JP5775178B2 - Ｎ−置換ピリジニウム化合物の調製のための方法および物質 - Google Patents

Description

本発明は、ペンタメチン前駆体を第一級アミンと反応させることによるＮ−置換３−アシル化ピリジニウム化合物の合成のための方法に関する。この反応において、Ｎ−置換３−アシル化ピリジニウム複素環が形成される。

ピリジニウム化合物は、例えば薬物設計において、または有機合成のための、特に天然産物合成における一般的な中間体として、特別に興味深い(Cheng, W.-C. and Kurth, M.J., Organic Preparations and Procedures International 34 (2002) 585-608)。本発明に従う置換ピリジニウム化合物のあるものは、ＮＡＤおよびその誘導体の合成において、ならびにＮＡＤ類似体およびその誘導体の合成において、それぞれ非常に有用である。

置換ピリジニウム化合物の生成における標準的な合成経路は、ピリジン誘導体のアルキル化による。しかし、この反応は第１級アルキルハライドを用いる場合にのみ好都合である。第２級または第３級アルキルハライドを用いる場合、望まれない副反応として脱離が起き、収率は一般に低い。さらに、アルキル化がハロゲン原子が不斉炭素原子に結合したアルキルハライドを用いて実施される場合、求核置換反応の間にラセミ化が起こり得る。

全てのこれらの限界は“Ｚｉｎｃｋｅ反応”を用いることにより克服され、それはＺｉｎｃｋｅ塩類のアルキルまたはアリールアミン類との反応に基づいている。Ｚｉｎｃｋｅ塩類は活性化されたピリジニウム塩類であり、それは第１級アミン（Ｒ−ＮＨ２）と反応することができ、ここで２または６位それぞれの窒素において開環が誘導され、今度はそれに続いて閉環が起きてＲ−置換ピリジニウム化合物になる。そのＺｉｎｃｋｅ反応はヒドラジン類、ヒドロキシルアミン類およびカルボン酸ヒドラジド類を用いて実施することもできる。これらのタイプのＺｉｎｃｋｅ反応は、溶液中での有機合成のために、または固相有機合成のために用いられる(Eda, M. et al., J. Org. Chem. 65 (2000) 5131-5135)。

当技術において、望まれるＺｉｎｃｋｅ塩類を調製するための主な方法は、ピリジン誘導体を２，４ジニトロハロベンゾール、好ましくは２，４ジニトロクロロベンゾールおよび２，４ジニトロブロモベンゾールと反応させることによる。

上記の現状技術のプロセスの記述から明らかであるように、現在用いられている活性化試薬は、毒性であるか、爆発性であるか、または他の点で危険であるかのいずれかであり、従って小規模の研究での適用に限られている。Ｚｉｎｃｋｅ反応を自然にやさしい様式で、例えばマイクロ波に支援される合成を用いることにより実施する散発的試みが存在する。しかし、この試みはまだ爆発性のジニトロフェニル化合物に頼っており、爆発予防手段を取らずにこの方法をスケールアップすることは不可能である(Vianna, G.H.R. et al., Letters in Organic Chemistry 5 (2008) 396-398)。

Ｚｉｎｃｋｅ法の別の主な限界は、３−アシル置換ピリジン類のような電子不足反応物は２，４−ジニトロハロゲン化ベンゼン類と反応して対応するＺｉｎｃｋｅ塩類になることがほとんどないという事実である(Genisson, Y. et al., Synlett. 5 (1992) 431-434)。

従って、Ｎ−置換アシルピリジニウム化合物の合成を、例えば危険な活性化試薬を避けることにより向上するかなりの必要性が存在する。新規のより危なくない方法は、そのような化合物のはるかに大きな規模でのより安全な生産手順を、そしてより容易でより危険性が低くより効率的な生産を可能にするはずである。

様々な２−アルキルアミノペンタジエンイミン誘導体が酸性条件下でＮＨ４ＯＡｃまたは第１級アミン（Ｒ−ＮＨ２）と反応してそれぞれ対応する３−アルキル化ピリジン類、１−Ｒ−３−アルキル置換ピリジニウム化合物になることが知られている。必要とされる２−アルキルアミノペンタジエンイミン化合物は、アルデヒド類のＮ−ｔｅｒｔブチルイミノ誘導体をＬＤＡを用いて脱プロトン化して塩化ビナミジニウムと反応させることから入手可能である(Wypych, J.C. et al., J. Org. Chem. 73 (2008) 1169-1172)。

しかし、この方法の有用性は残念ながら限られている。反応性の基、例えばアシル官能基はアミノペンタジエンイミン系の２位において導入することができず、それは例えば１−Ｒ−３−アシル置換ピリジニウム化合物の合成に関する必要条件であろう。

驚くべきことに、先行技術の手順の不都合のかなり多くを本発明により開示されるような物質および方法の使用により克服することができることが分かっている。本発明に従う方法において、まずアミノペンタジエンイミニウム化合物が提供される。第１級アミン（Ｒ６−ＮＨ２）を用いたこの化合物のその次の反応が、１位においてＲ６で置換された対応するピリジニウム化合物をもたらす。本明細書において下記で開示される方法は、上記で言及した危ない活性化試薬を回避する。さらに、そのＮ−置換ピリジニウム誘導体の形成はほとんど定量的であり、容易にスケールアップすることができる。

すべてのこれらの発見に基づいて、当技術から既知の問題の多くを回避し、克服することができる。

Cheng, W.-C. and Kurth, M.J., Organic Preparations and Procedures International 34 (2002) 585-608 Eda, M. et al., J. Org. Chem. 65 (2000) 5131-5135 Vianna, G.H.R. et al., Letters in Organic Chemistry 5 (2008) 396-398 Genisson, Y. et al., Synlett. 5 (1992) 431-434 Wypych, J.C. et al., J. Org. Chem. 73 (2008) 1169-1172

本発明は、以下の工程を含む、Ｎ−置換３−アシルピリジニウム化合物の合成のための方法に関する：ａ）アシルペンタメチニウム塩を提供する工程、ｂ）工程（ａ）のペンタメチニウム塩を第１級アミンと反応させる工程、そしてｃ）それによりＮ−置換３−アシルピリジニウム化合物を得る。

このアプローチは、ＮＡＤおよびカルバＮＡＤ（＝ｃＮＡＤ）のようなＮＡＤ類似体それぞれの合成において非常に有用である。
新規のアシルペンタメチニウム化合物も開示する。

図１は、ｃＮＡＤＨ（破線）、ｃＮＡＤＰＨ（実線）およびアセチル−ｃＮＡＤＨ（点線）の吸収スペクトルを図説する。アセチル−ｃＮＡＤＨに関する吸収極大は約３８０ｎｍにあり、４００ｎｍ以上の波長においてさえも著しい吸収が見られる。

第１態様において、本発明は、以下の工程を含む、Ｎ−置換３−アルキルカルボニル、３−アリールカルボニルまたは３−ヘテロアリールカルボニルピリジニウム化合物の合成のための方法に関する：ａ）アシルペンタメチニウム塩を提供する工程、ｂ）工程（ａ）のペンタメチニウム塩を第１級アミンと反応させる工程、そしてｃ）それによりＮ−置換３−アルキルカルボニル、３−アリールカルボニルまたは３−ヘテロアリールカルボニルピリジニウム化合物を得る。

好ましい態様において、本発明は、以下の工程を含む、Ｎ−置換３−アルキルカルボニル、３−アリールカルボニルまたは３−ヘテロアリールカルボニルピリジニウム化合物の合成のための方法に関する：
ａ）式Ｉに示すペンタメチニウム塩を提供する工程、

式中、Ｘ⁻は対イオンであり、Ｒ１はアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択され、Ｒ２〜Ｒ５は独立してメチルまたはエチルであり、ｂ）工程（ａ）のペンタメチニウム塩を式ＩＩの第１級アミンと反応させる工程、

式中、Ｒ６は線状、分枝状、または環状の、場合により置換されたアルキルであり、ｃ）それにより式ＩＩＩのＮ−置換ピリジニウム化合物を得て、

式中、Ｘ⁻、Ｒ１、およびＲ６は上記で定義された通りである。
適切かつ好ましい対イオン（Ｘ⁻）は、ドデシル硫酸、塩化物、ＰＦ６⁻、ＢＦ４⁻、およびＣｌＯ４⁻である。好ましくは、その対イオンはドデシル硫酸、テトラフルオロホスフェート、またはテトラフルオロボレートである。

１態様において、用語アルキルは線状、分枝状および環状Ｃ１〜Ｃ１０アルキル残基を含む。１態様において、用語アリールは６〜３０個のＣ原子を有するアリール残基に関する。アリールは例えばフェニルもしくはナフチルまたは５個までの縮合したベンゼン環の総数を有するより高度な縮合芳香族多環である。１態様において、本発明のヘテロアリール基は合計で６〜３０個の原子（６〜３０原子）を有する。ヘテロアリールは好ましくはＳ、ＯおよびＮから選択される５個までのヘテロ原子を含む。ヘテロアリールは例えばフラニル、チオフェニルおよびピリジルまたはイミダゾイルであり、それは例えばキノリンまたはベンゾフランにおけるようにアリール環に縮合していてよい。

１態様において、アルキルはＣ１〜Ｃ１０アルキルであり、アリールはＣ６〜Ｃ３０アリールであり、ヘテロアリールは６〜３０原子のヘテロアリール（＝６〜３０原子ヘテロアリール）である。

あらゆるアルキル、アリールまたはヘテロアリールは、所与の反応条件下で不活性であるあらゆる置換基により置換され得る。当業者には、そのような不活性な置換基を選択することは標準的である。

本発明に従う方法は、アルキルカルボニル、アリールカルボニルならびにヘテロアリールカルボニルピリジニウム化合物を生成するのに適切である。
１態様において、本発明に従う方法は式Ｉに示すペンタメチニウム化合物を用いて実施され、ここでＲ１はメチル、エチル、プロピル、ブチルまたはイソプロピルである。１態様において、本発明はＲ１がＣＨ３である本発明に従う方法におけるペンタメチニウム塩の使用に、すなわちＮ−置換３−アセチルピリジニウム化合物の生成に関する。

１態様において、本発明に従う方法は、Ｒ２〜Ｒ５がメチルである式Ｉに示すペンタメチニウム化合物を用いて実施される。
好ましい態様において、本発明は、以下の工程を含む、Ｎ−置換３−アルキルカルボニルピリジニウム化合物の合成のための方法に関する：
ａ）式Ｉに示すペンタメチニウム塩を提供する工程、

式中、Ｘ⁻は対イオンであり、Ｒ１はＣ１〜Ｃ１０アルキルであり、Ｒ２〜Ｒ５は独立してメチルまたはエチルであり、ｂ）工程（ａ）のペンタメチニウム塩を式ＩＩの第１級アミンと反応させる工程、

式中、Ｒ６は線状、分枝状、または環状の、場合により置換されたアルキルであり、ｃ）それにより式ＩＩＩのＮ−置換ピリジニウム化合物を得て、

式中、Ｘ⁻、Ｒ１、およびＲ６は上記で定義された通りである。
上記で定義されたように、Ｒ６は好ましくは線状または分枝状、または環状の、場合により置換されたアルキルである。好ましい態様において、アルキルは線状Ｃ１〜Ｃ６アルキル、もしくは分枝状Ｃ３〜Ｃ６アルキル、もしくは環状Ｃ５〜Ｃ６アルキルであり、または置換されたアルキルは置換された線状Ｃ１〜Ｃ６、もしくは置換された分枝状Ｃ３〜Ｃ６、もしくは置換された環状Ｃ５〜Ｃ６アルキルである。好ましくは、式ＩＩに示す化合物は線状もしくは分枝状アルキルアミンであり、またはフラノシルアミンもしくはシクロペンチルアミンである。１態様において、Ｒ６はフラノシルまたはシクロペンチル残基である。

驚くべきことに、本発明に従う合成は望まれる生成物の非常に高い収率を有することが分かっている。従って、塩基性条件にも関わらず、ＣＨ酸アシル官能基（ＣＨ ａｃｉｄ ａｃｙｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）による著しい副反応は観察することができなかった。

本発明に従う方法は、アシルピリジニウム誘導体の合成において特に有用である。例えば我々は、例えばペンタメチニウム塩である５−ジメチルアミノ−４−アセチル−ペンタ−２，４−ジエニリデン−ジメチルアンモニウム テトラフルオロボレートが異なる第１級アミン（Ｒ−ＮＨ２）により１工程で環化して対応する１−Ｒ−３−アシル置換ピリジニウム化合物になることを見出した。この方法を用いて、例えば３−アセチル−１−［２，３−ビスヒドロキシ−４−（ホスホノオキシ）メチル−シクロペンチル］−ピリジニウムを、例えばジイソプロピルエチル−アンモニウム塩として得ることが可能である。この化合物は、カルバＮＡＤ（＝ｃＮＡＤ）の３−アセチル誘導体の合成における優秀な前駆体である。

１態様において、本発明に従う方法は、３−アミノ−５−（ホスホノオキシメチル）−１，２−シクロ−ペンタンジオールである式ＩＩに示す第１級アミンを用いて実施される。この式ＩＩに示す化合物は、２，３−ジヒドロキシ−４−ホスホノ−オキシメチル−１−アミノシクロペンタンとして、またはリン酸モノ−（４−アミノ−２，３−ジヒドロキシ−シクロペンチルメチル）エステルとしても知られている。当業者は理解するであろうように、この化合物および関連する他の好ましい化合物は好都合には二アンモニウム塩として提供される。

１態様において、本発明に従う方法は、（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−４−ホスホノ−オキシメチル−１−アミノシクロペンタンである式ＩＩに示す第１級アミンを用いて実施される。

１態様において、本発明に従う方法は、（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−１−アミノシクロペンタンである式ＩＩに示す第１級アミンを用いて実施される。

驚くべきことに、例えば実施例の節において開示される方法により、新規のペンタメチニウム化合物を生成し、公衆に提供することが可能であることが分かっている。１態様において、本発明は式Ｉの化合物に関し、

式中、Ｘ⁻は対イオンであり、Ｒ１はＣ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ６〜Ｃ３０アリールおよび６〜３０原子を有するヘテロアリールからなる群から選択され、Ｒ２〜Ｒ５は独立してメチルまたはエチルである。

１態様において、本発明は、Ｒ１がＣ１〜Ｃ１０アルキルである、式Ｉに示すペンタメチニウム化合物に関する。
１態様において、本発明は、Ｒ１がメチル、エチル、プロピル、ブチルおよびイソプロピルからなる群から選択される、式Ｉに示すペンタメチニウム化合物に関する。

１態様において、本発明は、Ｒ１がメチルである、式Ｉに示すペンタメチニウム化合物に関する。
実施例の節において示される実験の焦点は、ペンタメチニウム塩である５−ジメチルアミノ−４−アセチル−ペンタ−２，４−ジエニリデン−ジメチルアンモニウム テトラフルオロボレートの３−アミノ−５−［（ホスホノオキシ）メチル］−１，２−シクロ−ペンタンジオール ジアンモニウム塩を用いた変換にあった。リン酸化アミノ糖は、例えば対イオンとしてのテトラフルオロボレートの存在下で、ペンタメチニウム塩とほとんど定量的に反応してＮ−置換３−アセチルピリジニウム誘導体が得られることが分かっている。

しかし、示した方法は、他の第１級アミンに拡張することができる。当業者が理解しているように、そのような第１級アミンはさらにその環化反応を妨げない置換基を含むことができる。好ましい態様において、その化合物Ｒ６−ＮＨ２は置換された第１級アルキルアミンである。

本発明に従う方法における使用のための好ましい置換された第１級アルキルアミンは、アミノアルコール類およびアミノ酸の純粋な立体異性体である。
好ましくは、アミノアルコール類はあらゆる天然存在アミノ酸またはあらゆる商業的に入手できる非天然アミノ酸に由来する。好ましくは、そのアミノアルコール類は、セリノール、スレオニノール、フェニルアラニノール、２，５−ジアミノ−１−ペンタノール（オルニチンから）、２，６−ジアミノ−１−ヘキサノール（リシンから）からなる群から選択される。

式ＩＩに示す化合物がアミノ酸である場合、そのアミノ酸はあらゆる天然存在アミノ酸またはあらゆる非天然アミノ酸から選択されてよい。好ましい態様において、そのアミノ酸は天然存在アミノ酸または非天然存在の、好ましくは商業的に入手できるアミノ酸のどちらかである。好ましくは、式ＩＩに示す化合物は、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、およびロイシンから選択されるアミノ酸である。

望まれるならば、さらなる代替の態様において、ジ−ピリジニウムまたはポリ−ピリジニウム化合物を形成するために、アミノ基が保護されていないジ−またはポリアミン類を２当量以上のペンタメチニウム塩と反応させることができる。

フラノシル糖部分またはそのようなフラノシル糖部分の類似体で置換されたアミンも好ましい第１級アミンであり、それは場合によりＯＨ基においてリン酸化されており、または保護されたヒドロキシル基を含み、一方でその保護基はベンジル、アセタール、シリルおよびトリチルであり、またはＯＨ基の代わりにＦまたはメトキシ基を含む。好ましくは、ＮＡＤまたはニコチンアミドモノヌクレオシドおよびそれらの類似体の合成に適したフラノシル糖またはそのような類似体が用いられる。

ＮＡＤまたはニコチンアミドモノヌクレオシドおよびそれらに対する類似体の合成のためのフラノシルアミン類の使用は、以下の参考文献において詳細に記述されている：Kam, B.L. et al., Biochemistry 26 (1987) 3453-3461; Sicsic, S. et al., European Journal of Biochemistry 155 (1986) 403-407; Kam, B.L. and Oppenheimer, N.J., Carbohydrate Research 77 (1979) 275-280;および米国特許第４，４１１，９９５号。

好ましいフラノシルアミン類は、Ｄ−およびＬ−リボース、キシロースおよびアラビノースのベータおよびアルファアミノアノマー類である。
ベータ−Ｄ−リボフラノシルアミン類、２−デオキシリボフラノシルアミン、または２，３−ジデオキシ−リボシルフラノシルアミンのようなフラノシルアミン類のカルバ類似体であるシクロペンチルアミン類、すなわち（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−１−アミノシクロペンタン、（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−３−アミノ−４−ヒドロキシ−シクロ−ペンタンメタノール、または（１Ｒ−シス）−３−アミノ−シクロペンタン−メタノールも好ましい。

１態様において、本発明において開示される方法は、ＮＡＤ類似体であるカルバＮＡＤ（＝ｃＮＡＤ）の、およびその類似体の合成においてそれぞれ用いられる。それはｃＮＡＤのアセチル化誘導体の合成において特に有用である。カルバＮＡＤおよびその好ましい使用がＷＯ ２００７／０１２４９４において詳細に記述されている。ＷＯ ２００７／０１２４９４の完全な開示を本明細書に援用する。本発明に従う方法における好ましい態様において、ペンタメチニウム塩は第１級アミンと反応し、ここで前記の第１級アミンは（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−３−アミノ−５−［（ホスホノオキシ）メチル］−１，２−シクロ−ペンタンジオール 二アンモニウム塩である。５−ジメチルアミノ−４−アセチル−ペンタ−２，４−ジエニリデン−ジメチルアンモニウム テトラフルオロボレートをこの第１級アミンと反応させることは、（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ） ３−アセチル−１−［２，３−ビスヒドロキシ−４−（ホスホノ−オキシ）メチル−シクロペンチル］−ピリジニウム（ジイソプロピルエチルアンモニウム塩）の形成につながり、それはｃＮＡＤのアセチル類似体の合成への鍵である（アセチルｃＮＡＤは、カルボキサミド基がアセチル基により置換されている化合物を指す）。カルバＮＡＤおよび類似体ならびにその好ましい使用がＷＯ ２００７／０１２４９４において詳細に記述されている。ＷＯ ２００７／０１２４９４の完全な開示を本明細書に援用する。

他の好ましい置換された第１級アミンは、３−アミノテトラヒドロフラン類または保護された３−アミノ−ピロリジン類、例えば（２Ｒ，４Ｒ）−４−アミノテトラヒドロフラン−２−メタノール（２，３−ジデオキシリボシルアミンの複素環式類似体）、シクロヘキシルアミン類およびシクロヘキサ−２−エニルアミン類、例えばGoulioukina, N. et al., Helvetica Chimica Acta 90 (2007) 1266-1278により開示されたような６環糖（６ ｒｉｎｇ ｓｕｇａｒ）類似体から選択される。

リン酸化アミノ糖の好ましい例は、（１Ｒ，４Ｓ，６Ｓ）−４−アミノ−６−ヒドロキシ−２−シクロヘキセン−１−メタノール−１−（二水素ホスフェート）、２−アミノ−１，５−アンヒドロ−２−デオキシ−６−（二水素ホスフェート） Ｄ−アルトリトール、および２−アミノ−１，５−アンヒドロ−２，３−ジデオキシ−６−（二水素ホスフェート） Ｄ−アラビノ−ヘキシトールである。

当業者は理解するであろうように、追加の主に求核性の置換基を有する第１級アミンを用いることさえできる。この場合、そのさらなる求核基は適切な保護基により保護されなければならない。保護基は当技術から周知であり、標準的な教科書において概説されている（Greene, T.W., Protective groups in organic synthesis, John Wiley&Sons, Inc. (1981) ニューヨーク、チチェスター、ブリズベン、トロント）。好ましくは、アミノ基はｂｏｃ−、フタロイル−またはトリフルオロアセチル−保護基により保護され、メルカプト基はジスルフィドとして保護される。

驚くべきことに、本発明者らにより、発光波長がアセチル化されていないＮＡＤおよび／またはｃＮＡＤ形態と比較した場合により長い波長（４００ｎｍ）へとシフトしていることも分かっている。これは、（生物学的）試料中に含まれる自己蛍光化合物からの干渉を回避するために、重要な利点である。

以下の実施例および図は本発明の理解を助けるために提供されており、その真の範囲は添付された特許請求の範囲において述べられている。述べられた手順において本発明の精神から逸脱することなく修正を行うことができることは理解されている。

実施例１．１
（（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−シクロペンチル）−カルバミン酸 ９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルの合成

（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−４−（ヒドロキシルメチル）−１−アミノシクロペンタン 塩酸塩（７０．０ｇ，３８０ｍｍｏｌ）を水（６６０ｍｌ）中で溶解させ、ジオキサン（２．００ ｌ）中で溶解させたＦｍｏｃＯＳＵ（Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）−スクシンイミド）（１４８．５ｇ，４４０ｍｍｏｌ）を添加した。次いで飽和した炭酸水素ナトリウム溶液（８００ｍｌ，８８０ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。その混合物を、ＴＬＣ（シリカゲル Ｍｅｒｃｋ ６０、クロロホルム／メタノール／酢酸 ８：２ ＋ ０．１％ ｖ／ｖ／ｖ）がその遊離体（ｅｄｕｃｔｓ）の完全な消費を示すまで、室温で３時間撹拌した。得られた沈殿を濾別し、その濾液を水（６．００ ｌ）に添加した。結果として得られた懸濁液を５分間撹拌し、次いで４℃で１２時間保管した。結果として得られた懸濁液を濾過した。得られた固体を冷水（３．００ ｌ）で洗浄し、塩化カルシウム上で４５℃において減圧下で１２時間乾燥させた。さらなる精製のため、その粗生成物を酢酸エチル中で懸濁し、１時間撹拌し、濾過し、減圧下で乾燥させると、１３４ｇ（９５％）の表題化合物が白色固体として得られた。

実施例１．２：
（（３ａＳ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−ヒドロキシメチル−２，２−ジメチル−テトラヒドロ−シクロペンタ［１，３］ジオキソール−４−イル）−カルバミン酸 ９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルの合成

（（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−シクロペンチル）−カルバミン酸 ９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（１１５ｇ，３１０ｍｍｏｌ）、２，２−ジメトキシプロパン（３６０ｍｌ，３．１０ｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸一水和物（１１８ｇ，６２０ｍｍｏｌ）を、乾燥アセトン(2.00 ｌ)中で溶解させた。その混合物を、ＴＬＣ（シリカゲル Ｍｅｒｃｋ ６０、クロロホルム／メタノール／酢酸 ９：１ ＋ ０．１％ ｖ／ｖ／ｖ）に従う出発物質の完全な消費まで、室温で３．５時間撹拌した。結果として得られた懸濁液を０℃で１５分間撹拌し、その沈殿を濾別し、冷アセトンで洗浄した。得られた褐色固体を再度ジエチルエーテル（８００ｍｌ）中で懸濁し、２０分間撹拌し、濾別し、ジエチルエーテル（４００ｍｌ）で洗浄し、減圧下で８時間乾燥させると、１１６ｇ（９１％）の表題化合物が得られた。

実施例１．３：
（（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−４−ホスホノ−オキシメチル−シクロペンチル）−カルバミン酸 ９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルの合成

温度計を取り付けた三つ口フラスコに、（（３ａＳ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−ヒドロキシメチル−２，２−ジメチル−テトラヒドロ−シクロペンタ［１，３］ジオキソール−４−イル）−カルバミン酸 ９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（１４６ｇ，３５７ｍｍｏｌ）を、続いて乾燥リン酸トリメチル（１．８０ ｌ）を入れ、固体がほとんど完全に溶解した。氷浴を用いた冷却下で、乾燥リン酸トリメチル（２００ｍｌ）中で溶解させた新しく蒸留したオキシ塩化リン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｘｙｃｈｌｏｒｉｄｅ）（３０５ｍｌ，３．３３ｍｏｌ）を、その混合物の温度が１０℃より上に上がらないように注意して１時間の期間をかけて滴加した。同じ条件下で乾燥ピリジン（８０．０ｍｌ，９９１ｍｍｏｌ）を添加し、その混合物を氷冷の下で２時間撹拌した。その混合物を室温で１時間そのままにした後、それを炭酸水素ナトリウム（７．００ ｌ）の飽和溶液中に３時間の期間をかけてゆっくりと滴下した。その反応混合物が熱くなっている場合、それを氷浴を用いて冷却する。完全に添加した後、その混合物はまだ酸性（ｐＨ＝２）である。結果として得られた懸濁液を４℃で１２時間保管する。得られた沈殿を濾別し、その濾液を塩化ナトリウムの飽和溶液（３０．０ ｌ）と共に撹拌した。続いてその混合物を４℃で１２時間そのままにし、結果として生じた沈殿を濾別または遠心分離した。その残留物を水（１３．０ ｌ）に添加し、２時間強く撹拌した。より遅い撹拌の下で、湿ったｄｉａｉｏｎ（Ｓｕｐｅｌｃｏ ＨＰ−２０）（５．００ ｌ）を添加し、その混合物をさらに４５分間撹拌した。続いてそのｄｉａｉｏｎをデカントし、同じ方法で水（５．００ ｌ）で２回洗浄した。装填された（ｌｏａｄｅｄ）ｄｉａｉｏｎをクロマトグラフィーカラム中に充填し、２５％イソプロパノールで溶離すると、７６．０ｇ（４６％）の表題化合物が得られた。

実施例１．４：
（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−３−アミノ−５−［（ホスホノ−オキシ）メチル］−１，２−シクロ−ペンタンジオール ジアンモニウム塩の合成

（（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−４−ホスホノ−オキシメチル−シクロペンチル）−カルバミン酸 ９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（４２．４ｇ，９４．３ｍｍｏｌ）をメタノール（２００ｍｌ）中で懸濁し、続いてアンモニア溶液（Ｈ_２Ｏ中２５％、５００ｍｌ）を添加した。その混合物を室温で１２時間撹拌した。結果として生じた沈殿を濾別し、その濾液を減圧下で蒸発させた。その残留物を水（５００ｍｌ）中で溶解させ、凍結乾燥すると、２４．４ｇ（９９％）の表題化合物が得られた。

実施例２：
ピリジニウム テトラフルオロボレートの合成

テトラフルオロホウ酸（２５０ｍｌ，２．００ｍｏｌ）を冷（０℃）ピリジン（１５７．７ｍｌ，１．９５ｍｏｌ）に２５分以内に添加し、無色の沈殿が得られた。その酸を完全に添加した後、その混合物を同じ温度でさらに３０分間撹拌した。次いでその反応混合物を濾過した。その残留物を冷エタノールで２回洗浄し、高真空において１２時間乾燥させると、２０１．９ｇ（６０％）のピリジニウム テトラフルオロボレートが無色の結晶として得られた。

実施例３：
５−ジメチルアミノ−４−アセチル−ペンタ−２，４−ジエニリデン−ジメチルアンモニウム テトラフルオロボレートの合成

ピリジニウム テトラフルオロボレート（２．２１ｇ，１３．３ｍｍｏｌ）を、（３Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−３−ブテン−２−オン（１．５４ｍｌ，１３．３ｍｍｏｌ）の１３．５ｍｌの無水酢酸／酢酸（２：１）中における溶液に添加した。結果として得られた懸濁液を０℃に冷却し、３−ジメチルアミノアクロレイン（１．３３ｍｌ，１３．３ｍｍｏｌ）を、強い撹拌および氷浴による冷却の下で１時間の期間をかけて添加し、赤褐色の沈殿が得られた（ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ）。その冷反応混合物を濾過し、残った固体をジエチルエーテルで数回洗浄し、減圧下で乾燥させた。そのペンタメチニウム塩がオレンジ色の粗生成物（２．６９ｇ，９６％）として得られ、それをそれ以上一切精製せずに用いた。

実施例４：
３−アセチル−１−［（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−２，３−ビスヒドロキシ−４−（ホスホノオキシ）メチル−シクロペンチル］−ピリジニウム ジイソプロピルエチルアンモニウム塩の合成

（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−３−アミノ−５−［（ホスホノオキシ）メチル］−１，２−シクロ−ペンタンジオール ジアンモニウム塩（３．２２ｇ，１２．３ｍｍｏｌ）を２０．０ｍｌのメタノール／Ｈ_２０（１：１）中で溶解させた。次いでジイソプロピルエチルアミン（４．００ｍｌ，２３．０ｍｍｏｌ）を添加し、続いて減圧下で蒸発させた。この手順を２回繰り返した。その得られた乾燥した固体を１００．０ｍｌのＭｅＯＨ中で懸濁し、５−ジメチルアミノ−４−アセチル−ペンタ−２，４−ジエニリデン−ジメチルアンモニウム テトラフルオロボレート（２．４９ｇ、８．８３ｍｍｏｌ、実施例３からの粗生成物）を添加した。その懸濁液をジイソプロピルエチルアミン（３．０６ｍｌ，１７．６ｍｍｏｌ）と共に混合し、４５分間還流した。冷却して室温まで下げた後、３００ｍｌの酢酸エチルを添加した。結果として生じた沈殿を濾別し、減圧下で短時間乾燥させた。得られた固体を水中で溶解させ、活性炭（５．００ｇ）を用いて精製し、濾過し、凍結乾燥すると、３．４７ｇの強い吸湿性の赤褐色の固体が得られた（そのピリジニウム塩の８５％に相当する）。この予備精製した物質は主に表題化合物を含有しており（ＨＰＬＣ／ＭＳによる）、それをその時点の純度でさらなる反応のために用いた。

実施例５：
アセチルｃＮＡＤの（酵素的）合成

３−アセチル−１−［（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−２，３−ビスヒドロキシ−４−（ホスホノオキシ）メチル−シクロ−ペンチル］−ピリジニウム ジイソプロピルエチルアンモニウム塩（３．５５ｇ，７．７１ｍｍｏｌ）、ＡＴＰ二ナトリウム塩（６．９９ｇ，１１．６ｍｍｏｌ）および塩化マグネシウム六水和物（５６８ｍｇ，２．７９ｍｍｏｌ）を１８０ｍｌの水中で溶解させた。ｐＨを１０Ｍ ＮａＯＨを用いて７．５に設定した後、Ａｘｘｏｒａ ＡＬＸ−２０１−２３８からのニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼＮＭＮＡＴ３（ヒト、組み換え）（ＥＣ ２．７．７．１）（３．００ｍｌ，１６２Ｕ／ｇ）の酵素懸濁液を添加した。その混合物を３７℃で撹拌した。１６時間後、再度１．００ｍｌの酵素懸濁液を添加した。さらに８時間後にこの手順を繰り返した。３７℃でさらに１６時間撹拌した後、リン酸化アミノ糖のほとんどが反応して表題化合物になっていた（ＨＰＬＣ／ＭＳによる）。

実施例６：
アセチルｃＮＡＤ、ｃＮＡＤ、ｃＮＡＤＰの酵素還元
アセチルｃＮＡＤＨおよび比較のためにｃＮＡＤ、ｃＮＡＤＰを、ＧｌｕｃＤＨ ｍｕｔ ２（ＷＯ２０１０／０９４６３２）を用いることにより、以下の条件を用いて還元した：
化学物質：
ＮａＣｌ（Ｍｅｒｃｋ．１．０２４０６．００８０）
トリス（７０８ ９７６、Ｒｏｃｈｅから）
Ｄ（＋）−グルコース一水和物 ｐ．ａ．（Ｍｅｒｃｋ ８３４２）
アセチル−ｃＮＡＤ（遊離酸）
再蒸留水（Ｂｉｄｅｓｔ． ｗａｔｅｒ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
ＨＣｌ １Ｎ（Ｍｅｒｃｋ １．０９９７３．０００１）
希釈緩衝液（ＮａＣｌ ０．２ｍｏｌ／ｌ；トリス０．１ｍｏｌ／ｌ；ｐＨ８．５）を以下のように調製した：
１１．７ｇのＮａＣｌおよび１２．１ｇのトリス（＝トリス（ヒドロキシエチル）アミン）を９００ｍｌの再蒸留水中で溶解させ、そのｐＨをＨＣＬ（１Ｎ）の添加によりｐＨ８．５に調節し、再蒸留水を加えて１．００ ｌにした。

グルコース溶液：
２．００ｇのＤ（＋）−グルコース一水和物を１０．０ｍｌの再蒸留水中で溶解させた。その溶液は室温で２時間後に使用の用意ができている。

ＧｌｕｃＤＨ２ストック溶液：
１０．０ｍｇのその酵素（Ｌｙｏ）を１．００ｍｌのトリス緩衝液中で溶解させた。
アセチルｃＮＡＤ溶液（１５ｍｍｏｌ／ｌ）の還元：
９．９０ｍｇのアセチルｃＮＡＤ（分子量＝６５９．４７ｇ／ｍｏｌ）を１．００ｍｌの再蒸留水中で溶解させた。

１００μｌのＧｌｕｃＤＨ２ストック溶液を０．９０ｍｌの希釈緩衝液中で溶解させた（希釈因子＝１０）。
ｃＮＡＤＰ（１５ｍｍｏｌ／ｌ）の還元：
１０μｌのＧｌｕｃＤＨ２ストック溶液を０．９９ｍｌの希釈緩衝液中で溶解させた。１００μｌのこの溶液を０．４０ｍｌの希釈緩衝液中で溶解させた（希釈因子＝５００）。

ｃＮＡＤ（１５ｍｍｏｌ／ｌ）の還元：
１０μｌのＧｌｕｃＤＨ２ストック溶液を０．９９ｍｌの希釈緩衝液中で溶解させた。１００μｌのこの溶液を０．３０ｍｌの希釈緩衝液中で溶解させた（希釈因子＝４００）。

調節した（２５℃）試薬溶液をピペットで１ｃｍプラスチックキュベット中に以下のように入れた：

混合して２５℃に調節した後、０．０５ｍｌの上記で言及した対応するＧｌｕｃＤＨ２溶液の添加により反応を開始した。紫外／可視スペクトルを３０分後に記録した。
この実験から、アセチルｃＮＡＤはデヒドロゲナーゼのための補酵素の役目も果たすことは明らかである。

その吸収波長がアセチル化されていないＮＡＤおよび／またはｃＮＡＤ形態と比較した場合により長い波長（４００ｎｍに近い最大値）にシフトしていることも分かっている。対応する吸収スペクトルを図１において示す。これは、それが（生物学的）試料中に含まれる自己蛍光化合物からの干渉を低減または回避することを可能にするため、酸化還元に基づくアッセイに関する重要な利点である。

Claims (10)

1. 以下の工程：
   ａ）式Ｉに示すペンタメチニウム塩を提供する工程、
   

   

   式中、
   Ｘ⁻は対イオンであり、
   Ｒ１はＣ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ６〜Ｃ３０アリールおよび６〜３０原子を有するヘテロアリールからなる群から選択され、そして
   Ｒ２〜Ｒ５は独立してメチルまたはエチルであり、
   ｂ）工程（ａ）のペンタメチニウム塩を式ＩＩの第１級アミンと反応させる工程、
   

   

   式中、Ｒ６は線状、分枝状、または環状の、場合により置換されたアルキルであり、
   ｃ）それにより式ＩＩＩのＮ−置換ピリジニウム化合物を得る工程、
   

   

   式中、Ｘ⁻、Ｒ１、およびＲ６は上記で定義された通りである；
   を含む、Ｎ−置換３−アルキルカルボニル、３−アリールカルボニルまたは３−ヘテロアリールカルボニルピリジニウム化合物の合成方法。
2. Ｒ１がメチル、エチル、プロピル、ブチルまたはイソプロピルである、請求項１に記載の方法。
3. Ｒ２〜Ｒ５がメチルである、請求項１または２に記載の方法。
4. 式ＩＩに示す第１級アミンが３−アミノ−５−［（ホスホノオキシ）メチル］−１，２−シクロ−ペンタンジオールである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 式ＩＩに示す第１級アミンが（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−３−アミノ−５−［（ホスホノ−オキシ）メチル］−１，２−シクロ−ペンタンジオールである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 式ＩＩに示す第１級アミンが（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−１−アミノシクロペンタンである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. 式Ｉの化合物であって、
   

   

   式中、
   Ｘ⁻は対イオンであり、
   Ｒ１はＣ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ６〜Ｃ３０アリールおよび６〜３０原子を有するヘテロアリールからなる群から選択され、そして
   Ｒ２〜Ｒ５は独立してメチルまたはエチルである、前記化合物。
8. Ｒ１がＣ１〜Ｃ１０アルキルである、請求項７に記載の化合物。
9. Ｒ１がメチル、エチル、プロピル、ブチルおよびイソプロピルからなる群から選択される、請求項７または８に記載の化合物。
10. Ｒ１がメチルである、請求項９に記載の化合物。

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