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CN117479831A - 用于在植物中生产感兴趣的蛋白质的方法和系统 - Google Patents

用于在植物中生产感兴趣的蛋白质的方法和系统 Download PDF

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CN117479831A
CN117479831A CN202280041202.3A CN202280041202A CN117479831A CN 117479831 A CN117479831 A CN 117479831A CN 202280041202 A CN202280041202 A CN 202280041202A CN 117479831 A CN117479831 A CN 117479831A
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light
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派翠克·松吉翁
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Abstract

本文提供了用于在植物或植物的一部分中生产感兴趣的蛋白质的方法和系统。该方法包括将一种或多种核酸引入该植物或该植物的一部分中，该核酸包括编码该感兴趣的蛋白质的核苷酸序列，并在允许编码该感兴趣的蛋白质的核苷酸序列表达的条件下培育该植物或该植物的一部分。该方法还包括向该植物的培养基环境中添加包括碳酸钙源如文石的培养基改良剂。

Description

用于在植物中生产感兴趣的蛋白质的方法和系统
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年6月9日提交的美国临时申请号63/208,836的35U.S.C.§119(e)下的权益。该临时申请的全部披露内容通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本文提供了用于在植物或植物的一部分中产生感兴趣的蛋白质的方法和系统，包括向植物的培养基环境(如土壤)提供培养基改良剂，例如，包括碳酸钙源(包括文石)。
背景技术
背景描述包括可用于理解本文所述的系统和方法的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术，也不承认具体地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。
植物组织的转化已经成为转基因的一种替代模式，为植物生物技术在治疗性蛋白质生产、代谢工程化和合成生物学方面创造了新的机会。例如，植物中的治疗性蛋白质生产是增加和改善用于治疗或预防人类和其他动物疾病的蛋白质生产的一个具有巨大潜力的领域。有利的是，可以在植物组织中产生各种抗体、疫苗、酶疗法和其他治疗性蛋白质。
与细菌或酵母不同，植物细胞可以正确折叠、装配和修饰哺乳动物来源的复杂蛋白质，如治疗性和诊断性抗体。此外，与传统的哺乳动物细胞培养相比，基于植物的蛋白质表达典型地不需要开发高产细胞系来实现大规模生产。植物蛋白质生产的扩大规模需要种植更多的植物，而不是对于哺乳动物细胞蛋白质表达的扩大规模所需的转换到更大的生物反应器以及相关的成本和复杂性增加。因此，与基于哺乳动物细胞的生产系统相比，基于植物的蛋白质表达在易于扩大规模、安全性和资本投资方面提供了许多益处。
WO 2002/101006(Icon Genetics公司)报道了在植物中表达蛋白质，尤其是需要多个结构基因协同表达才能具有生物活性的蛋白质。
WO 2005/076766(Sunol Molecular公司)报道了蛋白质在植物中的瞬时表达。单克隆抗体和其他药学上重要的蛋白质由通过农杆菌(Agrobacter)递送载体转化到植物中的转基因表达。
WO 2006/004675(阿尔托生物科学有限公司(Altor Bioscience Corp.))报道了在植物中生产用于治疗血管系统障碍的人组织因子。
因此，需要优化表达并提高植物中蛋白质生产的数量和质量，例如，经由包括向植物的培养基环境中添加改良剂以及修改生长期间提供给植物的光的持续时间和/或光的强度的方法。
发明内容
本节提供了本披露内容的总体概要，而并不是对其全部范围或所有特征的全面披露。
本披露涉及用于在植物或植物的一部分中产生感兴趣的蛋白质的方法和系统。在各个方面，本披露提供了用于在植物或植物的一部分中产生感兴趣的蛋白质的方法。该方法包括将一种或多种核酸引入植物或植物的一部分中。核酸包括编码感兴趣的蛋白质的核苷酸序列，并且该核苷酸序列可操作地连接到调节区。例如，核苷酸序列编码药物活性蛋白、抗体、抗原、疫苗、酶或工业酶。该方法进一步包括在允许编码感兴趣的蛋白质的核苷酸序列表达的条件下培育植物或植物的一部分，从而产生感兴趣的蛋白质，并向植物的培养基环境(如土壤)中添加培养基改良剂。培养基改良剂包括碳酸钙源，包括文石。
在各个方面，本披露还提供了用于在植物或植物的一部分中产生感兴趣的蛋白质的系统。该系统包括适于植物生长的培养基环境，如土壤。培养基环境包括培养基改良剂，包括碳酸钙源，包括文石。该植物包括引入植物或植物的一部分中的一种或多种核酸。核酸包括编码感兴趣的蛋白质的核苷酸序列，并且该核苷酸序列可操作地连接到调节区。例如，核苷酸序列编码药物活性蛋白、抗体、抗原、疫苗、酶或工业酶。该系统进一步包括培育设备，其适于在允许编码感兴趣的蛋白质的核苷酸序列表达的条件下培育植物，从而产生感兴趣的蛋白质。培育设备包括至少一个照明元件，以向植物提供光。该系统可以进一步包括与植物相关联的至少一个传感器，该至少一个传感器被配置为感测植物的至少一个参数，被配置为存储计算机可执行指令的存储器，以及被配置为执行指令的至少一个处理器。这些指令包括接收所感测的植物的至少一个参数。这些指令还可以包括以下至少一项：根据所感测的植物的至少一个参数，控制照明元件的操作，以修改在植物生长期间的一个或多个指定的每日时间段期间提供给植物的光的持续时间；根据所感测的植物的至少一个参数，控制照明元件的操作，以修改在植物生长期间提供给植物的光的强度；以及根据所感测的植物的至少一个参数，控制照明元件的操作，以修改在植物生长期间提供给植物的光的波长。
根据优选实施方案的以下详细描述，本主题的各种目标、特征、方面和优点将变得更显而易见。
附图说明
图1是NAI(N-803)的图示。
图2是HCW9218的图示。
图3是抗CD20单链抗体和IL-15衍生物IL-15N72D和IL-15RaSu/IgG1 Fc融合蛋白的融合蛋白复合物的图示。
图4是说明不同TxM复合物的示意图，这些复合物包含与识别免疫检查点分子、免疫信号传导分子和/或疾病抗原的结合结构域融合的IL-15/IL-15RaSu/Fc支架。
图5A和图5B描绘了不同TxM复合物的示意图，这些复合物包含与IL-12和IL-18的结合结构域(图5A)或单独的IL-18的结合结构域(图5B)融合的IL-15N72D：IL-15RaSu支架。
图6是TxM复合物的示意图，该复合物包含与IL-7和IL-21融合的IL-15N72D：IL-15RaSu支架。
图7是用于在植物或植物的一部分中生产感兴趣的蛋白质的示例系统的功能框图。
在附图中，附图标记可以重复用于标识类似和/或相同的元件。
具体实施方式
除非另外指示，否则所有百分比和比率都是按重量计算的。除非另外指示，否则所有百分比和比率都是基于总组成计算的。
所有组分或组合物含量都是指该组分或组合物的活性含量，且不包括杂质，例如残留溶剂或副产物，它们可能存在于商业可得的来源中。
I.用于生产感兴趣的蛋白质的方法
本文提供了用于在植物或植物的一部分中生产感兴趣的蛋白质的方法。方法包括将一种或多种核酸引入植物或植物的一部分中，其中核酸包含编码感兴趣的蛋白质的核苷酸序列。该方法进一步包括在允许编码感兴趣的蛋白质的核苷酸序列表达的条件下培育植物或植物的一部分，从而产生感兴趣的蛋白质，并向植物的土壤环境中添加土壤改良剂，其中该土壤改良剂包括碳酸钙源，该碳酸钙源包括文石。
如本文所用，“植物的一部分”是指来源于植物的任何部分，包括从植物获得的组织，例如但不限于从植物获得的叶、叶和茎、根、植物的地上部分(包括叶、茎和任选的花部分)、细胞、原生质体或其任何组合。例如，“植物的一部分”可以指植物的叶或茎。
如本文所用，术语“植物物质”是指来源于植物的任何材料。植物物质可以涵盖完整的植物、组织、细胞或其任何部分，以及细胞内植物组分、细胞外植物组分、植物的液体或固体提取物或其组合。术语植物物质还可以涵盖来自植物叶、茎、果实、根或其组合的植物、植物细胞、组织、液体提取物或其组合。植物物质可以包括未经过任何加工步骤的植物或其部分。可替代地，还考虑可以对植物物质进行如下定义的最低限度加工步骤，或更严格的加工，包括使用本领域公知的技术(包括但不限于色谱法、电泳等)，进行部分或大量蛋白质纯化。
A.引入一种或多种核酸
如本文所用，术语“感兴趣的核苷酸(或核酸)序列”或“感兴趣的编码区”是指要在宿主生物(例如植物)中表达以产生感兴趣的蛋白质的任何核苷酸序列或编码区(这些术语可以互换使用)。这种感兴趣的核苷酸序列可以编码但不限于天然或经修饰的蛋白质、工业酶或经修饰的工业酶、农业蛋白或经修饰的农业蛋白、辅助蛋白、蛋白补充剂、药物活性蛋白、营养制品、增值产品或其用于饲料、食品或饲料和食品两种用途的片段。
在任何实施方案中，编码感兴趣的蛋白质的核苷酸序列可以可操作地连接到调节区。如本文所用，“调节区”、“调节元件”或“启动子”是指典型地但不总是位于基因的蛋白质编码区上游的核酸部分，其可以由DNA或RNA，或DNA和RNA两者组成。此外，术语“调节元件”或“调节区”典型地是指DNA的序列，通常但不总是位于结构基因的编码序列上游(5′)，其通过提供对RNA聚合酶和/或转录所需的其他因子在特定位点处开始的识别来控制编码区的表达。然而，应当理解，位于内含子或序列的3′内的其他核苷酸序列也可能有助于调节感兴趣的编码区的表达。提供对RNA聚合酶或其他转录因子的识别以确保在特定位点处启动的调节元件的实例是启动子元件。
如本文所用，“可操作地连接”意指特定序列直接或间接地相互作用以实现预期功能，如基因表达的介导或调节。可操作地连接的序列的相互作用可以例如，由与可操作地连接的序列相互作用的蛋白质介导。当序列功能性连接时，转录调节区和感兴趣的序列可操作地连接，从而允许感兴趣的序列的转录被转录调节区介导或调节。
当调节区是活性的，并且与感兴趣的基因可操作关联或可操作地连接时，这可以导致感兴趣的基因的表达。调节元件可以能够介导器官特异性，或控制发育或时序基因激活。“调节区”包括启动子元件、表现出基础启动子活性的核心启动子元件、响应于外部刺激可诱导的元件、介导启动子活性的元件如负调节元件或转录增强子。如本文所用，“调节区”还涵盖转录后有活性的元件，例如，调节基因表达的调节元件，如翻译和转录增强子、翻译和转录阻遏物、上游激活序列和mRNA不稳定性决定簇。后面这些元件中的几个可以位于编码区附近。
大多数(但不是全部)真核启动子元件含有TATA盒，一种由腺苷和胸苷核苷酸碱基对组成的保守核酸序列，通常位于转录起始位点上游大约25个碱基对处。启动子元件包含负责转录起始的基础启动子元件，以及修饰基因表达的其他调节元件(如上所列)。
组成型调节区指导基因在植物各部分的表达，并在整个植物发育过程中持续表达。已知组成型调节元件的实例包括与CaMV 35S转录物(Odell等人，1985，Nature[自然]，313：810-812)、水稻肌动蛋白1(Zhang等人，1991，Plant Cell[植物细胞]，3：1155-1165)、肌动蛋白2(An等人，1996，Plant J.[植物杂志]，10：107-121)或tms2(美国专利号5,428,147，其通过引用以其全文并入本文)，以及磷酸丙糖异构酶1(Xu等人，1994，PlantPhysiol.[植物生理学]106：459-467)基因、玉米泛素1基因(Cornejo等人，1993，PlantMol.Biol.[植物分子生物学]29：637-646)、拟南芥泛素1和6基因(Holtorf等人，1995，Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]29：637-646)和烟草翻译起始因子4A基因(Mandel等人，1995Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]29：995-1004)相关的启动子。如本文所用的术语“组成型”不一定指示在组成型调节区控制下的基因在所有细胞类型中以相同水平表达，而是该基因在广泛的细胞类型中表达，即使经常观察到丰度的变化。
在一个实施方案中，可以通过本领域已知的方法将该一种或多种核酸引入植物或植物的一部分中。例如，可以使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微量注射、电穿孔等将一种或多种核酸引入植物细胞中。关于此类技术的综述，参见例如，Weissbach和Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology[植物分子生物学方法]，AcademyPress[学院出版社]，纽约VIII，第421-463页(1988)；Geierson和Corey，Plant MolecularBiology[植物分子生物学]，第2版(1988)；以及Miki和Iyer，Fundamentals ofGeneTransfer in Plants[植物基因转移基础].In Plant Metabolism[在植物代谢中]，第2d版D T.Dennis，D H Turpin，D D Lefebrve，D B Layzell(编)，Addison Wesly，伦敦Langmans有限公司，第561-579页(1997)。其他方法包括直接DNA摄取、使用脂质体、电穿孔，例如使用原生质体、微量注射、微粒或须状物以及真空渗透。参见例如，Bilang等人(1991，Gene[基因]100：247-250)、Scheid等人(1991，Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和基因组学]228：104-112)、Guerche等人(1987，Plant Science[植物科学]52：111-116)、Neuhause等人(1987，Theor.Appl Genet.[理论和应用遗传学]75：30-36)、Klein等人(2987，Nature[自然]327：70-73)；Freeman等人(1984，Plant Cell Physiol.[植物细胞生理学]29：1353)、Howell等人(1980，Science[科学]208：1265)、Horsch等人(1985，Science[科学]227：1229-1231)、DeBlock等人(1989，Plant Physiology[植物生理学]91：694-701)、植物分子生物学的方法(Weissbach和Weissbach编，学院出版社有限公司[Academic Press Inc.]，1988)、植物分子生物学中的方法(Schuler和Zielinski编，学院出版社有限公司[Academic PressInc.]，1989)、WO 92/09696、WO 94/00583、EP 331083、EP 175966、Liu和Lomonossoff(2002，J Virol Meth[病毒学方法杂志]，105：343-348)、EP 290395；WO 8706614；美国专利号4,945,050；5,036,006；5,100,792；5,625,136；以及6,403,865(其全部特此通过引用以其全文并入本文)。
“表达盒”是指包含感兴趣的核酸的核苷酸序列，该核酸受用于感兴趣的核酸在宿主细胞(例如植物细胞)中的转录的适当启动子或其他调节元件控制，并可操作地(或可操作地)连接到该启动子或其他调节元件。
B.培育植物或植物的一部分
该方法包括在允许编码感兴趣的蛋白质的核苷酸序列表达的条件下培育植物或植物的一部分，从而产生感兴趣的蛋白质。培育条件可以包括，例如，光暴露持续时间、温度、光强度、光波长、浇水计划、湿度水平等。例如，植物或植物的一部分的合适培育条件可以包括以下中的一种或多种：约30-90天(例如，30天、60天、90天)，在约60°F至约85°F(例如，约65°F、约70°F、80°F)下，在12小时开12小时关的每日光照周期(例如，光周期)中，光强度为约20μmol/m2s至约2300μmol/m2s(例如，约50μmol/m2s、约100μmol/m2s、约120μmol/m2s、约150μmol/m2s、约250μmol/m2s、约500μmol/m2s、约1000μmol/m2s、约1500μmol/m2s、约2000μmol/m2s)，光波长为约400nm至约700nm(例如约450nm、约500nm、约600nm、约650nm)，以及约30％至约70％湿度(例如，约50％、约60％、约65％)。合适的培育条件可以根据植物或植物的一部分的类型、条件、发育阶段等而变化。
在任何实施方案中，核酸可以在植物中瞬时表达。如本文所用，术语“瞬时表达”或“瞬时表达的”是指尚未整合到植物细胞基因组中的核酸的表达。瞬时表达通常会导致短期表达和快速结果。瞬时表达方法可以用于表达本发明的构建体(参见D′Aoust等人，2009，Methods in molecular biology[分子生物学方法]，第483卷，第41-50页；Liu和Lomonossoff，2002，Journal of Virological Methods[病毒学方法杂志]，105：343-348；其通过引用以其全文并入本文)。可替代地，可以使用基于真空的瞬时表达方法，如Kapila等人(1997，Plant Sci.[植物科学]122，101-108；其通过引用以其全文并入本文)或WO 00/063400、WO 00/037663(其通过引用以其全文并入本文)所述。这些方法可以包括但不限于，农杆菌接种或农杆菌浸润、注射器浸润的方法，然而，还可以使用如上所述的其他瞬时方法。通过农杆菌接种、农杆菌浸润或注射器浸润，包含所期望核酸的农杆菌混合物进入组织(例如叶、植物的地上部分(包括茎、叶和花)、植物的其他部分(茎、根、花)或整个植物)的细胞间隙。在穿过表皮后，农杆菌感染t-DNA拷贝并将其转移到细胞中。t-DNA被游离转录，且mRNA被翻译，从而导致感兴趣的蛋白质在感染细胞中产生，然而，t-DNA在细胞核内的通过是短暂的。
如果植物、植物部分或植物细胞要被两种或更多种核酸转化或共转化，则可以在单次转染事件中将核酸引入农杆菌中，其中将核酸合并，并如所述地转染细菌细胞。交替地，可以连续引入每种核酸。在这种情况下，可以将第一种核酸引入如所述的农杆菌中，细胞在选择性条件下(例如，在抗生素存在下)生长，其中仅单一转化的细菌可以生长。在该第一选择步骤之后，可以如所述地将第二种核酸引入农杆菌中，并且细胞在双重选择条件下生长，其中仅双重转化的细菌可以生长。然后，双重转化的细菌可以用于转化如本文所述的植物、植物部分或植物细胞，或者可以进行进一步的转化步骤以容纳第三种核酸。
可替代地，如果植物、植物部分或植物细胞要被两种或更多种核酸转化或共转化，则可以通过将农杆菌细胞的混合物与植物、植物部分或植物细胞共浸润来将核酸引入植物中，每个农杆菌细胞均可以包含一种或多种要引入植物中的核酸。为了改变构建体中感兴趣的核苷酸序列在植物、植物部分或植物细胞中的相对表达水平，在浸润步骤中，可以改变包含所期望构建体的各种农杆菌群体的浓度。
另外地或可替代地，感兴趣的蛋白质可以在包含扩增元件和/或调节元件或区域(本文也称为增强子元件)的表达系统中表达。如本文所用，术语“扩增元件”是指包含双生病毒基因组的一个或多个长基因间区域(LIR)的至少一部分的核酸区段。如本文所用，“长基因间区域”是指长基因间区域的一个区域，其含有能够介导双生病毒Rep蛋白切除和复制的rep结合位点。在一些方面，包含一个或多个LIR的核酸区段可以进一步包含双生病毒基因组的短基因间区域(SIR)。如本文所用，术语“短基因间区域”是指互补链(玉米线条病毒(Mastreviruses)的短IR(SIR))。本文可以使用任何合适的双生病毒衍生的扩增元件。参见例如，WO 2000/20557；WO 2010/025285；Zhang X.等人(2005，Biotechnology andBioengineering[生物技术与生物工程]，第93卷，271-279)、Huang Z.等人(2009，Biotechnology andBioengineering[生物技术与生物工程]，第103卷，706-714)、Huang Z.等人(2009，Biotechnology and Bioengineering[生物技术与生物工程]，第106卷，9-17)；其通过以其全文并入本文)。如果在构建体中使用多于一个LIR，例如两个LIR，则启动子、CMPV-HT区域和感兴趣的核酸序列以及终止子可以被两个LIR中的每一个括起来。
例如，来自双生病毒的扩增元件，例如像来自菜豆黄矮病毒(BeYDV)的扩增元件可以用于表达感兴趣的蛋白质。BeYDV属于适应于双子叶植物的玉米线条病毒属。BeYDV是具有单链环状DNA基因组的单份病毒，并且可以通过滚环机制复制到非常高的拷贝数。BeYDV衍生的DNA复制子载体系统已经用于植物中的快速高产蛋白质生产。
另外地或可替代地，增强子元件可以用于实现感兴趣的蛋白质的更高水平的瞬时表达。增强子元件可以基于RNA植物病毒，包括豇豆花叶病毒属(comoviruses)，如豇豆花叶病毒(CPMV；参见例如，WO 2007/135480；WO 2009/087391；US 2010/0287670、Sainsbury F.等人，2008，Plant Physiology[植物生理学]；148：121-1218；Sainsbury F.等人，2008，Plant Biotechnology Journal[植物生物技术杂志]；6：82-92；Sainsbury F.等人，2009，Plant Biotechnology Journal[植物生物技术杂志]；7：682-693；Sainsbury F.等人2009，Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]，Recombinant Proteins From Plants[来自植物的重组蛋白质]，第483卷：25-39；其中每一个均以其全文并入本文)、如U.S.61/971,274(其通过引用以其全文并入本文)中所述的“CPMVHT+”，或者如U.S.61/925,852(其通过引用以其全文并入本文)中所述的“CPMVX”(也称为“CPMV 160”)和/或“CPMVX+”(也称为“CPMV 160+”)。
转录后基因沉默(PTGS)可能参与限制转基因在植物中的表达，并且来自马铃薯Y病毒(HcPro)的沉默抑制子的共表达可以用于抵消转基因mRNA的特异性降解(Brigneti等人，1998，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]17,6739-6746，其通过引用以其全文并入本文)。替代的沉默抑制子是本领域熟知的，并且可以如本文所述地使用(Chiba等人，2006，Virology[病毒学]346：7-14；其通过引用以其全文并入本文)，例如但不限于TEV-p1/HC-Pro(烟草蚀纹病毒-p1/HC-Pro)、BYV-p21、番茄丛矮病毒的p19(TBSV p19；p19的构建描述于WO 2010/0003225中，其通过引用以其全文并入本文)、番茄皱缩病毒(TCV-CP)的衣壳蛋白、黄瓜花叶病毒的2b(CMV-2b)、马铃薯X病毒的p25(PVX-p25)、马铃薯M病毒的p11(PVM-p11)、马铃薯S病毒的p11(PVS-p11)、蓝莓枯焦病毒的p16(BScV-p16)、柑橘衰退病毒的p23(CTV-p23)、葡萄卷叶相关病毒-2的p24(GLRaV-2p24)、葡萄A病毒的p10(GVA-p10)、葡萄B病毒的p14(GVB-p14)、独活潜隐病毒的p10(HLV-p10)或大蒜普通潜隐病毒的p16(GCLV-p16)。
一种或多种沉默抑制子(包括但不限于HcPro、TEV-p1/HC-Pro、BYV-p21、TBSVp19、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、rgscam、来自FHV的B2蛋白、CPMV的小外壳蛋白，以及来自TCV、PVM-p11、PVS-p11、BScV-p16、CTV-p23、GLRaV-2p24、GBV-p14、HLV-p10、GCLV-p16或GVA-p10的外壳蛋白)可以与基于豇豆花叶病毒属的表达盒、双生病毒衍生的扩增元件和编码感兴趣的蛋白质的核酸序列一起共表达，以进一步确保植物内高水平的蛋白质生产。
可替代地，核酸可以在植物中稳定地表达。如本文所用，术语“稳定表达”或“稳定地表达”是指已经整合到植物细胞基因组中的核酸的表达。当核酸整合到基因组中时，核酸可以传递给后代。稳定表达通常导致整合核酸的长期表达。由于大多数转化开始时是短暂的，因此导致稳定转化的核酸整合到基因组中的频率很低。稳定表达可能需要更复杂的转化技术。例如，在将核酸转移到细胞中并整合到基因组中之后，通常需要另一个步骤来选择稳定转化的植物或植物细胞以及完整存活植物的再生。可以经由培育条件、转化载体的类型等进行对植物再生技术以及核酸转移和整合技术的改变。例如，农杆菌感染后小麦植物组织的干燥导致T-DNA递送增强，从而增加了稳定转化的频率(参见Cheng，M.，Hu，T.，Layton，J.等人，2003，In Vitro Cell Dev Biol-Plant[体外细胞与发育生物学-植物]，第39卷，第595-604页；其通过引用以其全文并入本文)。
在任何实施方案中，感兴趣的蛋白质可以包含天然或非天然信号肽；非天然信号肽可以是植物来源的。例如，信号肽可以是蛋白质二硫键异构酶信号肽(PDI)。天然信号肽可以对应于被表达的感兴趣的蛋白质的信号肽。感兴趣的核苷酸序列或感兴趣的编码区也可以包括编码感兴趣的蛋白质的核苷酸序列，如药物活性蛋白质，例如生长因子、生长调节剂、抗体、抗原、疫苗及其片段，或它们的可用于免疫或疫苗接种等的衍生物、酶和工业酶。此类蛋白质包括但不限于作为人类病原体的蛋白质、病毒蛋白质(例如但不限于来自呼吸道合胞病毒(RSV)、轮状病毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、狂犬病病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、肠道病毒71(EV71)的一种或多种蛋白质)或白细胞介素(例如IL-1至IL-24、IL-26和IL-27中的一种或多于一种)、细胞因子、红细胞生成素(EPO)、胰岛素、G-CSF、GM-CSF、hPG-CSF、M-CSF或其组合、干扰素(例如，干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ)、凝血因子(例如，因子VIII、因子IX或tPAhGH)、受体、受体激动剂、抗体(例如但不限于利妥昔单抗、神经多肽、胰岛素、疫苗)、生长因子(例如但不限于表皮生长因子、角质细胞生长因子、转化生长因子)、生长调节剂、抗原、自身抗原、其片段、或其组合。
感兴趣的蛋白质还可以包括流感血凝素(HA；参见WO 2009/009876，其通过引用以其全文并入本文)。HA是同源三聚体膜I型糖蛋白，通常包含信号肽、HA1结构域和HA2结构域，该HA2结构域包含位于C-末端处的跨膜锚定位点和小的细胞质尾。编码HA的核苷酸序列是熟知的并且是可获得的(参见例如，生物防御和公共卫生数据库(BioDefense andPublic Health Database)(流感研究数据库；Squires等人，2008Nucleic Acids Research[核酸研究]36：D497-D503)，URL为：biohealthbase.org/GSearch/home.do？decorator＝Influenza；或者由国家生物技术信息中心(Naional Center for BiotechnologyInformation)维护的数据库(参见URL：ncbi.nlm.nih.gov)。
另外地或可替代地，感兴趣的蛋白质可以是nogapendekin-alfa-inbakicept(NAI)，也称为N-803或ALT-803。NAI是一种IL-15超激动剂复合物，其包含与IL-15Rα/IgG1Fc融合蛋白结合的IL-15N72D衍生物，并且可以在图1中看到。US 9,328,159描述了NAI，并且通过引用以其全文并入本文。
另外地或可替代地，感兴趣的蛋白质可以是异二聚体双功能融合复合物，其包含由组织因子接头连接的可溶性TGF-βRII结构域和IL-15/IL15RαSu结构域。该分子也被称为HCW9218。该分子可以在图2中看到。在另一个实施方案中，感兴趣的蛋白质是HCW9218的IL-15D8N突变形式，其缺乏IL-15活性，但表现出类似于HCW9218的TGF-β1中和活性。HCW9218和HCW9228两者描述于Liu等人，2021，Mol.Ther.[分子疗法]，第29卷，第2949-2962页中，其通过引用以其全文并入本文。
另外地或可替代地，感兴趣的蛋白质可以是可溶性融合蛋白，其包含针对IL-15衍生物IL-15N72D和IL-15RαSu/IgG1 Fc融合蛋白的N-末端的抗CD20单链抗体的C-末端。该蛋白质在图3中示出。US 10,358,478描述了该融合蛋白，并且通过引用以其全文并入本文。
另外地或可替代地，感兴趣的蛋白质可以是一种或多种TxM。术语“TxM”是指包含与结合结构域连接的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc支架的复合物。示例性TxM是IL-15N72D：IL-15RαSu复合物，该复合物包含与特异性识别PD-L1的结合结构域(PD-L1 TxM)的融合体。图4是说明不同TxM复合物的示意图，这些复合物包含与识别免疫检查点分子、免疫信号传导分子和/或疾病抗原的结合结构域融合的IL15/IL-15RαSu/Fc支架。WO 2018/075989、US2021/0196821和US 11,173,191描述了TxM，并且通过引用以其全文并入本文。
另外地或可替代地，TxM的结合结构域可以是IL-12或IL-18结合结构域。包含与IL-12或IL-18结合结构域或仅IL-18结合结构域融合的IL-15N72D：IL-15RαSu支架的TxM融合复合物的实例分别在图5A和图5B中示出，并且描述于US 11,129,883中，其通过引用以其全文并入本文。
另外地或可替代地，TxM的结合结构域可以是IL-7和IL-21结合结构域。包含与IL-7或IL-21结合结构域融合的IL-15N72D：IL-15RαSu支架的TxM融合复合物的实例在图6中示出，并且描述于US2019/0300591中，其通过引用以其全文并入本文。
另外地或可替代地，TxM的结合结构域可以是细胞因子受体、细胞因子受体、细胞因子配体、疾病特异性抗原、免疫检查点分子或免疫信号传导分子。例如，结合结构域可以是或结合到PD-1、PD-L1 CTLA-4、CD47、TIM-3、TNFR、GITR、ssDNA、HER2、EGFR、CD19、CD38、CD52、GD2、CD33、Notch 1、ICAM-1、组织因子或HIV包膜。结合结构域可以与IL-15N72D：IL-15RαSu支架融合。此类TxM的实例描述于US 11,168,138中，其通过引用以其全文并入本文。
另外地或可替代地，感兴趣的蛋白质可以是单克隆抗体(mAb或moAb)，例如，如WO2016/004060中所述的抗体，其通过引用以其全文并入本文。mAb的实例包括但不限于利妥昔单抗、奥法木单抗和奥妥珠单抗(obinutuzumab)(抗CD20 Ab)；曲妥珠单抗(trastuzumab)和帕妥珠单抗(pertuzumab)(抗HER2Ab)；西妥昔单抗和帕尼单抗(抗EGFRAb)；阿仑单抗(抗CD52 Ab)；TA99(小鼠IgG2a)。其他mAb包括但不限于纳武利尤单抗(nivolumab)(抗PD-1Ab)、TA99(抗gp75)、3F8(抗GD2)、8H9(抗B7-H3)、阿巴伏单抗(abagovomab)(抗CA-125(仿制品))、阿德木单抗(adecatumumab)(抗EpCAM)、阿托珠单抗(afutuzumab)(抗CD20)、培阿珠单抗(alacizumab pegol)(抗VEGFR2)、喷替酸阿妥莫单抗(altumomab pentetate)(抗CEA)、阿麦妥单抗(amatuximab)(抗间皮素)、AME-133(抗CD20)、马安莫单抗(anatumomab mafenatox)(抗TAG-72)、阿泊珠单抗(apolizumab)(抗HLA-DR)、阿西莫单抗(arcitumomab)(抗CEA)、巴维昔单抗(bavituximab)(抗磷脂酰丝氨酸)、贝妥莫单抗(bectumomab)(抗CD22)、贝利木单抗(belimumab)(抗BAFF)、贝索单抗(besilesomab)(抗CEA相关抗原)、贝伐珠单抗(bevacizumab)(抗VEGF-A)、莫比伐单抗(bivatuzumab mertansine)(抗CD44 v6)、兰妥莫单抗(blinatumomab)(抗CD19)、BMS-663513(抗CD137)、维布妥昔单抗(brentuximab vedotin)(抗CD30(TNFRSF8))、美坎珠单抗(cantuzumab mertansine)(抗mucin CanAg)、坎妥单抗瑞伐坦(cantuzumab ravtansine)(抗MUCl)、喷替酸卡罗单抗(capromab pendetide)(抗前列腺癌细胞)、卡伦单抗(carlumab)(抗MCP-1)、卡妥索单抗(catumaxomab)(抗EpCAM、CD3)、cBR96-多柔比星免疫偶联物(抗路易斯-Y抗原)、CC49(抗TAG-72)、西利珠单抗(cedelizumab)(抗CD4)、Ch.14.18(抗GD2)、ch-TNT(抗DNA相关抗原)、泊西他珠单抗(citatuzumab bogatox)(抗EpCAM)、西妥木单抗(cixutumumab)(抗IGF-1受体)、泰坦-克利妥珠单抗(clivatuzumab tetraxetan)(抗MUCl)、可那木单抗(conatumumab)(抗TRAIL-R2)、CP-870893(抗CD40)、达西珠单抗(dacetuzumab)(抗CD40)、达克珠单抗(daclizumab)(抗CD25)、达妥珠单抗(dalotuzumab)(抗胰岛素样生长因子I受体)、达雷妥尤单抗(daratumumab)(抗CD38(环状ADP核糖水解酶))、地昔单抗(demcizumab)(抗DLL4)、地莫单抗(detumomab)(抗B-淋巴瘤细胞)、屈西他单抗(drozitumab)(抗DR5)、杜利他单抗(duligotumab)(抗HER3)、杜昔单抗(dusigitumab)(抗ILGF2)、依美昔单抗(ecromeximab)(抗GD3神经节苷脂)、依屈洛单抗(edrecolomab)(抗EpCAM)、伊洛珠单抗(elotuzumab)(抗SLAMF7)、艾西莫单抗(elsilimomab)(抗IL-6)、恩伐珠单抗(enavatuzumab)(抗TWEAK受体)、依诺替单抗(enoticumab)(抗DLL4)、恩妥昔单抗(ensituximab)(抗5AC)、西依匹莫单抗(pitumomab cituxetan)(抗episialin)、依帕珠单抗(epratuzumab)(抗CD22)、厄马索单抗(ertumaxomab)(抗HER2/neu、CD3)、依他珠单抗(etaracizumab)(抗整合素αvβ3)、法拉莫单抗(faralimomab)(抗干扰素受体)、法鲁珠单抗(farletuzumab)(抗叶酸受体1)、FBTA05(抗CD20)、非卡妥珠单抗(ficlatuzumab)(抗HGF)、菲妥木单抗(figitumumab)(抗IGF-1受体)、法兰妥单抗(flanvotumab)(抗TYRPl(醣蛋白75))、非苏木单抗(fresolimumab)(抗TGFβ)、伏妥昔单抗(futuximab)(抗EGFR)、加利昔单抗(galiximab)(抗CD80)、加尼单抗(ganitumab)(抗IGF-I)、吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)(抗CD33)、吉妥昔单抗(girentuximab)(抗碳酸酐酶9(CA-IX))、维格列巴单抗(glembatumumab vedotin)(抗GPNMB)、古塞尔库姆单抗(guselkumab)(抗IL13)、伊巴珠单抗(ibalizumab)(抗CD4)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(抗CD20)、伊鲁库单抗(icrucumab)(抗VEGFR-1)、伊戈伏单抗(igovomab)(抗CA-125)、IMAB362(抗CLDN18.2)、IMC-CS4(抗CSFIR)、IMC-TR1(TGF RII)、伊马曲单抗(imgatuzumab)(抗EGFR)、英克拉单抗(inclacumab)(抗选择素P)、拉-英达西单抗(indatuximab ravtansine)(抗SDC1)、伊珠单抗-奥佐米星(inotuzumab ozogamicin)(抗CD22)、英妥木单抗(intetumumab)(抗CD51)、伊匹木单抗(ipilimumab)(抗CD152)、伊妥木单抗(iratumumab)(抗CD30(TNFRSF8))、KM3065(抗CD20)、KW-0761(抗CD194)、LY2875358(抗MET)、拉贝珠单抗(labetuzumab)(抗CEA)、兰布利单抗(lambrolizumab)(抗PDCDl)、来沙木单抗(lexaumumab)(抗TRAIL-R2)、林妥珠单抗(lintuzumab)(抗CD33)、立鲁单抗(lirilumab)(抗KIR2D)、莫洛伐妥单抗(lorvotuzumab mertansine)(抗CD56)、鲁卡木单抗(lucatumumab)(抗CD40)、鲁昔单抗(lumiliximab)(抗CD23(IgE受体))、马帕木单抗(mapatumumab)(抗TRAIL-R1)、马妥昔单抗(margetuximab)(抗ch4D5)、马妥单抗(matuzumab)(抗EGFR)、马维里单抗(mavrilimumab)(抗GMCSF受体a-链)、米拉珠单抗(milatuzumab)(抗CD74)、明瑞莫单抗(minretumomab)(抗TAG-72)、米妥莫单抗(mitumomab)(抗GD3神经节苷脂)、莫加利单抗(mogamulizumab)(抗CCR4)、帕舒托-莫塞妥莫单抗(moxetumomab pasudotox)(抗CD22)、他那可单抗(nacolomab tafenatox)(抗C242抗原)、他那莫单抗(naptumomab estafenatox)(抗5T4)、那呐妥单抗(namatumab)(抗RON)、奈妥木单抗(necitumumab)(抗EGFR)、奈伐苏单抗(nesvacumab)(抗血管生成素2)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)(抗EGFR)、尼沃单抗(nivolumab)(抗IgG4)、巯诺莫单抗(nofetumomabmerpentan)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)(抗CD20)、奥卡伦单抗(ocaratuzumab)(抗CD20)、奥拉他单抗(olaratumab)(抗PDGF-R a)、阿那妥单抗(onartuzumab)(抗c-MET)、昂妥昔珠单抗(ontuxizumab)(抗TEM1)、莫奥珠单抗(oportuzumab monatox)(抗EpCAM)、奥戈伏单抗(oregovomab)(抗CA-125)、奥乐妥珠单抗(otlertuzumab)(抗CD37)、潘科曼单抗(pankomab)(MUC1的抗肿瘤特异性糖基化)、巴萨妥珠单抗(parsatuzumab)(抗EGFL7)、帕考利珠单抗(pascolizumab)(抗IL-4)、帕曲妥单抗(patritumab)(抗HER3)、培妥莫单抗(pemtumomab)(抗MUCl)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(抗HER2/neu)、利妥昔单抗(pidilizumab)(抗PD-1)、平尼土珠单抗(pinatuzumab vedotin)(抗CD22)、平妥莫单抗(pintumomab)(抗腺癌抗原)、维波达单抗(polatuzumab vedotin)(抗CD79B)、普鲁米单抗(pritumumab)(抗波形蛋白)、PR0131921(抗CD20)、奎珠单抗(quilizumab)(抗IGHE)、拉托单抗(racotumomab)(抗N-羟乙酰神经氨酸)、雷德图单抗(radretumab)(抗纤连蛋白额外结构域-B)、雷莫芦单抗(ramucirumab)(抗VEGFR2)、利妥木单抗(rilotumumab)(抗HGF)、罗妥木单抗(robatumumab)(抗IGF-1受体)、罗度单抗(roledumab)(抗RHD)、洛维利珠单抗(rovelizumab)(抗CD11和CD18)、沙玛立珠单抗(samalizumab)(抗CD200)、沙妥莫单抗喷地肽(satumomab pendetide)(抗TAG-72)、司里班妥单抗(seribantumab)(抗ERBB3)、SGN-CD19A(抗CD19)、SGN-CD33A(抗CD33)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)(抗FAP)、司妥昔单抗(siltuximab)(抗IL-6)、索利托单抗(solitomab)(抗EpCAM)、松妥珠单抗(sontuzumab)(抗episialin)、他巴鲁单抗(tabalumab)(抗BAFF)、泰坦-替他珠单抗(tacatuzumabtetraxetan)(抗甲胎蛋白)、帕-他莫单抗(taplitumomab paptox)(抗CD 19)、阿替莫单抗(telimomab aritox)、替尼他单抗(tenatumomab)(抗固生蛋白C)、替奈昔单抗(teneliximab)(抗CD40)、替妥木单抗(teprotumumab)(抗CD221)、TGN1412(抗CD28)、替西木单抗(ticilimumab)(抗CTLA-4)、替加珠单抗(tigatuzumab)(抗TRAIL-R2)、TNX-650(抗IL-13)、托西莫单抗(tositumomab)(抗CS20)、托维妥单抗(tovetumab)(抗CD140a)、TRBS07(抗GD2)、曲加利珠单抗(tregalizumab)(抗CD4)、曲美木单抗(tremelimumab)(抗CTLA-4)、TRU-016(抗CD37)、西莫白介素单抗(tucotuzumab celmoleukin)(抗EpCAM)、乌妥昔单抗(ublituximab)(抗CD20)、乌瑞鲁单抗(urelumab)(抗4-1BB)、万替妥单抗(vantictumab)(抗卷曲受体)、伐帕利昔单抗(vapaliximab)(抗AOC3(VAP-1))、伐特利珠单抗(vatelizumab)(抗ITGA2)、维妥珠单抗(veltuzumab)(抗CD20)、维森库单抗(vesencumab)(抗NRP1)、维西珠单抗(visilizumab)(抗CD3)、伏洛昔单抗(volociximab)(抗整合素α5β1)、伏妥土珠单抗(vorsetuzumab mafodotin)(抗CD70)、伏妥莫单抗(votumumab)(抗肿瘤抗原CTAA16.88)、扎鲁木单抗(zalutumumab)(抗EGFR)、扎诺利木单抗(zanolimumab)(抗CD4)、扎妥昔单抗(zatuximab)(抗HERl)、齐拉明单抗(ziralimumab)(抗CD147(basigin))、RG7636(抗ETBR)、RG7458(抗MUC16)、RG7599(抗NaPi2b)、MPDL3280A(抗PD-L1)、RG7450(抗STEAPl)和GDC-0199(抗Bcl-2)。
感兴趣的蛋白质可以在任何合适的植物宿主中表达，该宿主被如本文所述的核苷酸序列、或构建体、或载体转化。合适的宿主的实例包括但不限于来自选自由以下组成的组的属的植物：拟南芥属(Arabidopsis)、烟草属(Nicotiana)、芸苔属(Brassica)、番薯属(Ipomoea)、玉米属(Zea)、高粱属(Sorghum)、红花属(Carthamus)、甘氨酸属(Glycine)、小麦属(Triticum)、茄属(Solanum)、燕麦属(Avena)、黑麦属(Secale)、苜蓿属(Medicago)、向日葵属(Helianthus)、棉属(Gossypium)、大麦属(Hordeum)、稻属(Oryza)、人参属(Panax)和豌豆属(Pisum)。这样的属包括农作物，例如油菜、芸苔属(Brassica spp.)、玉米(maize)、烟草属(Nicotiana spp.)(烟草)(例如，本氏烟草(Nicotiana benthamiana))、苜蓿、马铃薯、甘薯(sweet potato)(甘薯(Ipomoea batatus))、人参、豌豆、燕麦、大米、大豆、小麦、大麦、向日葵、棉花、玉米、黑麦(rye)(黑麦(Secale cereale))、高粱(高粱(Sorghumbicolor、Sorghum vulgare))和红花(safflower)(红花(Carthamus tinctorius))。
在各种实施方式中，培育植物可以包括在植物生长期间修改提供给植物(或植物的一部分)的光。例如，培育植物可以包括修改在一个或多个特定时间段期间提供给植物的光的持续时间(如在第一天提供12小时的光，然后在第二天提供14小时的光)、修改如上所述提供给植物的光的强度、修改如上所述提供给植物的光的波长(如在上午6:00和下午12:00之间使用第一波长，且在中午12:00和下午6:00之间使用较短的第二波长，或者在不同天的类似时间段期间使用不同波长)等。
该方法可以包括感测感兴趣的蛋白质的生产水平。光的持续时间、强度和/或波长可以根据所感测的感兴趣的蛋白质的生产水平来修改。类似地，可以感测植物的生长水平，并且可以根据所感测的植物生长水平来修改光的持续时间、强度和/或波长。
尽管光的持续时间、强度和波长由上面的实例提供，但其他实施方案可以修改任何其他合适的光参数，或者针对植物生长环境的其他合适的控制参数(如环境温度、水位、土壤组分、营养水平等)。此外，可以感测其他合适的植物参数，以便修改控制参数。
在各种实施方式中，该方法可以包括使用人工智能算法根据所感测的植物参数来计算修改值，如感兴趣的蛋白质的生长水平或生产水平。然后，可以根据所计算的至少一个修改值来修改光的持续时间、强度和/或波长(或任何其他合适的控制参数)。例如，人工智能算法可以接收感测的植物参数作为输入，并输出植物生长环境的一个或多个控制参数的变化。
人工智能算法可以包括任何合适的算法，如下面进一步解释的。例如，人工智能算法可以包括被训练，以基于光的持续时间、强度和/或波长(或任何其他合适的控制参数)预测植物生长、感兴趣的蛋白质的生产等的机器学习模型。可以基于光持续时间、强度、波长或其他合适的控制参数的多个值，根据植物生长、蛋白质生产等的历史值来训练机器学习模型。
可以使用至少一个与植物相关联的传感器来确定植物的生长水平、感兴趣的蛋白质的生产等。可以使用任何合适的传感器，如测树器、应变传感器、光传感器、温度传感器、湿度传感器、照相机等。
C.培养基改良剂
如本文所用，“培养基(medium/media)”是指植物在其中生长的材料。植物培养基的功能可以包括保持水分、保持和交换养分、气体交换和根系固定。植物培养基类型包括土壤、泥碳苔、椰糠(coconut coir)、树皮碎片、稻壳、木纤维、粘土卵石、岩棉、石头、砾石、塑料泡沫、珍珠岩、蛭石、浮石、沙子、水凝胶等。植物培养基还可以是基于水的，并且可以包括胶凝剂，如琼脂、PhytagelTM、结冷胶(Gellan)等。在任何实施方案中，一种或多种培养基可以是土壤。
如本文所用，“培养基改良剂”是指为了改善其物理、化学和/或生物特征和/或为植物提供一种或多种营养以及为了改善植物或植物的一部分中的蛋白质生产而添加到培养基(例如，土壤)中的材料。如本文所用，“改良培养基”是指向培养基(例如，土壤)中添加合适的材料，以便改善其物理、化学和/或生物特征和/或为其提供一种或多种营养。在任何实施方案中，培养基改良剂可以是土壤改良剂。
在任何实施方案中，培养基改良剂包括碳酸钙(CaCO3)源，包括文石。文石是碳酸钙的一种天然正交晶体形式，最常见于石膏层和铁矿石层中。文石与方解石的不同之处在于，文石具有正交晶体结构，比重更大(与方解石的2.71g/cm3相比，为2.93至2.95g/cm3)，并且比方解石的解理更不明显。
文石的一种形式，称为“鲕状文石”，出现在世界各地的海底。鲕状文石呈不连续的颗粒，其基本上是球形的。作为海洋沉积物的该材料是未固结的，并且随着混入其中的不同数量的壳碎片而在粒度上有所变化。鲕状文石可以在加勒比海发现，例如，在巴哈马群岛上及其周围。下表1提供了鲕状文石的示例性组成。
表1
鲕状文石可以从海底回收，例如，通过从海底挖掘或以其他方式移除鲕状文石。海底的挖掘可以在巴哈马群岛的海滩附近、邻近或在海滩上进行。回收的鲕状文石可以包括各种尺寸的材料。在任何实施方案中，回收的鲕状文石可以具有约50μm至约2mm的特定粒径。在一些实施方案中，可以首先筛分鲕状文石以除去任何过大的材料，如颗粒尺寸直径大于或等于约275μm的壳碎片。可替代地，鲕状文石可以直接从海洋中提取，而不需要任何筛选、研磨或两者。换句话说，当鲕状文石被掺入组合物或培养基(如土壤)中时，它可以是未加工的。因此，如本文所用的术语“未加工的”意指在从海底回收文石后，除了仅仅将其处理和运输到原料堆，然后与一种组分混合之外，没有对其进行进一步处理。在任何实施方案中，在掺入土壤改良剂中之前，鲕状文石基本上是干燥的，例如含有约10％或更少的水分。
在一些实施方案中，至少一部分或基本上全部的鲕状文石可以在掺入土壤改良剂之前，例如在球磨机中研磨。合适的研磨技术和研磨的鲕状颗粒描述于2019年4月26日提交的US 2020/0308015中，其全部内容通过引用以其全文并入本文。鲕状文石可以研磨成直径大于或等于约1μm、大于或等于约3μm、大于或等于约5μm、大于或等于约8μm、大于或等于约10μm、大于或等于约13μm、大于或等于约15μm、大于或等于约18μam、或约20μm；或约1μm至约20μm、约1μm至约15μm、约3μm至约10μm、约3μm至约8μm、或约3μm至约5μm的鲕状颗粒。
另外地或可替代地，碳酸钙源可以进一步包括钙石灰、白云石石灰(碳酸钙-碳酸镁，CaCo3+MgCO3)、铸造残渣、水泥制造残渣、及其组合。
在任何实施方案中，碳酸钙源(例如，文石)可以基于培养基改良剂的总重量，以大于或等于约1重量％、大于或等于约5重量％、大于或等于约10重量％、大于或等于约15重量％、大于或等于约20重量％、大于或等于约25重量％、大于或等于约30重量％、大于或等于约40重量％、大于或等于约50重量％、或约60重量％；或约1重量％至约60重量％、约1重量％至约30重量％、约1重量％至约20重量％、约1重量％至约10重量％、约5重量％至约60重量％、约5重量％至约50重量％、约5重量％至约30重量％、约5重量％至约20重量％、约5重量％至约10重量％、约10重量％至约30重量％、或约10重量％至约20重量％的量存在于培养基改良剂中。
另外，培养基改良剂可以包含一种或多种其他组分。其他组分的实例包括但不限于粘合剂、有机材料、堆肥、石膏、硼砂、风化褐煤、磷酸盐、顺磁性玄武岩粉末、冰川砾石粉尘、钾、富里酸粉末、腐殖酸粉末、填料、除草剂、杀有害生物剂、杀真菌剂、真菌和细菌。
可以使用用于在土壤改良剂中使用的任何合适的粘合剂。例如，可以使用农业、肥料、营养和/或采矿领域中已知的任何无毒的水溶性粘合剂。更具体地说，可以使用木质素磺酸钙或钠化合物，如LIGNOSOL TM。此外，可以使用蜂蜜、糖蜜或与生态用途相容的且在水中具有高溶解度的任何粘合剂溶液。
有机材料可以包括不同动物(如牛、猪、马、鸡和其他动物)的粪便，并且可以用作起始材料。此外，有机材料可以包括任何有机污泥(例如，市政污泥、屠宰场污泥等)、木材残渣、工业有机残渣、农作物残渣等。
如本文所用，“堆肥”是指包含有机材料的分解或部分分解残余物的有机材料，这些有机材料是由细菌、真菌和其他生物分解这些材料而产生的，即来自堆肥过程。在任何实施方案中，堆肥的碳氮比(C/N)可以在约1和约13之间。堆肥可以通过本领域已知的任何方法制备。例如，它可以在自由空气中、在需氧反应器中、在厌氧反应器中或这些方法的任何组合中“自然地”制备。用于制备堆肥的起始材料可以是本领域技术人员已知的可堆肥或可消化的任何材料。例如，任何易腐烂的材料都可以用作起始材料。如上所述的任何可消化或部分消化的有机材料也可以用于制备本发明中使用的堆肥。
填料(也称为惰性载剂)的实例包括但不限于淀粉、改性淀粉、麦芽糖糊精、树胶、硅藻土、壤土、纤维素、生物炭、浮石、硅石、天然或合成硅酸盐、硅石、树脂、蜡、固体肥料(例如铵盐)、滑石、高岭土、石灰石、石灰、石英、白垩、粘土(例如，蒙脱石、锂蒙脱石、膨润土、蒙脱土、硅藻土、伊利石及其组合)、绿坡缕石、白云石、沸石、珍珠岩、硅藻土、蛭石、腐殖质、活性炭、各种磷化合物、及其组合。
土壤改良剂中可以包含杀有害生物剂，如杀真菌剂和/或除草剂。杀有害生物剂可以包括仅在地下起作用的化合物。杀真菌剂的实例包括但不限于克菌丹(captan)、福美双(thiram)、甲霜灵(metalaxyl)、咯菌腈(fludioxonil)、恶霜灵(oxadixyl)以及这些物质中每种的异构体等。除草剂的实例包括但不限于选自以下的化合物：草甘膦、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、乙酰胺、三嗪、二硝基苯胺、甘油醚、哒嗪酮、尿嘧啶、苯氧基、脲和苯甲酸；除草安全剂，如苯并噁嗪、二苯甲基衍生物、N，N-二烯丙基二氯乙酰胺、各种二卤代酰基、噁唑烷基和噻唑烷基化合物、乙酮、萘酐化合物和肟衍生物；化学肥料；以及生物肥料。
细菌的实例包括但不限于以下属的细菌：无色杆菌属(Achromobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、农杆菌属(Agrobacterium)、白粉寄生孢(Ampelomyces)、短柄霉属(Aureobasidium)、固氮螺菌属(Azospirillum)、固氮菌属(Azotobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、白僵菌属(Beauveria)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、假丝酵母属(Candida)、毛壳菌属(Chaetomium)、色杆菌属(Chromobacterium)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、金色单胞菌属(Chryseomonas)、虫草属(Cordyceps)、隐球菌属(Cryptococcus)、德巴利酵母属(Dabaryomyces)、代夫特菌属(Delftia)、欧文氏菌属(Erwinia)、外瓶霉属(Exophilia)、粘帚菌属(Gliocladium)、草螺菌属(Herbaspirillum)、乳杆菌属(Lactobacillus)、马利亚霉属(Mariannaea)、微球菌属(Microccocus)、Mitsuaria、拟青霉属(Paecilomyces)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、泛菌属(Pantoea)、发光杆菌属(Photorhabdus)、植物杆菌属(Phytobacter)、毕赤酵母属(Pichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、假食酸菌属(Pseudacidovorax)、根瘤菌属(Rhizobium)、酵母属(Saccharomyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、踝节菌属(Talaromyces)、木霉属(Trichoderma)、致病杆菌属(Xenorhabdus)、及其组合。
真菌的实例包括但不限于麝香霉菌(Muscodor)物种、粉虱座壳孢(Aschersoniaaleyrodis)、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)(“白毒蕈碱”)、布氏白僵菌(Beauveriabrongniartii)、多主枝孢(Chladosporium herbarum)、棒形虫草(Cordyceps clavulata)、茂兰虫草(Cordyceps entomorrhiza)、多枝虫草(Cordyceps facis)、新疆产黑槌虫草(Cordyceps gracilis)、Cordyceps melolanthae、蛹虫草(Cordyceps militaris)、蚁虫草(Cordyceps myrmecophila)、Cordyceps ravenelii、冬虫夏草(Cordyceps sinensis)、蜂头虫草(Cordyceps sphecocephala)、Cordyceps subsessilis、单侧生虫草(Cordycepsunilateralis)、变形虫草(Cordyceps variabilis)、Cordyceps washingtonensis、棒孢蚊霉(Culicinomyces clavosporus)、蝗噬虫霉(Entomophaga grylli)、噬虫霉(Entomophagamaimaiga)、蝇虫霉(Entomophaga muscae)、Entomophaga praxibulli、菜蛾蝇霉(Entomophthora plutellae)、砖红镰刀菌(Fusarium lateritium)、桔形被毛孢(Hirsutella citriformis)、汤普松被毛孢(Hirsutella thompsoni)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)(“绿毒蝇碱”)、黄绿绿僵菌(Metarhizium flaviride)、白色产气霉(Muscodor albus)、佛罗里达新接霉(Neozygitesfloridana)、莱氏野村菌(Nomuraearileyi)、粉拟青霉(Paecilomyces farinosus)、玫烟色拟青霉(Paecilomycesfumosoroseus)、新蚜虫疠霉(Pandora neoaphidis)、柱胞弯颈霉(Tolypocladiumcylindrosporum)、蜡蚧轮枝孢(Verticillium lecanii)、根虫瘟霉(Zoophthoraradicans)、菌根真菌(rnycorrhizal)物种如双色蜡蘑(Laccaria bicolor)、及其组合。
在任何实施方案中，该一种或多种其他组分可以基于培养基改良剂的总重量，以大于或等于约1重量％、大于或等于约10重量％、大于或等于约20重量％、大于或等于约40重量％、大于或等于约50重量％、大于或等于约60重量％、大于或等于约70重量％、大于或等于约80重量％、大于或等于约90重量％、大于或等于约95重量％、或约99重量％；或约1重量％至约99重量％、约10重量％至约99重量％、约20重量％至约99重量％、约40重量％至约99重量％、约40重量％至约95重量％、约40重量％至约90重量％、约40重量％至约80重量％、约40重量％至约60重量％、约60重量％至约99重量％、约60重量％至约90重量％、约60重量％至约80重量％、约80重量％至约99重量％、约80重量％至约95重量％、约80重量％至约90重量％、约90重量％至约99重量％、90重量％至约95重量％、或约95重量％至约99重量％的量，单独地或组合地存在于培养基改良剂中。
如本文所用，“培养基环境”是指培养基，如土壤，其中植物存在于例如，种植种子的培养基以及邻近和围绕植物的根、叶和茎或杆的培养基中。本文考虑了培养基改良剂可以以多种形式应用于培养基环境，以便使组合物易于被培养基吸收并改善培养基质量。例如，培养基改良剂可以制备成干燥形式，如松散的粗粉或颗粒形式。可替代地，可以通过将大网袋的土壤改良组合物浸泡在水中来制备呈液体形式的培养基改良剂。培养基改良剂还可以和珠光器一起使用以形成小珍珠。
可以添加到培养基环境中的培养基改良剂的量可以并且将会根据培养基的物理和化学条件、培养基的湿度条件以及要在培养基中生长的植物而变化。例如，可以以每英亩约200磅至每英亩约750磅、每英亩约300磅至每英亩约600磅、或每英亩约500磅的量使用培养基改良剂。在一些实施方案中，当培养基改良剂以液体形式制备时，培养基改良剂可以以每英亩约0.5加仑至约15加仑/英亩、每英亩约1加仑至每英亩约10加仑、或每英亩约1加仑至每英亩约5加仑的量施用于培养基(例如，土壤)。
在任何实施方案中，可以在播种之前、期间、之后或其组合将培养基改良剂添加到培养基环境中。本文预期培养基改良剂可以一次或多次(两次、三次、四次、五次、十次等)添加到培养基环境中。可以使用播种设备、撒布机或本领域公知的能够处理粒状改良剂和/或肥料的任何其他类型的设备将培养基改良剂添加到培养基中。可以在培养基改良剂被添加到培养基环境中之前、之后或同时将化学肥料、无机肥料、另一种培养基改良剂、或其混合物添加到土壤中。可替代地，可以在添加到培养基环境中之前将化学肥料、无机肥料、其他培养基改良剂或其混合物与土壤改良剂混合。
D.任选的其他步骤
该方法可以进一步包括收获植物或植物的一部分。例如，可以收获包括叶和茎的整个植物，或者可以仅收获植物叶。
另外，可以使用如本领域技术人员已知的方法，从植物、植物的一部分或植物物质中纯化、部分纯化根据本文所述方法产生的感兴趣的蛋白质，或者可以作为口服疫苗施用。纯化可以包括产生质外体部分，如WO 2011/035422(其通过引用以其全文并入本文)中所述。对于制备型尺寸排阻色谱法，可以获得包含感兴趣的蛋白质的制剂，并通过离心除去不溶性物质。还可以使用PEG进行沉淀。可以使用常规方法(例如，Bradford测定法，BCA)对回收的蛋白质进行定量，并且使用例如SEPHACRYLTM、SEPHADEXTM或类似介质使提取物通过尺寸排阻柱，并收集级分。蓝色葡聚糖2000或合适的蛋白质可以用作校准标准。还可以使提取物通过阳离子交换柱，并收集活性级分。在色谱法后，可以通过蛋白质电泳、免疫印迹或两者进一步分析级分，以确认感兴趣的蛋白质和级分的蛋白质补体的存在。
术语“最低限度加工”意指植物物质(例如，包含感兴趣的蛋白质的植物或其部分)被部分纯化以产生植物提取物、匀浆、植物匀浆的级分等(即，最低限度地加工)。部分纯化可以包括但不限于破坏植物细胞结构，从而产生包含可溶性植物组分和不溶性植物组分的组合物，其可以例如但不限于通过离心、过滤或其组合来分离。在这点上，使用真空或离心提取可以容易地获得在叶或其他组织的细胞外空间内分泌的蛋白质，或者可以在压力下通过辊或研磨等方法提取组织，以从细胞外空间内挤压或释放蛋白质。最低限度加工还可以包括制备可溶性蛋白质的粗提物，因为这些制备物几乎不会受到次级植物产品的污染。此外，最低限度加工可以包括从叶中用水提取可溶性蛋白质，随后用任何合适的盐沉淀。其他方法可以包括大规模浸渍和果汁提取，以便允许直接使用提取物。
本文预期，本文所述的方法包括修饰植物或其部分中感兴趣的蛋白质(例如，植物中已经产生的蛋白质)的表达。修饰感兴趣的蛋白质的表达可以包括增加和/或减少蛋白质生产、使基因沉默等。
本文还提供了含有本披露的基因构建体的转基因植物、植物细胞或种子，其可以用作适于本文所述瞬时蛋白质表达的平台植物。从植物细胞再生整个植物的方法也是本领域已知的(例如参见Guerineau和Mullineaux(1993，Plant transformation andexpression vectors[植物转化和表达载体].在：Plant Molecular Biology Labfax[植物分子生物学实验室传真](Croy RRD编)牛津大学，BIOS科学出版社[BIOS ScientificPublishers]，第121-148页中；通过引用以其全文并入本文)。一般而言，转化的植物细胞在适当的培养基中培养，该培养基可以含有选择剂如抗生素，其中选择性标记用于促进转化的植物细胞的鉴定。一旦愈伤组织形成，则可以根据已知的方法通过采用适当的植物激素来促进芽形成，并将芽转移到生根培养基中用于植物的再生。然后这些植物可以用于建立重复的代，或者来自种子或者使用营养繁殖技术。不使用组织培养也可以产生转基因植物。这些生物的稳定转化和再生方法在本领域中已经建立，并且是本领域技术人员已知的。可用的技术综述于Vasil等人(Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants[植物的细胞培养和体细胞遗传学]，第I、II和III卷，Laboratory Procedures and TheirApplications[实验室程序及其应用]，Academic Press[学术出版社]，1984)以及Weissbach和Weissbach(Methods for Plant Molecular Biology[植物分子生物学方法]，Academic Press[学术出版社]，1989)中，这两篇文献通过引用以其全文并入本文。
II.用于生产感兴趣的蛋白质的系统
图3示出了示例系统202的框图，该系统可以用于在植物或植物的一部分中产生感兴趣的蛋白质。例如，如本文所述的培养基环境可以适于使植物生长，其中该培养基环境包括如本文所述的培养基改良剂，例如像，包括文石的碳酸钙源。植物可以包括引入植物或植物的一部分中的一种或多种核酸，其中该核酸包括例如，编码感兴趣的蛋白质的核苷酸序列，并且核苷酸序列可操作地连接到调节区。
培育设备可以适于在允许编码感兴趣的蛋白质的核苷酸序列表达的条件下培育植物，从而产生感兴趣的蛋白质。例如，培育设备可以包括至少一个照明元件，以向植物提供光。传感器可以与植物相关联，并且被配置为感测植物的至少一个参数。
系统202可以被配置为控制该系统的一个或多个方面(如照明元件203)的操作。如图7所示，系统202包括一个或多个处理器216(其可以称为中央处理器单元或CPU)，其与存储器214通信，该存储器包括任选的只读存储器(ROM)218和任选的随机存取存储器(RAM)220，以及任选的辅助存储器222(如磁盘驱动器)。处理器216可以被实现为一个或多个CPU芯片。系统202进一步包括任选的输入/输出(I/O)设备224和网络连接设备(例如，通信接口)212。
在各种实施方式中，存储器214可以被配置为存储计算机可执行指令，并且该一个或多个处理器216可以被配置为执行控制照明元件203的操作的指令。I/O设备224中的一个或多个可以包括与植物相关联并被配置为感测植物的至少一个参数的传感器。
这些指令可以包括接收如由传感器检测的植物的至少一个参数，并根据该至少一个参数实施一个或多个控制操作。例如，该一个或多个处理器216可以被配置为根据所感测的植物的至少一个参数来控制照明元件203的操作，以修改在植物生长期间的一个或多个指定的每日时间段期间提供给植物的光的持续时间。
可替代地或除此之外，该一个或多个处理器216可以被配置为根据所感测的植物的至少一个参数来控制照明元件203的操作，以修改在植物生长期间提供给植物的光的强度。作为另一种选择，该一个或多个处理器可以被配置为根据所感测的植物的至少一个参数来控制照明元件203的操作，以修改在植物生长期间提供给植物的光的波长。
所感测的参数可以用于以任何合适的方式控制照明元件203的操作。例如，该一个或多个处理器216可以被配置为根据所感测的植物的至少一个参数来确定感兴趣的蛋白质的生产水平，根据所感测的植物的至少一个参数来确定植物的生长水平等。
然后，所确定的值可以用于控制照明元件203的持续时间、强度、波长等。例如，所确定的植物生长水平或所确定的感兴趣的蛋白质的生产水平可以用于修改照明元件203的持续时间、强度、波长等。在各种实施方式中，较低水平的所确定的植物生长可以导致该一个或多个处理器216增加照明元件203的持续时间或强度以促进生长，较低水平的蛋白质生产可以导致该一个或多个处理器216将照明元件203的波长调整到更有助于生产感兴趣的蛋白质的值等。
尽管以上描述提供了控制光的持续时间、强度和/或波长的实例，但各种实施方式可以控制植物的照明的其他方面，或者促进植物的生长或感兴趣的蛋白质的生产的任何其他合适的组件。例如，I/O设备224中的一个或多个可以包括用于向植物供水的水元件、用于控制植物附近的环境温度的热元件、用于控制食物或化学物质向植物或植物的土壤环境的扩散的营养元件等。
类似地，I/O设备224可以包括任何合适的传感器，如测树器、应变传感器、光传感器、温度传感器、湿度传感器、照相机等。该传感器可以用于检测或确定植物的生长、植物的蛋白质生产、或植物的任何其他合适的参数，这些参数可能是与植物相关控制照明元件等的操作所期望的。
在各种实施方式中，存储器214可以被配置为存储人工智能算法。该一个或多个处理器216可以被配置为使用人工智能算法来基于所感测或确定的参数计算至少一个修改值，并且基于修改值控制照明元件203的操作等。例如，该一个或多个处理器216可以向人工智能算法提供所确定或感测的植物生长水平，以便确定修改值，如增加或减少照明的持续时间。然后，该一个或多个处理器216可以根据所计算的修改值来控制照明元件203，以在下一个时间段周期期间增加或减少所提供光的持续时间。
人工智能算法可以包括任何合适的算法，如机器学习模型。例如，可以训练机器学习模型来根据历史值预测最佳光持续时间、光强度、光波长(或任何其他合适的控制参数)，以促进植物的生长或感兴趣的蛋白质的生产(或任何其他合适的植物参数)。历史值可以基于光持续时间、光强度、光波长等的多个值，指示经测试植物生长、蛋白质生产的水平等。
可以使用任何合适的机器学习模型，并且可以以任何合适的方式训练这些模型。例如，历史数据可以被分成训练数据和测试数据，其中训练数据用于训练该模型，而测试数据用于测试模型性能和预测准确度。典型地，根据期望的模型开发参数，训练数据集被选择为大于测试数据集。分离一部分获取的数据作为测试数据允许对照实际的历史输出数据测试经训练的模型，以促进该模型的更精确的训练和开发。这种布置可以允许系统在未来在处理新的植物生长参数、蛋白质生产参数等时模拟机器学习预测的结果。可以使用任何合适的机器学习模型技术来训练该模型，包括本文所述的那些技术，如随机森林、逻辑回归、决策树(例如，光梯度提升树)和神经网络。
可以使用测试数据来测试经训练的模型，并且可以将来自经测试模型的输出数据的结果与测试数据的实际历史输出进行比较，以确定准确度水平。可以使用任何合适的机器学习模型分析(如累积增益和提升图)来评价模型结果。提升是预测模型有效性的度量，计算为使用和不使用预测模型获得的结果之间的比率(例如，通过将经测试的模型输出与测试数据的实际输出进行比较)。累积增益和提升图为测量模型性能提供了直观的帮助。两个图都包括升力曲线和基线，其中升力曲线和基线之间的面积越大，表示模型越强。
在评价模型测试结果之后，如果模型测试结果令人满意，则可以部署该模型。部署该模型可以包括使用该模型来对具有未知输出的大规模输入数据集进行预测，以及使用该模型来修改控制植物的培育环境的元件的设置。如果模型测试结果的评价不令人满意，则可以使用不同的参数、使用不同的建模技术或使用其他模型类型来进一步开发模型。
一个示例机器学习模型是基于递归神经网络的模型，其可以直接预测因变量，而无需将变量之间的关系转换成数学形式。神经网络模型包括大量并行操作并分层排列的虚拟神经元。第一层是输入层，并接收原始输入数据。每个连续层修改来自前一层的输出，并将它们发送到下一层。最后一层是输出层，并产生系统的输出。
在一些实施方案中，可以实现卷积神经网络。类似于LSTM神经网络，卷积神经网络包括输入层、隐藏层和输出层。然而，在卷积神经网络中，输出层包括的输出比隐藏层中神经元的数量少一个，并且每个神经元都连接到每个输出。另外，输入层中的每个输入都连接到隐藏层中的每个神经元。
在各种实施方式中，输入层中的每个输入节点都可以与数值相关联，该数值可以是任何实数。在每一层中，每个离开输入节点的连接都具有一个与之相关联的权重，该权重也可以是任何实数。在输入层中，神经元的数量等于数据集中要素(列)的数量。输出层可以具有多个连续的输出。
如上所述，输入层和输出层之间的层是隐藏层。隐藏层的数量可以是一个或多个(对于许多应用来说，一个隐藏层可能是足够的)。没有隐藏层的神经网络可以表示线性可分函数或决策。具有一个隐藏层的神经网络可以执行从一个有限空间到另一个空间的连续映射。具有两个隐藏层的神经网络可以以任何准确度近似任何平滑映射。
可以优化神经元的数量。在训练开始时，网络配置很可能具有多余的节点。在不会显著影响网络性能的训练期间，可以从网络中移除一些节点。例如，在训练后权重趋近于零的节点可以移除(这个过程称为剪枝)。神经元的数量可能导致欠拟合(不能充分捕获数据集中的信号)或过拟合(没有足够的信息来训练所有神经元；网络在训练数据集上表现良好，但在测试数据集上表现不佳)。
可以使用各种方法和标准来测量神经网络模型的性能。例如，均方根误差(RMSE)测量观察值和模型预测值之间的平均距离。决定系数(R2)测量观察结果和预测结果之间的相关性(而非准确性)。如果数据具有大的差异，则这种方法可能不可靠。其他性能测量包括不可约噪声、模型偏差和模型方差。模型的高模型偏差表明该模型不能捕获预测因子和结果之间的真实关系。模型方差可以指示模型是否不稳定(数据中的轻微扰动将显著改变模型拟合)。
再次参考图7，辅助存储器222可以包括一个或多个磁盘驱动器或磁带驱动器。辅助存储器222可以用于数据的非易失性存储，并且在RAM220没有大到足以容纳所有工作数据的情况下，可以用作溢出数据存储设备。辅助存储器222可以用于存储程序，当选择执行此类程序时，将这些程序加载到RAM 220中。
在该实施方案中，辅助存储器222具有处理组件222a，该处理组件包括可由处理器216操作以执行本披露方法的各种操作的非暂时性指令。ROM 218用于存储在程序执行期间读取的指令和可能的数据。辅助存储器222、存储器214、RAM 220和/或ROM 218在一些上下文中可以被称为计算机可读存储介质和/或非暂时性计算机可读介质。
任选的I/O设备224可以包括打印机、视频监视器、液晶显示器(LCD)、等离子显示器、触摸屏显示器、键盘、小键盘、开关、拨号盘、鼠标、轨迹球、语音识别器、读卡器、纸带阅读器或其他合适的输入设备。
网络连接设备212可以采取调制解调器、调制解调器组、以太网卡、通用串行总线(USB)接口卡、串行接口、令牌环卡、光纤分布式数据接口(FDDI)卡、无线局域网(WLAN)卡、无线电收发器卡的形式。设备212可以使用如码分多址(CDMA)、全球移动通信系统(GSM)、长期演进(LTE)、全球互通微波访问(WiMAX)、近场通信(NFC)、射频识别(RFID)和/或其他空中接口协议无线电收发器卡以及其他合适的网络设备的协议来促进无线电通信。这些网络连接设备212可以使处理器216能够与互联网和/或一个或多个内联网通信。利用这样的网络连接，预期处理器216可以从网络接收信息，可以在执行上述方法操作的过程中向网络输出信息等。这种信息(通常被表示为要使用处理器216执行的指令序列)可以例如以包含在载波中的计算机数据信号的形式从网络接收和输出到网络。
处理器216执行指令、代码、计算机程序、脚本，其从硬盘、软盘、光盘(这些各种基于盘的系统都可以被认为是辅助存储器222)、闪存驱动器、存储器214、ROM218、RAM220、网络连接设备212等访问。虽然仅示出了一个处理器216，但可以存在多个处理器。因此，虽然指令可以被讨论为由处理器执行，但指令可以同时、串行执行，或者由一个或多个处理器执行。
尽管参考计算设备描述了系统202，但应当理解，该系统可以由协作执行任务的相互通信的两个或更多个计算设备形成。例如，但不限于，应用程序可以以允许应用程序的指令的同时和/或并行处理的方式被划分。可替代地，由应用程序处理的数据可以以允许由两台或更多台计算机同时和/或并行处理数据集的不同部分的方式被划分。
在一个实施方案中，虚拟化软件可以被系统202用于提供不直接绑定到系统202中的计算机数量的多个服务器的功能。上面披露的功能可以通过在云计算环境中执行一个和/或多个应用来提供。云计算可以包括使用动态可扩展的计算资源，经由网络连接提供计算服务。云计算环境可以由企业建立和/或可以根据需要从第三方提供商租用。
应当理解，通过将可执行指令编程和/或加载到系统202上，CPU216、存储器214、ROM218和RAM220中的至少一个被改变，从而将系统202部分地转换成具有由本披露内容教导的新功能的专用机器和/或装置。电气工程和软件工程领域的基础是，可以通过将可执行软件加载到计算机中来实现的功能可以通过熟知的设计规则转换成硬件实现。
先前描述本质上仅仅是说明性的并且决不旨在限制本披露内容、其应用或用途。本披露内容的广泛教导可以以多种形式实施。因此，虽然本披露内容包括特定示例，但是本披露内容的真实范围不应该被如此限制，因为在研究附图、说明书和所附权利要求后其他修改将变得显而易见。应当理解，方法内的一个或多个步骤可以在不改变本披露内容的原理的情况下以不同的顺序(或同时)执行。进一步地，虽然每个实施方案在上文被描述为具有某些特征，但是关于本披露内容的任何实施方案描述的那些特征中的任何一个或多个可以在任何其他实施方案中实施和/或与任何其他实施方案的特征组合，即使该组合没有被明确描述。换句话说，所描述的实施方案不是相互排斥的，并且一个或多个实施方案彼此的排列保持在本披露内容的范围内。
使用各种术语来描述元件之间(例如，模块之间)的空间和功能关系，包括“连接的”、“接合的”、“接口的”和“耦接的”。除非明确描述为“直接”，否则当在上述披露内容中描述第一元件与第二元件之间的关系时，该关系涵盖在第一元件与第二元件之间不存在其他中间元件的直接关系，以及在第一元件与第二元件之间存在一个或多个中间元件(空间上或功能上)的间接关系。短语A、B和C中的至少一个应该被解释为意指逻辑(A OR B OR C)，使用非排他性逻辑OR，而不应该被解释为表示“A中的至少一个、B中的至少一个和C中的至少一个”。
在附图中，箭头所指的箭头方向通常表明对图示感兴趣的信息流(如数据或指令)。例如，当元素A和元素B交换各种信息，但从元素A传输到元素B的信息与图示相关时，箭头可以从元素A指向元素B。该单向箭头并不意味着没有其他信息从元素B传输到元素A。此外，对于从元素A发送到元素B的信息，元素B可以向元素A发送对该信息的请求或接收确认。术语子集不一定需要真子集。换句话说，第一集的第一子集可以与第一集同延(等于第一集)。
在本申请中，包括以下定义，术语“模块(module)”或术语“控制器(controller)”可以用术语“电路(circuit)”代替。术语“模块”可以指代执行代码的处理器硬件(共享的、专用的或成组的)和存储由处理器硬件执行的代码的存储器硬件(共享的、专用的或成组的)、是其一部分或包括该处理器硬件和该存储器硬件。
模块可以包括一个或多个接口电路。在一些示例中，(多个)接口电路可以实施连接到局域网(LAN)或无线个人局域网(WPAN)的有线接口或无线接口。LAN的实例是电气和电子工程师协会(IEEE)标准802.11-2016(也被称为WIFI无线网络标准)和IEEE标准802.3-2015(也被称为以太网有线网络标准)。WPAN的实例是IEEE标准802.15.4(包括来自ZigBee联盟的ZIGBEE标准)和来自蓝牙技术联盟(SIG)的蓝牙无线网络标准(包括来自蓝牙SIG的核心规范版本3.0、4.0、4.1、4.2、5.0和5.1)。
模块可以使用(多个)接口电路与其他模块通信。尽管模块在本披露内容中可以被描绘为直接与其他模块进行逻辑通信，但是在各种实施方式中，模块实际上可以经由通信系统进行通信。通信系统包括如集线器、交换机、路由器和网关等物理和/或虚拟网络设备。在一些实施方式中，通信系统连接到或穿越如互联网等广域网(WAN)。例如，通信系统可以包括使用包括多协议标签交换(MPLS)的技术通过互联网或点对点租用线路彼此连接的多个LAN以及虚拟专用网(VPN)。
在各种实施方式中，模块的功能可以分布在经由通信系统连接的多个模块中。例如，多个模块可以实施由负载平衡系统分布的相同功能。在另外的示例中，模块的功能可以在服务器(也被称为远程或云)模块与客户端(或用户)模块之间划分。
如上文所使用的术语代码可以包括软件、固件和/或微代码，并且可以是指程序、例程、函数、类、数据结构和/或对象。共享处理器硬件涵盖执行来自多个模块的一些或所有代码的单个微处理器。组处理器硬件涵盖微处理器，该微处理器与附加微处理器相结合来执行来自一个或多个模块的一些或所有代码。对多个微处理器的引用涵盖分立管芯上的多个微处理器、单个管芯上的多个微处理器、单个微处理器的多个核、单个微处理器的多个线程或以上的组合。
共享存储器硬件涵盖存储来自多个模块的一些或所有代码的单个存储器设备。组存储器硬件涵盖与其他存储器设备相结合来存储来自一个或多个模块的一些或所有代码的存储器设备。
术语存储器硬件是术语计算机可读介质的子集。如本文所用的术语计算机可读介质不涵盖通过介质(如在载波上)传播的瞬态电或电磁信号；因此，术语计算机可读介质被认为是有形的和非暂态的。非暂态计算机可读介质的非限制性实例是非易失性存储设备(如闪速存储器设备、可擦除可编程只读存储设备或掩模只读存储器设备)、易失性存储器设备(如静态随机存取存储器设备或动态随机存取存储器设备)、磁存储介质(如模拟或数字磁带或硬盘驱动器)和光学存储介质(如CD、DVD或蓝光盘)。
本申请中描述的装置和方法可以部分或完全由专用计算机实施，该专用计算机通过配置通用计算机来执行计算机程序中体现的一个或多个特定功能而创建。上述功能框和流程图元素用作软件规范，该软件规范可以通过熟练的技术人员或程序员的日常工作翻译成计算机程序。
计算机程序包括存储在至少一个非暂态计算机可读介质上的处理器可执行指令。计算机程序还可以包括或依赖于存储的数据。计算机程序可以涵盖与专用计算机的硬件交互的基本输入/输出系统(BIOS)、与专用计算机的特定设备交互的设备驱动程序、一个或多个操作系统、用户应用程序、后台服务、后台应用程序等。
计算机程序可以包括：(i)要被解析的描述性文本，如HTML(超文本标记语言)、XML(可扩展标记语言)或JSON(JavaScript对象符号)，(ii)汇编代码，(iii)由编译器从源代码生成的目标代码，(iv)由解释器执行的源代码，(v)由即时编译器编译和执行的源代码等。仅作为实例，源代码可以使用来自包括C、C++、C#、Objective C、Swift、Haskell、Go、SQL、R、Lisp、Fortran、Perl、Pascal、Curl、OCaml、HTML5(超文本标记语言第5版)、Ada、ASP(活动服务器页面)、PHP(PHP：超文本预处理器)、Scala、Eiffel、Smalltalk、Erlang、Ruby、、Visual、Lua、MATLAB、SIMULINK和的语言的语法来编写。
除非另外指示，否则术语“约”在与数字结合使用时是指围绕该数字的+/-10％的范围，包括端值。例如，术语“约10pm”是指9至11μm的范围，包括端值。
本文中对值的范围的叙述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非在本文中另有说明，否则将每个单独的值并入说明书中，如同其在本文中单独叙述一样。除非在本文中另外指示或另外明显地与上下文矛盾，否则本文所述的所有方法能以任何合适顺序进行。
关于本文某些实施方案而提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“如”)的应用仅旨在更好地说明本发明，而不旨在对本文披露的实施方案做出限制。本说明书中的任何语言都不应当被解释为指示任何未要求保护的要素是实践本发明所必需的。
对于本领域技术人员应当清楚的是，除了已经描述的那些之外的更多修改是可能的。除了所附权利要求的范围之外，本文披露的系统、方法和设备不受限制。此外，在解释本说明书和权利要求书时，所有术语都应当以与上下文一致的尽可能广泛的方式来解释。特别地，术语“包含/包括(comprises和comprising)”应当被解释为以非排他性方式提及要素、组分或步骤，从而指示所提及的要素、组分或步骤可以与未明确提及的其他要素、组分或步骤一起存在、或使用、或组合。在本说明书的权利要求提及选自由A、B、C……和N组成的组的某物中的至少一种的情况下，该文本应当被解释为仅需要该组中的一种要素，而不是A加N或B加N等。

Claims (25)

1.一种用于在植物或植物的一部分中生产感兴趣的蛋白质的方法，该方法包括：
a)将一种或多种核酸引入该植物或该植物的一部分中，该核酸包含编码该感兴趣的蛋白质并且可操作地连接到调节区的核苷酸序列；
b)在允许编码该感兴趣的蛋白质的核苷酸序列表达的条件下培育该植物或该植物的一部分，从而产生该感兴趣的蛋白质；以及
c)向该植物的培养基环境中添加培养基改良剂，其中该培养基改良剂包括碳酸钙源，该碳酸钙源包括文石。
2.如权利要求1所述的方法，其中该核苷酸序列编码药物活性蛋白、抗体、抗原、疫苗、酶或工业酶。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中该感兴趣的蛋白质是nogapendekin-alfa-inbakicept(NAI)、TxM或mAb，该nogapendekin-alfa-inbakicept(NAI)是包含由组织因子接头连接的可溶性TGF-βRII结构域和IL-15/IL15RαSu结构域的异二聚体双功能融合复合物。
4.如权利要求3所述的方法，其中该包含由组织因子接头连接的可溶性TGF-βRII结构域和IL-15/IL15RαSu结构域的异二聚体双功能融合复合物是HCW9218或HCW9228。
5.如权利要求3所述的方法，其中该TxM是包含与结合结构域连接的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc支架的复合物。
6.如权利要求5所述的方法，其中该结合结构域识别免疫检查点分子、免疫信号传导分子或疾病抗原。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在步骤b)中，该核酸在该植物中瞬时表达。
8.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在步骤b)中，该核酸在该植物中稳定地表达。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该培养基环境包括土壤。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该文石呈颗粒形式，其颗粒尺寸为直径约3μm至约10μm。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该文石为鲕状文石。
12.如权利要求11所述的方法，其中该鲕状文石未经加工。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中基于该培养基改良剂的总重量，该碳酸钙源以至少约10重量％的量存在于该培养基改良剂中。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该培养基改良剂进一步包含以下中的一种或多种：粘合剂、有机材料、堆肥、石膏、硼砂、风化褐煤、磷酸盐、顺磁性玄武岩粉末、冰川砾石粉尘、钾、富里酸粉末、腐殖酸粉末、填料、除草剂、杀真菌剂、真菌和细菌。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在播种前、播种期间、播种后、或其组合，将该培养基改良剂添加到该培养基环境中。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该植物来自选自由以下组成的组的属：拟南芥属、烟草属、芸苔属、番薯属、玉米属、高粱属、红花属、甘氨酸属、小麦属、茄属、燕麦属、黑麦属、苜蓿属、向日葵属、棉属、大麦属、稻属、人参属和豌豆属。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，该方法进一步包括收获该植物或该植物的一部分的步骤d)。
18.如权利要求17所述的方法，其中该步骤d)进一步包括纯化该感兴趣的蛋白质。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中培育该植物包括以下至少一项：
修改在该植物生长期间的一个或多个指定的每日时间段期间提供给该植物的光的持续时间；
修改在该植物生长期间提供给该植物的光的强度；以及
修改在该植物生长期间提供给该植物的光的波长。
20.如权利要求19所述的方法，该方法进一步包括感测该感兴趣的蛋白质的生产水平，其中修改光的持续时间、强度和/或波长包括根据所感测的该感兴趣的蛋白质的生产水平修改光的持续时间、强度和/或波长。
21.如权利要求19所述的方法，该方法进一步包括感测该植物的生长水平，其中修改光的持续时间、强度和/或波长包括根据所感测的该植物的生长水平修改光的持续时间、强度和/或波长。
22.如权利要求20或21所述的方法，该方法进一步包括通过人工智能算法根据所感测的该植物生长水平和/或所感测的该感兴趣的蛋白质生产水平来计算至少一个修改值，其中修改光的持续时间、强度和/或波长包括根据所计算的至少一个修改值来修改光的持续时间、强度和/或波长。
23.如权利要求22所述的方法，其中该人工智能算法包括机器学习模型，该模型被训练成根据基于光持续时间、强度和/或波长的多个值的植物生长和/或蛋白质生产的历史值，预测用于该植物生长和/或该感兴趣的蛋白质生产的光的最佳持续时间、强度和/或波长。
24.如权利要求20至23中任一项所述的方法，其中：
感测该植物的生长水平和/或该感兴趣的蛋白质的生产包括使用至少一个与该植物相关联的传感器感测该感兴趣的蛋白质的生长和/或生产水平；以及
该至少一个传感器包括测树器、应变传感器、光传感器、温度传感器、湿度传感器和照相机中的至少一种。
25.一种用于在植物或植物的一部分中生产感兴趣的蛋白质的系统，该系统包括：
适于使该植物生长的培养基环境，该培养基环境包含培养基改良剂，该培养基改良剂包括碳酸钙源，该碳酸钙源包括文石，该植物包括引入该植物或该植物的一部分中的一种或多种核酸，该核酸包含编码该感兴趣的蛋白质并且可操作地连接到调节区的核苷酸序列；
适于在允许编码该感兴趣的蛋白质的核苷酸序列表达的条件下培育该植物，从而产生该感兴趣的蛋白质的培育设备，该培育设备包括至少一个向该植物提供光的照明元件；
与植物相关联的至少一个传感器，该至少一个传感器被配置为感测该植物的至少一个参数；
被配置为存储计算机可执行指令的存储器；以及
被配置为执行这些指令的至少一个处理器，其中这些指令包括：
接收所感测的该植物的至少一个参数；以及
以下至少一项：
根据所感测的该植物的至少一个参数，控制该照明元件的操作，以修改在该植物生长期间的一个或多个指定的每日时间段期间提供给该植物的光的持续时间；
根据所感测的该植物的至少一个参数，控制该照明元件的操作，以修改在该植物生长期间提供给该植物的光的强度；以及
根据所感测的该植物的至少一个参数，控制该照明元件的操作，以修改在该植物生长期间提供给该植物的光的波长。
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