JP5859148B2

JP5859148B2 - Ａβ抗体製剤

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Publication number: JP5859148B2
Application number: JP2014560323A
Authority: JP
Inventors: ゴルトバッハ，ピエール; マーラー，ハンス−クリスティアン; ミューラー，ロベルト
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2012-03-08
Filing date: 2013-03-05
Publication date: 2016-02-10
Anticipated expiration: 2033-03-05
Also published as: CN104159613A; WO2013131866A1; BR112014019667A2; MX2014009662A; CA2860543C; EP2822587B1; CY1117363T1; ZA201405103B; MX351148B; EP2822587A1; CN104159613B; DK2822587T3; JP2015510871A; AU2013229613A1; RU2014140137A; AU2013229613B2; NZ626955A; HUE028440T2; PL2822587T3; MY166045A

Description

本発明は、アミロイドβペプチド（Ａβ）に対する抗体分子および／または抗体分子の混合物の薬学的製剤に関する。

タンパク質医薬品群の一部としての抗体分子は、変性および凝集、脱アミド、酸化および加水分解などの物理的分解および化学的分解に非常に感受性である。タンパク質の安定性は、タンパク質自体の特徴、例えばアミノ酸配列によって、および温度、溶媒ｐＨ、賦形剤、界面、またはずり速度などの外部影響によって影響される。それで、製造、保存および投与の際に分解反応からタンパク質を保護する最適な製剤条件を定義することが重要である（Manning, M. C., K. Patel, et al. (1989). "Stability of protein pharmaceuticals." Pharm Res 6(11): 903-18., Zheng, J. Y. and L. J. Janis (2005). "Influence of pH, buffer species, and storage temperature on physicochemical stability of a humanized monoclonal antibody LA298." Int)_Pharm）。皮下または筋肉内経路による抗体の投与は、高用量および限られた投与体積を必要とすることが多いので、最終製剤中に高いタンパク質濃度を必要とする（Shire, S. J., Z. Shahrokh, et al. (2004). "Challenges in the development of high protein concentration formulations." J Pharm Sci 93(6): 1390-402., Roskos, L. K., C. G. Davis, et al. (2004). "The clinical pharmacology of therapeutic monoclonal antibodies." Drug Development Research 61(3): 108-120）。高タンパク質濃度の大規模製造は、限外濾過工程、凍結乾燥または噴霧乾燥などの乾燥工程、および沈殿工程によって達成することができる（Shire, S.1., Z. Shahrokh, et al. (2004). "Challenges in the development of high protein concentration formulations." J Pharm Sci 93(6): 1390-402）。

患者への抗体の皮下投与を可能にする、Ａβ抗体または該抗体の混合物の高濃度安定製剤を提供することが、本発明の目的である。

本発明の製剤は、２〜８℃および２５℃で８ヶ月間保存したときに、目に見える粒子を形成せずに良好な安定性を示す。薬物製品の製造または輸送の間に潜在的に起こる物理的ストレス条件をシミュレーションするために、液体製剤に振盪段階および複数の凍結解凍段階が適用された。

本発明の薬学的製剤は、抗体の凝集および粒子形成を減少させるために界面活性剤としてポロキサマーを含む。本明細書に使用される「ポロキサマー」という用語には、BASF（Parsippany, N.J.）によって商品名PLURONIC（登録商標）F68で販売されている、ポロキサマー１８８として公知のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレントリブロック共重合体が含まれる。本発明の製剤に利用されうる他のポロキサマーには、ポロキサマー４０３（PLURONIC（登録商標）P123として販売）、ポロキサマー４０７（PLURONIC（登録商標）P127として販売）、ポロキサマー４０２（PLURONIC（登録商標）P122として販売）、ポロキサマー１８１（PLURONIC（登録商標）L61として販売）、ポロキサマー４０１（PLURONIC（登録商標）L121として販売）、ポロキサマー１８５（PLURONIC（登録商標）P65として販売）、およびポロキサマー３３８（PLURONIC（登録商標）F108として販売）が含まれる。

本発明は、
− 約５０mg/ml〜２００mg/mlのＡβ抗体、
− 約０．０１％〜０．１％のポロキサマー、好ましくはポロキサマー１８８、
− 約５mM〜５０mMのバッファー、
− 約１００mM〜３００mMの安定化剤
をｐＨ約４．５〜７．０で含む、安定な液体薬学的抗体製剤を提供する。

本発明の特定の一態様では、Ａβ抗体の濃度は、約１００mg/ml〜２００mg/ml、好ましくは約１５０mg/mlである。

本発明の特定の一態様では、ポロキサマーは、濃度約０．０２％〜０．０６％、好ましくは約０．０４％で存在する。

本発明の特定の一態様では、バッファーは、酢酸ナトリウムバッファーまたはヒスチジンバッファー、好ましくはヒスチジン／ヒスチジン-ＨＣｌバッファーである。

本発明の特定の一態様では、バッファーは、濃度約１０〜３０mM、好ましくは約２０mMを有する。

本発明の特定の一態様では、製剤のｐＨは、約５〜６、好ましくは約５．５である。

本発明の特定の一態様では、安定化剤は、糖およびアミノ酸より選択される。

本発明の特定の一態様では、安定化剤は、トレハロースおよびアルギニンより選択される。

本発明の特定の一態様では、安定化剤は、濃度約１００mM〜３００mMを有する。

本発明の特定の一態様では、安定化剤はトレハロース（threhalose）であり、濃度約１５０mM〜２５０mM、好ましくは約２００mMを有する。

本発明の特定の一態様では、安定化剤はアルギニンであり、濃度約１００mM〜１５０mM、好ましくは約１３５mMを有する。

本発明の特定の一態様では、Ａβ抗体は、重鎖および軽鎖を含むモノクローナル抗体である。

本発明の特定の一態様では、Ａβ抗体の重鎖は、
− 配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、
− 配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、
− 配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３配列
を含むＶＨドメインを含む。

本発明の特定の一態様では、Ａβ抗体の軽鎖は、
− 配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、
− 配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、
− 配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３配列
を含むＶＬドメインを含む。

本発明の特定の一態様では、Ａβ抗体のＶＨドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、Ａβ抗体のＶＬドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。

本発明の特定の一態様では、Ａβ抗体の重鎖は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。

本発明の特定の一態様では、Ａβ抗体の軽鎖は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。

本発明の特定の一態様では、モノクローナルＡβ抗体は、モノグリコシル化Ａβ抗体と二重グリコシル化Ａβ抗体との混合物であり、ここで、モノグリコシル化抗体は、一方の抗体結合部位のＶＨドメイン中の配列番号２の位置５２にグリコシル化アスパラギン（Ａｓｎ）を含み、ここで、二重グリコシル化抗体は、両方の抗体結合部位のＶＨドメイン中の配列番号２の位置５２にグリコシル化アスパラギン（Ａｓｎ）を含み、その際、該混合物は、ＶＨドメイン中の配列番号２の位置５２でグリコシル化されていない抗体を５％未満含む。

特定の一態様では、本発明は、Ａβ抗体の皮下投与のための本発明の薬学的製剤の使用を提供する。

「Ａβ抗体」および「Ａβに結合する抗体」という用語は、十分な親和性でＡβペプチドと結合できることにより、診断剤および／または治療剤としてＡβペプチドのターゲティングに有用な抗体を表す。

Ａβがいくつかの天然形態を有することは注目に値し、その際、ヒト形態は上述のＡβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２およびＡβ４３と呼ばれる。最も有名な形態であるＡβ４２は、アミノ酸配列（Ｎ末端から開始）：
ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号１）を有する。Ａβ４１、Ａβ４０、Ａβ３９では、それぞれＣ末端アミノ酸Ａ、ＩＡおよびＶＩＡが欠如している。Ａβ４３形態では、追加的なトレオニン残基が上記配列（配列番号１）のＣ末端に含まれる。

「モノグリコシル化Ａβ抗体」という用語は、個別の抗体分子の一方の（ＶＨ）領域内の配列番号２の位置５２にＮ−グリコシル化を含む抗体分子に関する。図１も参照されたい。「二重グリコシル化Ａβ抗体」という用語は、重鎖」の両方の可変領域上の配列番号２の位置５２でＮ−グリコシル化されている抗体分子を定義するものである（図１）。両方の重鎖（ＶＨ）ドメイン上にＮ−グリコシル化を欠如する抗体分子は、「非グリコシル化抗体」と名付けられる（図１）。モノグリコシル化抗体、二重グリコシル化抗体および非グリコシル化抗体は、同一のアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を含みうる。モノグリコシル化抗体および二重グリコシル化抗体は、本明細書において「グリコシル化抗体アイソフォーム」と呼ばれる。少なくとも１個の抗原結合部位が重鎖（ＶＨ）の可変領域中にグリコシル化を含むことを特徴とする精製抗体分子は、二重グリコシル化抗体および非グリコシル化抗体より選択されるアイソフォームに関して不含または非常に低含量であるモノグリコシル化抗体、すなわち「精製モノグリコシル化抗体」である。本発明に関連する二重グリコシル化抗体は、モノグリコシル化抗体および非グリコシル化抗体より選択されるアイソフォームに関して不含または非常に低含量であり、すなわち「精製二重グリコシル化抗体」である。

「抗体」という用語は、非限定的に全抗体および抗体フラグメントを含めた多様な形態の抗体構造を包含する。本発明による特性が保たれる限り、本発明による抗体は、好ましくはヒト化抗体、キメラ抗体、またはさらに遺伝子組換え抗体である。

「抗体フラグメント」は、全長抗体の一部分、好ましくはその可変ドメイン、または少なくともその抗原結合部位を含む。抗体フラグメントの例には、抗体フラグメントから形成された二重特異性抗体、１本鎖抗体分子、および多重特異性抗体が含まれる。ｓｃＦｖ抗体は、例えばHouston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96）に記載されている。加えて、抗体フラグメントは、Ｖ_Ｈドメインの特徴、すなわちＶ_Ｌドメインと一緒に集合することができるという特徴、またはＡβに結合性のＶ_Ｌドメインの特徴、すなわちＶ_Ｈドメインと一緒に集合して機能的抗原結合部位になることができるという特徴を有することにより、その特性を提供する１本鎖ポリペプチドを含む。

本明細書に使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一アミノ酸組成の抗体分子の調製物を表す。

「キメラ抗体」という用語は、通常はリコンビナントＤＮＡ技法によって調製される、一つの起源または種からの可変領域、すなわち結合領域と、異なる起源または種から得られた定常領域の少なくとも一部分とを含む抗体を表す。マウス可変領域およびヒト定常領域を含むキメラ抗体が好ましい。本発明によって包含される「キメラ抗体」の他の好ましい形態は、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃレセプター（ＦｃＲ）結合に関して本発明による性質を生成するように、定常領域が本来の抗体の定常領域から改変または変更されたキメラ抗体である。そのようなキメラ抗体は、また、「クラススイッチ抗体」と呼ばれる。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントおよび免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む免疫グロブリン遺伝子の発現産物である。キメラ抗体の製造方法は、当技術分野において周知の従来のリコンビナントＤＮＡ技法および遺伝子トランスフェクション技法を伴う。例えばMorrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855；米国特許第５，２０２，２３８号および同第５，２０４，２４４号を参照されたい。

「ヒト化抗体」という用語は、フレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が改変されて、親免疫グロブリンのＣＤＲと異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含む抗体を表す。好ましい一態様では、マウスＣＤＲがヒト抗体のフレームワーク領域と接ぎ合わされて「ヒト化抗体」が調製される。例えばRiechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327；およびNeuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照されたい。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体について上に記載した抗原を認識する配列を表すＣＤＲに対応する。本発明によって包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃレセプター（ＦｃＲ）結合に関して本発明による性質を生成するように、定常領域が本来の抗体の定常領域から追加的に改変または変更されたヒト化抗体である。

本明細書に使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から得られた可変領域および定常領域を有する抗体を含むことが意図される。ヒト抗体は、当技術の現状において周知である（van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374）。ヒト抗体は、また、免疫処置したときに、内因性免疫グロブリンの産生の不在下でヒト抗体の全レパートリーまたは選択物を産生することができるトランスジェニック動物（例えばマウス）から産生されうる。そのような生殖細胞系突然変異マウスにヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを導入すると、抗原誘発時にヒト抗体の産生が生じる（例えばJakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40を参照されたい）。ヒト抗体は、また、ファージディスプレイライブラリー（Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597）から産生されうる。ColeらおよびBoernerらの技法もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用することができる（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；およびBoerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95）。本発明によるキメラ抗体およびヒト化抗体についてすでに言及されたように、本明細書に使用される「ヒト抗体」という用語は、また、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃＲ結合に関して本発明による性質を生成するように、例えば「クラススイッチ」、すなわちＦｃ部分の変更または突然変異（例えばＩｇＧ１からＩｇＧ４への、および／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）によって定常領域が改変されたヒト抗体を含む。

「エピトープ」という用語には、抗体に特異的に結合できる任意のポリペプチド決定基が含まれる。ある態様では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの分子の化学的活性表面基（surface grouping）を含み、ある態様では、特異的三次元構造特徴および／または特異的電荷特徴を有しうる。エピトープは、抗体によって結合される抗原の領域である。

本明細書に使用される「可変ドメイン」（軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）、重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ））は、抗原に抗体を結合させることに直接関与する軽鎖ドメインおよび重鎖ドメインの対のそれぞれを意味する。可変軽鎖および重鎖ドメインは、同じ一般構造を有し、各ドメインは、三つの「超可変領域」（または相補性決定領域、ＣＤＲ）によって連結された、配列が広く保存されている四つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域は、βシートコンフォメーションをとり、ＣＤＲはβシート構造を連結するループを形成しうる。各鎖中のＣＤＲは、フレームワーク領域によってその三次元構造に保持され、もう一方の鎖からのＣＤＲと一緒になって抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明による抗体の結合特異性／親和性に特に重要な役割を果たし、それによって本発明のさらなる目的を提供する。

本明細書に使用するときの「抗体の抗原結合部分」という用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を表す。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」領域は、本明細書において定義されたような超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にかけてドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、最も大きく抗原結合を担う領域であって、抗体の性質を定義する。ＣＤＲおよびＦＲ領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的定義および／または「超可変ループ」からの残基にしたがって決定される。

「安定化剤」という用語は、製造、保存および適用の際に活性薬学的成分および／または製剤を化学的および／または物理的分解から保護する、薬学的に許容されうる賦形剤を意味する。タンパク質医薬品の化学的および物理的分解経路は、Cleland, J. L., M. F. Powell, et al. (1993). "The development of stable protein formulations: a close look at protein aggregation, deamidation, and oxidation." Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 10(4): 307-77、Wang, W. (1999). "Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals." Int J Pharm 185(2): 129-88.、Wang, W. (2000). "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int J Pharm 203(1-2): 1-60.およびChi, E. Y.,. S. Krishnan, et ai. (2003). "Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation." Pharm Res 20(9): 1325-36によって総説されている。安定化剤には、非限定的に本明細書下記に定義されるような糖、アミノ酸、ポリオール、界面活性剤、抗酸化剤、保存料、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、例えばＰＥＧ３０００、３３５０、４０００、６０００、アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、塩類、例えば塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、キレート剤、例えばＥＤＴＡが含まれる。本明細書で上述のように、安定化剤は、約１０〜約５００mMの量、好ましくは約１０〜約３００mMの量、より好ましくは約１００mM〜約３００mMの量で製剤中に存在しうる。

「安定な液体薬学的抗体製剤」は、冷蔵温度（２〜８℃）で少なくとも１２ヶ月間、特に２年間、より特定には３年間顕著な変化が観察されない液体抗体製剤である。安定性の基準は以下にしたがう：サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）によって測定したとき、１０％以下、特に５％以下の抗体モノマーが分解されている。さらに、溶液は、目視分析で無色または透明ないしやや乳白である。製剤のタンパク質濃度は、変化が±１０％以下である。凝集の形成は１０％以下、特に５％以下である。安定性は、ＵＶ分光法、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥ−ＨＰＬＣ）、比濁法および目視検査などの、当技術分野において公知の方法によって測定される。

リコンビナント法およびリコンビナント組成物
抗体は、リコンビナント法およびリコンビナント組成物を使用して、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているように製造することができる。一態様では、本明細書記載の抗［［ＰＲＯ］］抗体をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および／またはＶＨを含むアミノ酸配列をコードしうる（例えば抗体の軽鎖および／または重鎖）。さらなる一態様では、そのような核酸を含む一つまたは複数のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。さらなる一態様では、そのような核酸を含むホスト細胞が提供される。そのような一態様では、ホスト細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクターおよび抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えばそれでトランスフォーメーションされている）。一態様では、ホスト細胞は、真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ系細胞（例えばＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一態様では、抗［［ＰＲＯ］］抗体の製造方法であって、上記に提供されるような抗体をコードする核酸を含むホスト細胞を、抗体の発現に適した条件で培養すること、および場合によりホスト細胞（またはホスト細胞の培養液）から抗体を回収することを含む方法が提供される。

抗Ａβ抗体のリコンビナント産生のために、例えば上記のような抗体をコードする核酸が単離され、ホスト細胞でのさらなるクローニングおよび／または発現のために一つまたは複数のベクターに挿入される。そのような核酸は、従来の手順を使用して（例えば抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離および配列決定することができる。

抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適したホスト細胞には、本明細書記載の原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、特にグリコシル化およびＦｃエフエクター機能が必要ない場合、抗体は細菌から産生されうる。細菌での抗体フラグメントおよびポリペプチドの発現については、例えば米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、および同第５，８４０，５２３号を参照されたい（Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248(E. coliでの抗体フラグメントの発現を記載しているB.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254も参照されたい）。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離することができ、さらに精製することができる。

原核微生物に加えて、グリコシル化経路が「ヒト化」されていて、部分ヒトまたは完全ヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生を生じる真菌株および酵母株を含めた糸状菌または酵母などの真核微生物も、抗体をコードするベクターに適したクローニングホストまたは発現ホストである。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、およびLi et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照されたい。

グリコシル化抗体の発現に適したホスト細胞は、また、多細胞生物（無脊椎生物および脊椎動物）から得られる。無脊椎生物細胞の例には、植物細胞および昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と共に、特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために使用することができる多数のバキュロウイルス株が同定されている。

植物細胞培養物もまた、ホストとして利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、および同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物から抗体を産生するためのPLANTIBODIES（商標）技法を記載している）を参照されたい。

脊椎動物細胞もまた、ホストとして使用することができる。例えば、懸濁液中で成長するように適応された哺乳動物細胞系が有用でありうる。有用な哺乳動物ホスト細胞系の他の例は、ＳＶ４０によってトランスフォーメーションされたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７）；ヒト胎児腎臓系（例えばGraham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載されているような２９３または２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えばMather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されているようなＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸ガン細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されているようなＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物ホスト細胞系には、ＤＨＦＲ⁻ＣＨＯ細胞を含めたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）；ならびにＹ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞系が含まれる。抗体産生に適したある種の哺乳動物ホスト細胞系の総説については、例えばYazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照されたい。

実施例
本発明による皮下投与用液体医薬品製剤を以下のように開発した。

実施例１：液体製剤の調製
以下のＡβ液体製剤を、タンパク質濃度１５０mg/mlで調製した。

国際公開公報第２００７／０６８４２９号に記載されたように調製および入手されたＡβ抗体は、ｐＨ約５．５にて１０mMヒスチジンバッファー中に濃度約５０〜６０mg/mLで提供した。実施例に使用されたＡβ抗体は、本出願の配列リスト（配列番号２〜１１）に明記されたＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、重鎖および軽鎖を含む。

液体製剤の調製のために、予測されるバッファー組成を含有するダイアフィルトレーションバッファーに対してＡβをバッファー交換し、限外濾過によって抗体濃度約２００mg/mLに濃縮した。限外濾過の作業を完了後、賦形剤（例えばトレハロース）を原液として抗体溶液に添加した。次に、界面活性剤を５０〜１２５倍原液として添加した。最後に、タンパク質濃度をバッファーでＡβ終濃度約１５０mg/mLに調整した。

０．２２μm低タンパク質結合フィルターを通過させて全ての製剤を無菌濾過し、ＥＴＦＥ（エチレン−テトラフルオロエチレン共重合体）でコーティングされたゴム栓およびアルミ（alucrimp）キャップで密封された滅菌６mLガラスバイアルに無菌充填した。充填体積は約２．４mLであった。これらの製剤を異なる気候条件（５℃、２５℃および４０℃）で異なる時間保存し、振盪（５℃および２５℃において振盪回数２００回／分で１週間）および凍結解凍ストレス法（−８０℃／＋５℃で５サイクル）によってストレスを与えた。ストレス検査を適用前後、および保存後に以下の分析法：
− ＵＶ分光法
− サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
− イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）
− 溶液の透明性および乳光
− 目視検査
によって試料を分析した。

タンパク質含量の決定のために使用されたＵＶ分光法は、Perkin Elmer λ35UV分光計を用いて波長範囲２４０nm〜４００nmで行った。ニートなタンパク質試料を対応する製剤バッファーで約０．５mg/mLに希釈した。タンパク質濃度を式１により計算した。

２８０nmでのＵＶ光吸収を３２０nmでの光散乱について補正し、希釈倍率を乗じた。希釈倍率は、ニートな試料および希釈バッファーの秤量質量および密度から決定した。キュベットの光路長ｄと吸光係数εの積で分子を除算した。

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して製剤中の可溶性高分子量種（凝集物）および低分子量加水分解産物（ＬＭＷ）を検出した。この方法は、Waters W2487二重吸光検出器を有しTosoHaas TSK-Gel G3000SWXLカラムを備えるWaters Alliance 2695 ＨＰＬＣ装置で行った。無傷のモノマー、凝集物および加水分解産物は、移動相として０．２ＭＫ２ＨＰＯ４／０．２５ＭＫＣＬ（ｐＨ７．０）を使用して均一濃度溶離プロファイルによって分離し、波長２８０nmで検出した。

製剤中のＡβの実効電荷を変化させる化学分解産物を検出するためにイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）を行った。この方法は、Waters W2487二重吸光検出器（検出波長２８０nm）およびMono S TM 5/50GLカラム（Amersham Biosciences）を有するWaters Alliance 2695 ＨＰＬＣ装置を使用した。５０mMマロン酸／マロン酸塩（ｐＨ５．３）および移動相Ａ（ｐＨ５．３）中の１Ｍ酢酸Ｎａを、それぞれ移動相ＡおよびＢとして流速１．０mL/分で使用した。

勾配プログラム：

透明度および乳光度は、ネフェロメトリー法によりホルマジン濁度単位（ＦＴＵ）として測定した。ニートな試料を直径１１mmの透明ガラスチューブ内に移し、HACH 2100AN比濁計に入れた。

試料は、Seidenader V90-T目視検査装置を使用することによって、目に見える粒子の存在について検査した。

上に示した安定性データは、ポリソルベート２０含有製剤およびポリソルベート８０含有製剤の全てが５℃、２５℃または４０℃で８ヶ月保存後に目に見える粒子を発生していることを示している。他方、ポロキサマー含有製剤は、５℃、２５℃および４０℃で８ヶ月保存後に目に見える粒子がほとんどない。したがって、ポロキサマーはＡβ抗体製剤中の目に見える粒子の形成を防止することができる。

本出願に開示されたアミノ酸配列

Claims

− ５０mg/ml〜１５０mg/mlのＡβ抗体、
− ０．０４％のポロキサマー１８８、
− ２０ｍＭの酢酸ナトリウム又はヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ、
− ２００ｍＭのトレハロース又は１３５ｍＭのアルギニン
をｐＨ５．５で含み、
Ａβ抗体は、それぞれ配列番号１０及び１１の重鎖および軽鎖を含むモノクローナル抗体であり、
該モノクローナルＡβ抗体は、モノグリコシル化Ａβ抗体と二重グリコシル化Ａβ抗体との混合物であり、ここで、モノグリコシル化抗体が、一方の抗体結合部位のＶＨドメイン中の配列番号２の位置５２にグリコシル化アスパラギン（Ａｓｎ）を含み、ここで、二重グリコシル化抗体が、両方の抗体結合部位のＶＨドメイン中の配列番号２の位置５２にグリコシル化アスパラギン（Ａｓｎ）を含み、その際、該混合物が、ＶＨドメイン中の配列番号２の位置５２でグリコシル化されていない抗体を５％未満含む、
安定な液体薬学的抗体製剤。