JP5795341B2 - 参照ブロック配列によるｆｕｌｌＣＯＬＤ−ＰＣＲ濃縮 - Google Patents

Description

本発明は、核酸サンプル中の有病率の低い標的配列（例えば、変異）の増幅と濃縮に対する改善に関する。とりわけ、本発明は、ｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ（低変性温度でのＣＯ増幅）の間の、参照ブロック配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の使用に関する。

遺伝子分析で一般に遭遇する状況は、過剰な非変異体配列（「参照配列」）の存在下で、低い割合の変異体ＤＮＡ配列（「標的配列」）を特定する必要性を伴う。そのような状況の例は次のものを含む。（ａ）過剰な正常対立遺伝子の存在下で、少数の突然変異対立遺伝子を特定して配列を決定すること；（ｂ）エピジェネティック解析で、過剰なメチル化していない対立遺伝子（またはその逆）の存在下で、少数のメチル化した対立遺伝子を特定すること；（ｃ）ミトコンドリアＤＮＡ中の低レベルのヘテロプラスミーの検出；（ｄ）ウィルス感染症での薬剤耐性の疑似種の検出と、（ｅ）過剰な野生型対立遺伝子の存在下で、癌患者（ここで、人々は、癌の処置の成果を追跡するため、または、再発を検知するために、癌を有している疑いをかけられる）の血液中の腫瘍循環ＤＮＡの特定。

本出願の発明者は、サンプルＰＣＲ反応混合物中の低含量対立遺伝子の濃度を濃縮するためのＣＯＬＤ−ＰＣＲ方法を先に記載した。「Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」と題された、公開されたＰＣＴ出願である特許文献１（現在では特許文献２（Ｇｅｒａｓｓｉｍｏｓ Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓによる。本発明の譲受人に譲渡された））を参照のこと。記載されたＣＯＬＤ−ＰＣＲ濃縮方法は、臨界（ｃｒｉｔｉｃａｌ）変成温度「Ｔ_ｃ」で、反応混合物をインキュベートする修飾された核酸増幅プロトコルに基づく。従来の特許出願は、ＣＯＬＤ−ＰＣＲの２つのフォーマット、すなわち、ｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲとｆａｓｔ ＣＯＬＤ−ＰＣＲについて記載している。

ｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲでは、反応混合物は、従来のＰＣＲに類似した参照（例えば、野生型）および標的（例えば、変異体）の配列のために、融解温度をゆうに上回って選択される第１の変性温度（例えば、９４°Ｃ）にさらされる。その後、その混合物はゆっくり冷却され、ハイブリダイゼーションによって参照−標的ヘテロ二本鎖の形成を促進する。８分間にわたって９４°Ｃから７０°Ｃまで、制御された方法で温度を確実に低下させることは、適切なハイブリダイゼーションを保証するのに典型的なことである。あるいは、温度を急速に７０°Ｃに低下させ、この温度を８分間保つことで適切なハイブリダイゼーションを保証する。いったん冷やされると、反応混合物は、参照−標的ヘテロ二本鎖だけでなく、参照−参照ホモニ本鎖（ｈｏｍｏｄｕｐｌｅｘｅｓ）も（より少ない程度に、標的−標的ホモニ本鎖）含有している。標的配列と参照配列がクロスハイブリダイズする際、短い（例えば、＜２００ｂｐ）二本鎖ＤＮＡ配列に沿ったどの場所でも、１以上の単一ヌクレオチドのミスマッチまたは、挿入、または、欠失のわずかな配列の差は、その配列の融解温度（Ｔ_ｍ）のわずかながら予測可能な変化をもたらす（非特許文献１および非特許文献２）。ミスマッチの正確な配列構成と位置に依存しているため、０．１−２０°Ｃの融解温度の変化を熟慮する。上で参照した特許出願に述べられているように、ｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲは、ニ本鎖参照配列とハイブリダイズされた参照−標的ヘテロ二本鎖との間の融解温度の差を前提としている。参照−標的ヘテロ二本鎖を形成するために冷却した後、反応混合物を臨界変性温度（Ｔ_ｃ）でインキュベートする。該温度は、ニ本鎖参照配列の融解温度未満で、かつ、参照−標的ヘテロ二本鎖の低融解温度よりも高くなるように選択され、その結果として、参照−参照ホモニ本鎖よりもクロスハイブリダイズされた標的−参照ヘテロ二本鎖を優先的にインキュベーションする。

臨界変性温度（Ｔ_ｃ）は、それ以下で、参照核酸配列について、ＰＣＲ効率が不意に落ちる（それでも参照−標的ヘテロ二本鎖の変性を促進するのに十分な）温度である。例えば、ＰＣＲ変性温度が８７°Ｃに設定されると１６７ ｂｐ ｐ５３配列はよく増幅し、ＰＣＲ変性が８６°Ｃに設定されると、８６．５°Ｃで適度に増幅し、検知可能な生成物を生み出さない。したがってこの例では、Ｔ_ｃ〜８６．５°Ｃである。臨界変性温度（Ｔ_ｃ）の中間インキュベーション後、プライマーは、変性した標的と変性したヘテロ二本鎖からの参照鎖とにアニールされ、ポリメラーゼによって伸長され、参照配列に対する標的配列の濃度を濃縮する。ｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲの利点の１つは、同じプライマー対が標的と参照の配列の両方に使用されるということである。

Ｆａｓｔ ＣＯＬＤ−ＰＣＲは、上記で引用された特許出願に記載されるように、ニ本鎖参照配列（例えば、野生型配列）とニ本鎖標的配列（例えば、変異体配列）の間の融解温度の差があることを前提としている。とりわけ、標的配列の融解温度は参照配列より低くなければならない。ｆａｓｔ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ中の臨界変性温度（Ｔ_ｃ）は、それ以下で、ニ本鎖参照核酸配列についてＰＣＲ効率が不意に落ちる温度であるが、それでもニ本鎖標的配列の変性を促進するのに十分である。ｆａｓｔ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ濃縮サイクル中に、反応混合物は、ｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲサイクルの第１工程でのように、参照配列の融解温度以上の温度（例えば、９４°Ｃ）では変性にさらされない。むしろ、反応混合物は、臨界変性温度（例えばＴ_ｃ＝８３．５°Ｃ）でインキュベートされ、該温度は、（ａ）ニ本鎖参照配列の融解温度未満であるとともに、ニ本鎖標的配列の低融解温度よりも高くなるように、または、（ｂ）参照と標的の配列の変性の程度間の差を依然として生み出しながら、参照と標的の配列の両方のＴ_ｍよりも低くなるように、選択される。臨界変性温度（Ｔ_ｃ）でのインキュベーション後、プライマーは変性した標的にアニールされ、ポリメラーゼによって伸長され、こうして、参照配列に対する標的配列の濃度を濃縮する。再度、同じプライマー対は標的と参照配列の両方に使用される。

ｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲによる濃縮は、Ｆａｓｔ ＣＯＬＤ−ＰＣＲによって濃縮と比較して、比較的非能率的で時間もかかることがわかっている。しかしながら、ｆａｓｔ ＣＯＬＤ−ＰＣＲの使用は、ニ本鎖標的配列の融解温度が、ニ本鎖参照配列の融解温度未満である出願に限定されている。例えば、変異体配列の融解温度が野生型の配列の融解温度と同じか高い場合、変異は、ｆａｓｔ ＣＯＬＤ−ＰＣＲにさらされた低含量の変異体配列を備えたサンプルのデータを配列する際には検出できない。したがって、ｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲサイクルの有効性と速度を改善することが望ましい。

ｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲの相対的非効率は、主として、とりわけｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲの初期のサイクル中に形成されるヘテロ二本鎖の不足によるものと信じられている。たとえばハイブリダイゼーション工程の間にゆっくりとした冷却が最適化され（例えば、９４℃から７０℃まで８分間徐々に冷却される）ても、とりわけ初期のサイクル中の非常に低い濃度の標的（例えば、変異体）は、ヘテロ二本鎖を形成する能力を低下させる。ハイブリダイゼーションによる冷却のための時間の増加は望ましいことではなく、どのような場合においても、濃縮を改善するのにとりわけ有効であるとは分かっていない。
ｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲがｆａｓｔ ＣＯＬＤ−ＰＣＲほど比較的効率的ではないという別の理由は、後のｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲのサイクル中の増幅産物はヘテロ二本鎖を形成するよりもホモ二本鎖を再形成する傾向があるということである。

国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００９２４８号 米国第１２／６７１，２９５号

Ｌｉｐｓｋｙ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ， ４７, ６３５−６４４ Ｌｉｅｗ, Ｍ., ｅｔ ａｌ. （２００４） Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ, ５０, １１５６−１１６４

本発明の１つの目的は、ｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲの初期のサイクル中のヘテロ二本鎖形成の効率を改善することである。別の目的はｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲのための全体的なサイクル時間を減少させることである。

本発明はサンプル中の低含量対立遺伝子を濃縮するための方法を対象としており、ｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲの効率を改善し、かつ、サイクル時間を減らすために、反応混合物中の過剰な参照ブロック配列の使用を対象としている。

本発明は、先に引用された特許出願（「Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」と題された特許文献１（現在では特許文献２（Ｇｅｒａｓｓｉｍｏｓ Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓによる。本発明の譲受人に譲渡されている））の図１と２に関して記載されたＣＯＬＤ−ＰＣＲ方法に対する修飾を含んでおり、該文献は引用によって本明細書に組み込まれている。より具体的には、本発明に従って、修飾されたｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲプロトコルにつき、反応混合物を熱サイクル（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）にさらす前に、操作された参照ブロック配列（例えば、一本鎖オリゴヌクレオチド）は、反応混合物に過剰に加えられる。

修飾されたｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ方法は、核酸サンプルを含有する増幅反応混合物の調製を含む。核酸サンプルは、野生型の配列のような参照配列と、１つ以上の変異型配列のような１つ以上の標的配列を含有していると想定される。言及されたように、本発明の目的は、標的配列の濃度を濃縮することであり、したがって、ほとんどの状況では、標的配列が（存在するとして）低含量である場合、該方法が使用される。該方法は約１乃至１０のヌクレオチド配列の変化を含む突然変異対立遺伝子を濃縮するのに適しているが、本発明に従う標的配列は、参照配列に使用されたものと同じ対のプライマーを含むＰＣＲによって増幅可能である。言及されたように、本発明は、超過濃度レベルの反応物混合物に参照ブロック配列の存在を含んでいる。参照ブロック配列は、少なくともそのプライマー部位間の参照配列鎖の１つの少なくとも一部と相補的であるか、または、プライマー部位に部分的に重複する核酸配列である。反応混合物に加えられる参照ブロック配列は、一本鎖であるのが望ましい。（だが、最初の変性工程が変性した一本鎖の参照ブロック配列をもたらすため、二本鎖でもありうる）。

ｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲプロトコルに従って、反応混合物は、参照配列とさらには標的配列の融解温度（Ｔ_ｍ）以上ある第１の変性温度（例えば９５°Ｃ）にさらされ、結果として、参照配列と標的配列の変性鎖をもたらす。反応液は、例えば、７０°Ｃまでハイブリダイゼーションを促進するために冷却される。冷却が配列を過剰な量の参照ブロック配列の存在下で起こるため、参照ブロック配列は、参照配列の相補鎖と、さらに標的配列の相補鎖とハイブリダイズする。例えば、一本鎖参照ブロック配列が工程の開始時に過剰に加えられると仮定すると、工程でのこの時点での反応混合物は、参照ブロック配列と相補的な参照（例えば、野生型）鎖のヘテロ二本鎖、および、参照ブロック配列と標的（例えば変異体）鎖のヘテロ二本鎖を含有している。この時点での反応混合物は、参照と標的の配列の変性マイナス鎖を含有する。修飾されたｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲサイクル中に存在する形成されたヘテロ二本鎖は、上記の参照された特許出願に記載されたｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲプロトコル中で形成された参照−標的ヘテロ二本鎖とは基本的に異なる。過剰な量の参照ブロック配列を加えると、従来のｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲプロトコル（例えば、約８分）中よりも迅速なハイブリダイゼーション（例えば、約３０秒）を促進する。本発明の好ましい実施形態では、冷却ハイブリダイゼーション工程は、継続時間が１分未満である。

その後、反応混合物は、参照ブロック配列からの標的鎖の優先的な変性を可能にするの
に十分な臨界温度（例えば、Ｔｃ＝８４．５°Ｃ）にさらされる。臨界温度（Ｔｃ）は、
反応混合物がＴｃインキュベートされる場合、参照ブロック鎖と相補参照鎖の二本鎖が
ほとんど変性されないままであるが、参照ブロック鎖と標的鎖はほとんど変性されるように選択される。「ほとんど」という用語は、所定の変性型または未変性型の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも９０％、または、さらに好ましくは少なくとも９８％を意味する。参照ブロック配列と標的鎖の二本鎖の融解温度は、参照ブロック配列と相補配列鎖の二本鎖の溶解温度よりも常に低い。なぜなら、前者はミスマッチを含むが、後者はミスマッチを含まないためである。

優先的な変性後、反応混合物の温度が下げられることによって、反応混合物中の遊離標的（ｆｒｅｅ ｔａｒｇｅｔ）と参照の鎖にプライマー対をアニール化することが可能となる。再度、一本鎖参照ブロックオリゴヌクレオチドが工程の開始時に過剰に加えられると仮定すると、サイクルのこの時点で、理論上は、最初の変性工程と比較して標的配列の２つの遊離鎖と、わずか１つの遊離参照鎖がある。別の参照鎖は参照ブロック配列でハイブリダイズされ、したがって、増幅には利用不可能である。アニールされたプライマーは伸長され、結果として、標的配列の指数関数的な増幅をもたらす一方で、参照鎖は単に直線的に増幅されるだけである。従って、標的配列は、ＣＯＬＤ−ＰＣＲサイクルのあいだ、サンプル中の参照配列に対して委徐々に濃縮される。

方法は１０乃至３０以上のサイクルが繰り返される傾向がある。該方法は、標的増幅産物の濃縮をかなり増加させて、ｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲのためのサイクル時間を減らすことがわかった。それは、従来のｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲプロトコルではヘテロ二本鎖を形成しなかったホモ接合変異を濃縮することもできる。

参照ブロック配列の長さは、標的または参照配列の長さと等しいか、または、標的または参照の配列の長さよりも短いか、あるいは、長くてもよい。好ましい実施形態では、参照ブロック配列は、プライマーが参照配列にあまり結合しないように、配列の各側で標的と参照の配列よりもいくつかの塩基分小さい。従って、参照ブロック配列は、標的配列を増幅するプライマーによって伸長することができない。この目的のために、随意に、参照ブロック配列の３’ＯＨはＤＮＡポリメラーゼ伸長に対してブロック可能である。同様に、随意に、参照ブロック配列の５’―末端は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち、ハイブリダイズされた参照ブロック配列の分解）による５’から３’のエキソヌクレオリシス（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｓｉｓｉ）が避けられるように、部分的に重複するヌクレオチド配列で設計されてもよい。

言及されるように、参照配列は一本鎖またはニ本鎖である。好ましい実施形態では、参照ブロック配列は一本鎖核酸である。しかしながら、参照ブロック配列は、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックト核酸（ＬＮＡ）、あるいは、別の修飾ヌクレオチドのあいだのキメラのような他の形状をとることができる。キメラ配列上のＰＮＡまたはＬＮＡの位置は、その位置での潜在的なミスマッチの効果を最大限にするように、変異が存在しそうな位置にマッチするために選択可能である。参照ブロック配列は、一本鎖ＰＮＡまたは一本鎖ＤＮＡであってもよい。

本発明の他の実施形態と利点は、図面と以下の詳細な記載を再検討すると当業者に明白なことがある。

「Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」と題された特許文献１（現在では特許文献２）に記載されるように、標的配列を選択的に濃縮するためのｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲの先行技術実施形態を説明しており、この文献は引用によって本明細書に組み込まれる。 増幅反応混合物中の過剰な量の参照ブロック配列の存在によって、ｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲを改善する本発明の原則を説明する。 本発明の１つの実施形態を実施するための６０ｂｐ参照ブロック配列を説明する概略図である。８７ｂｐ 増幅産物は、下線を引いたプライマーを用いて予備的に増幅される。相補的な参照ブロック配列は、各鎖について設計され、３’の非伸長性のリン酸基を含有する。 規則的なＰＣＲ、反応混合物中の参照ブロック配列を使用しないｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、反応混合物中の過剰な参照ブロック配列によるｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、および、ｆａｓｔ ＣＯＬＤ−ＰＣＲをそれぞれ用いて処理されたサンプルからＰＦＳＫ−１突然変異対立遺伝子の濃縮のためのＳａｎｇｅｒ配列決定データ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔｅ）を表示する。 規則的なＰＣＲ、反応混合物中の参照ブロック配列を使用しないｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、反応混合物中の過剰な参照ブロック配列（ＲＳ）（６０ｂｐ）によるｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、および、ｆａｓｔ ＣＯＬＤ−ＰＣＲをそれぞれ用いて処理されたサンプルからＨＣＣ１００８突然変異対立遺伝子の濃縮のためのＳａｎｇｅｒ配列決定データを表示する。 規則的なＰＣＲ、反応混合物中の参照ブロック配列を使用しないｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、反応混合物中の過剰な参照ブロック配列（ＲＳ）によるｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、および、ｆａｓｔ ＣＯＬＤ−ＰＣＲをそれぞれ用いて処理されたサンプルからＨＣＣ２２１８突然変異対立遺伝子の濃縮のためのＳａｎｇｅｒ配列決定データを表示する。 規則的なＰＣＲ、反応混合物中の参照ブロック配列を使用しないｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、反応混合物中の過剰な参照ブロック配列（ＲＳ）によるｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、および、ｆａｓｔ ＣＯＬＤ−ＰＣＲをそれぞれ用いて処理されたサンプルからＴＬ９２突然変異対立遺伝子（１ｂｐ Ｇ ｄｅｌ）の濃縮のためのＳａｎｇｅｒ配列決定データを表示する。 ９０ｂｐ参照ブロック配列（ＲＳ）を使用するｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲを用いて処理されたサンプルからＨＣＣ１００８突然変異対立遺伝子の濃縮のためのＳａｎｇｅｒ配列決定データを表示する。

本明細書で使用されているように、「標的配列を濃縮する」という用語は、標的配列の量を増加させて、サンプル中の対応する参照配列に対する標的配列の割合を増やすことを言う。例えば、サンプル中で標的配列と参照配列の割合は当初５％対９５％である場合、標的配列は３０％の参照配列に対して７０％の標的配列の割合をもたらすように、増幅反応で、優先的に増幅されてもよい。したがって、参照配列に対する標的配列の１４倍の濃縮がある。

本明細書に使用されるように、用語「標的配列」は、対応する参照配列ほど核酸サンプル中では見られない核酸を指す。標的配列は、サンプルにおいて、参照配列＋標的配列の総量の５０％未満を構成する。標的配列は突然変異対立遺伝子であってもよい。例えば、サンプル（例えば、血液サンプル）は多数の正常細胞とわずかな癌細胞を含有してもよい。正常細胞は突然変異でないまたは野生型の対立遺伝子を含有するが、少数の癌細胞は体細胞突然変異を含有している。この場合、変異体は標的配列であり、その一方で野生型の配列が参照配列である。

本明細書で使用されているように、「標的鎖」は、標的配列の一つの核酸鎖（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｔｒａｎｄ））を指す。

標的配列は対応する参照配列に少なくとも５０％相同でなければならないが、参照配列からの少なくとも１つのヌクレオチドで異ならなければならない。標的配列は、参照配列に使用されたものと同じ対のプライマーによるＰＣＲを介して増幅可能である。

本明細書で使用されているように、用語「参照配列」は、対応する標的配列よりも核酸サンプル中で見られる核酸を指す。参照配列は、サンプル中の全参照配列＋標的配列の５０％以上を構成する。好ましくは、参照配列は、標的配列よりも、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡレベル１０Ｘ、１５Ｘ、２０Ｘ、２５Ｘ、３０Ｘ、３５Ｘ、４０Ｘ、４５Ｘ、５０Ｘ、６０Ｘ、７０Ｘ、８０Ｘ、９０Ｘ １００Ｘ、１５０Ｘ、２００Ｘ以上で発現される。本明細書で使用されているように、「参照鎖」は、参照配列の一つの核酸鎖を指す。

本明細書で使用されているように、用語「野生型」は、母集団中の特定の遺伝子について最も一般的なポリヌクレオチド配列または対立遺伝子を指す。一般に、野生型対立遺伝子は正常細胞から得られる。

本明細書で使用されているように、用語「変異体」は、核酸配列中のヌクレオチド変化（すなわち、単一または複数ヌクレオチドの置換、欠失または挿入）を指す。変異を有する（ｂｅａｒ）核酸は、対応する野生型ポリヌクレオチド配列とは配列において異なる核酸配列（突然変異対立遺伝子）を有している。本発明は、体細胞突然変異と多型性に広く関連している。本発明の方法は、多くの配列変化でも有用であるが、約１乃至１０のヌクレオチド配列変化を含有する突然変異対立遺伝子を選択的に濃縮する際に特に役立つ。突然変異対立遺伝子は、病変組織または細胞から典型的に得られ、疾患状態に関連している。

本明細書に使用されるように、用語「融解温度」または「Ｔ_ｍ」は、ポリヌクレオチドがその相補的配列から解離する温度を指す。一般的に、Ｔ_ｍは、二本鎖核酸分子中のワトソン・クリック塩基対の半分が破壊または解離し（すなわち、「溶解している」）、その一方で、ワトソン・クリック塩基対のもう半分が二本鎖立体構造中で変化しない温度として定義されてもよい。言いかえれば、Ｔ_ｍは、２つの相補配列のヌクレオチドの５０％がアニールされ（二本鎖）、ヌクレオチドの５０％が変性される（一本鎖）温度として定義される。したがって、Ｔ_ｍは、二本鎖から一本鎖の核酸分子への移行時（または、逆に、一本鎖から二本鎖の核酸分子への移行時）の中間点を定義する。

Ｔ_ｍは、多くの方法、例えば、Ｗｅｔｍｕｒ １９９１（Ｗｅｔｍｕｒ， Ｊ． Ｇ． １９９１． ＤＮＡ ｐｒｏｂｅｓ： ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ． Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６： ２２７−２５９， のように最隣接計算（ａ ｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ）、および、インターネットで利用可能なＯｌｉｇｏ（商標）プライマー設計と計画を含むコマーシャル番組によって、推定することが可能である。あるいは、Ｔ_ｍは実際の実験を介して測定可能である。例えば、二本鎖ＤＮＡ結合、または、臭化エチジウムまたはＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ（分子プローブ）のような挿入色素は、核酸の実際なＴ_ｍを測定するために、融解曲線アッセイで使用されることができる。核酸のＴ_ｍを測定するための追加の方法は、当該技術では周知である。
これらの方法のいくつかは、発明者の先行特許「Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」と題された特許文献１（現在では特許文献２）に列挙されており、この文献は引用によって本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用されているように、「参照ブロック配列」は、オリゴヌクレオチドなどの操作された一本鎖またはニ本鎖の核酸配列であり、好ましくは標的配列よりも短い長さを有する。好ましい実施形態では、参照ブロック配列は、プライマーが参照配列にあまり結合しないように、配列の各側で、参照配列よりもいくつかの塩基分小さい。随意に、参照ブロック配列の３’ＯＨ末端は、ＤＮＡポリメラーゼ伸長に対してブロックされ、５−末端はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼによる５’から３’のエキソヌクレオリシスを避けるために修飾される。参照ブロック配列は、反応混合物が一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックト核酸（ＬＮＡ）、あるいは、別の修飾されたヌクレオチドの間のキメラのような臨界温度「Ｔ_ｃ」にさらされる際に、参照配列にアニール化されたままの他の形状をとることもできる。

本発明に関して使用されるように、用語「臨界温度」または「Ｔ_ｃ」は、標的鎖と参照ブロック配列のニ本鎖を優先的に変性するために選択された温度を指す。反応混合物がＴ_ｃでインキュベートされる際に、参照ブロック鎖と相補的な参照鎖からなるニ本鎖はほとんど変性しないままであるが、参照ブロック鎖と標的鎖からなるニ本鎖がほとんど変性されるように、臨界温度（Ｔ_ｃ）は選択される。「ほとんど」という用語は、所定の変性型または未変性型の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも９０％、または、さらに好ましくは少なくとも９８％を意味する。以下に提供される例において、中間のインキュベーション工程に選択された臨界温度「Ｔ_ｃ」は、８４．５°Ｃであるが、第１の変性温度は９５°Ｃである。

本明細書で使用されているように、「プライマー対」は、ＰＣＲ反応の間に増幅生成物を形成するように標的と参照の配列の反対側の鎖とアニール化される２つのプライマーを指す。標的および参照配列は、プライマー結合を促進するために少なくとも２５の塩基でなければならない。プライマー対は反応のＴ_ｃ未満のＴ_ｍを有するように設計されている。

本明細書で使用されているように、「相同性」は、２つのポリマー分子、例えば、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド間のサブユニット配列の類似を指す。パーセント配列同一性と配列類似性を測定するのにふさわしいアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらはＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２ （１９９７） とＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０ （１９９０）にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行なうためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公に利用可能である。

（核酸増幅）
一般的に、１つの実施形態では、本発明の方法で用いられる核酸サンプルは、標的と参照配列を有するゲノムＤＮＡを含む。別の実施形態では、本発明の方法の核酸サンプルは、先に核酸増幅反応で増幅させた標的と参照の配列を含む。当業者は、核酸を増幅するのに利用可能な多くの方法があることを認識するであろう。恐らく、最も一般的な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；例えば、米国特許第４，６８３，１９５号と第４，６８３，２０２号だけでなく、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０−１３５４ （１９８５） ａｎｄ Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ８５：７６５２−７６５６ （１９８５）を参照）である。ＰＣＲ方法の好ましい変更形態は、非対称ＰＣＲ（例えば、Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７（４）：６７４−６７８ （１９９９）； Ｌｅｈｂｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９（８−９）：１３８１−１３８４ （１９９８）； Ｌａｚａｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ６（５）：３５７−３５９ （１９９２）； および、米国特許第６，１９７，４９９号を参照）。他の増幅方法は、限定されないが、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０（７）：１６９１−１６９６ （１９９２）と同様に、米国特許第５，７４４，３１１号、５，６４８，２１１号、および、５，６３１，１４７号を参照）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（ＰＣＴ公報ＷＯ９７／１９１９３を参照）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）（Ｃｏｍｐｔｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３５０：９１−９２ （１９９１）と同様に、米国特許第５，４０９，８１８号と第５，５５４，５２７号を参照）、転写増幅法（ＴＭＡ）（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ８６：１１７３−１１７７ （１９８９）と同様に、米国特許第５，３９９，４９１号を参照）、自家持続配列複製法（３ＳＲ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ８７：１８７４−１８７９ （１９９０）を参照）、および、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＡ）（米国特許第５，４２７，９３０号と５，７９２，６０７号を参照）を含む。

その最も単純な形状では、ＰＣＲは、標的ＤＮＡ中で反対側の鎖にハイブリダイズして関心領域に隣接する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、特異的ＤＮＡ配列の酵素合成のためのインビトロな方法である。鋳型変性、プライマーアニーリング、および、ＤＮＡポリメラーゼによってアニールされたプライマーの伸長に関与する一連の反復的な反応工程は、その終端がプライマーの５’末端によって定義される、特定のフラグメントの指数関数的な蓄積をもたらす。ＰＣＲはゲノムＤＮＡ中の他の配列に対する１０９の因子によって特異的ＤＮＡ配列の選択的な濃縮をもたらすことができると報告されている。ＰＣＲ方法はＳａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０にも記載されている。

ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ（標的と参照の配列）（少なくとも１ｆｇ；さらに好ましくは１−１０００ｎｇ）と少なくとも２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマー用いて行われる。典型的な反応混合物は以下のものを含んでいる：２μｌのＤＮＡ、２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマー、２．５μｌの適切な緩衝液、０．４μｌの１．２５μＭ ｄＮＴＰ、２．５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、および、脱イオン水で総容積２５μｌ。ＰＣＲはプログラム可能なサーマルサイクラーを用いて行なわれる。

ＰＣＲサイクルの各工程の長さと温度は、サイクルの数と同じように、ストリンジェンシー条件にしたがって有効に調節される。アニール温度とタイミングは、プライマーが鋳型とアニール化される効率と、許容されるミスマッチの程度の両方によって決定される。プライマーアニーリング条件のストリンジェンシーを最適化する能力は、十分、当業者の知識の範囲内である。３０°Ｃと７２°Ｃの間のアニール温度が使用される。鋳型分子の最初の変性は、４分間、９２°Ｃ乃至９９°Ｃの間で通常生じ、その後、変性（１５秒乃至１分間、９４°Ｃ乃至９９°Ｃ）、アニーリング（上に議論されるように測定された温度；１−２分）、および、伸長（１分間７２°Ｃ）からなる２０−４０のサイクルが続く。最終の伸長工程は７２°Ｃで４分間行なわれるのが一般的であり、その後、４°Ｃで限定されていない（０−２４時間）工程が行われてもよい。

ＰＣＲは、ヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する核酸ポリメラーゼまたは酵素を利用する。一般に、酵素は、標的配列にアニールされたプライマーの３’−末端で合成を始め、鋳型に沿って５’−方向に続ける。既存のＤＮＡポリメラーゼは、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアティクス（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、および、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼを含んでいる。用語「核酸ポリメラーゼ」はＲＮＡポリメラーゼを含有する。核酸鋳型がＲＮＡである場合、「核酸ポリメラーゼ」は逆転写酵素のようなＲＮＡ依存性の重合活性を指す。

本発明の濃縮手順は、サーモサイクラーのようなＰＣＲ装置で行われるか、または、より好ましくはリアルタイムＰＣＲ装置でリアルタイム反応条件下で行なわれる。リアルタイム反応条件は、さらに、生成時にＰＣＲ生成物を測定／検知するために、核酸検出剤（例えば、色素またはプローブ）を用いる。

（サンプル）
本明細書で使用されているように、「サンプル」は、対象の核酸（標的および参照の配列）を含有しているかまたは含有すると推定される任意の物質、あるいは、対象の核酸を含有しているかまたは含有すると推定される核酸そのものを指す。用語「サンプル」は、このように核酸（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）、細胞、生物、組織、液体、または、物質のサンプルを含み、限定されないが、例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、便、皮膚の外分泌液、気道、腸管、および、泌尿生殖器、唾液、血球、腫瘍、器官、組織、インビトロの細胞培養成分のサンプル、自然分離株（飲料水、海水、固形物質など）、微生物標本（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ）、および、核酸トレーサー分子で「マーキングされた」物体または標本を含む。

本発明の核酸配列はゲノムＤＮＡから増幅することができる。ゲノムＤＮＡは、以下の方法に応じて組織または細胞から分離することができる。あるいは、本発明の核酸配列は、当該技術で周知の方法によって血液から分離することができる。

特定の組織から遺伝子の変異形態の検出を促進するために、組織は分離される。哺乳動物組織からゲノムＤＮＡを分離するために、組織は液体窒素中で細分化されて凍結させる。凍結させた組織は、あらかじめ冷やしておいた乳鉢と乳棒で細かい粉末に砕かれ、消化緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ）中で、組織１００ｍｇごとに１．２ｍｌの消化緩衝液で、懸濁される。哺乳動物の組織培養細胞からゲノムＤＮＡを分離するために、細胞は５００ｘｇで５分間、遠心分離によってペレット状にされ（ｐｅｌｌｅｔｅｄ）、１−１０ｍｌの氷のように冷たいＰＢＳ中で再懸濁され、５００ｘｇで５分間再度ペレット状にされ、１容量の緩衝液中で再懸濁される。

消化緩衝液中のサンプルは、５０℃で１２−１８時間（振りながら）インキュベートされ、その後、等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用いて抽出される。相が遠心分離工程（１７００ｘｇ、１０分間）後に分解しない場合、別の容量の消化緩衝液（プロテイナーゼＫを含まない）が加えられ、遠心分離工程が繰り返される。厚い白い物質が二相の界面に明瞭に存在する場合、有機抽出工程が繰り返される。抽出後、上の水層は新しい管に移され、該管には、１／２の容量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムと２容量の１００％エタノールが加えられる。核酸は、１７００ｘｇで２分間のペレット状にされ、７０％エタノールで洗浄され、空気乾燥され、１ｍｇ／ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で再懸濁される。残りのＲＮＡは０．１％ＳＤＳと１μｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼを含まないリボヌクレアーゼの存在下で、３７℃で１時間サンプルをインキュベートすることによって、および、抽出とエタノール沈殿工程を繰り返すことによって、取り除かれる。本方法によるゲノムＤＮＡの収量は、およそ２ｍｇＤＮＡ／１ｇ細胞または組織であると推定される（Ａｕｓｕｂｅｌら。上記参照）。この方法によって分離されたゲノムＤＮＡは、本発明にしたがって使用することができる。

標的ＤＮＡも全血から抽出されてもよい。例えば、血液は、血清を調製するための抗凝血剤を伴わないか、または、ＥＤＴＡ、クエン酸ナトリウム、ヘパリン、あるいは、同様の抗凝血剤、最も好ましくは血漿の調製のためのＥＤＴＡを伴う、好ましくはシリコーン化されたガラスを含む採取チューブへと、標準的な方法によって採取されてもよい。好ましい方法は、必ずしも必要とされるとは限らないが、血漿または血清が全血から分画されるものである。血漿または血清は、遠心分離によって、好ましくは５−１０分間、３００〜８００ｘｇの穏やかな遠心分離によって全血から分画されるか、または、他の標準分析法によって分画されてもよい。ヘパリンがＰＣＲの邪魔になることがあるため、ヘパリン処置した血液の使用はヘパリナーゼによる事前処理を必要とすることがある。したがって、ＥＤＴＡは血液標本の好ましい抗凝血剤である。採取したばかりの血漿または血清、あるいは、凍結させて（保存して）その後解凍した血漿または血清のいずれかは、本発明の方法で使用することができる。保存された血漿または血清は、−２０°Ｃ乃至−７０°Ｃで維持されなければならず、採取したばかりの血漿または血清は、使用するまで冷却されたままか氷の上で維持される。その後、ＤＮＡは当該技術で周知の方法によって抽出されてもよい。

本発明の方法はメチル化が標的配列で生じたかどうかを検知するために使用することができる。メチル化検出法は、ＤＮＡのメチル化感受性処置のための化学的または酵素的な手法を含む。化学処理は、亜硫酸水素ナトリウムによるＤＮＡのインキュベーションを含み、それはメチル化されていないシトシンを選択的にウラシルへと変換する。ＤＮＡはまず熱変性され、次に、５Ｍの亜硫酸水素塩（ｐＨ５−７）で処理される。あらかじめ存在するウラシルを取り除くゲノムＤＮＡの事前処理は、亜硫酸水素塩による処置の前に使用される。この事前処理は、５ｍＭヒドロキシルアミン（ｐＨ７）の存在下でのウラシル・グリコシラーゼ処置からなる。

標的配列のメチル化されたシトシンはウラシルに変換されるので、（参照ブロック配列の存在下において）ｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲのハイブリダイゼーション冷却工程で参照ブロック配列を用いて二重になる際に、該シトシンはここでミスマッチを形成することになる。

（参照ブロック配列の不在下でのｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ（先行技術））
図１は、先に組み込まれた、「Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」と称された特許文献２で説明されるように、標的と参照の配列を含有している核酸サンプル中の標的配列を濃縮するための、ｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲとして知られている先行技術手順を示す。図１は、上記の組み込まれた特許出願で図１の再生である。

標的と参照の配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ、哺乳動物ＤＮＡ、胎児ＤＮＡ、または、細菌ＤＮＡを含む様々なソースから得ることができる。参照配列は一般に野生型対立遺伝子で、標的配列が突然変異対立遺伝子であるが、逆もまた真実であってもよい。突然変異対立遺伝子は１つ以上のどんなヌクレオチドの欠失、挿入または変質を含んでもよい。幾つかの実施形態では、突然変異対立遺伝子は体細胞突然変異である。他の実施形態では、標的配列はメチル化されたＤＮＡであり、その一方で、参照配列はメチル化されていないＤＮＡである。

方法は、参照配列の融解温度「Ｔ_ｍ」以上の第１の変性温度（図１Ａ、工程１）に増幅反応混合物をさらす工程を含んでいる。核酸のＴ_ｍは実験を通じて測定され、計算によって評価されてもよい。当業者は、本明細書に記載の核酸のＴ_ｍを測定するための多数の周知な方法をよく知っている。ＰＣＲ反応の変性温度を通常選択されるように、第１の変性温度は一般に選択され、標的と参照の配列を十分に変性するのを可能にするほどに十分高いものでなければならない（例えば９４°Ｃ）。１つの実施形態では、第１の変性温度は参照配列のＴ_ｍ以上の約１°Ｃ乃至３０°Ｃで、より好ましくは、参照配列のＴ_ｍは、参照配列のＴ_ｍ以上の約５°Ｃ乃至２０°Ｃである。

次に、増幅反応混合物の温度は、標的配列と参照配列がハイブリダイズするのを可能にするほど低い（図１Ａ、工程２）。このアニーリング工程は、標的―標的、参照―参照、および、標的―参照の配列の二本鎖の形成をもたらすが、標的―参照の二本鎖を形成するために最適化されなければならない。この方法で使用されるＰＣＲプライマーは、該プライマーがこの中間温度で標的と参照の配列に結合するのを妨げる融解温度を有するように設計される。上に言及されるように、標的―参照ハイブリダイゼーションと冷却に係る比較的長い時間の要件は、少なくともいくつかの適用でｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲの有効性を制限することがわかっている（図１Ａ、工程２）

その後、標的参照ハイブリダイゼーションのニ本鎖は、反応混合物の温度をＴ_ｃに増加させることによって優先的に変性される（図１Ａ、工程３）。図１のＴ_ｃまたは臨界温度は、参照配列のＴ_ｍ未満であるが、標的−参照のニ本鎖のＴ_ｍ以上になるように選択される。先に言及されたように、標的配列と参照配列がクロスハイブリダイズすると、二本鎖ＤＮＡ配列に沿ったどの場所でも、１以上の単一ヌクレオチドのミスマッチのわずかな配列の差が、その配列の融解温度（Ｔ_ｍ）の小さいが予測可能な変化を生じさせる（非特許文献１；非特許文献２）。ミスマッチの正確な配列の構成と位置に依存しているため、０．１−２０°Ｃの範囲での融解温度の変化が起こり得る。Ｔ_ｃは、約１秒から５分間適用されるのか一般的であり（図１Ａ、工程３）、好ましくは５秒から３０秒適用される。必要に応じて、多くのサイクルについて、工程３と２の間で振動させることができる。

標的−参照ハイブリダイゼーションのニ本鎖を優先的に変性させた後、反応混合物の温度は、１つ以上のプライマーが標的配列とアニールすることを可能にするように、下げられる（図１Ａ、工程４）。アニールされたプライマーは、核酸ポリメラーゼによって伸長され（図１Ａ、工程５）、それにより、サンプルに含有される核酸の母集団中の標的配列を濃縮する。

この方法の工程は、標的と参照の配列の十分な増幅を得るために、多数のサイクルで繰り返されるのが一般的である。１つの実施形態では、方法の工程は、５乃至４０のサイクルが繰り返され、より好ましくは、１０−３０のサイクルが繰り返される。サイクルの最適な数は、当業者によって決定されることができる。好ましくは、本方法は、ＰＣＲ装置で、より好ましくはＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲリアルタイムＰＣＲ装置（カリフォルニア州サニーベールのＣｅｐｈｅｉｄ）やＭｘ３００５ＰリアルタイムＰＣＲ装置（カリフォルニア州ラホーヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）のようなリアルタイム検出ＰＣＲ装置で行われる。この実施形態では、反応混合物は、反応の増幅産物を定量化するか、および／または、モニタリングするために、核酸検出剤（例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ色素またはＬＣ−Ｇｒｅｅｎ色素のような核酸検色素、あるいは、蛍光染料に適切につながれたプローブ）を含んでもよい。ひとたび標的配列の濃縮が完全であれば、サンプルはさらに処理されてもよく、例えば、配列決定反応にさらされてもよい。濃縮した対立遺伝子は、以下のものを含む様々な手順によってさらに処理されてもよい：ＭＡＬＤＩ―ＴＯＦ、ＨＲ−融解、ジデオキシ配列決定方法、単一の分子配列決定、第二世代ハイスループット配列決定（ｓｅｃｏｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ），ピローシケンス，ＲＦＬP，デジタルＰＣＲ、および、定量的ＰＣＲ（図１Ｂを参照）。診断アッセイと同様にこれらの処理技術のさらに具体的な記載は、「Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」と題された上記の特許文献２に含まれており、該文献は参照によって本明細書に組み込まれる。

（反応混合物中の過剰な参照ブロック配列によるｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲサイクル）図２は、本発明の修飾されたｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ方法に従って標的配列の濃縮を説明する。初めに（図２、工程１）、核酸サンプルは、二本鎖の参照配列（１０）（例えば、野生型の配列）を含有しており、二本鎖の標的配列（１２）（例えば変異体配列）を含有している。増幅反応混合物は、サンプル、他のＰＣＲ成分、および、本発明に従って、２５ｎＭのような過剰な濃度レベルの参照ブロック配列（１４）を含有している。図２では、描かれた参照ブロック配列（１４）は、そのプライマー部位間の参照配列（１０）の鎖（１０Ａ）の一つと相補的な一本鎖核酸配列である。

図２の工程１の反応混合物は、３０秒間、例えば９５℃の第１の変性温度にさらされ、その結果、参照配列（１０Ａ）、（１０Ｂ）と、標的配列（１２Ａ）、（１２Ｂ）の変性鎖がもたらされる。その後、反応混合物はハイブリダイゼーションを促進するために冷やされる（例えば７０℃で、３０秒間）が、これは、先行技術での通常の８分間の冷却からの劇的な減少である。冷却は過剰な量の山参照ブロック配列（１４）の存在下で起こるため、参照ブロック配列（１４）は、参照配列の相補鎖（１０Ａ）と標的配列の相補鎖（１２Ａ）と優先的にハイブリダイズする。図２の工程２は、７０℃までのハイブリダイゼーション冷却後の反応混合物の状態を説明する。参照ブロック配列（１４）および相補的な参照鎖（１０Ａ）のヘテロ二本鎖（１６）と、参照ブロック配列（１４）および相補的な標的鎖（１２Ａ）のヘテロ二本鎖（１８）に加えて、反応混合物は、参照と標的の配列の変性したマイナス鎖（１０Ｂ）および（１２Ｂ）をそれぞれ含有している。

図２の工程３で、反応混合物は、臨界温度「Ｔ_ｃ」（例えば、８４．５°Ｃ）にさらされる。この温度は、標的鎖（１２Ａ）と参照ブロック配列（１４）のヘテロ二本鎖（１８）の優先的な変性を可能にするために選ばれる。臨界温度（Ｔ_ｃ）は、反応混合物が「Ｔ_ｃ」でインキュベートされる際に、参照ブロック鎖（１４）と相補的な参照鎖（１０Ａ）のニ本鎖（１６）がほとんど変性されないままであるように、選択される。参照ブロック配列（１４）と標的鎖（１０Ｂ）のニ本鎖（１８）の融解温度は、常に、参照ブロック配列（１４）と相補的な参照鎖（１０Ａ）のニ本鎖（１６）の融解温度未満となる。なぜなら、参照ブロック配列（１４）は参照鎖（１０Ａ）の少なくとも一部と完全に相補的であるためであり、標的鎖（１２Ａ）を含む少なくとも１つのミスマッチがある。

図２の工程４を参照すると、優先的な変性の後、反応混合物の温度が６０℃に下げられることで、プライマー対（２０Ａ）（２０Ｂ）は、反応混合物中の遊離標的鎖（１２Ａ）（１２Ｂ）と遊離参照鎖（１０Ｂ）とアニールすることが可能となる。参照番号（２０Ａ）はフォワードプライマーを、参照番号（２０Ｂ）はリバースプライマーを指す。先に記載されたように、標的配列（１２）は、参照配列（１０）に使用されるものと同じ対のプライマー（２０Ａ）（２０Ｂ）を介して増幅可能である。図２の工程５は、第１の変性工程と比較した標的配列の２つの遊離鎖（１２Ａ）（１２Ｂ）と、たった１つの遊離参照鎖（１０Ｂ）を説明している。もう一方の参照鎖（１０Ａ）は、参照ブロック配列（１４）によってハイブリダイズされ、したがって、増幅には利用できない。その後、反応混合物の温度が例えば７２℃に上げられることによって、アニールされたプライマー（２０Ａ）（２０Ｂ）を伸長し、そうすることで参照配列（１０）に対する反応混合物中の標的配列（１２）の濃度を濃縮する。この方法は５乃至３０サイクル繰り返される傾向にある。

図２で示される方法は、個々のプロトコルに関して最適化可能であり、最適化されなければならない。様々なＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲ機器を操作するために、必要に応じて、このようなプロトコルをソフトウェアで具体化することができる。

（好ましい参照ブロック配列についての設計面での配慮）
上記のように、参照ブロック配列は多くの形態をとることができるが、好ましい形態は一本鎖の非伸長性のＤＮＡである。より具体的には、好ましい参照ブロック配列は以下の特徴を有する：（ａ）長さが２００ｂｐまでの一本鎖ＤＮＡを含む；（ｂ）プライマーが参照ブロック配列にアニールされる際に参照配列にあまり結合しないように、標的配列よりもいくつかの塩基分（例えば、配列の各側で８−１２の塩基分）小さな長さを有し、および、参照ブロック配列そのものにもあまり結合しない；および、（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ伸長にブロックされる３’−末端を含有している。

そのような参照ブロック配列は、いくつかの方法の１つで合成することができる。まず、参照ブロック配列は、配列の３’−末端の修飾を可能にする標準的なオリゴヌクレオチド合成方法を用いる直接合成によって作ることができる。３’−末端は、リン酸基、アミノ基、ジデオキシヌクレオチド、または、３’乃至５’ポリメラーゼ伸長をブロックする他の部分を含有してもよい。あるいは、参照ブロック配列は、最終生成物として一本鎖ＤＮＡを生成するＰＣＲ反応の間に、ポリメラーゼ合成によって作ることができる。この場合、生成された一本鎖ＤＮＡは、参照ブロック配列に必要な完全な配列に相当する。ポリメラーゼ合成によって一本鎖ＤＮＡを合成する方法は、複数あり、当業者に周知である。例えば、非対称のＰＣＲまたはＬＡＴＥ ＰＣＲは適切である。あるいは、一本鎖ＤＮＡ参照ブロック配列は、固体の支持体上でニ本鎖ＰＣＲ生成物を結合することによって合成可能である。これは、ビオチン化されるプライマー対のひとつを用いて、標準的なＰＣＲ反応を行なうことにより遂行される。ＰＣＲの後、ＰＣＲ生成物は、ストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体（例えば、電磁ビーズ）でインキュベートされ、ビーズに結合することが可能となる。その後、温度を２−３分間９５°Ｃに上げることで、ＤＮＡを変性して、固定化されたＰＣＲ生成物からビオチン化されていないＤＮＡ鎖を溶液に放出する。相補的ＤＮＡ鎖を含む磁気ビーズは、その後取り除かれ、溶液中に残っている一本鎖生成物は、参照ブロック配列として役立つ。

一本鎖参照ブロック配列が使用される前に、３’−末端は好ましくはポリメラーゼ伸長にブロックされる。これは当業者に周知のいくつかの方法で遂行することができる。例えば、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）による反応は、一本鎖参照ブロック配列の末端に単一のジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）を加えるために、溶液中のｄｄＮＴＰの存在下で用いることができる。ｄｄＮＴＰｓは、ポリメラーゼ伸長をブロックする役目をする。あるいは、参照ブロック配列の３’−末端に相補的なオリゴヌクレオチド鋳型は、一時的なニ本鎖構造を提供するために使用することができる。その後、ポリメラーゼはハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドの反対側の参照ブロック配列の３’−末端に、単一のｄｄＮＴＰを挿入するために使用することができる。

ニ本鎖形態の参照ブロック配列を合成する別の方法では、従来のＰＣＲが、まれな酵素制限部位を含有するプライマーを用いて行われることで、対象の配列の野生版を増幅する。ＰＣＲ増幅の後、制限酵素は、ＰＣＲ生成物の両末端を温浸し、オーバーハングを形成するために適用される。その後、これらのオーバーハングは、ジデオキシヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ伸長にさらされ、それによって、さらなる伸長から両側の３’−末端をブロックする。その後、二本鎖の３’−末端ブロックＰＣＲ生成物は、ニ本鎖参照ブロック配列として役立つことができる。

（オリゴヌクレオチド合成により生成された参照ブロック配列の特異的な例）
２つの参照ブロック配列は合成された：ｐ５３エキソン８の部分に対応する、６０ｂｐ（ＲＢＳ６０）および９０ｂｐ（ＲＢＳ９０）参照ブロック配列。表１は、合成されたＲＢＳ６０およびＲＢＳ９０の参照ブロック配列について列挙される配列を含む。ＲＢＳ６０およびＲＢＳ９０配列の両方は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃによる３’−ブロックリン酸基で合成された。同じエキソン８フラグメント中の変異を含む株化細胞は、方法を試験するために使用される（表１の配列表を参照）。

図３は、修飾されたｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ濃縮に関する、ＲＢＳ６０参照ブロック配列の使用を説明する概略図である。８７ ｂｐ増幅産物は、下線を引いたプライマーを用いて予備的に増幅される。相補的な参照ブロック配列（ＲＢＳ６０）は、図３の参照鎖のために設計される。図３から明白なように、ＲＢＳ６０はプライマーが結合するのを防ぎ、伸長を防ぐために３’リン酸基を含有している。

ＲＢＳ６０のためのプロトコル：ｐ５３エキソン８からの１６７ｂｐ配列は、従来のＰＣＲと、プライマーＥｘ８−１６７Ｆ、および、Ｅｘ８−１６７Ｒ（表１）を用いて最初に増幅された。使用されたゲノムＤＮＡは、野生型のＤＮＡ、または、３％変異体ＤＮＡ混合物を野生型のＤＮＡに入れたもののいずれかであった。特定の変異を含有する使用された突然変異細胞株が、表１に列挙される。

ＰＣＲ生成物はその後５００倍に希釈された。その後、２５ｎＭの参照ブロック配列ＲＢＳ６０と、１６７ｂｐフラグメント内で入れ子にされた（ｎｅｓｔｅｄ）領域を増幅する２００ｎＭのプライマー８７ｆおよび８７ｒとの存在下で、修飾されたｆｕｌｌ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲ反応は実行された。Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）は増幅に用いられた。ｆｕｌｌ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲプログラムは次のとおりだった：５サイクルの従来のＰＣＲ（９５°Ｃで３０秒；６０°Ｃで３０秒；７２°Ｃで１分）；その後の２５サイクルのｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ（９５°Ｃで３０秒；７０°Ｃで３０秒；その後Ｔ_ｃ＝８４．５°Ｃで３秒、その後６０°Ｃで３０秒；７２°Ｃで１分）Ｘ２５。あるいは、（ＲＢＳ６０の不在下での）ｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲは、ＲＢＳ６０の存在下でｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲについてまったく同じプログラムを適用することによって、しかしながら、反応混合物からＲＢＳ６０を取り除くことによって、行なわれた。ＲＢＳ６０の存在下でのｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ（および、ｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ（ＲＢＳ６０はない）と、ｆａｓｔＣＯＬＤ−ＰＣＲと規則的なＰＣＲ）の後、生成物は長めのプライマー３０Ｔ−ｐ５３−８７Ｆ用いて配列決定された。

ＲＢＳＳ９０のためのプロトコル：ＲＢＳ６０について記載されたように、同じ手順がＲＢＳ９０にも適用された。しかしながら、入れ子にされたｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲのために設定されたプライマーは、ｐ５３−ｅｘ８−１１５Ｆおよびｐ５３−ｅｘ８−１１５Ｒであり、ＲＢＳ９０に適用されたＴ_ｃは、Ｔ_ｃ＝８４．４°Ｃであった。

結果：代表的な結果がＲＢＳ６０について図４乃至７で、ＲＢＳ９０について図８で描かれる。図４乃至７において、（ＲＢＳ６０の存在下の）修飾したｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲは、ｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ（ＲＢＳ６０はない）、Ｆａｓｔ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、および、従来のＰＣＲと比較される。

図４は、修飾したｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ（２５ｎＭ ＲＢＳ）による濃縮は、変異が融解温度を上昇させる環境には左右されない（３％から３７％までの増加）ことを説明している。図４のＦａｓｔ ＣＯＬＤ−ＰＣＲと従来のＰＣＲを使用する場合、変異は検出できない。図５は、修飾したｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ（２５ｎＭ ＲＢＳ）による濃縮は、変異が融解温度に影響を与えない環境には左右されない（３％から４７％までの増加）ことを同じように説明している。再び、図５のＦａｓｔ ＣＯＬＤ−ＰＣＲと従来のＰＣＲを使用する場合、変異は検出できない。図６は、修飾したｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ（２５ｎＭ ＲＢＳ）による濃縮は、変異が融解温度を下げる環境には左右されない（３％から４５％までの増加）ことを説明している。図６では、Ｆａｓｔ ＣＯＬＤ−ＰＣＲによる濃縮は、同様に（すなわち、下がった融解温度によって）左右されない。再び、図６では、従来のＰＣＲを使用する場合、変異は検出できない。図７は、欠失を減らす温度の結果を説明する。修飾したｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ（２５ｎＭ ＲＢＳ）による濃縮は、Ｆａｓｔ ＣＯＬＤ−ＰＣＲによる濃縮と同じように堅調である（３％から４５％までの増加）。再び、従来のＰＣＲを使用する場合、変異は検出できない。

図８は、ＲＢＳ９０を用いて処理されたサンプルからのＨＣＣ１００８突然変異対立遺伝子の濃縮のＳａｎｇｅｒ配列決定データを表示しており、９０ｂｐ参照ブロック配列の存在下での修飾したｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲによる濃縮が堅調である（３％から３８％までの増加）を示している。ＲＢＳ６０を用いて処理されたサンプルからのＨＣＣ１００８突然変異対立遺伝子の濃縮のＳａｎｇｅｒ配列決定データを表示している図５の結果を、図８の結果と比較することで、本発明の方法が異なる期間の参照ブロック配列で堅調であることが確認される。ここまで研究してきたすべてのケースとすべての変異において、（ＲＢＳの存在下の）修飾したｆｕｌｌ ＣＯＬＤ−ＰＣＲは、短い反応時間ですべてのタイプの変異（Ｔ_ｍを上昇、維持、低下させる変異）を濃縮し、かつ、Ｆｕｌｌ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲ）（ＲＢＳがない）よりも濃縮が優れているという点で、最良の性能を有するように思われる。

Claims (24)

1. 増幅反応混合物中の標的鎖を濃縮するための方法であって、
   前記方法は、
   ａ） 参照配列を有する参照鎖に、及び前記参照鎖と少なくとも５０％相同である１つ以上の標的配列を有する標的鎖に、アニール可能なプライマー対を提供し、
   少なくとも以下の成分：
   参照鎖を有し、および、前記参照配列に少なくとも５０％相同するとともに前記参照鎖と同じプライマー対によって増幅可能でもある１以上の標的配列を有する標的鎖を含むと想定される核酸と、プライマー対結合部位間の参照配列の鎖の１つの配列の少なくとも一部と完全に相補的な参照鎖の量と比較して過剰なモル濃度の参照ブロック配列鎖、を含む増幅反応混合物を調製する工程と、
   ｂ） 変性された参照鎖と変性された標的鎖を形成するために、参照配列二本鎖の溶解温度（Ｔ_ｍ ）および標的配列二本鎖の融解温度（Ｔ_ｍ）より高い第１の変性温度に、前記反応混合物の温度を上昇させる工程と、
   ｃ） 参照ブロック配列鎖と相補的な参照鎖との二本鎖、および、参照ブロック配列鎖と標的鎖とのヘテロ二本鎖の形成を可能にするように、反応混合物の温度を下げる工程と、
   ｄ） 参照ブロック配列鎖と標的鎖との前記ヘテロ二本鎖の変性を、参照ブロック配列鎖と参照鎖の前記二本鎖の変性よりも優先的な変性を可能にするのに十分な臨界温度（Ｔ_ｃ）に、前記反応混合物の温度を上昇させる工程であって、その結果前記反応混合物中の変性された二本鎖からの参照鎖の一本鎖の量と比較した、変性されたヘテロ二本鎖からの標的鎖の一本鎖の量の増加を提供する工程と、
   ｅ） 前記プライマー対を反応混合物中の標的鎖の一本鎖と任意の参照鎖の一本鎖にアニールすることができるように、反応混合物の温度を下げる工程と、
   ｆ） 反応混合物中で標的鎖および参照鎖にアニーリングした前記プライマー対を伸長する工程であって、その結果前記参照鎖と比較して前記標的鎖が濃縮される工程、および
   ｇ） 前記参照鎖と比較してより標的鎖を濃縮するためにｂ）からｆ）の工程を２回以上繰り返す工程を含むことを特徴とする方法。
2. 前記参照ブロック配列鎖の３’−末端は伸長を阻害するためにブロックされることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記参照ブロック配列鎖上の５’−末端は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼによる５’から３’のエキソヌクレオリシスを妨げるヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 前記参照ブロック配列鎖は一本鎖として工程ａ）に提供されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 前記参照ブロック配列鎖は、反応混合物が第１の変性温度にさらされる際に工程ｂ）で一本鎖にされた参照ブロック配列鎖を形成するために変性する二本鎖として工程ａ）で提供されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 前記参照ブロック配列鎖は、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、ロックト核酸及び別の修飾ヌクレオチドからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 前記参照ブロック配列鎖は、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸またはロックト核酸、あるいは、別の修飾ヌクレオチドの間のキメラであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
8. キメラ配列上のペプチド核酸、ロックト核酸又は別の修飾ヌクレオチドの位置は、変異が存在しそうな位置にマッチするように選択され、それによって、参照ブロック配列鎖と標的鎖とのヘテロ二本鎖を変性するために必要な温度と、参照ブロック配列鎖と相補的な参照鎖との二本鎖を変性するために必要な温度の差を最大化することを特徴とする請求項７に記載の方法。
9. 前記参照ブロック配列鎖は、そのプライマー結合部位間の参照配列の鎖の１つと完全に相補的であるか、または、プライマー結合部位のいずれかの末端で重複することを特徴とする請求項１に記載の方法。
10. 前記参照ブロック配列鎖は参照鎖と同じか、参照鎖よりも短いことを特徴とする請求項１に記載の方法。
11. 冷却工程ｃ）は１分未満であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
12. 前記参照ブロック配列鎖は、２５ｎＭにほとんど等しい量で反応混合物中に存在することを特徴とする請求項１に記載の方法。
13. 標的配列二本鎖の溶解温度は、参照配列二本鎖の溶解温度よりも高いか、該溶解温度と等しいこと、および第一変性温度が標的配列二本鎖の溶解温度より高いことを特徴とする請求項１に記載の方法。
14. 前記参照鎖および標的鎖は、ＰＣＲに核酸サンプルをさらし、その後、請求項１の濃縮方法に増幅された核酸サンプルの少なくとも一部をさらすことによって、まず増幅されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
15. 前記標的鎖はホモ接合変異を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
16. 前記標的鎖は、参照鎖から差次的にメチル化され、核酸サンプル上で請求項１の方法を実施する前に、核酸サンプルは亜硫酸水素ナトリウムで処理されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
17. 前記参照鎖および標的鎖は、少なくとも２５の塩基対を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
18. ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＨＲ−融解、ジデオキシ配列決定法、単一分子配列決定、ピロシーケンス、第二世代ハイスループット配列決定、ＳＳＣＰ、ＲＦＬＰ、ｄＨＰＬＣ、ＣＣＭ、デジタルＰＣＲ、および、定量的ＰＣＲからなる群から選択される１以上の方法を用いて、濃縮した標的鎖で前記混合反応物を分析する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
19. 前記Ｔ_ｃは１秒から１分の間で適用されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
20. 前記反応混合物は核酸検出色素を含有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
21. 前記方法はリアルタイムＰＣＲ装置で実行されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
22. 前記方法は標識化されたプローブを用いるリアルタイム反応条件下で実行されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
23. 請求項１に記載の方法を実行するためのプログラム命令を含む、コンピュータ読み取り可能な媒体。
24. プライマー伸長工程ｆ）がアニーリングされたプライマーの伸長を促進するため反応混合物の温度を上昇させる工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。