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JP5785080B2 - 植物におけるワクチン及びモノクローナル抗体治療薬の高レベル迅速生産のためのｄｎａレプリコン系 - Google Patents

植物におけるワクチン及びモノクローナル抗体治療薬の高レベル迅速生産のためのｄｎａレプリコン系 Download PDF

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Description

本発明は概して、植物の遺伝子工学の分野に関する。特に、本発明は、対象となる産物を発現させる組み換えＤＮＡ技法を用いた植物の形質転換に関する。
本願は２００８年８月２７日付で出願された米国仮出願第６１／０９２，３１８号（その内容全体が参照により本明細書中に援用される）に対する優先権の利益を主張するものである。
本発明は、米国立衛生研究所によって与えられた助成金番号５Ｕ０１ＡＩ０６１２５３及びＵ１９−ＡＩ−０６６３３３２の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
近年、医薬用タンパク質を作り出すためのトランスジェニック植物の使用に大きな関心が払われている。植物においてウイルス抗原及び細菌性抗原、並びにワクチン、並びに多様な形態の抗体を含む様々な化合物を発現させることに成功している（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３に概説される）。植物は、大量の産物を効率的かつ持続的に産生することができ、かつ、条件によってでは製造コストにおいてかなりの利点を有し得るため、タンパク質工場として魅力的である（非特許文献４、非特許文献５）。「分子農業」によって農業規模で治療用タンパク質薬剤を生産する可能性は非常に魅力的である。系の拡張性に加え、植物の大きな利点の１つは哺乳動物細胞と同様の細胞内膜系及び分泌経路を有することである（非特許文献６）。これにより、タンパク質は概して適切に翻訳後修飾され、効率的に構築される。これらのコスト及び規模による利点により、物製造医薬品（plant-made pharmaceuticals）（ＰＭＰ）は、商業的な医薬品生産及び発展途上国向けの製品の製造の両方にとって非常に有望なものとされている。
医薬用タンパク質は、一時的なウイルスベースの発現系を用いて（非特許文献７、非特許文献８）、又は安定に形質転換される植物を用いて（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）生産されてきた。後者の戦略については、安定なトランスジェニック植物を作り出すための期間が長い（数ヶ月から数年）ことが、前臨床初期研究のためにタンパク質試料を得る上で懸念されている。また、高レベルのタンパク質蓄積を推進する強い調節要素の欠如、及び植物ゲノムにおける導入遺伝子組み込みのランダム性に関連する位置効果が、依然として安定なトランスジェニック技術にとっての課題となっている。対照的に、生産速度に重点を置いた一時的な系によって、前臨床試験において標的医薬用タンパク質の機能を試験するための初期研究材料を得る際の困難性が解決されている。例えば、「脱構築した（deconstructed）」タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ベースの三成分発現系（非特許文献１２）によって、その後の免疫化及び抗原投与の研究のためのワクチン候補の迅速かつ高収率の生産が可能となる（非特許文献１３、非特許文献１４）。近年では、ＴＭＶ及びジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）に由来する非競合ウイルスベクターを用いて、完全長モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を葉生体重１ｇ当たり０．５ｍｇのｍＡｂという高いレベルで迅速に産生させることができることが報告されている（非特許文献１５）。しかしながら、重鎖分子及び軽鎖分子の両方の同時発現に必要とされる合計で５つの構築物モジュール（１つのサブユニット当たり２つのモジュール＋インテグラーゼ）（非特許文献１５）の複雑により、この系の実際の商業利用にはさらなる課題があるだろう。さらに、多成分ウイルス様粒子（ＶＬＰ）（非特許文献１６、非特許文献１７）又は分泌ＩｇＡ抗体等の幾つかの重要な医薬用複合体の生産及び集合に必要とされる、同じ細胞における３つ以上の異なるサブユニットタンパク質の効率的な同時発現を可能にするためには、既存のＴＭＶ／ＰＶＸ発現系に適合する第３又はそれ以上のウイルスを発見するという、依然として困難な課題が残っている。現時点では、３つ以上のサブユニットから構成されるヘテロオリゴマータンパク質の効率的な発現に利用可能な植物の一時的発現系は、未だ存在しない。したがって、最低限の数のベクターから構成されているが、それでも複数のサブユニットタンパク質の高レベルの発現を可能にする改良された一時的発現系を開発する必要がある。
Ma et al., 2005 Stoger et al., 2005 Ma et al., 2003 Hood et al., 2001 Giddings, 2001 Vitale and Pedrazzini, 2005 Canizares et al., 2005 Yusibov et al., 2006 Giddings et al., 2000 Floss et al., 2007 Twyman et al., 2005 Marillonnet et al., 2004 Santi et al., 2006 Huang et al., 2006 Giritch et al., 2006 Latham and Galarza, 2001 Pushko et al., 2005
本開示は、非競合ウイルスを同定するという難題及び複数の発現モジュールの重感染の必要性を解消し、２．３ｋｂより長い遺伝子をレプリコンに組み入れる可能性をもたらすことによって、当該技術分野における欠陥を克服し、それにより多重サブユニットタンパク質複合体を生産するこの技術の現実的な商業利用を促進するものである。
或る特定の態様では、本発明は、植物細胞において産物を産生させる方法であって、
プロモーター及び対象となる産物をコードする領域を含む第１の核酸セグメントを得ることであって、該対象となる産物をコードする領域のいずれかの側に、ジェミニウイルスゲノムの長い遺伝子間領域（ＬＩＲ）の少なくとも一部が隣接する、第１の核酸セグメントを得ること、
プロモーター及びジェミニウイルスゲノムのＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質をコードする核酸を含む第２の核酸セグメントを得ること、
前記第１の核酸セグメント及び前記第２の核酸セグメントを植物細胞に導入すること、並びに
前記植物細胞又はその任意の世代の子孫において前記対象となる産物を産生させることを含む、方法を提供する。本明細書中で使用される場合、「ジェミニウイルスゲノムの長い遺伝子間領域（ＬＩＲ）」とは、ジェミニウイルスＲｅｐタンパク質による切り出し及び複製を媒介することが可能なｒｅｐ結合部位を含有する、長い遺伝子間領域（ＬＩＲ）の領域を指す。幾つかの実施の形態では、前記第１の核酸セグメントはジェミニウイルスゲノムの短い遺伝子間領域（ＳＩＲ）をさらに含み得る。本明細書中で使用される場合、「ジェミニウイルスゲノムの短い遺伝子間領域（ＳＩＲ）」とは、相補鎖（マストレウイルスの短いＩＲ（ＳＩＲ））を指す。対象となる産物を含む前記核酸セグメントは、レプリコンに組み込まれることができる任意の長さであり得る。或る特定の実施の形態では、対象となる産物を含む前記核酸セグメントは０．１ｋｂ〜８ｋｂであり得る。特定の実施の形態では、対象となる産物を含む前記核酸セグメントは２．０ｋｂ、２．５ｋｂ、３．０ｋｂ、３．５ｋｂ、４．０ｋｂ、４．５ｋｂ、５．０ｋｂ、５．５ｋｂ、６．０ｋｂ、６．５ｋｂ、７．０ｋｂ又は７．５ｋｂ超である。特定の実施の形態では、対象となる産物を含む前記核酸セグメントは２．８７ｋｂである。幾つかの実施の形態では、該方法は、前記対象となる産物を前記植物細胞又はその任意の世代の子孫から単離することをさらに含み得る。
幾つかの実施の形態では、前記第１の核酸セグメント及び前記第２の核酸セグメントは、それぞれ第１及び第２のベクターに含まれる。かかる実施の形態では、前記第１及び第２のベクターを前記植物細胞に同時に又は別個に導入してもよい。他の実施の形態では、前記第１の核酸セグメント及び前記第２の核酸セグメントは、単一のベクターに含まれる。
特定の実施の形態では、該方法は、第３の核酸セグメントを得ること、及び該第３の核酸セグメントを前記植物細胞にトランスフェクトすることをさらに含み得る。幾つかの実施の形態では、前記第３の核酸セグメントはプロモーター、ジェミニウイルスゲノムのＬＩＲの少なくとも一部、及び対象となる産物をコードする領域を含む。特定の実施の形態では、前記第３の核酸セグメントは、プロモーター及び遺伝子サイレンシング阻害因子を含む。一つの実施の形態では、前記遺伝子サイレンシング阻害因子は、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９である。該方法は、前記対象となる産物を前記植物細胞又はその任意の世代の子孫から単離することをさらに含み得る。
幾つかの実施の形態では、前記第１の核酸セグメント、前記第２の核酸セグメント及び前記第３の核酸セグメントは、それぞれ第１、第２及び第３のベクターに含まれる。特定の実施の形態では、前記第１、第２及び第３のベクターを前記植物細胞に同時に又は別個に導入する。他の実施の形態では、前記第１の核酸セグメント、前記第２の核酸セグメント及び前記第３の核酸セグメントが、単一のベクターに含まれる。
特定の実施の形態では、該方法は、
プロモーター及び対象となる産物をコードする領域を含む第３の核酸セグメントを得ることであって、該対象となる産物をコードする領域のいずれかの側に、ジェミニウイルスゲノムの長い遺伝子間領域（ＬＩＲ）の少なくとも一部が隣接する、第３の核酸セグメントを得ること、
プロモーター及び遺伝子サイレンシング阻害因子を含む第４の核酸セグメントを得ること、並びに
前記第３及び第４の核酸セグメントを前記植物細胞にトランスフェクトすることをさらに含む。該方法は、前記対象となる産物を前記植物細胞又はその任意の世代の子孫から単離することをさらに含み得る。
幾つかの実施の形態では、前記第１の核酸セグメント、前記第２の核酸セグメント、前記第３の核酸セグメント及び前記第４の核酸セグメントは、それぞれ第１、第２、第３及び第４のベクターに含まれる。かかる実施の形態では、前記第１、第２、第３及び第４のベクターを前記植物細胞に同時に又は別個に導入する。他の実施の形態では、前記第１の核酸セグメント、前記第２の核酸セグメント、前記第３の核酸セグメント及び前記第４の核酸セグメントは、単一のベクターに含まれる。
前記対象となる産物が核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドであり得ることが考えられる。或る特定の実施の形態では、前記核酸はｍＲＮＡである。幾つかの実施の形態では、前記タンパク質、ポリペプチド又はペプチドが動物に導入された場合に免疫応答を惹起することが考えられる。
前記対象となる産物が抗原であり得ることが特に考えられる。幾つかの実施の形態では、前記抗原は病原体又は病変細胞に由来するものである。或る特定の実施の形態では、前記抗原はウイルス抗原、細菌性抗原、真菌抗原又は癌細胞由来抗原である。特定の実施の形態では、前記抗原はＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃ）又はノーウォークウイルスカプシドタンパク質（ＮＶＣＰ）である。幾つかの実施の形態では、前記抗原は動物に導入された場合に免疫応答を惹起する。前記免疫応答が病原体又は疾患を防ぐものであり得ることが考えられる。
前記対象となる産物が抗体であり得ることがさらに考えられる。幾つかの実施の形態では、前記抗体はモノクローナル抗体である。特定の実施の形態では、前記モノクローナル抗体はエボラウイルスＧＰ１を防ぐもの（６Ｄ８）である。
幾つかの実施の形態では、該方法は、前記第１及び第２の核酸を、植物細胞又はその任意の世代の子孫に取り込ませることをさらに含む。さらなる実施の形態では、前記植物細胞又はその任意の世代の子孫は、前記第１及び第２の核酸によって安定に形質転換される。またさらなる実施の形態では、前記第１及び第２の核酸は、前記植物細胞又はその任意の世代の子孫中のプラスミドに含まれる。
さらなる実施の形態では、本発明は、ベクター系であって、
プロモーター及び対象となる産物をコードする領域を含む第１の核酸セグメントであって、該対象となる産物をコードする領域のいずれかの側に、ジェミニウイルスゲノムの長い遺伝子間領域（ＬＩＲ）の少なくとも一部が隣接する、第１の核酸セグメント、並びに
プロモーター及びジェミニウイルスゲノムのＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質をコードする核酸を含む第２の核酸セグメントを含む、ベクター系を提供する。
またさらなる実施の形態では、本発明は、植物であって、
プロモーター及び対象となる産物をコードする領域を含む第１の核酸セグメントであって、該対象となる産物をコードする領域のいずれかの側に、ジェミニウイルスゲノムの長い遺伝子間領域（ＬＩＲ）の少なくとも一部が隣接する、第１の核酸セグメント、並びに
プロモーター及びジェミニウイルスゲノムのＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質をコードする核酸を含む第２の核酸セグメントを含む、植物を提供する。
本明細書中で論考される任意の実施の形態を本発明の任意の方法又は組成物に対して実施することができ、逆もまた同様であると考えられる。さらに、本発明の組成物を使用して本発明の方法を達成することができる。
特許請求の範囲及び／又は明細書中での「ａ」又は「ａｎ」という語の使用は、「１つの」を意味し得るが、「１つ又は複数の」、「少なくとも１つの」及び「１つ又は２つ以上の」という意味とも一致する。
特許請求の範囲及び／又は明細書中に見られる「１つ又は複数の」という表現は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０つ又はそれ以上として定義される。
本願全体を通して、「約」及び「およそ」という用語は、値がその値を決定するために利用される装置、方法に関する固有の誤差変動、又は被験体間に存在する変動を含むことを示している。非限定的な一つの実施の形態では、この用語は１０％以内、好ましくは５％以内、より好ましくは１％以内、最も好ましくは０．５％以内であると定義される。
本開示は選択肢のみと「及び／又は」とを指す定義を支持するものであるが、特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、選択肢のみを指すこと又は選択肢が相互に排他的であることが明示されている場合を除き、「及び／又は」を意味するように使用される。
本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、「含む（comprising)」（並びに「含む（comprising)」の任意の形態、例えば「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」等）、「有する（having）」（並びに「有する（having）」の任意の形態、例えば「有する（have）」及び「有する（has）」等）、「含む（including）」（並びに「含む（including）」の任意の形態、例えば「含む（includes）」及び「含む（include）」等）、又は「含有する（containing）」（並びに「含有する（containing）」の任意の形態、例えば「含有する（contains）」及び「含有する（contain）」等）という語は、包括的又は非限定的であり、列挙されていない付加的な要素又は方法工程を排除するものではない。
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、この詳細な説明から、本発明の精神及び範囲内にある様々な変更形態及び修正形態が当業者に明らかになるため、詳細な説明及び具体的な実施例は本発明の具体的な実施形態を示しているが、例示目的でのみ与えられていることを理解すべきである。
本発明は、これらの図面の１つ又は複数を、本明細書に提示された具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、より良く理解され得る。
本研究において使用されるベクターのＴ−ＤＮＡ領域の概略図である。３５Ｓ／ＴＥＶ ５’、タバコエッチウイルス５’ＵＴＲを有するＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター；３５Ｓ／ＴＭＶ ５’、タバコモザイクウイルス５’ ＵＴＲを有するＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター；ＶＳＰ ３’、ダイズｖｓｐＢ遺伝子３’エレメント；ｒｂｃＳ ３’、エンドウマメｒｂｃＳ遺伝子３’エレメント；ＮＰＴ ＩＩ、カナマイシン耐性に関するｎｐｔＩＩ遺伝子をコードする発現カセット；ＬＩＲ、ＢｅＹＤＶゲノムの長い遺伝子間領域；ＳＩＲ、ＢｅＹＤＶゲノムの短い遺伝子間領域；Ｃ１／Ｃ２、複製開始タンパク質（Ｒｅｐ）及びＲｅｐＡをコードするＢｅＹＤＶのＯＲＦ Ｃ１及びＣ２；ΔＣ１／Ｃ２、Ｒｅｐのみをコードするイントロン欠失Ｃ１及びＣ２；ＬＢ及びＲＢ、Ｔ−ＤＮＡ領域の左境界配列及び右境界配列。矢印はＣ１／Ｃ２遺伝子の転写の方向を示す。 植物の葉におけるＧＦＰ及び／又はＤｓＲｅｄ発現の可視化を示す図である。ベンサミアナタバコ（N. benthamiana）の葉に、指定の発現ベクターを有する単一のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株又は株の混合物を浸潤させた。浸潤させた葉を、浸潤後５日目（ｄｐｉ）に、材料及び方法の項に記載される手持ち式ＵＶランプを用いて検査した。 植物の葉におけるＨＢｃの一時的発現を示す図である。 種々のベクターの組み合わせによるＨＢｃ発現の定量化を示す図である。 浸潤させた葉に由来する植物ＤＮＡのサザンブロット法によって示されたレプリコン形成を示す図である。 浸潤させた葉に由来する植物ＲＮＡのノーザンブロット分析を示す図である。 植物によって発現されたＨＢｃの特性化を示す図である。（図４Ａ）浸潤させたベンサミアナタバコの葉に由来するＨＢｃのウエスタンブロット分析。タンパク質試料を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動し（run）、ＰＶＤＦメンブレンにブロットした。次いで、メンブレンをＨＢｃのアミノ酸残基１３０〜１４０を認識するマウスモノクローナル抗ＨＢｃでプローブした。（図４Ｂ）ショ糖勾配分析。ＢＹＨＢｃ／ＲＥＰ１１０／Ｐ１９を浸潤させたベンサミアナタバコの葉からの抽出物及び大腸菌由来ＨＢｃ（ｅ−ＨＢｃ）を、材料及び方法の項に記載されるように、１０％から５０％までのショ糖勾配上に重層し、遠心分離に供した。上から下に向かって１０個の画分（各々０．５ｍｌ）を取り、ＨＢｃ ＥＬＩＳＡによってアッセイした。（図４Ｃ）ウサギポリクローナル抗ＨＢｃでプローブしたショ糖勾配画分のドットブロット。（図４Ｄ）及び（図４Ｅ）電子顕微鏡検査。部分的に精製したＨＢｃを０．５％酢酸ウラニルでネガティブ染色し、透過電子顕微鏡検査によって可視化した。バー＝５０ｎｍ。 レプリコンベクターを用いたＮＶＣＰの一時的発現を示す図である。（図５Ａ）種々のベクターの組み合わせによるＮＶＣＰ発現の経時変化。報告したデータは、４つの独立して浸潤させた試料からの平均±標準偏差である。（図５Ｂ）ＮＶＣＰ発現についてのウエスタンブロット。レーン１、それぞれ昆虫由来のＮＶＣＰ標準；レーン２、レーン３及びレーン４は、それぞれ非浸潤の、ＢＹＧＦＰを浸潤させた及びＢＹＮＶＣＰを浸潤させた葉の抽出物である。（図５Ｃ）ポリクローナルＥＬＩＳＡアッセイによって分析された、昆虫由来の及び植物によって発現されたＮＶＣＰのショ糖勾配プロファイル。 ＧＦＰ及びＤｓＲｅｄを発現する葉肉細胞プロトプラストの蛍光顕微鏡検査法を示す図である。（図６Ａ）及び（図６Ｂ）ＢＹＧＦＰ／ＲＥＰ１１０／Ｐ１９又はＢＹＤｓＲｅｄ／ＲＥＰ１１０／Ｐ１９を別個に浸潤させた葉に由来するプロトプラストの混合物。（図６Ｃ）及び（図６Ｄ）ＢＹＧＦＰ／ＢＹＤｓＲｅｄ／ＲＥＰ１１０／Ｐ１９を浸潤させた葉に由来するプロトプラスト。（図６Ｅ）及び（図６Ｆ）ＢＹＧＦＰＤｓＲｅｄ．Ｒを浸潤させた葉に由来するプロトプラスト。図６Ａ、図６Ｃ及び図６ＥはＧＦＰフィルターを用いて見たものであり、図６Ｂ、図６Ｄ及び図６ＦはＤｓＲｅｄフィルターを用いて見たものである。 エボラウイルスｇｐ１に対する植物由来防御ｍＡｂ（６Ｄ８）の特性化を示す図である。（図７Ａ）６Ｄ８の発現。ベンサミアナタバコの葉に、軽鎖（ｐＢＹ−Ｌ（６Ｄ８））又は重鎖（ｐＢＹ−Ｈ（６Ｄ８））、ＲＥＰ１１０及びＰ１９に対する別個のベクターを同時浸潤させるか、又は軽鎖、重鎖及びＲｅｐに対するレプリコンを有する単一のベクター（ｐＢＹ−ＨＬ（６Ｄ８）．Ｒ）を浸潤させた。葉に陰性対照としてｍＲＮＡサイレンシング阻害因子Ｐ１９をコードする構築物も浸潤させた。タンパク質抽出物を、６Ｄ８ ｍＡｂの集合形態を検出するＥＬＩＳＡで分析した（方法の項を参照されたい）。（図７Ｂ）還元条件下での植物由来６Ｄ８のウエスタンブロット分析。タンパク質試料を、変性及び還元条件下で４％から１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル上で分離し、ＰＶＤＦメンブレンにブロットした。メンブレンを、重鎖（図７Ｂ１）又は軽鎖（図７Ｂ２）を検出するために、ヤギ抗ヒトγ鎖抗体又はヤギ抗ヒトκ鎖抗体と共にインキュベートした。レーン１、非浸潤の葉を用いて抽出されたタンパク質試料；レーン２、参照標準としてのヒトＩｇＧ；レーン３、軽鎖（ｐＢＹ−Ｌ（６Ｄ８））及び重鎖（ｐＢＹ−Ｈ（６Ｄ８））に対する別個のレプリコンを同時浸潤させた葉から抽出されたタンパク質試料；レーン４、単一のベクターｐＢＹ−ＨＬ（６Ｄ８）．Ｒを浸潤させた葉から抽出されたタンパク質。（図７Ｃ）非還元条件下でのウエスタンブロット分析。タンパク質試料を、非還元条件下で４％から１２％までのＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル上で分離した。次いで、メンブレンをヤギ抗ヒトκ鎖特異的抗体と共にインキュベートした。レーン１、非浸潤の葉を用いて抽出されたタンパク質試料；レーン２、参照標準としてのヒトＩｇＧ；レーン３、軽鎖（ｐＢＹ−Ｌ（６Ｄ８））及び重鎖（ｐＢＹ−Ｈ（６Ｄ８））に対する別個のレプリコンを同時浸潤させた葉から抽出されたタンパク質試料。Ｈ２Ｌ２、２つの重鎖及び２つの軽鎖を有する完全に集合したＩｇＧヘテロ四量体。Ｈ２Ｌ、集合した２つの重鎖及び１つの軽鎖を有するヘテロ三量体；ＨＬ、１つの軽鎖及び重鎖を有するヘテロ二量体；Ｌ２、２つの軽鎖を有するホモ二量体。 単一のレプリコンベクターを用いたＨＢｃの発現を示す図である。ＢＹＨＢｃ／ＲＥＰ１１０／Ｐ１９、ＢＹＨＢｃ．Ｒ、又はＢＹＨＢｃ．Ｒ／Ｐ１９を浸潤させたベンサミアナタバコの葉からの抽出物について、ポリクローナルＥＬＩＳＡによってＨＢｃ発現を分析した。報告したデータは４つの独立して浸潤させた試料からの平均±標準偏差である。 ２つのレプリコンの非競合的形成のサザンブロット分析を示す図である。指定のベクターの組み合わせを浸潤させた葉に由来する植物ＤＮＡを、ＸｈｏＩで消化し、１％アガロースゲル上で泳動し（図９Ａ）、メンブレンにブロットし、それぞれＧＦＰプローブ（図９Ｂ）又はＤｓＲｅｄプローブ（図９Ｃ）を用いて検出した。ＧＦＰ特異的プローブ又はＤｓＲｅｄ特異的プローブの調製は、材料及び方法の項に記載されている。 単一のベクターによる２つの別個のレプリコンの形成を示す図である。指定の様々なベクターの組み合わせを浸潤させた葉に由来する植物ＤＮＡを、ＸｈｏＩで消化し、１％アガロースゲル上で泳動し（図１０Ａ）、メンブレンにブロットし、それぞれＧＦＰプローブ（図１０Ｂ）又はＤｓＲｅｄプローブ（図１０Ｃ）を用いて検出した。ＧＦＰ特異的プローブ又はＤｓＲｅｄ特異的プローブの調製は、材料及び方法の項に記載されている。 還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、クマシーブルーで染色した葉中のｐＢＹＲ−Ｈ２ｇｐＫＤＥＬ−Ｋ３発現産物を示す図である。レーン３、レーン４及びレーン５は、硫酸アンモニウム溶液（それぞれ０％〜３５％、３５％〜６０％及び６０％〜１００％の飽和溶液）によって沈殿させた葉タンパク質を示す。３５％〜６０％の画分をプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーに供した：レーン６、通過画分（非結合）；レーン７、レーン８、レーン９、レーン１０は結合した材料の連続溶出物である。 還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによって分析した、プロテインＧアフィニティー精製した葉抽出物を示す図である。染色、クマシーブルーで染色したタンパク質；抗γ、抗ヒトγ鎖でプローブしたウエスタンブロット；抗κ、抗ヒトκ鎖でプローブしたウエスタンブロット；抗６Ｄ８、抗ＧＰ１（６Ｄ８マウスモノクローナル抗体）でプローブしたウエスタンブロット。
Arntzen et al. (2005)において論考されるように、植物における抗原の発現に対して、安定なトランスジェニック遺伝子発現及びウイルスベクターによる一時的発現という２つの優越した（dominate）戦略があった。本明細書中で提示したもののような一時的発現系は、初期特性化のための材料を提供する上で迅速な解決をもたらすが、安定なトランスジェニック植物は極めて大量の植物製造医薬品（ＰＭＰ）生産が必要とされる場合の最も有望な拡張性を秘めている。安定な系及び一時的な系のいずれにおいても、ｍＲＮＡ蓄積がタンパク質発現における障害となっている。のみならず、安定なトランスジェニック技術による発現は、「位置効果」（ｍＲＮＡレベルが染色体において導入遺伝子を挿入する位置に左右される）により、さらに複雑となる（Matzke and Matzke, 1998）。このため、高度に発現するトランスジェニック系統の発見には統計作業が必要となっており、数百又はさらには数千もの植物を、高レベルで発現する外れ値を特定するためにスクリーニングする必要がある。
本発明は、ウイルスレプリコンベースのベクター一時的発現系、及び植物におけるＶＬＰワクチン及びｍＡｂを含む薬学的に重要なオリゴマータンパク質複合体の高収率迅速生産でのその利用を提供する。初めに、１つのレプリコンベクター、１つのＲｅｐ／ＲｅｐＡ供給ベクター及び１つのサイレンシング抑制ベクターから構成される三成分ベクター系が、極めて効率的なレプリコン形成及び高レベルの標的ｍＲＮＡ及びタンパク質の蓄積を可能にすることを実証した。次に、このレプリコン系が非競合的であり、２つのサブユニットタンパク質の同時発現を可能にすることを示した。より重要なことには、複数のレプリコンカセットを含有する単一のベクターを設計し、これは２つのオリゴマータンパク質分子の発現を誘導する上で三成分系と同じくらい効率的であることを見出した。このレプリコンベクターを用いると、２つのＶＬＰワクチン抗原（Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃ）及びノーウォークウイルスカプシドタンパク質（ＮＶＣＰ））と、エボラウイルスＧＰ１に対する１つの防御ｍＡｂ（６Ｄ８）（Wilson et al., 2000）との高レベルの発現及び正確な集合が、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）の葉の浸潤後４日〜７日（ｄｐｉ）以内に得られた。したがって、この系は最も改良された植物一時的発現技術であり、非競合ウイルスを同定するという難題及び複数の発現モジュールの重感染の必要性を解消し、それにより多重サブユニットタンパク質複合体を生産するこの技術の現実的な商業利用を増進するものである。
Ｉ．ジェミニウイルス
ジェミニウイルスは、環状二本鎖ＤＮＡ中間体を経て複製される環状一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡゲノムを有する植物ＤＮＡウイルスの大きく多様なファミリーである。Hanley-Bowdoin et al. (1999)、Lazarowitz (1992)、Timmermans et al. (1994)を参照されたい。
特に、ジェミニウイルスは、グラム陽性菌のｓｓＤＮＡプラスミドによって用いられるものと類似のローリングサークル機構を介して複製する。複製に必要とされる唯一の外因性タンパク質は、ジェミニウイルスレプリカーゼ遺伝子によってコードされるウイルス複製開始（Ｒｅｐ）タンパク質である。この多機能タンパク質は、ウイルスの複製起点において見られる保存されたステムループ構造で、遺伝子間ループ配列中に見られる保存されたノナヌクレオチドモチーフ（ＴＡＡＴＡＴＴＡ↓Ｃ）内にニックを誘発することによって複製を開始する。ウイルスゲノムの転写は、初期の遺伝子間（ＩＲ）領域内での転写と双方向性である。Ｒｅｐはまた、植物細胞周期の制御に関わり、おそらくはＤＮＡ複製に関与する宿主遺伝子の調節にも関わる機能を有する（Palmer et al., 1997bによって概説される）。Ｒｅｐタンパク質はトランスに作用することができる、すなわちウイルスレプリコン自体によって発現される必要はなく、別の染色体外ウイルスレプリコンから、又はさらには核導入遺伝子から供給される場合もある（Hanley-Bowdoin et al., 1990）。ウイルス複製に関するシス要件は、ローリングサークル複製（マストレウイルスの長い遺伝子間領域（ＬＩＲ）、又は他のジェミニウイルスの遺伝子間領域）及び相補鎖の合成（マストレウイルスの短いＩＲ（ＳＩＲ））の開始に不可欠な配列を含有するウイルス遺伝子間領域（regioin/s）（ＩＲ）である。
ジェミニウイルスのＲｅｐタンパク質に固有のニッキング機能（Laufs et al., 1995a、Laufs et al., 1995b）は、ＬＩＲのタンデムリピートの間にクローニングした組み換えウイルスＤＮＡの、染色体に組み込まれた部位からの複製放出を可能にする（Hayes et al., 1988、Grimsley et al., 1987、Kanevski et al., 1992）。次いで、ＤＮＡはエピソームとして核内で複製される。ジェミニウイルスレプリコンのこれらの特性から安定なトランスジェニックベクターの開発が可能となるが、この場合、ジェミニウイルスレプリコンのエピソーム複製性及び高コピー数によって導入遺伝子発現の位置効果が失われ、安定な形質転換植物における高い標的タンパク質発現レベルが保証される。以前の研究から、安定なトランスジェニックジャガイモにおいて誘導プロモーターによって誘導されたＲｅｐと同時発現させた、これまでのバージョンのインゲン黄化萎縮ウイルス由来ベクターが、ｍＲＮＡ発現において８０倍の増大をもたらし、トランスジェニックタンパク質発現において１０倍の増大をもたらしたことが実際に示された（Zhang and Mason, 2006）。この証拠によって、大規模ＰＭＰ生産のための高発現の安定なトランスジェニックベクターを開発するために、現在の改良されたバージョンのレプリコンを用いる際の成功の可能性のさらなる根拠となりうる。一時的及び安定なトランスジェニック技術の両方における改良されたレプリコンベクターの利用はしたがって、医薬品候補の迅速な評価及び商業生産のための拡張可能なプラットフォームを可能にする。
ＩＩ．核酸
本発明は、プロモーター及び対象となる産物をコードする領域を含む第１の核酸セグメントであって、該対象となる産物をコードする領域のいずれかの側に、ジェミニウイルスゲノムの長い遺伝子間領域（ＬＩＲ）の少なくとも一部が隣接する、第１の核酸セグメント、並びにプロモーター及びジェミニウイルスゲノムのＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質をコードする核酸を含む第２の核酸セグメントを含む１つ又は複数のベクターを含む植物発現ベクターに関する。ベクターはまた、上に記載されるものを含むが、それらに限定されない様々な付加的成分を含み得る。
「核酸」という用語は当該技術分野において既知である。本願において使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、組み換え型であるか、又は全ゲノム核酸から単離された核酸分子を指す。「ポリヌクレオチド」という用語には、オリゴヌクレオチド（長さが１００残基以下の核酸）、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等を含む組み換えベクターが含まれる。或る特定の態様では、ポリヌクレオチドは、その天然の遺伝子又はタンパク質コード配列から実質的に単離された調節配列を含む。ポリヌクレオチドはＲＮＡ、ＤＮＡ、それらの類似体又はそれらの組み合わせであり得る。
あらゆるタイプの遺伝子を本発明のベクター系によって発現させることができる。この点で、「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、タンパク質、ポリペプチド又はペプチド（正確な転写、翻訳後修飾又は局在化に必要とされる任意の配列を含む）をコードする核酸を指すために使用される。当業者によって理解されるように、この用語は、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質及び変異体を発現するか、又は発現するのに適している可能性があるゲノム配列、発現カセット、ｃＤＮＡ配列及びより小さい人工核酸セグメントを包含する。ポリペプチドの全部又は一部をコードする核酸は、以下の長さのかかるポリペプチドの全部又は一部をコードする連続した核酸配列を含有し得る：１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、２６０個、２７０個、２８０個、２９０個、３００個、３１０個、３２０個、３３０個、３４０個、３５０個、３６０個、３７０個、３８０個、３９０個、４００個、４１０個、４２０個、４３０個、４４０個、４４１個、４５０個、４６０個、４７０個、４８０個、４９０個、５００個、５１０個、５２０個、５３０個、５４０個、５５０個、５６０個、５７０個、５８０個、５９０個、６００個、６１０個、６２０個、６３０個、６４０個、６５０個、６６０個、６７０個、６８０個、６９０個、７００個、７１０個、７２０個、７３０個、７４０個、７５０個、７６０個、７７０個、７８０個、７９０個、８００個、８１０個、８２０個、８３０個、８４０個、８５０個、８６０個、８７０個、８８０個、８９０個、９００個、９１０個、９２０個、９３０個、９４０個、９５０個、９６０個、９７０個、９８０個、９９０個、１０００個、１０１０個、１０２０個、１０３０個、１０４０個、１０５０個、１０６０個、１０７０個、１０８０個、１０９０個、１０９５個、１１００個、１５００個、２０００個、２５００個、３０００個、３５００個、４０００個、４５００個、５０００個、５５００個、６０００個、６５００個、７０００個、７５００個、８０００個、９０００個、１００００個又はそれ以上の本発明のポリペプチドのヌクレオチド、ヌクレオシド又は塩基対。特定のポリペプチドが、わずかに異なる核酸配列を有するにもかかわらず、同じ又は実質的に同様のタンパク質をコードする、変異を含有する核酸によってコードされ得ることも考えられる。
本発明において使用される核酸セグメントは、コード配列自体の長さに関わらず、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、付加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、他のコードセグメント等といった他の核酸配列と組み合わせて、それらの全体の長さが大幅に異なるようにしてもよい。したがって、ほとんど全ての長さの核酸断片を利用することができるが、全長は好ましくは作製の容易さ及び意図される組み換え核酸プロトコルにおける使用によって限定されることが考えられる。場合によっては、核酸配列は、例えばポリペプチドの精製、輸送、分泌、翻訳後修飾を可能にするため、又は標的化若しくは効力等の治療的有用性のために、付加的な異種コード配列を有するポリペプチド配列をコードし得る。上記で論考されるように、タグ又は他の異種ポリペプチドを、修飾ポリペプチドをコードする配列に付加してもよく、ここで「異種」とは修飾ポリペプチドとは同じでないポリペプチドを指す。
本発明の核酸構築物が、任意の供給源からの完全長ポリペプチドをコードし得るか、又はコード領域の転写産物が切断バージョンを表すように切断バージョンのポリペプチドをコードし得ることが考えられる。切断転写産物は次に切断タンパク質に翻訳され得る。代替的には、核酸配列は、例えばポリペプチドの精製、輸送、分泌、翻訳後修飾を可能にするため、又は標的化若しくは効力等の治療的有用性のために、付加的な異種コード配列を有する完全長ポリペプチド配列をコードし得る。上記で論考されるように、タグ又は他の異種ポリペプチドを、修飾ポリペプチドをコードする配列に付加してもよく、ここで「異種」とは修飾ポリペプチドとは同じでないポリペプチドを指す。
非限定的な例では、対象となる産物等の特定の遺伝子と同一又は相補的なヌクレオチドの連続ストレッチを含む１つ又は複数の核酸構築物を調製してもよい。核酸構築物は少なくとも２０ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、６０ヌクレオチド長、７０ヌクレオチド長、８０ヌクレオチド長、９０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、１１０ヌクレオチド長、１２０ヌクレオチド長、１３０ヌクレオチド長、１４０ヌクレオチド長、１５０ヌクレオチド長、１６０ヌクレオチド長、１７０ヌクレオチド長、１８０ヌクレオチド長、１９０ヌクレオチド長、２００ヌクレオチド長、２５０ヌクレオチド長、３００ヌクレオチド長、４００ヌクレオチド長、５００ヌクレオチド長、６００ヌクレオチド長、７００ヌクレオチド長、８００ヌクレオチド長、９００ヌクレオチド長、１０００ヌクレオチド長、２０００ヌクレオチド長、３０００ヌクレオチド長、４０００ヌクレオチド長、５０００ヌクレオチド長、６０００ヌクレオチド長、７０００ヌクレオチド長、８０００ヌクレオチド長、９０００ヌクレオチド長、１００００ヌクレオチド長、１５０００ヌクレオチド長、２００００ヌクレオチド長、３００００ヌクレオチド長、５００００ヌクレオチド長、１０００００ヌクレオチド長、２５００００ヌクレオチド長、５０００００ヌクレオチド長、７５００００ヌクレオチド長〜少なくとも１００００００ヌクレオチド長、並びに酵母人工染色体等の核酸構築物の出現が当業者に既知であると仮定すると、染色体サイズまでのより大きなサイズの構築物（中間の長さ及び中間の範囲の全てを含む）であり得る。「中間の長さ」及び「中間の範囲」は本明細書中で使用される場合、引用の値を含むか、又は引用の値の間の任意の長さ又は範囲（すなわち、かかる値を含み、かかる値の間の全ての整数）を意味することが容易に理解される。
本発明において使用されるＤＮＡセグメントは、生物学的に機能的な等価の修飾ポリペプチド及びペプチドを包含する。核酸配列及びこのようにしてコードされるタンパク質内に天然に生じることが知られる、かかる配列はコドンの冗長性及び機能的等価性の結果として生じる。代替的には、機能的に等価なタンパク質又はペプチドは、組み換えＤＮＡ技術を適用することによって作り出すことができるが、ここで、タンパク質構造における変化は、交換されるアミノ酸の特性の考察に基づいて操作することができる。例えばタンパク質の抗原性の向上を生じさせるため、タンパク質が与えられる被験体へのｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質の毒性効果を減少させるため、又はタンパク質を含む任意の治療の効力を増大させるために、人工的に設計される変化を、部位特異的突然変異誘発法の適用によって導入することができる。
本発明が対象となる産物をコードするポリヌクレオチドの特定の核酸及びアミノ酸配列に限定されないことも理解されよう。したがって、組み換えベクター及び単離されたＤＮＡセグメントは、対象となる産物自体のコード領域（基本コード領域中に選択された変化又は修飾を有するコード領域）を様々に含んでいても、又はより大きいポリペプチド（ただし対象となる産物のコード領域を含む）をコードしていても、又は変異体アミノ酸配列を有する、生物学的に機能的な等価のタンパク質若しくはペプチドをコードしていてもよい。
必要に応じて、例えば対象となる産物のコード領域が、例えば精製目的又は免疫検出目的で所望の機能を有する他のタンパク質又はペプチドと同じ発現単位内で並んでいる、融合タンパク質及びペプチド（例えば、アフィニティークロマトグラフィー及び酵素標識コード領域のそれぞれによって精製することができるタンパク質）を調製してもよい。
例えば約１５アミノ酸長〜約５０アミノ酸長、より好ましくは約１５アミノ酸長〜約３０アミノ酸長のペプチドといった比較的小さいペプチドをコードするＤＮＡセグメント、及びさらに対象となる産物に対する完全長の公開配列に相当するタンパク質までの、より大きいポリペプチドも本発明の或る特定の実施形態に包含される。
機能的核酸分子、例えばハイブリダイゼーションプローブ；増幅プライマー；ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ若しくはアンチセンス分子；リボザイム；又はＲＮＡアプタマーをコードするＤＮＡセグメントも本発明の或る特定の実施形態に包含される。特定の実施形態では、これらの機能的核酸分子は、対象となる産物のアミノ酸配列をコードする核酸配列の全部又は一部と同一又は相補的である。他の実施形態では、これらの機能的核酸分子は、対象となる産物の非コード領域の転写産物、又は対象となる産物のＲＮＡ若しくはタンパク質の効率的な発現に必要とされる核酸「制御配列」と同一又は相補的である。
これらの定義は概して、一本鎖分子を指すが、具体的な実施形態では、その一本鎖分子に部分的、実質的又は完全に相補的なさらなる鎖も包含する。したがって、核酸は、分子を含む特定の配列の相補鎖又は「相補体」を含む二本鎖分子を包含し得る。特定の態様では、核酸はタンパク質若しくはポリペプチド、又はその一部をコードする。
Ａ．核酸ベクター
特定の実施形態では、本発明は、対象となる産物をコードするＤＮＡ配列を組み込んだ単離されたＤＮＡセグメント及び組み換えベクターに関する。「組み換え型」という用語は、ポリペプチド又は具体的なポリペプチドの名称と共に使用され得るが、概して核酸分子から産生される、ｉｎ ｖｉｔｒｏで操作されているか、又はかかる分子の複製産物であるポリペプチドを指す。
「ベクター」という用語は、それを複製し、発現させることができる細胞へ導入するために異種核酸配列を挿入することができる担体核酸分子を指すために使用される。核酸配列は「異種」であってもよく、これは細胞又は核酸中の配列と相同であるが、それが通常は見られない宿主細胞又は核酸内の位置にある配列を含む、ベクターが導入される細胞又はベクターが取り込まれる核酸とは異なる状況下にあることを意味する。ベクターはＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス及び植物ウイルス）、並びに人工染色体（例えばＹＡＣ）を含む。当業者は、ベクターを標準的な組み換え技法（例えば、Sambrook et al., 2001、Ausubel et al., 1996（どちらも参照により本明細書中に援用される））によって構築するのに十分な能力を備えているだろう。かかる融合タンパク質をコードする有用なベクターは、ｐＩＮベクター（Inouye et al., 1985）、ヒスチジンのストレッチをコードするベクター、及びその後の精製及び分離又は切断のためにグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）可溶性融合タンパク質を作製するのに使用されるｐＧＥＸベクターを含む。
「発現ベクター」という用語は、転写することが可能な遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含有するベクターを指す。場合によっては、ＲＮＡ分子はその後タンパク質、ポリペプチド又はペプチドに翻訳される。他の場合では、これらの配列は、例えばアンチセンス分子又はリボザイムの産生において翻訳されない。発現ベクターは様々な「制御配列」を含有し得るが、これは特定の宿主生物における操作可能に（operably）連結したコード配列の転写及び場合により翻訳に必要とされる核酸配列を指す。ベクター及び発現ベクターは、転写及び翻訳を支配する制御配列に加えて、その他の機能を果たし、以下に記載される核酸配列を含有してもよい。
１．プロモーター及びエンハンサー
「プロモーター」とは、転写の開始及び速度を制御する核酸配列の領域である制御配列である。プロモーターは、調節タンパク質及び分子がＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子等と結合し得る遺伝要素を含有する場合もある。「動作可能に（operatively）位置する」、「動作可能に連結した」、「制御下で」及び「転写制御下で」という表現は、プロモーターが核酸配列に対して、その配列の転写開始及び／又は発現を制御する上で正確な機能的位置及び／又は方向にあることを意味する。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用調節配列を指す「エンハンサー」と併用されても、又は併用されなくてもよい。
プロモーターは、コードセグメント及び／又はエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得ることができる、遺伝子又は配列に天然に付随するプロモーターであってもよい。かかるプロモーターは「内在性」と称することができる。同様に、エンハンサーは、その配列の下流又は上流に位置する核酸配列に天然に付随するものであってもよい。代替的には、コード核酸セグメントを、組み換え型又は異種プロモーター（これらはその自然な環境で通常は核酸配列に付随していないプロモーターを表す）の制御下に位置付けることによって、或る特定の利点が得られる。組み換え型又は異種エンハンサーとはまた、その自然な環境で通常は核酸配列に付随していないエンハンサーを指す。かかるプロモーター又はエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、及び任意の他の原核細胞、ウイルス細胞又は真核細胞から単離されたプロモーター又はエンハンサー、及び「天然」でない、すなわち異なる転写調節領域の異なる要素、及び／又は発現を変化させる突然変異を含有するプロモーター又はエンハンサーを含み得る。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に生産することに加えて、配列は、本明細書中で開示される組成物に関連する、組み換えクローニング及び／又はＰＣＲ（商標）を含む核酸増幅技術を用いて生産することができる（米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号（各々参照により本明細書中に援用される）を参照されたい）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体等の非核細胞小器官内の配列の転写及び／又は発現を誘導する制御配列も同様に利用することができると考えられる。
当然ながら、発現のために選択される細胞型、細胞小器官及び生物において、ＤＮＡセグメントの発現を効率的に誘導するプロモーター及び／又はエンハンサーを利用することが重要であり得る。分子生物学の技術分野の当業者には、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー及び細胞型の組み合わせの使用が一般に知られており、例えばSambrook et al. (1989)（参照により本明細書中に援用される）を参照されたい。利用されるプロモーターは構成的、組織特異的、誘導性であり、及び／又は組み換えタンパク質及び／又はペプチドの大規模生産において有益であるように、導入されるＤＮＡセグメントの高レベル発現を誘導するのに適切な条件下で有用であり得る。プロモーターは異種であっても、又は内在性であってもよい。
組織特異的プロモーター又は要素の固有性（identity）、及びそれらの活性を特性化するアッセイは当業者に既知である。かかる領域の例としては、ヒトＬＩＭＫ２遺伝子（Nomoto et al. 1999）、ソマトスタチン受容体２遺伝子（Kraus et al., 1998）、マウス精巣上体レチノイン酸結合遺伝子（Lareyre et al., 1999）、ヒトＣＤ４（Zhao-Emonet et al., 1998）、マウスα２（ＸＩ）コラーゲン（Tsumaki, et al., 1998）、Ｄ１Ａドーパミン受容体遺伝子（Lee, et al., 1997）、インスリン様成長因子ＩＩ（Wu et al., 1997）、ヒト血小板内皮細胞接着分子−１（Almendro et al., 1996）及びＳＭ２２αプロモーターに関連する制御配列が挙げられる。
開始シグナル及び内部リボソーム結合部位
特異的な開始シグナルもコード配列の効率的な翻訳に必要とされ得る。これらのシグナルはＡＴＧ開始コドン又は隣接配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを提供する必要があり得る。当業者であれば、容易にこれを決定し、必要なシグナルを提供することが可能であるだろう。開始コドンは、挿入断片全体の翻訳を保証するために、所望のコード配列のリーディングフレームと「インフレーム」でなくてはならないことが知られている。外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは天然又は合成のいずれであってもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素を組み入れることによって増進することができる。
本発明の或る特定の実施形態では、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）要素は、多重遺伝子又は多シストロン性メッセージを作り出すために使用される。ＩＲＥＳ要素は、５’メチル化キャップ依存的翻訳のリボソーム走査モデルを回避し、内部部位で翻訳を開始することが可能である（Pelletier and Sonenberg, 1988）。ピコルナウイルス科の２つの成員（ポリオ及び脳心筋炎）に由来するＩＲＥＳ要素（Pelletier and Sonenberg, 1988）、並びに哺乳動物メッセージに由来するＩＲＥＳ（Macejak and Sarnow, 1991）が記載されている。ＩＲＥＳ要素は、異種オープンリーディングフレームと連結させることができる。各々がＩＲＥＳによって隔てられた複数のオープンリーディングフレームを、共に転写させ、多シストロン性メッセージを作り出すことができる。ＩＲＥＳ要素によって、各々のオープンリーディングフレームは効率的な翻訳のためにリボソームにとって利用しやすいものとなる。複数の遺伝子を、単一のメッセージを転写する単一のプロモーター／エンハンサーを用いて効率的に発現させることができる（米国特許第５，９２５，５６５号及び同第５，９３５，８１９号（参照により本明細書中に援用される）を参照されたい）。
２．多重クローニング部位
ベクターは複数の制限酵素部位を含有する核酸領域である多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含んでいてもよく、そのいずれもベクターを消化する標準的な組み換え技術と共に用いてもよい（Carbonelli et al., 1999、Levenson et al., 1998及びCocea, 1997（参照により本明細書中に援用される）を参照されたい）。「制限酵素での消化」とは、核酸分子中の特異的な位置でのみ機能する酵素による核酸分子の触媒的切断を指す。これらの制限酵素の多くが商業的に利用可能である。かかる酵素の使用は当業者に広く理解されている。しばしば、ベクターは、外因性配列をベクターにライゲートさせるために、ＭＣＳ内で切断する制限酵素を用いて線形化又は断片化される。「ライゲーション」とは、互いに連続していても、又はしていなくてもよい２つの核酸断片間にホスホジエステル結合を形成するプロセスを指す。制限酵素及びライゲーション反応を含む技法が、組み換え技術の技術分野の当業者に既知である。
３．スプライシング部位
転写された真核ＲＮＡ分子の大部分は、イントロンを一次転写産物から除去するＲＮＡスプライシングを受ける。ゲノム真核配列を含有するベクターは、タンパク質発現のための転写産物の正確なプロセシングを保証するため、ドナー及び／又はアクセプタスプライシング部位を必要とし得る（Chandler et al., 1997（参照により本明細書中に援用される）を参照されたい）。
４．終結シグナル
本発明のベクター又は構築物は概して、少なくとも１つの終結シグナルを含む。「終結シグナル」又は「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の特異的な終結に関与するＤＮＡ配列からなる。したがって、或る特定の実施形態では、ＲＮＡ転写産物の産生を終了させる終結シグナルが考えられる。ターミネーターは、ｉｎ ｖｉｖｏで望ましいメッセージレベルを達成するために必要とされ得る。
真核系では、ターミネーター領域は、ポリアデニル化部位を露出させるように、新たな転写産物の部位特異的切断を可能とする特異的なＤＮＡ配列も含み得る。これは、特殊化した内在性ポリメラーゼに、約２００個のＡ残基のストレッチ（ポリＡ）を転写産物の３’末端に付加するよう信号を送る。このポリＡテールによって修飾されたＲＮＡ分子は、より安定であると考えられ、より効率的に翻訳される。したがって、真核生物を含む他の実施形態では、ターミネーターがＲＮＡを切断するシグナルを含むのが好ましく、ターミネーターシグナルがメッセージのポリアデニル化を促進するのがより好ましい。ターミネーター及び／又はポリアデニル化部位要素は、メッセージレベルを増進する、及び／又はカセットから他の配列への読み過しを最小限に抑える働きをし得る。
本発明に使用することが考えられるターミネーターとしては、本明細書中に記載されるか又は当業者に既知である転写の任意の既知のターミネーターが挙げられ、例えば遺伝子の終結配列（例えばウシ成長ホルモンターミネーター等）又はウイルス終結配列（例えばＳＶ４０ターミネーター等）が挙げられるが、これらに限定されない。或る特定の実施形態では、終結シグナルは、例えば配列切断（truncation）による転写可能な又は翻訳可能な配列の欠如であってもよい。
５．ポリアデニル化シグナル
発現、特に真核生物の発現においては、転写産物の正確なポリアデニル化を達成するために、典型的にはポリアデニル化シグナルを組み入れる。ポリアデニル化シグナルの性質は本発明の実施の成功にはあまり重要でないと考えられ、及び／又はかかる配列のいずれも利用することができる。好ましい実施形態としては、好都合であり、及び／又は様々な植物標的細胞において十分に機能することが知られる、ダイズ栄養貯蔵タンパク質（ｖｓｐＢ）ポリアデニル化シグナル及び／又はエンドウマメＲｕＢＰカルボキシラーゼ小サブユニット（ｒｂｃＳ）ポリアデニル化シグナルが挙げられる。ポリアデニル化は転写産物の安定性を増大させるか、又は細胞質輸送を促進し得る。
６．複製起点
宿主細胞にベクターを伝播させるために、ベクターは複製が開始される特異的な核酸配列である１つ又は複数の複製起点部位（多くの場合、「ｏｒｉ」と称される）を含有してもよい。代替的には、宿主細胞が酵母である場合には自己複製配列（ＡＲＳ）を利用することができる。
７．選択可能及びスクリーニング可能なマーカー
本発明の或る特定の実施形態では、本発明の核酸構築物を含有する細胞は、マーカーを発現ベクターに組み入れることによってｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで同定することができる。かかるマーカーは、識別可能な変化を細胞に与え、発現ベクターを含有する細胞の容易な同定を可能にするものであり得る。概して、選択可能なマーカーとは選択を可能にする特性を与えるものである。ポジティブ選択可能なマーカーとはマーカーの存在によりその選択が可能となるものであり、ネガティブ選択可能なマーカーとはその存在によってその選択が妨げられるものである。ポジティブ選択可能なマーカーの一例は薬剤耐性マーカーである。
通常、薬剤選択マーカーを組み入れることは、形質転換体のクローニング及び同定に役立ち、例えばネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン及びヒスチジノールに対する耐性を与える遺伝子が、有用な選択可能なマーカーである。条件の導入に基づいて形質転換体の区別を可能にする表現型を与えるマーカーに加えて、ＧＦＰ等のスクリーニング可能なマーカーを含む他のタイプのマーカー（選択は比色分析に基づく）も考えられる。代替的には、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等のスクリーニング可能な酵素を利用することができる。当業者であれば、免疫学的マーカーを、場合によりＦＡＣＳ分析と関連して利用する方法も知っているだろう。使用されるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることが可能な限り、重要ではないと考えられる。選択可能及びスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者に既知である。
Ｂ．宿主細胞
本発明のベクターは、対象となる産物を産生させるために宿主細胞において使用することができる。特に（The particular）、本発明のベクターは植物細胞であり得る。本明細書中で使用される場合、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」という用語は互換可能に使用され得る。これらの用語は全て、その後のあらゆる世代であるそれらの子孫も含む。全ての子孫が意図的又は偶発的な突然変異のために同一でない場合もあることが理解される。異種核酸配列を発現するという文脈内で、「宿主細胞」とは原核細胞又は真核細胞を指し、ベクターを複製し及び／又はベクターによってコードされる異種遺伝子を発現することが可能な、任意の形質転換可能な生物を含む。宿主細胞はベクターのレシピエントとして使用することができ、また使用されてきた。宿主細胞は、「トランスフェクト」又は「形質転換」（修飾タンパク質をコードするか又は機能的核酸をコードする配列等の外因性核酸を、宿主細胞に移入又は導入するプロセスを指す）されていてもよい。形質転換細胞は初代被験細胞及びその子孫を含む。
宿主細胞は、所望の結果がベクターの複製であるか、又はベクターにコードされた核酸配列の一部若しくは全ての発現であるかに応じて、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞を含む原核生物又は真核生物に由来し得る。多数の細胞株及び培養物が宿主細胞としての使用に利用可能であり、生きた培養物及び遺伝物質のアーカイブとして働く機関であるアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から得ることができる（www.atcc.org）。当業者は適切な宿主を、ベクター骨格及び所望の結果に基づいて決定することができる。例えば、プラスミド又はコスミドを多くのベクターの複製のために原核生物宿主細胞に導入することができる。ベクターの複製及び／又は発現のための宿主細胞として使用される細菌細胞には、ＤＨ５α、ＪＭ１０９及びＫＣ８、並びにＳＵＲＥ（登録商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ及びＳＯＬＯＰＡＣＫ（商標）Ｇｏｌｄ Ｃｅｌｌｓ（STRATAGENE（登録商標），La Jolla，CA）といった多数の商業的に利用可能な細菌宿主が含まれる。代替的には、大腸菌ＬＥ３９２等の細菌細胞をファージウイルス用の宿主細胞として使用してもよい。適切な酵母細胞としては、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）が挙げられる。
ベクターの複製及び／又は発現のための真核宿主細胞の例としては、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、ジャーカット、２９３、Ｃｏｓ、ＣＨＯ、Ｓａｏｓ、Ｓｆ９及びＰＣ１２が挙げられる。様々な細胞型及び生物に由来する多くの宿主細胞が利用可能であり、当業者に既知である。同様に、ウイルスベクターは真核又は原核のいずれかの宿主細胞、特にベクターの複製又は発現を許容するものと併用してもよい。
一部のベクターは、それが原核及び真核の両方の細胞において複製及び／又は発現されるのを可能にする制御配列を利用し得る。当業者は、上記の宿主細胞の全てをインキュベートして、それらを維持する条件、及びベクターの複製を可能にする条件をさらに理解するだろう。ベクターの大規模生産、並びにベクターによってコードされる核酸及びそれらの同族ポリペプチド、タンパク質又はペプチドの生産を可能にする技法及び条件も理解され、既知である。
Ｃ．発現系
上記で論考される組成物の少なくとも一部又は全部を含む多数の発現系が存在する。原核生物及び／又は真核生物ベースの系を、核酸配列、又はその同族ポリペプチド、タンパク質及びペプチドを産生させる目的で本発明で用いるために利用することができる。かかる系の多くが商業的に広く入手可能である。
昆虫細胞／バキュロウイルス系は、米国特許第５，８７１，９８６号、同第４，８７９，２３６号（どちらも参照により本明細書中に援用される）に記載されるような異種核酸セグメントの高レベルのタンパク質発現をもたらすことができ、例えばINVITROGEN（登録商標）からＭＡＸＢＡＣ（登録商標）２．０、CLONTECH（登録商標）からＢＡＣＰＡＣＫ（商標）バキュロウイルス発現系という名で購入することができる。
本発明の開示の発現系に加えて、発現系の他の例としては、合成エクジソン誘導性受容体を含む、STRATAGENE（登録商標）のＣＯＭＰＬＥＴＥ ＣＯＮＴＲＯＬ（商標）誘導性哺乳動物発現系、又はそのｐＥＴ発現系、大腸菌発現系が挙げられる。誘導性発現系の別の例は、INVITROGEN（登録商標）から入手可能な、完全長ＣＭＶプロモーターを用いる誘導性哺乳動物発現系である、Ｔ−ＲＥＸ（商標）（テトラサイクリン調節発現）系を保有するものがある。INVITROGEN（登録商標）は、メチロトローフ酵母ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）における組み換えタンパク質の高レベル生産のために設計したピキア・メタノリカ発現系と呼ばれる酵母発現系も提供している。当業者であれば、核酸配列又はその同族ポリペプチド、タンパク質若しくはペプチドを産生させるために、発現構築物等のベクターを発現させる方法を知っているだろう。
１．ウイルスベクター
発現ベクターを細胞に導入することができる多数の方法がある。本発明の或る特定の実施形態では、発現ベクターはウイルス、又はウイルスゲノムに由来する人工ベクターを含む。受容体媒介性エンドサイトーシスを介して細胞に侵入する能力、宿主細胞ゲノムに組み込まれて、ウイルス遺伝子を安定かつ効率的に発現する能力を有するようなウイルスが、哺乳動物細胞への外来遺伝子の移入にとって魅力的な候補となる（Ridgeway, 1988、Nicolas and Rubinstein, 1988、Baichwal and Sugden, 1986、Temin, 1986）。遺伝子ベクターとして使用された最初のウイルスは、パポバウイルス（シミアンウイルス４０、ウシ乳頭腫ウイルス及びポリオーマ）（Ridgeway, 1988、Baichwal and Sugden, 1986）、並びにアデノウイルス（Ridgeway, 1988、Baichwal and Sugden, 1986）を含むＤＮＡウイルスであった。これらは、外来ＤＮＡ配列に対する容量が比較的小さく、宿主範囲（host spectrum）が限られている。さらに、許容細胞におけるそれらの発癌能及び細胞変性効果は、安全性に対する懸念を引き起こしている。これらは８ｋｂの外来遺伝物質までしか収容することができないが、様々な細胞株及び実験動物に容易に導入することができる（Nicolas and Rubinstein, 1988、Temin, 1986）。
レトロウイルスは、感染細胞においてそれらのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換する能力を特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルスの群であり、これらもベクターとして使用することができる。他のウイルスベクターを本発明において発現構築物として利用してもよい。ベクターは、ワクシニアウイルス（Ridgeway, 1988、Baichwal and Sugden, 1986、Coupar et al., 1988）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ridgeway, 1988、Baichwal and Sugden, 1986）に由来し得る。上記で論考される組成物の少なくとも一部又は全部を含む多数の発現系が存在する。原核生物及び／又は真核生物ベースの系を、核酸配列、又はその同族ポリペプチド、タンパク質及びペプチドを産生させる目的で本発明で用いるために利用することができる。かかる系の多くが商業的に広く入手可能である。
昆虫細胞／バキュロウイルス系は、米国特許第５，８７１，９８６号、同第４，８７９，２３６号（どちらも参照により本明細書中に援用される）に記載されるような異種核酸セグメントの高レベルのタンパク質発現をもたらすことができ、例えばINVITROGEN（登録商標）からＭＡＸＢＡＣ（登録商標）２．０、CLONTECH（登録商標）からＢＡＣＰＡＣＫ（商標）バキュロウイルス発現系という名で購入することができる。
本発明の開示の発現系に加えて、発現系の他の例としては、合成エクジソン誘導性受容体を含む、STRATAGENE（登録商標）のＣＯＭＰＬＥＴＥ ＣＯＮＴＲＯＬ（商標）誘導性哺乳動物発現系、又はそのｐＥＴ発現系、大腸菌発現系が挙げられる。誘導性発現系の別の例は、INVITROGEN（登録商標）から入手可能な、完全長ＣＭＶプロモーターを用いる誘導性哺乳動物発現系である、Ｔ−ＲＥＸ（商標）（テトラサイクリン調節発現）系を保有するものがある。INVITROGEN（登録商標）は、メチロトローフ酵母ピキア・メタノリカにおける組み換えタンパク質の高レベル生産のために設計したピキア・メタノリカ発現系と呼ばれる酵母発現系も提供している。当業者であれば、核酸配列又はその同族ポリペプチド、タンパク質若しくはペプチドを産生させるために、発現構築物等のベクターを発現させる方法を知っているだろう。
発現ベクターを細胞に導入することができる多数の方法がある。本発明の或る特定の実施形態では、発現ベクターはウイルス、又はウイルスゲノムに由来する人工ベクターを含む。受容体媒介性エンドサイトーシスを介して細胞に侵入する能力、宿主細胞ゲノムと一体化して、ウイルス遺伝子を安定かつ効率的に発現する能力を有するようなウイルスが、哺乳動物細胞への外来遺伝子の移入にとって魅力的な候補となっている（Ridgeway, 1988、Nicolas and Rubinstein, 1988、Baichwal and Sugden, 1986、Temin, 1986）。遺伝子ベクターとして使用された最初のウイルスは、パポバウイルス（シミアンウイルス４０、ウシ乳頭腫ウイルス及びポリオーマ）（Ridgeway, 1988、Baichwal and Sugden, 1986）、並びにアデノウイルス（Ridgeway, 1988、Baichwal and Sugden, 1986）を含むＤＮＡウイルスであった。これらは、外来ＤＮＡ配列に対する容量が比較的小さく、宿主範囲が限られている。さらに、許容細胞におけるそれらの発癌能及び細胞変性効果は、安全性に対する懸念を引き起こしている。これらは８ｋｂの外来遺伝物質までしか収容することができないが、様々な細胞株及び実験動物に容易に導入することができる（Nicolas and Rubinstein, 1988、Temin, 1986）。
レトロウイルスは、感染細胞においてそれらのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換する能力を特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルスの群であり、これらもベクターとして使用することができる。他のウイルスベクターを本発明において発現構築物として利用してもよい。ワクシニアウイルス（Ridgeway, 1988、Baichwal and Sugden, 1986、Coupar et al., 1988）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ridgeway, 1988、Baichwal and Sugden, 1986、Hermonat and Muzycska, 1984）及びヘルペスウイルス等のウイルスに由来するベクターを利用することができる。これらは様々な哺乳動物細胞に対して魅力的な幾つかの特徴を備えている（Friedmann, 1989、Ridgeway, 1988、Baichwal and Sugden, 1986、Coupar et al., 1988、Horwich et al., 1990）。
Ｄ．遺伝子移入の方法
本発明の組成物の発現を達成するための核酸送達の好適な方法は、実質的に、本明細書中に記載されるか又は当業者に既知のように、核酸（例えば、ウイルスベクター及び非ウイルスベクターを含むＤＮＡ）を細胞小器官、細胞、組織又は生物体に導入することができる任意の方法を含むと考えられる。かかる方法としては、注入（米国特許第５，９９４，６２４号、同第５，９８１，２７４号、同第５，９４５，１００号、同第５，７８０，４４８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，７０２，９３２号、同第５，６５６，６１０号、同第５，５８９，４６６号及び同第５，５８０，８５９号（各々参照により本明細書中に援用される））、例えばマイクロインジェクション（Harland and Weintraub, 1985、米国特許第５，７８９，２１５号（参照により本明細書中に援用される））；電気穿孔（米国特許第５，３８４，２５３号（参照により本明細書中に援用される））；リン酸カルシウム沈殿（Graham and Van Der Eb, 1973、Chen and Okayama, 1987、Rippe et al., 1990）；ＤＥＡＥ−デキストラン及びその後のポリエチレングリコールの使用（Gopal, 1985）；直接音波負荷（direct sonic loading）（Fechheimer et al., 1987）；リポソーム媒介トランスフェクション（Nicolau and Sene, 1982、Fraley et al., 1979、Nicolau et al., 1987、Wong et al., 1980、Kaneda et al., 1989、Kato et al., 1991）；微粒子銃（ＰＣＴ出願の国際公開第９４／０９６９９号及び同第９５／０６１２８号、米国特許第５，６１０，０４２号、同第５，３２２，７８３号、同第５，５６３，０５５号、同第５，５５０，３１８号、同第５，５３８，８７７号及び同第５，５３８，８８０号（各々参照により本明細書中に援用される））；炭化ケイ素繊維との攪拌（Kaeppler et al., 1990、米国特許第５，３０２，５２３号及び同第５，４６４，７６５号（各々参照により本明細書中に援用される））；アグロバクテリウム媒介形質転換（米国特許第５，５９１，６１６号及び同第５，５６３，０５５号（各々参照により本明細書中に援用される））；プロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換（Omirulleh et al., 1993、米国特許第４，６８４，６１１号及び同第４，９５２，５００号（各々参照により本明細書中に援用される））又は乾燥／阻害媒介ＤＮＡ取り込み（Potrykus et al., 1985）等によるＤＮＡの直接送達が挙げられるが、これらに限定されない。これらのような技法を適用することによって、細胞小器官（複数可）、細胞（複数可）、組織（複数可）又は生物（複数可）を安定に又は一時的に形質転換することができる。
Ｅ．核酸の調製
本発明の一態様は、単離された核酸セグメント、及び植物細胞において対象となる産物を産生させる際のそれらの使用に関する。或る特定の実施形態では、本発明は、本発明のタンパク質、ポリペプチド、ペプチドをコードする核酸に関する。核酸は、例えば化学合成、酵素的産生又は生物学的産生といった当業者に既知の任意の技法によって作製することができる。合成核酸（例えば合成オリゴヌクレオチド）の非限定的な例としては、欧州特許第２６６０３２号（参照により本明細書中に援用される）に記載されるようなリン酸トリエステル化学、亜リン酸エステル化学若しくはホスホラミダイト化学及び固相法を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ化学合成によって、又はFroehler et al., 1986及び米国特許第５，７０５，６２９号（各々参照により本明細書中に援用される）によって記載されるようなデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネート中間体を介して作製された核酸が挙げられる。本発明の方法では、１つ又は複数のオリゴヌクレオチドを使用することができる。オリゴヌクレオチド合成の様々な異なる機構が、例えば米国特許第４，６５９，７７４号、同第４，８１６，５７１号、同第５，１４１，８１３号、同第５，２６４，５６６号、同第４，９５９，４６３号、同第５，４２８，１４８号、同第５，５５４，７４４号、同第５，５７４，１４６号、同第５，６０２，２４４号（各々参照により本明細書中に援用される）に開示されている。
酵素的に産生される核酸の非限定的な例としては、ＰＣＲ（商標）（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号及び米国特許第４，６８２，１９５号（各々参照により本明細書中に援用される）を参照されたい）等の増幅反応、又は米国特許第５，６４５，８９７号（参照により本明細書中に援用される）に記載のオリゴヌクレオチド合成において酵素によって産生されるものが挙げられる。生物学的に産生される核酸の非限定的な例としては、細菌中で複製される組み換えＤＮＡベクター等の生細胞において産生される（すなわち、複製される）組み換え核酸が挙げられる（例えば、Sambrook et al. 2001（参照により本明細書中に援用される）を参照されたい）。
Ｆ．核酸の精製
或る特定の態様では、本発明は単離された核酸である核酸に関する。本明細書中で使用される場合、「単離された核酸」という用語は、１つ又は複数の細胞の全ゲノム核酸及び転写核酸の大部分を含まぬように単離されているか、又はそれらを別の形で含まない核酸分子（例えばＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子）を指す。或る特定の実施形態では、「単離された核酸」とは、細胞成分、又は例えば脂質若しくはタンパク質等の巨大分子、小さな生物学的分子等のｉｎ ｖｉｔｒｏ反応成分の大部分を含まぬように単離されているか、又はそれらを別の形で含まない核酸を指す。
核酸はポリアクリルアミドゲル、塩化セシウム遠心分離勾配、クロマトグラフィーカラムで、又は当業者に既知の任意の他の手段によって精製することができる（例えば、Sambrook et al., 2001（参照により本明細書中に援用される）を参照されたい）。一部の態様では、核酸は薬理学的に許容可能な核酸である。薬理学的に許容可能な組成物は当業者に既知であり、本明細書中に記載されている。
Ｇ．核酸検出
１．ハイブリダイゼーション
７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド若しくは１００ヌクレオチド、好ましくは１７ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの長さ、又は本発明の一部の態様では、最大１キロベース〜２キロベース又はそれ以上の長さのプローブ又はプライマーの使用によって、安定かつ選択的な二本鎖分子の形成が可能となる。得られるハイブリッド分子の安定性及び／又は選択性を増大させるには、長さ２０塩基超の連続ストレッチを超える相補配列を有する分子が一般に好ましい。一般に、２０ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド、又は所望に応じてさらに長い１つ又は複数の相補配列を有するハイブリダイゼーション用の核酸分子を設計するのが好まれる。かかる断片は、例えば、断片を化学的手段によって直接合成するか、又は選択された配列を組み換え産生のための組み換えベクターに導入することによって容易に調製することができる。
したがって、本発明のヌクレオチド配列は、相補的なＤＮＡ及び／又はＲＮＡのストレッチを有する二本鎖分子を選択的に形成するか、又は試料からのＤＮＡ若しくはＲＮＡの増幅のためのプライマーを提供するために使用することができる。想定される用途に応じて、標的配列に対するプローブ又はプライマーの様々な程度の選択性を達成するために様々なハイブリダイゼーション条件を利用することが望まれる。
高い選択性を必要とする用途については、典型的には、ハイブリッドを形成するために比較的高ストリンジェンシーの条件を利用することが望まれる。例えば、約５０℃〜約７０℃の温度で約０．０２Ｍ〜約０．１０ＭのＮａＣｌによってもたらされるような、比較的低塩及び／又は高温の条件が挙げられる。かかる高ストリンジェンシーの条件は、プローブ又はプライマーと鋳型又は標的鎖との間のミスマッチを、たとえあったとしてもわずかにしか許容せず、特異的な遺伝子を単離するか、又は特異的な多型を検出するのに特に好適である。概して、漸増量のホルムアミドを添加することによって、条件をよりストリンジェントに変更することができることを理解されよう。例えば、高度にストリンジェントな条件下では、フィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーションは、６５℃で０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で、６８℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄して行うことができる（Ausubel et al., 1989）。
塩濃度を増加させ、及び／又は温度を低下させることによって、条件をより低ストリンジェントに変更することができる。例えば、中ストリンジェンシーの条件は、約３７℃〜約５５℃の温度で約０．１Ｍ〜０．２５ＭのＮａＣｌによってもたらすことができ、低ストリンジェンシーの条件は、約２０℃〜約５５℃の範囲の温度で約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩によってもたらすことができる。中程度にストリンジェントな条件のような低ストリンジェントな条件下では、洗浄は例えば４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で行うことができる（Ausubel et al., 1989）。ハイブリダイゼーション条件は所望の結果に応じて容易に操作することができる。
他の実施形態では、ハイブリダイゼーションは例えば、およそ２０℃〜約３７℃の温度で５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭジチオスレイトールの条件下で達成することができる。利用される他のハイブリダイゼーション条件は、およそ４０℃〜約７２℃の範囲の温度で、およそ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含み得る。
或る特定の実施形態では、本発明の規定の配列の核酸を、ハイブリダイゼーションを測定するための標識といった適切な手段と組み合わせて利用するのが有益である。検出することが可能な蛍光リガンド、放射性リガンド、酵素リガンド又はアビジン／ビオチン等の他のリガンドを含む、多様な適切な指標手段が当該技術分野で既知である。好ましい実施形態では、放射性試薬又は他の環境的に望ましくない試薬の代わりに、蛍光標識、又はウレアーゼ、アルカリホスファターゼ若しくはペルオキシダーゼ等の酵素タグを利用するのが望まれる場合がある。酵素タグの場合、相補的な核酸を含有する試料との特異的なハイブリダイゼーションを同定する目的で、可視的又は分光光度的に検出可能な検出手段を提供するために利用することができる比色指標基質が既知である。他の態様では、特定のヌクレアーゼ切断部位が存在する場合があり、特定のヌクレオチド配列の検出は、核酸切断の存在又は非存在によって決定することができる。
概して、本明細書中に記載されるプローブ又はプライマーが、ＰＣＲと同様、発現又は対応する遺伝子の遺伝子型の検出のための溶液ハイブリダイゼーションにおける試薬として、並びに固相を利用する実施形態に有用であることが想定される。固相を含む実施形態では、試験ＤＮＡ（又はＲＮＡ）を選択されたマトリクス又は表面に吸着させるか又は別の形で固定する。この固定した一本鎖核酸を次いで、所望の条件下での選択されたプローブとのハイブリダイゼーションに供する。選択される条件は特定の状況に依存する（例えばＧ＋Ｃ含量、標的核酸のタイプ、核酸の供給源、ハイブリダイゼーションプローブのサイズ等に依存する）。対象となる特定の用途のためのハイブリダイゼーション条件の最適化は当業者に既知である。ハイブリダイズした分子を洗浄して、非特異的に結合したプローブ分子を除去した後、ハイブリダイゼーションを、結合した標識の量を測定することによって検出及び／又は定量化する。代表的な固相ハイブリダイゼーション方法は、米国特許第５，８４３，６６３号、同第５，９００，４８１号及び同第５，９１９，６２６号に開示されている。本発明の実施に際して使用することができるハイブリダイゼーションの他の方法は、米国特許第５，８４９，４８１号、同第５，８４９，４８６号及び同第５，８５１，７７２号に開示されている。本明細書のこの節で特定されたこれら及び他の参照文献の関連部分は、参照により本明細書中に援用される。
２．核酸の増幅
増幅の鋳型として使用される核酸は、細胞、組織又は他の試料から標準的な方法（Sambrook et al., 2001）に従って単離することができる。或る特定の実施形態では、分析は、鋳型核酸の実質的な精製を行って又は行わずに、全細胞又は組織ホモジネート又は生体液試料に対して行われる。核酸はゲノムＤＮＡ又は分画ＲＮＡ又は全細胞ＲＮＡであり得る。ＲＮＡを使用する場合、最初にＲＮＡを相補的なＤＮＡに変換することが望ましい場合もある。
「プライマー」という用語は、本明細書中で使用される場合、鋳型依存的プロセスにおいて新生核酸の合成を開始する（priming）ことが可能な任意の核酸を包含することが意図される。典型的には、プライマーは長さが１０塩基対〜２０塩基対及び／又は３０塩基対のオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列を利用してもよい。プライマーは二本鎖形態及び／又は一本鎖形態で提供することができるが、一本鎖形態が好ましい。
ＳＯＤ１遺伝子座、その変異体及び断片に対応する核酸に選択的にハイブリダイズするように設計したプライマー対を、選択的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で鋳型核酸と接触させる。所望の用途に応じて、プライマーに完全に相補的な配列へのハイブリダイゼーションしか可能でないような高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を選択してもよい。他の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、プライマー配列との１つ又は複数のミスマッチを含有する核酸の増幅を可能にするような低下したストリンジェンシー下で起こり得る。ハイブリダイズさせた後、鋳型−プライマー複合体を、鋳型依存的核酸合成を促進する１つ又は複数の酵素と接触させる。複数回の増幅（「サイクル」とも称される）を、十分な量の増幅産物が産生されるまで行う。
増幅産物は、検出、分析又は定量化することができる。或る特定の用途では、検出は視覚的手段によって行うことができる。或る特定の用途では、検出は化学発光、取り込まれた放射標識若しくは蛍光標識の放射性シンチグラフィー、又はさらには電気及び／又は熱インパルスシグナルを用いたシステムによる産物の間接的同定を含み得る（Affymax technology; Bellus, 1994）。
所与の鋳型試料中に存在するオリゴヌクレオチド配列を増幅するために、多数の鋳型依存的プロセスが利用可能である。最良の既知の増幅方法の１つは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号及び同第４，８００，１５９号並びにInnis et al., 1988に詳細に記載されている（各々その全体が参照により本明細書中に援用される）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ（商標）と称される）である。
別の増幅方法は、欧州特許出願公開第３２０３０８号（その全体が参照により本明細書中に援用される）に開示されるリガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）である。米国特許第４，８８３，７５０号は、プローブ対を標的配列に結合させるためのＬＣＲと同様の方法を記載している。米国特許第５，９１２，１４８号に開示される、ＰＣＲ（商標）及びオリゴヌクレオチドリガーゼアッセイ（ＯＬＡ）（下記にさらに詳細に記載される）に基づく方法も使用することができる。
本発明の実施に際して使用することができる標的核酸配列の増幅のための代替的な方法は、米国特許第５，８４３，６５０号、同第５，８４６，７０９号、同第５，８４６，７８３号、同第５，８４９，５４６号、同第５，８４９，４９７号、同第５，８４９，５４７号、同第５，８５８，６５２号、同第５，８６６，３６６号、同第５，９１６，７７６号、同第５，９２２，５７４号、同第５，９２８，９０５号、同第５，９２８，９０６号、同第５，９３２，４５１号、同第５，９３５，８２５号、同第５，９３９，２９１号及び同第５，９４２，３９１号、英国特許出願公開第２２０２３２８号、並びにＰＣＴ出願のＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５号（各々その全体が参照により本明細書中に援用される）に開示されている。ＰＣＴ出願のＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０号に記載されるＱβレプリカーゼも、本発明において増幅方法として使用することができる。
制限エンドヌクレアーゼ及びリガーゼを使用して、制限部位の一方の鎖中にヌクレオチド５’−［α−チオ］−トリホスフェートを含有する標的分子の増幅を達成する等温増幅方法も、本発明における核酸の増幅に有用であり得る（Walker et al., 1992）。米国特許第５，９１６，７７９号に開示される鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、複数回の鎖置換及び合成、すなわちニックトランスレーションを含む核酸の等温増幅を行う別の方法である。
他の核酸増幅手順は、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）及び３ＳＲを含む、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）を含む（Kwoh et al., 1989、ＰＣＴ出願の国際公開第８８／１０３１５号（それらの全体が参照により本明細書中に援用される））。欧州特許出願公開第３２９８２２号は、本発明に従って使用することができる、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を繰返し合成することを含む核酸増幅プロセスを開示している。
ＰＣＴ出願の国際公開第８９／０６７００号（その全体が参照により本明細書中に援用される）は、プロモーター領域／プライマー配列の標的一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）へのハイブリダイゼーション、その後の配列の多くのＲＮＡコピーの転写に基づく核酸配列増幅スキームを開示している。このスキームは繰り返し型ではない、すなわち得られるＲＮＡ転写産物から新たな鋳型は産生されない。他の増幅方法としては、「ＲＡＣＥ」及び「片側（one-sided）ＰＣＲ」が挙げられる（Frohman, 1990、Ohara et al., 1989）。
３．核酸の検出
任意の増幅に続いて、増幅産物を鋳型及び／又は過剰のプライマーから分離することが望ましい場合もある。一実施形態では、増幅産物は標準方法を用いたアガロース、アガロース−アクリルアミド又はポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離される（Sambrook et al., 2001）。分離した増幅産物をさらなる操作のためにゲルから切り取り、溶出させてもよい。低融点アガロースゲルを用いて、分離したバンドをゲルを加熱することによって取り出し、続いて核酸を抽出することができる。
核酸の分離は、スピンカラム及び／又は当該技術分野で既知のクロマトグラフ法によっても達成することができる。吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー及びガスクロマトグラフィー並びにＨＰＬＣを含む、本発明の実施に際して使用することができる多くの種類のクロマトグラフィーがある。
或る特定の実施形態では、増幅産物を分離して又は分離せずに可視化する。典型的な可視化方法には、エチジウムブロマイドでのゲルの染色及び紫外線下でのバンドの可視化が含まれる。代替的には、増幅産物を放射標識した又は蛍光定量的に標識したヌクレオチドによって全体的に標識した場合、分離した増幅産物をＸ線フィルムに曝露するか、又は適切な励起（excitatory）スペクトル下で可視化することができる。
一実施形態では、増幅産物の分離に続いて、標識した核酸プローブを増幅したマーカー配列と接触させる。プローブは発色団と複合体形成させるのが好ましいが、放射標識してもよい。別の実施形態では、プローブを、抗体又はビオチン、又は検出可能部分を保有する別の結合パートナー等の結合パートナーと複合体形成させる。
特定の実施形態では、検出は標識プローブを用いたサザンブロット法及びハイブリダイゼーションによって行う。サザンブロット法に関する技法は当業者に既知である（Sambrook et al., 2001を参照されたい）。その一例は、自動電気泳動及び核酸の移入のための装置及び方法を開示している米国特許第５，２７９，７２１号（参照により本明細書中に援用される）に記載されている。装置は、ゲルの外部操作なしに電気泳動及びブロッティングを可能にし、本発明による方法の実行に理想的に適している。
本発明の実施に際して使用することができる核酸検出の他の方法は、米国特許第５，８４０，８７３号、同第５，８４３，６４０号、同第５，８４３，６５１号、同第５，８４６，７０８号、同第５，８４６，７１７号、同第５，８４６，７２６号、同第５，８４６，７２９号、同第５，８４９，４８７号、同第５，８５３，９９０号、同第５，８５３，９９２号、同第５，８５３，９９３号、同第５，８５６，０９２、同第５，８６１，２４４号、同第５，８６３，７３２号、同第５，８６３，７５３号、同第５，８６６，３３１号、同第５，９０５，０２４号、同第５，９１０，４０７号、同第５，９１２，１２４号、同第５，９１２，１４５号、同第５，９１９，６３０号、同第５，９２５，５１７号、同第５，９２８，８６２号、同第５，９２８，８６９号、同第５，９２９，２２７号、同第５，９３２，４１３号及び同第５，９３５，７９１号（各々参照により本明細書中に援用される）に開示されている。
ＩＩＩ．タンパク質性組成物
対象となる産物が核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドであり得ることが考えられる。対象となる産物は抗原又は抗体を含み得るが、これらに限定されない。抗原の例としては、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃ）又はノーウォークウイルスカプシドタンパク質（ＮＶＣＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。抗体の例としては、モノクローナル抗体が挙げられるが、これに限定されない。
或る特定の実施形態では、対象となる産物はタンパク質、ポリペプチド又はペプチドである。本明細書中で使用される場合、「タンパク質」、「タンパク質性分子」、「タンパク質性組成物」、「タンパク質性化合物」、「タンパク質性鎖」又は「タンパク質性材料」とは概して、約２００アミノ酸超のタンパク質、若しくは遺伝子から翻訳された完全長内在性配列；約１００アミノ酸超のポリペプチド；及び／又は約３アミノ酸〜約１００アミノ酸のペプチドを指すが、これらに限定されない。上記の「タンパク質性」の用語は全て、本明細書中で互換可能に使用することができる。
本明細書中で使用される場合、「タンパク質」又は「ポリペプチド」とは、少なくとも１０個のアミノ酸残基を含む分子を指す。幾つかの実施形態では、タンパク質又はポリペプチドの野生型バージョンが利用される。しかしながら、本発明の多くの実施形態では、免疫応答を生じさせるために修飾されたタンパク質又はポリペプチドが利用される。上記の用語は互換可能に使用することができる。「修飾されたタンパク質」又は「修飾されたポリペプチド」とは、その化学構造、特にそのアミノ酸配列が野生型タンパク質又はポリペプチドと比べて変化したタンパク質又はポリペプチドを指す。修飾されたタンパク質又はポリペプチドは１つの活性又は機能に関して変化していることがあるが、他の点では野生型の活性又は機能（免疫原性等）を保持していると特に考えられる。
或る特定の実施形態では、タンパク質又はポリペプチドのサイズは、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、２７５個、３００個、３２５個、３５０個、３７５個、４００個、４２５個、４５０個、４７５個、５００個、５２５個、５５０個、５７５個、６００個、６２５個、６５０個、６７５個、７００個、７２５個、７５０個、７７５個、８００個、８２５個、８５０個、８７５個、９００個、９２５個、９５０個、９７５個、１０００個、１１００個、１２００個、１３００個、１４００個、１５００個、１７５０個、２０００個、２２５０個、２５００個又はそれ以上のアミノ分子、及びその中で導き出せる任意の範囲、又は本明細書中で記載若しくは参照される対応するアミノ配列の誘導体を含み得るが、これらに限定されない。ポリペプチドは切断によって突然変異させ、それらの対応する野生型形態より短くすることができると考えられるが、（例えば、標的化又は局在化させるため、免疫原性を増進するため、精製目的等で）特定の機能を有する異種タンパク質配列を融合又は複合体形成させることによって変化させてもよい。
本明細書中で使用される場合、「アミノ分子」とは、当該技術分野で既知の任意のアミノ酸、アミノ酸誘導体又はアミノ酸模倣体を指す。或る特定の実施形態では、タンパク質性分子の残基は連続的であり、任意の非アミノ分子がアミノ分子残基の配列を中断することはない。他の実施形態では、配列は１つ又は複数の非アミノ分子部分を含み得る。特定の実施形態では、タンパク質性分子の残基の配列が１つ又は複数の非アミノ分子部分によって中断され得る。
したがって、「タンパク質性組成物」という用語は、天然に合成されるタンパク質の２０個の共通アミノ酸の少なくとも１つ、又は少なくとも１つの修飾若しくは異常アミノ酸を含むアミノ分子配列を包含する。
タンパク質性組成物は、（ｉ）標準的な分子生物学的技法によるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドの発現、（ｉｉ）天然源からのタンパク質性化合物の単離又は（ｉｉｉ）タンパク質性材料の化学合成を含む、当業者に既知の任意の技法によって作製することができる。様々な遺伝子に関するヌクレオチド並びにタンパク質、ポリペプチド及びペプチドの配列は以前に開示されており、公認のコンピュータ化されたデータベース中に見ることができる。かかるデータベースの１つは、全米バイオテクノロジー情報センターのＧｅｎｂａｎｋ及びＧｅｎＰｅｐｔデータベース（ncbi.nlm.nih.gov/のワールドワイドウェブ上）である。これらの遺伝子のコード領域は、本明細書中で開示されるか、又は当業者に既知の（know）技法を用いて増幅及び／又は発現させることができる。
Ａ．タンパク質精製
対象となるタンパク質を精製又は単離するのが望ましい場合がある。タンパク質精製法は当業者に既知である。これらの技法は、或るレベルで細胞環境をポリペプチド及び非ポリペプチド画分へと粗分画することを含む。ポリペプチドを他の細胞成分から分離した後、対象となるポリペプチドをクロマトグラフ法及び電気泳動法を用いてさらに精製し、部分的又は完全な精製（又は均質となるまでの精製）を達成することができる。精製されたペプチドの調製に特に適した分析法はイオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー；アフィニティークロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；及び等電点電気泳動法である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー、又はさらにはＨＰＬＣである。
「精製したタンパク質又はペプチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、他の成分から単離可能な組成物を指すことが意図され、タンパク質又はペプチドはその天然に得られる状態と比べた任意の程度まで精製される。したがって、精製したタンパク質又はペプチドとは、それが天然に生じ得る環境から分離したタンパク質又はペプチドも指す。
概して、「精製した」とは、分画に供して他の様々な成分を除去したタンパク質又はペプチド組成物を指し、この組成物はその生物学的活性を実質的に保持している。「実質的に精製した」という用語を使用する場合、この呼称は、タンパク質又はペプチドが組成物の主要成分を形成する、例えば組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％又はそれ以上を構成する組成物を指す。
タンパク質又はペプチドの精製の程度を定量化する様々な方法が、本開示に照らして当業者に既知である。これらの方法としては、例えば、活性画分の特異的活性を測定すること、又は画分中のポリペプチドの量をＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって評価することが挙げられる。画分の純度を評価する好ましい方法は、画分の特異的活性を算出すること、それを初期抽出物の特異的活性と比較すること、及びそれにより、本明細書中で「〜倍の精製数（-fold purification number）」によって評価される純度を算出することである。活性の量を表すために使用される実際の単位は、当然ながら、選択される特定のアッセイ技法、及び発現されたタンパク質又はペプチドが検出可能な活性を示すか否かに依存する。
タンパク質精製に使用するのに好適な様々な技法が当業者に既知である。これらとしては、例えば硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体等による、又は熱変性による沈殿に続く遠心分離；イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー工程；等電点電気泳動法；ゲル電気泳動；並びにこれらの組み合わせ及び他の技法が挙げられる。当該技術分野において一般に知られているように、様々な精製工程を行う順序を変更することができ、又は或る特定の工程を省くことができ、それでも実質的に精製されたタンパク質又はペプチドを調製する好適な方法が得られると考えられる。
部分的な精製は、より少数の精製工程を組み合わせて用いることにより、又は同じ一般的精製スキームの異なる形態を利用することにより達成することができる。例えば、ＨＰＬＣ装置を利用して行う陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは概して、低圧クロマトグラフィーシステムを利用する同じ技法の「〜倍の」精製をもたらすことを理解されよう。より低い相対精製度を示す方法は、タンパク質産物の総回収量、又は発現されたタンパク質の活性の維持において利点を有し得る。
ポリペプチドの移動は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの条件の違いによって、場合によっては有意に変化し得ることが知られている（Capaldi et al., 1977）。したがって、異なる電気泳動条件下では、精製した又は部分的に精製した発現産物の見かけの分子量は変化し得ることが理解されよう。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、並外れたピーク分解能での非常に迅速な分離を特徴とする。これは、適当な流速を維持するために非常に微細な粒子及び高い圧力を用いることによって達成される。分離はわずか数分間、又は最大でも１時間以内に達成され得る。さらに、粒子が小さく密集していることにより空隙容量がベッド容量のごく一部でしかないため、非常に少量の試料しか必要とされない。また、バンドが狭いことにより試料が非常にわずかにしか希釈されないため、試料の濃度をあまり大きくする必要はない。
ゲルクロマトグラフィー又は分子篩クロマトグラフィーは、分子のサイズに基づく特別なタイプの分配クロマトグラフィーである。ゲルクロマトグラフィーの基礎となる理論は、小孔を含有する不活性物質の小さな粒子を用いて調製されるカラムによって、孔内又は孔の周囲を通過する際に、より小さい分子からより大きい分子がサイズに応じて分離されることである。粒子を作製する材料が分子を吸着しない限り、流速を決定する唯一の因子はサイズである。したがって、形状が比較的一定である限り、分子はサイズの減少と共にカラムから溶出される。ゲルクロマトグラフィーは、分離がｐＨ、イオン強度、温度等の他の全ての因子に非依存的であるため、異なるサイズの分子の分離に関して卓越している。また、実質的に吸着がなく、ゾーンの拡大が少なく、溶出容量は単に分子量に関連している。
アフィニティークロマトグラフィーは、単離される物質とそれが特異的に結合し得る分子との間の特異的親和性に依存するクロマトグラフ手順である。これは受容体−リガンド型の相互作用である。カラム材料は、結合パートナーの１つを不溶性マトリクスに共有結合させることによって合成される。カラム材料はそれにより溶液から物質を特異的に吸着することが可能である。溶出は条件を結合が起こらない条件に変化させる（例えばｐＨ、イオン強度及び温度を変化させる）ことによって行われる。
マトリクスは、それ自体が分子を任意の有意な程度まで吸着せず、広範な化学的安定性、物理的安定性及び熱安定性を有する物質でなくてはならない。リガンドは、その結合特性に影響を与えないように結合する必要がある。リガンドはまた、比較的強い結合をもたらすものでなくてはならない。また、物質を試料又はリガンドを破壊せずに溶出することが可能である必要がある。最も一般的な形態のアフィニティークロマトグラフィーの１つはイムノアフィニティークロマトグラフィーである。この方法は本発明に従って使用するのに好適である。この方法による抗体の生成は下記で論考される。
Ｂ．タンパク質検出
対象となるタンパク質は、下記に記載のものが挙げられるが、それらに限定されない当業者に既知の任意の手段によって検出することができる。
１．免疫検出法
論考されるように、一部の実施形態では、本発明は、対象となるタンパク質等の生物学的成分を結合、精製、除去、定量化する、及び／又は別の形で検出する免疫検出法に関する。本発明の免疫検出法は、治療に関連する対象となるタンパク質の抗原領域を同定するために使用することができる。
免疫検出法としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射定量測定法、蛍光免疫測定法、化学発光分析法、生物発光分析法及びウエスタンブロットが挙げられるが、幾つかの他の方法も当業者に既知である。様々な有用な免疫検出法の工程は、例えばDoolittle et al., 1999、Gulbis et al., 1993、De Jager et al., 1993及びNakamura et al., 1987（各々参照により本明細書中に援用される）等の科学文献に記載されている。
概して、免疫結合法は、タンパク質、ポリペプチド及び／又はペプチドを含有する疑いがある試料を得ること、及び本発明に従って、場合によっては免疫複合体を形成させるのに効果的な条件下で、試料をモノクローナル又はポリクローナルの第１の抗体と接触させることを含む。
これらの方法には、細胞小器官、細胞、組織又は生物の試料からタンパク質、ポリペプチド及び／又はペプチドを精製する方法が含まれる。これらの場合では、抗体によって抗原タンパク質、ポリペプチド及び／又はペプチド成分が試料から除去される。抗体は、カラムマトリクスの形態等の固体支持体に連結させるのが好ましく、タンパク質、ポリペプチド及び／又はペプチド抗原成分を含有する疑いがある試料を固定化抗体に加える。不要な成分をカラムから洗い流し、固定化抗体に免疫複合体形成した（immunocomplexed）抗原を溶出させる。
免疫結合法には、試料中の抗原成分の量を検出及び定量化する方法、並びに結合過程において形成される任意の免疫複合体の検出及び定量化も含まれる。ここでは、抗原又は抗原ドメインを含有する疑いがある試料を得て、試料をその抗原又は抗原ドメインに対する抗体と接触させた後、特定の条件下で形成される免疫複合体の量を検出及び定量化する。
抗原検出に関して、分析される生物学的試料は、抗原又は抗原ドメインを含有する疑いがある任意の試料、例えば組織切片若しくは組織標本、ホモジナイズした組織抽出物、細胞、細胞小器官、上記抗原含有組成物のいずれかの分離形態及び／又は精製形態、又はさらには血液及び／又は血清を含む、細胞若しくは組織と接触する任意の生体液等であり得る。
効果的な条件下で、免疫複合体（一次免疫複合体）を形成させるのに十分な期間、選択された生物学的試料を抗体と接触させるとは一般に、単に抗体組成物を試料に添加し、混合物を抗体が存在する任意の抗原と免疫複合体を形成する、すなわち、結合するのに十分に長い期間インキュベートすることである。その後、組織切片、ＥＬＩＳＡプレート、ドットブロット又はウエスタンブロット等の試料−抗体組成物を概して、洗浄して全ての非特異的に結合した抗体種を除去し、一次免疫複合体内に特異的に結合したこれらの抗体のみを検出する。
概して、免疫複合体形成の検出は当該技術分野において既知であり、多数のアプローチを適用することによって達成することができる。これらの方法は概して、放射性タグ、蛍光タグ、生物学的タグ及び酵素的タグ等の標識又はマーカーの検出に基づく。かかる標識の使用に関する米国特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号及び同第４，３６６，２４１号（各々参照により本明細書中に援用される）が挙げられる。当然ながら、当該技術分野で既知のように、第２の抗体及び／又はビオチン／アビジンリガンド結合構成等の二次結合リガンドを使用することによってさらなる利点を見出すことができる。
検出に利用される抗体は、それ自体が検出可能な標識に連結したものであってもよく、それにより単にこの標識を検出することによって、組成物中の一次免疫複合体の量を決定することが可能である。代替的には、一次免疫複合体内に結合される第１の抗体は、該抗体に対して結合親和性を有する、第２の結合リガンドを用いて検出することができる。これらの場合では、第２の結合リガンドを検出可能な標識に連結してもよい。第２の結合リガンドは多くの場合、それ自体が抗体であるため、「二次」抗体と称される場合がある。一次免疫複合体を、効果的な条件下で、二次免疫複合体を形成させるのに十分な期間、標識した二次結合リガンド又は抗体と接触させる。次いで、二次免疫複合体を概して洗浄し、全ての非特異的に結合した標識二次抗体又はリガンドを除去して、二次免疫複合体中の残りの標識を検出する。
さらなる方法としては、２段階アプローチによる一次免疫複合体の検出が挙げられる。抗体に対して結合親和性を有する抗体等の第２の結合リガンドを用いて、上記のような二次免疫複合体を形成する。洗浄後、二次免疫複合体を、同様に効果的な条件下で、免疫複合体（三次免疫複合体）を形成させるのに十分な期間、第２の抗体に対して結合親和性を有する第３の結合リガンド又は抗体と接触させる。第３のリガンド又は抗体を検出可能な標識に連結させ、このようにして形成された三次免疫複合体を検出する。この系は所望される場合にシグナル増幅をもたらし得る。
Charles Cantorによって設計された免疫検出の一方法では２つの異なる抗体が使用される。第１工程のビオチン化したモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を使用して、標的抗原（複数可）を検出し、次いで第２工程の抗体を使用して、抗体／抗原複合体に結合したビオチンを検出する。この方法では、試験する試料を初めに第１工程の抗体を含有する溶液中でインキュベートする。標的抗原が存在する場合、抗体の一部が抗原に結合して、ビオチン化抗体／抗原複合体を形成する。次いで、抗体／抗原複合体を、ストレプトアビジン（又はアビジン）、ビオチン化ＤＮＡ及び／又は相補的ビオチン化ＤＮＡの一連の溶液中でインキュベートすることによって増幅し、各々の工程でさらなるビオチン部位を抗体／抗原複合体に付加する。増幅工程を好適なレベルの増幅が達成されるまで繰り返し、その時点で試料をビオチンに対する第２工程の抗体を含有する溶液中でインキュベートする。この第２工程の抗体を、例えば発色（chromogen）基質を用いた組織酵素学的手法（histoenzymology）によって抗体／抗原複合体の存在を検出するために使用することができる酵素で標識する。好適な増幅によって、肉眼で見える複合体が産生され得る。
免疫検出の別の既知の方法は、イムノＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）の方法論を利用する。このＰＣＲ方法は、ビオチン化ＤＮＡとのインキュベーションまではCantorの方法と同様であるが、複数回のストレプトアビジンとビオチン化ＤＮＡとのインキュベーションを用いる代わりに、ＤＮＡ／ビオチン／ストレプトアビジン／抗体複合体を、抗体を放出させる低ｐＨ又は高塩バッファーで洗い流す。次いで、得られる洗浄液を使用して、適切な対照と共に好適なプライマーを用いたＰＣＲ反応を行う。少なくとも理論上は、ＰＣＲの非常に大きな増幅能及び特異性を利用して、単一の抗原分子を検出することができる。
ａ．ＥＬＩＳＡ
上記に詳述したように、イムノアッセイとは、その最も単純及び／又は直接的な意味で、結合アッセイである。好ましいイムノアッセイは、当該技術分野において既知の様々なタイプの酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）及び／又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられる。組織切片を用いた免疫組織化学的検出も特に有用である。しかしながら、検出はかかる技法に限定されず、及び／又はウエスタンブロット法、ドットブロット法、ＦＡＣＳ分析等も使用することができることが容易に理解されよう。
ＥＬＩＳＡの一例では、ポリスチレンマイクロタイタープレート中のウェル等のようなタンパク質親和性を示す選択された表面に抗体を固定化する。次いで、臨床試料等の抗原を含有する疑いがある試験組成物をウェルに添加する。結合させた後及び／又は洗浄して非特異的に結合した免疫複合体を除去した後、結合した抗原を検出することができる。検出は概して、検出可能な標識に連結した別の抗体を添加することによって達成される。これは単純な「サンドイッチＥＬＩＳＡ」である。検出は第２の抗体を添加し、続いて第２の抗体に対して結合親和性を有する第３の抗体を添加することによって達成することもできる（第３の抗体は検出可能な標識に連結している）。
ＥＬＩＳＡの別の例では、抗原を含有する疑いがある試料をウェル表面に固定化し、及び／又は次いで抗体と接触させる。結合させた後及び／又は洗浄して非特異的に結合した免疫複合体を除去した後、結合した抗体を検出する。最初の抗体が検出可能な標識と連結している場合、免疫複合体は直接検出することができる。この場合も、免疫複合体は、第１の抗体に対して結合親和性を有する第２の抗体を用いて検出することができる（第２の抗体は検出可能な標識に連結している）。
抗原を固定化する別のＥＬＩＳＡでは、検出において抗体競合を用いる。このＥＬＩＳＡでは、抗原に対する標識抗体をウェルに添加して、結合させ、及び／又はそれらの標識を用いて検出する。次いで、コーティングしたウェルでのインキュベーションの間に、試料を抗原に対する標識抗体と混合することによって、未知試料中の抗原の量を測定する。試料における抗原の存在は、ウェルに結合するのに利用可能な抗原に対する抗体の量を減少させるように作用し、したがって最終的なシグナルを減少させる。このことも未知試料中の抗原に対する抗体を検出するのに適切であるが、この場合、非標識抗体が抗原をコーティングしたウェルに結合し、同様に標識抗体に結合するのに利用可能な抗原の量を減少させる。
利用する様式に関わらず、ＥＬＩＳＡはコーティングすること、インキュベートすること及び結合させること、洗浄して非特異的に結合した種を除去すること、及び結合した免疫複合体を検出すること等のように共通した或る特定の特徴を有する。これらは下記に記載される。
プレートを抗原又は抗体のいずれかでコーティングする際には、一般にプレートのウェルを抗原又は抗体の溶液と共に、一晩又は指定の時間にわたってインキュベートする。次いで、プレートのウェルを洗浄して、不完全に吸着した材料を除去する。次いで、ウェルの残り全ての利用可能な表面を、試験抗血清に対して抗原的に中性の非特異的なタンパク質で「コーティングする」。これらとしては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン又は粉乳溶液が挙げられる。コーティングによって、固定化表面上の非特異的な吸着部位のブロッキングが可能となり、それにより表面への抗血清の非特異的な結合により生じるバックグラウンドが減少する。
ＥＬＩＳＡにおいて、直接的な手順よりも二次又は三次検出手段を使用する方が日常的であると思われる。したがって、タンパク質又は抗体をウェルに結合させ、バックグラウンドを減少させるために非反応性材料でコーティングし、洗浄して非結合材料を除去した後、固定化表面を試験される生物学的試料と、免疫複合体（抗原／抗体）を形成させるのに効果的な条件下で接触させる。免疫複合体の検出はこの場合、標識した二次結合リガンド若しくは抗体、又は標識した三次抗体若しくは第３の結合リガンドと結合した二次結合リガンド若しくは抗体を必要とする。
「免疫複合体（抗原／抗体）を形成させるのに効果的な条件下で」とは、条件が好ましくは抗原及び／又は抗体をＢＳＡ、ウシγグロブリン（ＢＧＧ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎ等の溶液で希釈することを含むことを意味する。これらの添加される薬剤も、非特異的なバックグラウンドの減少を助ける傾向がある。
また、「好適な」条件とは、インキュベーションを効果的な結合を可能にするのに十分な温度又は期間で行うことを意味する。インキュベーション工程は典型的には、好ましくはおよそ２５℃〜２７℃の温度で約１〜２時間から４時間程度であり、又は約４℃程度で一晩行ってもよい。
ＥＬＩＳＡにおける全てのインキュベーション工程の後、接触させた表面を洗浄して、複合体形成してない材料を除去する。洗浄手順の一例としては、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ等の溶液又はホウ酸塩緩衝剤での洗浄が挙げられる。試験試料と最初に結合した材料との間の特異的な免疫複合体の形成、及び続く洗浄の後、さらに微量の免疫複合体の発生も測定することができる。
検出手段を提供するために、第２又は第３の抗体は検出を可能にする結合した標識を有する。これは、適切な発色基質と共にインキュベートすると発色を生じる酵素であってもよい。したがって、例えば第１及び第２の免疫複合体をウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又は水素ペルオキシダーゼ結合抗体と、さらなる免疫複合体形成の発生を促す期間及び条件下で（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ等のＰＢＳ含有溶液中、室温で２時間のインキュベーション）接触させる又はインキュベートすることが望まれる。
標識抗体とのインキュベーションの後、洗浄して非結合材料を除去した後、標識の量を、例えば、尿素、又はブロモクレゾールパープル、又は２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、又はＨ２Ｏ２（ペルオキシダーゼを酵素標識とした場合）等の発色基質とのインキュベーションによって定量化する。定量化はその後、例えば可視スペクトル分光光度計を用いて、生じた色の程度を測定することによって達成される。
ｂ．免疫組織化学
本発明の抗体は、免疫組織化学（ＩＨＣ）による研究のために作製した新たに凍結した及び／又はホルマリン固定したパラフィン包埋組織ブロックの両方と併用することもできる。例えば、免疫組織化学を利用して、対象となるタンパク質を特性化するか、又は細胞中の対象となるタンパク質の量を評価することができる。これらの粒子状標本から組織ブロックを作製する方法は、様々な予後因子の以前のＩＨＣ研究において首尾よく使用されており、及び／又は当業者に既知である（Brown et al., 1990、Abbondanzo et al., 1990、Allred et al., 1990）。
免疫組織化学（すなわちＩＨＣ）とは、抗体が生物組織において抗原に特異的に結合する原理を利用して、組織切片の細胞におけるタンパク質を局所化するプロセスを指す。この名称は、手順において使用される抗体に関する「ｉｍｍｕｎｏ」、及び組織を意味する「ｈｉｓｔｏ」という語根から付けられている。免疫組織化学的染色は、癌の診断及び治療において広く使用されている。特定の分子マーカーは特定の癌型に特異的である。
抗体−抗原相互作用の可視化は多数の方法で達成することができる。最も一般的な例では、抗体を、発色反応を触媒することができるペルオキシダーゼ等の酵素と複合体形成させる。代替的には、抗体をＦＩＴＣ、ローダミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ又はＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒ等のフルオロフォアでタグ付けしてもよい。後者の方法は、高感度であり、複数のタンパク質間の相互作用を可視化するためにも使用することができる共焦点レーザー走査顕微鏡検査において非常に有用である。
簡潔に述べると、凍結切片は、小さいプラスチックカプセルにおいて、５０ｍｇの凍結「粉砕」組織を室温でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再水和させること、粒子を遠心分離によって沈殿させること、それらを粘性包埋媒質（ＯＣＴ）に再懸濁させること、カプセルを反転し、及び／又は再度遠心分離によって沈殿させること、−７０℃のイソペンタン中で急速凍結すること（snap-freezing）、プラスチックカプセルを切断し、及び／又は凍結した組織の円筒を取り出すこと、組織の円筒をクライオスタットのミクロトームチャックに固定すること、及び／又は２５個〜５０個の連続切片を切り出すことによって作製することができる。
永久切片は、プラスチックマイクロチューブにおいて５０ｍｇの試料を再水和させること、沈殿させること、１０％ホルマリンに４時間再懸濁して固定すること、洗浄すること／沈殿させること、２．５％温寒天に再懸濁すること、沈殿させること、氷水中で冷却して寒天を固めること、チューブから組織／寒天ブロックを取り出すこと、ブロックをパラフィンに浸潤及び／又は包埋すること、及び／又は最大５０個の連続永久切片を切り出すことを含む、同様の方法によって作製することができる。
組織における抗原の免疫組織化学的（immmunohistochemical）検出に使用される戦略は、直接的方法及び間接的方法の２つである。どちらの場合においても、通常はＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００等の界面活性剤を用いることにより組織を処理して、膜を破壊する。
直接的方法は一段階染色法であり、標識抗体（例えば、ＦＩＴＣ結合抗血清）を、組織切片中で抗原と直接反応させることを含む。この技法は１つの抗体しか利用せず、したがって手順は単純かつ迅速である。しかしながら、直接的方法には、シグナル増幅がほとんどないことから感度に関連する問題が生じる可能性があり、間接的方法よりも一般的に使用されていない。
間接的方法は、組織抗原と反応する非標識一次抗体（第１の層）、及び一次抗体と反応する標識二次抗体（第２の層）を含む。この方法は、一次抗体上の異なる抗原部位との複数の二次抗体反応を介したシグナル増幅のために、より高感度である。第２の層の抗体は蛍光色素又は酵素で標識することができる。
一般的手順では、ビオチン化した二次抗体を、ストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼと結合させる。これは３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と反応すると、ＤＡＢ染色として知られるプロセスにおいて一次抗体及び二次抗体が結合した場所であればどこでも茶色の染色を生じる。この反応はニッケルを用いて増進させることができ、濃い紫色／灰色の染色を生じる。
間接的方法は、そのより高い感度に加えて、比較的少ない数の標準結合（標識）二次抗体しか生じさせる必要がないという利点も有する。例えば、ウサギＩｇＧに対して産生された標識二次抗体（「既製品」として購入することができる）は、ウサギにおいて産生されたいかなる一次抗体についても有用である。直接的方法では、対象となる抗原全てに対して特別に標識した抗体を作製する必要があり得る。
ｃ．タンパク質アレイ
タンパク質アレイ技術は、Pandey and Mann (2000)及びMacBeath and Schreiber (2000)（各々参照により本明細書中に具体的に援用される）で詳細に論考されている。
これらのアレイは典型的には、スライドガラス上にスポットした、又は小さなウェル内に固定化した数千種の異なるタンパク質又は抗体を含有し、一度に多数のタンパク質の生化学的活性及び結合プロファイルを試験することを可能にする。かかるアレイとのタンパク質の相互作用を試験するために、標識したタンパク質をスライドガラス上に固定化した標的タンパク質の各々と共にインキュベートした後、多くのタンパク質のうちいずれに標識した分子が結合するかを決定する。或る特定の実施形態では、かかる技術を用いて、対象となるタンパク質等の試料中の多数のタンパク質を定量化することができる。
タンパク質チップの基本構成には、分子のアレイが点在するガラス又はプラスチック表面を使用する等といったＤＮＡチップとの幾つかの類似点がある。これらの分子は、タンパク質を捕捉するように設計されたＤＮＡ又は抗体であり得る。規定量のタンパク質を、タンパク質の幾らかの活性を保持したまま各々のスポット上に固定化する。蛍光マーカー又は他の検出方法によって、これらのタンパク質を捕捉したスポットが明らかになるため、タンパク質マイクロアレイはハイスループットプロテオミクス及び創薬において強力なツールとして使用されている。
最も初期の最もよく知られているタンパク質チップは、Ciphergen Biosystems Inc.（Fremont，Calif）によるＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐである。ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐは、表面増強レーザー脱離及びイオン化（ＳＥＬＤＩ）プロセスに基づく。既知のタンパク質は、チップ上での機能的アッセイを用いて分析される。例えば、チップ表面は、研究者がタンパク質−タンパク質相互作用研究、リガンド結合研究又はイムノアッセイを行うことを可能にする酵素、受容体タンパク質又は抗体を含有し得る。最先端のイオン光学技術及びレーザー光学技術を用いると、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ系によって１０００Ｄａ未満の小ペプチドから３００ｋＤａのタンパク質までの範囲のタンパク質が検出され、飛行時間（ＴＯＦ）に基づいて質量が算出される。
ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐバイオマーカー系は、バイオマーカーパターン認識分析を行うことを可能にする最初のタンパク質バイオチップベースの系である。この系によって、研究者は、様々な粗臨床試料（すなわち、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによって切り出した（laser capture microdissected）細胞、生検材料、組織、尿及び血清）からプロテオームを調査することによって重要な臨床上の問題に対処することが可能となる。この系は、疾患表現型を有する臨床試料からのタンパク質発現パターンを相互に関連付けるために、パターン認識に基づく統計学的分析法を自動化するバイオマーカーパターンソフトウェアも利用する。
Ｃ．防御免疫
本発明の幾つかの実施形態では、対象となるタンパク質は被験体において免疫応答を惹起し得る。防御免疫とは、被験体が、免疫応答のある薬剤に関連する特定の疾患又は状態を発症するのを防止する特異的な免疫応答を開始する身体の能力を指す。免疫原として有効な量によって被験体に防御免疫を与えることが可能である。
本明細書及びその後の特許請求の範囲において使用される場合、ポリペプチドという用語は、ペプチド結合を介してそれらの間で共有結合したアミノ酸のストレッチを指す。異なるポリペプチドは本発明による異なる機能性を有する。一態様によると、ポリペプチドはレシピエントにおいて能動免疫応答を誘導するように設計した免疫原に由来するが、本発明の別の態様によると、ポリペプチドは、例えば動物において能動免疫応答の誘発に続いて生じ、レシピエントにおいて受動免疫応答を誘導する働きをし得る抗体に由来する。しかしながら、どちらの場合においても、ポリペプチドは任意の考え得るコドン使用頻度に従ってポリヌクレオチドによってコードされる。
本明細書中で使用される場合、「免疫応答」又はその同義の「免疫学的応答」という表現は、レシピエント患者において本発明のタンパク質、ペプチド又はポリペプチドに対して誘導される体液性応答（抗体媒介性）、細胞性応答（抗原特異的Ｔ細胞又はそれらの分泌産物によって媒介される）又は体液性応答及び細胞性応答の両方の発生を指す。かかる応答は免疫原の投与によって誘導される能動応答であっても、又は抗体、抗体を含有する材料若しくは感作Ｔ細胞の投与によって誘導される受動応答であってもよい。細胞性免疫応答は、クラスＩ又はクラスＩＩ ＭＨＣ分子に関連したポリペプチドエピトープの提示によって誘発され、抗原特異的ＣＤ４（＋）ヘルパーＴ細胞及び／又はＣＤ８（＋）細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する。この応答は単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、好塩基球、樹状細胞、星状細胞、小グリア細胞、好酸球又は先天性免疫の他の成分の活性化も伴い得る。
本明細書中で使用される場合、「能動免疫」とは、抗原の投与によって被験体に対して与えられる任意の免疫を指す。
本明細書中で使用される場合、「受動免疫」とは、被験体に抗原を投与することなく被験体に対して与えられる任意の免疫を指す。したがって、「受動免疫」には、免疫応答の細胞メディエーター又はタンパク質メディエーター（例えば、モノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体）を含む活性化された免疫エフェクターの投与が含まれるが、これに限定されない。モノクローナル又はポリクローナル抗体組成物は、抗体によって認識される抗原を保有する生物による感染の予防又は治療のための受動免疫化に使用することができる。抗体組成物は、様々な生物に関連し得る様々な抗原に結合する抗体を含み得る。抗体成分はポリクローナル抗血清であり得る。或る特定の態様では、抗体（単数又は複数）は、抗原（複数可）でチャレンジした動物又は第２の被験体からアフィニティー精製される。代替的には、同じ、関連する、又は異なる微生物若しくは生物（ブドウ球菌が挙げられるが、これに限定されないグラム陽性細菌、グラム陰性細菌等）中に存在する抗原に対するモノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体の混合物である抗体混合物を使用することができる。
受動免疫は、既知の免疫反応性を有するドナー又は他の非患者源から得られた免疫グロブリン（Ｉｇ）及び／又は他の免疫因子を患者に投与することによって、患者又は被験体に与えられ得る。他の態様では、本発明の抗原組成物は、ブドウ球菌又は他の生物に指向性を有する抗体を含有する組成物からのチャレンジに応答して産生されるグロブリン（「高力価免疫グロブリン」）の供給源又はドナーとなる被験体に投与することができる。このようにして処理した被験体から血漿が提供され、そこから従来の血漿分画法によって高力価免疫グロブリンを得て、ブドウ球菌感染に対する耐性を与えるか、又はそれを治療するために別の被験体に投与する。本発明による高力価免疫グロブリンは、免疫低下個体に対して、侵襲的処置を受けている個体に対して、又はワクチン接種された個体が自身の抗体を産生する時間がない場合に特に有用である。受動免疫に関連する例示的な方法及び組成物に関しては、米国特許第６，９３６，２５８号、同第６，７７０，２７８号、同第６，７５６，３６１号、同第５，５４８，０６６号、同第５，５１２，２８２号、同第４，３３８，２９８号及び同第４，７４８，０１８号（各々その全体が参照により本明細書中に援用される）を参照されたい。
本明細書及び添付の特許請求の範囲の目的上、「エピトープ」及び「抗原決定基」という用語は互換可能に使用され、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞が応答又は認識する抗原上の部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、連続アミノ酸又はタンパク質の三次折り畳みによって近接した不連続アミノ酸の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒に曝露された状態で保持されるが、三次折り畳みによって形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒での処理の際に失われる。エピトープでは、典型的には少なくとも３個、より一般には少なくとも５個又は８個〜１０個のアミノ酸が特有の空間的立体配座を形成する。エピトープの空間的立体配座を決定する方法としては、例えばＸ線結晶学及び二次元核磁気共鳴が挙げられる。例えばEpitope Mapping Protocols (1996)を参照されたい。同じエピトープを認識する抗体を、標的抗原への別の抗体の結合を遮断する或る抗体の能力を示す単純なイムノアッセイにおいて同定することができる。Ｔ細胞は、ＣＤ８細胞に対しては約９アミノ酸、又はＣＤ４細胞に対しては約１３〜１５アミノ酸の連続したエピトープを認識する。エピトープを認識するＴ細胞は、エピトープに応答した感作Ｔ細胞による３Ｈ−チミジン取り込みによって決定される抗原依存的増殖を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（Burke et al., 1994）、抗原依存的死滅（細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ、Tigges et al., 1996）又はサイトカイン分泌によって同定することができる。
細胞媒介性免疫学的応答の存在は、増殖アッセイ（ＣＤ４（＋）Ｔ細胞）又はＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）アッセイによって決定することができる。免疫原の予防効果又は治療効果に対する体液性応答及び細胞性応答の相対的寄与は、免疫化した同系動物からＩｇＧ及びＴ細胞を別個に単離すること、及び第２の被験体における予防効果又は治療効果を測定することによって識別することができる。
本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、「抗体」又は「免疫グロブリン」という用語は互換可能に使用され、動物又はレシピエントの免疫応答の一部として機能する幾つかのクラスの構造上関連するタンパク質（ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及び関連タンパク質を含む）のいずれかを指す。
正常な生理学的条件下では、抗体は血漿及び他の体液中、並びに或る特定の細胞の膜中に見られ、Ｂ細胞と称されるタイプのリンパ球又はそれらの機能的等価物によって産生される。ＩｇＧクラスの抗体は、ジスルフィド結合によって共に連結した４つのポリペプチド鎖から構成される。無傷ＩｇＧ分子のこの４つの鎖は、Ｈ鎖と称される２つの同一の重鎖及びＬ鎖と称される２つの同一の軽鎖である。
ポリクローナル抗体を産生させるために、ウサギ又はヤギ等の宿主を、抗原又は抗原断片を一般にアジュバントと共に、必要に応じて担体に結合させて用いて免疫化する。抗原に対する抗体を続いて宿主の血清から回収する。ポリクローナル抗体は、抗原に対してアフィニティー精製して、単一特異性とすることができる。
モノクローナル抗体を産生させるために、抗原による適切なドナー、一般にマウスの過免疫を行う。次いで、脾臓の抗体産生細胞の単離を行う。これらの細胞を、骨髄腫細胞等の不死細胞と融合させて、培養物中で維持することができ、必要とされるモノクローナル抗体を分泌する融合細胞雑種（ハイブリドーマ）を得る。次いで、細胞を大量に培養し、使用するモノクローナル抗体を培地から採取する。定義によれば、モノクローナル抗体は単一のエピトープに特異的である。モノクローナル抗体は多くの場合、この理由から同様の抗原に対して産生されたポリクローナル抗体よりも低い親和性定数を有する。
モノクローナル抗体は、脾臓細胞又は脾臓に由来する細胞株の一次培養物を用いてｅｘ ｖｉｖｏでも産生させることができる。組み換え抗体（概して、Huston et al., 1991；Johnson et al., 1991；Mernaugh et al., 1995を参照されたい）を産生させるために、動物のＢリンパ球を産生する抗体、又はハイブリドーマに由来するメッセンジャーＲＮＡを逆転写して、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を得る。抗体ｃＤＮＡ（完全長であっても又は部分長であってもよい）を増幅し、ファージ又はプラスミドにクローニングする。ｃＤＮＡは、分離した又はリンカーによって結合した部分長の重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡであり得る。抗体又は抗体断片を好適な発現系を用いて発現させて、組み換え抗体を得る。抗体ｃＤＮＡは、適切な発現ライブラリーをスクリーニングすることによっても得ることができる。
抗体は、当該技術分野において既知であるように、固体支持基板に結合させても、又は検出可能部分と複合体形成させても、又は結合及び複合体形成の両方を行わせてもよい。蛍光部分又は酵素部分の複合体形成の一般的考察については、Johnstone et al. (1982)を参照されたい。固体支持基板への抗体の結合も当該技術分野において既知である（Harlow et al., 1988；Borrebaeck, 1992）。
本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、「抗体の免疫学的部分」という表現は、抗体のＦａｂ断片、抗体のＦｖ断片、抗体の重鎖、抗体の軽鎖、抗体の重鎖及び軽鎖の非結合混合物、抗体の重鎖及び軽鎖から構成されるヘテロ二量体、抗体の重鎖の触媒ドメイン、抗体の軽鎖の触媒ドメイン、抗体の軽鎖の可変断片、抗体の重鎖の可変断片、並びに抗体の一本鎖変異体（ｓｃＦｖとしても知られる）を含む。また、この用語は、異なる種に由来する融合遺伝子の発現産物であるキメラ免疫グロブリンを含み、これらのうち一の種はヒトであり得るが、この場合、キメラ免疫グロブリンはヒト化されたと呼ばれる。典型的には、抗体の免疫学的部分は、抗原への特異的な結合について、それが由来する無傷抗体と競合する。
任意で、抗体又は好ましくは抗体の免疫学的部分を、他のタンパク質との融合タンパク質と化学的に複合体形成させるか、又は該融合タンパク質として発現させてもよい。本明細書及び添付の特許請求の範囲の目的上、かかる融合タンパク質の全てが抗体又は抗体の免疫学的部分の定義に含まれる。
本明細書中で使用される場合、「免疫原性作用物質（immunogenic agent）」又は「免疫原」又は「抗原」という用語は互換可能に使用され、単独で、アジュバントと共に、又はディスプレイビヒクル（display vehicle）上に提示してレシピエントへ投与することにより、自身に対して免疫学的応答を誘導することが可能な分子を表す。
ＩＶ．実施例
以下の実施例は、本発明の或る特定の非限定的な態様を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技法は、本発明の実施に際して十分に機能する、本発明者によって発見された技法を表すことが当業者には理解されよう。しかしながら、当業者には、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態において多くの変更を加えても、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく類似又は同様の結果を得ることができることが理解されよう。
実施例１
Ｉ．結果
レプリコンベクターとＲｅｐ／ＲｅｐＡ供給ベクターとの植物の葉へのアグロバクテリウム媒介性同時送達によって、効率的なレプリコン形成及び高レベルのタンパク質産生がもたらされる。
陽子線照射された（bombarded）タバコＮＴ−１細胞におけるインゲン黄化萎縮ウイルス（ＢｅＹＤＶ）ベースのレプリコンの形成が、標的タンパク質の一時的発現の増大をもたらすことが以前に示されている（Mor et al., 2003）。拡張可能な高収率一時的発現系を開発するために、初めにレプリコンベクターの植物の葉へのアグロバクテリウム媒介性送達が、レプリコン形成及び標的タンパク質発現の増大をもたらし得るかについて試験した。ベンサミアナタバコの葉に、緑色蛍光タンパク質をコードするレプリコンベクターｐＢＹＧＦＰ（図１）を含有するアグロバクテリウム培養物を浸潤させるか、又はｐＢＹＧＦＰ及びＲｅｐ供給ベクターの１つ（Ｒｅｐ及びＲｅｐＡの両方をコードするｐＲＥＰ１１０、又はＲｅｐのみをコードするｐＲＥＰ１１１、図２）を含有する２つのアグロバクテリウム培養物の混合物を同時浸潤させた。浸潤後５日目（ｄｐｉ）に、ｐＢＹＧＦＰ単独を浸潤させた葉の領域、又はｐＢＹＧＦＰ及びｐＲＥＰ１１１を同時浸潤させた葉の領域（ＢＹＧＦＰ／ＲＥＰ１１１と略される）から非常にかすかな緑色の蛍光が観察されたが、浸潤バッファーのみを浸潤させた対照からは緑色のシグナルは見られなかった（図２Ａ）。対照的に、ＢＹＧＦＰ／ＲＥＰ１１０での同時浸潤によって、浸潤させた領域全体に強力な緑色の蛍光がもたらされた（図２Ａ）。
同様に、ベンサミアナタバコの葉に、ＶＬＰ形成タンパク質であるＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃ）をコードする別のレプリコンベクターｐＢＹＨＢｃ（図１）を単独で、又はｐＲＥＰ１１０若しくはｐＲＥＰ１１１と組み合わせて浸潤させた。ＨＢｃ発現をドットブロット法（データは示さない）及びポリクローナルサンドイッチＥＬＩＳＡ（図３Ａ）によって、７日間にわたってモニタリングした。ＢＹＨＢｃ／ＲＥＰ１１０の組み合わせが、２ｄｐｉ及び４ｄｐｉに、生体重１ｇ当たり平均しておよそ０．１８ｍｇのＨＢｃという最も高い発現を有していた。ＧＦＰ研究による結果と一致して、ＢＹＨＢｃ処理とＢＹＨＢｃ／ＲＥＰ１１１処理との間に有意な差は見られなかった。
この増大がレプリコン形成に関連しているか否かを決定するために、浸潤させた葉から抽出したＤＮＡを、０．８％アガロースゲルに溶解させた。全ての試料において植物の染色体ＤＮＡを表す高分子量のバンドが観察され、これを内部ローディング対照とした。ＢＹＨＢｃ／ＲＥＰ１１０レーンにおいて約３．０ｋｂ及び約２．０Ｋｂの２つのさらなるバンドが可視化されたが、ＢＹＨＢｃレーン又はＢＹＨＢｃ／ＲＥＰ１１１レーンにおいては可視化されなかった（図３Ｂ）。ＨＢｃ特異的プローブを用いたサザンブロット法によって、約３．０ｋｂ及び約２．０Ｋｂのバンドが実際にＨＢｃレプリコンであることが確認された（図３Ｂ）。興味深いことに、植物ＤＮＡを消化すると、約３．０ｋｂの１つの主要バンドしか生じず（図３Ｃ）、約３．０ｋｂ及び約２．０ｋｂのバンドが、それぞれ線状形態及び環状形態のレプリコンを表すことが示唆された。総合すると、上記の結果から、ＢＹＨＢｃ／ＲＥＰに関してレプリコン増幅と標的タンパク質蓄積との間の強い相関が実証され、タンパク質収率の上昇が主にレプリコンのコピー数の高さによることが強く示唆される。
Ａ．遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９は、標的特異的ｍＲＮＡ及びタンパク質の蓄積を増進した
トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９が、遺伝子サイレンシングの抑制によって標的タンパク質の蓄積を増進することが報告されている（Voinnet et al., 1998）。Ｐ１９をレプリコン系に組み入れることによって、タンパク質蓄積をさらに高めることができる否かを試験するために、Ｐ１９発現ベクター（図１）を、レプリコンの組み合わせ及びＲｅｐ供給ベクターを同時浸潤させたが、ＢＹＧＦＰ／ＲＥＰ１１０／Ｐ１９が最も強力なＧＦＰ蛍光を生じることが見出された（図２Ｂ）。同様に、ＢＹＨＢｃ／ＲＥＰ１１０／Ｐ１９の組み合わせが、平均して０．８ｍｇ／ｇＦＷという最も高いＨＢｃ発現を生じた（図３Ａ）。Ｐ１９の同時送達は、アガロースゲル電気泳動及びサザンブロット法によって実証されるように、レプリコン形成に有意に影響を与えなかった（図３Ｂ及び図３Ｃ）。対照的に、ノーザンブロット分析から、ＨＢｃ特異的ｍＲＮＡの蓄積がＰ１９の同時発現によって大幅に増大したことが示された（図３Ｄ）。これらの結果は、Ｐ１９が実際に、おそらくは導入遺伝子の転写後サイレンシングを抑制することによって標的ｍＲＮＡ及びタンパク質の蓄積を増大させ得ることを示している。
１．ノーウォークウイルスカプシドタンパク質（ＮＶＣＰ）の一時的発現及びＶＬＰ形成
ＶＬＰワクチンを生産する際のこの系の有効性を確認するために、レプリコン系を、別のＶＬＰ形成抗原であるＮＶＣＰの一時的発現についても試験した。図５Ａに、種々のベクターの組み合わせによるＮＶＣＰ発現の経時変化研究を示す。ＢＹｓＮＶ／ＲＥＰ１１０／Ｐ１９が、ＮＶＣＰを約０．３４ｍｇ／ｇＦＷというレベルで生じる最良の組み合わせであった。これらの結果はＧＦＰ及びＨＢｃの知見と一致している。
ＮＶＣＰの完全性（integrity）を、ウエスタンブロット法によって検証した。図５Ｂに示されるように、植物由来ＮＶＣＰは昆虫細胞由来ＮＶＣＰ標準と同様、約５８ＫＤａのバンドを示した。
ＢＹＮＶＣＰ葉抽出物を、ＶＬＰ集合を測定するためにショ糖勾配沈降に供した。図５Ｃに示されるように、精製昆虫細胞由来ＮＶＣＰは、主にＶＬＰとして画分＃１０、＃１１及び＃１２中に存在するが、植物由来ＮＶＣＰは、これら３つのＶＬＰ画分において、また非ＶＬＰ形態を示す上部画分において検出された。
２．ＢｅＹＤＶレプリコン系は非競合的である
インフルエンザＶＬＰ等の幾つかのタイプのＶＬＰ（非特許文献１６、非特許文献１７）、及び２種以上のタンパク質成分を含有する治療薬（ｍＡｂ等、下記を参照されたい）は、１つの細胞内での複数のタンパク質の同時発現を必要とする。異なるタンパク質をコードする２つのレプリコンが同時発現することができるか否かを試験するために、ベンサミアナタバコの葉にＢＹＧＦＰ及び／又はＢＹＤｓＲｅｄを浸潤させた。ＵＶ照射下で、ＢＹＧＦＰ／ＲＥＰ１１０／Ｐ１９及びＢＹＤｓＲｅｄ／ＲＥＰ１１０／Ｐ１９を浸潤させた領域は、それぞれ緑色及び赤色の蛍光を示したが、ＢＹＧＦＰ／ＢＹＤｓＲｅｄを同時浸潤させた領域の蛍光は、おそらくは緑色及び赤色の両方の蛍光の重なりのために黄色に見えた（図２Ｃ）。葉肉細胞プロトプラストを続いて浸潤させた領域から単離し、蛍光顕微鏡下で観察した。ＢＹＧＦＰ又はＢＹＤｓＲｅｄを個別に発現したプロトプラストの２つの集団を混合した場合、蛍光プロトプラストの重なりは観察されなかった（図６Ａ及び６Ｂ）。対照的に、ＢＹＧＦＰ／ＢＹＤｓＲｅｄの同時浸潤からの蛍光プロトプラストの大部分（＞８０％）が緑色及び赤色の両方の蛍光を示し（図６Ｃ及び６Ｄ）、同じ細胞におけるＧＦＰ及びＤｓＲｅｄの同時発現が示された。したがって、ＢｅＹＤＶレプリコン系は非競合的であり、これによりモノクローナルｍＡｂ等の多重サブユニットタンパク質の生産におけるその適用が可能となる（下記を参照されたい）。
２つの異なるレプリコンの形成が同時発現によって影響されないか否かを決定するために、浸潤させた葉から抽出されたＤＮＡをアガロースゲル及び続くサザンブロット法によって分析した。図９Ａに示されるように、分離したバンドは非浸潤、ＢＹＧＦＰ単独又はＢＹＤｓＲｅｄ単独の試料については観察されなかった。対照的に、約３ｋｂのバンドがＢＹＧＦＰ／ＲＥＰ１１０／Ｐ１９、ＢＹＤｓＲｅｄ／ＲＥＰ１１０／Ｐ１９及びＢＹＧＦＰ／ＢＹＤｓＲｅｄ／ＲＥＰ１１０／Ｐ１９のレーンにおいて可視化され、ＤＮＡレプリコンの効率的な形成が示された。バンドのサイズ（約３ｋｂ）は、ＧＦＰ遺伝子及びＤｓＲｅｄ遺伝子が非常によく似た長さであることから、ＢＹＧＦＰレプリコン及びＢＹＤｓＲｅｄレプリコンの両方について予想された通りであった。レプリコンの固有性をさらに検証するために、ＧＦＰプローブ及びＤｓＲｅｄプローブの両方を用いたサザンブロット法を行った。予想された通り、ＢＹＧＦＰ／ＲＥＰ１１０／Ｐ１９レプリコンはＧＦＰプローブのみと反応し、ＢＹＤｓＲｅｄ／ＲＥＰ１１０／Ｐ１９はＤｓＲｅｄプローブのみと反応したが（図９Ｂ〜図９Ｃ）、ＢＹＧＦＰ／ＢＹＤｓＲｅｄ／ＲＥＰ１１０／Ｐ１９試料はＧＦＰプローブ及びＤｓＲｅｄプローブの両方について陽性のシグナルを生じ、シグナル強度は対応する単一のレプリコンを示すものと同様であり（図９Ｂ〜図９Ｃ）、ＢＹＧＦＰ及びＢＹＤｓＲｅｄレプリコンがほぼ等しく同時発現されたことが示唆された。総合すると、これらの結果から、ＢｅＹＤＶレプリコン系が非競合的であり、これによりｍＡｂ等の薬学的に重要な多重サブユニットタンパク質の生産におけるその適用が可能となることが実証される。
３．エボラウイルスの糖タンパク質ｇｐ１に対する防御ｍＡｂの高収率一時的発現
非競合発現系の多用性を実証するために、エボラウイルス糖タンパク質ｇｐ１に対する防御ｍＡｂ（６Ｄ８）を、それぞれ６Ｄ８の重鎖サブユニット及び軽鎖サブユニットをコードする２つのレプリコンベクター（ｐＢＹ−Ｈ（６Ｄ８）及びｐＢＹ−Ｌ（６Ｄ８））（図１）をベンサミアナタバコの葉に同時浸潤することによって発現させた。結果から、６Ｄ８ ｍＡｂが感染後４日目〜６日目に、０．３ｍｇ／ｇＦＷ〜０．５ｍｇ／ｇＦＷという発現レベルで迅速に産生されたことが示された（図７Ａ）。ｍＡｂ発現のレベルは、植物ベースの発現系を用いてこれまでに達成された最も高いレベルに相当する（非特許文献１５）。ウエスタン分析によって、軽鎖及び重鎖の両方の存在が確認された（図７Ｂ、レーン３）。還元ゲル及び非還元ゲル上のバンドパターンを比較することによって、抗体が軽鎖又は重鎖において切り取られる（clipping）ことなく完全に集合したことが示された（図７Ｃ、レーン３）。完全に集合したヘテロ四量体の主要バンドに加えて、部分的に集合したヘテロ三量体、ヘテロ二量体等に相当する小（minor）バンドも、ウエスタンブロットでの非還元条件下で観察された（図７Ｃ、レーン３）。部分的に集合した分子に対する完全に集合した分子の比率は、ヒトＩｇＧ陽性対照の比率及びｍａｇｎＩＣＯＮ系によって生産されたｍＡｂの比率（非特許文献１５）と同様であり、ｍＡｂの集合が現在の最良の植物一時的系と同じくらい効率的であることが示された。
４．単一ベクターレプリコン系
収率を損なうことなく３ベクターレプリコン系を単純化する可能性を調べた。ウイルスＬＩＲプロモーターの制御下にある天然Ｃ１／Ｃ２コード領域を含有するレプリコンベクターを、ＧＦＰ（ｐＢＹＧＦＰ．Ｒ）及びＨＢｃ（ｐＢＹＨＢｃ．Ｒ）それぞれの発現のために構築した（図１）。５ｄｐｉに浸潤させた葉にＵＶ照射することによって、ＢＹＧＦＰ．Ｒ試料又はＢＹＧＦＰ．Ｒ／Ｐ１９試料が、ＢＹＧＦＰ／ＲＥＰ１１０／Ｐ１９と同様であるが、ＢＹＧＦＰ／ＲＥＰ１１０よりも高い強度で蛍光を示したことが明らかとなった（図２Ｄ）。また、ＢＹＨＢｃ．Ｒ試料及びＢＹＨＢｃ．Ｒ／Ｐ１９試料が、４ｄｐｉ又は７ｄｐｉに、ＢＹＨＢｃ／ＲＥＰ１１０／Ｐ１９に匹敵するレベルでＨＢｃを発現したことが見出された（図８）。ＢＹＨＢｃ／ＲＥＰ１１０／Ｐ１９試料は、７ｄｐｉに重度の壊死のために回収しなかった。これらの結果をまとめると、より単純な単一ベクターレプリコン系が、対象となるタンパク質の最終収率という観点で三成分系と同じくらい効率的であることが実証される。
単一レプリコンベクターを用いて２つの標的タンパク質を発現させるために、ｐＢＹＧＦＰＤｓＲｅｄ．ＲをＧＦＰ及びＤｓＲｅｄの同時発現のために構築した（図１）。タンデム結合したレプリコンが独立して放出及び増幅され、両方のタンパク質の効率的な発現が生じることが仮定された。ｐＢＹＧＦＰＤｓＲｅｄ．Ｒを浸潤させた葉から調製したプロトプラストの検査によって、ＧＦＰ蛍光及びＤｓＲｅｄ蛍光の両方が蛍光プロトプラストの約９５％において同時に検出されることが示された（図６Ｅ及び図６Ｆ）。したがって、単一レプリコンベクター系は、同じ細胞において複数の標的タンパク質の高レベルの同時発現を生じる。
３ベクターレプリコン系が収率を損なうことなく単純化することができることが示されている（Huang et al. 2009）。天然ＲＥＰ発現カセット（ウイルスＬＩＲプロモーターの制御下のＣ１／Ｃ２コード領域）を含有する単一ベクターレプリコン（図１中のＢＹＧＦＰ．Ｒ等）は、単一のタンパク質の発現について三ベクター系と同じくらい効率的である（Huang et al. 2009）。単一ベクターレプリコン系を複数のタンパク質を同時に発現させるのに使用することができるかを試験するため、ｐＢＹＧＦＰＤｓＲｅｄ．ＲをＧＦＰ及びＤｓＲｅｄの同時発現のために構築した（図１）。ｐＢＹＧＦＰＤｓＲｅｄ．Ｒを浸潤させた葉から調製したプロトプラストの検査によって、ＧＦＰ蛍光及びＤｓＲｅｄ蛍光の両方が蛍光プロトプラストの約９５％において同時に検出されることが示され（図６Ｅ及び図６Ｆ）、同じ細胞内での両方の蛍光タンパク質の高効率の同時発現が示された。浸潤させた葉からのＤＮＡの分析によって、ＢＹＧＦＰＤｓＲｅｄ．Ｒ試料が異なるサイズのレプリコン（ＧＦＰプローブ又はＤｓＲｅｄプローブとも異なる形で反応した）を産生したことが明らかとなり（図１０）、ＧＦＰレプリコン及びＤｓＲｅｄレプリコンの同時の存在が示される。ＢＹＧＦＰＤｓＲｅｄ．Ｒ試料については、最も強いＤｓＲｅｄプローブ反応バンドは約３．５ｋｂであり（図１０）、これはＢＹＧＦＰ．Ｒレプリコンのサイズと同様であり、このバンドが２つのＬＩＲ内に３５Ｓ／ＴＥＶ ５’−ＤｓＲｅｄ−ＶＳＰ ３’−ＳＩＲ−Ｃ２／Ｃ１配列を含むＤｓＲｅｄレプリコンを表すことが示唆される（図１を参照されたい）。一方、一番上のＧＦＰプローブ反応バンドは約２．６ｋｂであり（図１０）、これは２つの隣接ＬＩＲ要素間の３５Ｓ／ＴＭＶ ５’−ＧＦＰ−ｒｂｃＳ ３’−ＳＩＲ領域から構成されるより小さいレプリコンについて予想される（図１を参照されたい）。これらの結果から、２つのタンデム結合したレプリコンが、独立して放出及び増幅されることができ、２つの異なる二本鎖ＤＮＡレプリコンの高レベルの増殖及び両方のタンパク質の効率的な発現をもたらすことが実証される。興味深いことに、ＢＹＧＦＰＤｓＲｅｄ．Ｒレーンにおいて、約１．６ｋｂのバンドがＧＦＰプローブと反応し、わずかに高い約１．７ｋｂのバンドはＤｓＲｅｄプローブとあまり強く反応せず（図１０）、おそらくはそれぞれ対応するレプリコンの一本鎖ＤＮＡ形態を表すことも観察された。それにもかかわらず、データは、単一レプリコンベクター系を複数の標的タンパク質の高レベルの同時発現に使用することが実現可能であることを示している。
Ｂ．単一レプリコンベクターを用いた完全長ＩｇＧの同時発現及び集合
単一ベクターレプリコン系の有効性をさらに実証するために、Ｃ１／Ｃ２（Ｒｅｐ／ＲｅｐＡ）、６Ｄ８ ｍＡｂの軽鎖及び重鎖のコード配列に対する３つの発現カセットを有するベクターを構築した（ｐＢＹ−ＨＬ（６Ｄ８）．Ｒ、図１）。ＥＬＩＳＡによって、この単一ベクターｐＢＹ−ＨＬ（６Ｄ８）．Ｒの浸潤による６Ｄ８の発現レベルが、４つの別個のベクターの同時浸潤によって生じたものに匹敵する（これよりわずかに高い）ことが示された（図７）。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタン分析によって、ｐＢＹ−ＨＬ（６Ｄ８）．Ｒによって産生されるｍＡｂが、正しい軽鎖及び重鎖の成分を有し（図７Ｂ、レーン４）、同様に完全に集合する（データは示さない）ことが示される。これらのデータは、ｍＡｂ及び他の多重サブユニットタンパク質医薬品を製造する際のこの単純な系の潜在的な広い用途をさらに示した。
ＩＩ．考察
Ａ．単一ベクター、非競合レプリコン発現系の開発
単純な植物一時的発現系は、特に３つ以上の異なるサブユニットタンパク質の産生及び集合を必要とするような、重要な医薬品の迅速な高収率の生産に未だ利用可能ではない。そのため、この研究はかかる必要性に対処するよう設計されている。ジェミニウイルスの成員であるインゲン黄化萎縮ウイルス（ＢｅＹＤＶ）の複製機構を利用し、最終的に一連の最適化手順によって単一ベクターレプリコンベースの高収率の一時的な発現系を開発した。
ジェミニウイルスは感染細胞の核内で非常に高コピー数で複製する一本鎖環状ＤＮＡゲノムを有しているため、コピー数を増大させ、ウイルスレプリコンに連結する外来遺伝子の発現レベルを増進する遺伝子増幅戦略において非常に魅力的である（Palmer and Rybicki, 1998に概説されている）。Mor et al. (2003)は、タバコＮＴ−１細胞へのインゲン黄化萎縮ウイルス（ＢｅＹＤＶ）由来レプリコンベクター及びＲｅｐ／ＲｅｐＡ供給ベクターの陽子線照射（bombardment）による同時送達によって、レプリコン形成及び標的タンパク質の高度発現がもたらされたことを以前に示している。しかしながら、このプロセスは実際には拡張可能でない。本研究では、植物の葉へのレプリコンベクターのアグロバクテリウム媒介性送達によって、高コピー数のレプリコン形成がもたらされ（図３）、標的タンパク質の発現が劇的に増大したことが示された（図３Ａ及び図５Ａ）。実際、レプリコンＤＮＡは、その存在をＥｔｄＢｒ染色によって可視化することができるほど豊富である（図３Ｂ及び図３Ｃ）。データはまた、より高いＨＢｃ収率が高コピー数のレプリコンと相関することを明らかに示している（図３）。
ＰＭＰを高レベルで迅速に生産する際の三成分レプリコン系の有用性を示すために、初めに２つのワクチン抗原（ＨＢｃ及びＮＶＣＰ）を試験した。しかしながら、組み換えＨＢｃ及びＮＶＣＰは、以前にトランスジェニック植物において比較的低いレベルで発現されている（Tsuda et al., 1998、Mason et al., 1996）。例えば、トランスジェニック植物は、葉生体重１ｇ当たり最大で２４μｇのＨＢｃを発現した（Tsuda et al., 1998）。対照的に、レプリコン系は抗原を、感染後４日〜５日以内に、ＨＢｃ及びＮＶＣＰのそれぞれに関して平均して０．８ｍｇ／ｇＦＷ及び０．３４ｍｇ／ｇＦＷのレベルで産生した。抗原蓄積の速度及びレベルは、最先端のｍａｇｎＩＣＯＮ一時的発現系によってもたらされるものに匹敵する（非特許文献１４）。ここに報告した結果の他に、この系は、Ｎａｒｉｔａ１０４ノロウイルスカプシドタンパク質及びヒト乳頭腫ウイルスＬ１カプシドタンパク質を含む、幾つかの他のワクチン抗原を発現させるためにも首尾よく使用されている（未発表のデータ）。総合すると、ジェミニウイルスレプリコン系を使用して、ワクチン抗原を将来の商業的開発に好適な高いレベルで生産することができることが確立された。
最近まで、ヘテロオリゴマータンパク質を植物ウイルスベクターを用いて効率的に発現させることは、同じウイルス骨格上に構築したウイルスベクターの同時送達では常に、「競合レプリコン」の一般的なシナリオである、１つの細胞内での一方のベクターの早期の分離及びその後の選択的増幅が生じているために困難であった（非特許文献１５；Dietrich and Maiss, 2003；Diveki et al., 2002；Hull and Plaskitt, 1970）。この問題は最近になって、非競合ＴＭＶ及びＰＶＸのそれぞれに由来する２つのベクターセットを利用することによって克服された（非特許文献１５）。しかしながら、この系には、１つのタンパク質サブユニットにつき３つの構築モジュールの重感染が必要とされ（非特許文献１５）、このことは３つ以上のヘテロサブユニットを有するヘテロオリゴマータンパク質（分泌ＩｇＡ及びＩｇＭ等）が医薬用標的である場合に課題となり得る。今日現在、３つ以上のサブユニットを有する異種タンパク質の効率的な同時発現及び集合を可能にする植物一時的発現系の報告はない。
ほぼ完全長のウイルスゲノムのｉｎ ｐｌａｎｔａ集合及び複製に依存する、伝統的な又は「脱構築した」ウイルス発現系とは異なり、ＢｅＹＤＶ由来レプリコン系は、エピソームレプリコンの開始及び増幅にＬＩＲ領域及びＲｅｐ／ＲｅｐＡの２つのウイルス要素しか必要としない（Mor et al, 2003）。したがって、この系を複数のタンパク質サブユニットの非競合同時発現に使用することができると推測された。実際、２つの蛍光タンパク質（ＧＦＰ及びＤｓＲｅｄ）をコードするレプリコンの同時浸潤によって、両方の蛍光が示され、８０％を超える細胞が同じ細胞内で両方のタンパク質を同時発現し（図６）、ＢｅＹＤＶレプリコン系が非競合的であることが示された。
モノクローナル抗体の市場は、およそ１４億米ドルの規模であり、タンパク質治療薬市場全体の４分の１以上を占めると評価されており（２００５年）、以来、医薬品業界で最も急成長している分野であった（Monoclonal antibodies 2007, Arrowhead publishers）。ｍＡｂの効率的な生産は、医薬用タンパク質生産のための発現系の商業的実現可能性を評価する上で標準ベンチマークとなっていた。したがって、レプリコン系の多用性を、エボラウイルスＧＰ１に対する防御ｍＡｂを産生させることによってさらに実証した。結果から、レプリコン系が６Ｄ８ ｍＡｂを迅速に（４ｄｐｉ）産生し得ることが示された（図７）。さらに、このｍＡｂはその四量体構造まで正確に集合した（図７Ｃ）。本研究の素晴らしい結果の１つは、ｍＡｂ発現レベルが植物ベースの発現系を用いてこれまで達成された最高のｍＡｂレベルと同じ範囲にあることである（図７Ａ）（非特許文献１５）。６Ｄ８に加えて、完全な集合性（assembly）及び機能性を有する（未発表のデータ）６Ｄ８の２倍の大きさのｍＡｂ融合タンパク質も首尾よく発現された。高レベルの集合したｍＡｂ（及びｍＡｂ融合タンパク質）の迅速な生産の成功によって、ＰＭＰを生産する際の発現系の潜在的に広い用途が明らかに実証された。
レプリコン系が非競合的であることを踏まえ、多重サブユニットタンパク質医薬品候補の実際の生産にとって実現可能であるように系を単純化することに焦点を切り替えた。具体的には、本発明者らは、多重サブユニットＰＭＰを発現させるのに必要とされる多重ベクター系を、収率又は速度を損なう（comprising）ことなく単一ベクターに単純化することができるか否かを決定しようとした。初めにＲｅｐ／ＲｅｐＡ発現カセットをレプリコンベクターに組み込んだ。結果から、かかる単一ベクターのうち２つ（それぞれＧＦＰ又はＨＢｃを発現する（図１）、ｐＢＹＧＦＰ．Ｒ及びｐＢＹＨＢｃ．Ｒ）が、標的タンパク質の発現を誘導する際にそれらの三成分対応物と同じくらい効率的であることが示された（図２Ｄ及び図８）。第３の構築物では、Ｒｅｐに対する発現カセット、ｍＡｂ軽鎖に対するレプリコン及びｍＡｂ重鎖に対するレプリコンを単一ベクターに組み合わせた（図１）。注目すべきことに、この単一ベクターｐＢＹ−ＨＬ（６Ｄ８）．Ｒの感染によって、完全に集合したｍＡｂが、４つの別個のベクターの重感染によってもたらされるものと同様のレベルで産生された（図７）。上記の３つの選択されたタンパク質標的による結果を総合すると、多成分レプリコン系を、標的ＰＭＰの最終収率を犠牲にすることなく、より単純な単一ベクター系に首尾よく単純化することができることが示される。さらに、単一レプリコンベクターによる完全に集合した四量体ＩｇＧ（２つのヘテロオリゴマーサブユニット）の産生の成功から、４つものヘテロサブユニットの同時発現を、２つのレプリコンベクターを用いて、又は３つ以上のタンデム結合したレプリコンを有する単一ベクターを作り出すことによって容易に達成することができることが強く示唆される。知る限りでは、この技術はこれまでのところ、全ての植物一時的発現系の中で、かかる可能性を有する最初で唯一の発現系である。
上記の系によるＶＬＰワクチン及びｍＡｂの発現レベルは、最良の植物一時的系のレベルに匹敵するが、いかなる意味においても完全に最適化されてはいない。この系には、未だ改善されていない遺伝的及び技術的要素が依然として多く存在する。例えば、抗サイレンシング要素Ｐ１９を単純化した単一ベクター系に組み込むことができる。さらに、ジェミニウイルスベクターを脱構築して、ｍａｇＩＣＯＮ系におけるウイルス要素についてより良好な発現を達成することができる（非特許文献１２）。他の文献が示唆するように、高レベルのオリゴマーＰＭＰの蓄積によって要求される集合の増加に対処するために、シャペロンを発現カセットに組み入れてもよい（Nuttall et al., 2002）。
Ｂ．ＶＬＰ集合
多数のウイルス構造タンパク質が、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と称される組織的なマクロ分子構造（本物のビリオンを形態学的に模倣するが、感染性ウイルスゲノムを欠く）へと自己集合することができる。ＶＬＰは非常に免疫原性が高く、ワクチン、特に弱毒化生ウイルス又は不活化ウイルスベースのワクチンのより安全な代替品として使用することができる（Garcea and Gissmann, 2004）。例えば、酵母産生ＨＢｓＡｇ ＶＬＰは、史上初の組み換えサブユニットワクチンの構成要素である（McAleer et al., 1984）。この論文では、レプリコン系によって産生されるＨＢｃ及びＮＶＣＰがＶＬＰに集合するか否かが検査されている。ＨＢｃに関しては、ショ糖勾配分析、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット分析及び電子顕微鏡検査によって肯定的な結果が得られた（図４及び図５）。ＮＶＣＰ粗抽出物中のタンパク質の勾配分離を用いると、ショ糖勾配上に、集合したサブユニット（最上部画分、図５）及び集合したＶＬＰ（画分１０〜画分１２、図５）として部分的に割り当てられる２つのピークが検出された。後者のピークは、昆虫細胞において産生されるＶＬＰと共移動する（co-migrated）（図５）。この「２ピーク」パターンは、マウスにおいて非常に免疫原が高かった（Santi et al., 2008）ｍａｇｎＩＣＯＮ系によって産生されるＮＶＣＰについて観察されるものと同様である。したがって、このレプリコン系によって産生されるＶＬＰ形成抗原は、高次オリゴマーＶＬＰへと効率的に集合することができると結論付けられた。
Ｃ．トランスジェニック植物発現系におけるレプリコンベクターの適用
Arntzen et al., 2005において論考されるように、植物における抗原の発現に対して、安定なトランスジェニック遺伝子発現及びウイルスベクターによる一時的発現という２つの優越した戦略があった。本明細書中で提示したもののような一時的発現系は、初期特性化のための材料を提供する上で迅速な方法となるが、安定なトランスジェニック植物は極めて大量のＰＭＰ生産が必要とされる場合の最も有望な拡張性を秘めている。安定な系及び一時的な系の両方にとって、ｍＲＮＡ蓄積がタンパク質発現における障害となっている。しかしながら、安定なトランスジェニック技術は「位置効果」、すなわちｍＲＮＡレベルが染色体において導入遺伝子を挿入する位置に左右される（Matzke and Matzke, 1998）ためにさらに複雑である。このため、高度に発現するトランスジェニック系統の発見は統計作業となっており、数百又はさらには数千もの植物を、高レベルで発現する外れ値を特定するためにスクリーニングする必要がある。ジェミニウイルスのＲｅｐタンパク質に固有のニッキング機能（Laufs et al., 1995a、Laufs et al., 1995b）は、ＬＩＲのタンデムリピートの間にクローニングした組み換えウイルスＤＮＡの、染色体に組み込まれた部位からの複製放出を可能にする（Hayes et al., 1988、Grimsley et al., 1987、Kanevski et al., 1992）。次いで、ＤＮＡはエピソームとして核内で複製される。ジェミニウイルスレプリコンのこれらの特性から安定なトランスジェニックベクターの開発が可能となるが、この場合、ジェミニウイルスレプリコンのエピソーム複製性及び高コピー数によって導入遺伝子発現の位置効果が失われ、安定な形質転換植物における高い標的タンパク質発現レベルが保証される。以前の研究から、安定なトランスジェニックジャガイモにおいて誘導プロモーターによって誘導されたＲｅｐと同時発現させた、これまでのバージョンのインゲン黄化萎縮ウイルス由来ベクターが、ｍＲＮＡ発現において８０倍の増大をもたらし、トランスジェニックタンパク質発現において１０倍の増大をもたらしたことが実際に示された（Zhang and Mason, 2006）。この証拠によって、大規模ＰＭＰ生産のための高発現の安定なトランスジェニックベクターを開発するために、現在の改良されたバージョンのレプリコンを用いる際の成功の可能性がさらに支持される。一時的及び安定なトランスジェニック技術の両方における改良されたレプリコンベクターの利用はしたがって、医薬品候補の迅速な評価及び商業生産のための拡張可能なプラットフォームを可能にする。
総合すると、本研究により、ＶＬＰワクチン及び多重サブユニット治療薬を含む広範囲のＰＭＰに対して迅速な高レベルのＰＭＰ蓄積を達成することが可能である、ロバストなジェミニウイルスベースの発現系が開発された。ｍＡｂ及び他のヘテロオリゴマー製剤の生産のために複数の発現カセット／レプリコンを送達する単純化した単一ベクターの能力は、その商業生産の実現可能性において他の系に優る重要な利点をもたらす。さらに、この系を、大規模ＰＭＰ生産のための安定なトランスジェニック技術に適用することもできる。最適化され、商業的規模で実施されれば、この発現系は迅速に、効率的に、コスト効率よくかつ安全に医薬用タンパク質を生産する技術プラットフォームを提供する可能性を有する。
実施例２−組み換え免疫複合体（ＲＩＣ）の発現
本実施例は、２．８７ｋｂの遺伝子を発現して、１３０ｋＤａのタンパク質：モノクローナル抗体６Ｄ８の重鎖をコードする遺伝子（実施例１、結果、４．単一ベクターレプリコン系）をエボラウイルス糖タンパク質ＧＰ１（Ｈ２ｇｐＫＤＥＬ）に融合させた修飾免疫グロブリンを産生する、タンデム二重ジェミニウイルスレプリコン系の使用を説明するものである。タバコモザイク（ＲＮＡ）ウイルスベクターを用いた以前の研究では、高分子量タンパク質を産生するために発現及び翻訳することのできるＲＮＡ分子サイズの制限が示されている。例えば、マグニフェクション（magnifection）系は、最大で２．３ｋｂの遺伝子又は最大で８０ｋＤａのタンパク質を発現することができる（Gleba et al., 2007）。さらに、本実施例では、同じＴ−ＤＮＡプラスミドに組み入れられる別個のジェミニウイルスレプリコンにおける重鎖融合Ｈ２ｇｐＫＤＥＬ及び軽鎖Ｋ３の同時発現を実証する。
構築物ｐＢＹＲ−Ｈ２ｇｐＫＤＥＬ−Ｋ３は、実施例１（結果、４．単一ベクターレプリコン系）に記載されるｐＢＹ−ＨＬ（６Ｄ８）．Ｒに類似しており、それに由来する。ｐＢＹＲ−Ｈ２ｇｐＫＤＥＬ−Ｋ３を構築するために、ヘキサペプチドＳＥＫＤＥＬのＣ末端付加を有するエボラウイルス（Ｚａｉｒｅ株、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＹ３５４４５８）ＧＰ１をコードする１４０７ｂｐの植物最適化遺伝子を、基本的に記載のように（Chargelegue et al., 2005）、ヒト化６Ｄ８ Ｈ２重鎖のＣ末端にリンカー（Ｇ４Ｓ）３を介して融合させた。この重鎖融合体（Ｈ２ｇｐＫＤＥＬ）を、ｐＢＹ−ＨＬ（６Ｄ８）．Ｒに６Ｄ８重鎖の代わりにライゲートさせて、二重レプリコン構築物ｐＢＹＲ−Ｈ２ｇｐＫＤＥＬ−Ｋ３を得た。このＴ−ＤＮＡプラスミドを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＬＢＡ４４０４に電気穿孔し、プラスミド調製及び制限消化によって確認した。
アグロバクテリウム培養物（Ｏ．Ｄ．６００＝０．２５）を、Ｐ１９構築物（実施例１）を有する等量のアグロバクテリウム（Agrobaceria）（Ｏ．Ｄ．６００＝０．２５）と混合し、４週齢〜５週齢の全ベンサミアナタバコ植物の葉に減圧浸潤させた。葉を４日後に採取し、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）及びプロテアーゼ阻害剤錠剤（Sigma Chemicals）を含有する抽出バッファーを用いて実施例１に記載されるように抽出した。次いで、取り出した上清（１００００×ｇ）を硫酸アンモニウム分画に供し、３５％〜６０％画分にＲＩＣを得た。ＲＩＣ画分を次いで、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）に商品パンフレットに記載されるように供した。
還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による精製工程の結果を図１１に示す。硫酸アンモニウム分画によって、ＲｕＢＰカルボキシラーゼの大半が除去され、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーによって、幾らかの明らかなタンパク質分解産物（レーン７、レーン８、レーン９）と共に高度に精製された重鎖及び軽鎖が得られた。
還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによって分析した精製ＲＩＣを図１２に示す。抗ヒトγ鎖及び抗ＧＰ１（６Ｄ８エピトープ）用のプローブによって、１３０ｋＤａにバンドが検出された（予想された完全長Ｈ２ｇｐＫＤＥＬ融合体）。また、抗γ鎖プローブによって、１１０ｋＤａ、５５ｋＤａ及び５０ｋＤａに３つの他のバンドが検出された（完全長融合タンパク質のタンパク質分解（proteoltyic）産物を表すと考えられる）。κ鎖プローブによって、予想された２５ｋＤａのタンパク質が示された。したがって、二重レプリコンベクターｐＢＹＲ−Ｈ２ｇｐＫＤＥＬ−Ｋ３を用いると重鎖融合体（Ｈ２ｇｐＫＤＥＬ）及び軽鎖の両方が発現し、蓄積した。この系を用いて発現させることのできるコード配列の長さに対する実際的な限界は、見出されていない。
実施例３−方法
ベクター構成
３５Ｓプロモーター／ＴＥＶ ５’ ＵＴＲとＶＳＰターミネーターとの間に天然ＢｅＹＤＶ Ｃ１／Ｃ２遺伝子を含有するプラスミドｐＢＹ０３６は、以前に記載されている（Mor et al., 2003）。Ｃ１／Ｃ２発現カセットをＸｈｏＩ／ＳａｃＩ消化によってｐＢＹ０３６から放出させ、ｐＰＳ１（Huang and Mason, 2004）に同じ部位から挿入し、Ｒｅｐ及びＲｅｐＡの両方の発現のためのバイナリーベクターｐＲＥＰ１１０を作製した（図１）。バイナリーベクターｐＲＥＰ１１１をＲｅｐのみの発現のためにｐＢＹ０３７（Mor et al., 2003）から同様に作製した。トマトブッシースタントウイルスに由来するＰ１９遺伝子を、プライマーＰ１９−Ｂａｍ（５’−ｔｃａａｇｇａｔｃｃａｔｇｇａａｃｇａｇｃｔａｔａｃａ）（配列番号１）及びＰ１９−Ｓａｃ（５’−ａｇａｇｇａｇｃｔｃｔｔａｃｔｃｇｃｃｔｔｃｔｔｔｔｔｃ）（配列番号２）を用いて、ｐＴＢＳＶ（H. Scholthof、テキサスＡ＆Ｍ大学）から増幅し、ＮｃｏＩびＳａｃＩで消化し、ｐＰＳ１に挿入し、バイナリーベクターｐＰＳＰ１９を得た。
レプリコンベクターを、骨格ベクターｐＢＹ０２３（Mor et al., 2003）をベースにして構築した。ｐＢＹｓＮＶ４１０（Zhang and Mason, 2006）中のＮＶＣＰレプリコンを、ＡｓｃＩ及びＦｓｅＩでの消化によって放出させ、ｐＢＹ０２３に同じ部位でライゲートさせて、ｐＢＹＮＶＣＰを作製した。ＧＦＰ遺伝子を、ｐＩＣＨ７４１０（非特許文献１２）（Icon Genetics）からプライマーＰ−ＧＦＰ／ＮｃｏＩ．Ｆ（５’−ＧＴＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧ）（配列番号３）及びＰ−ＧＦＰ／ＳａｃＩ．Ｒ（５’−ＡＴＴＡＧＡＧＣＴＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣ）（配列番号４）を用いて増幅し、ＮｃｏＩ及びＳａｃＩで消化し、ｐＩＢＴ２１０（Haq et al., 1995）に挿入して、ｐＧＦＰｉ２１０を作製した。ＴＥＶ ５’ＵＴＲ−ＧＦＰを含有するＸｈｏＩ−ＳａｃＩ断片を、ｐＢＹｓＮＶ１１０（Zhang et al., 2006）の同じ部位にライゲートさせて、ｐＢＹＧＦＰを作製した。ＤｓＲｅｄ遺伝子を、プライマー５’−ＡＴＣＧＴＣＴＡＧＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧＣＧＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧ（配列番号５）及び５’−ＡＴＴＡＧＡＧＣＴＣＣＴＡＣＡＧＧＡＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧ（配列番号６）を用いてｐＤｓＲｅｄ１−１（Clontechカタログ番号６９２２−１）から増幅し、ＸｂａＩ及びＳａｃＩで消化し、ｐＩＢＴ２１０にライゲートさせて、ｐＩＢＴ−ＤｓＲｅｄを作製し、それからＸｈｏＩ−ＳａｃＩ断片をｐＢＹＧＦＰに挿入し（substituted into）、ｐＢＹＤｓＲｅｄを作製した。Ｂ型肝炎コア抗原遺伝子（ＨＢｃ）を、ｐＩＣＨ−ＨＢｃ（非特許文献１４）からＮｃｏＩ−ＳａｃＩでの消化によって得て、ｐＩＢＴ２１０にライゲートさせた後、ＸｈｏＩ−ＳａｃＩによってｐＢＹＧＦＰにサブクローニングし、ｐＢＹＨＢｃを作製した。Ｒｅｐ遺伝子含有レプリコンを、ｐＢＹ００２（Mor et al., 2003）に由来するＢｅＹＤＶ Ｃ１／Ｃ２遺伝子の７２７ｂｐのＢａｍＨＩ断片のｐＢＹＧＦＰ及びｐＢＹＨＢｃへの挿入によって作製し、それぞれｐＢＹＧＦＰ．Ｒ及びｐＢＹＨＢｃ．Ｒを作製した。
タンデム二重レプリコン構築物では、プライマー３５Ｓ−Ｓｄａ（５’−ＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧｇＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＣＡ）（配列番号７）及びＶＳＰＨＴ（５’−ＴＧＡＡＴＡＧＴＧＣＡＴＡＴＣＡＧＣＡＴＡＣＣＴＴＡ）（配列番号８）によるｐＢＹＤｓＲｅｄ及びｐＩＢＴ２１０．３（Judge et al., 2004）における発現カセットの増幅によって得られた、単一のエンハンサー要素を有するＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを使用した。ｐＩＢＴ２１０．３から増幅された断片中のプロモーター及びタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の５’−ＵＴＲ、ｐＢＹＧＦＰに由来するＧＦＰ遺伝子、及びエンドウマメリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット（ｒｂｃＳ）ターミネーター（Friedrichsen et al., 2000）を、ｐＢＹ０２４（Mor et al., 2003）のＰｓｔＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位に共にライゲートさせ、ｐＢＹＧＦＰ２１０．３を作製した。ｐＢＹＧＦＰ２１０．３をＢａｍＨＩで消化し、クレノウ酵素で充填し（filling）、次いでＡｓｃＩで消化することによって得られたＧＦＰレプリコンを含有する断片を、ＡｓｃＩで消化し、クレノウ酵素で充填し、次いでＳａｃＩで消化した３５Ｓ−Ｓｄａ増幅ｐＢＹＤｓＲｅｄレプリコンと共に、ＡｓｃＩ及びＳａｃＩで消化したベクターｐＢＹＨＢｃ．Ｒにライゲートさせ、ｐＢＹ−ＧＦＰＤｓＲｅｄ．Ｒを作製した。
マウスモノクローナル抗体６Ｄ８（Wilson et al., 2000）の重鎖（Ｈ２）及び軽鎖（Ｋ３）の遺伝子配列を、ヒト定常領域配列をγ鎖タイプ１及びκ鎖（Biovation，Edinburgh，Scotland）で置換することによってヒトに対して脱免疫化した（de-immunized）。得られる配列を使用して、植物コドン最適化遺伝子を設計し、商業的に合成した（Retrogen，San Diego，CA）。ｐＣＨＦ４−６Ｄ８−Ｈ２（Mapp Biopharmaceutical, Inc.）中のＨ２遺伝子を、プライマーＨ２−ＳＥＫＤＥＬ−Ｋｐｎ（５’−ＧＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＡＧＣＴＣＡＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＡＧＧＡＧＡＧ）（配列番号９）によるＰＣＲによって、Ｃ末端「ＳＥＫＤＥＬ」ヘキサペプチドを付加するように末端処理して（end-tailored）、ＮｃｏＩ及びＫｐｎＩで消化し、ｐＰＳ１に挿入し、ｐ６Ｄ８−Ｈ２を作製し、それからＴＥＶ５’−ＵＴＲ−Ｈ２−ＶＳＰ３’を含有するＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＢＹＧＦＰに挿入し、ｐＢＹＨ（６Ｄ８）を作製した。ｐＣＨＦ４−６Ｄ８−Ｋ３（Mapp Biopharmaceutical, Inc.）中のＫ３遺伝子をＮｃｏＩ−ＫｐｎＩ断片として得て、３５ＳプロモーターＴＭＶ５’及びｒｂｃＳ３’エレメントとライゲートさせ、これを（thus）ｐＢＹＧＦＰベクターに挿入して、ｐＢＹ−Ｌ（６Ｄ８）を作製した。ｐＢＹ−Ｌ（６Ｄ８）からのレプリコン（ＬＩＲからＳＩＲまで）をｐＢＹＧＦＰ．Ｒに挿入し、ｐＢＹＫ３Ｒを作製した。Ｈ２−ＳＥＫＤＥＬ断片を、ｐＢＹ−Ｈ（６Ｄ８）からプライマーＨ２−Ｘｂａ（５’−ＡＣＧＡＴＣＴＡＧＡＡＣＡＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＴＴＧＣＡＴＣ）（配列番号１０）及びＶＳＰＨＴを用いて増幅し、ＸｂａＩ及びＫｐｎＩで消化し、ベクターｐＢＹ０２７（Mor et al., 2003）に挿入し、ｐＢＹ−Ｈ２Ｋ２１０を作製した。次いで、ｐＢＹ−Ｈ２Ｋ２１０からのレプリコンをｐＢＹＫ３Ｒに挿入し、タンデム二重レプリコン構築物ｐＢＹ−ＨＬ（６Ｄ８）．Ｒを作製した。
アグロインフィルトレーション手順
バイナリーベクターを、電気穿孔によりアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４に別個に導入した。得られた株をプラスミドの制限消化によって検証し、３０℃で一晩増殖させ、温室栽培した６週齢〜８週齢のベンサミアナタバコ植物の葉の浸潤に使用した。簡潔に述べると、細菌を５０００×ｇで５分間の遠心分離によって沈殿させた後、浸潤バッファー（１０ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ５．５）及び１０ｍＭ ＭｇＳＯ４）に、６００ｎｍで所望の光学密度（ＯＤ）まで再懸濁した。得られた細菌懸濁液を単独で又は幾つかの株の混合物として、完全に展開した葉に針を有しないシリンジを用いて小さく穴をあけて注入した（Huang and Mason, 2004）。
植物ＤＮＡ抽出及びサザンブロット法
植物の葉から全ＤＮＡを記載のように（Zhang and Mason, 2006）抽出した。ＤＮＡ（約３μｇ）を消化しないか、又はＸｈｏＩで消化し、０．８％アガロースゲルに溶解し、エチジウムブロマイドで染色し、ナイロンメンブレン（Ｚｅｔａ−ｐｒｏｂｅ，Bio-Rad，Hercules，CA）に転写した。次いで、メンブレンを、ＨＢｃ遺伝子のそれぞれ５’末端（−ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴ−）（配列番号１１）及び３’末端（−ＴＴＡＡＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴＣＣＣＴ−）（配列番号１２）に固定されたプライマーによるＰＣＲによって、製造業者の使用説明書（Roche Applied Science，Indianapolis，IN）に従って合成したジゴキシゲニン（digoxygenin）（ＤＩＧ）標識ＨＢｃ特異的プローブとハイブリダイズさせた。
植物ＲＮＡ抽出及びノーザンブロット法
全ＲＮＡの単離及びＲＮＡブロット分析を記載のように（Zhang and Mason, 2006）行った。ＨＢｃの転写産物を、ＤＮＡブロットに対して調製したＤＩＧ標識プローブを用いて検出した。
タンパク質分析
ＨＢｃ分析のために、ベンサミアナタバコの葉から全可溶性タンパク質を抽出し、以前に記載されるように（Huang et al., 2005）測定した。全ＨＢｃを、以前に記載されるように（非特許文献１４）、わずかに変更を加えて（５０００倍に希釈したマウスポリクローナル抗ＨＢｃ［腹腔内注射した大腸菌由来組み換えＨＢｃ（ViroGen，Watertown，MA）］を検出に使用した）サンドイッチＥＬＩＳＡによって定量化した。ドットブロット法、ウエスタンブロット法及びショ糖勾配沈降を以前に記載されるように（非特許文献１４）行った。
ＮＶＣＰ分析のために、全葉タンパク質をＦａｓｔＰｒｅｐ装置を用いて氷冷酸抽出バッファー（２５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．７５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム及び１０μｇ／ｍｌのロイペプチン）で抽出し、取り出した上清を記載のように（Mason et al., 1996）ＥＬＩＳＡによってＮＶＣＰについてアッセイした。ウエスタンブロット法を、ウサギ抗ｒＮＶ血清でプローブする以外は以前に記載されるように（Mason et al., 1996）行った。ＮＶＣＰ抽出物のショ糖勾配沈降は、変更したプロトコル（Mason et al., 1996）に従った。簡潔に述べると、植物抽出物又は昆虫細胞由来ＮＶＣＰ標準を、変性リン酸バッファー（２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．７５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ）中に溶解した５ｍｌの１０％から６０％の線形のショ糖勾配上に重層した。BeckmanのＳＷ５５Ｔｉローターにおいて４℃、４５０００ｒｐｍで３時間遠心分離した後、１５個の画分（各々０．３３３ｍｌ）を取り、ＮＶＣＰ含量についてＥＬＩＳＡによってアッセイした。
６Ｄ８ ｍＡｂ分析については、全葉タンパク質を、ＦａｓｔＰｒｅｐ装置（Ｂｉｏ１０１）を用いて抽出バッファー（２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．６）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍｇ／ｍｌのアスコルビン酸ナトリウム、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、０．３ｍｇ／ｍｌのフッ化フェニルメチルスルホニル）で抽出した。精製した（clarified）全タンパク質抽出物を、以前に記載されるように（非特許文献１５）、ｍＡｂの集合形態（軽鎖及び重鎖の両方を有する）を検出するように設計したＥＬＩＳＡによって分析した。具体的には、プレートをγ重鎖に特異的なヤギ抗ヒトＩｇＧ（Southern Biotech）でコーティングした。植物タンパク質抽出物とのインキュベーション後、ＨＲＰ結合抗ヒトκ鎖抗体（Southern Biotech）を検出抗体として使用した。上記のγ鎖及びκ鎖特異的抗体もウエスタンブロット分析に使用した。
電子顕微鏡検査
ＨＢｃを以前に記載されるように（非特許文献１４）浸潤させた葉から部分的に精製した。部分的に精製したＨＢｃを０．５％酢酸ウラニル水溶液でのネガティブ染色に供し、透過電子顕微鏡検査をPhilipsのＣＭ−１２Ｓ顕微鏡を用いて行った。
ベンサミアナタバコ葉肉細胞プロトプラストの単離
プロトプラストを、０．４Ｍマンニトール、８ｍＭ ＣａＣｌ２、０．４％セルラーゼ及び０．４％Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ Ｒ−１０を含有する溶液中での室温で１０時間〜１６時間のインキュベーションによって浸潤させた葉組織から放出させた。放出させたプロトプラストを孔径６２μｍのナイロンメッシュを通して濾過した。
ＧＦＰ及びＤｓＲｅｄの可視化
ＧＦＰを発現する葉を、Ｂ−１００ＡＰランプ（UVP，Upland，CA）によって発生させたＵＶ照射下で観察した。ＧＦＰ及びＤｓＲｅｄを同時発現する葉を、ＵＶＧＬ−２５ランプ（UVP，Upland，CA）の下で観察した。プロトプラストを、ＧＦＰフィルターセット（Chroma番号４１０２８；励起フィルター、５００／２０ｎｍ；蛍光（emission）フィルター、５３５／３０ｎｍ）及びＤｓＲｅｄフィルターセット（Chroma番号４２００５；励起フィルター、５４０／４０ｎｍ；蛍光フィルター、６００／５０ｎｍ）を有するNikonの倒立顕微鏡で観察した。
本明細書中で開示及びクレームされる組成物及び方法は全て、過度の実験なく、本開示に照らして作製及び実行することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態の観点から記載されているが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、組成物及び方法に対して、及び本明細書中に記載される方法の工程又は一連の工程において変更を加えることができることは当業者に明らかである。より具体的には、同じ又は同様の結果が達成されれば、化学的にかつ生理学的に関連する或る特定の薬剤が、本明細書中に記載される薬剤の代替となり得ることが明らかである。当業者に明らかな、かかる同様の代替物及び変更は全て、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲及び概念の内にあると見なされる。

Claims (16)

  1. 複数のレプリコンを用いて植物細胞においてタンパク質複合体を産生させる方法であって、
    プロモーター及び第１の対象となる産物をコードする第１の領域、並びに該プロモーター及び第１の領域をはさんで位置する２つの長い遺伝子間領域（ＬＩＲ）及び短い遺伝子間領域（ＳＩＲ）を含む第１のレプリコンであって、ＬＩＲ−（プロモーター−第１のコード領域）−ＳＩＲ−ＬＩＲ構造を有し、該ＬＩＲ及びＳＩＲはそれぞれ、ジェミニウイルスゲノムの長い遺伝子間領域（ＬＩＲ）及び短い遺伝子間領域（ＳＩＲ）である、第１のレプリコンを得ること、
    プロモーター及び第２の対象となる産物をコードする第２の領域、並びに該プロモーター及び第２の領域をはさんで位置する２つの長い遺伝子間領域（ＬＩＲ）及び短い遺伝子間領域（ＳＩＲ）を含む第２のレプリコンであって、ＬＩＲ−（プロモーター−第２のコード領域）−ＳＩＲ−ＬＩＲ構造を有し、該ＬＩＲ及びＳＩＲはそれぞれ、ジェミニウイルスゲノムの長い遺伝子間領域（ＬＩＲ）及び短い遺伝子間領域（ＳＩＲ）である、第２のレプリコンを得ること、
    プロモーター及びジェミニウイルスゲノムのＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質をコードする核酸を含む核酸セグメントを得ること、
    前記第１のレプリコン及び第２のレプリコン、並びに前記核酸セグメントを植物細胞に導入して、第１の領域及び第２の領域それぞれの複製及び一時的発現を引き起こすこと；
    並びに前記第１の対象となる産物と前記第２の対象となる産物とを含む前記タンパク質複合体を前記植物細胞において産生させることを含み、
    前記第１のレプリコンと前記第２のレプリコンとは非競合であり、
    前記第１のレプリコンと前記第２のレプリコンとは別個のレプリコンである、方法。
  2. 前記タンパク質複合体は抗原である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記抗原はＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃ）又はノーウォークウイルスカプシドタンパク質（ＮＶＣＰ）である、請求項２に記載の方法。
  4. さらに、プロモーター、ジェミニウイルスゲノムのＬＩＲ及びＳＩＲ、及び第３の対象となる産物をコードする第３の領域を含む第３のレプリコンを得ることを含み、
    該第３のレプリコンは、ＬＩＲ−（プロモーター−第３のコード領域）−ＳＩＲ−ＬＩＲ構造を含み、
    該第３のレプリコンは前記植物細胞に導入されて第３の対象となる産物をコードする第３の領域の複製及び一時的発現を引き起こされ；前記タンパク質複合体は前記第１の対象となる産物、前記第２の対象となる産物及び該第３の対象となる産物を含み；
    前記第１のレプリコンと前記第２のレプリコンと該第３のレプリコンとは非競合であり；
    前記第１のレプリコンと前記第２のレプリコンと該第３のレプリコンとは別個のレプリコンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. さらに、プロモーター及びトマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９を含む核酸セグメントを得ることを含み、
    該遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９を含む核酸セグメントは前記植物細胞に導入されて複製及び一時的発現を引き起こされる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 植物細胞において完全に集合した多成分系タンパク質複合体を産生させる方法であって、
    （ａ）複数のレプリコンを含む単一のベクターであって、
    （ｉ）それぞれが動作可能に連結したＬＩＲ−プロモーター１−コード領域１−ＳＩＲ−ＬＩＲ構造を含む第１のレプリコンであって、コード領域１は第１の対象となる産物をコードし、両側のＬＩＲはジェミニウイルスゲノムの長い遺伝子間領域であって、ＳＩＲはジェミニウイルスゲノムの短い遺伝子間領域である、第１のレプリコンと、
    （ｉｉ）それぞれが動作可能に連結したＬＩＲ−プロモーター２−コード領域２−ＳＩＲ−Ｃ２／Ｃ１−ＬＩＲ構造を含む第２のレプリコンであって、コード領域２はコード領域１とは異なる第２の対象となる産物をコードし、両側のＬＩＲはジェミニウイルスゲノムの長い遺伝子間領域であって、Ｃ２／Ｃ１はジェミニウイルスゲノムのＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質をコードし、ＳＩＲはジェミニウイルスゲノムの短い遺伝子間領域である、第２のレプリコンと、を含み、
    該第２のレプリコンは、該複数のレプリコンを含む単一のベクターにおいて、該第１のレプリコンに動作可能にタンデム結合して、該第１のレプリコンの一方の端のＬＩＲを共有することにより、タンデム結合した２つのレプリコンは、ＬＩＲ−プロモーター１−コード領域１−ＳＩＲ−ＬＩＲ−プロモーター２−コード領域２−ＳＩＲ−Ｃ２／Ｃ１−ＬＩＲ構造を有し、
    該タンデム結合したレプリコンの該コード領域１及び該コード領域２は、それぞれ同時に、だが独立して、増幅されることが可能であり；それぞれのコード領域の増幅は非競合かつ高レベルであり；該対象となる産物はタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである、
    複数のレプリコンを含む単一のベクターを得ること、
    （ｂ）該複数のレプリコンを含む単一のベクターを植物細胞に導入すること、並びに
    （ｃ）該複数のレプリコンを含む単一のベクターのそれぞれのコード領域を独立かつ非競合に増幅及び発現させ、その後、それぞれのコード領域の対象となる産物を含む該多成分系タンパク質複合体を完全に集合させること、
    を含む方法。
  7. 前記多成分系タンパク質複合体は抗エボラウイルス糖タンパク質（ＧＰ１）抗体（６Ｄ８）であり、前記コード領域１及び前記コード領域２からの産物はそれぞれ、抗エボラウイルス糖タンパク質（ＧＰ１）抗体（６Ｄ８）の重鎖及び軽鎖である、請求項６に記載の方法。
  8. 複数のレプリコンを含む単一ベクター系であって、
    それぞれが動作可能に連結したＬＩＲ−プロモーター１−コード領域１−ＳＩＲ−ＬＩＲ構造を含む第１のレプリコンであって、コード領域１は第１の対象となる産物をコードし、両側のＬＩＲはジェミニウイルスゲノムの長い遺伝子間領域であって、ＳＩＲはジェミニウイルスゲノムの短い遺伝子間領域である、第１のレプリコンと、
    それぞれが動作可能に連結したＬＩＲ−プロモーター２−コード領域２−ＳＩＲ−Ｃ２／Ｃ１−ＬＩＲ構造を含む第２のレプリコンであって、コード領域２はコード領域１とは異なる第２の対象となる産物をコードし、両側のＬＩＲはジェミニウイルスゲノムの長い遺伝子間領域であって、Ｃ２／Ｃ１はジェミニウイルスゲノムのＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質をコードし、ＳＩＲはジェミニウイルスゲノムの短い遺伝子間領域である、第２のレプリコンと、
    を含み、
    該第２のレプリコンは、該第１のレプリコンに動作可能にタンデム結合して、該第１のレプリコンの一方の端のＬＩＲを共有することにより、タンデム結合した２つのレプリコンは、ＬＩＲ−プロモーター１−コード領域１−ＳＩＲ−ＬＩＲ−プロモーター２−コード領域２−ＳＩＲ−Ｃ２／Ｃ１−ＬＩＲ構造を有し、
    該タンデム結合したレプリコンの該コード領域１及び該コード領域２のそれぞれは、同時に、だが独立して、増幅されることが可能であり；それぞれのコード領域１の増幅は非競合かつ高レベルであり；該対象となる産物はタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドであり；該対象となるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは完全に集合させること
    により多成分系タンパク質複合体を産生することが可能である、
    複数のレプリコンを含む単一ベクター系。
  9. それぞれが動作可能に連結したＬＩＲ−コード領域ｎ−ＳＩＲ−ＬＩＲ構造を含む１又は複数のレプリコンをさらに含み、該追加の１又は複数のレプリコンは上流のレプリコンとタンデム結合し、それぞれの下流のレプリコンはその一方の端のＬＩＲを上流のレプリコンと共有し、コード領域ｎはコード領域１及びコード領域２とは異なる対象となる産物をコードし、該コード領域ｎの産物はタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドであり；
    該タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは完全に集合させることにより多成分系タンパク質複合体を産生することが可能である、請求項８に記載の複数のレプリコンを含む単一ベクター系。
  10. ひとつのレプリコンのコード領域ｎは遺伝子サイレンシング阻害因子をコードする、請求項９に記載の複数のレプリコンを含む単一ベクター系。
  11. プロモーターｎはプロモーター１及びプロモーター２とは異なるプロモーターである、請求項９または１０に記載の複数のレプリコンを含む単一ベクター系、ただしコード領域ｎはプロモーターｎと作動可能に連結している。
  12. プロモーター１、プロモーター２及びプロモーターｎは同じプロモーターである、請求項９または１０に記載の複数のレプリコンを含む単一ベクター系、ただしコード領域ｎはプロモーターｎと作動可能に連結している。
  13. 前記コード領域１及び前記コード領域２の産物は、完全に集合させることにより形成される多成分系タンパク質複合体の２つのサブユニットである、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の複数のレプリコンを含む単一ベクター系。
  14. 前記２つのサブユニットはそれぞれ、抗エボラウイルス糖タンパク質（ＧＰ１）抗体（６Ｄ８）の重鎖及び軽鎖である、請求項１３に記載の複数のレプリコンを含む単一ベクター系。
  15. ３つのレプリコンを含む単一ベクター系であって、
    それぞれが動作可能に連結したＬＩＲ−プロモーター１−コード領域１−ＳＩＲ−ＬＩＲ構造を含む第１のレプリコンであって、コード領域１は対象となる産物をコードする第１のレプリコンと、
    それぞれが動作可能に連結したＬＩＲ−プロモーター２−コード領域２−ＳＩＲ−Ｃ２／Ｃ１−ＬＩＲ構造を含む第２のレプリコンであって、コード領域２はコード領域１とは異なる対象となる産物をコードし、Ｃ２／Ｃ１はジェミニウイルスゲノムのＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質をコードする、第２のレプリコンと、
    それぞれが動作可能に連結したＬＩＲ−プロモーター３−コード領域３−ＳＩＲ−ＬＩＲ構造を含む第３のレプリコンであって、コード領域３はトマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９をコードする、第３のレプリコンと、を含み、
    該第１、第２、第３のそれぞれのレプリコンにおいて、両側のＬＩＲはジェミニウイルスゲノムの長い遺伝子間領域であって、ＳＩＲはジェミニウイルスゲノムの短い遺伝子間領域であり、
    該第２のレプリコンは、該第１のレプリコンに動作可能にタンデム結合して、該第１のレプリコンの一方の端のＬＩＲを共有し；該第３のレプリコンは、該第２のレプリコンに動作可能にタンデム結合して、該第２のレプリコンの、該第１のレプリコンとタンデム結合を形成しない側の端のＬＩＲを共有し、
    該タンデム結合したレプリコンの該コード領域１、該コード領域２及び該コード領域３のそれぞれは、同時に、だが独立して、増幅されることが可能であり；それぞれのコード領域の増幅は非競合かつ高レベルであり；それぞれのコード領域の対象となる産物は同時にかつ独立して放出され；該対象となる産物はタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドであり；該対象となるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは完全に集合させること
    により多成分系タンパク質複合体を産生することが可能である、
    単一ベクター系。
  16. ４つのレプリコンを含む単一ベクター系であって、
    それぞれが動作可能に連結したＬＩＲ−プロモーター１−コード領域１−ＳＩＲ−ＬＩＲ構造を含む第１のレプリコンであって、コード領域１は対象となる産物をコードする第１のレプリコンと、
    それぞれが動作可能に連結したＬＩＲ−プロモーター２−コード領域２−ＳＩＲ−Ｃ２／Ｃ１−ＬＩＲ構造を含む第２のレプリコンであって、コード領域２はコード領域１とは異なる対象となる産物をコードし、Ｃ２／Ｃ１はジェミニウイルスゲノムのＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質をコードする第２のレプリコンと、
    それぞれが動作可能に連結したＬＩＲ−プロモーター３−コード領域３−ＳＩＲ−ＬＩＲ構造を含む第３のレプリコンであって、コード領域３はコード領域１及びコード領域２とは異なる対象となる産物をコードする、第３のレプリコンと、
    それぞれが動作可能に連結したＬＩＲ−プロモーター４−コード領域４−ＳＩＲ−ＬＩＲ構造を含む第４のレプリコンであって、コード領域４はトマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９をコードする、第４のレプリコンと、を含み、
    該第１、第２、第３、第４のそれぞれのレプリコンにおいて、両側のＬＩＲはジェミニウイルスゲノムの長い遺伝子間領域であって、ＳＩＲはジェミニウイルスゲノムの短い遺伝子間領域であり、
    該第２のレプリコンは、該第１のレプリコンに動作可能にタンデム結合して、該第１のレプリコンの一方の端のＬＩＲを共有し；該第３のレプリコンは、該第２のレプリコンに動作可能にタンデム結合して、該第２のレプリコンの、該第１のレプリコンとタンデム結合を形成しない側の端のＬＩＲを共有し；該第４のレプリコンは、該第３のレプリコンに動作可能にタンデム結合して、該第３のレプリコンの、該第２のレプリコンとタンデム結合を形成しない側の端のＬＩＲを共有し、
    該タンデム結合したレプリコンの該コード領域１、該コード領域２、該コード領域３及び該コード領域４のそれぞれは、同時に、だが独立して、増幅されることが可能であり；
    それぞれのコード領域の増幅は非競合かつ高レベルであり；それぞれのコード領域の対象となる産物は同時にかつ独立して放出され；該対象となる産物はタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドであり；該対象となるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは完全に集合させることにより多成分系タンパク質複合体を産生することが可能である、
    単一ベクター系。
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