JP5878313B2 - ３−ヒドロキシプロピオン酸溶液の取扱い方法または保管の方法 - Google Patents

Description

本発明は、３−ヒドロキシプロピオン酸溶液の取扱い方法または保管の方法に関する。さらに３−ヒドロキシプロピオン酸溶液からのアクリル酸の製造方法に関する。

地球温暖化防止および環境保護の観点から、炭素源としてリサイクル可能な生物由来資源を従来の化石原料の代替として用いることが注目されている。例えば、汎用化成品、プラスチックおよび燃料生産の原料として、トウモロコシや小麦等の澱粉系バイオマス、サトウキビなどの糖質系バイオマス、および菜種の絞りかすや稲わら等のセルロース系バイオマス等のバイオマス資源を原料として利用する方法の開発が試みられている。また、バイオマス由来の糖類の利用以外にも、木質系バイオマスをガス化して得られる一酸化炭素と水素とを原料として利用する方法や、木質系バイオマスをガス化してメタノールを合成する方法についても検討・報告されている。このように、バイオマスから得られる糖類以外にも、様々な原料から汎用化成品を合成する技術が望まれている。

３−ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰとも称す）は、脂肪族ポリエステルの原料として有用な化合物であり、また、これから合成されるポリエステルは生分解性の地球にやさしいポリエステルとして注目されている。

また３−ヒドロキシプロピオン酸は、脱水することによりアクリル酸を製造することができる。アクリル酸は、主にアクリル酸エステル製造の中間体として使用されており、アクリル酸エステルはコーティング剤、仕上げ剤、ペイント、接着剤の製造に使用され、吸着剤や洗浄剤用添加剤の製造にも使用されている。また、アクリル酸を部分中和させ、架橋性モノマーと共重合させることで吸水性樹脂を製造することもできる。アクリル酸の代替製造法としては、アクリロニトリルの硫酸による加水分解が知られている。しかし、この方法では、硫酸アンモニウム廃棄物が大量に生成し、それに伴うコストのために商業的には実施されていない。

３−ヒドロヒドロキシプロピオン酸は微生物の培養により生産可能なことが報告されている。例えば、特許文献１では、３−ヒドロキシプロピオン酸生成能を有さない大腸菌に遺伝子組換えにより３―ヒドロキシプロピオン酸生成能を付与し、得られた組換え微生物を３−ヒドロキシプロピオン酸の発酵生産に用いる方法が開示されている。

一方、非特許文献１および２では、３−ヒドロキシプロピオン酸生成能を元来保有する微生物を３−ヒドロキシプロピオン酸の発酵生産に用いる方法が開示されている。具体的に、非特許文献１では、Ｄｅｕｓｕｌｆｏｒｉｂｒｉｏ属細菌を用いて、非特許文献２では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌を用いて、３−ヒドロキシプロピオン酸の発酵生産が行われている。

また上記のような、３−ヒドロキシプロピオン酸を含んだ発酵液から、３−ヒドロキシプロピオン酸を取り出す方法も検討されており、例えば特許文献２では、３−ヒドロキシプロピオン酸のアンモニウム塩を含んだ液を、水に非混和性の有機アミンの存在下で加熱することにより、有機アミン相へ抽出し、さらに逆抽出することで、３−ヒドロキシプロピオン酸を分離することが開示されている。さらに特許文献３には、電気透析を用いた回収方法が開示されている。

しかし、３−ヒドロキシプロピオン酸の発酵による製造や、その誘導体化の技術は未だ確立されておらず、工業化に当たっては技術のブラッシュアップが望まれている。

国際公開第２００８／０２７７４２号 国際公開第２００２／０９０３１２号 国際公開第２０１１／００２８９２号

Ｑａｔｉｂｉ ＡＩ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，３６，２８３−２９０ Ｓｏｂｏｌｏｖ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９６０，７９，２６１−２６６

本発明者らは、３−ヒドロキシプロピオン酸の合成、精製、誘導体化を検討する中で、３−ヒドロキシプロピオン酸は、分子間エステル化反応により二量体、三量体、四量体といったオリゴマーを形成しやすく、安定性に欠ける化合物であることを見出した。

本発明は、発酵にて得られた３−ヒドロキシプロピオン酸を含む溶液の取扱いまたは保管する際に、３−ヒドロキシプロピオン酸のオリゴマー化を抑制し、３−ヒドロキシプロピオン酸を誘導体化するために十分な品質を保持する３−ヒドロキシプロピオン酸溶液の取扱いまたは保管できる方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、種々検討の結果、発酵により得られた３−ヒドロキシプロピオン酸を濃度１０〜９０質量％の濃度で含む溶液を取り扱うまたは保管するに当たり、溶液中の水の含有量が１０〜９０質量％でかつ５〜５０℃の範囲で取り扱うことまたは保管することを見出した。また３−ヒドロキシプロピオン酸を除く発酵由来の有機酸が３−ヒドロキシプロピオン酸に対して５０質量％以下で取り扱うことまたは保管すること、さらに３−ヒドロキシプロピオン酸に対して、リン、窒素、マグネシウム、カルシウム、ナトリウムおよびカリウムから選ばれる少なくとも１種以上の元素を含み、該元素の合計が、１０００質量ｐｐｍ以下で取り扱うことまたは保管することにより、３−ヒドロキシプロピオン酸溶液を安定に存在させることができ、３−ヒドロキシプロピオン酸の誘導体化も効率的に進行させることができることを見出した。

本発明によれば３−ヒドロキシプロピオン酸溶液を安定に取扱いまたは保管することができる。また３−ヒドロキシプロピオン酸の誘導体化へ問題なく使用することができため、誘導体化反応の効率化や、安定化、コストダウンに寄与することができる。

本発明は、発酵により生成した３−ヒドロキシプロピオン酸の二量体化、三量体化、四量体化等のオリゴマー化を抑制し、安定に存在させる方法である。３−ヒドロキシプロピオン酸溶液は、特に濃度が高くなると安定性が低下するため、高い濃度領域での安定性の保持が重要である。本発明の取扱い方法または保管の方法においては、３−ヒドロキシプロピオン酸の初期濃度が１０〜９０質量％の溶液の場合に効果的であり、２０質量％以上の時により効果的であり、３０質量％以上の時にさらに効果的であり、４０質量％以上の時に一層効果的であり、５０質量％以上の時により一層効果的である。１０質量％未満の場合は、濃度が薄いため、その後の誘導体化反応において、反応速度が遅くなったり、コストアップの要因となり好ましくない。また９０質量％を超える濃度では、安定性が著しく悪いため、安定に保管することは困難である。

またヒドロキシカルボン酸はカルボキシル基と水酸基を有するため、オリゴマー化しやすいと考えられがちであるが、例えば３−ヒドロキシプロピオン酸の異性体である乳酸と比較すると、３−ヒドロキシプロピオン酸の方がオリゴマー化しやすく、これは３−ヒドロキシプロピオン酸の水酸基は１級であるのに対し、乳酸の水酸基は２級であることを考えると、驚くべきことであり、そのため本法により３−ヒドロキシプロピオン酸溶液を安定に取り扱うことまたは保管することは、非常に重要である。

本発明の３−ヒドロキシプロピオン酸溶液は、３−ヒドロキシプロピオン酸と溶媒を含む。溶媒としては３−ヒドロキシプロピオン酸を溶解すればよく、特に限定されないが、水、アルコール、炭化水素、エーテル、ケトン、エステル、アミン、アミドまたはこれらを組み合わせた溶媒を用いることができる。好適には水である。
特に水の濃度は、３−ヒドロキシプロピオン酸溶液の安定性には影響が大きく、水の濃度によって、３−ヒドロキシプロピオン酸のカルボキシル基の解離平衡がずれｐＨが変化すること、また水は３−ヒドロキシプロピオン酸がオリゴマー化する際の副生物でもあるため、水の濃度によって見かけの反応速度が変わることから、３−ヒドロキシプロピオン酸溶液の安定な取扱い方法または保管の方法においては、最適な範囲を選択する必要がある。本発明においては、水は３−ヒドロキシプロピオン酸溶液中に１０〜９０質量％存在することが好ましく、より好ましくは８０質量％以下であり、さらに好ましくは６０質量％以下である。
本発明における３−ヒドロキシプロピオン酸溶液の取扱い方法または保管の方法においては、温度は重要な要因である。温度が高すぎるとオリゴマー化速度が大きくなって好ましくないが、平衡的には温度が低い方がオリゴマー生成側に有利になるため、最適な温度範囲を選択する必要がある。本発明においては、５〜５０℃の範囲で、３−ヒドロキシプロピオン酸を取り扱うことまたは保管することが望ましい。５℃未満の場合、長期の保管の場合、平衡的にオリゴマーが増加する恐れがあり、また粘度が高くなるため取扱いに支障が出る場合がある。５０℃を超える温度では、オリゴマー化速度が大きくなり、短時間で安定性が低下する。

発酵による３−ヒドロキシプロピオン酸の生成においては、使用する酵素や菌体、酵母等の微生物の種類や、原料、発酵条件によっても異なるが、副生成物として有機酸が生成することが多い。例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、グリコール酸、乳酸、２−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、４−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸、コハク酸、ピルビン酸等が挙げられる。これらは３−ヒドロキシプロピオン酸と同様の有機酸のため、分離が難しい場合があり、発酵液から３−ヒドロキシプロピオン酸を回収した際に、不純物として含まれることが多い。

これらの有機酸が不純物として含まれると、３−ヒドロキシプロピオン酸溶液の安定性は低下し、３−ヒドロキシプロピオン酸のオリゴマー化の速度が上がり、３−ヒドロキシプロピオン酸の濃度が低下する。そのため、３−ヒドロキシプロピオン酸を除く発酵由来の有機酸は３−ヒドロキシプロピオン酸に対して５０モル％以下であることが好ましい。より好ましくは４０モル％以下であり、一層好ましくは３０モル％以下であり、さらに好ましくは２０モル％以下であり、より一層好ましくは１０モル％以下である。

また、発酵により３−ヒドロキシプロピオン酸を合成する際には、微生物の生育を促すために培地を添加する場合が多い。培地としては、天然物を使用したり、化学薬品を使用する。天然物としては例えば肉汁、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、コーンミール、グルコース等が挙げられる。

また化学薬品としては、例えば、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、パントテン酸、ニコチン酸、クエン酸、イノシトール等が挙げられる。

３−ヒドロキシプロピオン酸やこれらの培地成分を含んだ発酵液より、３−ヒドロキシプロピオン酸を回収する際、一部の培地成分が、混入する場合がある。中でも、リン、窒素、マグネシウム、カルシウム、ナトリウムおよびカリウムから選ばれる少なくとも１種以上の元素が含まれると、３−ヒドロキシプロピオン酸のオリゴマー化速度が大きくなり、安定性が損なわれる。そのため、３−ヒドロキシプロピオン酸溶液中のリン、窒素、マグネシウム、カルシウム、ナトリウムおよびカリウムの合計が、３−ヒドロキシプロピオン酸に対して、１０００質量ｐｐｍ以下が好ましい。より好ましくは７００質量ｐｐｍ以下である。

また、特にリンについては、リン酸やリン酸塩の形で存在すると、３−ヒドロキシプロピオン酸溶液の安定性の低下に大きく影響を及ぼすため、リン酸および／またはリン酸塩の形で存在するリンの量は、３−ヒドロキシプロピオン酸に対して、５００質量ｐｐｍ以下が好ましく、より好ましくは３００質量ｐｐｍ以下である。

また窒素については、アミンやアンモニウム塩の形で存在すると、３−ヒドロキシプロピオン酸溶液の安定性の低下に大きく影響を及ぼすため、アミンおよび／またはアンモニウム塩の形で存在する窒素の量は、３−ヒドロキシプロピオン酸に対して、５００質量ｐｐｍ以下が好ましく、より好ましくは３００質量ｐｐｍ以下である。

上記のような条件で取扱いまたは保管された３−ヒドロキシプロピオン酸溶液は、オリゴマー化もある程度抑制され、安定に存在することができる。３−ヒドロキシプロピオン酸溶液の取扱いとは、３−ヒドロキシプロピオン酸溶液の反応、物理的処理、化学的処理あるいは移送等を含む。また保管は、次の誘導体化工程までの間、タンクや容器中に貯蔵することを指す。上記のような条件で取扱いまたは保管された場合、３−ヒドロキシプロピオン酸溶液はその後の誘導体化においても問題なく使用可能である。安定性の目安は、次の誘導体化反応にもよるが、３−ヒドロキシプロピオン酸溶液中の３−ヒドロキシプロピオン酸のオリゴマーの濃度が３−ヒドロキシプロピオン酸の１００質量％以下で留まることが望ましい。３−ヒドロキシプロピオン酸のオリゴマーは、３−ヒドロキシプロピオン酸分子が２〜１０個結合したものが、オリゴマー全体の７０質量％以上であることが好ましく、８０質量％以上であることがより好ましい。さらに３−ヒドロキシプロピオン酸分子が２〜８個結合したものが、オリゴマー全体の７０質量％以上であることが好ましく、８０質量％以上であることがより好ましい。さらには３−ヒドロキシプロピオン酸分子が２〜５個結合したものが、オリゴマー全体の７０質量％以上であることが好ましく、８０質量％以上であることがより好ましい。３−ヒドロキシプロピオン酸溶液を上記条件に保持後、すぐに誘導体化反応する場合は、２４時間以上安定であれば良く、好ましくは４８時間以上である。３−ヒドロキシプロピオン酸溶液をある程度の期間、保管する場合は好ましくは１ヶ月以上、より好ましくは３ヶ月以上安定であればよい。

以下、３−ヒドロキシプロピオン酸を誘導体化する例として、３−ヒドロキシプロピオン酸溶液を気相で脱水することによるアクリル酸の製造について例示するが、それ以外の液相での反応等、他の方法にも、本発明で得られた３−ヒドロキシプロピオン酸溶液は原料として使用できる。

アクリル酸の製造に使われる３−ヒドロキシプロピオン酸を含む原料組成物は、上記の取扱い方法または保管の方法を経て得られた３−ヒドロキシプロピオン酸溶液をそのまま脱水反応の原料としても良いし、さらに濃度調整や溶媒や添加物等の添加によって、原料組成物を調製できる。
本発明における３−ヒドロキシプロピオン酸を含む原料組成物は、３−ヒドロキシプロピオン酸を含んでいれば良い。発酵やその後の回収工程、取扱いや保管中に生成する３−ヒドロキシプロピオン酸のダイマー等のオリゴマー類は、３−ヒドロキシプロピオン酸に対して１００質量％以下であれば使用可能である。原料組成物に含まれる３−ヒドロキシプロピオン酸の濃度は５〜９５質量％、好ましくは１０〜９０質量％、より好ましくは２０〜９０質量％である。

３−ヒドロキシプロピオン酸を含む原料組成物には溶媒が含まれていてもよい。溶媒としては、３−ヒドロキシプロピオン酸を溶解すればよく、特に限定されないが、水、アルコール、炭化水素、エーテル、ケトン、エステル、アミン、アミドまたはこれらを組み合わせた溶媒を用いることができる。好適には水である。

本発明において原料組成物に溶媒を用いる場合、溶媒の濃度は５〜９５質量％であり、好ましくは１０〜９０質量％、より好ましくは１０〜８０質量％である。５質量％以上であれば、粘度の低下により原料組成物の取扱いが容易になり、また気化した溶媒の同伴によって３−ヒドロキシプロピオン酸の蒸発が促進される効果が期待できる。一方９５質量％以下とすることで、蒸発にかかる熱量を抑制し、用役費の低減に寄与できる。

脱水反応においては、上記原料組成物を気化させた後、脱水触媒と接触させてアクリル酸を製造する。原料組成物の気化は、気化器にて原料組成物を蒸発させた後、脱水反応器に供給しても良いし、脱水反応器の上部に気化器を接続して一体化しても良い。

脱水工程で使用する反応器は、中に固体触媒を保持し、加熱することができればよく、固定床式流通反応器や流動床式流通反応器等が使用できる。固定床式反応器は、反応器内に触媒を充填して加熱しておき、そこに原料組成物の蒸気を供給すればよい。原料組成物の蒸気は、上昇流、下降流、水平流いずれも好適に使用できる。また熱交換の容易さから、多管式固定床反応器が好適に使用できる。
流動床式反応器は、反応器の中に粒状の触媒を入れ、原料組成物の蒸気や、別途供給する不活性ガス等で触媒を流動させながら反応させることができる。触媒が流動しているため、重質分による閉塞が起こりにくい。また触媒の一部を連続的に抜き出して、新しい触媒や再生した触媒を連続的に供給することもできる。

脱水反応の触媒は、３−ヒドロキシプロピオン酸をアクリル酸に転化する触媒作用を有するものであれば特に限定されず、ゼオライト等の結晶性メタロシリケート；カオリナイト、ベントナイト、モンモリロナイトなどの天然または合成粘土化合物；硫酸、ヘテロポリ酸、リン酸またはリン酸塩（リン酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、リン酸マンガン、リン酸ジルコニウム等）をアルミナやシリカ等の担体に担持させた触媒；活性アルミナ、ＳｉＯ_２、ＴｉＯ_２、ＺｒＯ_２、ＳｎＯ_２、Ｖ_２Ｏ_５、ＳｉＯ_２−Ａｌ_２Ｏ_３、ＳｉＯ_２−ＴｉＯ_２、ＳｉＯ_２−ＺｒＯ_２、ＴｉＯ_２−ＷＯ_３、ＴｉＯ_２−ＺｒＯ_２などの無機酸化物または無機複合酸化物；ＭｇＳＯ_４、Ａｌ_２（ＳＯ_４）_３、Ｋ_２ＳＯ_４、ＡｌＰＯ_４、Ｚｒ（ＳＯ_４）_２等の金属の硫酸塩、リン酸塩などの固体酸性物質；を挙げることができる。また酸化カルシウム、酸化マグネシウム等の固体塩基性物質も挙げられる。

触媒層の温度は１５０〜５００℃に保持することが好ましい。好ましくは２００〜４５０℃である。この温度範囲であると、反応速度が速く、副反応も生じにくくアクリル酸の収率が高くなる。また反応圧力は特に限定されないが、原料組成物の蒸発方法、脱水反応の生産性や脱水反応後の捕集効率等を勘案して決定することができる。例えば反応圧力としては１０〜１０００ｋＰａであり、好ましくは５０〜３００ｋＰａである。

本発明において、反応生成物を冷却してアクリル酸を含む組成物を得る方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、反応生成ガスを熱交換器に導入し反応生成ガスの露点以下の温度で凝縮して得る方法や、または反応生成ガスを溶剤等の捕集剤に接触させて吸収する方法等により冷却して、アクリル酸を含む組成物を得ることができる。

このようにして得られた反応生成物の組成物中には主な反応生成物である水、アクリル酸が含まれており、その他に副生物や原料組成物中の溶媒や不純物が含まれる場合がある。溶媒が水の場合は、アクリル酸の水溶液の状態で重合物製造の原料とすることができる。また精製工程を加えることにより高純度のアクリル酸にすることができる。精製工程は、蒸発、蒸留、抽出、膜分離、晶析等公知の技術により実施でき、それらを組み合わせて実施しても良い。

以上の方法により、アクリル酸を製造することができる。かくして製造されたアクリル酸は、アクリル酸エステルなどのアクリル酸誘導体、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウムなどの親水性樹脂、吸水性樹脂などの合成原料として有用である。従って、本発明によるアクリル酸の製造方法は、アクリル酸誘導体や親水性樹脂の製造方法に取り入れることが当然可能である。

３−ヒドロキシプロピオン酸は、公知の方法で入手可能であり、例えば国際公開第２００８／０２７７４２号に記載されている、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ ＡＴＣＣ２１８９７由来ｂｅｔａ−ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子導入大腸菌を用いた、グルコースを炭素源とした発酵により得ることができる。また、国際公開第２００１／０１６３４６号に記載されている、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来グリセリン脱水酵素および大腸菌由来アルデヒド酸化酵素導入大腸菌を用いた、グリセリンを炭素源とした発酵によっても得ることができる。

３−ヒドロキシプロピオン酸の入手方法の例として上記公知文献を記載したが、本発明の方法を用いる限り、発酵に用いる細菌または組換え細菌は特に限定されず、３−ヒドロキシプロピオン酸生成能を有する生物を用いた発酵により入手した３−ヒドロキシプロピオン酸であれば本発明記載の方法で利用可能である。また、発酵以外にも原料とする糖類と生物とを接触させることで生成した３−ヒドロキシプロピオン酸でも本特許記載の方法でアクリル酸へ変換することができる。糖類と生物を接触させるとは、原料として利用する糖類の存在下で微生物又はその処理物を用いて反応を行うことをも包含する。該処理物としては、アセトン、トルエン等で処理した菌体、菌死体、凍結乾燥菌体、菌体破砕物、菌体を破砕した無細胞抽出物、これらから酵素を抽出した粗酵素液、精製酵素等が挙げられる。また、常法により担体に固定化した菌体、該処理物、酵素等を用いて反応を行うことにより入手した３−ヒドロキシプロピオン酸も用いることができる。

本発明では、生物由来資源を用いて発酵により３−ヒドロキシプロピオン酸を得る具体的実施形態に係る方法において、固体、特に微細な植物の部分又は細胞及び／又は細胞断片、特に発酵の後に得られる３−ヒドロキシプロピオン酸及び微生物等を含む水性組成物から微生物や生物的材料等を分離するのが良い。前記分離は、固体を液状組成物から分離するための、当業者に公知の全ての方法により実施することができるが、好ましくは沈殿法、遠心分離法又は濾過法、最も好ましくは濾過法により分離するのがよい。

３−ヒドロキシプロピオン酸及び微生物等を含む水性組成物から微生物等を分離する処理においては、そこに含まれる微生物に処理を施すことなく行っても良いが、加熱処理して、そこに含まれる微生物を殺菌する処理工程を含んでも良い。前記水性組成物から微生物等を殺菌する処理は、微生物を分離する前、その間若しくは後に行うことができる。上記加熱処理の方法としては、３−ヒドロキシプロピオン酸及び微生物等を含む水性組成物を少なくとも６０秒間、好ましくは少なくとも１０分間、更に好ましくは少なくとも３０分間にわたり、少なくとも１００℃、特に好ましくは少なくとも１１０℃、更に好ましくは少なくとも１２０℃の温度で加熱することによって実施するのが好ましく、当該加熱処理は、当業者に公知の装置（例えばオートクレーブ）において実施するのが好ましい。高エネルギー照射（例えば紫外線照射）により微生物を殺菌してもよいが、加熱による微生物の殺菌が特に好適である。

３−ヒドロキシプロピオン酸を含む水性組成物から、さらに３−ヒドロキシプロピオン酸を回収する方法としては公知の技術が使用できる。例えば、蒸留、蒸発、抽出、膜分離、晶析、イオン交換、電気透析等が挙げられ、これらを組み合わせても良い。さらに具体的には、発酵により得られた粗製ヒドロキシプロピオン酸を、カルシウム塩を用いて沈殿させて３−ヒドロキシプロピオン酸のカルシウム塩として回収し、その後、硫酸等の酸と反応させて３−ヒドロキシプロピオン酸を精製する方法、または発酵により得たアンモニウム型の３−ヒドロキシプロピオン酸を電気透析または陽イオン交換法によって３−ヒドロキシプロピオン酸に化学変換させて精製する方法等が利用できる。また、発酵により得られたアンモニウム型の３−ヒドロキシプロピオン酸に、水に不混和性のアミン溶媒を添加し加熱することで、アンモニアを除去して３−ヒドロキシプロピオン酸のアミン溶液を得ることができる。そこに水を加えて加熱することで、３−ヒドロキシプロピオン酸の水溶液を得ることができる。このようにして発酵液より、３−ヒドロキシプロピオン酸溶液を得ることができる。この３−ヒドロキシプロピオン酸溶液を、本発明の条件にて取り扱うまたは保管することによって、３−ヒドロキシプロピオン酸を誘導体化するに十分な品質を保持することができる。

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記の実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
なお、以下ことわりのない場合、「％」は「質量％」を、「部」は「質量部」をそれぞれ示すものとする。

（調製例１）
３−ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）を含む組成物の取得
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ２５９５５株のゲノムＤＮＡをテンプテレ−トとしてグリセロールデヒドラターゼ遺伝子（ＧＤ遺伝子）およびグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子（ＧＤＲ遺伝子）を含む領域を、下記の２つのプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、増幅断片の末端を制限酵素ＮｄｅＩ、ＢｇｌＩＩで切断し、電気泳動によって切断断片を回収した。なお、ＧＤ遺伝子およびＧＤＲ遺伝子配列を増幅する以下のプライマーはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＮＣ＿００９６４８記載のＤＮＡ配列を元に設計した。
フォワードプライマー：
５’−ＧＣＧＣＧＣＣＡＴＡＴＧＴＴＡＡＴＴＣＧＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣ−３’
リバースプライマー：
５’−ＧＣＧＣＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＧＴＴＴＣＴＣＴＣＡＣＴＴＡＡＣＧ−３’
ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１プラスミド（タカラバイオ社）をテンプレートにして下記の２つのプライマーでベクター配列を増幅し、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１プラスミドのＴ７プロモーターの後ろにＮｄｅＩサイトおよびＢｇｌ ＩＩサイトを持ったＤＮＡ断片を増幅した。
フォワードプライマー：
５’−ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＧＣＧＣ−３’
リバースプライマー：
５’−ＣＣＧＡＴＡＴＣＣＡＡＴＴＧＡＧＡＴＣＴＧＣＧＣＧＣ−３’
増幅断片を制限酵素ＢｇｌＩＩとＮｄｅＩで切断し、電気泳動によって切断断片を分離して回収した。この２つのＤＮＡ断片をライゲーションし、大腸菌ＴＯＰ１０コンピテントセル（インビトロジェン社）に導入し、クロラムフェニコール含有プレートに広げて培養しところ、クロラムフェニコール耐性大腸菌を得ることができた。クロラムフェニコール耐性大腸菌からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素により分子量の確認を行ったところ、目的とするＧＤ遺伝子およびＧＤＲ遺伝子がｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１プラスミドに挿入されていることが確認できた。構築した組換えプラスミドをＧＤ−ＧＤＲ／ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１と命名し、以降の実験に用いた。

大腸菌Ｋ−１２ Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡをテンプテレ−トとしてγ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−γ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ遺伝子（ａｌｄＨ遺伝子）を下記の２つのプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅し、増幅断片の末端を制限酵素ＮｄｅＩ、ＢｇｌＩＩで切断し、電気泳動によって切断断片を回収した。なお、以下プライマーはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＢ２００３１９記載のＤＮＡ配列を元に設計した。
フォワードプライマー：
５’−ＧＧＧＧＧＧＣＣＡＴＡＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＧＧＣＴＴＡＣＴＧ−３’
リバースプライマー：
５’−ＣＣＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＣＣＴＣＣＡＧＧＣＴＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧ−３’
ｐＵＣ１８プラスミドをテンプレートにして下記の２つのプライマーでベクター配列を増幅し、ｐＵＣ１８プラスミドのｌａｃプロモーターの後ろにＮｄｅＩサイトを持ち、ｌａｃＺ遺伝子の終始コドンの位置にＢａｍＨＩサイトを持ったＤＮＡ断片を増幅した。
フォワードプライマー：
５’−ＣＣＣＣＣＣＣＡＴＡＴＧＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＡＴＡＴＡＣＧＡＧＣＣ−３’
リバースプライマー：
５’−ＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＴＡＡＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＡＣＡＣＣＣＧＣＣＡＡＣＡＣＣ−３’
増幅断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＮｄｅＩで切断し、電気泳動によって切断断片を分離して回収した。この２つのＤＮＡ断片をライゲーションし、大腸菌ＴＯＰ１０コンピテントセルに導入し、アンピシリン含有プレートに広げて培養した。得られた形質転換体からプラスミドを抽出し、制限酵素処理により分子量の確認をしたところ、目的どおり、ａｌｄＨがｐＵＣ１８プラスミドに挿入されていることを確認した。構築した組換えプラスミドをａｌｄＨ／ｐＵＣ１８と命名し、以降の実験で使用した。
構築したＧＤ−ＧＤＲ／ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１およびａｌｄＨ／ｐＵＣ１８をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（Ｍｅｒｃｋ社）のプロトコールに従って、ヒートショック法により導入し、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＧＤ−ＧＤＲ／ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１、ａｌｄＨ／ｐＵＣ１８）を作出した。

Ｅ．ｃｏｌｉ（ＧＤ−ＧＤＲ／ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１、ａｌｄＨ／ｐＵＣ１８）を、アンピシリン１００ｐｐｍ、クロラムフェニコール５０ｐｐｍ添加ＬＢ液体培地５ｍＬ（ＬＢ培地１Ｌあたりの組成：トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ）で３７℃、１６時間、振盪培養し、前培養液を得た。次に前培養液５ｍＬを、アンピシリン１００ｐｐｍ、クロラムフェニコール５０ｐｐｍ、添加ＮＳ液体培地１Ｌに植菌し、３７℃、攪拌速度７２５ｒｐｍ、通気量１Ｌ／ｍｉｎ、で通気攪拌培養を行った。なお、ＮＳ液体培地の組成は、グリセリン４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム６ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇ／Ｌ、酵母エキス４０ｇ／Ｌである。また、培養には、バイオット製ジャーファーメンター：ＢＭＪ−０２ＮＰ２を使用し、培養中はアンモニア水を用いて培養液中のｐＨを７にコントロールした。培養８時間後に１Ｍ ＩＰＴＧ溶液を１ｍＬ、８ｍＭアデノシルコバラミン溶液を１ｍＬ添加し、培養途中にグリセリンが枯渇しないように適時グリセリンを添加しながら１００時間培養を行った。得られた培養液を遠心分離にかけ、培養液上清を回収した。以下記載の高速液体クロマトグラフィーを用いた分析方法で培養液上清中の生成物の確認を行ったところ、生成物である３−ヒドロキシプロピオン酸のピークを７．９分の位置に確認することができ、培養液中の３−ヒドロキシプロピオン酸の濃度は２質量％であった。

高速液体クロマトグラフィーでの分析条件：
使用カラム： ＹＭＣ−ｐＡＣＫ ＦＡ（ＹＭＣ社）
流量：１ｍＬ／ｍｉｎ
インジェクション量：１０μＬ
溶離液：メタノール／アセトニトリル／Ｈ_２Ｏ＝４０／５／５５（Ｖ／Ｖ／Ｖ）
内部標準：２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌ−ｎ−ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ
検出：ＵＶ ４００ｎｍ
培養上清１００μＬに内部標準液２００μＬを加えた。ヒドロキシカルボン酸ラベル化試薬（ＹＭＣ社）の試薬Ａ液２００μＬ、試薬Ｂ液２００μＬを加え、よく混合した後、６０℃、２０分間処理した。ヒドロキシカルボン酸ラベル化試薬（ＹＭＣ社）の試薬Ｃ液２００μＬを添加し、よく混合した。６０℃、１５分間処理後、室温まで冷えたら０．４５ｍｍフィルターに通し、ＬＣ分析サンプルとして供した。

菌体を除去した２質量％の３−ヒドロキシプロピオン酸含有培養液からＷＯ２００２／０９０３１２記載の方法で、３ＨＰを１２質量％含む水溶液を得た。またこの水溶液中には、発酵副生物である酢酸が７．２質量％含まれていた。

（実施例１）
調製例１で得られた３ＨＰ水溶液を、薄膜式蒸発器を用いて濃縮を行った。圧力を２０ｍｍＨｇ、ジャケット温度を５０℃として、軽沸分を留去した。得られたボトム液をさらに薄膜蒸発器にかけ、圧力２ｍｍＨｇ、ジャケット温度を１００℃として、３ＨＰを含む留分を得た。この留分を３ＨＰ溶液とした。この３ＨＰ溶液中の３ＨＰ濃度は８８．０質量％であった。この溶液を、３５℃、５０℃にて２４時間保管した。保管後の３ＨＰ濃度は、３５℃保管の場合で８１．３質量％、５０℃保管の場合で６９．１質量％であった。

（比較例１）
実施例１で得られた、８８．０質量％の３ＨＰ溶液を６５℃で２４時間保管した。保管後の３ＨＰ濃度は３０．７質量％であった。

（比較例２）
調製例１で得られた３ＨＰ水溶液を、薄膜式蒸発器を用いて濃縮を行った。圧力を１５ｍｍＨｇ、ジャケット温度を５０℃として、軽沸分を留去した。得られたボトム液をさらに薄膜蒸発器にかけ、圧力２ｍｍＨｇ、ジャケット温度を１００℃として、３ＨＰを含む留分を得た。この留分を３ＨＰ溶液とした。この３ＨＰ溶液中の３ＨＰ濃度は９５．０質量％であった。この溶液を、５０℃にて２４時間保管した。保管後の３ＨＰ濃度は、４３．５質量％であった。

（実施例２）
実施例１で得られた８８．０質量％の３ＨＰ溶液に、水を添加して３ＨＰが４９．３質量％になるように調製した。この３ＨＰ溶液中の酢酸濃度は、５．４質量％（３ＨＰに対して１６．４ｍｏｌ％）であった。この溶液を３５℃で２４時間保管した。保管後の３ＨＰ濃度は、４８．３質量％であった。

（実施例３）
調製例１で得られた、１２質量％の３ＨＰ水溶液を薄膜蒸発器で濃縮を行った。圧力３０ｍｍＨｇ、ジャケット温度４０℃として、軽沸分を除去した。得られたボトム液をさらに薄膜蒸発器にかけ、圧力２ｍｍＨｇ、ジャケット温度を１００℃として、３ＨＰを含む留分を得た。その留分に水を添加して３ＨＰが４９．３質量％になるように調製し３ＨＰ溶液とした。この溶液中の酢酸濃度は、１７．７質量％（３ＨＰに対して５３．９ｍｏｌ％）であった。この溶液を３５℃で２４時間保管した。保管後の３ＨＰ濃度は、４５．４質量％であった。

（実施例４）
調製例１において、培養液のｐＨ調整をアンモニア水の代わりに水酸化カルシウムを用いて実施した。培養終了後、培養液に、使用した水酸化カルシウムに対して９８モル％相当の硫酸水溶液を滴下し、３０℃で２時間撹拌した。得られた液から濾過により、菌体と生成した硫酸カルシウムを除去した。濾液を１００℃で２時間加熱することにより、タンパク質の変性物を析出させ、これを濾過により除去した。得られた濾液を、薄膜蒸発器にて濃縮した。圧力を２０ｍｍＨｇ、ジャケット温度を５０℃として、軽沸分を留去した（薄膜蒸発１回目）。得られたボトム液をさらに薄膜蒸発器にかけ、圧力２ｍｍＨｇ、ジャケット温度を１００℃として、３ＨＰを含む留分を得た（薄膜蒸発２回目）。得られた留分に水を添加し、３ＨＰが６９．０質量％になるように調製し３ＨＰ溶液とした。この溶液中のリン酸イオン、アンモニウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオンをイオンクロマトグラフィーにて分析した（表１）。この溶液を３５℃にて２４時間保管した。保管後の３ＨＰ濃度は６５．９％質量であった。

（実施例５）
実施例４において、薄膜蒸発１回目で得られたボトム液に水を添加した後、陽イオン交換樹脂アンバーリスト１５（オルガノ社製）を添加し、３０℃で２時間撹拌し、液中のイオン成分を吸着させた。陽イオン交換樹脂および析出物を除去後、３ＨＰが６９．０質量％になるように調製し３ＨＰ溶液とした。この溶液中のリン酸イオン、アンモニウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオンをイオンクロマトグラフィーにて分析した（表１）。この溶液を３５℃にて２４時間保管した。保管後の３ＨＰ濃度は５８．１質量％であった。

（実施例６）
実施例１において３５℃で保管して得られた３ＨＰ溶液に、水を添加して３ＨＰ濃度が６０質量％になるように原料組成物を調整した。ＮＭＲにて、３ＨＰと３ＨＰのオリゴマーを分析したところ、３ＨＰに対して、３ＨＰオリゴマーは８質量％含まれていた。上記３ＨＰ水溶液にメトキノンを１００質量ｐｐｍになるように添加した。
内径１０ｍｍの反応管に、固体触媒としてγ−アルミナを充填し、その上に蒸発層としてディクソンパッキンを充填した。反応管を電気炉にて３００℃に加熱し、上記原料組成物を毎時２．９ｇの速度で反応管の上部に供給した。同時に、毎時２０Ｌの速度で窒素ガスを流した。８時間継続して脱水反応を実施した。
反応管の下部から抜き出した反応ガスを、冷却捕集し反応液を得た。得られた反応液を液体クロマトグラフィーで分析したところ、３ＨＰおよび３ＨＰオリゴマーの転化率は９５％、３ＨＰと３ＨＰオリゴマーの合計に対するアクリル酸の収率は９０モル％であった。

（比較例３）
比較例２で保管された３ＨＰ溶液を、実施例６の原料組成物と３ＨＰとオリゴマー（３ＨＰ換算）の合計濃度が同じになるように調製した。３ＨＰ濃度は２９．８質量％、３ＨＰのオリゴマーは３１．７質量％であり、３ＨＰに対して、３ＨＰのオリゴマーは１０７質量％含まれていた。この原料組成物を、実施例６と同じ条件で脱水反応に用いた。３ＨＰおよび３ＨＰオリゴマーの転化率は８８％、３ＨＰと３ＨＰオリゴマーの合計に対するアクリル酸の収率は７２モル％であった。

本発明は、発酵により生成した３−ヒドロキシプロピオン酸を含む溶液を安定に取扱いまたは保管することができ、さらにこの３−ヒドロキシプロピオン酸溶液を原料として高品質のアクリル酸を高収率で安定的かつ連続的に製造することを可能にする。リサイクル可能な生物由来資源（例えばバイオマス）から入手または調製された３−ヒドロキシプロピオン酸を使用するため、地球温暖化対策に多大の貢献をなすものである。

Claims (6)

1. 発酵により生成した３−ヒドロキシプロピオン酸を、１０〜９０質量％の濃度で含む溶液の保管の方法であって、
   該方法は、溶液中の水の含有量を１０〜９０質量％とし、溶液中にアミンおよび／またはアンモニウム塩の形で存在する窒素の量が、３−ヒドロキシプロピオン酸に対して、１７質量ｐｐｍ以上、５００質量ｐｐｍ以下である溶液を５〜５０℃の範囲で保管することを特徴とする３−ヒドロキシプロピオン酸溶液の保管の方法。
2. 前記３−ヒドロキシプロピオン酸溶液は、３−ヒドロキシプロピオン酸に対して、３−ヒドロキシプロピオン酸を除く発酵由来の有機酸が５０モル％以下であることを特徴とする請求項１に記載の３−ヒドロキシプロピオン酸溶液の保管の方法。
3. 前記３−ヒドロキシプロピオン酸溶液は、３−ヒドロキシプロピオン酸に対して、リン、窒素、マグネシウム、カルシウム、ナトリウムおよびカリウムから選ばれる少なくとも１種以上の元素を含み、該元素の合計が、９７質量ｐｐｍ以上、１０００質量ｐｐｍ以下であることを特徴とする請求項１または２に記載の３−ヒドロキシプロピオン酸溶液の保管の方法。
4. 前記リンがリン酸および／またはリン酸塩であることを特徴とする請求項３記載の３−ヒドロキシプロピオン酸溶液の保管の方法。
5. 前記窒素がアミンおよび／またはアンモニウム塩であることを特徴とする請求項３または４記載の３−ヒドロキシプロピオン酸溶液の保管の方法。
6. アクリル酸を製造する方法であって、
   該製造方法は、発酵により生成した３−ヒドロキシプロピオン酸を１０〜９０質量％の濃度で含む溶液を保管する工程と
   該保管工程後の３−ヒドロキシプロピオン酸溶液を脱水する工程とを有し、
   該保管工程は、溶液中の水の含有量が１０〜９０質量％であり、溶液中にアミンおよび／またはアンモニウム塩の形で存在する窒素の量が、３−ヒドロキシプロピオン酸に対して、１７質量ｐｐｍ以上、５００質量ｐｐｍ以下である溶液を５〜５０℃の範囲で保管することを特徴とするアクリル酸の製造方法。