細書において使用される「アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基を含む有機化合物である。ポリペプチドは、２個以上のアミノ酸を含む。本明細書における目的のために、アミノ酸は、２０個の天然アミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ酸類似体（すなわち、α−炭素が側鎖を有するアミノ酸）を含む。
本明細書において使用される「アミノ酸残基」は、ポリペプチドのペプチド結合での化学消化（加水分解）時に形成されるアミノ酸を示す。本明細書に記載されているアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体形態であると推定される。そのように指定される「Ｄ」異性体形態の残基は、所望の機能特性がポリペプチドにより維持される限り、任意のＬ−アミノ酸残基と置き換えることができる。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を示す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基を示す。J. Biol. Chem.、243: 3557-3559 (1968)に記載され、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２２に採用される標準ポリペプチド命名法に沿って、アミノ酸残基の略語は表１に示されている。
表１−対応の表
Figure 0005885765
式により本明細書において示されるすべてのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の慣用の方向に左から右の方向性を有する。加えて、「アミノ酸残基」なる語句は、対応の表（表１）に記載されているアミノ酸および修飾され異常なアミノ酸、例えば、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２２（出典明示により本明細書に包含される）に言及されているものを含むように定義される。さらに、アミノ酸残基配列の前または後ろのダッシュが、１つ以上のアミノ酸残基のさらなる配列、アミノ末端基、例えば、ＮＨ２またはカルボキシル末端基、例えば、ＣＯＯＨへのペプチド結合を示すということに注意すべきである。
本明細書において使用される「天然α−アミノ酸」は、ヒトにおける同族ｍＲＮＡコドンでの荷電ｔＲＮＡ分子の特異的な認識によりタンパク質に組み込まれる天然に見られる２０種のα−アミノ酸の残基である。したがって、非天然アミノ酸は、例えば、２０種の天然アミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸の類似体を含み、限定はしないがアミノ酸のＤ−イソステレオマー(isostereomer)を含む。典型的な非天然アミノ酸は、本明細書に記載されており、当業者に知られている。
本明細書において使用されるＤＮＡ構築物は、本来は見られない方法において組み合わせられ、並べられたＤＮＡのセグメントを含む一本鎖または二本鎖の直鎖または環状ＤＮＡ分子である。ＤＮＡ構築物は、ヒトの操作の結果として存在し、操作された分子のクローンおよび他のコピーを含む。
本明細書において使用されるＤＮＡセグメントは、特定の特質を有する大きなＤＮＡ分子の一部である。例えば、特定のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、大きなＤＮＡ分子の一部、例えば、プラスミドまたはプラスミドフラグメントであり、これは、５’から３’の方向に読まれると、特定のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする。
本明細書において使用されるポリヌクレオチドなる用語は、５’から３’末端に読まれるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡおよびＤＮＡを含み、天然供給源から単離してもよく、インビトロで合成してもよく、または天然および合成分子の組合せから製造してもよい。ポリヌクレオチド分子の長さは、本明細書においてヌクレオチド（「ｎｔ」と省略される）または塩基対（「ｂｐ」と省略される）の単位で与えられる。ヌクレオチドなる用語は、文脈が許すとき、一本鎖および二本鎖分子に対して使用される。該用語が二本鎖分子に適用されるとき、全長を示すために使用され、塩基対なる用語と同等であると理解される。二本鎖ポリヌクレオチドの２つの鎖が長さにおいてわずかに異なり、それらの末端がずれており、したがって、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドが対を形成していないかもしれないことを、当業者は認識している。このような対を形成していない末端は、一般的に、２０ヌクレオチド長を超えない。
本明細書において使用される２つのタンパク質または核酸間の「類似性」は、タンパク質のアミノ酸配列または核酸のヌクレオチド配列間の関連性を示す。類似性は、残基の配列の同一性および／または相同性の程度およびその中に含まれる残基に基づくものであり得る。タンパク質または核酸間の類似性の程度を評価する方法は、当業者に知られている。例えば、配列類似性を評価する１つの方法において、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列を、配列間の最大レベルの同一性を生じる方法でアラインする。「同一性」は、アミノ酸またはヌクレオチド配列が不変である程度を示す。アミノ酸配列およびある程度のヌクレオチド配列のアラインメントは、また、アミノ酸（またはヌクレオチド）における保存的違いおよび／または頻繁な置換を考慮することができる。保存的違いは、関与する残基の物理化学的特性を保存するものである。アラインメントは、包括的（すべての残基を含む配列の全長にわたり、比較される配列のアラインメント）または局所的（最も類似した領域のみを含む配列の一部のアラインメント）であり得る。
「同一性」は、それ自体、当該技術分野で認められた意味を有し、公開された技術を使用して計算することができる（例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987;およびSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991参照）。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の同一性を測定するために多くの方法が存在するが、「同一性」なる用語は当業者によく知られている（Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)）。
本明細書において使用される相同（核酸および／またはアミノ酸配列に対して）は、約２５％以上の配列相同性、一般的に２５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の配列相同性を意味し；正確なパーセンテージは、必要なとき、指定することができる。本明細書における目的のために「相同性」および「同一性」なる用語は、他に記載のない限り、しばしば互換的に使用される。一般的に、相同性または同一性パーセンテージの決定のために、配列は、最大順序のマッチが得られるようにアラインされる（例えば：Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987;およびSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073参照）。配列相同性により、保存されたアミノ酸の数は、標準アラインメントアルゴリズムプログラムにより決定され、各供給業者により確立されたデフォルトギャップペナルティーを使用することができる。実質的に相同な核酸分子は、一般的に、興味ある核酸の長さのすべてに沿って中程度のストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーでハイブリダイズする。ハイブリダイズする核酸分子のコドンの代わりに縮重コドンを含む核酸分子も考慮される。
任意の２種の分子が少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％「同一」または「相同」であるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有するか否かは、既知のコンピューターアルゴリズム、例えば、Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444におけるようなデフォルトパラメーターを使用する、例えば、「ＦＡＳＴＡ」プログラムを使用して決定することができる（他のプログラムは、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12(I):387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Atschul, S.F., et al., J Mol Biol 215:403 (1990)）；Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994、およびCarillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073を含む）。例えば、National Center for Biotechnology Information databaseのＢＬＡＳＴ関数を、同一性を決定するために使用することができる。他の市販または公的に入手可能なプログラムは、ＤＮＡＳｔａｒ「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」プログラム（Madison, WI）およびUniversity of Wisconsin Genetics Computer Group(UWG)「Ｇａｐ」プログラム（Madison WI）を含む。タンパク質および／または核酸分子の相同性または同一性パーセントは、例えば、ＧＡＰコンピュータープログラムを使用する配列情報を比較することにより決定することができる（例えば、Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443、Smith and Waterman ((1981) Adv. Appl. Math. 2:482により修正された）。簡潔には、ＧＡＰプログラムは、２つの配列の短いほうの中の記号の総数によって除した、類似であるアラインされた記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数として類似性を定義する。ＧＡＰプログラムに対するデフォルトパラメーターは、（１）Schwartz and Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353 358 (1979)に記載されている、単項比較行列（同一性に対して１および非同一性に対して０の値を含む）およびGribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745の加重比較行列；（２）各ギャップに対して３．０のペナルティーおよび各ギャップ中の各記号に対してさらなる０．１０ペナルティー；ならびに（３）末端ギャップに対してペナルティーなしを含むことができる。
したがって、本明細書において使用される、「同一性」または「相同性」なる用語は、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較を示す。本明細書において使用される少なくとも「９０％同一」なる用語は、参照核酸またはポリペプチドのアミノ酸配列と比較して９０から９９．９９の同一性パーセントを示す。９０％またはそれ以上のレベルの同一性は、例示目的のために、１００個のアミノ酸の試験および参照ポリペプチドの長さが比較されると仮定して、試験ポリペプチドのアミノ酸の１０％（すなわち、１００のうち１０）以下が参照ポリペプチドと異なるという事実を示す。類似の比較を、試験および参照ポリヌクレオチド間で行うことができる。このような違いは、ポリペプチドの全長にわたって無作為に分配される点突然変異として示さてもよく、また、それらは、最大許容、例えば、１０／１００アミノ酸の違い（約９０％同一性）までで変化する長さの１または複数の位置で集中していてもよい。違いは、核酸またはアミノ酸置換、挿入または欠失として定義される。約８５−９０％を越える相同性または同一性のレベルで、結果は、プログラムおよびギャップパラメータセットと無関係であるはずである。このような高レベルの同一性は、しばしばソフトウェアに頼ることなく手作業のアラインメントにより容易に評価することができる。
本明細書において使用されるアラインされる配列は、相同性（類似性および／または同一性）の使用を示し、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列における対応する位置をアラインする。一般的に、５０％以上の同一性により関連している２つ以上の配列をアラインする。アラインされる配列のセットは、対応する位置でアラインされた２つ以上の配列を示し、ゲノムＤＮＡ配列とアラインされるＲＮＡ、例えば、ＥＳＴおよび他のｃＤＮＡに由来するアラインする配列を含むことができる。
本明細書において使用される「プライマー」は、適当な条件下（例えば、４つの異なるヌクレオシド三リン酸および重合剤、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素の存在下）で適当なバッファー中で適当な温度で鋳型指向性ＤＮＡ合成の開始点として作用することができる核酸分子を示す。特定の核酸分子が「プローブ」および「プライマー」として働き得ることが理解される。しかしながら、プライマーは、伸長のための３’ヒドロキシル基を有する。プライマーは、種々の方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ、ＲＮＡ ＰＣＲ、ＬＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、パンハンドルＰＣＲ、キャプチャーＰＣＲ、発現ＰＣＲ、３’および５’ＲＡＣＥ、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ、ライゲーション−介在ＰＣＲおよび他の増幅プロトコールにおいて使用することができる。
本明細書において使用される「プライマー対」は、増幅される（例えば、ＰＣＲにより）配列の５’末端とハイブリダイズする５’（上流）プライマーおよび増幅される配列の３’末端の相補体とハイブリダイズする３’（下流）プライマーを含むプライマーのセットを示す。
本明細書において使用される「特異的にハイブリダイズする」は、標的核酸分子への核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の相補的な塩基対合によるアニーリングを示す。当業者は、特異的ハイブリダイゼーションに影響するインビトロおよびインビボパラメーター、例えば、特定の分子の長さおよび組成に精通している。特にインビトロハイブリダイゼーションに関連するパラメーターは、アニーリングおよび洗浄温度、バッファー組成および塩濃度を更に含む。高ストリンジェンシーで非特異的に結合している核酸分子を除去するための典型的な洗浄条件は、０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳ、６５℃であり、中程度のストリンジェンシーでは、０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳ、５０℃である。同等のストリンジェンシー条件は、当該分野で知られている。当業者は、容易に、特定の適用に適当な標的核酸分子への核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションを達成するためにこれらのパラメーターを調節することができる。相補的は、２つの核酸配列に関するとき、ヌクレオチドの２つの配列が、一般的に、対向するヌクレオチド間で２５％、１５％または５％未満のミスマッチでハイブリダイズすることができることを意味する。必要なとき、相補性のパーセントは指定される。一般的に、２つの分子は、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするように選択される。
本明細書において使用される生成物と実質的に同一は、興味ある特性が十分に不変であり、実質的に同一の生成物を生成物の代わりに使用することができるように十分に類似であることを意味する。
本明細書において使用される「実質的に同一」または「類似」なる用語は、関連技術分野の当業者により理解される状況で変化することも理解される。
本明細書において使用される対立遺伝子変異体または対立遺伝子変異は、同じ染色体座を占有する遺伝子の２つ以上のすべての代替形態を示す。対立遺伝子変異は、変異を介して天然に生じ、集団内で表現型多型をもたらし得る。遺伝子変異は、サイレント（コードされるポリペプチドに変化なし）であり得、また、改変されているアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。「対立遺伝子変異体」なる用語は、また、本明細書において、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされるタンパク質を示すために使用される。一般的に、遺伝子の参照型は、種の集団または単一の参照メンバー由来のポリペプチドの野生型および／または優性型をコードする。一般的に、種間および種中の変異体を含む対立遺伝子変異体は、同じ種由来の野生型および／または優性型と少なくとも８０％、９０％またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する。同一性の程度は、遺伝子および比較が種間または種内であるか否かに依存する。一般的に、種内対立遺伝子変異体は、ポリペプチドの野生型および／または優性型と少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上の同一性、例えば、野生型および／または優性型と９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を有する。本明細書において対立遺伝子変異体の言及は、一般的に、同じ種のメンバー中のタンパク質の変異を示す。
本明細書において「対立遺伝子変異体」と互換的に使用される本明細書において使用される「対立遺伝子」は、遺伝子またはその一部の代替形態を示す。対立遺伝子は、相同染色体上の同じ遺伝子座または位置を占有する。対象が遺伝子の２つの同一の対立遺伝子を有するとき、対象は、該遺伝子または対立遺伝子に対してホモ接合体であると言われる。対象が遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を有するとき、対象は、該遺伝子に対してヘテロ接合体であると言われる。特定の遺伝子の対立遺伝子は、単一のヌクレオチドまたはいくつかのヌクレオチドにおいて互いに異なっていてよく、ヌクレオチドの修飾、例えば、置換、欠失および挿入を含み得る。遺伝子の対立遺伝子は、また、変異を含む遺伝子の形態であり得る。
本明細書において使用される種変異体は、異なる種、例えば、異なる哺乳動物種、例えば、マウスおよびヒトの中のポリペプチドにおける変異体を示す。本明細書において提供される典型的な種変異体は、霊長類ＰＨ２０、例えば、ヒト、チンパンジー、マカクザルおよびカニクイザルのものであるが、これらに限定されない。一般的に、種変異体は、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列同一性を有する。種変異体間および中の対応する残基は、例えば、配列間の同一性が９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるように、一致するヌクレオチドまたは残基の数を最大限にするように配列を比較し、アラインすることにより決定することができる。次に、興味ある位置は、参照核酸分子に割り当てられる数を与える。特に、配列同一性が８０％以上であるとき、アラインメントは、手動または肉眼により成し遂げることができる。例えば、図１におけるアラインメントは、ヒトＰＨ２０のアミノ酸残基４９１がチンパンジーＰＨ２０のアミノ酸残基４９１に対応し、ヒトＰＨ２０のアミノ酸残基４９７がチンパンジーＰＨ２０のアミノ酸残基４９８に対応することを示す。
本明細書において使用されるスプライス変異体は、２種以上のｍＲＮＡをもたらすゲノムＤＮＡの一次転写物の特異なプロセッシングにより生産される変異体を示す。
本明細書において使用される修飾は、ポリペプチドのアミノ酸配列または核酸分子におけるヌクレオチドの配列の修飾に関連し、それぞれ、アミノ酸およびヌクレオチドの欠失、挿入および置換を含む。ポリペプチドを修飾する方法は、例えば、組換えＤＮＡ方法論を使用することによる、当業者にとって日常的なものである。
本明細書において使用されるプロモーターなる用語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の開始を提供するＤＮＡ配列を含む遺伝子の一部を意味する。プロモーター配列は、いつもではないが通常、遺伝子の５’非コード領域に見られる。
本明細書において使用される、単離された、または精製されたポリペプチドまたはタンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分は、タンパク質が由来する細胞または組織に由来する細胞物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または、化学的に合成されたとき、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。調製物は、純度を評価するために当業者により使用される分析の標準方法、例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定されるとき、容易に検出可能な不純物を含まないと思われるとき実質的に含まないと、または、さらなる精製により、物質の物理化学的特性、例えば、酵素的および生物学的活性を検出可能に変化しないとき、十分に純粋であると決定することができる。実質的に化学的に純粋な化合物を生産するための化合物の精製のための方法は、当業者に知られている。しかしながら、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物であってよい。このような場合、さらなる精製が化合物の比活性を増大させ得る。
したがって、実質的に精製されたポリペプチド、例えば、実質的に精製された延長された可溶性ＰＨ２０の言及は、細胞物質を実質的に含まないＰＨ２０タンパク質の調製物を示し、単離されたか、または組換え的に生産される細胞の細胞成分から分離されたタンパク質の調製物を含む。１つの態様において、細胞物質を実質的に含まないなる用語は、約３０％（乾燥重量で）未満の非酵素タンパク質（また、本明細書において夾雑タンパク質と称される）、一般的に、約２０％未満の非酵素タンパク質または１０％の非酵素タンパク質または約５％未満の非酵素タンパク質を有する酵素タンパク質の調製物を含む。酵素タンパク質が組換え的に生産されるとき、培養培地も実質的に含まない、すなわち、培養培地は、酵素タンパク質調製物の容量の約２０％、１０％または５％未満を示す。
本明細書において使用される、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないなる用語は、タンパク質が、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されている酵素タンパク質の調製物を含む。該用語は、約３０％（乾燥重量で）、２０％、１０％、５％未満の、またはさらに少ない化学的前駆体または非酵素化学物質または成分を有する酵素タンパク質の調製物を含む。
本明細書において使用される、例えば、合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドに関する合成は、組換え方法および／または化学合成方法により生産される核酸分子またポリペプチド分子を示す。
本明細書において使用される組換え手段または組換えＤＮＡ方法を使用することによる生産は、クローン化ＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現させるための分子生物学のよく知られている方法の使用を意味する。
本明細書において使用されるベクター（またはプラスミド）は、発現または複製のいずれかのために異種核酸を細胞に導入するために使用される別個のエレメントを示す。該ベクターは、一般的に、エピソームを維持するが、ゲノムの染色体への遺伝子またはその一部の組み込みを達成するように設計することができる。人工染色体、例えば、酵母人工染色体および哺乳動物人工染色体であるベクターも考慮される。このようなビヒクルの選択および使用は、当業者によく知られている。
本明細書において使用される発現ベクターは、ＤＮＡフラグメントの発現を達成することができる調節配列、例えば、プロモーター領域と作動可能に連結したＤＮＡを発現することができるベクターを含む。このようなさらなるセグメントは、プロモーターおよびターミネーター配列を含んでよく、所望により、１つ以上の複製起点、１つ以上の選択可能なマーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含んでよい。発現ベクターは、一般的にプラスミドまたはウイルスＤＮＡ由来であるか、または両方のエレメントを含み得る。したがって、発現ベクターは、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物、例えば、プラスミド、ファージ、組換えウイルス、または適当な宿主細胞に導入されるとクローン化ＤＮＡの発現をもたらす他のベクターを示す。適当な発現ベクターは、当業者によく知られており、真核細胞および／または原核細胞において複製可能なものおよびエピソームのままであるものまたは宿主細胞ゲノムに組み込むものを含む。
本明細書において使用されるベクターは、また、「ウイルスベクター(virus victor)」または「ウイルスベクター(viral vector)」を含む。ウイルスベクターは、外因性遺伝子を細胞に移すために（ビヒクルまたはシャトルとして）、外因性遺伝子に作動可能に連結している操作されたウイルスである。
ＤＮＡセグメントに言及するとき、本明細書において使用される「作動可能に」または作動可能に連結」は、セグメントが、意図される目的と一致して機能するように、例えば、転写がプロモーターの下流および任意の転写配列の上流で開始するように配置されていることを意味する。プロモーターは、通常、転写機構が転写を開始するために結合し、コードセグメントを通ってターミネーターに向かって進行するドメインである。
本明細書において使用される「評価」なる用語は、サンプル中に存在するプロテアーゼまたはそのドメインの活性の絶対値を得る、または活性のレベルを示す指数、割合、パーセンテージ、視覚的もしくは他の値を得るという意味における定量的および定性的測定を含むことを意図する。評価は、直接的または間接的であってよく、実際に検出される化学種は、もちろん、タンパク質分解産物それ自体である必要はないが、例えば、その誘導体またはさらなる物質であり得る。例えば、相補体タンパク質の開裂産物の検出、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルーでのタンパク質染色による。
本明細書において使用される生物学的活性は、化合物、組成物または他の混合物のインビボ投与時に起こる化合物のインビボ活性または生理学的応答を示す。したがって、生物学的活性は、このような化合物、組成物および混合物の治療効果および医薬活性を含む。生物学的活性は、このような活性を試験または使用するように設計されたインビトロ系で観察することができる。したがって、本明細書における目的のためのプロテアーゼの生物学的活性は、ポリペプチドが加水分解される触媒活性である。
核酸の２つの配列に言及するとき、本明細書において使用される同等は、問題の２つの配列が同じアミノ酸配列または同等のタンパク質をコードすることを意味する。同等が２つのタンパク質またはペプチドに対する言及において使用されるとき、２つのタンパク質またはペプチドが、タンパク質またはペプチドの活性または機能を実質的に変化しないアミノ酸置換のみを有する、実質的に同じアミノ酸配列を有することを意味する。同等が特性に対して言及するとき、特性は同じ程度で存在する必要はないが（例えば、２つのペプチドは、異なる割合の同じ型の酵素活性を示し得る）、活性は、通常、実質的に同じである。
本明細書において使用される「調節する」および「調節」または「変更する」は、分子、例えば、タンパク質の活性の変化を示す。典型的な活性は、生物学的活性、例えば、シグナル変換を含むが、これらに限定されない。調節は、活性の増加（すなわち、上方調節またはアゴニスト活性）、活性の減少（すなわち、下方調節または阻害）または活性のあらゆる他の変化（例えば、周期性、頻度、期間、速度論または他のパラメーターにおける変化）を含み得る。調節は、文脈依存的であり得、一般的に調節は、指定された状態、例えば、野生型タンパク質、恒常的状態におけるタンパク質または指定された細胞型もしくは状態において発現されるタンパク質と比較される。
本明細書において使用される組成物はあらゆる混合物を示す。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはそれらの任意の組合せであり得る。
本明細書において使用される組合せは、２つ以上の品目間または中の任意の関連性を示す。組合せは、２つ以上の別々の品目、例えば、２つの組成物または２つの回収物であってよく、それらの混合物、例えば、２つ以上の品目の単一の混合物、またはそれらのあらゆる変化物であり得る。組合せのエレメントは、一般的に機能的に関連または関係している。
本明細書において使用される「疾患または障害」は、感染、後天的な状態、遺伝的な状態を含むが、これらに限定されない原因または状態に起因する、同定可能な症状により特徴付けられる生物における病理学的状態を示す。本明細書における興味ある疾患および障害は、ＥＣＭの成分に関連するものである。
本明細書において使用される疾患または状態を有する対象を「処置する」は、対象の症状が部分的にまたは完全に緩和されるか、または処置後に静的のままであることを意味する。したがって、処置は、予防、治療および／または治癒を包含する。予防は、可能性のある疾患の防止および／または症状の悪化もしくは疾患の進行の防止を示す。処置は、また、修飾されたインターフェロンおよび本明細書において提供される組成物の任意の医薬的使用を含む。
本明細書において使用される薬学的に有効な薬剤は、あらゆる治療剤または生物活性剤を含み、例えば、麻酔剤、血管収縮剤、分散剤、慣用の治療剤、例えば、小分子薬、例えば、ビスホスホネート、および治療用タンパク質、例えば、インスリン、ＩｇＧ分子、および抗体を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される治療剤は、あらゆる薬学的に有効な薬剤または生物活性剤、例えば、麻酔剤、血管収縮剤、分散剤、慣用の治療剤、例えば、小分子薬物、例えば、ビスホスホネート、ならびに治療タンパク質、例えば、インスリン、ＩｇＧ分子および抗体を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される処置は、状態、障害もしくは疾患または他の適応症の症状が、改善するか、あるいは有益に改変されるあらゆる方法を意味する。
本明細書において使用される治療効果は、疾患もしくは状態の症状を変化する、一般的に向上もしくは改善する、または疾患もしくは状態を治癒する対象の処置をもたらす効果を意味する。治療有効量は、対象への投与後に治療効果をもたらす、組成物、分子または化合物の量を示す。
本明細書において使用される「対象」なる用語は、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトを示す。
本明細書において使用される患者は、疾患または障害の症状を示すヒト対象を示す。
本明細書において使用される、例えば、医薬組成物または他の治療剤の投与による処置による特定の疾患または障害の症状の改善は、組成物または治療剤の投与に起因または関連し得る症状の永久、一時的、持続的、一過性であるかに関わらないあらゆる緩和を示す。
本明細書において使用される防止または予防は、疾患または状態を発症する危険性が減少される方法を示す。
本明細書において使用される「治療有効量」または「治療有効用量」は、治療効果を生み出すために少なくとも十分である、薬物、化合物、物質または化合物を含む組成物の量を示す。したがって、それは、疾患または障害の症状を予防、治癒、改善、阻止または部分的に阻止するために必要な量である。
本明細書において使用される単位投与形態は、ヒトおよび動物対象に適当であり、当該分野で知られているように個別にパッケージされている物理的に別個の単位を示す。
本明細書において使用される単回投与製剤は、直接投与のための製剤を示す。
本明細書において使用される「製品」は、製造され、販売される生成物である。本願を通じて使用されるように、該用語は、パッケージングの同じまたは別々の品目に含まれる、治療剤と可溶性ＰＨ２０、例えば、ｅｓＰＨ２０を、またはｅｓＰＨ２０単独を含むことを意図する。
本明細書において使用される流体は、流れることができるあらゆる組成物を示す。したがって、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームの形態である組成物および他のこのような組成物を含む。
本明細書において使用される「キット」は、本明細書において提供される組成物、ならびに、再構成、活性化ならびに送達、投与、診断および生物学的活性または特性の評価のための器具／デバイスを含むが、これらに限定されない目的のための他の品目の組合せを示す。キットは、所望により使用のための指示書を含む。
本明細書において使用される細胞抽出物または溶解物は、溶解または破壊された細胞から作られる調製物または画分を示す。
本明細書において使用される動物は、あらゆる動物を含み、例えば、霊長類、例えば、ヒト、ゴリラおよびサル、齧歯動物、例えば、マウスおよびラット、鳥類、例えば、ニワトリ、反芻動物、例えば、ヤギ、ウシ、シカ、ヒツジ、ブタおよび他の動物を含むが、これらに限定されない。非ヒト動物は、考慮される動物としてヒトを除外する。本明細書において提供される酵素は、あらゆる供給源、動物、植物、原核生物および真菌由来である。多数の酵素は、哺乳動物起源を含む動物起源のものである。
本明細書において使用される対照は、試験パラメーターで処置されないか、または、それが血漿サンプルであるとき、興味ある状態に罹患していない正常ボランティア由来であり得る点を除き、試験サンプルと実質的に同一であるサンプルを示す。対照は、また、内部対照であり得る。
本明細書において使用される単数形「１つの(a)」、「１つの(an)」および「その(the)」は、文脈上明確に他に指示されていない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「１つの細胞外ドメイン」を含む化合物への言及は、１つまたは複数の細胞外ドメインを含む化合物を含む。
本明細書において使用される範囲および量は、「約」特定の値または範囲として表すことができる。約は、また、正確な量も含む。したがって、「約５個の塩基」は、「約５個の塩基」および「５個の塩基」を意味する。
本明細書において使用される「任意選択の」または「所望により」は、次に記載される事象または状況が生じるか生じないこと、および該記載が前記事象または状況が生じる場合およびそうではない場合を含むことを意味する。例えば、所望により置換されている基は、該基が置換されていないか、または置換されていることを意味する。
本明細書において使用されるあらゆる保護基、アミノ酸および他の化合物の略語は、特に断りのない限り、その一般的な用法、認識された略語または生化学命名法におけるＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会（(1972) Biochem. 11:1726参照）にしたがう。
Ｂ．概観
ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸の加水分解を触媒し、それによりヒアルロン酸の粘度を低下させ、組織透過性を増加させる酵素である。ＰＨ２０は、グリコシル化されているとき最適な活性を示す中性活性および酸性活性なヒアルロニダーゼである。ヒトＰＨ２０は、タンパク質のＣ−末端に接続しているグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを介して細胞膜の細胞外膜(leaflet)に固定されているＧＰＩに固定されたタンパク質である。すべてのＧＰＩに固定されたタンパク質へのＧＰＩアンカーの付加は、ω−部位（一般的に、Ｃ−末端から約２０−３０個のアミノ酸に位置している）と呼ばれる特定のアミノ酸位置での開裂、およびＥＲにおけるＣ−末端部分の除去後に起こる。このＣ−末端部分はＧＰＩアンカー結合シグナル配列である。ヒトＰＨ２０のＧＰＩアンカー結合シグナル配列は、配列番号：１０７に記載されている前駆体ポリペプチドのアミノ酸位置４９１−５０９に位置し、ω−部位は、アミノ酸位置４９０である。ＧＰＩに固定されたＰＨ２０ポリペプチド、例えば、ヒトＰＨ２０は、膜に結合しており、したがって、不溶性である。ＰＨ２０の不溶性形態は、一般的に治療目的に適当ではない。
ＧＰＩアンカーを欠いているＰＨ２０ポリペプチドは、ポリペプチドを膜に固定するＧＰＩ−接続シグナル配列を含まないため、一般的に発現すると細胞により分泌される。ＰＨ２０の可溶性形態は、また、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列内に残基を含むものを含むことも今回見出した。延長された可溶性ＰＨ２０（ｅｓＰＨ２０）ポリペプチドは、対応する野生型ＰＨ２０ポリペプチドのＣ−末端で短縮されているが、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列に位置する１つ以上のアミノ酸残基を維持する可溶性ＰＨ２０タンパク質である。このようなｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、可溶性であり、治療用ポリペプチドとして、例えば、ヒアルロナン関連疾患または状態を処置するために、および／または他の薬剤、薬物およびタンパク質の分散および送達を促進、増強または増加させ、それにより共投与される薬剤、薬物またはタンパク質の薬物動態学および薬物動力学プロフィールを改善するための展着剤または分散剤として役立てるために使用することができる。
１．ＰＨ２０
精子表面タンパク質、精子接着分子１、ＳＰＡＭ１またはＨＹＡＬ３としても知られているＰＨ２０は、ヒアルロニダーゼである。ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸（ヒアルロナンまたはヒアルロン酸塩またはＨＡとしても知られている）を分解する酵素ファミリー、細胞外マトリックスの必須成分および間質バリアの主要な成分である。ヒアルロン酸の加水分解を触媒することにより、ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸の粘度を低下させ、それにより、組織透過性を増加させる。そのようなものとして、ヒアルロニダーゼは、その分散および送達を増強させるための、ならびに共投与用薬剤、薬物またはタンパク質の薬物動態学および薬物動力学プロフィールを改善するための、例えば、他の薬剤、薬物およびタンパク質と共に、展着剤または分散剤として使用されている。
他の哺乳動物ヒアルロニダーゼのようなＰＨ２０は、ヒアルロン酸のβ１→４グリコシド結合を四糖および六糖のような種々のオリゴ糖の長さに加水分解するエンド−β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼである。ＰＨ２０は、加水分解活性およびトランスグリコシダーゼ活性の両方を有し、ヒアルロン酸およびコンドロイチン硫酸、例えば、Ｃ４−ＳおよびＣ６−Ｓを分解することができる。ＰＨ２０は、精子−卵子接着に天然に関与しており、ヒアルロン酸を消化することにより卵丘細胞の層の精子による浸透を補助する。ＰＨ２０は、精子表面上およびリソソーム由来先体に位置し、ここで先体内膜と結合している。細胞膜ＰＨ２０は、中性ｐＨでのみヒアルロニダーゼ活性を有するが、先体内膜ＰＨ２０は、中性および酸性ｐＨの両方で活性を有する。ヒアルロニダーゼに加えて、ＰＨ２０は、ＨＡ誘導性細胞シグナル伝達の受容体および卵母細胞を囲む透明帯の受容体でもあると思われる。
典型的なＰＨ２０タンパク質は、ヒト（配列番号：１０７に記載されている前駆体ポリペプチド、配列番号：１０８に記載されている成熟体ポリペプチド）、ウシ（配列番号：１１１および１１９）、ウサギ（配列番号：１１２）、ヒツジ（配列番号：１１３、１１８および１２０）、カニクイザル（配列番号：１１４）、モルモット（配列番号：１１５）、ラット（配列番号：１１６）、マウス（配列番号：１１７）、チンパンジー（配列番号：１９７）およびアカゲザル（配列番号：１９８）のＰＨ２０ポリペプチドを含むが、これらに限定されない。ヒトＰＨ２０ｍＲＮＡ転写物は、正常に翻訳されて、Ｎ−末端に３５個のアミノ酸のシグナル配列（配列番号：１０７のアミノ酸残基位置１−３５）を含む５０９個のアミノ酸の前駆体ポリペプチド（配列番号：１０７）を生産する。したがって、ＥＲへの輸送およびシグナルペプチドの除去後、配列番号：１０８に記載されているアミノ酸配列を有する４７４個のアミノ酸の成熟体ポリペプチドが生産される。以下に記載されているとおり、次にＣ−末端ペプチドがＥＲにおいて開裂され、配列番号：１０７に記載されている前駆体ポリペプチドの位置４９０に対応するアミノ酸位置で新規に形成されるＣ末端アミノ酸とのＧＰＩアンカーの共有結合を容易にする。
ヒトＰＨ２０は、一般的にグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを介して細胞膜に固定されている原型的な中性活性なヒアルロニダーゼである。上記のとおり、ＰＨ２０は、また、先体内膜上に発現され、中性および酸性ｐＨの両方でヒアルロニダーゼ活性を有する。証拠は、配列番号：１０７に記載されている前駆体ポリペプチドのアミノ酸１４２−１７２に対応するＰＨ２０のペプチド１領域が、中性ｐＨで酵素活性に必要であることを示唆する。配列番号：１０７に記載されている前駆体ポリペプチドのアミノ酸２７７−２９７に対応するペプチド３領域は、酸性ｐＨで酵素活性に重要であると思われる（Cherr et al., (2001) Matrix Biology 20:515-525）。したがって、ＰＨ２０は２つの触媒部位を含むと思われる。触媒部位に加えて、ＰＨ２０は、また、ヒアルロナン結合部位を含む。実験的証拠により、この部位は、ペプチド２領域中に位置しており、配列番号：１０７に記載されている前駆体ポリペプチドのアミノ酸位置２０５−２３５に対応するということが示唆される。この領域は、ヒアルロニダーゼ間で高度に保存されており、ヘパリン結合モチーフと類似している。
ａ．グリコシル化
いくつかのヒアルロナン分解酵素、例えば、ヒアルロニダーゼのグリコシル化、例えば、ＮおよびＯ結合型グリコシル化は、その触媒活性および安定性にとって重要であり得る。Ｎ結合型オリゴ糖は、いくつかの主要な種類（オリゴマンノース、複合体、ハイブリッド）に分類され、そのすべてが、−Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ−配列（ここで、ＸａａはＰｒｏではない）内に含まれるＡｓｎ残基のアミド窒素を介して結合している（Ｍａｎ）３−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−コアを有する。−Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−でのさらなるグリコシル化部位は、凝固タンパク質Ｃについて報告されている。場合によっては、ヒアルロナン分解酵素、例えば、ヒアルロニダーゼは、Ｎ−グリコシド結合およびＯ−グリコシド結合の両方を含むことができる。例えば、ＰＨ２０は、アミノ酸Ｔ４７５で１つのＯ結合型オリゴ糖ならびに配列番号：１０７に例示されるヒトＰＨ２０のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３で６つのＮ結合型オリゴ糖を有する。アミノ酸残基Ｎ８２、Ｎ１６６およびＮ２５４は複合型グリカンにより占有されるが、アミノ酸残基Ｎ３６８およびＮ３９３は高マンノース型グリカンにより占有される（例えば、以下の実施例６参照）。アミノ酸残基Ｎ２３５は、約８０％の高マンノース型グリカンおよび２０％の複合型グリカンにより占有される。
糖タンパク質を修飾するグリカンの型を変更することは、タンパク質の抗原性、構造的フォールディング、溶解度および安定性に劇的な影響を有し得るが、多数の酵素は、最適な酵素活性のためにグリコシル化を必要とすると考えられていない。いくつかのヒアルロニダーゼにおいて、Ｎ結合型グリコシル化の除去が、ヒアルロニダーゼ活性のほぼ完全な不活性化をもたらし得る。したがって、このようなヒアルロニダーゼにおいて、Ｎ結合型グリカンの存在が活性な酵素の作製に必要である。ＰＨ２０ポリペプチドにおけるＮ結合型グリカンの存在は、活性な酵素を生産するために必要である。例えば、エンドグリコシダーゼＰＮＧａｓｅＦまたはＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）阻害剤ツニカマイシンでの処理によるヒトＰＨ２０の完全な脱グリコシル化は、ヒアルロニダーゼ活性の全喪失をもたらすことを今回見出した（例えば、以下の実施例７−８参照）。対照的に、エンドグリコシダーゼＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３またはＥｎｄｏＨでの処理によるヒトＰＨ２０の部分的な脱グリコシル化は、ヒトＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性に影響しない（例えば、以下の実施例７参照）。
ｂ．ＧＰＩ固定
ヒトＰＨ２０はＧＰＩに固定されたタンパク質である。ＰＨ２０ポリペプチドそれ自体は、タンパク質のＣ−末端に接続したグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを介して細胞膜の細胞外膜に固定されている。ＧＰＩに固定されたタンパク質、例えば、ヒトＰＨ２０は、小胞体（ＥＲ）へタンパク質を指向する開裂できるＮ−末端シグナルペプチドで翻訳される。これらのタンパク質のＣ−末端は、ＥＲの内腔内においてポリペプチドへあらかじめ形成されたＧＰＩアンカーの付加を指向する別のシグナル配列である。ＧＰＩアンカーの付加は、ω−部位（一般的に、Ｃ−末端から約２０−３０個のアミノ酸に位置している）と呼ばれる特定のアミノ酸位置でのＣ−末端部分の開裂後に起こる。ω−部位の位置を同定するためのコンセンサス配列がないようだが、ＧＰＩに固定されたタンパク質は、一般的にω−部位のすぐ下流の８−１２個のアミノ酸の親水性スペーサー領域の前に、８−２０個のアミノ酸の主に疎水性領域を含む、Ｃ−末端ＧＰＩアンカー結合シグナル配列またはドメインを含む。この親水性スペーサー領域は、しばしば、荷電アミノ酸およびプロリンが豊富である（White et al., (2000) J. Cell Sci. 113(Pt.4):721-727）。より詳細な分析によって、少量の予測二次構造により特徴付けられるω−１位置より前の約１１個のアミノ酸の領域、小さい側鎖残基の存在により特徴付けられるω−１からω＋２の開裂部位（ω−部位）周囲の領域、位置ω＋３からω＋９間のスペーサー領域、およびω＋１０からＣ−末端の疎水性テールが存在することを示唆する（Pierleoni et al., (2008) BMC Bioinformatics 9:392）。
ＧＰＩアンカー結合シグナルコンセンサス配列は存在しないが、ポリペプチドにおけるこのような配列を同定するために使用することができる種々のコンピューターによる方法およびアルゴリズム（例えば, Udenfriend et al. (1995) Methods Enzymol. 250:571-582; Eisenhaber et al., (1999) J. Biol. Chem. 292: 741-758; Kronegg and Buloz, (1999), “Detection /prediction of GPI cleavage site (GPI-anchor) in a protein (DGPI),” 129.194.185.165/dgpi/; Fankhauser et al., (2005) Bioinformatics 21:1846-1852; Omaetxebarria et al., (2007) Proteomics 7:1951-1960; Pierleoni et al., (2008) BMC Bioinformatics 9:392参照）、例えば、バイオインフォマティクスウェブサイト、例えば、ＥｘＰＡＳｙ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓツールサイト（expasy.ch/tools/）で容易に利用できるものが開発されている。したがって、当業者は、ＰＨ２０ポリペプチドがＧＰＩアンカー結合シグナル配列を含むか否か、したがって、ＰＨ２０ポリペプチドがＧＰＩに固定されたタンパク質であるか否かを決定することができる。
ヒトＰＨ２０のＧＰＩアンカー結合シグナル配列は、配列番号：１０７に記載されている前駆体ポリペプチドのアミノ酸位置４９１−５０９に位置し、ω−部位は、アミノ酸位置４９０である。したがって、ヒトＰＨ２０のこのモデリングにおいて、アミノ酸４９１−５０９はＥＲへの輸送後に開裂し、ＧＰＩアンカーは位置４９０でセリン残基に共有結合する。ヒトＰＨ２０のＣ−末端へのＧＰＩアンカーの共有結合、したがって、ＰＨ２０の膜結合性質は、ホスファチジルイノシトール−特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）加水分解試験を使用して行われている（例えば、Lin et al., (1994) J. Biol. Chem. 125:1157-1163および以下の実施例３参照）。ホスファチジルイノシトール−特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）およびＤ（ＰＩ−ＰＬＤ）は、ＧＰＩアンカーを加水分解し、ＰＨ２０ポリペプチドを細胞膜から放出する。したがって、得られる放出されるＰＨ２０ポリペプチドは可溶性である。可溶性ＰＨ２０は、当該分野でよく知られている方法、例えば、限定はしないが、以下および実施例４に記載されているＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４アッセイを使用するものを使用して、不溶性の膜結合ＰＨ２０から検出および区別することができる。このアッセイにおいて、可溶性ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは３７℃に温められたＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４溶液の水相に分配するが（Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7）、膜に固定されたＰＨ２０ヒアルロニダーゼは界面活性剤リッチな相に分配する。したがって、当然にＰＨ２０ポリペプチドがＧＰＩに固定されているか否かを評価するアルゴリズムの使用に加えて、溶解度実験も行うことができる。
Ｃ．延長された可溶性ＰＨ２０ポリペプチド
本明細書において提供されるものは、延長された可溶性ＰＨ２０（ｅｓＰＨ２０）ポリペプチドおよび組成物である。典型的な本明細書において提供されるｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、霊長類ｅｓＰＨ２０ポリペプチド、例えば、ヒトおよびチンパンジーｅｓＰＨ２０ポリペプチドを含むが、これらに限定されない。本明細書において提供されるｅｓＰＨ２０ポリペプチドは可溶性であり、すなわち、Ｃ−末端で短縮されているが、対応する野生型ＰＨ２０ポリペプチドのＧＰＩアンカー結合シグナル配列に位置する少なくとも１つ以上のアミノ酸残基を維持するＰＨ２０タンパク質を分泌する（例えば、アミノ酸位置４９１−５００で短縮されている）。ｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、ＧＰＩに固定されたＰＨ２０ポリペプチドの修飾により、すなわち、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列の部分の除去により、いずれかのＧＰＩに固定されたＰＨ２０ポリペプチドから生産することができる（ただし、得られるｅｓＰＨ２０ポリペプチドは可溶性である）。溶解度または細胞培養培地への分泌は、発現時にＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析により、あるいは、ＰＨ２０ポリペプチドが組換え発現およびポリペプチド合成を含む当業者に知られているあらゆる方法により生産されるとき、以下および実施例４に記載されているＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４アッセイにおいて測定することができる。本明細書において提供されるｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、その分散および送達を増強させるための、ならびに共投与用薬剤、薬物またはタンパク質の薬物動態学および薬物動力学プロフィールを改善するための、他の薬剤、薬物およびタンパク質と共に、例えば、治療用ポリペプチドとして、例えば、展着剤または分散剤として使用することができる。
本明細書において提供されるｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、ｅｓＰＨ２０ポリペプチドが可溶性である、すなわち、以下に記載されるＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４溶液の水相へ分配される限り、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列中の１、２、３、４、５、６、７個またはそれ以上のアミノ酸残基を含む。本明細書において提供される延長された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、あらゆる自然にＧＰＩに固定されたＰＨ２０ポリペプチドからＣ−末端切断することにより生産することができ、ここで、得られるｅｓＰＨ２０ポリペプチドは可溶性であり、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列由来の１個または複数のアミノ酸残基を含む。当業者は、ＰＨ２０ポリペプチドがＧＰＩに固定されているか否かを、当該分野でよく知られている方法を使用して決定することができる。このような方法は、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列およびω部位の存在および位置を予測する既知のアルゴリズムを使用すること、およびホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）またはＤ（ＰＩ−ＰＬＤ）で消化の前後の溶解度分析を実施することを含むが、これらに限定されない。
典型的なｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、霊長類のｅｓＰＨ２０ポリペプチド、例えば、ヒトおよびチンパンジーｅｓＰＨ２０ポリペプチドを含むが、これらに限定されない。例えば、本明細書において提供されるｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号：１０７、１０８または１９７に記載されている成熟体または前駆体ポリペプチド、またはそれらの対立遺伝子もしくは他の変異、例えば、それらの活性なフラグメントのいずれかのＣ−末端切断により作ることができる（ここで、得られるポリペプチドは可溶性であり、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列由来の１個以上のアミノ酸残基を維持する）。対立遺伝子変異体および他の変異体は、当業者に知られており、配列番号：１０７、１０８および１９７のいずれかと６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。本明細書において提供されるｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、野生型ポリペプチド、例えば、配列番号：１０７、１０８および１９７に記載されている配列を有するポリペプチドと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のアミノ酸がＣ−末端短縮され得る、ただし、得られるｅｓＰＨ２０ポリペプチドは可溶性であり、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列由来の１個以上のアミノ酸残基を維持する。
本明細書において提供される延長された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、ヒアルロニダーゼ活性を維持している。さらに、ｅｓＰＨ２０ポリペプチドは中性活性である、すなわち、それらは中性ｐＨでヒアルロニダーゼ活性を維持している。ヒアルロニダーゼ活性は、ＰＨ２０の野生型のＧＰＩに固定された形態と比較して、増加または減少し得る。例えば、本明細書において提供されるｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、野生型のＧＰＩに固定された形態により示されるヒアルロニダーゼ活性の１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％またはそれ以上であるヒアルロニダーゼ活性を示し得る。
１．ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチド
本明細書において提供される典型的なｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドである。本明細書において提供されるヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドは可溶性であり、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列由来の１個以上のアミノ酸残基を含む。したがって、本明細書において提供されるものは、ＧＰＩがＧＰＩアンカー結合シグナル配列を完全に欠いていないヒトＰＨ２０の可溶性形態である。
本明細書において提供される前駆体ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列のアミノ酸１からアミノ酸４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９または５００を含むポリペプチドを生産するようにＣ−末端切断を有するものを含むが、これらに限定されない。哺乳動物細胞において発現されるとき、３５個のアミノ酸のＮ−末端シグナル配列はプロセッシング中に開裂され、タンパク質の成熟形態を分泌する。したがって、成熟体ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号：１０７のアミノ酸３６から４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９または５００を含む。したがって、本明細書において提供される成熟体ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号：５９−６３または１００−１０４に記載されているものまたはそれらの対立遺伝子もしくは他の変異体を含む。
本明細書において提供されるヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、ＣＨＯ細胞において発現されるか、あるいは任意の細胞において、または当業者に知られている任意の方法により生産され得る（ただし、それらは、可溶性であり、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列由来の少なくとも１個のアミノ酸を含む）。ＣＨＯ細胞において生産される可溶性ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、細胞培養培地に分泌されるものである。 ヒトｅｓＰＨ２０が部分的に分泌され得る、すなわち、発現されるポリペプチドの５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が培養培地に分泌されることは当業者に理解される（ただし、分泌されるｅｓＰＨ２０は可溶性である、すなわち、以下に記載されているＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４溶液の水相に分配する）。アミノ酸１−５００または３６−５００を含む本明細書において提供されるヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、部分的に分泌される。さらに、ＣＨＯ細胞において発現されるとき、アミノ酸１から４９８、４９９または５００を含む前駆体ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドまたはアミノ酸３６から４９８、４９９または５００を含む成熟体ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、１週間毎に発現される（例えば、以下の実施例３参照）。
したがって、典型的な前駆体ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列のアミノ酸１からアミノ酸４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６または４９７を含むポリペプチドを生産するようにＣ−末端切断を有するあらゆるものを含むが、これらに限定されない。哺乳動物細胞において発現されるとき、プロセッシング中のＮ−末端シグナルペプチドの開裂後、成熟体ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号：１０７のアミノ酸３６から４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６または４９７を含む。したがって、本明細書において提供される典型的な成熟体ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号：６０−６３および１０２−１０４のいずれかに記載されているような４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１または４６２アミノ酸長であるものまたはそれらの対立遺伝子もしくは他の変異体を含む。対立遺伝子変異体および他の変異体は、当業者に知られており、配列番号：１０７または１０８のいずれかと６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
また、本明細書において提供されるものは、アミノ酸置換ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドである。アミノ酸置換ｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、例えば、配列番号：６０−６３および１０２−１０４に記載されているような、本明細書において提供されるヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドと比較して、アミノ酸置換を含むように修飾されているヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドである。したがって、アミノ酸置換ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、Ｃ−末端切断を有するものである。いくつかの例において、本明細書において提供されるアミノ酸置換ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列のアミノ酸１から４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６または４９７、またはアミノ酸３６から４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６または４９７に記載されているアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。他の例において、アミノ酸置換ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号：６０−６３および１０２−１０４に記載されているアミノ酸配列と８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。
本明細書において提供されるヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、ＰＨ２０の野生型のＧＰＩに固定された形態と比較して、増加または減少しているヒアルロニダーゼ活性を示し得る。例えば、本明細書において提供されるヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、野生型のＧＰＩに固定された形態により示されるヒアルロニダーゼ活性の１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％またはそれ以上であるヒアルロニダーゼ活性を示し得る。いくつかの例において、ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、野生型のＧＰＩに固定された形態と比較して、ヒアルロニダーゼ活性の増加を示す。ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性は、野生型のＧＰＩに固定された形態のヒアルロニダーゼ活性と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％またはそれ以上増加し得る。
本明細書において提供されるヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、中性活性であるヒアルロニダーゼ活性、または中性ｐＨで測定されたとき、ＰＨ２０の野生型のＧＰＩに固定された形態と比較して増加または減少するヒアルロニダーゼ活性を示す。例えば、本明細書において提供されるヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、野生型のＧＰＩに固定された形態により示されるヒアルロニダーゼ活性の１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％またはそれ以上であるヒアルロニダーゼ活性を示し得る。いくつかの例において、ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、野生型のＧＰＩに固定された形態と比較して、中性活性であるヒアルロニダーゼ活性の減少を示す。中性活性であるヒアルロニダーゼ活性は、野生型のＧＰＩに固定された形態の中性活性であるヒアルロニダーゼ活性と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上減少し得る。他の例において、ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、野生型のＧＰＩに固定された形態と比較して、中性活性であるヒアルロニダーゼ活性の増加を示す。中性活性であるヒアルロニダーゼ活性は、野生型のＧＰＩに固定された形態の中性活性であるヒアルロニダーゼ活性と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％またはそれ以上増加し得る。
グリコシル化がこれらのポリペプチドの触媒活性および安定性のために重要であるため、一般的に、ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドはポリペプチドが活性を確実に保持するように正しいＮ−グリコシル化を容易にするタンパク質発現系を使用して生産される。ｅｓＰＨ２０ポリペプチドの組換え発現のために有用な典型的な細胞は、、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＤＧ４４ ＣＨＯまたはＣＨＯ−Ｓ細胞）を含む。
２．他の種のｅｓＰＨ２０ポリペプチド
本明細書において提供されるものは、非ヒト延長された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドである。当業者は、延長された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドを生産するためにＣ−末端切断を作ることができる、配列番号：１０７に記載されているヒトＰＨ２０ポリペプチドの位置４９１−５００に対応する位置を同定するために、ヒトＰＨ２０のアミノ酸配列を任意の非ヒトＰＨ２０ポリペプチドとアラインすることができる。さらに、本明細書の他の部分に記載されているもののようなアルゴリズムを、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列の位置を予測するために使用することができる。Ｃ−末端短縮ポリペプチドの溶解度を、生産されたＣ−末端短縮ポリペプチドが可溶性であるか、したがって、ｅｓＰＨ２０ポリペプチドであるかを同定するために、以下および実施例４に記載されているＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４アッセイを含む当該分野でよく知られている方法を使用して評価することができる。
本明細書においてされるものは、非ヒト霊長類種の延長された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドである。典型的な非ヒト霊長類のＧＰＩに固定されたＰＨ２０ポリペプチドは、チンパンジーＰＨ２０（配列番号：１９７）を含むが、これらに限定されない。したがって、本明細書において提供されるものは、チンパンジーｅｓＰＨ２０ポリペプチドである。本明細書において提供されるチンパンジーのｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドに対して上記のＣ−末端切断に対応するＣ−末端切断を含む。したがって、本明細書において提供されるチンパンジーｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列のアミノ酸残基１から４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００または５０１に対応するアミノ酸を含む。
チンパンジーＰＨ２０ポリペプチドを、当業者に知られている任意の方法によりヒトＰＨ２０ポリペプチドとアラインすることができる。このような方法は、一般的に一致を最大にし、例えば、手動アラインメントを使用する方法ならびに利用できる多数のアラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ）および当業者に知られている他のものを使用することによる方法を含む。図１は、ヒトおよびチンパンジーＰＨ２０の前駆体ポリペプチドのアラインメントを提供する。ヒトＰＨ２０のアミノ酸残基４９１から５００（本明細書において提供されるヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、野生型ヒトＰＨ２０ポリペプチドと比較して短縮されている）は、チンパンジーＰＨ２０のアミノ酸残基４９１から５０１に対応する。したがって、本明細書において提供されるものは、配列番号：１９７に記載されているアミノ酸配列のアミノ酸残基１から４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００または５０１を含むチンパンジーｅｓＰＨ２０ポリペプチドである。哺乳動物細胞において発現されるとき、３５個のアミノ酸のシグナル配列はプロセッシング中に開裂され、タンパク質の成熟形態を分泌する。したがって、成熟体チンパンジーｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号：１９７のアミノ酸３６から４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００または５０１を含む。
典型的なチンパンジーｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号：１９７に記載されているアミノ酸配列のアミノ酸残基１から４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７または４９８を含むものである。哺乳動物細胞において発現されるとき、３５個のアミノ酸のシグナルペプチドはプロセッシング中に開裂され、タンパク質の成熟形態を分泌する。したがって、成熟体チンパンジーｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号：１９７のアミノ酸３６から４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７または４９８を含む。
Ｄ．部分的にＮ−グリコシル化されているＰＨ２０ポリペプチド
本明細書において提供されるものは、Ｎ−グリコシル化されたヒアルロニダーゼのヒアルロニダーゼ活性のすべてまたは一部を維持している、部分的に脱グリコシル化されたＰＨ２０ポリペプチドを含む部分的にＮ−グリコシル化されたヒアルロニダーゼである。典型的な部分的に脱グリコシル化されたヒアルロニダーゼは、何らかの種由来の部分的に脱グリコシル化されたＰＨ２０ポリペプチド、例えば、配列番号：１０７−１０９、１１１−１２０、１９７および１９８のいずれかに記載されているもの、またはそれらの対立遺伝子変異体もしくは他の変異体を含む。対立遺伝子変異体および他の変異体は当業者に知られており、配列番号：１０７−１０９、１１１−１２０、１９７および１９８のいずれかと６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドまたはそれらの短縮された形態を含む。本明細書において提供される部分的に脱グリコシル化されたヒアルロニダーゼは、また、ハイブリッド、融合およびキメラの部分的に脱グリコシル化されたヒアルロニダーゼおよび部分的に脱グリコシル化されたヒアルロニダーゼ複合体を含む。
本明細書において提供される部分的にＮ−グリコシル化されたヒアルロニダーゼは、１つ以上のグリコシダーゼでの消化により生産することができる。したがって、すべてのＮ結合型グリコシル化部位（例えば、配列番号：１０７に例示されているヒトＰＨ２０のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３での部位）がグリコシル化され得るが、グリコシル化の程度は、１つ以上のグリコシダーゼで消化されないヒアルロニダーゼと比較して減少する。本明細書において提供される部分的に脱グリコシル化されたヒアルロニダーゼポリペプチド、例えば、部分的に脱グリコシル化された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、完全にグリコシル化されたヒアルロニダーゼのグリコシル化のレベルの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％を有し得る。１つの例において、高マンノースまたは複合型グリカンを含まず、むしろ少なくとも１つのＮ−アセチルグルコサミン部分を含むように、配列番号：１０７のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３に対応する１、２、３、４、５または６個のＮ−グリコシル化部位は、部分的に脱グリコシル化される。いくつかの例において、配列番号：１０７のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６およびＮ２５４に対応する１、２または３個のＮ−グリコシル化部位は脱グリコシル化されており、すなわち、それらが糖部分を含まない。他の例において、配列番号：１０７のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３に対応する３、４、５または６個のＮ−グリコシル化部位がグリコシル化される。グリコシル化されるアミノ酸残基は、最小限、１つのＮ−アセチルグルコサミン部分を含む。
また、本明細書において提供されるものは、部分的にＮ−グリコシル化されているＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドである。本明細書において提供される部分的に脱グリコシル化されたＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、全長ＰＨ２０ポリペプチド、例えば、配列番号：１０７−１０９、１１１−１２０、１９７および１９８に記載されているいずれかのもののＣ−末端から１個以上のアミノ酸を欠いている。したがって、本明細書において提供される部分的にＮ−グリコシル化されているＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、全長野生型ポリペプチド、例えば、配列番号：１０７−１０９、１１１−１２０、１９７および１９８に記載されている配列を有する全長野生型ポリペプチドと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０個またはそれ以上のアミノ酸がＣ−末端短縮され得る。いくつかの例において、配列番号：１０７のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３に対応する３、４、５または６個のＮ−グリコシル化部位がグリコシル化される。グリコシル化されるアミノ酸残基は、最小限、１つのＮ−アセチルグルコサミン部分を含む。他の例において、配列番号：１０７のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３に対応する１、２または３個のＮ−グリコシル化部位は、グリコシル化されない。さらなる例において、ヒアルロニダーゼ活性を維持する限り、部分的にグリコシル化されたＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドが高マンノースおよび複合型グリカンを含まず、むしろ少なくとも１つのＮ−アセチルグルコサミン部分を含むように、グリコシル化の程度を減少させることができる。したがって、本明細書において提供される部分的に脱グリコシル化されたＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、完全にグリコシル化されたＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドのグリコシル化のレベルの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％を有し得る。
本明細書において提供される部分的に脱グリコシル化されたＰＨ２０ポリペプチドおよびＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、ヒアルロニダーゼ活性を維持している。さらに、部分的に脱グリコシル化されたＰＨ２０ポリペプチドおよびＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは中性活性である、すなわち、それらは中性ｐＨでヒアルロニダーゼ活性を維持している。ヒアルロニダーゼ活性は、グリコシル化された全長およびＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドと比較して、増加または減少し得る。例えば、本明細書において提供される部分的に脱グリコシル化されたＰＨ２０ポリペプチドおよびＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、グリコシル化された全長およびＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドにより示されるヒアルロニダーゼ活性の１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％またはそれ以上であるヒアルロニダーゼ活性を示し得る。
したがって、本明細書において提供されるＰＨ２０ポリペプチドは、例えば、ヒアルロナン関連疾患または状態を処置するための、治療用ポリペプチドとして使用することができる。部分的に脱グリコシル化されたＰＨ２０ポリペプチドおよびＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドも、また、例えば、併用療法において使用することができる。
１．ＰＨ２０ポリペプチド
本明細書において提供される典型的な部分的にＮ−グリコシル化されたヒアルロニダーゼは、何らかの種由来の部分的に脱グリコシル化されたＰＨ２０ポリペプチド、例えば、配列番号：１０７−１０９、１１１−１２０、１９７および１９８のいずれかに記載されているもの、またはそれらの対立遺伝子変異体もしくは他の変異体を含む。対立遺伝子変異体および他の変異体は当業者に知られており、配列番号：１０７−１０９、１１１−１２０、１９７および１９８のいずれかまたはそれらの短縮された形態と６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例において、配列番号：１０７のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３に対応する３、４、５または６個のＮ−グリコシル化部位がグリコシル化される。他の例において、配列番号：１０７のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６およびＮ２５４に対応する１、２または３個のＮ−グリコシル化部位は、グリコシル化されない。いくつかの例において、配列番号：１０７のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３に対応する１、２、３、４、５または６個のＮ−グリコシル化部位は、最小限、１つのＮ−アセチルグルコサミン部分を含む。
本明細書において提供される部分的に脱グリコシル化されたヒアルロニダーゼは、１つ以上のグリコシダーゼでの消化により生産することができる。したがって、すべてのＮ結合型グリコシル化部位（例えば、配列番号：１０７に例示されているヒトＰＨ２０のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３での部位）がグリコシル化され得るが、グリコシル化の程度は、１つ以上のグリコシダーゼで消化されないヒアルロニダーゼと比較して減少する。特に、部分的にグリコシル化されたヒアルロニダーゼは、Ｎ結合型グリコシル化部位のそれぞれで少なくとも１つのＮ−アセチルグルコサミン部分を維持する。部分的にグリコシル化されたヒアルロニダーゼは、配列番号：１０７のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３に対応する３、４、５または６個のＮ−グリコシル化部位でグリコシル化され得る。いくつかの例において、ヒアルロニダーゼは、配列番号：１０７のアミノ酸残基Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３に対応する１、２または３個のＮ−グリコシル化部位で脱グリコシル化されている。本明細書において提供される部分的に脱グリコシル化されたＰＨ２０ポリペプチドは、完全にグリコシル化されたヒアルロニダーゼのグリコシル化のレベルの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％を有し得る。
グリコシダーゼまたはグリコシドヒドロラーゼは、グリコシド結合の加水分解を触媒し、２つの小さな糖を生産する酵素である。図２に示されるとおり、脊椎動物におけるＮ−グリカンの主要な型は、高マンノースグリカン、ハイブリッドグリカンおよび複合型グリカンを含む。高マンノースおよびハイブリッド型グリカンを開裂するＥｎｄｏＦ１；二分岐複合型グリカンを開裂するＥｎｄｏＦ２；二分岐およびそれ以上の分岐複合型グリカンを開裂するＥｎｄｏＦ３；および高マンノースおよびハイブリッド型グリカンを開裂するＥｎｄｏＨを含む部分タンパク質脱グリコシル化をもたらすいくつかのグリコシダーゼがある（図３）。ヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ＰＨ２０の、１種またはすべてのこれらのグリコシダーゼでの処理は、部分脱グリコシル化のみもたらし、したがって、ヒアルロニダーゼ活性の維持をもたらし得る。
例えば、ｒＨｕＰＨ２０の、１種またはすべてのグリコシダーゼでの処理は、部分脱グリコシル化をもたらす。これらの部分的に脱グリコシル化されたｒＨｕＰＨ２０ポリペプチドは、完全にグリコシル化されたポリペプチドに匹敵するヒアルロニダーゼ酵素活性を示す（例えば、実施例７参照）。対照的に、ｒＨｕＰＨ２０（配列番号：１２２）の、すべてのＮ−グリカンを開裂するグリコシダーゼであるＰＮＧａｓｅＦでの処理（図３参照）、またはＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）阻害剤ツニカマイシンでの処理は、すべてのＮ−グリカンの完全脱グリコシル化をもたらし、それによりＰＨ２０を酵素的に不活性にする（例えば、以下の実施例７−８参照）。
本明細書において提供される部分的に脱グリコシル化されたヒアルロニダーゼポリペプチド、例えば、部分的に脱グリコシル化された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、完全にグリコシル化されたヒアルロニダーゼのグリコシル化レベルの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％を有し得る。一般的に、本明細書において提供される部分的に脱グリコシル化されたヒアルロニダーゼ、例えば、部分的に脱グリコシル化された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、完全にグリコシル化されたヒアルロニダーゼにより示されるヒアルロニダーゼ活性の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％またはそれ以上であるヒアルロニダーゼ活性を示す。
本明細書において提供される部分的に脱グリコシル化されたヒアルロニダーゼは、また、ハイブリッド、融合およびキメラの部分的に脱グリコシル化されたヒアルロニダーゼおよび部分的に脱グリコシル化されたヒアルロニダーゼ複合体を含む。
２．Ｃ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチド
本明細書において提供される典型的な部分的にＮ−グリコシル化された、または部分的に脱グリコシル化されたＰＨ２０ペプチドは、Ｃ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドである。本明細書において提供される部分的にグリコシル化されたＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号：１０７−１０９、１１１−１２０、１９７および１９８に記載されている全長ＰＨ２０ポリペプチドのＣ−末端由来の１個以上のアミノ酸を欠いている。したがって、本明細書において提供される部分的にグリコシル化されたＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、全長野生型ポリペプチド、例えば、配列番号：１０７−１０９、１１１−１２０、１９７および１９８に記載されている配列を有する全長野生型ポリペプチドと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０個またはそれ以上のアミノ酸がＣ−末端短縮され得る。いくつかの例において、配列番号：１０７のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３に対応する３、４、５または６個のＮ−グリコシル化部位がグリコシル化される。他の例において、配列番号：１０７のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６およびＮ２５４に対応する１、２または３個のＮ−グリコシル化部位は、グリコシル化されない。
本明細書において提供される部分的に脱グリコシル化されたＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、１つ以上のグリコシダーゼでの消化により生産することができる。すべてのＮ結合型グリコシル化部位（例えば、配列番号：１０７に例示されているヒトＰＨ２０のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３での部位）がグリコシル化され得るが、グリコシル化の程度は、１つ以上のグリコシダーゼで消化されないヒアルロニダーゼと比較して減少する。したがって、本明細書において提供される部分的に脱グリコシル化されたＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、完全にグリコシル化されたヒアルロニダーゼのグリコシル化のレベルの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％を有し得る。特に、部分的にＮ−グリコシル化されたヒアルロニダーゼは、Ｎ結合型グリコシル化部位のそれぞれで少なくとも１つのＮ−アセチルグルコサミン部分を維持する。いくつかの例において、配列番号：１０７のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３に対応する１、２、３、４、５または６個のＮ−グリコシル化部位は、最小限、１つのＮ−アセチルグルコサミン部分を含む。他の例において、配列番号：１０７のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３に対応する３、４、５または６個のＮ−グリコシル化部位は、３、４、５または６個のＮ−グリコシル化部位のそれぞれで、完全にグリコシル化されたヒアルロニダーゼのグリコシル化のレベルでグリコシル化される。さらなる例において、配列番号：１０７のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３に対応する１、２または３個のＮ−グリコシル化部位は、完全に脱グリコシル化される。これらの例において、一般的に、アミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６またはＮ２５４は、完全に脱グリコシル化される。
典型的な部分的にＮ−グリコシル化されたＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、何らかの種由来のもの、例えば、配列番号：１０７−１０９、１１１−１２０、１９７および１９８のいずれかに記載されているもの、またはそれらの対立遺伝子変異体もしくは他の変異体である。対立遺伝子変異体および他の変異体は当業者に知られており、配列番号：１０７−１２０、１９７および１９８のいずれかまたはそれらの短縮された形態と６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。本明細書において提供される部分的にＮ−グリコシル化されているＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、また、ハイブリッド、融合およびキメラのＰＨ２０ポリペプチドおよびＰＨ２０複合体を含む。例えば、本明細書において提供される部分的に脱グリコシル化されたＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、ポリマー、例えば、デキストラン、ポリエチレングリコール（ペグ化（ＰＥＧ））またはシアリル部分、または他のこのようなポリマー、例えば、天然または糖ポリマーと複合体化し得る。他の例において、部分的にＮ−グリコシル化されたＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、ドメイン、例えば、ＩｇＧ免疫グロブリン由来のＦｃドメインと連結または融合させる。
本明細書において提供されるグリコシル化または部分的に脱グリコシル化Ｃ−末端短縮ポリペプチドに含まれるものは、配列番号：１０７（前駆体ポリペプチド）または１０８（成熟体ポリペプチド）に記載されている野生型ＰＨ２０と比較して２個アミノ酸から４４個のアミノ酸がＣ−末端で短縮されているもの、またはそれらの対立遺伝子または種変異体である。したがって、Ｃ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、グリコシル化された配列番号：１０７のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３に対応する２、３、４、５または６個のＮ−グリコシル化部位を有する、配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列のアミノ酸１からアミノ酸４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６または５０７、または、それらの対立遺伝子または種変異体における対応する位置を含むポリペプチドを生産するＣ−末端切断を有するあらゆるものを含む。哺乳動物細胞において発現されるとき、３５個のアミノ酸のＮ−末端シグナル配列はプロセッシング中に開裂され、タンパク質の成熟形態を分泌する。したがって、本明細書において提供されるものは、グリコシル化される配列番号：１０７のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３に対応する３、４、５または６個のＮ−グリコシル化部位を有する、配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列のアミノ酸３６から４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６または５０７、または、それらの対立遺伝子または種変異体における対応する位置を含む成熟Ｃ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドである。
表２は、グリコシル化または部分的に脱グリコシル化され得る典型的なＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドの非限定的な例を提供する。以下の表２において、前駆体および成熟体ポリペプチドの長さ（アミノ酸において）ならびにＣ−末端を短縮されたＰＨ２０タンパク質の前駆体および成熟体ポリペプチドの典型的なアミノ酸配列が示されている配列識別子（配列番号）が提供される。野生型ＰＨ２０ポリペプチドも、比較のために表２に含まれている。
表２．典型的なＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチド
Figure 0005885765
Figure 0005885765
本明細書において提供されるＮ−グリコシル化された、および部分的に脱グリコシル化されたＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、可溶性である、すなわちＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４溶液の水相へ分配するもの、および不溶性である、すなわちＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４溶液の界面活性剤相へ分配するものを含む。本明細書において提供される部分的に脱グリコシル化されたＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、完全にグリコシル化されたヒアルロニダーゼのグリコシル化のレベルの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％を有し得る。あるいは、部分的に脱グリコシル化されたＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、グリコシル化されていない、配列番号：１０７のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６およびＮ２５４に対応する１、２または３個のＮ−グリコシル化部位を有し得る。最小限、グリコシル化されている、１つのＮ−グリコシル化部位は、少なくとも１つのＮ−アセチルグルコサミン部分を含む。
いくつかの例において、本明細書において提供される部分的にＮ−グリコシル化されたＣ−末端を短縮されたポリペプチドは可溶性であり、すなわち、ＧＰＩに固定されていない。これは、例えば、以下および実施例４に記載される、ＰＩ−ＰＬＣまたはＰＩ−ＰＬＤとのインキュベーション後のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４アッセイを使用して、評価することができる。例えば、配列番号：１０７に記載されているＰＨ２０ポリペプチドのアミノ酸残基位置４９０に対応するアミノ酸位置とそれから５’がＣ−末端短縮されているＰＨ２０ポリペプチドは、一般的に、哺乳動物発現系において発現されるとき、可溶性である（例えば、実施例３参照）。これらのポリペプチドは、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列を完全に欠いている事実のため可溶性である。他の例において、本明細書において提供される部分的にグリコシル化されたＣ−末端を短縮されたポリペプチドは不溶性であり、哺乳動物発現系において発現されるとき膜結合している。例えば、配列番号：１０７に記載されているＰＨ２０ポリペプチドのアミノ酸位置５００に対応するアミノ酸位置とそれから３’Ｃ−末端短縮されているＰＨ２０ポリペプチドは、一般的に、哺乳動物発現系において発現されるとき、不溶性である（例えば、実施例３参照）。本明細書において提供されるＣ−末端短縮ポリペプチドは、配列番号：１０７のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３に対応する３、４、５または６個のＮ−グリコシル化部位がグリコシル化されるように、部分的にグリコシル化され得る。
本明細書において提供される可溶性の部分的にグリコシル化されたＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、短縮されているがＧＰＩアンカー結合シグナルに位置する少なくとも１つ以上のアミノ酸残基を維持しているもの、およびＧＰＩアンカー結合シグナル配列およびω−部位を完全に欠いているものを含む。したがって、ＥＲにおけるタンパク質のＣ−末端に共有結合しているＧＰＩアンカーを有する、および細胞膜の細胞外膜に固定されている代わりに、これらのポリペプチドは分泌される。これらのＣ−末端を短縮された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、３、４、５または６個のＮ−グリコシル化部位がグリコシル化されるように部分的にグリコシル化され得る。典型的なＧＰＩアンカー結合シグナル配列を欠いている可溶性のＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、何らかの種由来のもの、例えば、配列番号：１０７−１０９、１１１−１２０、１９７および１９８のいずれかに記載されているもの、またはそれらの対立遺伝子変異体もしくは他の変異体である。これらの部分的にグリコシル化された可溶性のＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列のアミノ酸１から４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９または５００を含むポリペプチドを生産するようにＣ−末端切断を有する。哺乳動物細胞における発現後のＮ−末端シグナル配列が開裂されると、成熟型の部分的にグリコシル化された可溶性のＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列のアミノ酸３６から４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９または５００を含む。いくつかの例において、Ｃ−末端ＧＰＩアンカーシグナル配列を短縮された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、例えば、配列番号：１０７のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３に対応する３、４、５または６個のＮ−グリコシル化部位で少なくとも１つのＮ−アセチルグルコサミンを含んで部分的にグリコシル化される。他の例において、Ｃ−末端ＧＰＩアンカーシグナル配列を短縮された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、完全にグリコシル化されたヒアルロニダーゼのグリコシル化のレベルの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％を有する。
本明細書において提供されるＧＰＩアンカー結合シグナル配列における少なくとも１個のアミノ酸を維持する部分的に脱グリコシル化されたＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、部分的に脱グリコシル化された延長された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドである。いくつかの例において、部分的に脱グリコシル化されたＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号：１０７のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６およびＮ２５４に対応する１、２または３個のＮ−グリコシル化部位でグリコシル化されていない。これらの部分的に脱グリコシル化された延長された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列のアミノ酸１から４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９または５００を含む。哺乳動物細胞において発現されるとき、３５個のアミノ酸のＮ−末端シグナル配列はプロセッシング中に開裂され、タンパク質の成熟形態を分泌する。したがって、部分的に脱グリコシル化されたｅｓＰＨ２０ポリペプチドの成熟形態は、配列番号：１０７に記載されているアミノ酸配列のアミノ酸３６から４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９または５００を含む。本明細書において提供される部分的にグリコシル化されたｅｓＰＨ２０ポリペプチドの成熟ヒト形態は、配列番号：１０７のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３に対応する３、４、５または６個のＮ−グリコシル化部位で少なくとも１個のＮ−アセチルグルコサミンを含む配列番号：５９−６３または１００−１０４に記載されているものを含む。いくつかの例において、グリコシル化の程度は、エンドグリコシダーゼでの処理により減少する。したがって、本明細書において提供されるＧＰＩアンカー結合シグナル配列において少なくとも１個のアミノ酸を含む部分的に脱グリコシル化されたＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、完全にグリコシル化されたヒアルロニダーゼのグリコシル化のレベルの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％を有し得る。
また、本明細書において提供されるものは、可溶性でなく、すなわち、細胞膜に結合され、したがって発現時に培地に分泌されない、部分的に脱グリコシル化されたＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドである。可溶性でないＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、ヒアルロニダーゼ活性を維持している限り、部分的に脱グリコシル化され得る。典型的な可溶性でない部分的にグリコシル化された成熟型のＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号：１０７のアミノ酸位置３６から５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６または５０７に対応するアミノ酸を含むものである。したがって、本明細書において提供される可溶性でない部分的にグリコシル化されたＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、完全にグリコシル化されたヒアルロニダーゼのグリコシル化のレベルの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％を維持する、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１または４７２アミノ酸長であるもの、例えば、配列番号：５５−５８および９７−９９に記載されているものを含む。いくつかの例において、配列番号：１０７のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３に対応する３、４、５または６個のＮ−グリコシル化部位がグリコシル化される。他の例において、配列番号：１０７のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３に対応する１、２、３、４、５または６個のＮ−グリコシル化部位は、少なくとも１つのＮ−アセチルグルコサミン部分を含む。
本明細書において提供される部分的にグリコシル化されたＣ−末端を短縮されたポリペプチドは、ＰＨ２０の野生型のＧＰＩに固定された形態と比較して、増加または減少しているヒアルロニダーゼ活性を示し得る。さらに、部分的に脱グリコシル化されたＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは中性活性である、すなわち、それらは中性ｐＨでヒアルロニダーゼ活性を維持している。例えば、本明細書において提供されるＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、野生型のＧＰＩに固定された形態により示されるヒアルロニダーゼ活性の１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％またはそれ以上であるヒアルロニダーゼ活性を示し得る。いくつかの例において、部分的にグリコシル化されたＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、野生型のＧＰＩに固定された形態と比較して、ヒアルロニダーゼ活性の増加を示す。
本明細書において提供されるＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、また、Ｎ−グリコシル化され得る。本明細書において提供されるＮ−グリコシル化されたおよび部分的にＮ−グリコシル化されたヒアルロニダーゼは、また、ハイブリッド、融合およびキメラのＮ−グリコシル化されたおよび部分的に脱グリコシル化されたヒアルロニダーゼならびにＮ−グリコシル化されたおよび部分的に脱グリコシル化されたヒアルロニダーゼ複合体を含む。
３．さらなる修飾
本明細書に含まれるＰＨ２０ポリペプチド、例えば、ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチド、Ｎ−グリコシル化されたおよび部分的にＮ−グリコシル化されたＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドならびに部分的にグリコシル化されたＰＨ２０ポリペプチドは、また、化学または翻訳後修飾を含むものおよび化学または翻訳後修飾を含まないものを含む。このような修飾は、ペグ化、シアル化、アルブミン化、グリコシル化、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化および当該分野で知られている他のポリペプチド修飾を含むが、これらに限定されない。したがって、本明細書において提供されるＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチド、例えば、ｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、炭水化物部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、シリル化部分、免疫グロブリンＧ由来のＦｃドメイン、または任意の他のドメインもしくは部分を含むが、これらに限定されない、ポリペプチドの一次配列において、または該一次配列にではない他の修飾を含むことができる。例えば、このようなさらなる修飾は、タンパク質の安定性または血清半減期を増加させることができる。本明細書において提供されるＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチド、例えば、ｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、化学および組換え方法を含む当該分野で知られている任意の方法を使用して、任意の部分と複合体化または融合させることができる（ただし、得られるポリペプチドはヒアルロニダーゼ活性を維持する）。
減少した免疫原性
本明細書において提供されるＰＨ２０ポリペプチド、例えば、ヒトｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、減少した免疫原性を有するように作ることができる。減少した免疫原性は、ポリペプチド由来の抗原エピトープを除去する配列交換により、または翻訳後修飾を変化することによりもたらすことができる。例えば、ポリペプチドが、最小限、配列番号：１０７のアミノ酸残基Ｎ２３５、Ｎ３６８およびＮ３９３で少なくともＮ−アセチルグルコサミンを含む限り、ペプチドのグリコシル化の変化が考えられる。
例えば、ＰＨ２０ポリペプチドは、フコース、特にビフコシル化を欠くように修飾され得る。特に、本明細書において提供されるＰＨ２０ポリペプチドは、ビフコシル化されない。これは、ビフコシル化をもたらさない宿主細胞、一般的に昆虫宿主細胞においてＰＨ２０ポリペプチドを発現し、生産することにより達成することができる。フコースは、多種多様の生物、例えば、哺乳動物、昆虫および植物に存在するデオキシヘキソースである。フコシル化されたグリカンは、フコシルトランスフェラーゼにより合成される。例えば、Ma et al., Glycobiology, 15(2):158R-184R, (2006); Nakayama et al., J. Biol. Chem., 276:16100-16106 (2001);およびSturla et al., Glycobiology, 15(10):924-935 (2005)参照。ヒトにおいて、フコースは、頻繁にグリカン構造に末端修飾として存在し、フコースα１，６−連結Ｎ−アセチルグルコサミンの存在は、糖タンパク質プロセッシングおよび認識において重要であることが示されている。昆虫において、Ｎ−グリカン核構造は、α１，６−およびα１，３−連結でビフコシル化を示す。α１，３−連結での昆虫細胞核フコシル化は、ヒトにおいて免疫原性である炭水化物エピトープを生産する（例えば、米国特許出願第２００７００６７８５５号参照）。例えば、本明細書において提供されるＰＨ２０ポリペプチド、例えば、ｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、ポリペプチドをビフコシル化することができない宿主細胞において生産することができる。したがって、ビフコシル化する昆虫細胞または他の細胞をポリペプチドの発現のために使用することができるが、一般的に哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞を使用する。
いくつかの例において、脱フコシル化された、またはフコース欠損のＰＨ２０ポリペプチドは、真核オリゴ糖プロセッシング遺伝子を含むバキュロウイルス発現ベクターの使用を介して、それにより「哺乳動物化」昆虫細胞発現系を創造する、修飾されたグリコシル化経路を有する昆虫細胞において生産することができる（例えば、米国特許第６，４６１，８６３号参照）。あるいは、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴ３）を欠いている昆虫細胞におけるＰＨ２０ポリペプチドの発現により、抗原性を除去することができる（例えば、米国特許出願第２００７００６７８５５号参照）。他の例において、脱フコシル化された、またはフコース欠損のＰＨ２０ポリペプチドは、例えば、脱フコシル化されたタンパク質を生産する細胞系、例えば、タンパク質フコシル化を欠いているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願第２００３／０１５７１０８号；およびＷＯ２００４／０５６３１２）、およびノックアウト細胞系、例えば、アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)）において生産することができる。
ポリマーへの複合体化
いくつかの例において、本明細書において提供されるｅｓＰＨ２０ポリペプチドおよび他のＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチド、例えば、部分的にグリコシル化されたＰＨ２０ポリペプチドは、ポリマーと複合体化し得る。ＰＨ２０ポリペプチドと複合体化することができる典型的なポリマーは、天然および合成ホモポリマー、例えば、ポリオール（すなわち、ポリ−ＯＨ）、ポリアミン（すなわち、ポリ−ＮＨ２）およびポリカルボン酸（すなわち、ポリ−ＣＯＯＨ）、ならびにさらなるヘテロポリマー、すなわち１つ以上の異なるカップリング基、例えば、ヒドロキシル基およびアミン基を含むポリマーを含む。適当なポリマー分子の例は、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、例えば、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール、ＰＥＧ−グリシジルエーテル（Ｅｐｏｘ−ＰＥＧ）、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ−ＰＥＧ）、分岐ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリ−Ｄ，Ｌ−アミノ酸、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、デキストラン、例えば、カルボキシメチル−デキストラン、ヘパリン、相同アルブミン、セルロース、例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロース、キトサンの加水分解物、デンプン、例えば、ヒドロキシエチル−デンプンおよびヒドロキシプロピル−デンプン、グリコーゲン、アガロースおよびその誘導体、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンタンゴム、カラギーナン、ペクチン、アルギン酸加水分解物およびバイオポリマーから選択されるポリマー分子を含む。
一般的に、ポリマーは、多糖類、例えば、デキストラン、プルランなどと比較して、架橋することができる反応基をほとんど有さない、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、例えば、ポリエチレンオキシド、例えば、ＰＥＧ、一般的にｍＰＥＧである。一般的に、ポリマーは、比較的簡単な化学を使用して、ｅｓＰＨ２０ポリペプチドおよび他のＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドに（例えば、タンパク質表面上の結合基に）共有結合することができる非毒性ポリマー分子、例えば、（メトキシ）ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。
ｅｓＰＨ２０ポリペプチドおよび他のＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドへの結合のための適当なポリマー分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＥＧ誘導体、例えば、メトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＥＧ−グリシジルエーテル（Ｅｐｏｘ−ＰＥＧ）、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ−ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧおよびポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）を含むが、これらに限定されない（例えば、Roberts et al., Advanced Drug Delivery Review 2002, 54: 459-476; Harris and Zalipsky (eds.) “Poly(ethylene Glycol), Chemistry and Biological Applications” ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar et al., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136, 2000; Harris and Chess (2003) Nat Rev Drug Discov. 2(3):214-21;およびTsubery, J Biol. Chem 279(37):38118-24, 2004、参照）。ポリマー分子は、一般的に、約３ｋＤａから約６０ｋＤａの範囲の分子量であり得る。いくつかの態様において、本明細書において提供されるＰＨ２０ポリペプチドと複合体化しているポリマー分子は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０または６０ｋＤａを超える分子量を有する。
ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体を共有結合する（複合体化する）ことによりポリペプチドを修飾する種々の方法（すなわち「ペグ化」）は、当該分野で知られている（例えば、Ｕ．Ｓ．２００６／０１０４９６８、Ｕ．Ｓ．５，６７２，６６２、Ｕ．Ｓ．６，７３７，５０５およびＵ．Ｓ．２００４／０２３５７３４、参照）。ペグ化のための技術は、特殊リンカーおよびカップリング化学（例えば、Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002、参照）、単一の複合体部位への複数のＰＥＧ部分の結合（例えば、分岐ＰＥＧの使用を介する、例えば、Veronese et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002、参照）、部位特異的ペグ化および／またはモノペグ化（例えば、Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999、参照）、および部位特異的酵素的ペグ化（例えば、Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002、参照）を含むが、これらに限定されない（また、例えば、Lu and Felix (1994) Int. J. Peptide Protein Res. 43:127-138; Lu and Felix (1993) Peptide Res. 6:142-6, 1993; Felix et al. (1995) Int. J. Peptide Res. 46:253-64; Benhar et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:13398-404; Brumeanu et al. (1995) J Immunol. 154:3088-95参照;また、Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261-77およびMolineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S参照）。当該分野で記載されている方法および技術は、単一のタンパク質分子に結合される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０を越えるＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体を有するタンパク質を生産することができる（例えば、Ｕ．Ｓ．２００６／０１０４９６８、参照）。
ペグ化のための多数の試薬が当該分野で記載されている。このような試薬は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）活性化ＰＥＧ、スクシンイミジルｍＰＥＧ、ｍＰＥＧ２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｍＰＥＧスクシンイミジルアルファ−メチルブタノエート、ｍＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート、ｍＰＥＧスクシンイミジルブタノエート、ｍＰＥＧカルボキシメチル３−ヒドロキシブタン酸スクシンイミジルエステル、ホモ二官能性(homobifunctional)ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート、ホモ二官能性ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ホモ二官能性ＰＥＧブチルアルデヒド、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧヒドラジド、ｐ−ニトロフェニル−カルボネートＰＥＧ、ｍＰＥＧ−ベンゾトリアゾールカルボネート、プロピオンアルデヒドＰＥＧ、ｍＰＥＧブトリアルデヒド(butryaldehyde)、分岐ｍＰＥＧ２ブチルアルデヒド、ｍＰＥＧアセチル、ｍＰＥＧピペリドン、ｍＰＥＧメチルケトン、ｍＰＥＧ「リンカーなし」マレイミド、ｍＰＥＧビニルスルホン、ｍＰＥＧチオール、ｍＰＥＧオルトピリジルチオエステル、ｍＰＥＧオルトピリジルジスルフィド、Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、ビニルスルホンＰＥＧ−ＮＨＳ、アクリレートＰＥＧ−ＮＨＳ、フルオレセインＰＥＧ−ＮＨＳおよびビオチンＰＥＧ−ＮＨＳを含むが、これらに限定されない（例えば、Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polumers 12:197-207, 1997；Ｕ．Ｓ．５，６７２，６６２；Ｕ．Ｓ．５，９３２，４６２；Ｕ．Ｓ．６，４９５，６５９；Ｕ．Ｓ．６，７３７，５０５；Ｕ．Ｓ．４，００２，５３１；Ｕ．Ｓ．４，１７９，３３７；Ｕ．Ｓ．５，１２２，６１４；Ｕ．Ｓ．５，１８３，５５０；Ｕ．Ｓ．５，３２４、８４４；Ｕ．Ｓ．５，４４６，０９０；Ｕ．Ｓ．５，６１２，４６０；Ｕ．Ｓ．５，６４３，５７５；Ｕ．Ｓ．５，７６６，５８１；Ｕ．Ｓ．５，７９５、５６９；Ｕ．Ｓ．５，８０８，０９６；Ｕ．Ｓ．５，９００，４６１；Ｕ．Ｓ．５，９１９，４５５；Ｕ．Ｓ．５，９８５，２６３；Ｕ．Ｓ．５，９９０、２３７；Ｕ．Ｓ．６，１１３，９０６；Ｕ．Ｓ．６，２１４，９６６；Ｕ．Ｓ．６，２５８，３５１；Ｕ．Ｓ．６，３４０，７４２；Ｕ．Ｓ．６，４１３，５０７；Ｕ．Ｓ．６，４２０，３３９；Ｕ．Ｓ．６，４３７，０２５；Ｕ．Ｓ．６，４４８，３６９；Ｕ．Ｓ．６，４６１，８０２；Ｕ．Ｓ．６，８２８，４０１；Ｕ．Ｓ．６，８５８，７３６；Ｕ．Ｓ．２００１／００２１７６３；Ｕ．Ｓ．２００１／００４４５２６；Ｕ．Ｓ．２００１／００４６４８１；Ｕ．Ｓ．２００２／００５２４３０；Ｕ．Ｓ．２００２／００７２５７３；Ｕ．Ｓ．２００２／０１５６０４７；Ｕ．Ｓ．２００３／０１１４６４７；Ｕ．Ｓ．２００３／０１４３５９６；Ｕ．Ｓ．２００３／０１５８３３３；Ｕ．Ｓ．２００３／０２２０４４７；Ｕ．Ｓ．２００４／００１３６３７；ＵＳ２００４／０２３５７３４；Ｕ．Ｓ．２００５／０００３６０；Ｕ．Ｓ．２００５／０１１４０３７；Ｕ．Ｓ．２００５／０１７１３２８；Ｕ．Ｓ．２００５／０２０９４１６；ＥＰ０１０６４９５１；ＥＰ０８２２１９９；ＷＯ００１７６６４０；ＷＯ０００２０１７；ＷＯ０２４９６７３；ＷＯ９４２８０２４；およびＷＯ０１８７９２５、参照）。
他の修飾
本明細書において提供されるｅｓＰＨ２０ポリペプチドおよび他のＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、また、それらの融合体および複合体を含む。
Ｅ．延長された可溶性ＰＨ２０および他の可溶性ＰＨ２０ヒアルロニダーゼをコードする核酸ならびにそれらのポリペプチドを生産する方法
本明細書に記載されている延長された可溶性ＰＨ２０、Ｃ−末端を短縮されたＰＨ２０ヒアルロニダーゼおよび部分的にグリコシル化されたＰＨ２０ヒアルロニダーゼのポリペプチドならびにこのようなポリペプチドをコードする核酸分子は、組換えタンパク質発現およびタンパク質精製のための当該分野でよく知られている方法により得ることができる。例えば、ＤＮＡは、所望の細胞から精製された、クローン化ＤＮＡから（例えば、ＤＮＡライブラリーから）、化学合成、ｃＤＮＡクローニングまたはゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントのクローニングにより得ることができる。ポリペプチドが組換え手段により生産されるとき、所望の遺伝子をコードする核酸の同定のための当業者に知られているあらゆる手段を使用することができる。当該分野で利用できる任意の方法を、例えば、細胞または組織供給源から所望のＰＨ２０酵素をコードする全長（すなわち、全コード領域を含む）ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを得るために使用することができる。例えば、本明細書において提供される短縮された形態を含む修飾体または変異体は、標準組換えＤＮＡ方法を使用して野生型ポリペプチドから操作することができる。
ポリペプチドは、核酸分子をクローニングおよび単離するための当該分野で知られている利用できる任意の方法を使用して、クローニングまたは単離することができる。このような方法は、核酸のＰＣＲ増幅およびライブラリーのスクリーニング、例えば、核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体ベースのスクリーニングおよび活性ベースのスクリーニングを含む。
核酸の増幅のための方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法は、所望のポリペプチドをコードする核酸分子を単離するために使用することができる。ＰＣＲは、当該分野で知られている任意の方法または手段を使用して実施することができる。典型的なこのような方法は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＣｅｔｕｓサーマルサイクラーおよびＴａｑポリメラーゼ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ）の使用を含む。核酸含有物質を、所望のポリペプチドをコードする核酸分子を単離することができる出発物質として使用することができる。例えば、ＤＮＡおよびｍＲＮＡ調製物、細胞抽出物、適当な供給源（例えば、精巣、前立腺、乳房）由来の組織抽出物、液体サンプル（例えば、血液、血清、唾液）、健常および／または罹患対象由来のサンプルを、増幅方法において使用することができる。供給源は、真核種由来のあらゆるものであり得、脊椎動物、哺乳動物、ヒト、ブタ、ウシ、ネコ、鳥類、ウマ、イヌおよび他の霊長類供給源を含むが、これらに限定されない。核酸ライブラリーは、また、出発物質の供給源として使用することができる。プライマーは、所望のポリペプチドを増幅するように設計することができる。例えば、プライマーは、所望のポリペプチドが生産される発現される配列に基づいて設計することができる。プライマーは、ポリペプチドアミノ酸配列の逆翻訳に基づいて設計することができる。所望により、縮退プライマーを増幅のために使用することができる。所望の配列の３’および５’末端で配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを、核酸サンプルから配列をＰＣＲにより増幅するためにプライマーとして使用することができる。プライマーを、本明細書において提供される全長ＰＨ２０、またはその短縮配列、例えば、可溶性ＰＨ２０ポリペプチドのいずれかをコードする核酸を増幅するために使用することができる。増幅により生産される核酸分子は、シーケンシングし、所望のポリペプチドをコードすることを確認することができる。
合成遺伝子を、ベクター、例えば、タンパク質発現ベクターまたはコアタンパク質をコードするＤＮＡ配列の増幅のために設計されたベクターにクローニングする目的のために、制限エンドヌクレアーゼ部位を含むリンカー配列を含むさらなる核酸配列を、ポリペプチドをコードする核酸分子に結合させることができる。さらに、機能的ＤＮＡエレメントを規定するさらなるヌクレオチド配列を、ポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結することができる。このような配列の例は、細胞内タンパク質発現を促進するように設計されたプロモーター配列、およびタンパク質分泌を容易にするように設計された分泌配列、例えば、異種シグナル配列を含むが、これらに限定されない。このような配列は、当業者に知られている。例えば、典型的な異種シグナル配列は、配列番号：１４４および１４５にそれぞれ記載されているヒトおよびマウスカッパＩｇＧ異種シグナル配列を含むが、これらに限定されない。さらなるヌクレオチド残基配列、例えば、タンパク質結合領域を規定する塩基の配列も、また、酵素をコードする核酸分子に連結させることができる。このような領域は、特定の標的細胞への酵素の取り込みを容易にするか、あるいは、合成遺伝子の産物の薬物動態学を変えるタンパク質を容易にするか、またはコードする残基の配列を含むが、これらに限定されない。
加えて、例えば、ポリペプチドの検出またはアフィニティー精製を助けるために、タグまたは他の部分を加えることができる。例えば、さらなるヌクレオチド残基配列、例えば、エピトープタグまたは他の検出可能なマーカーを規定する塩基の配列も、また、酵素をコードする核酸分子に連結することができる。典型的なこのような配列は、Ｈｉｓタグ（例えば、６×Ｈｉｓ、ＨＨＨＨＨＨ；配列番号：１４２）またはＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号：１４３）をコードする核酸配列を含む。
次に、同定され、単離された核酸を、適当なクローニングベクターに挿入することができる。当該分野で知られている多くのベクター宿主系を使用することができる。可能なベクターは、プラスミドまたは修飾されたウイルスを含み、これらに限定されないが、ベクター系は使用される宿主細胞と適合しなければならない。このようなベクターは、バクテリオファージ、例えば、ラムダ誘導体、またはプラスミド、例えば、ｐＣＭＶ４、ｐＢＲ３２２またはｐＵＣプラスミド誘導体またはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を含むが、これらに限定されない。他の発現ベクターは、本明細書に例示されるＨＺ２４発現ベクター（配列番号：１４０に記載されている）を含む。クローニングベクターへの挿入は、例えば、ＤＮＡフラグメントを相補的な付着末端を有するクローニングベクターにライゲートすることにより達成することができる。ＤＮＡをフラグメントにするために使用される相補的な制限酵素認識部位がクローニングベクターに存在しないとき、ＤＮＡ分子の末端を、酵素的に修飾することができる。あるいは、所望の任意の部位は、ＤＮＡ末端に核酸配列（リンカー）をライゲートすることにより生産することができる。これらのライゲートされるリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学合成されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。代替方法において、開裂されたベクターおよびタンパク質遺伝子は、ホモポリマーテーリングにより修飾することができる。挿入は、ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して達成することができる。
組換え分子は、遺伝子配列の多数のコピーが生産されるように、例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションおよびソノポレーションを介して、宿主細胞に導入することができる。特定の態様において、単離されたタンパク質遺伝子、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ配列を組み込む組換えＤＮＡ分子での宿主細胞の形質転換は、遺伝子の多数のコピーの生産を可能にする。したがって、形質転換体を増殖させ、形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離し、必要なとき、単離された組換えＤＮＡから挿入された遺伝子を回収することにより、遺伝子を多量に得ることができる。
組換え生産に加えて、可溶性ＰＨ２０、例えば、本明細書において提供される任意のｅｓＰＨ２０は、固相技術（例えば、Stewart et al. (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co., San Francisco; Merrifield J (1963) J Am Chem Soc., 85:2149-2154、参照）を使用する直接ペプチド合成により生産することができる。インビトロタンパク質合成は、手動法を使用して、または自動化により行うことができる。自動合成は、例えば、製造業者により提供される指示書にしたがって、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）を使用することにより、達成することができる。ポリペプチドの種々のフラグメントを化学的に別々に合成し、化学方法を使用して組み合わせることができる。
１．ベクターおよび細胞
本明細書に記載されているいずれかのような１つ以上の所望のタンパク質の組換え発現のために、タンパク質をコードするヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含む核酸を、適当な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳のための必要なエレメントを含むベクターに挿入することができる。必要な転写および翻訳シグナルは、また、ＰＨ２０遺伝子の天然プロモーターおよび／またはその隣接領域により提供することができる。
また、酵素をコードする核酸を含むベクターを提供する。ベクターを含む細胞も提供する。細胞は真核および原核細胞を含み、ベクターはその使用のために任意の適したものである。
ベクターを含む、内皮細胞を含む原核および真核細胞を提供する。このような細胞は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞を含む。細胞は、コードされたタンパク質が細胞により発現される条件下で上記細胞を増殖させ、発現されたタンパク質を回収することにより、それらのタンパク質を生産するために使用される。本明細書における目的のために、例えば、延長された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドを含む可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、培地に分泌され得る。
宿主細胞株を、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の様式において発現されたタンパク質を処理する能力について選択することができる。このようなポリペプチドの修飾は、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化を含むが、これらに限定されない。翻訳後プロセッシングは、ポリペプチドのフォールディングおよび／または機能に影響し得る。異なる宿主細胞、例えば、限定しないがＣＨＯ（ＤＧ４４、ＤＸＢ１１、ＣＨＯ−Ｋ１）、ＨｅＬａ、ＭＣＤＫ、２９３およびＷＩ３８は、特異的な細胞機構およびこのような翻訳後活性のための特性メカニズムを有し、導入されるタンパク質の正しい修飾およびプロセッシングを確実にするために選択することができる。一般的に、細胞の選択は、発現されるポリペプチドにＮ結合型グリコシル化を導入することができるものである。したがって、該ベクターを含む真核細胞を提供する。典型的な真核細胞は、哺乳動物チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠失ＣＨＯ細胞（例えば、ＤＧ４４細胞）を、本明細書において提供されるポリペプチドを生産するために使用する。本明細書において提供される延長された可溶性ＰＨ２０またはＣ−末端を短縮されたＰＨ２０の細菌発現は、触媒的に活性なポリペプチドをもたらさないが、適当なグリコシル化機構と組み合わせられたとき、ＰＨ２０は人工的にグリコシル化され得ることに注意する。
天然または異種シグナル配列と結合している、延長された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドおよび他のＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドを含むヒアルロニダーゼポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列、ならびにそれらの多数のコピーを含むベクターを提供する。ベクターは、細胞における酵素タンパク質の発現のために、または酵素タンパク質が分泌タンパク質として発現されるように選択することができる。
種々の宿主−ベクター系が、タンパク質コード配列を発現させるために使用することができる。これらは、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスおよび他のウイルス）に感染した哺乳動物細胞系、ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、微生物、例えば、酵母ベクターを含む酵母、または、バクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌を含むが、これらに限定されない。ベクターの発現エレメントは、強度および特異性を変化する。使用される宿主−ベクター系に依存して、多くの適当な転写および翻訳エレメントの任意の１つを使用することができる。
適当な転写／翻訳調節シグナルおよびタンパク質コード配列を含むキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築するために、ベクターへのＤＮＡフラグメントの挿入のための当業者に知られている任意の方法を使用することができる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡおよび合成技術およびインビボ組換え（遺伝子組換え）を含むことができる。タンパク質、またはそのドメイン、誘導体、フラグメントもしくは相同体をコードする核酸配列の発現は、遺伝子またはそのフラグメントが組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主において発現されるように、第２の核酸配列により調節することができる。例えば、タンパク質の発現は、当該分野で知られている任意のプロモーター／エンハンサーにより調節することができる。特定の態様において、プロモーターは所望のタンパク質に対する遺伝子に由来するものではない。使用することができるプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター（Bernoist and Chambon, Nature 290:304-310 (1981)）、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復に含まれるプロモーター（Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980)）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981)）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)）、原核生物の発現ベクター、例えば、ｂ−ラクタマーゼプロモーター（Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543）またはｔａｃプロモーター（DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)）、Scientific American 242:79-94 (1980)中の“Useful Proteins from Recombinant Bacteria”も参照）、ノパリン合成プロモーターを含む植物発現ベクター（Herrara-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984)）またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター（Gardner et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)）および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター（Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984)）、酵母および他の真菌由来のプロモーターエレメント、例えば、Ｇａｌ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、ならびに組織特異性を示し、トランスジェニック動物において使用されている以下の動物の転写調節領域、膵臓腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Swift et al., Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)）、膵臓ベータ細胞において活性であるインスリン遺伝子調節領域（Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985)）、リンパ球細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子調節領域（Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)）、精巣、乳房、リンパ球および肥満細胞において活性であるマウス乳房腫瘍ウイルス調節領域（Leder et al., Cell 45:485-495 (1986)）、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子調節領域（Pinckert et al., Genes and Devel. 1:268-276 (1987)）、肝臓において活性であるアルファ−フェトプロテイン遺伝子調節領域（Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 1987)）、肝臓において活性であるアルファ−１アンチトリプシン遺伝子調節領域（Kelsey et al., Genes and Devel. 1:161-171 (1987)）、骨髄細胞において活性であるベータグロビン遺伝子調節領域（Magram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986)）、脳の乏突起膠細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987)）、骨格筋において活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域（Shani, Nature 314:283-286 (1985)）、および視床下部の性腺刺激ホルモン分泌細胞において活性であるゴナドトロフィン放出ホルモン遺伝子調節領域（Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986)）を含むが、これらに限定されない。
特定の態様において、ＰＨ２０タンパク質、またはそのドメイン、フラグメント、誘導体または相同体をコードする核酸、１つ以上の複製起点、および、所望により、１つ以上の選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）に作動可能に連結したプロモーターを含むベクターを使用する。発現系に依存して、特異的な開始シグナルも、ＰＨ２０配列の効率的な翻訳のために必要である。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。ＰＨ２０またはその可溶性形態の開始コドンおよび上流配列が適当な発現ベクターに挿入される場合、さらなる翻訳調節シグナルを必要としない。コード配列またはその部分のみを挿入する場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性転写調節シグナルを提供しなければならない。さらに、開始コドンは全挿入物の転写を確実にするように正しいリーディングフレーム内でなければならない。外因性転写エレメントおよび開始コドンは、天然および合成両方の種々の起源であり得る。発現の効率は、使用する細胞系に適当なエンハンサーの包含により増強することができる（Scharf et al. (1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62; Bittner et al. (1987) Methods in Enzymol, 153:516-544）。
典型的な大腸菌細胞の形質転換のためのプラスミドベクターは、例えば、ｐＱＥ発現ベクター（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡから利用できる；系を記載しているＱｉａｇｅｎにより発表された文献も参照）を含む。ｐＱＥベクターは、ファージＴ５プロモーター（大腸菌ＲＮＡポリメラーゼにより認識される）およびしっかりと調節された、大腸菌における組換えタンパク質の高レベル発現を提供するための二重ｌａｃオペレーター抑制モジュール、効率的な翻訳のための合成リボソーム結合部位（ＲＢＳ ＩＩ）、６×Ｈｉｓタグコード配列、ｔ０およびＴ１転写ターミネーター、ＣｏｌＥ１複製起点、ならびにアンピシリン耐性を与えるためのベータ−ラクタマーゼ遺伝子を有する。ｐＱＥベクターは、組換えタンパク質のＮ−またはＣ末端のいずれかで６×Ｈｉｓタグの配置が可能である。このようなプラスミドは、全３つのリーディングフレームに関するマルチクローニングサイトを提供し、Ｎ−末端に６×Ｈｉｓタグのタンパク質の発現を提供する、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ３０およびｐＱＥ３１を含む。他の大腸菌細胞の形質転換のための典型的なプラスミドベクターは、例えば、ｐＥＴ発現ベクター（米国特許４，９５２，４９６参照、ＮＯＶＡＧＥＮ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから利用できる、系を記載しているＮｏｖａｇｅｎにより発表された文献も参照）を含む。このようなプラスミドは、Ｔ７ｌａｃプロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘導性大腸菌ｌａｃオペレーターおよびｌａｃリプレッサー遺伝子を含むｐＥＴ１１ａ、Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーターおよび大腸菌ｏｍｐＴ分泌シグナルを含むｐＥＴ１２ａ−ｃ、ならびにＨｉｓカラムでの精製において使用するためのＨｉｓ−ＴａｇＴＭリーダー配列およびカラムを介した精製後の切断を可能にするトロンビン開裂部位、Ｔ７−ｌａｃプロモーター領域およびＴ７ターミネーターを含むｐＥＴ１５ｂおよびｐＥＴ１９ｂ（ＮＯＶＡＧＥＮ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含む。
典型的な哺乳動物細胞発現のためのベクターは、ＨＺ２４発現ベクターである。ＨＺ２４発現ベクターは、ｐＣＩベクター骨格由来であった（Ｐｒｏｍｅｇａ）。それは、ベータ−ラクタマーゼ耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）、Ｆ１複製起点、サイトメガロウイルス前初期エンハンサー／プロモーター領域（ＣＭＶ）、およびＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０）をコードするＤＮＡを含む。発現ベクターは、また、ＥＣＭＶウイルス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）およびマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を有する。このようなベクターでトランスフェクトされた細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジンの非存在下で化学的に定義された培地で培養し、次にメトトレキサートの増加した濃度でさらに遺伝子増幅を行うことができる。このような方法は、実施例１３および１５において本明細書に記載されている。
２．発現
本明細書において提供されるＰＨ２０ポリペプチド、例えば、ｅｓＰＨ２０ポリペプチドおよびＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、インビボおよびインビトロ方法を含む当業者に知られている任意の方法により生産することができる。所望のタンパク質は、例えば、投与および処置のために必要とされるタンパク質の必要量および形態を生産するために適当な任意の生物において発現させることができる。発現宿主は、原核生物および真核生物、例えば、大腸菌、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞系を含む哺乳動物細胞およびトランスジェニック動物を含む。発現宿主は、それらのタンパク質生産レベルならびに発現されたタンパク質に存在する翻訳後修飾の型において異なり得る。発現宿主の選択は、これらのものおよび他の因子、例えば、法的および安全性考察、生産コストならびに精製のために必要なものおよび精製のための方法に基づいて作ることができる。
多数の発現ベクターが利用でき、当業者に知られており、タンパク質の発現のために使用することができる。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択により影響する。一般的に、発現ベクターは、転写プロモーター、および所望によりエンハンサー、翻訳シグナル、ならびに転写および翻訳終結シグナルを含むことができる。安定な形質転換のために使用される発現ベクターは、一般的に、形質転換細胞の選択および維持を可能にする選択可能なマーカーを有する。いくつかの場合において、複製起点は、ベクターのコピー数を増幅するために使用することができる。
可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチド、例えば、ｅｓＰＨ２０および他のＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドは、また、タンパク質融合物として利用するか、または発現させることができる。例えば、酵素融合物を、酵素にさらなる機能性を加えるために産生することができる。酵素融合タンパク質の例は、シグナル配列、局在のためなどのタグ、例えば、ｈｉｓ６タグもしくはｍｙｃタグ、または精製のためのタグ、例えば、ＧＳＴ融合物、タンパク質分泌および／または膜結合に指向するための配列ならびに半減期を延長するために使用される他の配列の融合物、例えば、Ｆｃ融合物を含む。
組換えタンパク質の長期の高収率生産のために、安定な発現が望まれる。例えば、可溶性ＰＨ２０、例えば、ｅｓＰＨ２０または別のＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドを安定に発現する細胞系を、ウイルス複製起点または内因性発現エレメントおよび選択可能なマーカー遺伝子を含む発現ベクターを使用して形質転換することができる。ベクターの導入後、細胞を富化培地中で１−２日間増殖させ、それらを選択培地に移すことができる。選択可能なマーカーの目的は選択に対する耐性を与え、その存在が導入された配列を成功裏に発現する細胞の増殖および回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性細胞を、細胞型に適当な組織培養技術を使用して急増させることができる。
種々の選択系を形質転換された細胞系を回収するために使用することができる。これらは、ＴＫ−またはＡＰＲＴ−細胞のそれぞれにおいて使用することができる、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler M et al. (1977) Cell, 11:223-32）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy I et al. (1980) Cell, 22:817-23）遺伝子を含むが、これらに限定されない。また、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤耐性を、選択のための基礎として使用することができる。例えば、メトトレキサートに対する耐性を与えるＤＨＦＲ（Wigler M et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci, 77:3567-70）；アミノグリコシド ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を与えるｎｐｔ（Colbere-Garapin F et al. (1981) J. Mol. Biol., 150:1-14）；およびクロロスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼのそれぞれに対する耐性を与えるａｌｓまたはｐａｔを使用することができる。さらなる選択可能な遺伝子、例えば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするｔｒｐＢまたは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用できるようにするｈｉｓＤが記載されている（Hartman SC and RC Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci, 85:8047-51）。アントシアニン、ベータグルクロニダーゼおよびその基質ＧＵＳならびにルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンを含むが、これらに限定されない可視マーカーも、また、形質転換体を同定するために、また、特定のベクター系に起因する一過性の、または安定なタンパク質発現の量を定量するために使用することができる（Rhodes CA et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131）。
可溶性ＰＨ２０ポリペプチド、例えば、ｅｓＰＨ２０、および他のＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドの存在および発現をモニタリングすることができる。例えば、機能性ポリペプチドの検出は、適当な条件下でヒアルロニダーゼ酵素活性のための馴化培地で試験することにより測定することができる。以下のセクションＧは、発現されたタンパク質の溶解度および活性を評価するための典型的なアッセイを提供する。
ａ．原核細胞
原核生物、とりわけ大腸菌は、多量のタンパク質を生産するための系を提供する。大腸菌の形質転換は、当業者によく知られている簡単かつ迅速な技術である。大腸菌のための発現ベクターは、誘導プロモーターを含むことができ、このようなプロモーターは、高レベルのタンパク質発現を誘導するために、宿主細胞にいくらかの毒性を示すタンパク質を発現させるために有用である。誘導プロモーターの例は、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモーターならびに温度調節λＰＬプロモーターを含む。
例えば、本明細書において提供されるもののようなタンパク質は、大腸菌の細胞質環境中で発現させることができる。細胞質は還元環境であり、いくつかの分子に関して、これは不溶性封入体の形成をもたらすことができる。還元剤、例えば、ジチオトレイトールおよびβ−メルカプトエタノールならびに変性剤、例えば、グアニジン−ＨＣｌおよびウレアは、タンパク質を再可溶性にするために使用することができる。代替アプローチは、酸化環境およびシャペロニン様およびジスルフィドイソメラーゼを提供し、可溶性タンパク質の生産をもたらすことができる、細菌のペリプラズム空間におけるタンパク質の発現である。一般的に、タンパク質をペリプラズムに指向するリーダー配列を、発現されるタンパク質と融合させる。次に、リーダーは、ペリプラズム内のシグナルペプチダーゼにより除去される。ペリプラズム標的リーダー配列の例は、ペクチン酸リアーゼ遺伝子由来のｐｅｌＢリーダーおよびアルカリホスファターゼ遺伝子由来のリーダーを含む。いくつかの場合において、ペリプラズム発現は、培養培地への発現されたタンパク質の流出を可能にする。タンパク質の分泌物は、培養上清から迅速かつ簡単な精製が可能である。分泌されないタンパク質は、浸透圧溶解によりペリプラズムから得ることができる。細胞質発現と同様に、タンパク質が不溶性になる場合において、再可溶化およびリフォールディングを容易にするために、変性剤および還元剤を使用することができる。誘導および増殖の温度は、また、発現レベルおよび溶解度に影響し得、一般的に２５℃から３７℃の温度を使用する。一般的に、細菌はグリコシル化タンパク質を生産する。したがって、タンパク質が機能のためにグリコシル化を必要とするとき、宿主細胞から精製後に、グリコシル化をインビトロで加えることができる。
ｂ．酵母細胞
酵母、例えば、出芽酵母、分裂酵母、アルカン資化酵母、キラー酵母およびメタノール資化酵母は、本明細書に記載されているもののようなタンパク質の生産のために使用することができるよく知られている酵母発現宿主である。酵母は、エピソーム複製ベクターで、または相同組換えによる安定な染色体組込みにより形質転換することができる。一般的に、誘導プロモーターを、遺伝子発現を調節するために使用する。このようなプロモーターの例は、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ５ならびにメタロチオネインプロモーター、例えば、ＣＵＰ１、ＡＯＸ１または他のピチア属または他の酵母のプロモーターを含む。発現ベクターは、しばしば、形質転換されたＤＮＡの選択および維持のために選択可能なマーカー、例えば、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３およびＵＲＡ３を含む。酵母において発現されるタンパク質は、しばしば、可溶性である。シャペロニン、例えば、Ｂｉｐおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの共発現は、発現レベルおよび溶解度を改良することができる。さらに、酵母において発現されるタンパク質は、分泌シグナルペプチド融合物、例えば、出芽酵母由来の酵母接合型アルファ因子分泌シグナル、および酵母細胞表面タンパク質、例えば、Ａｇａ２ｐ接合型接着受容体またはアークスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)グルコアミラーゼとの融合物を使用して、分泌を指向することができる。例えば、Ｋｅｘ−２プロテアーゼに関するプロテアーゼ開裂部位を操作して、分泌経路から出るとき、発現されるポリペプチドから融合配列を除去することができる。酵母は、また、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフでグリコシル化することが可能である。
ｃ．昆虫細胞
特にバキュロウイルス発現を使用する、昆虫細胞は、ポリペプチド、例えば、ヒアルロニダーゼポリペプチドを発現するために有用である。昆虫細胞は、高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物により使用されるほとんどの翻訳後修飾が可能である。バキュロウイルスは、安全性を改善し、真核細胞の発現の規制懸念を減少させる限定的な宿主範囲を有する。典型的な発現ベクターは、高レベル発現のためのプロモーター、例えば、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターを使用する。一般的に使用されるバキュロウイルス系は、バキュロウイルス、例えば、キンウワバ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）およびカイコガ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）ならびに昆虫細胞系、例えば、ヨトウガ、夜蛾蛾の幼虫（Ａ７Ｓ）およびオオカバマダラ（ＤｐＮ１）由来のＳｆ９を含む。高レベル発現のため、発現される分子のヌクレオチド配列は、ウイルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合される。哺乳動物分泌シグナルは、昆虫細胞において正確にプロセッシングされ、培養培地に発現されたタンパク質を分泌するために使用することができる。加えて、細胞系、夜蛾の幼虫（Ａ７Ｓ）およびオオカバマダラ（ＤｐＮ１）は、哺乳動物細胞系と同様のグリコシル化パターンでタンパク質を生産する。典型的な昆虫細胞は、免疫原性を減少させるために改変されているもの、例えば、「哺乳動物化」バキュロウイルス発現ベクターを有するものおよび酵素ＦＴ３を欠いているものである。
昆虫細胞における代替発現系は、安定に形質転換された細胞の使用である。細胞系、例えば、Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒ ２（Ｓ２）およびＫｃ細胞（キイロショウジョウバエ）およびＣ７細胞（ヒトスジシマカ）は、発現のために使用することができる。ショウジョウバエメタロチオネインプロモーターは、カドミウムまたは銅での重金属誘導の存在下で高レベルの発現を誘導するために使用することができる。発現ベクターは、一般的に、選択可能なマーカー、例えば、ネオマイシンおよびハイグロマイシンの使用により維持される。
ｄ．哺乳動物細胞
哺乳動物発現系は、可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドを含むタンパク質を発現させるために使用することができる。発現構築物は、ウイルス感染、例えば、アデノウイルスにより、または直接ＤＮＡ導入、例えば、リポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランにより、および物理的方法、例えば、エレクトロポレーションおよび微量注入により、哺乳動物細胞に移すことができる。哺乳動物細胞のための発現ベクターは、一般的に、ｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）およびポリアデニル化エレメントを含む。ＩＲＥＳエレメントは、また、別の遺伝子、例えば、選択可能なマーカーと共に、二シストロン性発現を可能にするために加えることができる。このようなベクターは、しばしば、高レベル発現のための転写プロモーター−エンハンサー、例えば、ＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長末端反復を含む。これらのプロモーター−エンハンサーは、多数の細胞型において活性である。組織および細胞型プロモーターおよびエンハンサー領域は、また、発現のために使用することができる。典型的なプロモーター／エンハンサー領域は、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳房腫瘍ウイルス、アルブミン、アルファフェトプロテイン、アルファ１アンチトリプシン、ベータグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２および性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御のような遺伝子に由来するものを含むが、これらに限定されない。選択可能なマーカーは、発現構築物を有する細胞を選択および維持するために使用することができる。選択可能なマーカー遺伝子の例は、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼを含むが、これらに限定されない。例えば、発現は、ＤＨＦＲ遺伝子を発現する細胞のみを選択するために、メトトレキサートの存在下で実施することができる。細胞表面シグナル伝達分子、例えば、ＴＣＲ−ζおよびＦｃεＲＩ−γとの融合物は、細胞表面上で活性状態のタンパク質の発現を指向することができる。
多数の細胞系を、マウス、ラット、ヒト、サル、ニワトリおよびハムスター細胞を含む哺乳動物発現のために利用することができる。典型的な細胞系は、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０（非分泌）および他の骨髄腫細胞系、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞系、リンパ球、繊維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｓ、２Ｂ８およびＨＫＢ細胞を含むが、これらに限定されない。細胞系は、また、細胞培養培地から分泌されるタンパク質の精製を容易にする血清非含有培地に適用されるものを利用することができる。例えば、ＣＨＯ−Ｓ細胞（Invitrogen, Carlsbad, CA, cat # 11619-012）および血清非含有ＥＢＮＡ−１細胞系（Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42.）を含む。細胞系は、また、最大発現のために最適化された特別な培地において増殖するように適用されたものを利用することができる。例えば、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞は、化学的に定義された動物産物非含有培地中で懸濁培養において増殖するように適用されている。
ｅ．植物
トランスジェニック植物細胞および植物は、本明細書に記載されているもののようなタンパク質を発現させるために使用することができる。発現構築物は、一般的に、直接ＤＮＡ導入、例えば、微粒子銃およびプロトプラストへのＰＥＧ介在導入、およびアグロバクテリウム介在形質転換を使用して植物に導入される。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終結エレメントおよび翻訳調節エレメントを含むことができる。発現ベクターおよび形質転換技術は、通常、双子葉植物宿主、例えば、シロイヌナズナおよびタバコ、ならびに単子葉植物宿主、例えば、トウモロコシおよびイネに分けられる。発現のために使用される植物プロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンセターゼプロモーター、リボース二リン酸カルボキシラーゼプロモーターならびにユビキチンおよびＵＢＱ３プロモーターを含む。選択可能なマーカー、例えば、ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼが、しばしば、形質転換細胞の選択および維持を容易にするために使用される。形質転換された植物細胞は、細胞凝集体（カルス組織）として培養物中で維持することができるか、または植物全体に再生することができる。トランスジェニック植物細胞は、また、ヒアルロニダーゼポリペプチドを生産するように操作された藻類を含むことができる。植物は哺乳動物細胞と異なるグリコシル化パターンを有するため、これらの宿主において生産されるタンパク質の選択に影響し得る。
３．精製技術
可溶性ＰＨ２０、例えば、ｅｓＰＨ２０および他のＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培養からコードされたタンパク質の発現および回収に適当な条件下で培養することができる。組換え細胞により生産されるタンパク質は、一般的に分泌されるが、使用される配列および／またはベクターに依存して細胞内に含まれ得る。当業者により理解されるとおり、ＰＨ２０をコードする核酸を含む発現ベクターは、原核または真核細胞膜を通るＰＨ２０の直接分泌を容易にするシグナル配列を考慮して設計することができる。
したがって、宿主細胞からのポリペプチドの精製のための方法は、選択された宿主細胞および発現系に依存する。分泌される分子に関して、タンパク質は、一般的に、細胞を除去後に培養培地から精製される。細胞内発現に関して、細胞を溶解し、タンパク質を抽出物から精製することができる。トランスジェニック生物、例えば、トランスジェニック植物および動物が発現のために使用されるとき、組織または臓器を出発物質として使用して、溶解した細胞抽出物を作ることができる。さらに、トランスジェニック動物生産は、回収することができるミルクまたは卵におけるポリペプチドの生産を含むことができ、必要なとき、該タンパク質を抽出し、当該分野で標準の方法を使用してさらに精製することができる。
可溶性ＰＨ２０ポリペプチド、例えば、ｅｓＰＨ２０ポリペプチドまたは他のＣ−末端を短縮されたＰＨ２０ポリペプチドのようなタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ分画およびサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿ならびに陰イオン交換のようなイオン交換クロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない当該分野で知られている標準タンパク質精製技術を使用して、精製することができる。アフィニティー精製技術も、また、調製物の効率および純度を改良するために利用することができる。例えば、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ酵素に結合する抗体、受容体および他の分子を、アフィニティー精製において使用することができる。例えば、可溶性ＰＨ２０を、条件培地から精製することができる。
発現構築物は、また、タンパク質、例えば、ｍｙｃエピトープ、ＧＳＴ融合物またはＨｉｓ６を付加するように加工し、それぞれｍｙｃ抗体、グルタチオン樹脂およびＮｉ樹脂とアフィニティー精製することができる。このようなタグは、本明細書において他に記載のない限り、可溶性ＰＨ２０をコードするヌクレオチド配列と結合させることができ、これは可溶性タンパク質の精製を容易にすることができる。例えば、可溶性ＰＨ２０は、タンパク質精製を容易にするために加えられる１つ以上のさらなるポリペプチドドメインを有する組換えタンパク質として発現させることができる。このような精製を容易にするドメインは、固定化金属における精製を可能にする金属キレートペプチド、例えば、ヒスチジン−トリプトファンモジュール、固定化免疫グロブリンにおける精製を可能にするタンパク質ＡドメインおよびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製系（Immunex Corp., Seattle Wash.）において利用されるドメインを含むが、これらに限定されない。精製ドメインと発現されるＰＨ２０ポリペプチド間の開裂可能なリンカー配列、例えば、因子ＸＡまたはエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego, CA）を含むことは、精製を容易にするために有用である。１つのこのような発現ベクターは、可溶性ＰＨ２０を含む融合タンパク質の発現のために提供し、６ヒスチジン残基をコードする核酸、次にチオレドキシンおよびエンテロキナーゼ開裂部位を含む。ヒスチジン残基はＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）における精製を容易にするが、エンテロキナーゼ開裂部位は融合タンパク質からポリペプチドを精製するための手段を提供する。
純度は、ゲル電気泳動、直交ＨＰＬＣ方法、染色および分光光度法を含む当該分野で知られている任意の方法により評価することができる。発現され、精製されたタンパク質は、当業者に知られている任意のアッセイまたは方法、例えば、セクションＧに記載されている任意のものを使用して、分析することができる。これらは、ゲル電気泳動による分析、免疫測定法およびヒアルロニダーゼ活性のアッセイを含むが、これらに限定されない、タンパク質の物理的および／または機能特性に基づくアッセイを含む。
使用される発現系および宿主細胞に依存して、得られるポリペプチドは、生産および精製時に培養培地中に存在するペプチダーゼによって異種であり得る。例えば、ＣＨＯ細胞における可溶性ＰＨ２０の培養は、異種ポリペプチドの混合物をもたらし得る。可溶性ＰＨ２０（例えば、ｒＨｕＰＨ２０）の産生、生産および精製のための典型的なプロトコールは、以下の実施例１３−１５に記載されている。同様に、例えば、配列番号：６０に記載されているアミノ酸配列３６−４９７を有するポリペプチドをコードする核酸の発現は、可変的に４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９で終える、またはより短いポリペプチドを含むポリペプチドの異種混合物をもたらし得る。
Ｆ．延長された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドおよび他の可溶性ＰＨ２０ポリペプチドの製造、製剤化および投与
可溶性ＰＨ２０ポリペプチド、例えば、ｅｓＰＨ２０の医薬組成物は、投与用で本明細書において提供される。可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、別々に製剤化することができ、また、例えば、セクションＧにおいて記載されている他の治療剤の医薬製剤と共に製剤化または投与することができる。化合物は、適当な医薬品、例えば、経口投与のために、溶液、懸濁液、錠剤、分散性錠剤、丸剤、カプセル、粉末、持続放出製剤またはエリキシル剤、ならびに経皮パッチ製剤および乾燥粉末吸入剤に製剤化することができる。一般的に、化合物は、当該分野でよく知られている技術および手段を使用して、医薬組成物に製剤化される（例えば、Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126、参照）。
一般的に、治療有効用量が考慮される。疾患または状態の処置のために投与される選択された可溶性ＰＨ２０の量は、標準臨床技術により決定することができる。加えて、インビトロアッセイおよび動物モデルは、最適な用量範囲を同定するのを助けるために使用することができる。正確な用量は、経験的に決定することができ、特定の酵素、投与経路、処置される疾患の型および疾患の重症度に依存し得る。
したがって、正確な用量および処置期間は、処置される疾患の関数であり、既知の試験プロトコールを使用して経験的に、またはインビボもしくはインビトロ試験データからの外挿によって決定することができると理解される。濃度および用量の値は、また、緩和される状態の重症度で変化し得ることに注意すべきである。任意の特定の対象に対して、特定の投与レジメンは、個々の必要性および組成物を投与するか、または組成物の投与を管理する人の専門的な判断にしたがって時間をかけて調整されるべきであること、および本明細書に記載されている濃度は、単に典型であり、組成物およびそれを含む組合せの範囲または使用を限定する意図はないことをさらに理解すべきである。組成物は、毎時間、毎日、毎週、毎月、毎年または１回投与され得る。一般的に、投与レジメンは、毒性を制限するように選択される。担当医が毒性、または骨髄、肝臓もしくは腎臓または他の組織機能障害によって用量を低下させるために、治療をどのように、いつ、終結、中断または調整するかを知っていることに注意すべきである。逆に、担当医は、また、臨床反応が不適当であるとき（毒性副作用を除く）、処置を、どのように、いつ、より高いレベル調整するかを知っている。
薬学的に許容される組成物は、動物およびヒトにおける使用のための一般的に認識される薬局方にしたがって、監督官庁または他の官庁の承認を考慮して製造される。組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、粉末および持続放出製剤の形態をとることができる。組成物は、従来の結合剤および担体、例えば、トリグリセリドと、坐薬として製剤化することができる。経口製剤は、標準担体、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン酸ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムおよび他のこのような薬剤を含むことができる。製剤は投与経路に適合するべきである。
医薬組成物は、可溶性ＰＨ２０が投与される担体、例えば、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを含むことができる。適当な医薬担体の例は、E. W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。このような組成物は、一般的に、精製された形態における治療有効量の化合物を、患者への適当な投与のための形態を提供するような適当な量の担体と共に含む。このような医薬担体は、滅菌液体、例えば、水および油、例えば、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、ピーナッツオイル、ダイズ油、鉱油およびゴマ油であり得る。医薬組成物が静脈内に投与されるとき、水は典型的な担体である。塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液を、また、特に注射可能な溶液のために、液体担体として使用することができる。組成物は、活性成分と共に、希釈剤、例えば、ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウムまたはカルボキシメチルセルロース、滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびタルク、ならびに結合剤、例えば、デンプン、天然ゴム、例えば、アカシアゴム、ゼラチン、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリジン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドンおよび当業者に知られている他のこのような結合剤を含むことができる。適当な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水およびエタノールを含む。組成物は、また、所望により、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤、例えば、酢酸、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミン、酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミンおよび他のこのような薬剤を含むことができる。
薬学的に治療的に活性化合物およびその誘導体の製剤は、ヒトおよび動物への投与のために、単位投与形態または複数回投与形態で提供される。例えば、化合物は、適当な量の化合物またはその薬学的に許容される誘導体を含む、錠剤、カプセル、丸剤、粉末、顆粒、滅菌非経口溶液または懸濁液、および経口溶液または懸濁液、および水中油型エマルジョンとして製剤化することができる。それぞれの単位投与形態は、必要とされる医薬担体、ビヒクルまたは希釈剤と共に、所望の治療効果を生産するために十分な予め決められた量の治療活性化合物を含む。単位投与形態の例は、アンプルおよびシリンジならびに個々にパッケージされた錠剤またはカプセルを含む。単位投与形態は、画分またはその複数のもので投与することができる。複数回投与形態は、分離された単位投与形態において投与される、単一の容器にパッケージされた複数の同一の単位投与形態である。複数回投与形態の例は、バイアル、錠剤もしくはカプセルのボトルまたはパイントもしくはガロンのボトルを含む。したがって、複数回投与形態は、パッケージング中で分離されていない、複数の単位投与形態である。一般的に、非毒性担体から作られる平衡で０．００５％から１００％の範囲における活性成分を含む投与形態または組成物を、製造することができる。
一般的に本明細書において提供される組成物は、皮下経路による投与のために製剤化されるが、他の投与経路、例えば、当業者に知られている任意の経路、例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮内、病巣内、腹腔内注射、硬膜外、膣、経直腸、局所、耳、経皮投与または任意の経路も考慮される。このような経路に適当な製剤は当業者に知られている。投与は、治療の部位に依存して局所(local)、局所(topical)または全身であり得る。処置を必要とする領域への局所投与は、例えば、限定はしないが、手術の際の局所注入、例えば、術後の創傷被覆材と併用した局所適用、注射、カテーテル、坐薬またはインプラントにより達成することができる。組成物は、また、他の生物学的に活性な剤と共に、連続して、断続的に、また同じ組成物中のいずれかで投与することができる。
任意の場合において最も適当な経路は、種々の因子、例えば、疾患の性質、特定の投与形路に対する対象の耐容性、疾患の重症度および使用される特定の組成物に依存する。一般的に、本明細書において提供される組成物は、非経腸的に投与される。いくつかの例において、可溶性ＰＨ２０組成物は皮膚または組織の間質に達するように投与され、それにより次の治療剤の送達のための間質腔を分解する。したがって、いくつかの例において、皮膚下への、例えば、皮下投与方法による直接投与が考慮される。したがって、１つの例において、局所投与は、注射により、例えば、シリンジまたは注射デバイス、例えば、針を含む他の製品から達成することができる。他の例において、局所投与は、ポンプまたは他の類似のデバイスの使用により容易にされ得る注入により達成することができる。他の投与様式も考慮される。医薬組成物は、それぞれの投与経路に適当な投与形態で製剤化することができる。
投与方法は、分解プロセス、例えば、タンパク質分解ならびに抗原および免疫原性応答を介する免疫学的介入への選択された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドの暴露を減少させるために使用することができる。このような方法の例は、処置部位での局所投与を含む。治療薬のペグ化は、タンパク質分解に対する抵抗性を増加させ、血漿半減期を増加させ、抗原性および免疫原性を減少させることが報告されている。ペグ化方法論の例は、当該分野で知られている（例えば、Lu and Felix, Int. J. Peptide Protein Res., 43: 127-138, 1994; Lu and Felix, Peptide Res., 6: 142-6, 1993; Felix et al., Int. J. Peptide Res., 46 : 253-64, 1995; Benhar et al., J. Biol. Chem., 269: 13398-404, 1994; Brumeanu et al., J Immunol., 154: 3088-95, 1995; see also, Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261-77およびMolineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S、参照）。ペグ化は、また、インビボでの核酸分子の送達において使用することができる。例えば、アデノウイルスのペグ化は、安定性および遺伝子導入を増加させることができる（例えば、Cheng et al. (2003) Pharm. Res. 20(9): 1444-51、参照）。
１．注射可能物質、溶液およびエマルジョン
一般的に皮下に、筋肉内に、静脈内に、または皮内にのいずれかでの注射または注入により特徴付けられる非経口投与が、本明細書において考えられる。注射可能物質は、液体溶液または懸濁液、注射前に液体中の溶液または懸濁液用の適当な固体形態、またはエマルジョンのいずれかとして慣用の形態で製造することができる。適当な賦形剤は、例えば、水、塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールである。医薬組成物は、他の少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解度エンハンサー、および他のこのような薬剤、例えば、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンおよびシクロデキストリンを含み得る。一定レベルの用量が維持されるような徐放または持続放出系の埋め込み（例えば、米国特許第３，７１０，７９５号、参照）も、本明細書において考えられる。このような非経口組成物に含まれる活性化合物のパーセントは、その特定の性質、ならびに化合物の活性および対象の必要性に高度に依存する。
注射可能物質は、局所および全身投与用に設計される。本明細書における目的のために、局所投与は、罹患している間質への直接投与が望ましい。非経口投与のための調製物は、注射用滅菌溶液、皮下錠剤を含む使用直前に溶媒と組み合わせられる用の滅菌乾燥可溶性生成物、例えば、凍結乾燥粉末、注射用滅菌懸濁液、使用直前にビヒクルと組み合わせられる用の滅菌乾燥不溶性生成物および滅菌エマルジョンを含む。溶液は、水性または非水性のいずれかであり得る。静脈内に投与されるとき、適当な担体は、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、および増粘および可溶化剤、例えば、グルコース、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールを含む溶液ならびにそれらの混合物を含む。
非経口調製物において使用される薬学的に許容される担体は、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗菌剤、等張剤、バッファー、抗酸化剤、局所麻酔剤、懸濁および分散剤、乳化剤、金属イオン封鎖またはキレート化剤および他の薬学的に許容される物質を含む。水性ビヒクルの例は、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、等張ブドウ糖注射液、注射用滅菌水、デキストロースおよび乳酸加リンガー液を含む。非水性非経口ビヒクルは、植物起源の固定油、綿実油、コーンオイル、ゴマ油およびピーナッツオイルを含む。静菌または静真菌濃度の抗菌剤を、フェノールまたはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムを含む、複数回投与容器にパッケージングされた非経口調製物に加えることができる。等張剤は、塩化ナトリウムおよびデキストロースを含む。バッファーは、リン酸およびクエン酸を含む。抗酸化剤は、重硫酸ナトリウムを含む。局所麻酔剤は、塩酸プロカインを含む。懸濁および分散剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンを含む。乳化剤は、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ８０）を含む。金属イオンの金属イオン封鎖またはキレート化剤は、ＥＤＴＡを含む。医薬担体は、また、水混和性ビヒクルのためのエチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール、およびｐＨ調整のための水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸を含む。
薬学的に活性な化合物の濃度は、注射または注入が、所望の薬理学的効果、例えば、血糖コントロールを生じるために有効量を提供するように調整される。正確な用量は、当該分野で知られているとおり、患者または動物の年齢、体重および状態に依存する。単位用量非経口調製物は、例えば、アンプル、カートリッジ、バイアルまたは針を備えたシリンジ中にパッケージされ得る。薬学的に活性な化合物を含む液体溶液または再構成された粉末調製物の容量は、処置される疾患とパッケージのために選択される特定の製品の相関関係である。非経口投与のためのすべての調製物は、当該分野で知られ、実施されているように滅菌されなければならない。
１つの例において、医薬品は、液体形態、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液であり得る。液体形態において提供されるとき、医薬品は、使用前に治療有効濃度に希釈される濃縮調製物として提供され得る。このような液体調製物は、薬学的に許容される添加物、例えば、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステルまたは分画植物油）；および防腐剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を使用して、慣用の手段により製造することができる。他の例において、医薬品は、使用前に水または他の適当なビヒクルで再構成するための凍結乾燥形態で存在することができる。
凍結乾燥粉末
本明細書において興味あるものは凍結乾燥粉末であり、これは、溶液、エマルジョンおよび他の混合物として投与のために再構成することができる。それらは、また、固体またはゲルとしても再構成され、製剤化され得る。
滅菌凍結乾燥粉末は、不活性な酵素の化合物をバッファー溶液に溶解することにより製造される。バッファー溶液は、粉末または粉末から製造された再構成された溶液の安定性または他の薬理学的要素を改善する賦形剤を含み得る。次に溶液の滅菌濾過、次に当業者に知られている標準条件下での凍結乾燥により、所望の製剤を提供する。簡潔には、凍結乾燥粉末は、賦形剤、例えば、デキストロース、ソルビトール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロースまたは他の適当な薬剤を、適当なバッファー、例えば、クエン酸、リン酸ナトリウムもしくはカリウムまたは当業者に知られている他のこのようなバッファーに溶解することにより製造される。次に、選択された酵素を得られた混合物に加え、溶解するまで撹拌する。得られた混合物を、微粒子を除去し、無菌性を確実にするために滅菌濾過または処理し、凍結乾燥のためのバイアルに分配する。それぞれのバイアルは、化合物の単回用量または複数回用量を含む。凍結乾燥粉末は、適当な条件下、例えば、約４℃から室温で保存することができる。適当なバッファー溶液でのこの凍結乾燥粉末の再構成により、非経口投与における使用のための製剤を提供する。
２．局所投与
局所混合物は、局所および全身投与に関して記載されているとおりに製造される。得られた混合物は、溶液、懸濁液、エマルジョンなどであり得、クリーム、ゲル、軟膏、エマルジョン、溶液、エリキシル剤、ローション、懸濁液、チンキ剤、ペースト、泡状物、エアロゾル、洗浄剤、噴霧剤、坐薬、包帯、皮膚パッチまたは局所投与のために適当な他のあらゆる剤形として製剤化される。
化合物またはその薬学的に許容される誘導体は、例えば、吸入による局所適用のためのエアロゾルとして製剤化され得る（例えば、米国特許第４，０４４，１２６，４，４１４，２０９および４，３６４，９２３号参照、これらは炎症性疾患、特に喘息の処置のために有用なステロイドの送達のためのエアロゾルを記載している）。呼吸管への投与のためのこれらの製剤は、単独または不活性担体、例えば、ラクトースと組み合わせて、噴霧器のためのエアロゾルまたは溶液の形態中で、または吸入のための超微粒粉末としてであり得る。このような場合において、製剤の粒子は、一般的に、５０ミクロン未満または１０ミクロン未満の直径を有する。
化合物は、ゲル、クリームおよびローションの形態で、局所適用、例えば、皮膚および、例えば、眼における粘膜への局所適用、および眼への適用または嚢内もしくは髄腔内適用のために製剤化することができる。局所投与は、経皮送達用、また、眼または粘膜への投与用、または吸入治療用に考慮される。活性化合物の経鼻溶液は、また、単独または他の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、投与することができる。
経皮投与に適当な製剤を提供する。それらは、任意の適当な形式、例えば、レシピエントの表皮と長期間密接に接触したままにするように適合された個別のパッチで提供することができる。このようなパッチは、例えば、活性化合物に対して０．１から０．２Ｍの濃度の所望により緩衝された水溶液中に活性化合物を含む。経皮投与に適当な製剤は、また、イオン導入により送達することができ（例えば、Pharmaceutical Research 3(6):318 (1986)、参照）、一般的に所望により活性化合物の緩衝された水溶液の形態をとる。
３．他の投与経路のための組成物
処置される状態に依存して、他の投与経路、例えば、局所適用、経皮パッチ、経口および経直腸投与も、本明細書において考えられる。例えば、経直腸投与用の医薬投与形態は、全身効果のための経直腸坐薬、カプセルおよび錠剤である。経直腸坐薬は、体温で融解または軟化し、１種以上の薬理学的または治療活性成分を放出する、直腸への挿入のための固形物を含む。経直腸坐薬において利用される薬学的に許容される物質は、融点を上げるための基剤またはビヒクルおよび薬物である。基剤の例は、ココアバター（カカオ油）、グリセリン−ゼラチン、カルボワックス（ポリオキシエチレングリコール）ならびに脂肪酸のモノ、ジおよびトリグリセリドの適当な混合物を含む。種々の基剤の組合せが使用され得る。坐薬の融点を上げるための薬物は鯨ろうおよびワックスを含む。経直腸坐薬は、圧縮法または鋳造のいずれかにより製造され得る。経直腸坐薬の典型的な重量は、約２から３ｇｍである。経直腸投与用の錠剤およびカプセルは、同じ薬学的に許容される物質を使用して、経口投与用の製剤と同じ方法により製造される。
経直腸投与に適当な製剤は、単位用量坐薬として提供され得る。これらは、活性化合物を１種以上の慣用の固体担体、例えば、ココアバターと混合し、次に得られた混合物を成形することにより製造することができる。
経口投与のために、医薬組成物は、慣用の手段により、薬学的に許容される賦形剤、例えば、結合剤（例えば、プレゼラチン化メイズデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ポテトデンプンまたはグリコール酸ナトリウムデンプン）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）と製造される、例えば、錠剤またはカプセルの形態を取ることができる。錠剤は、当該分野でよく知られている方法によりコーティングすることができる。
経口内（舌下）投与に適当な製剤は、例えば、風味付けされた基剤、通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に活性化合物を含むドロップ、および不活性基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシア中に該化合物を含むトローチを含む。
医薬組成物は、また、制御放出製剤および／または送達デバイスにより投与することができる（例えば、米国特許第３，５３６，８０９、３，５９８，１２３、３，６３０，２００、３，８４５，７７０、３，８４７，７７０、３，９１６，８９９、４，００８，７１９、４，６８７，６１０、４，７６９，０２７、５，０５９，５９５、５，０７３，５４３、５，１２０，５４８、５，３５４，５６６、５，５９１，７６７、５，６３９，４７６；５，６７４，５３３および５，７３３，５６６号、参照）。
リポソームへのカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現することができる組換え細胞、受容体介在エンドサイトーシス、および選択された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドをコードする核酸分子の送達、例えば、レトロウイルス送達系を含むが、これらに限定されない種々の送達系が知られており、選択された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドを投与するために使用することができる。
したがって、特定の態様において、リポソームおよび／またはナノ粒子は、また、可溶性ＰＨ２０ポリペプチドの投与で使用することができる。リポソームは、水性媒体中に分散され、多重膜同心性二層小胞(multilamellar concentric bilayer vesicle)（多重膜小胞(multilamellar vesicles)（ＭＬＶ）とも称される）を自発的に形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶは、一般的に、２５ｎｍから４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、コア中に水溶液を含む２００から５００オングストロームの範囲の直径を有する小さな一枚膜小胞(small unilamellar vesicle)（ＳＵＶ）の形成をもたらす。
リン脂質は、水中に分散されるとき、脂質対水のモル比に依存してリポソーム以外の種々の構造を形成し得る。低い比で、リポソームを形成する。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度および二価の陽イオンの存在に依存する。リポソームは、イオン性および極性物質に対して低い透過性を示すが、高温で著しく透過性が変化する相転移を受け得る。相転移は、ゲル状態として知られているぎっしり詰まっており規則正しい構造から、流体状態として知られているゆるく充填された、あまり規則正しくない構造への変化を含む。これは、特有の相転移温度で起こり、イオン、糖および薬物に対する透過性の増加をもたらす。
リポソームは、異なるメカニズム、細網内皮系の食細胞、例えば、マクロファージおよび好中球によるエンドサイトーシス、非特異的な弱い疎水性もしくは静電気力、または細胞表面成分との特異的相互作用のいずれかによる、細胞表面への吸着、細胞膜へのリポソームの脂質二重層の挿入による細胞膜との融合と、リポソーム内容物の細胞質への同時放出、および、リポソーム内容物と何ら関連のない細胞またはオルガネラ膜へのリポソーム脂質の移動、またはその逆を介して細胞と相互作用する。種々のリポソーム製剤は、作動するメカニズムを変えることができ、１つ以上を同時に作動することができる。ナノカプセルは、一般的に、安定かつ再現性のある方法において化合物を封入することができる。細胞内ポリマー過負荷による副作用を回避するために、このような超微粒子（約０．１μｍのサイズ）は、インビボで分解され得るポリマーを使用して設計されるべきである。これらの必要条件に合う生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が本明細書における使用のために考慮され、このような粒子は容易に作ることができる。
４．用量および投与
本明細書において提供される可溶性ＰＨ２０ポリペプチド、例えば、ｅｓＰＨ２０は、単回投与または複数回投与のための医薬組成物として製剤化することができる。選択されるヒアルロナン分解酵素は、処置される患者に望ましくない副作用の非存在下で治療的に有用な効果を発揮するために十分な量で含まれる。治療的に有効な濃度は、既知のインビトロおよびインビボ系においてポリペプチドを試験することにより、例えば、本明細書において提供される、または当該分野で知られているアッセイを使用することにより、経験的に決定し（例えば、Taliani et al. (1996) Anal. Biochem., 240: 60-67; Filocamo et al. (1997) J Virology, 71: 1417-1427; Sudo et al. (1996) Antiviral Res. 32: 9-18; Buffard et al. (1995) Virology, 209:52-59; Bianchi et al. (1996) Anal. Biochem., 237: 239-244; Hamatake et al. (1996) Intervirology 39:249-258; Steinkuhler et al. (1998) Biochem., 37:8899-8905; D'Souza et al. (1995) J Gen. Virol., 76:1729-1736; Takeshita et al. (1997) Anal. Biochem., 247:242-246参照;また、例えば、Shimizu et al. (1994) J. Virol. 68:8406-8408; Mizutani et al. (1996) J. Virol. 70:7219-7223; Mizutani et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun., 227:822-826; Lu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci (USA), 93:1412-1417; Hahm et al., (1996) Virology, 226:318-326; Ito et al. (1996) J. Gen. Virol., 77:1043-1054; Mizutani et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun., 212:906-911; Cho et al. (1997) J. Virol. Meth. 65:201-207参照）、次にそれからヒトに対する用量を推定することができる。
一般的に、可溶性ＰＨ２０酵素の治療有効用量は、安定化溶液または懸濁液または凍結乾燥形態中で、１０ユニット（Ｕ）から５００，０００ユニット、１００ユニットから１００，０００ユニット、５００ユニットから５０，０００ユニット、１０００ユニットから１０，０００ユニット、５０００ユニットから７５００ユニット、５０００ユニットから５０，０００ユニット、または１，０００ユニットから１０，０００ユニット、一般的に１，０００から５０，０００ユニットであるか、またはほぼ前記のユニットである。製剤は、例えば、アンプル、シリンジおよび個々にパッケージされた錠剤またはカプセルを含むが、これらに限定されない単位用量形態で提供することができる。分散剤は、０．１−１００ｍｌ、１−５０ｍｌ、１０−５０ｍｌ、１０−３０ｍｌ、１−２０ｍｌ、または１−１０ｍｌ、一般的に１０−５０ｍｌの全容量中で、単独または他の薬理学的に有効な薬剤または治療剤と共に投与することができる。
例えば、可溶性ＰＨ２０、例えば、ｅｓＰＨ２０は、１０Ｕ、２０Ｕ、３０Ｕ、４０Ｕ、５０Ｕ、１００Ｕ、１５０Ｕ、２００Ｕ、２５０Ｕ、３００Ｕ、３５０Ｕ、４００Ｕ、４５０Ｕ、５００Ｕ、６００Ｕ、７００Ｕ、８００Ｕ、９００Ｕ、１０００Ｕ、２，０００Ｕ、３，０００Ｕ、４，０００ユニット、５，０００Ｕまたはそれ以上であるか、またはほぼ前記のユニットで皮下に投与することができる。いくつかの例において、用量は、可溶性ＰＨ２０ 対 投与される治療剤の量の比率として提供することができる。例えば、可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、１ヒアルロニダーゼＵ／治療剤Ｕ（１：１）から５０：１またはそれ以上、例えば、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１またはそれ以上で、またはほぼ前記の比率で投与することができる。一般的に、本明細書において考えられる可溶性ＰＨ２０の注射または注入の体積は、０．０１ｍＬ、０．０５ｍＬ、０．１ｍＬ、０．２ｍＬ、０．３ｍＬ、０．４ｍＬ、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、６ｍＬ、７ｍＬ、８ｍＬ、９ｍＬ、１０ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍｌまたはそれ以上で、またはほぼ前記のｍＬである。可溶性ＰＨ２０は、１００Ｕ／ｍｌ、１５０Ｕ／ｍｌ、２００Ｕ／ｍｌ、３００Ｕ／ｍｌ、４００Ｕ／ｍｌ、５００Ｕ／ｍｌ、６００Ｕ／ｍｌ、８００Ｕ／ｍＬまたは１０００Ｕ／ｍｌで、またはほぼ前記のＵ／ｍｌで貯蔵溶液として提供でき、また直接的使用のため、または使用の前に有効な濃度に希釈のための、さらなる濃縮形態、例えば、２０００Ｕ／ｍｌ、３０００ユニット／ｍｌ、４０００Ｕ／ｍｌ、５０００Ｕ／ｍｌ、８０００Ｕ／ｍｌ、１０，０００Ｕ／ｍＬまたは２０，０００Ｕ／ｍＬで、またはほぼ前記のＵ／ｍｌで提供できる。可溶性ＰＨ２０は、液体または凍結乾燥製剤として提供することができる。
５．パッケージング、製品およびキット
可溶性ＰＨ２０ポリペプチド、例えば、ｅｓＰＨ２０またはこのようなポリペプチドをコードする核酸、それらの誘導体または変異体の医薬化合物は、パッケージング材料、疾患または障害を処置するために有効である医薬組成物、および可溶性ＰＨ２０または核酸分子が疾患または障害を処置するために使用されることを示すラベルを含む製品としてパッケージされ得る。選択される可溶性ＰＨ２０ヒアルロニダーゼまたはその誘導体または変異体および治療剤の組合せも、製品においてパッケージされ得る。
本明細書において提供される製品は、パッケージング材料を含む。パッケージング医薬品における使用のためのパッケージング材料は、当業者によく知られている。例えば、米国特許第５，３２３，９０７、５，０５２，５５８および５，０３３，２５２号、参照、これらそれぞれをその全体において本明細書に包含させる。医薬パッケージング材料の例は、ブリスターパック、ボトル、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ、ボトル、ならびに選択される製剤および意図される投与経路および処置に適当なあらゆるパッケージング材料を含むが、これらに限定されない。製品は、局所注射目的のために投与（例えば、表皮下投与）を容易にするように、針または他の注射デバイスを含むことができる。可溶性ＰＨ２０、例えば、ｅｓＰＨ２０および特定の疾患または障害を処置することが知られている治療剤を含む、本明細書において提供される化合物および組成物の多様な製剤が考えられる。パッケージの選択は、可溶性ＰＨ２０および／または治療剤、ならびにこのような組成物が一緒に、または別々にパッケージされるか否かに依存する。１つの例において、可溶性ＰＨ２０は、治療剤との混合物としてパッケージされ得る。他の例において、該成分は別々の組成物としてパッケージされ得る。
選択される可溶性ＰＨ２０ポリペプチド、例えば、ｅｓＰＨ２０ポリペプチド、その治療剤および／または製品も、キットとして提供することができる。キットは、本明細書に記載されている医薬組成物および製品として提供される投与のための物を含むことができる。例えば、可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、投与のためのデバイス、例えば、シリンジ、吸入器、用量カップ、点滴器またはアプリケーターと提供することができる。組成物は、投与のための物に含まれていてもよく、または後で加えられるために別々に提供されてもよい。キットは、所望により、投与、投与レジメンを含む適用のための指示書および投与様式の指示書を含み得る。キットは、また、本明細書に記載されている医薬組成物および診断のための物を含むことができる。例えば、このようなキットは、対象における選択されたプロテアーゼの濃度、量または活性を測定するための物を含むことができる。
Ｇ．アッセイ
本明細書において提供される可溶性ＰＨ２０ポリペプチド、例えば、ｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、可溶性であり、ヒアルロニダーゼ酵素活性を維持する。本明細書において提供されるＮ−グリコシル化された、または部分的にＮ−グリコシル化されたＰＨ２０ポリペプチドは、ヒアルロニダーゼ酵素活性を維持する。本明細書において提供されるＰＨ２０の活性は、Ｃ−末端短縮または部分的にＮ−グリコシル化されていない対応するＰＨ２０の活性と比較して、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上で、またはほぼ前記％である。可溶性ＰＨ２０ヒアルロニダーゼポリペプチド、例えば、ｅｓＰＨ２０の活性は、当該分野でよく知られている方法を使用して評価することができる。これらの方法は、例えば、マイクロ濁度アッセイおよびビオチン化ヒアルロン酸を使用するマイクロタイターアッセイを含む。活性および評価は、馴化培地または上清または精製されたタンパク質で実施することができる。タンパク質の溶解度も、また、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４分配アッセイにより測定することができる。すべてのアッセイにおいて、可溶性ＰＨ２０の活性または溶解度を対照、例えば、Ｃ−末端切断のない全長ＰＨ２０と比較することができる。
１．ヒアルロニダーゼ活性
可溶性ＰＨ２０ポリペプチドの活性は、当該分野でよく知られている方法を使用して評価することができる。例えば、ヒアルロニダーゼに対するＵＳＰ ＸＸＩＩアッセイは、酵素を３０分３７℃でＨＡと反応させた後に残存する非分解ヒアルロン酸またはヒアルロナン、（ＨＡ）基質の量を測定することにより間接的に活性を測定する（USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD）。ヒアルロニダーゼ参照標準（ＵＳＰ）または国民医薬品集（ＮＦ）標準ヒアルロニダーゼ溶液を、任意のヒアルロニダーゼの、ユニットにおける活性を確認するためのアッセイにおいて使用することができる。
１つの例において、活性は、実施例１２に記載されているマイクロ濁度アッセイを使用して測定される。これは、ヒアルロン酸が血清アルブミンと結合するときの不溶性沈殿の形成に基づく。活性は、ヒアルロニダーゼをヒアルロン酸ナトリウム（ヒアルロン酸）と一定期間（例えば、１０分）インキュベートし、次に未消化ヒアルロン酸ナトリウムを酸性血清アルブミンの添加で沈澱させることにより測定される。得られるサンプルの濁度は、さらなる発達期間の後に、６４０ｎｍで測定される。ヒアルロン酸ナトリウム基質に対するヒアルロニダーゼ活性に起因する濁度の減少は、ヒアルロニダーゼ酵素活性の基準である。
他の例において、ヒアルロニダーゼ活性は、ヒアルロニダーゼとのインキュベーション後に残存するビオチン化ヒアルロン酸を測定するマイクロタイターアッセイを使用して測定される（例えば、Frost and Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269、米国特許公報第２００５０２６０１８６号、参照）。実施例４において、短縮されているヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのヒアルロニダーゼ活性は、ビオチン化ヒアルロン酸を使用して測定される。ヒアルロン酸のグルクロン酸残基上の遊離カルボキシル基をビオチン化し、ビオチン化ヒアルロン酸基質をマイクロタイタープレートと共有結合させる。ヒアルロニダーゼとのインキュベーション後、アビジン−ペルオキシダーゼ反応を使用して、残存するビオチン化ヒアルロン酸基質を検出し、既知の活性のヒアルロニダーゼ標準との反応後に得られたものと比較する。基質がマイクロタイタープレートと共有結合しているとき、人工産物、例えば、ビオチン化基質のｐＨ−依存移動が生じない。感度は、１０％未満のアッセイ間変動で培養細胞および生物学的サンプルからヒアルロニダーゼ活性の迅速な測定を可能にする。
ヒアルロニダーゼ活性を測定するための他のアッセイも当該分野で知られており、本明細書における方法において使用することができる（例えば、Delpech et al., (1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi et al., (2003) Anal. Biochem. 322:257-263、参照）。
多数のヒアルロニダーゼアッセイは、新規の還元Ｎ−アセチルアミノ基の生産（Bonner and Cantey, Clin. Chim. Acta 13:746-752, 1966）、または粘度（De Salegui et al., Arch. Biochem. Biophys.121:548-554, 1967）もしくは濁度の喪失（Dorfman and Ott, J. Biol. Chem. 172:367, 1948）の測定に基づいている。精製された基質で、すべてのこれらの方法は、エンド型グルコサミド(endoglucosamidic)活性の存在または非存在の決定に十分である。
実質的に精製されたグリコサミノグリカン基質も、また、ゲルシフトアッセイにおいて使用することができる。グリコサミノグリカンを組換えＰＨ２０、例えば、可溶性ＰＨ２０と混合し、ゲル内の基質移動度の変化をもたらすエンドグルコシダーゼ活性について試験する。典型的なこのような基質は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌから得ることができる、コンドロイチン−４および６硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸を含むが、これらに限定されない。ヒト臍帯ヒアルロナンは、ＩＣＮから得ることができる。例えば、それぞれの試験基質は、ｐＨ３．５−７．５のバッファー中で０．ｌｍｇ／ｍｌに、またはほぼ前記ｍｇ／ｍｌに希釈することができる。このような典型的なアッセイにおいて、ＰＨ２０を発現する細胞からの精製された可溶性ＰＨ２０または馴化培地の１０μｌまたはほぼ前記のμｌのサンプルを、所望のバッファー中の９０μｌまたはほぼ前記のμｌの試験基質と混合し、３時間３７℃でインキュベートすることができる。インキュベーション後、サンプルをサンプルバッファー（Ｔｒｉｓ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、ブロモフェノールブルーおよびグリセロール）で中性にし、電気泳動に付す。グリコサミノグリカンは、当該分野で知られている任意の方法を使用して検出することができ、例えば、グリコサミノグリカンは、一晩、３％の氷酢酸中の０．５％のＡｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅを使用するゲルの染色、次に７％の氷酢酸における脱染色により検出することができる。分解は、酵素の存在または非存在における基質移動度の比較により決定される。
ヒアルロニダーゼ活性は、また、基質ゲル酵素電気泳動により検出することができる（Guentenhoner et al., 1992, Matrix 388-396）。このアッセイにおいて、サンプルをヒアルロン酸を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに付し、サンプル中のタンパク質を電気泳動法により分離する。次にゲルを酵素アッセイバッファー中でインキュベートし、次にゲル中のヒアルロン酸を検出するために染色する。ヒアルロニダーゼ活性は、基質ゲルにおける除去されたゾーンとして視覚化される。
可溶性ＰＨ２０ポリペプチドが展着剤または拡散剤として作用する能力も評価することができる。例えば、トリパンブルー色素を可溶性ＰＨ２０と共に、または伴わずに、ヌードマウスの各側面の側面皮膚中に皮下注射することができる。次に、色素領域を、例えば、マイクロメーターカリパスを用いて、測定し、ヒアルロナン分解酵素が展着剤として作用する能力を決定する（米国特許第２００６０１０４９６８号）。ヒアルロニダーゼの他の薬剤、例えば、治療剤との共投与のその薬剤の薬物動態学および薬物動力学特性に対する効果も、例えば、臨床試験の設定において動物モデルおよび／またはヒト対象を使用してインビボで評価することができる。
可溶性ＰＨ２０、例えば、ｅｓＰＨ２０の機能活性は、これらの任意のアッセイを使用して参照標準と比較および／または標準化することができる。可溶性ＰＨ２０の機能的に同等な量を決定することができる。例えば、展着剤または拡散剤として作用する可溶性ＰＨ２０の能力は、マウスの側面の皮膚へトリパンブルーと共に注入することにより評価でき、例えば、１００ユニットのヒアルロニダーゼ参照標準と同じ量の拡散を達成するために必要な量を決定することができる。したがって、必要な可溶性ＰＨ２０の量は、１００ユニットのヒアルロニダーゼと機能的に同等な量である。
２．溶解度
ヒアルロニダーゼの溶解度は、当業者に知られている任意の方法により測定することができる。溶解度を測定するための１つの方法は、界面活性剤による分配である。例えば、可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、例えば、３７℃でのＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４溶液の水相への分配により、識別することができる（Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-1607）。例えば、本明細書に記載されているＰＨ２０ポリペプチドの溶解度は、実施例４に記載されているとおりに評価される。膜に固定されたヒアルロニダーゼ、例えば、脂質に固定されたヒアルロニダーゼ、例えば、ＧＰＩに固定されたヒアルロニダーゼは、界面活性剤の豊富な相に分配するが、ホスホリパーゼ−Ｃで処理した後は、界面活性剤の乏しい相または水相に分配する。ホスホリパーゼＣは、ＧＰＩに固定されたタンパク質において見出されるホスホ−グリセロール結合を開裂する酵素である。ＰＬＣでの処理は、細胞膜の外側からＧＰＩ連結タンパク質の放出を引き起こす。
溶解度を評価するための別の方法は、ＰＨ２０ポリペプチドがＧＰＩに固定されているか、否かを測定することである。ＧＰＩに固定されたＰＨ２０ポリペプチドは、細胞膜に結合しており、したがって不溶性である。ＰＨ２０ポリペプチドがＧＰＩに固定されているか否かを測定するために、１つはＰＬＣ／ＰＬＤ加水分解前後の溶解度を評価する、また、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列を同定するための予測アルゴリズムを使用することができる。ＧＰＩに固定されたタンパク質は、界面活性剤分配（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４）、抗体認識および代謝放射性標識と共に、特異的な酵素的または化学的開裂後の可溶化により同定することができる。
タンパク質がＧＰＩアンカーを有することを証明するために使用される一般的な方法は、細菌ＰＩ−ＰＬＣまたはトリパノソーマ由来ＧＰＩ−特異的ホスホリパーゼＣ（ＧＰＩ−ＰＬＣ）で処理することによる細胞表面からのその放出またはその可溶化である。これらの酵素は、膜におけるジアシルグリセロールを開裂し、タンパク質上に免疫反応性グリカンエピトープ（ＣＲＤ）を生産し、これはトリパノソーマのＧＰＩに対して生産された抗体でのウエスタンブロット法により検出することができる。とりわけ哺乳動物細胞において遭遇するこのアプローチでの１つの一般的な問題は、リパーゼはイノシトールがアシル化されているＧＰＩアンカーを開裂することができないことである。これらは、弱アルカリでの処理前にイノシトール環上の脂肪酸を除去することが必要である。あるいは、血清由来ＧＰＩ−特異的ホスホリパーゼＤは、ＧＰＩアンカーを開裂するために使用することができる。この酵素はイノシトール環とホスファチジン酸部分間を開裂し、イノシトールアシル化により抑制されない。フッ化水素酸は、イノシトール環とホスファチジン酸間のＧＰＩアンカーを開裂し、また、あらゆるホスホエタノールアミンとマンノシル残基間のホスホジエステル結合を開裂する。希亜硝酸は、非アセチル化グルコサミンとイノシトール環間を特異的に開裂し、タンパク質結合グリカン（今、診断的なアンヒドロマンノース部分を含む）およびホスファチジルイノシトールを放出するため、ＧＰＩアンカーの試験において特に有用である。ＣＲＤ抗体、組成分析、ｍｙｏ−イノシトール、エタノールアミン、グルコサミン、マンノースまたは脂肪酸での放射性標識およびクロマトグラフまたは界面活性剤分配方法と組み合わせて、これらの分解方法は、タンパク質上のＧＰＩアンカーを試験するための強力なツールセットを示す。
ポリペプチドにおけるＧＰＩアンカー結合シグナルコンセンサス配列を同定するために使用することができる種々のコンピューター方法およびアルゴリズムが、開発されている（例えば、Udenfriend et al. (1995) Methods Enzymol. 250:571-582; Eisenhaber et al., (1999) J. Biol. Chem. 292: 741-758, Kronegg and Buloz, (1999); “Detection/prediction of GPI cleavage site (GPI-anchor) in a protein (DGPI)”, 129.194.185.165/dgpi/; Fankhauser et al., (2005) Bioinformatics 21:1846-1852; Omaetxebarria et al., (2007) Proteomics 7:1951-1960; Pierleoni et al., (2008) BMC Bioinformatics 9:392参照）；（バイオインフォマティクスウェブサイト、例えば、ＥｘＰＡＳｙ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓツールサイト（expasy.ch/tools/）で容易に利用できるものを含む）。したがって、当業者は、ＰＨ２０ポリペプチドがＧＰＩアンカー結合シグナル配列を含むか否か、したがって、ＰＨ２０ポリペプチドがＧＰＩに固定されたタンパク質であるか否かを決定することができる。
Ｈ．延長された可溶性ＰＨ２０および他の可溶性ＰＨ２０の処置方法および使用ならびに併用療法
ＰＨ２０ヒアルロニダーゼの種々の形態は、ヒトにおける治療的使用のために製造され、承認されている。例えば、動物由来ヒアルロニダーゼ調製物は、Ｖｉｔｒａｓｅ（登録商標）（ISTA Pharmaceuticals）、精製されたヒツジ精巣ヒアルロニダーゼ、およびＡｍｐｈａｄａｓｅ（登録商標）（Amphastar Pharmaceuticals）、ウシ精巣ヒアルロニダーゼを含む。Ｈｙｌｅｎｅｘ（登録商標）（Halozyme Therapeutics）は、可溶性ｒＨｕＰＨ２０をコードする核酸を含む遺伝的に操作されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により生産されたヒト組換えヒアルロニダーゼである。ヒアルロニダーゼに対する承認された治療的使用は、皮下注入（皮下流体投与）のために他の治療剤の吸収および分散を増加させるためのアジュバントとしての、および放射線不透過性物質の吸収を改善するために皮下尿路造影における補助剤としての使用を含む。これらの適応に加えて、ヒアルロニダーゼは、さらなる疾患および状態の処置のための治療剤または化粧品として使用することができる。
ヒアルロニダーゼは、また、化学療法の活性および／または腫瘍の化学療法への接近可能性を増強するために使用されている（Schuller et al., 1991, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 32:173, abstract no. 1034; Czejka et al., 1990, Pharmazie 45:H.9）。ヒアルロニダーゼとの組合せ化学療法は、膀胱癌（Horn et al., 1985, J. Surg. Oncol. 28:304-307）、扁平上皮癌腫（Kohno et al., 94, J. Cancer Res. Oncol. 120:293-297）、乳癌（Beckenlehner et al., 1992, J. Cancer Res. Oncol. 118:591-596）および消化器癌（Scheithauer et al., 1988, Anticancer Res. 8:391-396）を含む種々の癌の処置において有効である。ヒアルロニダーゼは、脳の癌（神経膠腫）の処置において単独の治療剤として有効である（ＰＣＴ公開出願ＷＯ８８／０２２６１、１９８８年４月７日公開）。ヒアルロニダーゼの投与は、また、膵臓、胃、大腸、卵巣および乳房の従来の化学療法耐性腫瘍の応答性を誘導する（Baumgartner et al., 1988, Reg. Cancer Treat. 1:55-58; Zanker et al., 1986, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 27:390）。残念なことに、汚染物質および非ヒト性質のこのようなヒアルロニダーゼは、アナフィラキシー反応をもたらす。
間接的な抗癌作用に加えて、ヒアルロニダーゼは、また、直接的な抗発癌作用を有する。ヒアルロニダーゼは、マウスに移植された腫瘍の増殖を防止し（De Maeyer et al., 1992, Int. J. Cancer 51:657-660）、発癌物質への暴露時に腫瘍形成を抑制する（Pawlowski et al., 1979, Int. J. Cancer 23:105-109; Haberman et al., 1981, Proceedings of the 17th Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology, Washington, D.C., 22:105, abstract no. 415）。
特に、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、高い間質液圧と関連するヒアルロナン関連疾患または状態、例えば、椎間板圧迫、増殖性疾患、例えば、癌および良性前立腺過形成、および浮腫を処置するために使用することができる。浮腫は、例えば、臓器移植、卒中または脳外傷に起因し得る、またはそれで現れる。増殖性疾患は、癌、平滑筋細胞増殖、全身性硬化症、肝硬変症、成人呼吸窮迫症候群、特発性心筋症、エリテマトーデス、網膜症、例えば、糖尿病性網膜症または他の網膜症、心臓過形成、生殖器系関連障害、例えば、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）および卵巣嚢胞、肺線維症、子宮内膜症、線維腫症、良性腫瘍(harmatomas)、リンパ管腫症、サルコイドーシス、類腱腫を含むが、これらに限定されない。癌は、固形およびリンパ性／血液腫瘍および転移性疾患ならびに未分化腫瘍を含む。処置に適している腫瘍は、一般的に、同じ組織型の非癌性組織と比較して、または同じ腫瘍型の非転移性腫瘍と比較して、ヒアルロナンの細胞性および／または間質性発現を示す。癌は、任意の１つまたはそれ以上の卵巣癌、ｉｎ ｓｉｔｕ癌腫（ＩＳＣ）、扁平上皮癌腫（ＳＣＣ）、前立腺癌、膵臓癌、他の胃癌、非小細胞性肺癌、乳癌、脳の癌および大腸癌を含む。
したがって、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、展着剤としての使用を含み、それに加えて多数の使用を有する。ヒアルロニダーゼは、一般的に、例えば、眼科手術前の局所麻酔における球周囲の遮断のために使用される。酵素の存在は、さらなる遮断のための必要性を妨げ、アキネジア（眼球運動の喪失）の発症までの時間を速める。球周囲およびテノン嚢下の遮断は、眼科処置のためのヒアルロニダーゼの最も一般的な適用である。ヒアルロニダーゼは、また、美容整形、例えば、眼瞼形成およびしわ取りにおけるアキネジアを促進し得る。本明細書において提供される可溶性ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ、例えば、ｅｓＰＨ２０ヒアルロニダーゼが、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼが使用されるあらゆる処置方法または併用療法において使用することができることが理解される（例えば、米国公開番号ＵＳ２００４０２６８４２５；ＵＳ２００５０２６０１８６；ＵＳ２００６０１０４９６８；および米国出願番号第１２／３８１，８４４、１２／３８６，２４９、１２／３８７，２２５および１２／３８６，２２２号（これら全体を出典明示により包含させる）参照）。ヒアルロニダーゼに対する典型的な治療および化粧用途は、以下に記載されている。
１．展着剤および併用療法としての使用
上記のとおり、ヒアルロニダーゼは、結合組織および特定の特殊組織、例えば、臍帯および硝子体液の細胞間質物質において見られる多糖類である、ヒアルロン酸の加水分解を介する結合組織の透過性を修飾する展着または拡散物質である。展着因子が存在しないとき、皮下に注射された物質、例えば、薬物、タンパク質、ペプチドおよび核酸は、非常にゆっくりと拡散する。しかしながら、ヒアルロニダーゼとの共注射は、迅速な拡散を引き起こすことができる。拡散の速度は酵素の量に比例し、拡散の程度は溶液の容量に比例する。
本明細書において提供されるＰＨ２０、例えば、可溶性ＰＨ２０、例えば、ｅｓＰＨ２０は、種々の哺乳動物のインビボ組織のいずれかへ送達剤および分子を促進するか、または増強するために使用することができる。小分子薬理活性物質ならびに大分子薬理活性物質、例えば、タンパク質、核酸およびリボ核酸、ならびに、限定はしないが、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、脂質ベースの分子および薬物を含む成分の組合せを含むことができる高分子組成物の拡散を容易にし、したがって、送達を促進するために使用することができる（例えば、米国公開番号第ＵＳ２００４０２６８４２５；ＵＳ２００５０２６０１８６；およびＵＳ２００６０１０４９６８号参照）。ＰＨ２０、例えば、可溶性ＰＨ２０、例えば、ｅｓＰＨ２０は、共に製剤化される薬剤または共に投与される薬剤のバイオアベイラビリティならびに薬物動態学（ＰＫ）および／または薬物動力学（ＰＤ）特性を改良するための治療剤と、共に投与および／または共に製剤化することができる。可溶性ＰＨ２０、例えば、ｅｓＰＨ２０を使用することにより改善することができるＰＫ／ＰＤパラメーターは、Ｃｍａｘ（例えば、血流中における吸収後に達成される薬物の最大濃度）、Ｔｍａｘ（最大濃度に達するために必要な時間）、Ｔ１／２（濃度が半分にまで減少するために必要な時間）、Ｃｍｉｎ（代謝および排出後の薬物の最小濃度）、ＡＵＣ（濃度対時間の曲線下面積、バイオアベイラビリティの全体量の測定値）、種々の興味ある組織における濃度（例えば、所望の濃度に達する速度、全体レベル、および所望のレベルを維持する時間を含む）およびＥｍａｘ（達する最大効果）のような測定値を含む。
本明細書において提供される処置方法は、治療剤が処置する疾患または障害の処置のための治療剤との組合せ治療を含む。疾患または状態の重症度を改善するおよび／またはさもなければ軽減するあらゆる治療剤を、このような治療剤のバイオアベイラビリティを増加させるために、本明細書において提供される可溶性ＰＨ２０と組み合わせることができる。特に、本明細書において提供される可溶性ＰＨ２０ポリペプチド、例えば、ｅｓＰＨ２０は、記載されているヒアルロニダーゼまたはヒアルロニダーゼ分解酵素の代わりに、出願（例えば、米国公開番号第ＵＳ２００４０２６８４２５；ＵＳ２００５０２６０１８６；ＵＳ２００６０１０４９６８号および米国出願番号第１２／３８１，８４４、１２／３８６，２４９、１２／３８７，２２５および１２／３８６，２２２号参照）に記載されているそれぞれ、およびすべての組合せにおいて使用することができる。
本明細書において提供される可溶性ＰＨ２０ポリペプチド、特にｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、治療剤調製物の前に、該物の次に、該物と断続的に、または、該物と同時に投与することができる。一般的に、可溶性ＰＨ２０が間質腔におけるヒアルロン酸を分解することが可能であるため、可溶性ＰＨ２０は、治療剤調製物の投与の前または該投与と同時に投与される。可溶性ＰＨ２０は治療分子の投与部位と異なる部位で投与することができ、また可溶性ＰＨ２０は治療分子の投与部位と同じ部位で投与することができる。
ヒアルロニダーゼと共に投与することができる医薬用、治療用および化粧用薬剤および分子の例は、化学療法または抗癌剤、鎮痛剤、抗生物質、抗炎症剤、抗菌剤、殺アメーバ剤、殺トリコモナス剤、抗パーキンソン病薬、抗マラリア薬、鎮痙剤、抗抑制薬、抗関節炎剤、抗真菌剤、抗高血圧剤、解熱剤、駆虫剤、抗ヒスタミン剤、アルファアドレナリン作動性アゴニスト剤、アルファ遮断薬、麻酔薬、気管支拡張剤、殺生物剤、殺菌剤、静菌剤、ベータアドレナリン遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、心血管作動薬、避妊薬、化粧用または美的用薬剤、充血除去剤、利尿薬、抑制薬、診断薬、電解質物質、催眠剤、ホルモン剤、血糖上昇剤、筋弛緩剤、筋肉収縮剤、眼科用剤、副交感神経作用薬、精神賦活剤、鎮静剤、睡眠導入剤、交感神経様作用薬、精神安定剤、尿路剤、膣剤、殺ウイルス剤、ビタミン剤、非ステロイド系抗炎症剤またはアンジオテンシン変換酵素阻害剤、およびそれらの任意の組合せを含むが、これらに限定されない。特に、治療剤は、モノクローナル抗体を含む抗体、ビスホスホネート、インスリンおよび免疫グロブリンを含む。
例えば、典型的な抗生物質は、アミノグリコシド；アンフェニコール；アンサマイシン；カルバセフェム；カルバペネム；セファロスポリンまたはセフェム；セファマイシン；クラバム；環状リポペプチド；ジアミノピリミジン；ケトライド；ラコサミド；マクロライド；モノバクタム；ニトロフラン；オキサセフェム；オキサゾリジノン；ペネム、チエナマイシンおよび種々雑多なベータ−ラクタム；ペニシリン；ポリペプチド抗生物質；キノロン；スルホンアミド；スルホン；テトラサイクリン；および他の抗生物質（例えば、クロホクトール、フシジン酸、ヘキセジン、メテナミン、ニトロフラントイン、ニトロキソリン、リチペネム、タウロリジン、キシボモル(Xibomol)）を含むが、これらに限定されない。
また、典型的な治療剤に含まれるものは、血液修飾因子、例えば、抗血友病因子、活性化プロトロンビン複合体、アンチトロンビンＩＩＩ、凝固因子Ｖｈ、凝固因子ＶＩＩＩ、凝固因子ＩＸ、血漿タンパク分画、フォン・ヴィレブランド因子；抗血小板薬（例えば、アブシキシマブ、アナグレリド、シロスタゾール、クロピドグレル二硫酸塩、ジピリダモール、エポプロステノール、エプチフィバチド、チロフィバンを含む）；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、顆粒球ＣＳＦおよび顆粒球マクロファージＣＳＦを含む）；赤血球生成促進因子（例えば、エリスロポエチン、例えば、ダルベポエチンアルファを含む）およびエポエチンアルファ；止血薬およびアルブミン（例えば、アプロチニン、抗血友病因子および血漿の組合せ、酢酸デスモプレシン、およびアルブミンを含む）；免疫グロブリン、ならびにＢ型肝炎免疫グロブリン；トロンビン阻害剤（例えば、直接トロンビン阻害剤およびレピルジンを含む）およびドロトレコギンアルファ；抗凝固剤（例えば、ダルテパリン、エノキサパリンおよび他のヘパリン、およびワルファリンを含む）である。
可溶性ＰＨ２０、例えば、ｅｓＰＨ２０と共に投与および／または共に製剤化により組み合わせられ得る他の典型的な治療剤は、アダリムマブ、アガルシダーゼベータ、アレファセプト、アンピシリン、アナキンラ、抗ポリオワクチン、抗胸腺細胞、アジスロマイシン、ベカプレルミン、カスポファンギン、セファゾリン、セフェピム、セフォテタン、セフタジジム、セフトリアキソン、セツキシマブ、シラスタチン、クラブラン酸、クリンダマイシン、ダルベポエチンアルファ、ダクリズマブ、ジフテリア、ジフテリア抗毒素、ジフテリアトキソイド、エファリズマブ、エピネフリン、エリスロポエチンアルファ、エタネルセプト、フィルグラスチム、フルコナゾール、卵胞刺激ホルモン、フォリトロピンアルファ、フォリトロピンベータ、ホスフェニトイン、ガドジアミド、ガドペンテト酸、ガチフロキサシン、グラチラマー、ＧＭ−ＣＳＦ、ゴセレリン、酢酸ゴセレリン、グラニセトロン、インフルエンザ菌Ｂ、ハロペリドール、肝炎ワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、イブリツモマブチウキセタン、イブリツモマブ、チウキセタン、免疫グロブリン、インフルエンザ菌ワクチン、インフルエンザウイルスワクチン、インフリキシマブ、インスリン、インスリングラルギン、インターフェロン、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−１、インターフェロンアルファｎ３、インターフェロンベータ、インターフェロンベータ−１ａ、インターフェロンガンマ、インターフェロンアルファ−コンセンサス、イオジキサノール、イオヘキソール、イオパミドール、イオベルソール、ケトロラク、ラロニダーゼ、レボフロキサシン、リドカイン、リネゾリド、ロラゼパム、麻疹ワクチン、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹−おたふく風邪−風疹ウイルスワクチン、風疹ワクチン、メドロキシプロゲステロン、メロペネム、メチルプレドニゾロン、ミダゾラム、モルヒネ、オクトレオチド、オマリズマブ、オンダンセトロン、パリビズマブ、パントプラゾール、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペグ−インターフェロンアルファ−２ａ、ペグ−インターフェロンアルファ−２ｂ、ペグビソマント、百日咳ワクチン、ピペラシリン、肺炎球菌ワクチンおよび肺炎球菌複合体ワクチン、プロメタジン、レテプラーゼ、ソマトロピン、スルバクタム、スマトリプタン、タゾバクタム、テネクテプラーゼ、破傷風菌精製トキソイド、チカルシリン、トシツモマブ、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンヘキサセトニド、バンコマイシン、水痘帯状疱疹免疫グロブリン、水痘ワクチン、他のワクチン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、ヒ素、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、カルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）ワクチン、ＢＣＧ Ｌｉｖｅ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブスルファン静脈内、ブスルファン経口、カルステロン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、ポリフェプロザンを伴うカルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、リポゾーマルシタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、リポゾーマルダウノルビシン、ダウノルビシン、ダウノマイシン、デニロイキンジフチトクス、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、リポゾーマルドキソルビシン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エリオットＢ溶液、エピルビシン、エポエチンアルファ、エストラムスチン、エトポシド、リン酸エトポシド、エトポシドＶＰ−１６、エキセメスタン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、フルベストラント、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、レバミソール、ロムスチン、ＣＣＮＵ、メクロレタミン、ナイトロジェンマスタード、メゲストロール、酢酸メゲストロール、メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、メトキサレン、マイトマイシン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロン、フェンプロピオン酸ナンドロロン、ノフェツモバブ、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ミトラマイシン、ポルフィマー、ポルフィマーナトリウム、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タルク、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、６−チオグアニン、トリエチレンチオホスホルアミド（チオテパ）、トポテカン、トレミフェン、トラスツマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ゾレドロネート、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、レチノイン酸、アリトレチノイン、９−シス−レチノイン酸、アルボシジブ、アンバゾン、アンボマイシン、アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナキシロン、アンシタビン、アントラマイシン、アパジコン、アルギメスナ、アスペルリン、アトリムスチン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バノキサントロン、バタブリン、バチマスタット、ベナキシビン、ベンダムスチン、ベンゾデパ、ビカルタミド、ビエタセルピン、ビリコダル、ビサントレン、ビスナフィドジメシレート、ビゼレシン、ボルテゾミブ、ブレキナル、ブロピリミン、ブドチタン、カクチノマイシン、カネルチニブ、カラセミド、カルベチマー、カルボコン、カルモフール、カルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴール、セマドチン、クロラムブシル、シオテロネル、シロレマイシン、クランフェヌル、クロファラビン、クリスナトール、デシタビン、デクスニグルジピン、デキソルマプラチン、デザグアニン、ジアジコン、ジブロスピジウム、ジエノゲスト、ジナリン、ジセルモリド、ドフェキダル、ドキシフルリジン、ドロロキシフェン、デュアゾマイシン、エコムスチン、エダトレキサート、エドテカリン、エフロルニチン(Eflomithine)、エラクリダル、エリナフィド、エルサミトルシン、エミテフル、エンロプラチン、エンプロメート、エンザスタウリン、エピプロピジン、エプタロプロスト、エルブロゾール、エソルビシン、エタニダゾール、エトグルシド、エトプリン、エクシスリンド、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フルオキシメステロン、フルロシタビン、ホスキドン、ホストリエシン、ホトレタミン、ガラルビシン、ガロシタビン、ゲロキノール、ギマテカン、ギメラシル、グロキサゾン、グルホスファミド、イルモホシン、イロマスタット、イメキソン、インプロスルファン、インジスラム、インプロコン、インターロイキン、インターロイキン−２、組換えインターロイキン、イントプリシン、ヨーベングアン(lobenguane)、イプロプラチン、イルソグラジン、イクサベピロン、ケトトレキサート、Ｌ−アラノシン、ランレオチド、ラパチニブ、レドキサントロン、リュープロリド、リュープロレリン、レキサカルシトール、リアロゾール、ロバプラチン、ロメトレキソール、ロナファルニブ、ロソキサントロン、ルルトテカン、マホスファミド、マンノスルファン、マリマスタット、マソプロコール、メイタンシン、メクロレタミン(Mechiorethamine)、メレンゲストロール、メルファラン(Meiphalan)、メノガリル、メピチオスタン、メテシンド、メトミダート、メトプリン、メツレデパ、ミボプラチン、ミプロキシフェン、ミソニダゾール、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトフラキソン、ミトギリン、ミトグアゾン、ミトマルシン、ミトナフィド、ミトキドン、ミトスペル、ミトゾロミド、ミボブリン、ミゾルビン、モファロテン、モピダモール、ムブリチニブ、ミコフェノール酸、ネダプラチン、ネイザラビン(Neizarabine)、ネモルビシン、ニトラクリン、ノコダゾール、ノガラマイシン、ノラトレキセド、ノルトピキサントロン、オルマプラチン、オルタタキセル、オテラシル、オキシスラン、オキソフェナルシン、パツビロン、ペルデシン、ペリオマイシン、ペリトレキソール、ペメトレキセド、ペンタムスチン、ペプロマイシン、ペルホスファミド、ペリホシン、ピコプラチン、ピナフィド、ピポスルファン、ピルフェニドン、ピロキサントロン、ピキサントロン、プレビトレキセド、プロメスタン、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロパミジン、プロスピジウム、プミテパ、ピューロマイシン、ピラゾフリン、ラニムスチン、リボプリン、リトロスルファン、ログレチミド、ロキニメックス、ルホクロモマイシン、サバルビシン、サフィンゴール、サトラプラチン、セブリプラチン、セムスチン、シムトラゼン、シゾフィラン、ソブゾキサン、ソラフェニブ、スパルホサート、スパルホス酸、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、スクアラミン、ストレプトニグリン、ストレプトバリシン、スホスファミド、スロフェヌル、タセジナリン、タリソマイシン、タリムスチン、タリキダール、タウロムスチン、テコガラン、テガフール、テロキサントロン、テモポルフィン、テロキシロン、チアミプリン、チアミプリン、チアゾフリン、チロミソール、チロロン、チムコダル、チモナシック、チラパザミン、トピキサントロン、トラベクテジン、エクチナサイジン７４３、トレストロン、トリシリビン、トリロスタン、トリメトレキセート、四硝酸トリプラチン、トリプトレリン、トロホスファルニド(Trofosfarnide)、ツブロゾール、ウベニメクス、ウレデパ、バルスポダール(Vaispodar)、バプレオチド、ベルテポルフィン、ビンブラスチン(Vinbiastine)、ビンデシン、ビネピジン、ビンフルニン、ビンホルミド、ビングリシネート、ビンロイシノール、ビンロイロシン、ビンロシジン、ビントリプトール、ビンゾリジン、ボロゾール、キサントマイシンＡ、グアメシクリン、ゼニプラチン、ジラスコルブ［２−Ｈ］、ジノスタチン、ゾルビシン、ゾスキダル、アセタゾラミド、アシクロビル、アジピオドン、アラトロフロキサシン、アルフェンタニル、アレルゲン抽出物、アルファ１−プロテイナーゼ阻害剤、アルプロスタジル、アミカシン、アミノ酸、アミノカプロン酸、アミノフィリン、アミトリプチリン、アモバルビタール、アムリノン、鎮痛剤、抗ポリオワクチン、抗狂犬病血清、抗破傷風菌免疫グロブリン、破傷風菌ワクチン、アンチトロンビンＩＩＩ、抗毒素血清、アルガトロバン、アルギニン、アスコルビン酸、アテノロール、アトラクリウム、アトロピン、オーロチオグルコース、アザチオプリン、アズトレオナム、バシトラシン、バクロフェン、バシリキシマブ、安息香酸、ベンズトロピン、ベタメタゾン、ビオチン、ビバリルジン、ボツリヌス抗毒素、ブレチリウム、ブメタニド、ブピバカイン、ブプレノルフィン、ブトルファノール、カルシトニン、カルシトリオール、カルシウム、カプレオマイシン、カルボプロスト、カルニチン、セファマンドール、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフォキシチン、セフチゾキシム、セフロキシム、クロラムフェニコール(Chioramphenicol)、クロロプロカイン(Chioroprocaine)、クロロキン(Chioroquine)、クロロチアジド、クロロプロマジン(Chiorpromazine)、コンドロイチン硫酸、コリオゴナドトロピンアルファ、クロミウム、シドフォビル、シメチジン、シプロフロキサシン、シスアトラクリウム、クロニジン、コデイン、コルヒチン(Coichicine)、コリスチン、コラーゲン、コルチコレリンヒツジトリフルタート、コルチコトロピン、コシントロピン、シアノコバラミン、シクロスポリン、システイン、ダクリズマブ(Dacliximab)、ダルホプリスチン、ダルテパリン、ダナパロイド、ダントロレン、デフェロキサミン、デス
モプレシン、デキサメタゾン、デクスメデトミジン、デクスパンテノール、デキストラン、鉄デキストラン、ジアトリゾ酸、ジアゼパム、ジアゾキシド、ジサイクロミン、ジギバインド、ジゴキシン、ジヒドロエルゴタミン、ジルチアゼム、ジフェンヒドラミン、ジピリダモール、ドブタミン、ドーパミン、ドキサクリウム、ドキサプラム、ドキセルカルシフェロール、ドキシサイクリン、ドロペリドール、ダイフィリン、エデト酸、エドロホニウム、エナラプリラート、エフェドリン、エポプロステノール、エルゴカルシフェロール、エルゴノビン、エルタペネム、エリスロマイシン、エスモロール、エストラジオール、エストロゲン、エタクリン酸、エタノールアミン、エタノール、ヨード化ケシ油エチルエステル(Ethiodized oil)、エチドロン酸、エトミダート、因子ＶＩＩＩ、ファモチジン、フェノルドパム、フェンタニル、フルマゼニル、フルオレセイン、フルフェナジン、葉酸、フォメピゾール、ホミビルセン、フォンダパリヌクス、ホスカルネット、ホスフェニトイン、フロセミド、ガドテリドール、ガドベルセタミド、ガンシクロビル、ゲンタマイシン、グルカゴン、グルコース、グリシン、グリコピロラート、ゴナドレリン、絨毛性ゴナドトロピン、インフルエンザＢ型多糖体、ヘミン、ハーバル、ヒスタミン、ヒドララジン、ヒドロコルチゾン、ヒドロモルフォン、ヒドロキソコバラミン、ヒドロキシジン、ヒヨスチアミン、イブチリド、イミグルセラーゼ、インジゴカルミン、インドメタシン、アイオダイド、イオプロミド(lopromide)、イオタラム酸、イオキサグル酸(loxaglic acid)、イオキシラン(loxilan)、イソニアジド、イソプロテレノール、日本脳炎ワクチン、カナマイシン、ケタミン、ラベタロール、レピルジン、レボブピバカイン、レボチロキシン、リンコマイシン、リオチロニン、黄体形成ホルモン、ライム病ワクチン、マンガホジピール、マンストール(Manthtol)、髄膜炎菌多糖ワクチン、メペリジン、メピバカイン、メソリダジン、メタラミノール、メタドン、メトカルバモール、メトヘキシタール、メチルドペート、メチルエルゴノビン、メトクロプラミド、メトプロロール、メトロニダゾール、ミノサイクリン、ミバクリウム、モルルイック酸(Morrhuic acid)、モキシフロキサシン、ムロモナブ−ＣＤ３、ミコフェノール酸モフェチル、ナフシリン、ナルブフィン、ナルメフェン、ナロキソン、ネオスチグミン、ナイアシンアミド、ニカルジピン、ニトログリセリン、ニトロプルシド、ノルエピネフリン、オルフェナドリン、オキサシリン、オキシモルホン、オキシテトラシクリン、オキシトシン、パンクロニウム、パンテノール、パントテン酸、パパベリン、ペグインターフェロン−アルファ（例えば、インターフェロンアルファ２ａまたは２ｂ）、ペニシリンＧｓ、ペンタミジン、ペンタゾシン、ペントバルビタール、ペルフィウトレン(Perfiutren)、ペルフェナジン、フェノバルビタール、フェントラミン、フェニルエフリン、フェニトイン、フィゾスチグミン、フィトナジオン、ポリミキシンｂ、プラリドキシム、プリロカイン、プロカインアミド、プロカイン、プロクロルペラジン(Prochiorperazine)、プロゲステロン、プロプラノロール、ピリドスチグミン水酸化物、ピリドキシン、キニジン、キヌプリスチン、狂犬病免疫グロブリン、狂犬病ワクチン、ラニチジン、レミフェンタニル、リボフラビン、リファンピン、ロピバカイン、サマリウム、スコポラミン、セレニウム、セルモレリン、シンカリド、ソマトレム、スペクチノマイシン、ストレプトキナーゼ、ストレプトマイシン、サクシニルコリン、スフェンタニル、スルファメトキサゾール、タクロリムス(Tacrolirnus)、テルブタリン、テリパラチド、テストステロン、破傷風抗毒素、テトラカイン、テトラデシル硫酸、テオフィリン、チアミン、チエチルペラジン、チオペンタール、甲状腺刺激ホルモン、チンザパリン、チロフィバン、トブラマイシン、トラゾリン、トルブタミド、トルセミド、トラネキサム酸、トレプロスチニル、トリフルオペラジン、トリメトベンズアミド、トリメトプリム、トロメタミン、ツベルクリン、腸チフスワクチン、ウロフォリトロピン、ウロキナーゼ、バルプロ(Vaiproic)酸、バソプレシン、ベクロニウム、ベラパミル、ボリコナゾール、ワルファリン、黄熱病ワクチン、ジドブジン、亜鉛、ジプラシドン塩酸塩、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アドリアマイシン、アザセリン、６−アザウリジン、カルチノフィリン、クロモマイシン、デノプテリン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、エノシタビン、フロキシウリジン(Loxuridine)、オリゴマイシン(Olivomycine)、ピラルビシン、ピリトレキシム、プテロプテリン、テガフール(Tagafur)、ツベルシジン、アルテプラーゼ、アルシツモマブ、ベバシズマブ、ボツリヌス毒素Ａ型、ボツリヌス毒素Ｂ型、カプロマブペンデチド、ダクリズマブ、ドルナーゼアルファ、ドロトレコギンアルファ、イムシロマブペンテテート、およびヨウ素−１３１を含むが、これらに限定されない。
特に、治療剤は、免疫グロブリン、インターフェロンベータ、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−１、インターフェロンアルファ−ｎ３、インターフェロンベータ−１、インターフェロンベータ−１ａ、インターフェロンガンマ−ｌｂ、ペグ−インターフェロンアルファ−２およびペグインターフェロンアルファ−２ｂ、インスリン、ビスリン酸（例えば、パミドロネートまたはゾレドロネート）、ドセタキセル、ドキソルビシン、リポゾーマルドキソルビシンおよびベバシズマブを含むが、これらに限定されない。
２．過剰なグリコサミノグリカナーゼを除去するための使用
可溶性ＰＨ２０、一般的に可溶性ヒアルロニダーゼを含む組成物単独または、他の処置および／もしくは薬剤と組み合わせて、もしくは加えての投与により、ヒアルロナン関連疾患および状態を処置するための方法を、本明細書において提供される。ヒアルロナン関連状態および疾患は、ヒアルロナンレベルが疾患または状態における原因、結果または観察される他のものとして上昇する疾患および状態であり、組成物ヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ＰＨ２０単独または他の処置および／もしくは薬剤と組み合わせて、もしくは加えての投与により処置することができる。
一般的に、ヒアルロナン関連疾患および状態は、対照、例えば、他の組織、細胞または体液と比較して、組織、細胞または体液（例えば、腫瘍組織または腫瘍関連組織、血液または間質空間）におけるヒアルロナン発現の上昇と関連する。上昇したヒアルロン発現は、正常な組織、細胞または体液、例えば、処置されるサンプルと類似であるが、異なる対象、例えば、正常である（すなわち、疾患または状態を有さないか、または処置される対象が有する疾患または状態の型を有さない）対象、例えば、ヒアルロナン関連疾患または状態を有さない対象から単離された組織、細胞または体液と比較して上昇したものであり得る。上昇したヒアルロナン発現は、重度でない、および／またはヒアルロナン関連でないか、または比較的少ないヒアルロナンを発現し、したがってより少ない程度にヒアルロナン関連である、類似の疾患または状態を有する他の対象由来の類似の組織と比較して上昇したものであり得る。例えば、処置される対象は、組織、細胞または流体におけるＨＡ量が、あまり重度でない癌、例えば、初期、分化型または他の癌の型を有する対象と比較して、相対的に上昇している、ヒアルロナン関連癌を有する対象であり得る。他の例において、細胞、組織または流体は、既知量または相対量のＨＡを有する対照サンプル、例えば、流体、組織、抽出物（例えば、細胞または核抽出物）、核酸またはペプチド調製物、細胞系、生検、標準または他のサンプル、例えば、比較的低いレベルのＨＡを発現することが知られているサンプル、例えば、腫瘍細胞系、例えば、低いレベルのＨＡを発現する本明細書に記載されている典型的な腫瘍細胞系、例えば、ＨＣＴ１１６細胞系、ＨＴ２９細胞系、ＮＣＩ Ｈ４６０細胞系、ＤＵ１４５細胞系、Ｃａｐａｎ−１細胞系およびこのような細胞系を使用して作製した腫瘍モデル由来の腫瘍と比較して、上昇したレベルのヒアルロナンを含む。
いくつかの場合において、ヒアルロナン関連疾患および状態は、組織、例えば、腫瘍における間質液圧の増加、血管容量の減少、および／または水分含有量の増加と関連する。１つの例において、本明細書において提供される組成物および化合物での処置は、疾患または状態と関連する１つ以上のこれらの症状または他の症状を改善する、例えば、対象の生存または生活の質を経時的に向上するか、または腫瘍増殖を阻止する。
提供された酵素、組成物および方法を使用して処置することができる典型的なヒアルロナン関連疾患および状態は、ヒアルロナンリッチな癌、例えば、腫瘍、例えば、固形腫瘍、例えば、末期癌、転移性癌、未分化癌、卵巣癌、ｉｎ ｓｉｔｕ癌腫（ＩＳＣ）、扁平上皮癌腫（ＳＣＣ）、前立腺癌、膵臓癌、非小細胞性肺癌、乳癌、大腸癌および他の癌を含むが、これらに限定されない。
また、典型的なヒアルロナン関連疾患および状態は、間質液圧の上昇と関連する疾患、例えば、椎間板圧迫および浮腫と関連する疾患、例えば、臓器移植、卒中、脳外傷または他の損傷により引き起こされる浮腫である。典型的なヒアルロナン関連疾患および状態は、間質液圧の上昇、血管容量の減少、および／または組織における水分含有量の増加と関連する疾患および状態、例えば、癌、椎間板圧迫および浮腫を含む。１つの例において、ヒアルロナン関連状態、疾患または障害の処置は、改善、低減、または、間質液圧（ＩＦＰ）の増加、血管容量の減少および組織における水分含有量の増加の１つ以上における他の有益な効果を含む。
一般的に、ヒアルロナン関連疾患または状態は、例えば、病変組織、例えば、腫瘍におけるＨＡ発現の増加と関連する。１つの例において、ＨＡＬＯ（ヒアルロナンを含むプロテオグリカンが豊富である細胞周囲マトリックス領域）は、対象の組織、例えば、病変組織において形成する。他の例において、ＨＡＬＯの存在は、インビトロでの対象の組織、例えば、病変組織由来の細胞培養物において検出される。
ａ．癌の処置における使用
ヒアルロニダーゼは、腫瘍におけるヒアルロン酸の破壊により直接的な抗発癌作用を有する。したがって、可溶性ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ、例えば、ｅｓＰＨ２０は、腫瘍、特に、ヒアルロナンリッチである腫瘍を処置するために使用することができる。ヒアルロナンリッチな癌は、癌細胞がハロを生産する癌、ヒアルロナンの発現が上昇している癌（腫瘍由来の切片の免疫染色、例えば、組織学的染色により測定される）、ＨＡＳ２が上昇している癌（ヒアルロナンシンターゼ２）、インビトロでヒアルロニダーゼ（ＨＹＡＬ１）を生産しない癌であり得る。ヒアルロナンリッチな癌は、ヒアルロナン発現を評価するための任意の方法およびタンパク質／ｍＲＮＡ発現をアッセイするための他の既知の方法により同定することができる。
いくつかのヒアルロナンリッチな癌が同定されている。いくつかの場合において、ヒアルロナン発現は、予後不良、例えば、生存率および／または無再発生存率の低下、転移、血管形成、他の組織／領域への癌細胞浸潤および他の予後不良の指標と相関する。このような相関関係は、例えば、ヒアルロナンリッチな腫瘍、例えば、卵巣癌、ＳＣＣ、ＩＳＣ、前立腺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む肺癌、乳癌、大腸癌および膵臓癌において観察されている（例えば、Maarit et al., Cancer Research, 60:150-155 (2000); Karvinen et al., British Journal of Dermatology, 148:86-94 (2003); Lipponen et al., Eur. Journal of Cancer, 849-856 (2001); Pirinen et al., Int. J. Cancer: 95: 12-17 (2001); Auvinen et al., American Journal of Pathology, 156(2):529-536 (2000); Ropponen et al., Cancer Research, 58: 342-347 (1998)参照）。したがって、ヒアルロナンリッチな癌は、１つ以上の癌の症状を処置するために、ヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ＰＨ２０の投与により処置することができる。ヒアルロナンリッチな腫瘍は、前立腺、乳房、大腸、卵巣、胃、頭頸部および他の腫瘍および癌を含むが、これらに限定されない。
ヒアルロニダーゼは、また、慣用の化学療法に対して耐性である腫瘍の感受性を増加させるために使用することができる。例えば、ヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ＰＨ２０は、腫瘍部位周囲の拡散を増加させるために（例えば、腫瘍部位および周囲の化学療法剤の循環および／または濃度を促進するために）、例えば、ヒアルロン酸分解により、腫瘍細胞運動性を阻害するために、および／または腫瘍細胞アポトーシス域値を低下させるために有効な量で、ＨＹＡＬ１欠失と関連する腫瘍を有する患者に投与することができる。これによって、腫瘍細胞をアノイキスの状態に至らせることができ、これは腫瘍細胞を、化学療法剤の作用に対してより感受性にする。ヒアルロニダーゼの投与は、膵臓、胃、大腸、卵巣および乳房のこれまでは化学療法耐性であった腫瘍の応答性を誘導することができる（Baumgartner et al. (1988) Reg. Cancer Treat. 1:55-58; Zanker et al. (1986) Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 27:390）。したがって、可溶性ＰＨ２０単独での癌の処置に加えて、本明細書において提供される組成物および方法は、また、化学療法剤もしくは他の抗癌剤または処置と、例えば、同時に、または前に、組み合わせての可溶性ＰＨ２０の投与によりヒアルロナン関連癌を処置するために使用することができる。この例において、ヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ＰＨ２０は、一般的に、固形腫瘍への化学療法剤または他の抗癌剤の浸透を増強し、それにより疾患を処置する。
可溶性ＰＨ２０を含む組成物は、抗癌剤と共に腫瘍内に、または播種性癌または到達が難しい腫瘍に対して静脈内に投与することができる。抗癌剤は、化学療法剤、抗体、ペプチドまたは遺伝子治療ベクター、ウイルスまたはＤＮＡであり得る。さらに、ヒアルロニダーゼは、多剤耐性を獲得している以前に化学物質難治性の腫瘍における増感のために、腫瘍細胞を循環プールに動員するために使用することができる（St Croix et al., (1998) Cancer Lett September 131(1): 35-44）。
可溶性ＰＨ２０、例えば、ｅｓＰＨ２０の投与後、同時または投与前に投与することができる典型的な抗癌剤は、以下のものを含むが、これらに限定されない。アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン（９−シス−レチノイン酸）、アロプリノール、アルトレタミン、アルボシジブ、アンバゾン、アンボマイシン、アメタントロン、アミホスチン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アナキシロン、アンシタビン、アントラマイシン、アパジコン、アルギメスナ、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アトリムスチン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バノキサントロン、バタブリン、バチマスタット、ＢＣＧ Ｌｉｖｅ、ベナキシビン、ベンダムスチン、ベンゾデパ、ベキサロテン、ベバシズマブ、ビカルタミド、ビエタセルピン、ビリコダル、ビサントレン、ビサントレン、ビスナフィドジメシレート、ビゼレシン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブレキナル、ブロピリミン、ブドチタン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カネルチニブ、カペシタビン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルボコン、カルモフール、ポリフェプロザンを伴うカルムスチン、カルムスチン、カルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴール、セレコキシブ、セマドチン、クロラムブシル、シオテロネル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、クランフェヌル、クロファラビン、クリスナトール、シクロホスファミド、リポゾーマルシタラビン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダルベポエチンアルファ、リポゾーマルダウノルビシン、ダウノルビシン／ダウノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、デニロイキンジフチトクス、デクスニグルジピン、デキソナプラチン、デクスラゾキサン、デザグアニン、ジアジコン、ジブロスピジウム、ジエノゲスト、ジナリン、ジセルモリド、ドセタキセル、ドフェキダル、ドキシフルリジン、リポゾーマルドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣＬ、ドコルビシンＨＣＬリポソーム注射剤、ドキソルビシン、ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エコムスチン、エダトレキサート、エドテカリン、エフロールニチン、エラクリダル、エリナフィド、エリオットＢ溶液、エルサミトルシン、エミテフル、エンロプラチン、エンプロメート、エンザスタウリン、エピプロピジン、エピルビシン、エポエチンアルファ、エプタロプロスト、エルブロゾール、エソルビシン、エストラムスチン、エタニダゾール、エトグルシド、リン酸エトポシド、エトポシドＶＰ−１６、エトポシド、エトプリン、エキセメスタン、エクシスリンド、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルロシタビン、ホスキドン、ホストリエシン、ホストリエシン、ホトレタミン、フルベストラント、ガラルビシン、ガロシタビン、ゲムシタビン、ゲムツズマブ／オゾガマイシン、ゲロキノール、ギマテカン、ギメラシル、グロキサゾン、グルホスファミド、酢酸ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ／チウキセタン、イダルビシン、イホスファミド、イルモホシン、イロマスタット、メシル酸イマチニブ、イメキソン、インプロスルファン、インジスラム、インプロコン、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロン、インターロイキン−２ｓおよび他のインターロイキン（組換えインターロイキンを含む）、イントプリシン、ヨーベングアン［１３１−Ｉ］、イプロプラチン、イリノテカン、イルソグラジン、イクサベピロン、ケトトレキサート、Ｌ−アラノシン、ランレオチド、ラパチニブ、レドキサントロン、レトロゾール、ロイコボリン、リュープロリド、リュープロレリン（リュープロレリド）、レバミソール、レキサカルシトール、リアロゾール、ロバプラチン、ロメトレキソール、ロムスチン／ＣＣＮＵ、ロムスチン、ロナファルニブ、ロソキサントロン、ルルトテカン、マホスファミド、マンノスルファン、マリマスタット、マソプロコール、メイタンシン、メクロレタミン、メクロレタミン／ナイトロジェンマスタード、酢酸メゲストロール、メゲストロール、メレンゲストロール、メルファラン、メルファランｌＬ−ＰＡＭ、メノガリル、メピチオスタン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メスナ、メテシンド、メトトレキサート、メトキサレン、メトミダート、メトプリン、メツレデパ、ミボプラチン、ミプロキシフェン、ミソニダゾール、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトフラキソン、ミトギリン、ミトグアゾン、ミトマルシン、マイトマイシンＣ、マイトマイシン、ミトナフィド、ミトキドン、ミトスペル、ミトタン、ミトキサントロン、ミトゾロミド、ミボブリン、ミゾルビン、モファロテン、モピダモール、ムブリチニブ、ミコフェノール酸、フェンプロピオン酸ナンドロロン、ネダプラチン、ネルザラビン、ネモルビシン、ニトラクリン、ノコダゾール、ノフェツモバブ、ノガラマイシン、ノラトレキセド、ノルトピキサントロン、オクトレオチド、オプレルベキン、オルマプラチン、オルタタキセル、オテラシル、オキサリプラチン、オキシスラン、オキソフェナルシン、パクリタキセル、パミドロネート、パツビロン、ペガデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペルデシン、ペリオマイシン、ペリトレキソール、ペメトレキセド、ペンタムスチン、ペントスタチン、ペプロマイシン、ペルホスファミド、ペリホシン、ピコプラチン、ピナフィド、ピポブロマン、ピポスルファン、ピルフェニドン、ピロキサントロン、ピキサントロン、プレビトレキセド、プリカミシドミトラマイシン、プリカマイシン、プロメスタン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィマー、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロカルバジン、プロパミジン、プロスピジウム、プミテパ、ピューロマイシン、ピラゾフリン、キナクリン、ラニムスチン、ラスブリカーゼ、リボプリン、リトロスルファン、リツキシマブ、ログレチミド、ロキニメックス、ルホクロモマイシン、サバルビシン、サフィンゴール、サルグラモスチム、サトラプラチン、セブリプラチン、セムスチン、シムトラゼン、シゾフィラン、ソブゾキサン、ソラフェニブ、スパルホサート、スパルホス酸、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、スピロプラチン、スクアラミン、ストレプトニグリン、ストレプトバリシン、ストレプトゾシン、スホスファミド、スロフェヌル、リンゴ酸スニチニブ、６−ＴＧ、タセジナリン、タルク、タリソマイシン、タリムスチン、タモキシフェン、タリキダール、タウロムスチン、テコガラン、テガフール、テロキサントロン、テモポルフィン、テモゾロマイド、テニポシド／ＶＭ−２６、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアミプリン、チアゾフリン、チロミソール、チロロン、チムコダル、チモナシック、チラパザミン、トピキサントロン、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラベクテジン（エクチナサイジン７４３）、トラスツマブ、トレストロン、トレチノイン／ＡＴＲＡ、トリシリビン、トリロスタン、トリメトレキセート、四硝酸トリプラチン、トリプトレリン、トロホスファミド、ツブロゾール、ウベニメクス、ウラシルマスタード、ウレデパ、バルルビシン、バルスポダル、バプレオチド、ベルテポルフィン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビネピジン、ビンフルニン、ビンホルミド、ビングリシネート、ビンロイシノール、ビンロイロシン、ビノレルビン、ビンロシジン、ビントリプトール、ビンゾリジン、ボロゾール、キサントマイシンＡ（グアメシクリン）、ゼニプラチン、ジラスコルブ［２−Ｈ］、ジノスタチン、ゾレドロネート、ゾルビシンおよびゾスキダル、例えば：
アルデスロイキン（例えば、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標））、アレムツズマブ（例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、アリトレチノイン（例えば、ＰＡＮＲＥＴＩＮ（登録商標））、アロプリノール（例えば、ＺＹＬＯＰＲＩＭ（登録商標））、アルトレタミン（例えば、ＨＥＸＡＬＥＮ（登録商標））、アミホスチン（例えば、ＥＴＨＹＯＬ（登録商標））、アナストロゾール（例えば、ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、三酸化ヒ素（例えば、ＴＲＩＳＥＮＯＸ（登録商標））、アスパラギナーゼ（例えば、ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ＢＣＧ Ｌｉｖｅ（例えば、ＴＩＣＥ（登録商標）ＢＣＧ）、ベキサロテン（例えば、ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ブレオマイシン（例えば、ＢＬＥＮＯＸＡＮＥ（登録商標））、ブスルファン静脈内（例えば、ＢＵＳＵＬＦＥＸ（登録商標））、ブスルファン経口（例えば、ＭＹＬＥＲＡＮＴＭ）、カルステロン（例えば、ＭＥＴＨＯＳＡＲＢ（登録商標））、カペシタビン（例えば、ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、カルボプラチン（例えば、パラプラチン（登録商標））、カルムスチン（例えば、ＢＣＮＵ（登録商標）、ＢｉＣＮＵ（登録商標））、ポリフェプロザンを伴うカルムスチン（例えば、ＧＬＩＡＤＥＬ（登録商標）Ｗａｆｅｒ）、セレコキシブ（例えば、ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標））、クロラムブシル（例えば、ＬＥＵＫＥＲＡＮ（登録商標））、シスプラチン（例えば、ＰＬＡＴＩＮＯＬ（登録商標））、クラドリビン（例えば、ＬＥＵＳＴＡＴＩＮ（登録商標）、２−ＣｄＡ（登録商標））、シクロホスファミド（例えば、ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））、シタラビン（例えば、ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ（登録商標））、リポゾーマルシタラビン（例えば、ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））、ダカルバジン（例えば、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅυ）、ダクチノマイシン（例えば、ＣＯＳＭＥＧＥＮ（登録商標））、ダルベポエチンアルファ（例えば、ＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標））、リポゾーマルダウノルビシン（例えば、ＤＡＮＵオキソＭＥ（登録商標））、ダウノルビシン／ダウノマイシン（例えば、ＣＥＲＵＢＩＤＩＮＥ（登録商標））、デニロイキンジフチトクス（例えば、ＯＮＴＡＫ（登録商標））、デクスラゾキサン（例えば、ＺＩＮＥＣＡＲＤ（登録商標））、ドセタキセル（例えば、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、ドキソルビシン（例えば、アドリアマイシン（登録商標）、ＲＵＢＥＸ（登録商標））、ドコルビシンＨＣＬリポソーム注射剤（例えば、ＤＯＸＩＬ（登録商標））を含むリポゾーマルドキソルビシン、プロピオン酸ドロモスタノロン（例えば、ドロモスタノロン（登録商標）およびＭＡＳＴＥＲＯＮＥ（登録商標）注射剤）、エリオットＢ溶液（例えば、エリオットＢ溶液（登録商標））、エピルビシン（例えば、ＥＬＬＥＮＣＥ（登録商標））、エポエチンアルファ（例えば、ＥＰＯＧＥＮ（登録商標））、エストラムスチン（例えば、ＥＭＣＹＴ（登録商標））、リン酸エトポシド（例えば、ＥＴＯＰＯＰＨＯＳ（登録商標））、エトポシドＶＰ−１６（例えば、ＶＥＰＥＳＩＤ（登録商標））、エキセメスタン（例えば、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））、フィルグラスチム（例えば、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標））、フロクスウリジン（例えば、ＦＵＤＲ（登録商標））、フルダラビン（例えば、ＦＬＵＤＡＲＡ（登録商標））、５−ＦＵを含むフルオロウラシル（例えば、ＡＤＲＵＣＩＬ（登録商標））、フルベストラント（例えば、ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））、ゲムシタビン（例えば、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、ゲムツズマブ／オゾガマイシン（例えば、ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標））、酢酸ゴセレリン（例えば、ＺＯＬＡＤＥＸ（登録商標））、ヒドロキシウレア（例えば、ＨＹＤＲＥＡ（登録商標））、イブリツモマブ／チウキセタン（例えば、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標））、イダルビシン（例えば、ＩＤＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、イホスファミド（例えば、ＩＦＥＸ（登録商標））、メシル酸イマチニブ（例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））、インターフェロンアルファ−２ａ（例えば、ＲＯＦＥＲＯＮ−Ａ（登録商標））、インターフェロンアルファ−２ｂ（例えば、ＩＮＴＲＯＮ Ａ（登録商標））、イリノテカン（例えば、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、レトロゾール（例えば、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））、ロイコボリン（例えば、ＷＥＬＬＣＯＶＯＲＩＮ（登録商標）、ロイコボリン（登録商標））、レバミソール（例えば、ＥＲＧＡＭＩＳＯＬ（登録商標））、ロムスチン／ＣＣＮＵ（例えば、ＣｅｅＢＵ（登録商標））、メクロレタミン／ナイトロジェンマスタード（例えば、ＭＵＳＴＡＲＧＥＮ（登録商標））、酢酸メゲストロール（例えば、ＭＥＧＡＣＥ（登録商標））、メルファラン／Ｌ−ＰＡＭ（例えば、ＡＬＫＥＲＡＮ（登録商標））、６−ＭＰを含むメルカプトプリン（例えば、ＰＵＲＩＮＥＴＨＯＬ（登録商標））、メスナ（例えば、ＭＥＳＮＥＸ（登録商標））、メトトレキサート、メトキサレン（例えば、ＵＶＡＤＥＸ（登録商標））、マイトマイシンＣ（例えば、ＭＵＴＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、ＭＩＴＯＺＹＴＲＥＸ（登録商標））、ミトタン（例えば、ＬＹＳＯＤＲＥＮ（登録商標））、ミトキサントロン（例えば、ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（登録商標））、フェンプロピオン酸ナンドロロン（例えば、ＤＵＲＡＢＯＬＩＮ−５０（登録商標））、ノフェツモバブ（例えば、ＶＥＲＬＵＭＡ（登録商標））、オプレルベキン（例えば、ＮＥＵＭＥＧＡ（登録商標））、オキサリプラチン（例えば、ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））、パクリタキセル（例えば、ＰＡＸＥＮＥ（登録商標）、ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パミドロネート（例えば、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、ペガデマーゼ（例えば、ＡＤＡＧＥＮ（登録商標））、ペガスパルガーゼ（例えば、ＯＮＣＡＳＰＡＲ（登録商標））、ペグフィルグラスチム（例えば、ＮＥＵＬＡＳＴＡ（登録商標））、ペントスタチン（例えば、ＮＩＰＥＮＴ（登録商標））、ピポブロマン（例えば、ＶＥＲＣＹＴＥ（登録商標））、プリカマイシン／ミトラマイシン（例えば、ＭＩＴＨＲＡＣＩＮ（登録商標））、ポルフィマーナトリウム（例えば、ＰＨＯＴＯＦＲＩＮ（登録商標））、プロカルバジン（例えば、ＭＡＴＵＬＡＮＥ（登録商標））、キナクリン（例えば、ＡＴＡ塩水（登録商標））、ラスブリカーゼ（例えば、ＥＬＩＴＥＫ（登録商標））、リツキシマブ（例えば、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、サルグラモスチム（例えば、ＰＲＯＫＩＮＥ（登録商標））、ストレプトゾシン（例えば、ＺＡＮＯＳＡＲ（登録商標））、リンゴ酸スニチニブ（例えば、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、タルク（例えば、ＳＣＬＥＲＯＳＯＬ（登録商標））、タモキシフェン（例えば、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標））、テモゾロマイド（例えば、ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標））、テニポシド／ＶＭ−２６（例えば、ＶＵＭＯＮ（登録商標））、テストラクトン（例えば、ＴＥＳＬＡＣ（登録商標））、６−ＴＧを含むチオグアニン、チオテパ（例えば、チオＰＬＥＸ（登録商標））、トポテカン（例えば、ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、トレミフェン（例えば、ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））、トシツモマブ（例えば、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））、トラスツマブ（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、トレチノイン／ＡＴＲＡ（例えば、ＶＥＳＡＮＯＩＤ（登録商標））、ウラシルマスタード、バルルビシン（例えば、ＶＡＬＳＴＡＲ（登録商標））、ビンブラスチン（例えば、ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビンクリスチン（例えば、ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビノレルビン（例えば、ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））およびゾレドロネート（例えば、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））。
１つの例において、可溶性ＰＨ２０、例えば、ｅｓＰＨ２０、例えば、ペグ化されたｒＨｕＰＨ２０は、１種以上のドセタキセル（例えば、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、リポゾーマルドキソルビシン（例えば、ＤＯＸＩＬ（登録商標））、リンゴ酸スニチニブ（例えば、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））またはベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））の投与後、同時または投与前に対象に投与される。
したがって、本明細書において提供される可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、非癌性細胞と比較して内因性ヒアルロニダーゼ活性の減少を有するものを含む、転移性および非転移性癌の処置において使用することができる。ヒアルロニダーゼは、単独または他の化学療法と組み合わせて、化学療法剤として使用することができる。典型的な癌は、小肺細胞癌腫、肺扁平上皮癌、および乳房、卵巣、頭頸部の癌、またはヒアルロニダーゼ活性のレベルの低下もしくはヒアルロン酸異化の減少と関連する他のあらゆる癌を含むが、これらに限定されない。
ｂ．脳におけるグリコサミノグリカン蓄積の処置における使用
ヒアルロン酸レベルは、多くの脳脊髄の病理学的状態において上昇する。脳脊髄のヒアルロン酸のレベルは、通常、成人において２００μｇ／Ｌ未満であるが（Laurent et al. (1996) Acta Neurol Scand September 94(3):194-206）、髄膜炎、脊髄の狭窄、頭部外傷および頭部外傷のような疾患において８０００μｇ／Ｌを越えるレベルに上昇し得る。ヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ｒＨｕＰＨ２０は、非常に上昇したレベルの基質を分解することができる。
脳において有効なリンパ管の欠如は、また、頭部外傷後に、致命的な浮腫を引き起こし得る。ヒアルロン酸蓄積は、ヒアルロン酸シンターゼにより合成の増加および分解の減少の結果である。ヒアルロン酸の蓄積は、最初に、白血球の溢出を促進するために、損傷を受けた組織における水分含有量の増加の有益な目的に役立ち得るが、蓄積の継続は致死であり得る。頭部外傷を有する患者に、例えば、髄腔内または静脈内へのヒアルロニダーゼの投与は、組織ヒアルロン酸蓄積およびそれと関連している水を除去するために役立ち得る。
可溶性ＰＨ２０は、また、脳腫瘍と関連する浮腫、特に多形性グリア芽腫と関連するものの処置において使用することができる。脳腫瘍と関連する浮腫は、腫瘍に隣接する脳の非癌性部分におけるヒアルロン酸の蓄積をもたらす。ヒアルロン酸蓄積の部位への可溶性ＰＨ２０ヒアルロニダーゼの投与（例えば、静脈内注射によるか、またはシャントを介する）は、これらの部位で過剰なヒアルロン酸を分解することにより、このような悪性腫瘍と関連する浮腫を軽減することができる。
ｃ．心臓血管疾患におけるグリコサミノグリカン蓄積の処置における使用
可溶性ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、いくつかの心臓血管疾患の処置において使用することができる。実験的心筋梗塞後の動物モデルにおけるヒアルロニダーゼの投与は、梗塞のサイズを減少させることができる（Maclean, et al (1976) Science 194(4261):199-200）。これにより提案される１つのメカニズムは、虚血再かん流後に起こるヒアルロン酸蓄積を減少させることにより起こり得る。梗塞のサイズの減少は、リンパ排出の増加および組織酸素化の増加および心筋水分含有量の減少から起こると考えられる。
可溶性ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、また、動脈硬化症から冠動脈プラークを制限するために使用することができる。このようなプラークは、グリコサミノグリカンを蓄積し、マクロファージを介在し、細胞接着を形成する（Kolodgie et al. (2002) Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22(10):1642-8）。
ｄ．硝子体切除ならびに眼科疾患および状態における使用
ヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ＰＨ２０は、硝子体切除中の網膜の剥離または断裂を最小にするために使用することができる。これは、例えば、硝子体の除去前に、硝子体が網膜から分離される、または「放出される」ようにする。このような硝子体の放出または分離は、硝子体が除去されるときに、網膜のさらなる断裂または剥離が起こる可能性を最小にすることができる。
ヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ＰＨ２０は、米国特許第５，２９２，５０９号に記載されている硝子体切除補助剤適用を含む種々の眼適用のために使用することができる。高度に精製されたヒアルロニダーゼ、例えば、本明細書において提供される可溶性ＰＨ２０の使用は、免疫原性および毒性を最小化するための眼内処置のために好ましい。
可溶性ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、例えば、新血管形成を防止し、硝子体からの網膜に対して有毒な物質のクリアランス速度を増加させることにより、眼科疾患を処置および／または予防するために使用することができる。可溶性ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、眼に対する毒性障害を引き起こすことなく、眼の硝子体液を液化するために有効な量で投与することができる。硝子体液の液化は、硝子体房(vitreal chamber)からの液体交換速度を増加させる。この交換における増加は、存在が眼科的および網膜損傷を引き起こし得る汚染物質を除去する。
可溶性ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、また、術後圧力を減少させるために使用することができる。ヒアルロン酸は、主に白内障および眼内レンズ外科手術中のスペーサーとして、眼において使用されてきた。それは、また、他の眼の外科手術、例えば、緑内障、硝子体および網膜手術ならびに角膜移植において使用される。術後白内障患者において起こる一般的な副作用は、著しく早期の、および時折長期の、眼圧の上昇である。このような状態は、ときどき、とりわけ緑内障性視神経乳頭変化を有する患者において深刻である。ヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ＰＨ２０は、手術の前に眼にヒアルロン酸と共投与し、眼における術後圧力を減少させることができる。ヒアルロニダーゼは、手術中に有効性を減少させず、患者において副作用を引き起こすことなく、ヒアルロン酸を分解することにより眼圧を術前レベルに減少させるために有効な量で投与される（米国特許第６，７４５，７７６号）。
可溶性ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、また、小柱網からグリコサミノグリカンを除去し、眼圧を低下させるために、緑内障を有する患者に投与することができ、例えば、糖尿病性網膜症、網膜新血管形成、網膜静脈閉塞、後部硝子体剥離、網膜裂傷、眼外傷などの状態に関連して起こり得る硝子体出血（すなわち、硝子体への血液の溢出）の解決を促進するために、硝子体に適用することができる。一般的に解決が遅い硝子体出血の存在は、しばしば、増殖性糖尿病性網膜症のような状態に対する主な処置であるレーザー光凝固のような、診断および／または処置方法のために、網膜が硝子体を介して視覚化される必要がある方法を遅延、複雑化、または防止し得る。
ｅ．皮下注入における使用
皮膚の皮下組織への流体および電解質の注入である皮下注入は、軽度から中程度の脱水状態の成人患者、とりわけ高齢者に適当な有用かつ単純な水分補給技術である。安全かつ有効であると考えられるが、多数の頻繁な副作用は、局所マッサージまたは全身利尿薬により処置することができる軽度の皮下浮腫である。約３Ｌを、２つの別々の部位で２４時間に与えることができる。一般的な注入部位は、胸部、腹部、大腿部および上腕部を含む。皮下注入において使用される溶液は、例えば、生理食塩水、２分の１生理食塩水、塩水を有するグルコースおよび５％のグルコースを含む。塩化カリウムを、また、該溶液に加えることができる。溶液へのヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ＰＨ２０の添加は、流体吸収を増強し、全投与速度を増すことができる。
ｆ．遺伝子治療における使用
インビボでの多数の遺伝子送達ビヒクルの有効性は、インビトロで見られ、観察される有効性と対応しない。グリコサミノグリカンは、多数の細胞型へのＤＮＡおよびウイルスベクターの移動および拡散を妨げることができる。このような細胞外マトリックス物質のレベルは、該プロセスをかなり妨げることができる。ヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ＰＨ２０の投与は、細胞外マトリックスのチャネルを開け、したがって、遺伝子治療の送達を増強することができる。例えば、可溶性ＰＨ２０は、インビボでのＤＮＡの形質導入を容易にするために、コラゲナーゼと投与することができる（Dubensky et al. (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81(23):7529-33）。ヒアルロニダーゼは、また、アデノ随伴ウイルスを使用して、遺伝子治療を増強することができる（Favre et al, (2000) Gene Therapy 7(16):1417-20）。ヒアルロニダーゼの投与後に開かれるチャネルは、一般的に、小分子、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびＤＮＡ複合体（ならびに興味ある他の治療剤および薬物）の拡散を増強するサイズである。しかしながら、孔は、細胞の転位および運動を促進するほど大きくはない。
いくつかの例において、ウイルスを、ヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ＰＨ２０を発現し、それらの複製および標的組織内の広がりを容易にするように操作することができる。標的組織は、例えば、癌性組織であってよく、ウイルスを腫瘍内で選択的複製を可能にする。ウイルスは、また、組織特異的プロモーターの下で選択的に複製する非溶菌性ウイルスであり得る。ウイルスが複製するため、ヒアルロニダーゼのウイルス遺伝子との共発現は、インビボでウイルスの広がりを容易にすることができる。
ｇ．化粧用途
ヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ＰＨ２０は、投与することにより、セルライトの蓄積に関与するグリコサミノグリカンを除去し、リンパ流量を促進することができる。例えば、可溶性ＰＨ２０は、セルライトの処置のために使用することができる。ヒアルロニダーゼは、反復皮下注射を介して、軟膏もしくはクリームの形態の経皮送達を介して、または注射可能な持続放出製剤の使用を介して、グリコサミノグリカンの連続分解を容易にし、それらの回帰を防止するために投与することができる。
ヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ＰＨ２０は、また、「豚皮状」浮腫または「オレンジ皮状」浮腫のような状態を処置するために使用することができる。ヒアルロニダーゼは、結合水および代謝廃棄物を排除する有機液体の拡散の毛細血管圧縮による遅延の保持に関与する、真皮中に蓄積され得る長いムコ多糖鎖の脱重合を達成することができる。脂質細胞の脂肪過負荷と関連するこのような水および廃棄物の保持は、従来の「豚皮状」浮腫または「オレンジ皮状」浮腫を構成する。脱重合は、ムコ多糖類の長い鎖を短い鎖に切断し、結合水および廃棄物の排出ならびに静脈およびリンパ循環の回復をもたらし、局所浮腫の消失になり得る。
ｈ．臓器移植における使用
臓器中のヒアルロン酸の含量は、炎症で増加され得る。ヒアルロン酸の濃度の増加は、炎症性−免疫学的傷害、例えば、肺胞炎（Nettelbladt et al. (1991) Am. Rev. Resp. Dis. 139: 759-762）および心筋梗塞（Waldenstrom et al. (1991) J. Clin. Invest. 88(5): 1622-1628）により特徴付けられる異なる臓器由来の組織において観察されている。他の例は、腎臓（Hallgren et al. (1990) J. Exp. Med. 171: 2063-2076; Wells et al. (1990) Transplantation 50: 240-243）、小腸（Wallander et al. (1993) Transplant. Int. 6: 133-137）もしくは心臓（Hallgren et al. (1990) J Clin Invest 85:668-673）移植後の同種移植片拒絶反応、またはウイルス起源の心筋炎症（Waldenstrom et al. (1993) Eur. J. Clin. Invest. 23: 277-282）を含む。臓器の移植に関連する間質浮腫の発生は、移植手術の分野においていくつかの問題となる。間質浮腫を有する移植片は、機能が一時的に喪失される程度に膨潤し得る。場合によっては、膨潤は腎臓の破壊を引き起こし、大量出血を引き起こし得る。ヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ＰＨ２０は、臓器移植における蓄積したグリコサミノグリカンを分解するために使用することができる。このようなグリコサミノグリカンの除去は、移植片からの水の除去を促進し、したがって臓器機能を増強する。
ｉ．肺疾患における使用
正常個体由来の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）中のヒアルロン酸のレベルは、一般的に１５ｎｇ／ｍｌ未満である。ＢＡＬ中のヒアルロン酸レベルは、呼吸困難の状態において劇的に上昇する（Bjermer et al.(1987) Br Med J (Clin Res Ed) 295(6602):803-6）。肺におけるヒアルロン酸の増加は、酸素拡散およびガス交換ならびに好中球およびマクロファージ応答の活性化を防止することができる。可溶性ＰＨ２０、例えば、本明細書において提供されるものの精製された調製物を、肺または静脈内送達のいずれかにより、このような状態を示す患者に送達し、ヒアルロナンレベルを減少させることができる。ヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ＰＨ２０は、また、グリコサミノグリカンの上昇と関連する他の肺の合併症に罹患している患者に、または肺への他の共送達される分子の送達を増強するために投与することができる。
３．他の使用
その治療的使用のさらなる例において、ヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ＰＨ２０、例えば、本明細書において提供されるｅｓＰＨ２０は、このような目的のために、壊死物質、例えば、ビンカアルカロイドの静脈傍注射由来の局所壊死に対する解毒剤として（Few et al. (1987) Amer. J. Matern. Child Nurs. 12、23-26）、ガングリオン嚢胞の処置（Paul et al. (1997) J Hand Surg. 22 (2): 219-21）および静脈不全による組織壊死の処置（Elder et al. (1980) Lancet 648-649）のために使用することができる。可溶性ＰＨ２０は、また、最も一般的な手の軟組織塊であり、皮膚の下に感知することができる液体で満たされた嚢であるガングリオン嚢胞（手首嚢胞、聖書嚢胞または背側腱嚢胞としても知られている）を処置するために使用することができる。
ヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ＰＨ２０を、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）を分解することにより脊髄損傷の処置において使用することができる。脊髄損傷後、ＣＳＰＧを含むグリア性瘢痕は星状細胞により生産される。ＣＳＰＧは、軸索成長の阻害において重要な役割を果たす。加えて、ＣＳＰＧの発現は、中枢神経系（ＣＮＳ）の損傷後に増加することが示されている。可溶性ＰＨ２０は、また、化学的髄核融解術として知られるプロセスにおいて椎間板ヘルニアの処置のために利用することができる。ヒアルロニダーゼと同様の基質を開裂する酵素であるコンドロイチナーゼＡＢＣは、腰椎における椎間板内圧の減少を誘導することができる。３タイプの椎間板損傷がある。膨隆型椎間板は、無傷であるが、膨隆しているものである。脱出型椎間板において、線維包(fibrous wrapper)は破れており、ＮＰは漏出しているが、まだ椎間板と結合している。隔離型椎間板において、ＮＰのフラグメントは、椎間板からはずれ、脊柱管中に遊離している。化学的髄核融解術は、一般的に、膨隆型および脱出型椎間板に対して有効であるが、隔離型椎間板損傷に対して有効ではない。
Ｉ．実施例
以下の実施例は、説明の目的のみのために含まれており、本発明の範囲を制限する意図はない。
実施例１
ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのカルボキシ−末端欠失変異体の産生
本実施例において、一連のヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのカルボキシ−末端欠失変異体を産生した。成熟体ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼまたは精子接着分子１（ＳＰＡＭ１）は４７４個のアミノ酸を含むが、本実施例において産生された成熟カルボキシ−末端欠失変異体は４７２個のアミノ酸から４１５個のアミノ酸の長さの範囲であった。
短縮されているヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのアミノ酸Ａ５０７からアミノ酸Ｋ４５０のカルボキシ−末端欠失変異体をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドを、標準ＤＮＡ合成プロトコールにしたがって合成した。親ＤＮＡ配列はコドン最適化ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼであった、そしてこの核酸配列は配列番号：２に記載されている。このコドン最適化ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、配列番号：１４４に記載されている異種免疫グロブリンカッパ（ＩｇＫ）シグナル配列を含んだ。さらに、該配列は、ＨＺ２４プラスミド（配列番号：１４０）にクローニングできるように５’ＮｈｅＩおよび３’ＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を含んだ。ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのカルボキシ−末端欠失変異体の核酸配列は、配列番号：１４６−１８５および１９９−２０１に記載されている。合成ＤＮＡ配列をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、同様に消化されたＨＺ２４プラスミドにクローニングし、それぞれの個々のクローンのために成熟ＳＰＡＭ１−ＨＺ２４プラスミドを産生した。
ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのカルボキシ−末端欠失変異体は、表３に記載されている。ＳＰＡＭ１成熟体は、タンパク質のＣ−末端の４個のアミノ酸により同定される。前駆体および成熟体カルボキシ−末端欠失変異体のアミノ酸の長さが記載されている。
Figure 0005885765
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実施例２
ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのカルボキシ−末端欠失変異体の発現
本実施例において、実施例１において産生されるヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのカルボキシ−末端欠失変異体を、ＣＨＯ−Ｓ細胞において発現させた。さらに、ｒＨｕＰＨ２０およびＨｉｓ−タグＰＨ２０を、Ｌｅｃ１（カタログナンバーＣＲＬ−１７３５、ＡＴＣＣ）、Ｌｅｃ２（カタログナンバーＣＲＬ−１７３６、ＡＴＣＣ）、Ｌｅｃ８（カタログナンバーＣＲＬ−１７３７、ＡＴＣＣ）およびＰｒｏ−５（カタログナンバーＣＲＬ−１７８１）を含む、レクチン耐性ＣＨＯ変異体の４つの株のぞれぞれにおいて発現させた。Ｌｅｃ変異細胞におけるＰＨ２０の発現は、以下の実施例９においてさらに議論されている。
Ａ．６−ウェルプレートにおけるＣＨＯ−Ｓ細胞の一過性発現
実施例１において産生された変異ＰＨ２０−ＨＺ２４プラスミドを、製造業者の指示にしたがってＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（登録商標）（Novagen）を使用して、ＣＨＯ−Ｓ細胞（チャイニーズハムスター卵巣ＣＨＯ Ｋ１細胞由来）に一過性に感染させた。手短に言えば、ＣＨＯ−Ｓ細胞をＬ−グルタミンを補ったＣＤ ＣＨＯ培地において増殖した。トランスフェクション前に、ＣＨＯ−Ｓ細胞をウェルあたり約５×１０５細胞で６−ウェルプレートに置き、３７℃で５％ＣＯ２で一晩増殖した。次に培地を取り出し、ＣＨＯ−Ｓ細胞を１ｍＬの無血清培地で２回洗浄した。ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（登録商標）を血清非含有培地と混合し、次に２μｇの変異−ＨＺ２４ ＤＮＡを加えた。室温で５−１５分インキュベート後、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（登録商標）／ＤＮＡ混合物を洗浄したＣＨＯ−Ｓ細胞を含む個々のウェルに滴下した。４時間後、培地をＬ−グルタミンを補った１ｍＬのＣＤ−ＣＨＯ培地と置き換え、細胞を３７℃で５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。発現後、培地および細胞を別々に回収した。
Ｂ．１０ｃｍの細胞培養皿におけるＣＨＯ細胞の一過性発現
実施例１において産生された変異ＰＨ２０−ＨＺ２４プラスミドを、製造業者の指示にしたがってＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（登録商標）（Novagen）を使用して、ＣＨＯ−Ｓ細胞に一過性に感染させた。あるいは、ＨＺ２４−ＰＨ２０（ｒＨｕＰＨ２０をコードする配列番号：１０８）、ＰＨ２０ｓＨｉｓ（ヒス−タグＰＨ２０をコードする配列番号：１８７）およびＨＺ２４−ｍｕｔ（Ｂ／Ｓ）（アミノ酸４８２で短縮されたＰＨ２０をコードする配列番号：１２２）を、製造業者の指示にしたがってＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（登録商標）（Novagen）を使用して、Ｌｅｃ１（カタログナンバーＣＲＬ−１７３５、ＡＴＣＣ）、Ｌｅｃ２（カタログナンバーＣＲＬ−１７３６、ＡＴＣＣ）、Ｌｅｃ８（カタログナンバーＣＲＬ−１７３７、ＡＴＣＣ）およびＰｒｏ−５（カタログナンバーＣＲＬ−１７８１）を含むレクチン耐性ＣＨＯ変異体の４つの株に一過性に感染させた。
手短に言えば、ＣＨＯ−Ｓ細胞を８ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘを補ったＣＤ−ＣＨＯ培地において維持した。レクチン耐性ＣＨＯ変異細胞を１０％のＦＢＳを補ったＤＭＥＭ培地において増殖した。トランスフェクション前に、ＣＨＯ細胞をウェルあたり約３×１０６細胞で１０ｃｍの細胞培養皿に置き、１０％のＦＢＳを補ったＤＭＥＭ培地中で３７℃で５％ＣＯ２で一晩増殖した。次に培地を除去し、細胞の単層を１０ｍＬの無血清培地で２回洗浄した。３６μＬのＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（登録商標）を１．２ｍＬのＤＭＥＭと混合し、室温で５分インキュベートした。インキュベーション後、１２μｇのＤＮＡを加え、穏やかに混合した。室温で１５分インキュベーション後、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（登録商標）／ＤＮＡ混合物をＣＨＯ細胞の単層に滴下し、細胞培養皿を混合するために穏やかに振盪した。プレートを３７℃で５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。４時間後、培地をＧｌｕｔａｍａｘ−１を補った１２ｍＬの界面活性剤フリーのＣＤ ＤＧ４４培地と置き換え、細胞を３７℃で５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。発現後、培地および細胞を別々に回収した。
実施例３
ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのカルボキシ−末端欠失変異体の溶解度
本実施例において、上記実施例２に記載されている一過性発現後、培地および細胞を別々に回収し、ウエスタンブロット分析によりＰＨ２０発現および溶解度について分析した。Ｃ−末端切断変異体の溶解度を、発現されたタンパク質が増殖培地または細胞中に存在するか否かを調べることにより測定した。配列番号：５５−６５および９９−１０１に対応する４５５から４７２アミノ酸長のＣ−末端欠失変異体は、タンパク質を細胞膜に付着させるために役立つＧＰＩアンカー由来のアミノ酸残基を含む。これらの変異体を発現する細胞を、培地への可溶性タンパク質の放出を可能にするＧＰＩアンカーを開裂するホスホイノシトール−ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）で処理し、得られた培地および細胞中のＰＨ２０の存在をウエスタンブロット分析により測定した。
Ａ．ウエスタンブロット分析
非還元サンプルを４−２０％のトリス−グリシンゲル上に置き、ｉＢｌｏｔ（Invitrogen）を使用してＰＶＤＦ膜に移した。ウエスタンブロットのために、ウサギ抗−ＰＨ２０ＩｇＧ（０．５μｇ／ｍＬ）を一次抗体として使用し、ＨＲＰ−結合ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（０．１ｎｇ／ｍＬ、Ｃａｔ＃ ＤＣ０３Ｌ、ＥＭＤ）を二次抗体として使用した。発現の証拠は、組換えヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼに対応する約６６ｋＤａでのバンドにより決定される。
Ｂ．ＰＩ−ＰＬＣ処理
１．６−ウェルプレートにおける一過性発現
上記実施例２Ａに記載されている７２時間ＣＨＯ−Ｓ細胞におけるｒＨｕＰＨ２０の発現後、培地および細胞を別々に回収した。細胞を血清非含有培地で洗浄し、次にウェルあたり２ｍＬの血清非含有培地を加えた。ＰＩ−ＰＬＣ（０．５ユニット／ウェル）をそれぞれのウェルに加え、細胞をＰＩ−ＰＬＣ中で２時間インキュベートした。得られた培地および細胞を上記のようにウエスタンブロット分析により分析した。
２．１０ｃｍの組織培養皿における一過性発現
１つはＰＩ−ＰＬＣで処理され、およびもう１つはＰＩ−ＰＬＣで処理されない、それぞれｒＨｕＰＨ２０を発現するＣＨＯ−Ｓ細胞の２つのプレートで、上記実施例２Ｂに記載されているそれぞれのＣ−末端変異体を製造した。４８時間発現後、ＰＩ−ＰＬＣで処理しなかった細胞において、培地および細胞を別々に回収した。回収した培地を沈降させ、１０ｍＬの容量に濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ ３０ｋＤ ＭＷＣＯ濃縮器を使用してＰＢＳにバッファー交換した。細胞を冷ＰＢＳで濯ぎ、解体し、プロテアーゼ阻害剤Ｓｅｔ ＩＩＩ（カタログナンバー５３９１３４、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を有する１．２ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。再懸濁した細胞を手短に超音波処理し、全細胞抽出物を調製した。細胞のＰＩ−ＰＬＣ処理のために、発現の４８時間後、上記のように未処理培地を回収した。細胞をＧｌｕｔａｍａｘ−１を含む新鮮なＣＤ ＤＧ４４培地で１回濯ぎ、培地を皿あたり３．０ユニットのＰＩ−ＰＬＣでＧｌｕｔａｍａｘ−１を補った１２ｍＬの新鮮な界面活性剤フリーＣＤ ＤＧ４４培地と置き換え、細胞を３７℃で５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。２時間後、上記のようにＰＩ−ＰＬＣ培地および細胞を別々に回収した。得られた未処理培地および細胞ならびにＰＩ−ＰＬＣ処理培地および細胞を、上記のようにウエスタンブロット分析により分析した。
Ｃ．結果
結果は以下の表４に記載されている。４つの変異体、ＩＬＦＬ（配列番号：５８）、ＳＩＬＦ（配列番号：１００）、ＶＳＩＬ（配列番号：５９）およびＩＶＳＩ（配列番号：１０１）は、ＰＨ２０の低い発現を示した。ウエスタンブロット分析は、約６６ｋＤａでのタンパク質バンドにより証明されるとおり、ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのＦ５００（配列番号：５９−９５および１００−１０１）よりも短いカルボキシ−末端欠失変異体が培地に発現されることを示す。ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのＬ５０１からＡ５０７でのカルボキシ−末端欠失変異体（配列番号：５５−５８および９９）は細胞中に発現される。ＰＩ−ＰＬＣでこれらの細胞が処理されると、約６６ｋＤａでのタンパク質バンドにより証明されるとおり、ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼを培地に放出する。配列番号：５９−６５および１００−１０１に対応するヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのカルボキシ−末端欠失変異体由来の細胞のＰＩ−ＰＬＣでの処理は、これらのタンパク質が最初に培地に発現されるため、効果がなかった。
Figure 0005885765
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実施例４
Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４アッセイを使用するヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのカルボキシ−末端欠失変異体の溶解度
本実施例において、ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのカルボキシ−末端欠失変異体の溶解度をＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４アッセイを使用して試験した。このアッセイにおいて、可溶性ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは３７℃に温められたＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４溶液の水相に分配するが（Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7により記載されているとおりに修飾）、膜に固定されたＰＨ２０ヒアルロニダーゼは界面活性剤リッチ相に分配する。
この目的のために、ＰＢＳ中の２％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４を０℃で上記実施例３Ｂで製造されるとおりの２００μＬの組織培養培地または細胞抽出物に加え、サンプルを氷上でインキュベートした。分離のために、サンプルをマイクロチューブ中で４℃で０．０６％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４を含む３０μＬのスクロースクッション（６％ｗ／ｖ）上に覆った。相分離を誘導するためにサンプルを３７℃で３分加熱し、４０００ｇで室温で３分遠心した。水性および界面活性剤相をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびウエスタンブロット法のために取り出した。ウサギ抗−ＰＨ２０ＩｇＧ（０．５μｇ／ｍＬ）を一次抗体として使用し、ＨＲＰ−結合ヤギ−ウサギＩｇＧ（０．１ｎｇ／ｍＬ、Ｃａｔ＃ ＤＣ０３Ｌ、ＥＭＤ）を二次抗体として使用した。界面活性剤相に強く分配する全長ヒトＰＨ２０を対照として使用した。
カルボキシ−末端欠失変異体の溶解度の結果を表５に示す。ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのＦ５００までのカルボキシ−末端欠失変異体（前駆体配列番号：７−１３および４８−４９または成熟体配列番号：５９−６５および１００−１０１）は、水相に分配し、したがって可溶性である。ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのＦ５００より長いカルボキシ−末端欠失変異体（配列番号：５５−５８および９９）は、界面活性剤相に分配し、不溶性である。全長ＰＨ２０は、また、不溶性である。
Figure 0005885765
実施例５
ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのカルボキシ−末端欠失変異体のヒアルロニダーゼ活性
本実施例において、ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのカルボキシ−末端欠失変異体を、ビオチン化−ヒアルロン酸（ビオチン化−ＨＡまたはｂＨＡ）を用いたマイクロタイターアッセイを使用して、それらのＰＨ２０ヒアルロニダーゼ活性について試験した。ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのカルボキシ−末端欠失変異体を、ｐＨ７．４およびｐＨ５．５の両方でヒアルロニダーゼ活性について試験した。
手短に言えば、４×ＢＨＸ ９６−ウェルプレートをビオチン化−ＨＡ（１．１ＭＤａ）で被覆した。トランスフェクション７２時間後、ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのカルボキシ−末端欠失変異体でトランスフェクトされた細胞由来の上清を、ｐＨ７．４またはｐＨ５．５のいずれかでバッファーで希釈し、プレートの個々のウェルに加え、３７℃で９０分インキュベートした。反応を４ＭのグアニジンＨＣｌの添加により終結させた。ウェルをＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を有するリン酸緩衝生理食塩水で４回洗浄し、消化されたすべてのビオチン化−ＨＡを取り出し、次に室温で１時間でストレプトアビジン−ＨＲＰを加えた。ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄し、プレートをＴＭＢで発色させた。プレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して４５０ｎｍで読んだ。ヒアルロニダーゼ活性（ユニット／ｍＬ）を、ヒアルロニダーゼ参照標準曲線を用いて４５０ｎｍでの測定される吸光度を補間することにより決定した。全長成熟体ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼおよび非トランスフェクトＣＨＯ細胞を陽性および陰性対照として使用した。
結果を以下の表６および６Ａに示す。ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのＳＰＡＭ１−ＧＤＶＣからＳＰＡＭ１−ＡＤＶＫ（配列番号：８８−９５）に対応するＩ４３０より短いカルボキシ−末端欠失変異体は不活性である。ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのＩ４９８（配列番号：１０１）、Ｌ４９９（配列番号：５９）、Ｆ５００（配列番号：１００）、Ｌ５０１（配列番号：５８）およびＩ５０２（配列番号：９９）で終わるカルボキシ−末端欠失変異体は、低い発現レベルによってわずかに検出可能な活性を有する。他のすべてのヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのカルボキシ−末端欠失変異体（配列番号：５５−５７および６０−８７）は、ｐＨ７．４およびｐＨ５．５の両方で活性なヒアルロニダーゼである。
Figure 0005885765
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実施例６
ＬＣ−ＭＳによるｒＨｕＰＨ２０のグリカン分析
本実施例において、ｒＨｕＰＨ２０（配列番号：１２２）のグリカン分析試験をトリプシン消化ＰＨ２０の質量スペクトル分析により行った。
簡潔には、ｒＨｕＰＨ２０（実施例１５Ｃで生産されるとおりの）を凍結乾燥し、６ＭのグアニジンＨＣＬ、０．００２ＭのＥＤＴＡおよび０．０２ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．２８を含むバッファーで０．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度に再懸濁した。ＤＴＴ（１０ｍＭの最終濃度）を加え、タンパク質／ＤＴＴ混合物を３７℃で１時間インキュベートした。還元後、ヨードアセトアミドを２０ｍＭの最終濃度に加えた。最後に、トリプシン（１：２５ｗ／ｗ）を加え、混合物を３７℃で２０時間インキュベートした。
トリプシン消化物をＬＣ−ＭＳにより分析した。簡潔には、トリプシン消化物を以下の表７に記載されている条件を使用するＣ１８逆相カラムに注入した。ＭＳデータを陽性イオンモードにおけるエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を使用してＱ−ＴＯＦ Ｕｌｔｉｍａ質量分析計で回収した。データをＭＳモードにおけるｍ／ｚ２００−１９５０から得た。糖ペプチドをＧｌｙｃｏＭｏｄソフトウェア（www.expasy.ch/tools/glycomod/）を使用して分析し、グリカン型を決定した。
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ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、Ｔ４７５に１つのＯ−グリコシル化部位を有する。該部位は１または２個のシアル酸を有する核型１グリカンにより占有される。ｒＨｕＰＨ２０は、Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３を含む６つの異なるアスパラギン残基でグリコシル化される。結果は、Ｎ２５４が約７５％占有され、Ｎ３９３が約８５％占有され、Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５およびＮ３６８の残りの４つの部位が９９％以上占有されることを示す。高マンノース、ハイブリッドおよび複合型の全３つの型のＮ−グリカンがｒＨｕＰＨ２０に存在する。一般的に、ｒＨｕＰＨ２０は、約４５％の高マンノースグリカン、４５％の複合型グリカンおよび１０％のハイブリッドグリカンを含む。全グリカンの約３５％はアニオン性であり、その２５％はシアル酸を含み、残りの１０％は未知のアニオン性基、恐らくリン酸基を含む。多数の複合型グリカンはフコシル化されており、アニオン性複合型グリカンは、ほとんど１個のシアル酸を含むが、それらの一部は２個のシアル酸を含む。それぞれのアスパラギン残基は、Ｎ２３５を除いて、約９０％が１つの型のグリカンを有し、少ない割合で他の２つの型のグリカンを有する。それぞれの残基に対する主要なグリカン型は、以下の表８に記載されている。残基Ｎ８２、Ｎ１６６およびＮ２５４は、複合型グリカンにより占有される。残基Ｎ３６８およびＮ３９３は、高マンノースグリカンにより占有される。残基Ｎ２３５は、約８０％の高マンノースグリカンと約２０％の複合型グリカンにより占有される。
Figure 0005885765
実施例７
エンドグリコシダーゼでの処理によるヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼの脱グリコシル化
本実施例において、ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼを、精製されたｒＨｕＰＨ２０（配列番号：１２２）の種々のグリコシダーゼでの処理により脱グリコシル化し、ヒアルロニダーゼ活性を評価した。ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３を含む６つの異なるアスパラギン残基でグルコシル化される。すべてのＮ−グリカンを開裂するＰＮＧａｓｅＦ（New England Biolabs, Cat. No. P0704S, Lot #34）；高マンノースおよびハイブリッド型グリカンを開裂するＥｎｄｏＦ１；二分岐複合型グリカンを開裂するＥｎｄｏＦ２；二以上の分岐複合型グリカンを開裂するＥｎｄｏＦ３；および高マンノースおよびハイブリッド型グリカンを開裂するＥｎｄｏＨ（New England Biolabs, Cat. No. P0702S）を含む５つのグリコシダーゼを、脱グリコシル化されたヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼを生産するために使用した。したがって、ＰＮＧａｓｅＦでの処理は完全脱グリコシル化をもたらすが、エンドグリコシダーゼでの処理は部分的脱グリコシル化のみをもたらす。
完全脱グリコシル化について、精製されたｒＨｕＰＨ２０（０．１ｍｇ／ｍＬの最終濃度）を、３７℃で一晩５０ｍＭのリン酸バッファーｐＨ７．２中で、ＰＮＧａｓｅＦ（５０，０００ユニット／ｍＬ）とインキュベートした。部分的脱グリコシル化について、精製されたｒＨｕＰＨ２０（０．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度）を、３５℃で一晩５０ｍＭの酢酸ナトリウムバッファーｐＨ５．０中で、０．３ユニット／ｍＬのエンドグリコシダーゼ（ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３またはＥｎｄｏＨのいずれか）または全４つのエンドグリコシダーゼの混合物とインキュベートした。ｒＨｕＰＨ２０の脱グリコシル化をＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＰＨ２０の移動度の変化により分析した。ヒアルロニダーゼ酵素活性を実施例５に記載されているとおりに測定した。
ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、約６６ｋＤａの分子量を有する。ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＨまたはＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３およびＥｎｄｏＨの混合物での処理は、約５６ｋＤａの分子量へのＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動度シフトにより測定されるとおり、部分的に脱グリコシル化されたヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼをもたらした。ＰＮＧａｓｅＦでの処理は、ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼの完全脱グリコシル化をもたらした。ｒＨｕＰＨ２０の部分的脱グリコシル化は、ヒアルロニダーゼ酵素活性の不活性化をもたらさなかったが、Ｎ−グリカンを完全に除去するためのＰＮＧａｓｅＦでの包括的消化は、ヒアルロニダーゼ酵素活性の全喪失をもたらした（以下の表９参照）。
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実施例８
ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのグリコシル化阻害剤での処理
本実施例において、ｒＨｕＰＨ２０（配列番号：１２２）を２つのグリコシル化阻害剤のそれぞれの存在下で一過性に発現させ、ヒアルロニダーゼ分泌および活性を評価した。キフネンシンは、グリカンプロセッシングに関連する酵素である強力な阻害剤マンノシダーゼＩである（例えば、Elbein et al., J Biol Chem, 265:15599-15605 (1990)参照）。ツニカマイシンは、酵素ＧｌｃＮＡｃホスホ−トランスフェラーゼ（ＧＰＴ）を阻害し、それによりすべてのＮ−グリカンの合成を妨げる相同ヌクレオシド抗生物質の混合物である（例えば、Boehme et al., Eur. J. Biochem. 269:977-988 (2002)参照）。
簡潔には、１×１０６個のｒＨｕＰＨ２０を発現するＨＺ２４−２Ｂ２細胞（以下の実施例１４参照）を２つの１２５ｍＬフラスコ中の２４ｍＬの完全ＣＤ−ＣＨＯ培地に播種した。ツニカマイシン（ＤＭＳＯに溶解させる）またはキフネンシン（新たに水に溶解させる）を５μｇ／ｍＬの最終濃度に加えた（１２μＬのＤＭＳＯを含む）。対照として、１つのフラスコに１×１０６個のｒＨｕＰＨ２０を発現するＨＺ２４−２Ｂ２細胞を播種し、１２μＬのＤＭＳＯをビヒクル対照として加えた。ツニカマイシンまたはキフネンシンのいずれかの添加後、細胞を３７℃で５％のＣＯ２で４−６時間インキュベートした。発現後、２ｍＬの培養物を取り出し、５００ｇで５分遠心した。上清を４℃で保存し、細胞ペレットを−２０℃で保存した。残りの２２ｍＬの培養物を５００ｇで５分遠心した。上清を４℃で保存した。細胞を元の２つの１２５ｍＬフラスコ中の２２ｍＬの完全ＣＤ−ＣＨＯ培地に再懸濁した。ツニカマイシンまたはキフネンシンを５μｇ／ｍＬの最終濃度で培養物に加え、細胞を３７℃で５％のＣＯ２でインキュベートした。２ｍＬの培養物を、培地交換後約２４時間毎にそれぞれのフラスコから取り出した。それぞれの時点について、上清を４℃で保存し、細胞ペレットを−２０℃で保存した。ｒＨｕＰＨ２０の発現をウエスタンブロット分析により分析し、ヒアルロニダーゼ活性をビオチン化ＨＡ酵素的アッセイを使用して測定した（上記実施例３および５に記載されているとおり）。
結果を、生存細胞の数およびＰＨ２０活性を記載している以下の表１０−１３に示す。表１０−１１に示されるとおり、ツニカマイシンは、組織培養培地および細胞内両方のＰＨ２０活性を阻害し、また、細胞生存能力の完全な喪失をもたらす。さらに、ツニカマイシンでの１時間の処理は、細胞ペレット画分における約５６ｋＤａの分子量へのＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動度シフトにより測定されるとおり、細胞内部の脱グリコシル化されたヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼの蓄積をもたらす。表１２−１３に示されるとおり、キフネンシンはＰＨ２０の活性に影響しなかったが、ウエスタンブロット分析は、キフネンシンが処理細胞におけるｒＨｕＰＨ２０の発現および分泌を阻害することを示した。
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実施例９
レクチン耐性ＣＨＯ変異体におけるｒＨｕＰＨ２０の一過性発現
本実施例において、ｒＨｕＰＨ２０を４つのレクチン耐性ＣＨＯ変異体において一過性に発現させ、ヒアルロニダーゼ分泌および活性を評価した。レクチン耐性ＣＨＯ変異体は、以下の表１４に要約されている。Ｐｒｏ−５細胞は、ガラクトシル化Ｎ−グリカンにおける還元を引き起こすガラクトシルトランスフェラーゼβ４ｇａｌＴ−６を欠いている（例えば、Lee et al. J. Biol. Chem. 276:13924-13934 (2001)参照）。Ｌｅｃ１細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ活性を欠き、したがって複合体型またはハイブリッドグリカンを合成しない（例えば、Chen and Stanley, Glycobiology, 13:43-50 (2003)参照）。Ｌｅｃ２およびＬｅｃ８は、ＥＲまたはゴルジ膜を通って糖ヌクレオチドを輸送する糖ヌクレオチド輸送体を欠いている。Ｌｅｃ２細胞は、ＣＭＰ−シアル酸（すなわち、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の位置を変えることができず、したがってアシアロ細胞表面の発現を引き起こす（例えば、Eckhardt et al., J. Biol. Chem. 273:20189-20195 (1998)参照）。Ｌｅｃ８細胞は、ＵＤＰ−ガラクトースの位置を変えることができず、したがってガラクトースを欠いているグリカンを引き起こす（例えば、Bakker et al., Glycobiology, 15:193-201 (2005)参照）。
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簡潔には、ＰＨ２０ｓＨｉｓ（ヒス−タグＰＨ２０をコードする、配列番号：１８７）を、上記実施例２Ａに記載されているＬｅｃ１（カタログナンバーＣＲＬ−１７３５、ＡＴＣＣ）、Ｌｅｃ２（カタログナンバーＣＲＬ−１７３６、ＡＴＣＣ）、Ｌｅｃ８（カタログナンバーＣＲＬ−１７３７、ＡＴＣＣ）およびＰｒｏ−５（カタログナンバーＣＲＬ−１７８１）を含むレクチン耐性ＣＨＯ変異体の４つの株のそれぞれにおいて発現させた。さらに、ＨＺ２４−ｍｕｔ（Ｂ／Ｓ）（アミノ酸４８２でＰＨ２０短縮をコードする、配列番号：１２２）は、Ｐｒｏ−５細胞において一過性に発現され、陰性対照として、Ｐｒｏ−５細胞はｍｏｃｋトランスフェクションに付した。得られた細胞培養培地をウエスタンブロット分析により分析し、ヒアルロニダーゼ活性をビオチン化ＨＡ酵素的アッセイを使用して測定した（上記実施例３および５に記載されているとおり）。
結果は、約６６ｋＤａのタンパク質バンドにより証明されるとおり、Ｌｅｃ変異体において発現されるｒＨｕＰＨ２０が培地に分泌されることを示す。ｂＨＡ酵素的アッセイの結果は、レクチン耐性ＣＨＯ変異体、細胞をトランスフェクトするために使用されたプラスミドをコードするＰＨ２０、ならびに１：２７および１：８１の両方の希釈物におけるｐＨ５．５でのＰＨ２０活性を記載している以下の表１５に記載されている。Ｌｅｃ変異細胞により発現されるｒＨｕＰＨ２０は、酵素的に活性である。
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実施例１０
ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼＮ−グリコシル化部位の部位特異的変異誘発
本実施例において、Ｎ−グリカン部位に特異的なヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼの脱グリコシル化された変異体を産生し、それらの分泌パターンおよびヒアルロニダーゼ酵素活性を評価した。Ｎ−グリカン部位に特異的な脱グリコシル化された変異体およびグリカン型は、以下の表１６に記載されている。
ＰＨ２０ｓＨｉｓ（配列番号：２１０）を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キット（カタログナンバー２００５１８、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用する、それぞれのアスパラギン残基のアラニンへの変異誘発のための鋳型として使用した。鋳型ＤＮＡによってコードされるタンパク質は、アミノ酸Ｓ４９０後にヘキサＨｉｓタグ（配列番号：１４２）を含むヒトＰＨ２０クローンであるＰＨ２０ｓＨｉｓ（配列番号：１８７）に対応する。野生型ＰＨ２０ｓＨｉｓおよび脱グリコシル化された変異体は、表１６に記載されている。Ｎ−グリコシル化部位のそれぞれに対して１つの６つの単一変異体を産生した。さらに、３つの二重変異体および１つの三重変異体を、すべてが複合型グリカンにより占有されるアスパラギンＮ８２、Ｎ１６６およびＮ２５４に対して産生した。最後に、高マンノースグリカンを欠いている二重変異体Ｎ３６８Ａ／Ｎ３９３Ａを産生した。変異体をＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクトし、発現を実施例２Ａに記載されているとおりに実施した。培地への分泌およびヒアルロニダーゼ活性を上記実施例３および５に記載されているとおりに測定した。
結果を、変異、グリカン型、タンパク質が培地に分泌されるか否かならびにｐＨ５．５およびｐＨ７．４の両方でのヒアルロニダーゼ活性を示す以下の表１６に示す。ウエスタンブロット分析は、残基Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５およびＮ２５４の変異が培地へのｒＨｕＰＨ２０タンパク質の分泌に影響しなかったことを示した。あるいは、残基Ｎ３６８ＡおよびＮ３６８Ａ／Ｎ３９３Ａの変異は、培地中の約６６ｋＤａのタンパク質の欠乏により証明されるとおり、ＰＨ２０発現および分泌を妨げた。残基Ｎ３９３Ａの変異はタンパク質発現の減少をもたらしたが、ｒＨｕＰＨ２０は、約６６ｋＤａのタンパク質バンドにより証明されるとおり、培地において観察された。残基Ｎ８２、Ｎ１６６および／またはＮ２５４の変異は、ｒＨｕＰＨ２０活性に影響しなかった。これらの残基は、複合型グリカンにより占有される。対照的に、高マンノースグリカンを含む残基Ｎ２３５、Ｎ３６８および／またはＮ３９３の変異は、分泌の欠乏による培地中の検出可能な活性の完全な喪失をもたらした。
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抗−ＰＨ２０抗体でのＣＨＯ細胞の免疫蛍光分析を、Ｎ−グリカン部位で特異的に脱グリコシル化された変異体Ｎ３６８Ａ、Ｎ３９３ＡおよびＮ３６８Ａ／Ｎ３９３Ａの発現を視覚化するために使用した。ＣＨＯ細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）１ｍｌあたり２．５×１０４細胞で、２００μＬの細胞を有する８−ウェルチャンバースライド上に単層培養のために播種し、５％のＣＯ２の加湿雰囲気中で３７℃で増殖した。細胞を、以下のとおりのリポフェクタミンＴＭ２０００（Invitrogen）を使用して、８０％コンフルエンシーで３６時間後トランスフェクトした。ＤＮＡ（血清なしで５０μＬのＤＭＥＭ中で０．４μｇ）およびリポフェクタミンＴＭ２０００（血清なしでＤＭＥＭ中で１μＬ）を室温で２０分穏やかに混合し、次に細胞および１００μＬの無血清培地を含むそれぞれのウェルに加えた。混合物を、プレートの裏および外を穏やかに振盪することにより得た。次に、細胞を３７℃でＣＯ２インキュベーター中で４−６時間インキュベートし、その後、培地を１０％のＦＢＳを含む培地と置き換えた。トランスフェクション４８時間後、チャンバースライド上の細胞を４％のパラホルムアルデヒドで１５分で固定した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、２００μＬの１％のＮＰ−４０／ＰＢＳ溶液を加え、室温で３０分インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、免疫標識前に４℃で保存した。
細胞を免疫標識するため、サンプルを室温で３０分、１５％の正常ヤギ血清で阻止した。細胞を、ＰＢＳ中の５％の正常ヤギ血清で希釈した抗−ＰＨ２０ウサギＩｇＧの１：２０溶液と２時間インキュベートした。最後に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次にＦＩＴＣ−結合ヤギ抗−ウサギＩｇＧと１時間インキュベートし、次に視覚化した。加えて、取付け溶液は、核染色を可能にするＤＡＰＩを含んだ。抗−ＰＨ２０抗体を使用する免疫蛍光分析は、Ｎ３６８ＡおよびＮ３９３Ａ変異がＰＨ２０を細胞内部に蓄積させることを示した。
Ｎ−グリコシル化試験の要約
上記実施例７−１０に示されているとおり、Ｎ結合型グリコシル化は、ｒＨｕＰＨ２０の適当なフォールディングおよび酵素活性のために不可欠である。ＰＮＧａｓｅＦでの包括的消化により、またはツニカマイシンでの処理による生合成中のグリコシル化の阻害によりもたらされるｒＨｕＰＨ２０の完全脱グリコシル化は、全ての検出可能な酵素活性をなくした。加えて、グリコシル化されていないｒＨｕＰＨ２０は細胞中に蓄積することを示す。対照的に、キフネンシンでの処理により、またはＬｅｃ変異体における発現によりもたらされる部分的に脱グリコシル化されているｒＨｕＰＨ２０は、酵素活性を維持した。最後に、部位特異的変異誘発を使用する詳細な変異分析は、高マンノース型グリカンの存在が可溶性で、酵素的に活性なｒＨｕＰＨ２０の生産のために必要であることを示した。
実施例１１
可溶性ｒＨｕＰＨ２０を発現する細胞系の産生
ＨＺ２４プラスミド（配列番号：１４０に記載されている）を使用して、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）にトランスフェクトした（例えば、米国特許出願第１０，７９５，０９５、１１／０６５，７１６および１１／２３８，１７１号参照）。可溶性ｒＨｕＰＨ２０の発現のためのＨＺ２４プラスミドベクターは、ｐＣＩベクター骨格（Promega）、ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのアミノ酸１−４８２をコードするＤＮＡ（配列番号：１１０）、ＥＣＭＶウイルス由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）（Clontech）およびマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を含む。ｐＣＩベクター骨格は、また、ベータ−ラクタマーゼ耐性遺伝子をコードするＤＮＡ（ＡｍｐＲ）、ｆ１複製起点、サイトメガロウイルス前初期エンハンサー／プロモーター領域（ＣＭＶ）、キメライントロンおよびＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０）を含む。可溶性ｒＨｕＰＨ２０構築物をコードするＤＮＡは、ヒトＰＨ２０の天然の３５アミノ酸シグナル配列のアミノ酸位置１のメチオニンをコードするＤＮＡの前にＮｈｅＩ部位およびＫｏｚａｋコンセンサス配列ならびに配列番号：１０７に記載されているヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのアミノ酸位置４８２に対応するチロシンをコードするＤＮＡ後に終始コドン、次にＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を含む。したがって、構築物ｐＣＩ−ＰＨ２０−ＩＲＥＳ−ＤＨＦＲ−ＳＶ４０ｐａ（ＨＺ２４）は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により分離されている、ヒトＰＨ２０のアミノ酸１−４８２（配列番号：１０９に記載されている）およびマウスジヒドロ葉酸レダクターゼのアミノ酸１−１８６（配列番号：１４１に記載されている）をコードするＣＭＶプロモーターにより駆動される単一のｍＲＮＡ種をもたらす。
４ｍＭ グルタミンおよび１８ｍｌ／Ｌ Ｐｌｕｒｉｏｎｉｃ Ｆ６８／Ｌ （Gibco）を補った、ＤＨＦＲ（−）細胞のためのＧＩＢＣＯ改変ＣＤ−ＣＨＯ培地で増殖する非トランスフェクトＤＧ４４ ＣＨＯ細胞を、トランスフェクションのための調製物中振とうフラスコ中に０．５×１０６細胞／ｍｌで播種した。細胞を、１２０ｒｐｍで振とうしながら、加湿インキュベーター中５％ ＣＯ２中３７℃で増殖させた。対数増殖中の非トランスフェクトＤＧ４４ ＣＨＯ細胞を、トランスフェクション前に生存能力について試験した。
非トランスフェクトＤＧ４４ ＣＨＯ細胞培養物の６００万個の生存細胞をペレットにし、０．７ｍＬの２×トランスフェクションバッファー（２×ＨｅＢＳ：４０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０、２７４ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、１．４ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１２ｍＭ デキストロース）中に２×１０７細胞の密度に再懸濁した。再懸濁された細胞の各アリコートに、０．０９ｍＬ（２５０μｇ）の直鎖ＨＺ２４プラスミド（Ｃｌａ Ｉ（New England Biolabs）で一晩消化により直線化された）を加え、細胞／ＤＮＡ溶液を室温で０．４ｃｍ ｇａｐ ＢＴＸ（Gentronics）エレクトロポレーションキュベットに移した。陰性対照エレクトロポレーションは、細胞と混合されるプラスミドＤＮＡを使用せずに実施した。細胞／プラスミド混合物に、３３０Ｖおよび９６０μＦまたは３５０Ｖおよび９６０μＦのコンデンサー放電でエレクトロポレーションを行った。
細胞をエレクトロポレーション後にキュベットから取り出し、５ｍＬの４ｍＭ グルタミンおよび１８ｍｌ／Ｌ Ｐｌｕｒｉｏｎｉｃ Ｆ６８／Ｌ（Gibco）を補ったＤＨＦＲ（−）細胞のための改変ＣＤ−ＣＨＯ培地に移し、加湿インキュベーター中５％ ＣＯ２中３７℃で２日間、選択なしで６ウェル組織培養プレートのウェル中で増殖させた。
エレクトロポレーションの２日後、０．５ｍＬの組織培養培地をそれぞれのウェルから取り出し、実施例１２に記載されているマイクロ濁度アッセイを使用してヒアルロニダーゼ活性の存在について試験した。結果を表１７に示す。
Figure 0005885765
トランスフェクション２（３５０Ｖ）の細胞を組織培養ウェルから回収し、カウントし、１ｍｌあたり１×１０４から２×１０４個の生存細胞に希釈した。細胞懸濁液の０．１ｍＬのアリコートを、５つの９６ウェル丸底組織培養プレートの各ウェルに移した。４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ−１サプリメント（GIBCOTM、Invitrogen Corporation）を含み、ヒポキサンチンおよびチミジンサプリメントを含まない１００マイクロリットルのＣＤ−ＣＨＯ培地（GIBCO）を細胞を含むウェルに加えた（最終容量０．２ｍＬ）。
１０個のクローンを、メトトレキサートを含まない増殖させた５枚のプレートから同定した（表１８）。
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６つのＨＺ２４クローンを培養で拡大し、単一の細胞懸濁液として振とうフラスコに移した。クローン３Ｄ３、３Ｅ５、２Ｇ８、２Ｄ９、１Ｅ１１および４Ｄ１０を、細胞を左上隅のウェルで５０００個の細胞で出発し、プレートを下に１：２希釈、プレートを横に１：３希釈した二次元無限希釈戦略を使用して、９６ウェル丸底組織培養プレートに置いた。希釈したクローンを、ウェルあたり５００個の非トランスフェクトＤＧ４４ ＣＨＯ細胞のバックグラウンド中で増殖させ、培養中最初の数日間に必要な増殖因子を提供した。サブクローンあたり１０枚のプレートを作製し、そのうち５枚のプレートは５０ｎＭメトトレキサートを含み、５枚のプレートはメトトレキサートを含まない。
クローン３Ｄ３から２４個の眼に見えるサブクローンを生産した（メトトレキサート処理なしから１３個、および５０ｎＭのメトトレキサート処理から１１個）。２４個のサブクローンのうち８個から得た上清において、有意なヒアルロニダーゼ活性が測定され（＞５０ユニット／ｍＬ）、これら８個のサブクローンをＴ−２５組織培養フラスコに拡大した。メトトレキサート処理プロトコールから単離されたクローンを、５０ｎＭのメトトレキサートの存在下で拡大した。クローン３Ｄ３５Ｍを、５００ｎＭのメトトレキサート中でさらに拡大し、振とうフラスコ中で１，０００ユニット／ｍｌを超えて産生するクローンを生じさせた（クローン３Ｄ３５Ｍ；またはＧｅｎ１ ３Ｄ３５Ｍ）。次に、３Ｄ３５Ｍ細胞のマスター細胞バンク（ＭＣＢ）を調製した。
実施例１２
可溶性ｒＨｕＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性の測定
細胞培養物、精製画分および精製溶液のようなサンプル中の可溶性ｒＨｕＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性を、ヒアルロン酸が血清アルブミンと結合するときの不溶性沈殿の形成に基づく比濁アッセイを使用して測定した。活性は、可溶性ｒＨｕＰＨ２０をヒアルロン酸ナトリウム（ヒアルロン酸）と共に一定期間（１０分）インキュベートし、次に酸性血清アルブミンの添加で未消化のヒアルロン酸ナトリウムを沈殿させることにより測定される。得られたサンプルの濁度を、３０分の発生期間の後、６４０ｎｍで測定する。ヒアルロン酸ナトリウム基質の酵素活性に起因する濁度の低下が、可溶性ｒＨｕＰＨ２０ヒアルロニダーゼ活性の尺度である。方法は、可溶性ｒＨｕＰＨ２０アッセイ作業参照標準の希釈物で作製された較正曲線を使用して実施され、サンプル活性測定はこの較正曲線と比較して行われる。
サンプルの希釈物は、酵素希釈溶液で調製した。酵素希釈溶液は、３３．０±０．０５ｍｇの加水分解ゼラチンを２５．０ｍＬの５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ反応バッファー（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、ｐＨ５．５）および２５．０ｍＬのＳＷＦＩに溶解し、０．２ｍＬの２５％ Ｂｕｍｉｎａｔｅ溶液を混合物に希釈し、３０秒間ボルテックス処理することにより調製した。これは使用の２時間以内に実施し、必要になるまで氷上で保存した。サンプルを推定１〜２Ｕ／ｍＬに希釈した。一般的に、工程あたりの最大希釈は１：１００を超えず、第１の希釈のための最初のサンプルサイズは２０μＬ未満ではなかった。アッセイを実施するために必要な最小サンプル容積は：インプロセスサンプル、ＦＰＬＣ画分：８０μＬ；組織培養上清：１ｍＬ；濃縮物質８０μＬ；精製または最終工程物質：８０μＬであった。希釈は、低タンパク質結合９６−ウェルプレート中でトリプリケートで行い、３０μＬの各希釈物をＯｐｔｉｌｕｘ黒色／透明底プレート（BD BioSciences）に移した。
２．５Ｕ／ｍＬの濃度を有する既知の可溶性ｒＨｕＰＨ２０の希釈物を、酵素希釈溶液で調製して標準曲線を作成し、Ｏｐｔｉｌｕｘプレートにトリプリケートで加えた。希釈は、０Ｕ／ｍＬ、０．２５Ｕ／ｍＬ、０．５Ｕ／ｍＬ、１．０Ｕ／ｍＬ、１．５Ｕ／ｍＬ、２．０Ｕ／ｍＬおよび２．５Ｕ／ｍＬを含んだ。６０μＬの酵素希釈溶液を含む「試薬ブランク」ウェルを、陰性対照としてプレートに含めた。次に、プレートをカバーし、３７℃で５分間ヒートブロック上で加温した。カバーを取り、プレートを１０秒間振とうした。振とう後、プレートをヒートブロックに戻し、ＭＵＬＴＩＤＲＯＰ ３８４ Ｌｉｑｕｉｄ Ｈａｎｄｌｉｎｇ装置に、加温０．２５ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウム溶液（１００ｍｇのヒアルロン酸ナトリウム（LifeCore Biomedical）を２０．０ｍＬのＳＷＦＩに溶解することにより調製した）を入れた。これを、２−８℃で２−４時間または完全に溶解するまで、穏やかに回転および／または振動することにより混合した。反応プレートをＭＵＬＴＩＤＲＯＰ ３８４に移し、３０μＬのヒアルロン酸ナトリウムを各ウェルに分配するための起動キーを押すことにより反応を開始した。次に、プレートをＭＵＬＴＩＤＲＯＰ ３８４から回収し、１０秒間振とうし、交換されたプレートカバーを有するヒートブロックに移した。プレートを３７℃で１０分間インキュベートした。
ＭＵＬＴＩＤＲＯＰ ３８４を、機械に血清作業溶液を入れ、２４０μＬに溶液設定を変更することにより反応を停止するように調製した。（５００ｍＭの酢酸バッファー溶液７５ｍＬ中、２５ｍＬの血清貯蔵溶液［１容量のウマ血清（Sigma）を９容量の５００ｍＭの酢酸バッファー溶液で希釈し、ｐＨを塩酸で３．１に調整した］）。プレートをヒートブロックから回収し、ＭＵＬＴＩＤＲＯＰ ３８４上に置き、２４０μＬの血清作業溶液をウェルに分配した。プレートを回収し、プレートリーダー上で１０秒間振とうした。さらに１５分後、サンプルの濁度を６４０ｎｍで測定し、それぞれのサンプルのヒアルロニダーゼ活性（Ｕ／ｍＬ）を標準曲線に合わせることにより決定した。
比活性（ユニット／ｍｇ）を、ヒアルロニダーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）をタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）で除することにより計算した。
実施例１３
Ｇｅｎ１ヒトｓＰＨ２０の生産および精製
Ａ．５Ｌバイオリアクタープロセス
３Ｄ３５Ｍのバイアルを解凍し、振盪フラスコから１００ｎＭのメトトレキサートおよびＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ−１（Invitrogen）を補ったＣＤ−ＣＨＯ培地（Invitrogen、Carlsbad Calif.）中で１Ｌのスピナーフラスコによって拡大した。細胞を、１ｍｌあたり４×１０５個の生存細胞の播種密度で、スピナーフラスコから５Ｌのバイオリアクター（Braun）に移した。パラメータは、溶存酸素設定値２５％および０−１００ｃｃ／分のエアーオーバーレイで、温度設定値３７℃、ｐＨ７．２（開始設定値）であった。１６８時間で、２５０ｍｌのＦｅｅｄ＃１培地（５０ｇ／Ｌのグルコースを含むＣＤ ＣＨＯ）を加えた。２１６時間で、２５０ｍｌのＦｅｅｄ＃２培地（５０ｇ／Ｌのグルコースおよび１０ｍＭの酪酸ナトリウムを含むＣＤ ＣＨＯ）を加え、２６４時間で、２５０ｍｌのＦｅｅｄ＃２培地を加えた。このプロセスによって、６×１０６個細胞／ｍｌの最大細胞密度で１ｍｌあたり１６００ユニットの最終生産性が得られた。酪酸ナトリウムの添加は、生産の最終段階で可溶性ｒＨｕＰＨ２０の生産を劇的に増強させた。
３Ｄ３５Ｍクローンから得た馴化培地を、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．０への深層濾過およびタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションにより清澄化した。次に、可溶性ｒＨｕＰＨ２０を、Ｑセファロース（Pharmacia）イオン交換、フェニルセファロース（Pharmacia）疎水性相互作用クロマトグラフィー、ボロン酸フェニル（Prometics）およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（Biorad、Richmond、CA）での連続クロマトグラフィーにより精製した。
可溶性ｒＨｕＰＨ２０をＱセファロースと結合させ、同じバッファー中で４００ｍＭのＮａＣｌで溶離した。溶離物を２Ｍの硫酸アンモニウムで５００ｍＭの硫酸アンモニウムの最終濃度に希釈し、フェニルセファロース（ｌｏｗ ｓｕｂ）カラムを通し、次に同じ条件下でボロン酸フェニル樹脂と結合させた。可溶性ｒＨｕＰＨ２０を、硫酸アンモニウムを含まない５０ｍＭのビシン中ｐＨ９．０で洗浄した後、フェニルセファロース樹脂からＨｅｐｅｓ ｐＨ６．９中に溶離した。溶離物を５ｍＭのリン酸カリウムおよび１ｍＭのＣａＣｌ２中ｐＨ６．９でセラミックヒドロキシアパタイト樹脂上に負荷し、０．１ｍＭのＣａＣｌ２を含む８０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．４で溶離した。
得られた精製された可溶性ｒＨｕＰＨ２０は、ＵＳＰ参照標準を使用するマイクロ濁度アッセイ（実施例１２）によって、６５，０００ＵＳＰユニット／ｍｇタンパク質を超える比活性を有していた。精製されたｓＰＨ２０は、０．１％のＴＦＡ／Ｈ２Ｏから０．１％のＴＦＡ／９０％のアセトニトリル／１０％のＨ２Ｏの間の勾配でＰｈａｒｍａｃｉａ ５ＲＰＣスチレンジビニルベンゼンカラムから２４〜２６分から単一ピークとして溶離し、ＰＮＧＡＳＥ−Ｆでの処理の際に鮮明な５１ｋＤａバンドに減少するＳＤＳ電気泳動法により単一の広範な６１ｋＤａバンドとして分離された。Ｎ−末端アミノ酸シーケンシングによって、リーダーペプチドが効率的に除去されていることが示された。
Ｂ．１００Ｌのバイオリアクター細胞培養への上流細胞培養拡大プロセス
スケールアッププロセスを使用して、３Ｄ３５Ｍ細胞の４つの異なるバイアルから可溶性ｒＨｕＰＨ２０を別々に精製して、ｓＨｕＰＨ２０の４つの別々のバッチ；ＨＵＡ０４０６Ｃ、ＨＵＡ０４１０Ｃ、ＨＵＡ０４１５ＣおよびＨＵＡ０４２０Ｃを生産する。それぞれのバイアルを、１２５Ｌバイオリアクターによって別個に拡大および培養し、次にカラムクロマトグラフィーを使用して精製した。プロセスを通じてサンプルをとり、酵素収率のようなパラメーターを評価した。以下に提供されるプロセスの記載は、バイオリアクター出発および供給培地容量、転送細胞密度ならびに洗浄および溶離容量のような事柄の典型的な記載を示す。正確な数は各バッチでわずかに変化し、表２４から３０に詳細に記載されている。
４つのバイアルの３Ｄ３５Ｍ細胞を３７℃の水浴中で解凍し、１００ｎＭメトトレキサートおよび４０ｍＬ／Ｌ ＧｌｕｔａＭＡＸを含むＣＤ ＣＨＯを加え、細胞を遠心分離した。細胞を２０ｍＬの新鮮培地を含む１２５ｍＬ振とうフラスコに再懸濁し、３７℃、７％ ＣＯ２インキュベーターに置いた。細胞を１２５ｍＬ振とうフラスコ中で４０ｍＬまで拡大した。細胞密度が１．５−２．５×１０６細胞／ｍｌに達したとき、培養物を１００ｍＬ培養容量で１２５ｍＬスピナーフラスコに拡大した。フラスコを、３７℃、７％ ＣＯ２でインキュベートした。細胞密度が１．５−２．５×１０６細胞／ｍｌに達したとき、培養物を２００ｍＬ培養容量で２５０ｍＬスピナーフラスコに拡大し、フラスコを３７℃、７％ ＣＯ２でインキュベートした。細胞密度が１．５−２．５×１０６細胞／ｍｌに達したとき、培養物を８００ｍＬ培養容量で１Ｌスピナーフラスコに拡大し、３７℃、７％ ＣＯ２でインキュベートした。細胞密度が１．５−２．５×１０６細胞／ｍｌに達したとき、培養物を５Ｌ培養容量で６Ｌスピナーフラスコに拡大し、３７℃、７％ ＣＯ２でインキュベートした。細胞密度が１．５−２．５×１０６細胞／ｍｌに達したとき、培養物を２０Ｌ培養容量で３６Ｌスピナーフラスコに拡大し、３７℃、７％ ＣＯ２でインキュベートした。
１２５Ｌリアクターを１２１℃、２０ＰＳＩの蒸気で滅菌し、６５ＬのＣＤ ＣＨＯ培地を加えた。使用前に、リアクターを汚染について調べた。３６Ｌスピナーフラスコ中の細胞密度が１．８−２．５×１０６細胞／ｍｌに達したとき、２０Ｌの細胞培養物を３６Ｌスピナーフラスコから１２５Ｌバイオリアクター（Braun）へ移し、８５Ｌの最終容積および約４×１０５細胞／ｍｌの播種密度が得られた。パラメーターは、温度設定値、３７℃；ｐＨ：７．２；溶存酸素：２５％±１０％；羽根車速度５０ｒｐｍ；容器圧 ３ｐｓｉ；エアースパージ １Ｌ／分；エアーオーバーレイ：１Ｌ／分であった。リアクターは、細胞数、ｐＨ確認、培地分析、タンパク質生産および保持について毎日サンプリングした。実施の間に栄養供給物を加えた。６日目に、３．４ＬのＦｅｅｄ＃１培地（ＣＤ ＣＨＯ＋５０ｇ／Ｌのグルコース＋４０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ−１）を加え、培養温度を３６．５℃に変更した。９日目に、３．５ＬのＦｅｅｄ＃２（ＣＤ ＣＨＯ＋５０ｇ／Ｌのグルコース＋４０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ−１＋１．１ｇ／Ｌの酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を３６℃に変更した。１１日目に、３．７ＬのＦｅｅｄ＃３（ＣＤ ＣＨＯ＋５０ｇ／Ｌのグルコース＋４０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ−１＋１．１ｇ／Ｌの酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を３５．５℃に変更した。１４日目または細胞の生存能力が５０％未満に低下したとき、リアクターを回収した。プロセスは、８００万個の細胞／ｍｌの最大細胞密度で１６００ユニット／ｍｌの酵素活性を有する可溶性ｒＨｕＰＨ２０の生産をもたらした。回収時に、培養物を、インビトロおよびインビボでのマイコプラズマ、バイオバーデン、エンドトキシンおよびウイルス、ウイルス粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）および酵素活性のためにサンプリングした。
１００リットルのバイオリアクター細胞培養回収物を、ポリエーテルスルホン培地（Sartorius）を有する一連の使い捨てカプセルフィルター：最初に、８．０μｍデプスカプセル、０．６５μｍデプスカプセル、０．２２μｍカプセルを通し、最後に、０．２２μｍ Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ ２０００ｃｍ２フィルターを通して、１００Ｌ滅菌保存バッグに入れた。培養物を、らせん状ポリエーテルスルホン３０ｋＤａ ＭＷＣＯフィルター（Millipore）を用いる２つのＴＦＦと、次に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２５ｍＭのＮａ２ＳＯ４、ｐＨ７．０を用いる６×バッファー交換を使用して１０×濃縮し、０．２２μｍ最終フィルターを通し、２０Ｌ滅菌保存バッグに入れた。表１９は、細胞培養物、回収量、濃度およびバッファー交換工程に関するモニタリングデータを提供する。
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Ｑセファロース（Pharmacia）イオン交換カラム（３Ｌ樹脂、高さ＝２０ｃｍ、直径＝１４ｃｍ）を調製した。洗浄サンプルをｐＨ、伝導率の決定およびエンドトキシン（ＬＡＬ）アッセイのために回収した。カラムを、５カラム体積の１０ｍＭのＴｒｉｓ、２０ｍＭのＮａ２ＳＯ４、ｐＨ７．５で平衡にした。濃縮されダイフィルトレーションした(diafiltered)回収物を１００ｃｍ／時の流速でＱカラムに負荷した。カラムを５カラム体積の１０ｍＭのＴｒｉｓ、２０ｍＭのＮａ２ＳＯ４、ｐＨ７．５および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で洗浄した。タンパク質を１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、４００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で溶離し、０．２２μｍ最終フィルターを通して濾過し滅菌バッグに入れた。
フェニル−セファロース（Pharmacia）疎水性相互作用クロマトグラフィーを次に行った。フェニル−セファロース（ＰＳ）カラム（９．１Ｌ樹脂、高さ＝２９ｃｍ、直径＝２０ｃｍ）を調製した。カラムを、５カラム体積の５ｍＭのリン酸カリウム、０．５Ｍの硫酸アンモニウム、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０で平衡にした。上記から得たタンパク質溶離物に、２Ｍの硫酸アンモニウム、１Ｍのリン酸カリウムおよび１ＭのＣａＣｌ２貯蔵溶液をそれぞれ５ｍＭ、０．５Ｍおよび０．１ｍＭの最終濃度に補った。タンパク質を１００ｃｍ／時の流速でＰＳカラムに負荷した。５ｍＭのリン酸カリウム、０．５Ｍの硫酸アンモニウムおよび０．１ｍＭのＣａＣｌ２ ｐＨ７．０を１００ｃｍ／時で加えた。フロースルーを０．２２μｍ最終フィルターを通して滅菌バッグに入れた。
ＰＳ−精製されたタンパク質を、５カラム体積の５ｍＭのリン酸カリウム、０．５Ｍの硫酸アンモニウムで平衡にされているアミノフェニルボロン酸カラム（ProMedics）（６．３Ｌ樹脂、高さ＝２０ｃｍ、直径＝２０ｃｍ）に負荷した。タンパク質を１００ｃｍ／時の流速でカラムに通し、カラムを５ｍＭのリン酸カリウム、０．５Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０で洗浄した。次にカラムを２０ｍＭのビシン、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９．０で洗浄し、タンパク質を５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ６．９で溶離し、滅菌フィルターを通して２０Ｌ滅菌バッグに入れた。溶離物をバイオバーデン、タンパク質濃度および酵素活性について試験した。
ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）カラム（BioRad）（１．６Ｌ樹脂、高さ＝１０ｃｍ、直径＝１４ｃｍ）を５ｍＭのリン酸カリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＣａＣｌ２ ｐＨ７．０で平衡にした。洗浄サンプルを回収し、ｐＨ、伝導率およびエンドトキシンについて試験した（ＬＡＬアッセイ）。アミノフェニルボロン酸で精製されたタンパク質にリン酸カリウムおよびＣａＣｌ２を５ｍＭのリン酸カリウムおよび０．１ｍＭのＣａＣｌ２の最終濃度を得るために補い、１００ｃｍ／時の流速でＨＡＰカラムに負荷した。カラムを、５ｍＭのリン酸カリウム ｐＨ７．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、次に１０ｍＭのリン酸カリウム ｐＨ７．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＣａＣｌ２ ｐＨで洗浄した。タンパク質を７０ｍＭのリン酸カリウム ｐＨ７．０で溶離し、０．２２μｍフィルターを通して５Ｌ滅菌保存バッグに入れた。溶離物をバイオバーデン、タンパク質濃度および酵素活性について試験した。
次に、ＨＡＰ−精製されたタンパク質を、圧力タンクによって２０ｎＭのウイルス除去フィルターを通して送った。タンパク質をＤＶ２０圧力タンクおよびフィルター（Pall Corporation）に加え、２０ｎｍの孔を有するＵｌｔｉｐｏｒ ＤＶ２０フィルター（Pall Corporation）を通して滅菌２０Ｌ保存バッグに入れた。濾液を、タンパク質濃度、酵素活性、オリゴ糖、単糖類およびシアル酸プロファイリングおよびプロセス関連不純物について試験した。次に、濾液中のタンパク質を、１０ｋＤ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）システム（Sartorius）を使用して１ｍｇ／ｍＬに濃縮した。フィルターは、最初にＨｅｐｅｓ／塩水（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で洗浄することにより調製し、透過物をｐＨおよび伝導率のためにサンプリングした。濃縮後、濃縮されたタンパク質をサンプリングし、タンパク質濃度および酵素活性について試験した。濃縮されたタンパク質で、最終バッファー：１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ ７．０への６×バッファー交換を実施した。濃縮されたタンパク質を、０．２２μｍフィルターに通して２０Ｌ滅菌保存バッグに入れた。タンパク質をサンプリングし、タンパク質濃度、酵素活性、遊離スルフヒドリル基、オリゴ糖プロファイリングおよび浸透圧について試験した。
表２０から２６は、各３Ｄ３５Ｍ細胞ロットの上記の各精製工程と関連するモニタリングデータを提供する。
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精製され、濃縮された可溶性ｒＨｕＰＨ２０タンパク質を５ｍＬおよび１ｍＬの充填容量を有する滅菌バイアルに無菌的に充填した。タンパク質をオペレーター制御ポンプへ０．２２μｍフィルターを通し、これを使用し、重量測定読み出しを使用してバイアルに充填した。バイアルを栓で閉め、圧着キャップで固定した。閉じたバイアルを異物について目視検査し、次に標識化した。標識化後、バイアルを、液体窒素中にわずか１分沈めることにより急速冷凍し、≦−１５℃（−２０±５℃）で保存した。
実施例１４
可溶性ヒトＰＨ２０（ｒＨｕＰＨ２０）を含むＧｅｎ２細胞の生産
実施例１３に記載されているＧｅｎ１ ３Ｄ３５Ｍ細胞系を、より高いメトトレキサートレベルに適応させ、世代２（Ｇｅｎ２）クローンを生産した。３Ｄ３５Ｍ細胞を、確立されたメトトレキサート含有培養物から、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ−１ＴＭおよび１．０μＭのメトトレキサートを含むＣＤ ＣＨＯ培地へ播種した。細胞を、３７℃、７％ ＣＯ２加湿インキュベーター中で４６日間にわたって増殖させ、９回継代することにより、より高いメトトレキサートレベルに適応させた。増殖した細胞集団を、２．０μＭのメトトレキサートを有する培地を含む９６ウェル組織培養プレートにおける制限希釈によりクローニングした。約４週間後、クローンを同定し、クローン３Ｅ１０Ｂを拡大のために選択した。３Ｅ１０Ｂ細胞を、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ−１ＴＭおよび２．０μＭのメトトレキサートを含むＣＤ ＣＨＯ培地で２０継代の間、増殖させた。３Ｅ１０Ｂ細胞系のマスター細胞バンク（ＭＣＢ）を作製し、凍結し、後の試験に使用した。
細胞系の増幅を、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ−１ＴＭおよび４．０μＭのメトトレキサートを含むＣＤ ＣＨＯ 培地中で３Ｅ１０Ｂ細胞を培養することにより続けた。１２継代後、細胞を研究細胞バンク（ＲＣＢ）としてバイアル中で凍結した。ＲＣＢの１つのバイアルを解凍し、８．０μＭのメトトレキサートを含む培地で培養した。５日後、培地中のメトトレキサート濃度を、１６．０μＭ、次に１８日後に２０．０μＭに増加させた。２０．０μＭのメトトレキサートを含む培地中の８継代の細胞を、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ−１ＴＭおよび２０．０μＭのメトトレキサートを含むＣＤ ＣＨＯ培地を含む９６ウェル組織培養プレートで制限希釈によりクローニングした。５−６週間後にクローンを同定し、クローン２Ｂ２を、２０．０μＭのメトトレキサートを含む培地における拡大のために選択した。１１継代後、２Ｂ２細胞を研究細胞バンク（ＲＣＢ）としてバイアル中で凍結した。
得られた２Ｂ２細胞は、可溶性組換えヒトＰＨ２０（ｒＨｕＰＨ２０）を発現するジヒドロ葉酸レダクターゼ欠失（ｄｈｆｒ−）ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞である。可溶性ＰＨ２０は、２Ｂ２細胞中に約２０６コピー／細胞のコピー数で存在する。ｒＨｕＰＨ２０特異的プローブを使用するＳｐｅＩ−、ＸｂａＩ−およびＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ゲノム２Ｂ２細胞ＤＮＡのサザンブロット分析は、以下の制限消化プロフィールを示した：ＳｐｅＩで消化されたＤＮＡを有する、〜７．７ｋｂの１つの主要なハイブリダイズバンドおよび４つの少量のハイブリダイズバンド（〜１３．９、〜６．６、〜５．７および〜４．６ｋｂ）；ＸｂａＩで消化されたＤＮＡを有する、〜５．０ｋｂの１つの主要なハイブリダイズバンドおよび２つの少量のハイブリダイズバンド（〜１３．９および〜６．５ｋｂ）；ならびにＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化された２Ｂ２ ＤＮＡを使用して観察された〜１．４ｋｂの１つの単一のハイブリダイズバンド。ｍＲＮＡ転写物の配列分析は、導かれたｃＤＮＡ（配列番号：１３９）は、予測されるシトシン（Ｃ）の代わりにチミジン（Ｔ）であると観察された位置１１３１の１つの塩基対の違いを除いて、参照配列（配列番号：１１０）と同一であることを示した。これは、アミノ酸配列に対して効果がないサイレント変異である。
実施例１５
Ａ．３００Ｌバイオリアクター細胞培養におけるＧｅｎ２可溶性ｒＨｕＰＨ２０の生産
ＨＺ２４−２Ｂ２のバイアルを解凍し、振とうフラスコから２０μＭのメトトレキサートおよびＧｌｕｔａＭＡＸ−１ＴＭ（Invitrogen）を補ったＣＤ−ＣＨＯ培地（Invitrogen、Carlsbad、CA）中で３６Ｌのスピナーフラスコによって拡大した。簡潔には、細胞のバイアルを３７℃の水浴中で解凍し、培地を加え、細胞を遠心分離した。細胞を、２０ｍＬの新鮮培地を有する１２５ｍＬ振とうフラスコに再懸濁し、３７℃、７％ ＣＯ２インキュベーターに置いた。細胞を１２５ｍＬ振とうフラスコ中で４０ｍＬにまで拡大した。細胞密度が１．５×１０６細胞／ｍＬ以上に達したとき、培養物を１００ｍＬ培養容量で１２５ｍＬスピナーフラスコに拡大した。フラスコを３７℃、７％ ＣＯ２でインキュベートした。細胞密度が１．５×１０６細胞／ｍＬ以上に達したとき、培養物を２００ｍＬ培養容量で２５０ｍＬスピナーフラスコに拡大し、フラスコを３７℃、７％ ＣＯ２でインキュベートした。細胞密度が１．５×１０６細胞／ｍＬ以上に達したとき、培養物を８００ｍＬ培養容量で１Ｌスピナーフラスコに拡大し、３７℃、７％ ＣＯ２でインキュベートした。細胞密度が１．５×１０６細胞／ｍＬ以上に達したとき、培養物を５０００ｍＬ培養容量で６Ｌスピナーフラスコに拡大し、３７℃、７％ ＣＯ２でインキュベートした。細胞密度が１．５×１０６細胞／ｍＬ以上に達したとき、培養物を３２Ｌ培養容量で３６Ｌスピナーフラスコに拡大し、３７℃、７％ ＣＯ２でインキュベートした。
４００Ｌリアクターを滅菌し、２３０ｍＬのＣＤ−ＣＨＯ培地を加えた。使用前に、リアクターを汚染について調べた。約３０Ｌの細胞を３６Ｌスピナーフラスコから４００Ｌバイオリアクター（Braun）へ４．０×１０５生存細胞／ｍｌの播種密度で２６０Ｌの全容量で移した。パラメーターは、温度設定値、３７℃；羽根車速度４０−５５ＲＰＭ；容器圧：３ｐｓｉ；エアースパージ０．５−１．５Ｌ／分；エアーオーバーレイ：３Ｌ／分であった。リアクターは、細胞数、ｐＨ確認、培地分析、タンパク質生産および保持について毎日サンプリングした。また、実施の間に栄養供給物を加えた。１２０時間目に（５日目）、１０．４ＬのＦｅｅｄ＃１培地（４×ＣＤ−ＣＨＯ＋３３ｇ／Ｌのグルコース＋１６０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａｍａｘ−１ＴＭ＋８３ｍＬ／ＬのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ＋３３ｍｇ／ＬのｒＨｕインスリン）を加えた。１６８時間目に（７日目）、１０．８ＬのＦｅｅｄ＃２（２×ＣＤ−ＣＨＯ＋３３ｇ／Ｌのグルコース＋８０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａｍａｘ−１ＴＭ＋１６７ｍＬ／ＬのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ＋０．９２ｇ／Ｌの酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を３６．５℃に変更した。２１６時間目に（９日目）、１０．８ＬのＦｅｅｄ＃３（１×ＣＤ−ＣＨＯ＋５０ｇ／Ｌのグルコース＋５０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａｍａｘ−１ＴＭ＋２５０ｍＬ／ＬのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ＋１．８０ｇ／Ｌの酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を３６℃に変更した。２６４時間目に（１１日目）、１０．８ＬのＦｅｅｄ＃４（１×ＣＤ−ＣＨＯ＋３３ｇ／Ｌのグルコース＋３３ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａｍａｘ−１ＴＭ＋２５０ｍＬ／ＬのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ＋０．９２ｇ／Ｌの酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を３５．５℃に変更した。供給培地の添加は、生産の最終段階で可溶性ｒＨｕＰＨ２０の生産を劇的に増強すると観察された。１４または１５日目または細胞の生存能力が４０％未満に低下したとき、リアクターを回収した。プロセスは、１２００万個の細胞／ｍｌの最大細胞密度で１７，０００ユニット／ｍｌの最終生産性をもたらした。回収時に、培養物を、インビトロおよびインビボでのマイコプラズマ、バイオバーデン、エンドトキシンおよびウイルス、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）および酵素活性のためにサンプリングした。
培養物を、それぞれ４−８μｍに等級付けられた珪藻土の層および１．４−１．１μｍに等級付けられた珪藻土の層を含む、４つの並行なＭｉｌｌｉｓｔａｋ濾過システムモジュール（Millipore）、次にセルロース膜を通して、次に０．４−０．１１μｍに等級付けられた珪藻土の層および＜０．１μｍに等級付けられた珪藻土の層を含む、第２の単一のＭｉｌｌｉｓｔａｋ濾過システム（Millipore）、次にセルロース膜を通して、次に０．２２μｍ最終フィルターを通して蠕動ポンプにより、３５０Ｌの容積を有する滅菌単回使用フレキシブルバッグに入れた。回収した細胞培養液に１０ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭのＴｒｉｓを補って、７．５のｐＨにした。培養物を、４つのＳａｒｔｏｓｌｉｃｅ ＴＦＦ ３０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルター（Sartorious）を使用するタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）装置、次に１０ｍＭのＴｒｉｓ、２０ｍＭのＮａ２ＳＯ４、ｐＨ７．５を用いる１０×バッファー交換で１０×濃縮し、０．２２μｍ最終フィルターに入れ、５０Ｌ滅菌保存バッグに入れた。
濃縮されダイフィルトレーションした回収物をウイルスに対して不活性化させた。ウイルス不活性化の前に、１０％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、３％のトリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）の溶液を調製した。濃縮されダイフィルトレーションした回収物を、３６Ｌのガラス反応容器中で１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、０．３％のＴＮＢＰに１時間暴露し、直後にＱカラムで精製した。
Ｂ．Ｇｅｎ２可溶性ｒＨｕＰＨ２０の精製
Ｑセファロース（Pharmacia）イオン交換カラム（９Ｌ樹脂、Ｈ＝２９ｃｍ、Ｄ＝２０ｃｍ）を調製した。洗浄サンプルをｐＨ、伝導率の決定およびエンドトキシン（ＬＡＬ）アッセイのために回収した。カラムを、５カラム体積の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４、ｐＨ７．５で平衡にした。ウイルス不活性化後、濃縮したダイフィルトレーションした回収物を、１００ｃｍ／時の流速でＱカラムに負荷した。カラムを、５カラム体積の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４、ｐＨ７．５および１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で洗浄した。１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用いてタンパク質を溶離し、０．２２μｍ最終フィルターを通して滅菌バッグに濾過した。溶離サンプルを、バイオバーデン、タンパク質濃度およびヒアルロニダーゼ活性について試験した。Ａ２８０吸光度測定値を、交換の開始および終了時にとった。
フェニル−セファロース（Pharmacia）疎水性相互作用クロマトグラフィーを次に行った。フェニル−セファロース（ＰＳ）カラム（１９−２１Ｌ樹脂、Ｈ＝２９ｃｍ、Ｄ＝３０ｃｍ）を調製した。洗浄物を回収し、ｐＨ、伝導率およびエンドトキシン（ＬＡＬアッセイ）のためにサンプリングした。カラムを、５カラム体積の５ｍＭ リン酸カリウム、０．５Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０で平衡にした。Ｑセファロースカラムから溶離されたタンパク質を、それぞれ５ｍＭ、０．５Ｍおよび０．１ｍＭの最終濃度を得るために、２Ｍ 硫酸アンモニウム、１Ｍ リン酸カリウムおよび１Ｍ ＣａＣｌ２貯蔵溶液を補った。タンパク質を、１００ｃｍ／時の流速でＰＳカラムに負荷し、カラムフロースルーを回収した。カラムを、５ｍＭ リン酸カリウム、０．５Ｍ 硫酸アンモニウムおよび０．１ｍＭ ＣａＣｌ２ ｐＨ７．０で１００ｃｍ／時で洗浄し、洗浄液を回収されたフロースルーに加えた。カラム洗浄液と混合し、フロースルーを、０．２２μｍ最終フィルターを通して滅菌バッグに入れた。フロースルーを、バイオバーデン、タンパク質濃度および酵素活性のためにサンプリングした。
アミノフェニルボロン酸カラム（Prometics）を調製した。洗浄物を回収し、ｐＨ、伝導率およびエンドトキシン（ＬＡＬアッセイ）のためにサンプリングした。カラムを、５カラム体積の５ｍＭ リン酸カリウム、０．５Ｍ 硫酸アンモニウムで平衡にした。精製されたタンパク質を含むＰＳフロースルーを、１００ｃｍ／時の流速でアミノフェニルボロン酸カラムに負荷した。カラムを、５ｍＭ リン酸カリウム、０．５Ｍ 硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０で洗浄した。カラムを、２０ｍＭ ビシン、０．５Ｍ 硫酸アンモニウム、ｐＨ９．０で洗浄した。カラムを、２０ｍＭ ビシン、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ９．０で洗浄した。５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．９を用いてタンパク質を溶離し、滅菌フィルターを通して滅菌バッグに入れた。溶離サンプルを、バイオバーデン、タンパク質濃度および酵素活性について試験した。
ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）カラム（Biorad）を調製した。洗浄物を回収し、ｐＨ、伝導率およびエンドトキシン（ＬＡＬアッセイ）について試験した。カラムを、５ｍＭ リン酸カリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０で平衡にした。アミノフェニルボロン酸で精製されたタンパク質を、５ｍＭ リン酸カリウムおよび０．１ｍＭ ＣａＣｌ２の最終濃度に補い、１００ｃｍ／時の流速でＨＡＰカラムに負荷した。カラムを、５ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ７、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２で洗浄した。次に、カラムを、１０ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ７、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２で洗浄した。タンパク質を、７０ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ７．０で溶離し、０．２２μｍ滅菌フィルターを通して滅菌バッグに入れた。溶離サンプルを、バイオバーデン、タンパク質濃度および酵素活性について試験した。
次に、ＨＡＰ精製されたタンパク質を、ウイルス除去フィルターに通した。最初に、滅菌されたＶｉｏｓａｒｔフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を、２Ｌの７０ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ７．０を用いて洗浄することにより調製した。使用前に、濾過されたバッファーを、ｐＨおよび伝導率のためにサンプリングした。ＨＡＰ精製されたタンパク質を、蠕動ポンプによって２０ｎＭウイルス除去フィルターを通した。７０ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ７．０中のフィルター処理されたタンパク質を、０．２２μｍ最終フィルターを通して滅菌バッグに入れた。ウイルスフィルター処理されたサンプルを、タンパク質濃度、酵素活性、オリゴ糖、単糖類およびシアル酸プロファイリングについて試験した。サンプルを、また、プロセス関連不純物について試験した。
次に、濾液中のタンパク質を、１０ｋＤ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）システム（Sartorius）を使用して１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。最初に、フィルターを１０ｍＭ ヒスチジン、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０を用いて洗浄することにより調製し、透過物をｐＨおよび伝導率についてサンプリングした。濃縮後、濃縮されたタンパク質をサンプリングし、タンパク質濃度および酵素活性について試験した。濃縮されたタンパク質で、最終バッファー：１０ｍＭ ヒスチジン、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０への６×バッファー交換を実施した。バッファー交換後、濃縮されたタンパク質を、０．２２μｍフィルターを通して２０Ｌ滅菌保存バッグに入れた。タンパク質をサンプリングし、タンパク質濃度、酵素活性、遊離スルフヒドリル基、オリゴ糖プロファイリングおよび浸透圧について試験した。
次に、滅菌フィルター処理されたバルクタンパク質を、３０ｍＬの滅菌テフロンバイアル（Nalgene（登録商標））に２０ｍＬで無菌的に分配した。次に、バイアルを急速冷凍し、−２０±５℃で保存した。

Ｃ．Ｇｅｎ１可溶性ｒＨｕＰＨ２０およびＧｅｎ２可溶性ｒＨｕＰＨ２０の生産および精製の比較
３００Ｌバイオリアクター細胞培養におけるＧｅｎ２可溶性ｒＨｕＰＨ２０の生産および精製は、１００Ｌバイオリアクター細胞培養におけるＧｅｎ１可溶性ｒＨｕＰＨ２０の生産および精製と比較して（実施例１３Ｂに記載されている）、プロトコールにおいていくつかの変化を含んだ。表２７は、方法間の簡単なスケールアップ変化に加えて、典型的な違いを示す。
Figure 0005885765
Figure 0005885765
Figure 0005885765
Figure 0005885765
実施例１６
シアル酸および単糖類含有量の測定
可溶性ｒＨｕＰＨ２０のシアル酸および単糖類含有量は、トリフルオロ酢酸での加水分解後の逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）により評価することができる。１つの例において、精製されたヒアルロニダーゼロット番号ＨＵＢ０７０１Ｅ（１．２ｍｇ／ｍＬ；本質的に実施例１５に記載されているとおりに生産され精製された）のシアル酸および単糖類含有量を測定した。簡潔には、１００μｇのサンプルを１００℃で４時間デュプリケートで４０％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸で加水分解した。加水分解後、サンプルを乾燥させ、３００μＬの水に再懸濁した。それぞれの再懸濁されたサンプルからの４５μＬのアリコートを新しいチューブに移し、乾燥させ、１０μＬの１０ｍｇ／ｍＬの酢酸ナトリウム溶液をそれぞれに加えた。放出された単糖類を、５０μＬの３０ｍｇ／ｍＬの２−アミノ安息香酸、２０ｍｇ／ｍＬの水素化シアノホウ素ナトリウム、約４０ｍｇ／ｍＬの酢酸ナトリウムおよび２０ｍｇ／ｍＬのホウ酸を含むメタノール溶液の添加により蛍光標識した。混合物を、８０℃で暗所で３０分間インキュベートした。誘導体化反応を、４４０μＬの移動相Ａ（０．２％（ｖ／ｖ）のｎ−ブチルアミン、０．５％（ｖ／ｖ）のリン酸、１％（ｖ／ｖ）のテトラヒドロフラン）の添加によりクエンチした。水のマトリックスブランクも、陰性対照としてヒアルロニダーゼサンプルについて記載されているとおりに加水分解し、誘導体化した。放出された単糖類を、Ｏｃｔａｄｅｃｙｌ（Ｃ１８）逆相カラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ粒径；Ｊ．Ｔ． Ｂａｋｅｒ）を使用するＲＰＬＣにより分離し、蛍光検出（３６０ｎｍ励起、４２５ｎｍ発光）によりモニタリングした。単糖類含有量の定量を、ヒアルロニダーゼサンプル由来のクロマトグラムをＮ−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮ）、Ｎ−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮ）、ガラクトース、フコースおよびマンノースを含む単糖類標準のクロマトグラムと比較することにより行った。表２８は、ヒアルロニダーゼ分子あたりのそれぞれの単糖類のモル比を示す。
Figure 0005885765
 ＊ＧａｌＮ結果は、検出限界より低かった
実施例１７
３Ｄ３５Ｍおよび２Ｂ２細胞から得た可溶性ｒＨｕＰＨ２０のＣ−末端不均一性
Ｃ−末端シーケンシングを、１００Ｌバイオリアクター容積（ロットＨＵＡ０５０５ＭＡ）中の３Ｄ３５Ｍ細胞および３００Ｌバイオリアクター容積（ロットＨＵＢ０７０１ＥＢ）中の２Ｂ２細胞から生産され精製されたｓＨｕＰＨ２０の２つのロットで行った。ロットを、Ｎ−末端にアスパラギン酸およびシステイン酸でペプチド結合を特異的に開裂させるエンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎで別々に消化した。これは、配列番号：１２２の位置４３１のアスパラギン酸で可溶性ｒＨｕＰＨ２０のＣ−末端部分を放出する。Ｃ−末端フラグメントを分離し、特性決定して、ロットＨＵＡ０５０５ＭＡおよびロットＨＵＢ０７０１ＥＢにおけるそれぞれの集団の配列および存在量を決定した。
３Ｄ３５Ｍ細胞および２Ｂ２細胞からの可溶性ｒＨｕＰＨ２０調製物が不均一性を示し、それらのＣ−末端配列（表３０および３１）が互いに異なっているポリペプチドを含むことが観察された。この不均一性は、生産および精製プロセス中の細胞培養培地または他の溶液に存在するペプチダーゼにより発現された４４７個のアミノ酸ポリペプチド（配列番号：１２２）のＣ−末端開裂の結果であろう。可溶性ｒＨｕＰＨ２０調製物におけるポリペプチドは、配列番号：１２２に示されている可溶性ｒＨｕＰＨ２０配列のアミノ酸１−４４７、１−４４６、１−４４５、１−４４４および１−４４３に対応するアミノ酸配列を有する。これらのポリペプチドのそれぞれの完全アミノ酸配列は、それぞれ配列番号：１２２から１２６に示されている。表２９および３０に記載されているように、３Ｄ３５Ｍ細胞および２Ｂ２細胞からの可溶性ｒＨｕＰＨ２０調製物中のそれぞれのポリペプチドの存在量は異なる。
Figure 0005885765
Figure 0005885765
修飾は当業者に明らかであるため、本発明は特許請求の範囲のみにより制限されると意図される。

Claims (24)

  1. 配列番号：１０７のアミノ酸３６−４９５、３６−４９６、３６−４９７、３６−４９８、３６−４９９または３６−５００として記載されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、または
    配列番号：１０７のアミノ酸３６−４９５、３６−４９６、３６−４９７、３６−４９８、３６−４９９または３６−５００として記載されているアミノ酸配列においてアミノ酸置換を含むポリペプチド、ここで、該アミノ酸置換ポリペプチドは、配列番号：１０７のアミノ酸３６−４９５、３６−４９６、３６−４９７、３６−４９８、３６−４９９または３６−５００として記載されているアミノ酸の対応する配列と、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、該ポリペプチドは、可溶性であり、中性ｐＨで配列番号：１０７のアミノ酸３６−４９５、３６−４９６、３６−４９７、３６−４９８、３６−４９９または３６−５００として記載されているアミノ酸配列からなるポリペプチドの１つのヒアルロニダーゼ活性を維持している
    である、延長された可溶性ＰＨ２０（ｅｓＰＨ２０）ヒアルロニダーゼポリペプチド。
  2. 配列番号：１０７のアミノ酸３６−４９５、３６−４９６、３６−４９７、３６−４９８、３６−４９９または３６−５００として記載されているアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のｅｓＰＨ２０ポリペプチド。
  3. Ｎ−グリコシル化されている、請求項１または２に記載のｅｓＰＨ２０ヒアルロニダーゼポリペプチド。
  4. 配列番号：１０７のアミノ酸残基２３５、３６８および３９３から選択される少なくとも３つのアスパラギン（Ｎ）残基のそれぞれに連結したＮ−アセチルグルコサミン部分を含む、請求項３に記載のｅｓＰＨ２０ヒアルロニダーゼポリペプチド。
  5. シアル化、アルブミン化、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化およびリン酸化から選択される修飾により修飾されている、請求項１から４のいずれかに記載のｅｓＰＨ２０ヒアルロニダーゼポリペプチド。
  6. ポリマーにより修飾されている、請求項１から５のいずれかに記載のｅｓＰＨ２０ヒアルロニダーゼポリペプチド。
  7. ポリマーがデキストランまたはＰＥＧである、請求項６に記載のｅｓＰＨ２０ヒアルロニダーゼポリペプチド。
  8. 実質的に精製された、または単離された、請求項１から７のいずれかに記載のｅｓＰＨ２０ヒアルロニダーゼポリペプチド。
  9. 請求項１から８のいずれかに記載のｅｓＰＨ２０ヒアルロニダーゼポリペプチドを含む複合体。
  10. ｅｓＰＨ２０ポリペプチドが、多重体化ドメイン、毒素、検出可能な標識または薬物から選択される部分に複合体化している、請求項９に記載の複合体。
  11. ｅｓＰＨ２０ポリペプチドがＦｃドメインに複合体化している、請求項１０に記載の複合体。
  12. 請求項１または２に記載のｅｓＰＨ２０ポリペプチドをコードする核酸分子であって、全長ＰＨ２０をコードしないが、ｅｓＰＨ２０ポリペプチドをコードする核酸分子。
  13. 請求項１２に記載の核酸分子を含むベクター。
  14. 請求項１または２に記載のｅｓＰＨ２０ポリペプチドの発現のためのベクターに作動可能に挿入された終始コドンを含むか、または該終始コドンが隣接して次に続く、請求項１または２に記載のｅｓＰＨ２０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  15. 請求項１３または１４に記載のベクターまたは請求項１２に記載の核酸分子を含む培養細胞。
  16. ＣＨＯ細胞である、請求項１５に記載の細胞。
  17. 請求項１から８のいずれかに記載のｅｓＰＨ２０ポリペプチドを含む組成物。
  18. 医薬組成物である、請求項１７に記載の組成物。
  19. さらなる治療剤を含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 治療剤が、化学療法剤、鎮痛剤、抗炎症剤、抗菌剤、殺アメーバ剤、殺トリコモナス剤、抗パーキンソン病薬、抗マラリア薬、鎮痙剤、抗抑制薬、抗関節炎剤、抗真菌剤、抗高血圧剤、解熱剤、抗寄生虫薬、抗ヒスタミン剤、アルファアドレナリン作動薬、アルファ遮断薬、麻酔薬、気管支拡張剤、殺生物剤、殺菌剤、静菌剤、ベータアドレナリン遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、心血管作動薬、避妊薬、充血除去剤、利尿薬、抑制薬、診断薬、電解質物質、催眠剤、ホルモン剤、血糖上昇剤、筋弛緩剤、筋肉収縮剤、眼科用剤、副交感神経作用薬、精神賦活剤、鎮静剤、交感神経様作用薬、精神安定剤、尿路剤、膣剤、殺ウイルス剤、ビタミン剤、非ステロイド系抗炎症剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、ポリペプチド、タンパク質、核酸、薬物、有機分子および睡眠導入剤から選択される、請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. ヒアルロナン関連疾患または状態を処置するための、グリコサミノグリカン過剰を処置するための、腫瘍を処置するための、脳におけるグリコサミノグリカン蓄積を処置するための、心疾患を処置するための、眼科疾患を処置するための、肺疾患を処置するための、固形腫瘍への化学療法剤の浸透を増加させるための、セルライトを処置するための、増殖性疾患を処置するための、または薬物および他の治療剤のバイオアベイラビリティを増加させるための医薬の製造のための、請求項１から８のいずれかに記載のｅｓＰＨ２０ポリペプチドまたは請求項１７から２０のいずれかに記載の組成物の使用。
  22. 疾患が腫瘍である、請求項２１に記載の使用。
  23. ヒアルロナン関連疾患または状態を処置するための、グリコサミノグリカン過剰を処置するための、腫瘍を処置するための、脳におけるグリコサミノグリカン蓄積を処置するための、心疾患を処置するための、眼科疾患を処置するための、肺疾患を処置するための、固形腫瘍への化学療法剤の浸透を増加させるための、セルライトを処置するための、増殖性疾患を処置するための、または薬物および他の治療剤のバイオアベイラビリティを増加させるための、請求項１７から２０のいずれかに記載の医薬組成物。
  24. 疾患が腫瘍である、請求項２３に記載の医薬組成物。
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