JP5775068B2 - 細胞観察装置および細胞観察方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞観察装置および細胞観察方法に関するものである。

従来、細胞に例えば蛍光ラベルを付するなど、細胞の状態を侵襲的な方法により判別・評価することが行われていた。しかし、このような方法では、細胞に毒性のある色素を用いたり、細胞を固定液を用いて固定して処理したりするために、処理後に細胞を再利用することはできず、細胞を自然な状態で評価したり、評価後に培養を継続したり、移植に用いたりすることは難しい。したがって、非侵襲的な方法で細胞の状態を判別・評価することが好ましいといえる。特許文献１、および非特許文献１〜３は、非侵襲的な方法で細胞を判別・評価することについて開示している。

国際公開ＷＯ２００５／０２９４１３パンフレット

Y.Usson,A.Guignandon,N. Laroche,M-H. Lafage-Proust,L.Vico, "Quantitation of Cell-Matrix Adhesion Using Confocal ImageAnalysis of Focal Contact Associated Proteins and Interference Reflectioｎｍicroscopy.",Cytometry, 28, 298-304, (1997) C.K.Choi, C.H.Margraves,A.E.English, K.D.Kihm, "Multicontrast microscopy technique to dynamicallyfingerprint live-cell focal contacts during exposure and replacement ofcytotxic medium.", J. Biomedical Optics, 13(5), (2008) I.Weber, R.Albrecht, "Imageprocessing for combined bright-field and reflection interference contrast videomicroscopy.", Computer Methods and Programs in Biomedicine, 53, 113-118, (1997)

特許文献１は、非侵襲的な方法で細胞の状態を判別・評価する方法の一つとして、定量位相顕微鏡を用いる方法について開示している。この方法では、細胞の存否による光路長の差を用いて、細胞の状態を非侵襲的に判別・評価できる。しかし、この方法によって得られる情報は、細胞の光学的厚さ、面積、体積、および細胞内の屈折率の変化に基づく情報のみに限られており、細胞の状態を適切に判別・評価する上で必要な情報量として決して十分とはいえない。

非特許文献１〜３は、非侵襲的な方法の他の一例として、反射干渉顕微鏡を用いる方法について開示している。この方法では、個々の細胞の基板への接着状態に基づき、基板と培養液との間の界面からの反射光と、培養液と細胞膜との間の界面からの反射光との干渉により明暗のコントラストが現れる現象を利用して、細胞の状態を非侵襲的に判別・評価できる。しかし、この方法によって得られる情報は、細胞の基板への接着状態に基づく情報のみに限られており、細胞の状態を適切に判別・評価する上で必要な情報量として決して十分とはいえない。

このように、定量位相顕微鏡、反射干渉顕微鏡の何れか一方を単独で用いる方法では、細胞の光学的厚さ、面積、体積、および細胞内の屈折率の変化に基づく情報だけ、または細胞の基板への接着状態に基づく情報だけが得られる。それら単独の情報だけでは、細胞の状態を適切に判別・評価する上で必要な情報量として決して十分とはいえない。また、定量位相顕微鏡および反射干渉顕微鏡を一緒に用いることを開示または示唆するような文献は発見されておらず、両顕微鏡は機能が異なる別個の顕微鏡であることから、両顕微鏡を一緒に用いるには何らかの工夫が必要となる。

そこで、本発明は上記に鑑みてなされたもので、細胞の状態を適切に判別・評価するためのより多くの情報を得ることを可能とする細胞観察装置および細胞観察方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明の細胞観察装置は、反射干渉計測用光源と、前記反射干渉計測用光源から放射される光の光量を調整する反射干渉光量調整手段と、定量位相計測用光源と、前記定量位相計測用光源から放射される光の光量を調整する定量位相光量調整手段と、前記反射干渉計測用光源から放射され、細胞から反射される反射光を撮像することにより、反射干渉画像を生成するとともに、前記定量位相計測用光源から放射され、前記細胞を透過する透過光を撮像することにより、定量位相画像を生成する撮像手段と、前記撮像手段が生成した前記反射干渉画像より第１パラメータを抽出する第１抽出手段と、前記撮像手段が生成した前記定量位相画像より第２パラメータを抽出する第２抽出手段と、を備え、前記反射干渉画像を生成する際に、前記定量位相光量調整手段が前記定量位相計測用光源からの光を遮光し、前記撮像手段が前記反射光を撮像し、前記定量位相画像を生成する際に、前記反射干渉光量調整手段が前記反射干渉計測用光源からの光を遮光し、前記撮像手段が前記透過光を撮像する、ことを特徴とする。

また、本発明の細胞観察方法は、撮像手段が、反射干渉計測用光源から放射され、細胞から反射される反射光を撮像することにより、反射干渉画像を生成するとともに、定量位相計測用光源から放射され、前記細胞を透過する透過光を撮像することにより、定量位相画像を生成する撮像ステップと、第１抽出手段が、前記撮像手段が生成した前記反射干渉画像より第１パラメータを抽出する第１抽出ステップと、第２抽出手段が、前記撮像手段が生成した前記定量位相画像より第２パラメータを抽出する第２抽出ステップと、を備え、前記撮像ステップでは、前記反射干渉画像を生成する際に、定量位相光量調整手段が前記定量位相計測用光源からの光を遮光し、前記撮像手段が前記反射光を撮像し、前記撮像ステップでは、前記定量位相画像を生成する際に、反射干渉光量調整手段が前記反射干渉計測用光源からの光を遮光し、前記撮像手段が前記透過光を撮像する、ことを特徴とする。

このような本発明の細胞観察装置および細胞観察方法によれば、反射干渉計測用光源、定量位相光量調整手段、撮像手段、第１抽出手段（以下、「反射干渉計測ユニット」という。）を備えることにより、細胞からの反射光をもとに、第１パラメータを得る。また、定量位相計測用光源、反射干渉光量調整手段、撮像手段、第２抽出手段（以下、「定量位相計測ユニット」という。）を備えることにより、細胞からの透過光をもとに、第２パラメータを得る。このように、本発明の細胞観察装置および細胞観察方法では、反射干渉計測ユニットおよび定量位相計測ユニットの両方を備えることにより、第１パラメータおよび第２パラメータの両方を得ることができ、これにより使用者は細胞の状態を適切に判別・評価するためのより多くの情報を得ることとなる。

また、本発明の細胞観察装置および細胞観察方法では、反射干渉計測および定量位相計測の両計測に対して、共通の一つの撮像手段によって撮像を行っている。撮像手段を一つ備えるだけで済むことから、コストの面で有効である。また、撮像手段が共通であることから、両計測の結果として得られる画像（反射干渉画像および定量位相画像）間の空間的な位置ずれが起きない。したがって、両画像間の空間座標の位置合わせ処理をしなくて済むこととなり、処理負荷の面で有効である。

また、反射干渉画像を生成する際には定量位相光量調整手段が定量位相計測用光源からの光を遮光し、定量位相画像を生成する際には反射干渉光量調整手段が反射干渉計測用光源からの光を遮光することにより、時間的に互いに排他的に計測を行うこととなる。このような計測方法により、時間的に完全に同時の画像を取得する必要のない場合に、本発明は有用である。例えば、定量位相計測と反射干渉計測のそれぞれの画像取得に生じる時間差に対して、細胞が十分ゆっくり変化しているような場合に、特に有用である。また、反射干渉計測および定量位相計測を同時に行わないことから、光源を用いる際に計測方式別に波長を分けて用いる必要がなく、各々の計測に最も有効な波長を利用することができる。反射干渉計測用光源および定量位相計測用光源間で、波長範囲にオーバーラップがあっても良く、同一でも構わない。

また、本発明においては、前記反射干渉光量調整手段は、前記反射干渉計測用光源から放射される光の光量を調整するシャッタであり、前記定量位相光量調整手段は、前記定量位相計測用光源から放射される光の光量を調整するシャッタであっても良い。

この発明によれば、光の光量を調整するための具体的な手段が提供される。

また、本発明においては、前記反射干渉光量調整手段は、前記反射干渉計測用光源のＯＮ/ＯＦＦによる切り替えにより、前記反射干渉計測用光源から放射される光の光量を調整し、前記定量位相光量調整手段は、前記定量位相計測用光源のＯＮ/ＯＦＦによる切り替えにより、前記定量位相計測用光源から放射される光の光量を調整しても良い。

この発明によれば、光の光量を調整するための具体的な方法が提供される。この方法は、光源がＬＥＤやＬＤ、ＳＬＤなどの半導体型光源である場合に特に有用である。

また、本発明においては、前記定量位相画像に基づき、前記細胞の輪郭を抽出する輪郭抽出手段と、前記輪郭抽出手段が抽出した前記輪郭を前記反射干渉画像に適用することにより、輪郭適用後の反射干渉画像を生成する輪郭適用手段と、前記輪郭適用後の反射干渉画像より、第３パラメータを抽出する第３抽出手段と、を更に備えても良い。

また、本発明においては、輪郭抽出手段が、前記定量位相画像に基づき、前記細胞の輪郭を抽出する輪郭抽出ステップと、輪郭適用手段が、前記輪郭抽出手段が抽出した前記輪郭を前記反射干渉画像に適用することにより、輪郭適用後の反射干渉画像を生成する輪郭適用ステップと、第３抽出手段が、前記輪郭適用後の反射干渉画像より、第３パラメータを抽出する第３抽出ステップと、を更に備えても良い。

この発明によれば、第１パラメータおよび第２パラメータに加え、第３パラメータが更に得られる。この第３パラメータは、定量位相画像と反射干渉画像との間で細胞の輪郭を合わせた上で得られるパラメータであるため、第１パラメータおよび第２パラメータとは異なる性質のパラメータであり、使用者はこの第３パラメータを更に得ることにより、細胞の状態を適切に判別・評価するためのより多くの情報を得ることとなる。

また、定量位相画像から細胞の輪郭を抽出し、当該輪郭を反射干渉画像に適用することにより、輪郭適用後の反射干渉画像を生成する処理の中で使用者の介入はない。一方、従来の反射干渉顕微鏡を用いる方法（以下、「反射干渉法」という。）では、個々の細胞の輪郭を予め認識しておく必要があるため、反射干渉法は輪郭認識のための他の方法との組み合わせで用いられることが多い。上記の非特許文献１は、蛍光法と反射干渉法の組み合わせについて開示しているが、細胞の輪郭を自動的に抽出することが困難であったため、操作者が手描きにより細胞の輪郭を定めている。また、非特許文献２は、透過照明法と反射干渉法の組み合わせについて開示しているが、細胞の輪郭を人の手に寄らず自動的に定めることについての言及はない。更に、非特許文献３は、明視野法と反射干渉法の組み合わせについて開示しており、細胞輪郭抽出の自動化について一応の言及はしているものの、例えば、使用者が明視野画像を見ながら輪郭抽出のための最適な閾値を手動で設定する必要があることが記載されているなど、使用者のある程度の介入の必要性を認め、細胞の輪郭を人の手に寄らず自動的に定めるには至っていない。これに対して、本発明では、定量位相画像からの細胞輪郭抽出、当該輪郭の反射干渉画像への適用、輪郭適用後の反射干渉画像の生成までの処理が、輪郭抽出手段および輪郭適用手段により人の手に寄らず行われる。これらの処理が人の手に寄らず行われることにより作業効率は著しく向上し、それに伴う作業時間の顕著な短縮が達成される。

また、本発明においては、前記定量位相画像を生成するために、前記透過光を物体光および参照光に分離して干渉させる干渉光学系と、前記反射干渉画像を生成する際に、前記参照光を遮光する参照光遮光手段と、を更に備えても良い。

この発明によれば、干渉光学系を備えることにより定量位相画像を生成するために必要な参照光が得られ、参照光遮光手段を備えることにより反射干渉画像生成には不要な参照光を遮光することができる。

また、本発明においては、前記反射干渉計測用光源と前記撮像手段との間および前記定量位相計測用光源と前記撮像手段との間に位置し、波長により反射対透過の比率を異ならせることが可能なミラーを更に備えても良い。

この発明によれば、波長により反射対透過の比率を異ならせることが可能なミラーを備えることにより、例えば定量位相計測用光源の波長と反射干渉計測用光源の波長とが異なる場合に、反射干渉計測用光源の波長に対してはハーフミラーとして機能するような反射対透過の比率と設定し、定量位相計測用光源の波長に合わせては透過率を高めるような構成をとることができる。このような構成により、反射干渉計測においてはハーフミラーとして機能しながらも、定量位相計測においては観察光のロスを低減させることができる。

また、本発明においては、前記第１パラメータは、前記細胞が置かれている基板と、前記細胞との間の接着状態に基づく情報であっても良い。

この発明によれば、細胞の基板への接着状態に基づく情報として、細胞の基板への接着面積、撮像範囲全体に対した接着面積の割合、細胞の基板への接着模様（パターン・２次元分布）等の情報が得られ、使用者はこれらの情報を用いて細胞の状態を適切に判別・評価することができる。

また、本発明においては、前記第２パラメータは、前記細胞の光学的厚さ、面積、体積、または前記細胞内での屈折率の変化に基づく情報であっても良い。

この発明によれば、細胞の光学的厚さ、面積、体積、または細胞内での屈折率の変化に基づく情報が得られ、使用者はこれらの情報を用いて細胞の状態を適切に判別・評価することができる。

また、本発明においては、前記第３パラメータは、前記細胞の前記輪郭の中での、前記基板への前記接着状態に基づく情報であっても良い。

この発明によれば、細胞の輪郭の中での、つまり細胞が占める空間の範囲内での基板への接着状態に基づく情報として、細胞の全体面積に対した接着面積の割合等の情報が得られ、使用者はこのような情報を用いて細胞の状態を適切に判別・評価することができる。

また、本発明においては、予め既知の種類または状態の前記細胞に対して抽出したパラメータをリファレンスデータとして記憶するリファレンス記憶手段と、前記リファレンスデータに基づき、未知の細胞の種類または状態を判別する解析手段と、を更に備えても良い。

この発明によれば、リファレンスデータに基づき、未知の被検体の細胞の種類または状態を判別することができる。

また、本発明において、未知の細胞に対して抽出したパラメータの中から所定のパラメータを選択し、当該選択された所定のパラメータを用いて、前記未知の細胞の種類または状態を判別する解析手段を更に備えても良い。

この発明によれば、解析手段は、リファレンスデータによらずに、処理を行うことができる。この場合には、リファレンス記憶手段を設けなくて済むので、装置構成が簡潔になる。なお、解析手段は、特異な値を示すパラメータを所定のパラメータとして自動的に選択するように構成されていても良く、ユーザからの入力に基づき所定のパラメータを選択するように構成されていても良い。

また、本発明において、前記第１抽出手段または前記第２抽出手段が３つ以上のパラメータを抽出した場合に、前記３つ以上のパラメータに対して主成分分析を行うことにより、未知の細胞の種類または状態を判別する解析手段を更に備えても良い。

この発明によれば、抽出した多数のパラメータに対して主成分分析を行うことにより、当該多数のパラメータが細胞判別に適切に影響を及ぼうようにすることができる。主成分分析によれば、抽出した多数のパラメータのうち２つを選択する代わりに、当該多数のパラメータの全部または３つ以上の一部が適切に反映された２つの主成分により細胞判別を行うからである。

また、本発明においては、前記定量位相計測用光源として、低コヒーレント光を使用しても良い。

この発明によれば、定量位相計測において、波長幅が広く干渉性の低い低コヒーレント光を使用する。これにより、光学系に由来する干渉ノイズを低減でき、より安定した計測をすることができる。

また、本発明においては、前記反射干渉計測用光源として、低コヒーレント光を使用しても良い。

この発明によれば、反射干渉計測において、波長幅の広く干渉性の低い低コヒーレント光を使用している。広い波長幅の照明光を用いることにより、干渉が起きる距離を狭くすることができ、細胞の基板への接着面に限定した反射干渉画像を取り出すことが可能となる。

また、本発明においては、前記反射干渉計測用光源から放射され前記細胞から反射される光が集光される対物レンズと、前記対物レンズの前記反射干渉計測用光源側の開口絞りと共役な位置に、リング状のスリットと、を更に備えても良い。

この発明によれば、リング状に開口したスリットを反射干渉計測用光源からの照明光が通り、照明光は対物レンズの中心は通らず周辺を通って照明され、角度のついた高いＮＡの光のみを使って細胞が照明されるため、細胞上部の溶液からの反射光の影響を低減することができる。また、リング状のスリットを用いることにより、対物レンズ内部の反射による背景光を低減することもできる。

また、本発明においては、前記細胞を収容する容器を更に備え、前記容器の前記細胞の接着面の反対側に反射防止コートが施されていても良い。

この発明によれば、ドライ系の対物レンズを用いる場合であっても、高いコントラストで細胞接着面の反射干渉画像を得ることができる。

また、本発明においては、前記容器の上部に、前記細胞を浸す培養液に接触するような高さに観察窓を備えても良い。

この発明によれば、観察窓を用いて培養液の高さを一定に保つことにより、定量位相計測を安定な条件下で行うことができる。

また、本発明においては、前記観察窓において、前記培養液に接触する面の反対側に反射防止コートが施されていても良い。

この発明によれば、容器上面からの反射光の影響を抑えて、高いコントラストで細胞接着面の反射干渉画像を得ることができる。

本発明によれば、細胞の状態を適切に判別・評価するためのより多くの情報を得ることを可能な細胞観察装置および細胞観察方法を提供することができる。

細胞観察装置１の全体構成を示す概要図である。 処理部２０のハードウェア構成図である。 参照光カット装置１０８として機能する参照光シャッタ１０８Ａを示す図である。 定量位相撮像および反射干渉撮像にかかるタイミングチャートに示す図である。 処理部２０の機能および動作を示すフローチャートである。 輪郭抽出処理および輪郭適用処理の一例を示す図である。 細胞から得られたパラメータの一例を示す図である。 抽出したパラメータを用いて作成した２成分散布図の一例である。 リファレンスデータを用いて細胞判別を行った一例を示す図である。 第２実施例における画像取得部１０Ａを示す図である。 第３実施例における画像取得部１０Ｂを示す。 第３実施例による効果を示すための図である。 第６実施例にかかる細胞観察装置１Ａの構成概要図である。 第６実施例による効果を示すための図である。 第７実施例における容器１０２Ａを示す図である。 第７実施例による効果を示すための図である。 第７実施例による効果を示すための図である。 第７実施例による効果を示すための図である。 第７実施例の変形例を示す図である。 第８実施例における画像取得部１０Ｃを示す図である。 第９実施例における画像取得部１０Ｄを示す図である。 第１０実施例においてユーザに表示される画面の一例を示す図である。 第１１実施例にかかる細胞観察装置１Ｅの構成概要図である。 第１２実施例において、リファレンスとして用いた各細胞の反射干渉画像および定量位相画像を示す図である。 第１２実施例において、抽出した７つのパラメータの実際の計測値を示す図である。 第１２実施例において、パラメータの情報量として母集団に対した偏差平方和を求めた結果を示す図である。 第１２実施例において、各パラメータに対して標準化を行った結果を示す図である。 第１２実施例において、第１主成分ｆの係数を求めた結果を示す図である。 第１２実施例において、第２主成分ｇの係数を求めた結果を示す図である。 第１２実施例において、各細胞について第１主成分ｆおよび第２主成分ｇを求めた結果を示す図である。 第１２実施例において、第１主成分ｆおよび第２主成分ｇの値を用いて、２成分散布図に各細胞をプロットした結果を示す図である。

以下、添付図面を参照して本発明にかかる細胞観察装置および細胞観察方法の好適な実施形態を詳細に説明する。まず、細胞観察装置および細胞観察方法の概要について全体的に説明し、続いて、第１実施例〜第１２実施例の欄を用いてより詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。

［細胞観察装置１の全体構成］
まず、本発明の実施形態に係る細胞観察装置１の全体構成について、図１を参照しながら説明する。図１は、細胞観察装置１の全体構成を示す概要図である。図１に示すように、細胞観察装置１は、画像取得部１０および処理部２０から構成されている。

画像取得部１０は、試料となる細胞１０１を収容する容器１０２、細胞１０１の培養環境が維持された培養空間１０３、対物レンズ１０４、定量位相計測用光源１０５、照明光絞り部１０５Ｂ、反射干渉計測用光源１０６、反射干渉照明用光学系としてのハーフミラー１０７、全反射ミラー１０９、回折型干渉光学系１１１（特許請求の範囲の「干渉光学系」に相当）、カメラ１１０（特許請求の範囲の「撮像手段」に相当）、反射干渉シャッタ１０６Ａ（特許請求の範囲の「反射干渉光量調整手段」に相当）、定量位相シャッタ１０５Ａ（特許請求の範囲の「定量位相光量調整手段」に相当）、および参照光カット装置１０８（特許請求の範囲の「参照光遮光手段」に相当）を備える。

反射干渉シャッタ１０６Ａは、ハロゲンランプやキセノンランプなどの反射干渉計測用光源１０６から放射される光の光量を調整するものである。定量位相シャッタ１０５Ａは、ハロゲンランプやキセノンランプなどの定量位相計測用光源１０５から放射される光の光量を調整するものである。なお、ハロゲンランプやキセノンランプなどの広い波長範囲にわたって放射感度を有する光源であれば、７００ｎｍ〜２５００ｎｍの近赤外領域の光を照明光として用いることが可能であり、細胞１０１に対する毒性を低減できる。また、ハロゲンランプやキセノンランプなどの電球型光源を、光源として用いた場合、光量や波長などの安定性を考慮すると、測定中は光源自体をＯＮ/ＯＦＦせずに光源をＯＮにしておいたほうがよい。そのため、反射干渉計測と定量位相計測を切り替えるためには、反射干渉シャッタ１０６Ａや定量位相シャッタ１２１Ａが必要となる。カメラ１１０は、反射干渉計測用光源１０６から放射され、細胞１０１から反射される反射光を撮像することにより、反射干渉画像を生成するとともに、定量位相計測用光源１０５から放射された照射光が、ピンホールやアパーチャーなどの照明光絞り部１０５Ｂを通過することで点光源に近い照射光となり、細胞１０１を透過する透過光を撮像することにより、定量位相画像を生成するものである（特許請求の範囲の「撮像ステップ」に相当）。後述するように、反射干渉画像を生成する際には、定量位相シャッタ１０５Ａが定量位相計測用光源１０５からの光を遮光した上で、カメラ１１０が反射光を撮像する。また、定量位相画像を生成する際には、反射干渉シャッタ１０６Ａが反射干渉計測用光源１０６からの光を遮光した上で、カメラ１１０が透過光を撮像する。以上により、カメラ１１０は、反射干渉計測および定量位相計測に共通の一つのカメラとして、時間的に互いに排他的に両計測を行うこととなる。

回折型干渉光学系１１１は、定量位相画像を生成するために、細胞１０１からの透過光を物体光および参照光に分離して干渉させるものである。参照光カット装置１０８は、回折型干渉光学系１１１において参照光が通る光路上に設置され、反射干渉画像を生成する際に、参照光を遮光するものである。

処理部２０は、画像受信部２０１、第１抽出部２０４（特許請求の範囲の「第１抽出手段」に相当）、第２抽出部２０５（特許請求の範囲の「第２抽出手段」に相当）からなる第１処理部、輪郭抽出部２０２（特許請求の範囲の「輪郭抽出手段」に相当）、輪郭適用部２０３（特許請求の範囲の「輪郭適用手段」に相当）、第３抽出部２０６（特許請求の範囲の「第３抽出手段」に相当）からなる第２処理部、解析部２０７（特許請求の範囲の「解析手段」に相当）、およびリファレンス記憶部２０８（特許請求の範囲の「リファレンス記憶手段」に相当）からなる第３処理部を備える。なお、第１処理部および第２処理部、第３処理部は、それぞれ別の演算装置であってもよいし、同一の演算装置であってもよい。

画像受信部２０１は、カメラ１１０の撮像により生成された反射干渉画像および定量位相画像を受信するものである。輪郭抽出部２０２は、定量位相画像に基づき、細胞１０１の範囲である輪郭を抽出するものである（特許請求の範囲の「輪郭抽出ステップ」に相当）。輪郭適用部２０３は、輪郭抽出手段が抽出した輪郭を反射干渉画像に適用することにより、輪郭適用後の反射干渉画像を生成するものである（特許請求の範囲の「輪郭適用ステップ」に相当）。

第１抽出部２０４は、画像受信部２０１が受信した反射干渉画像より、第１パラメータを抽出するものである（特許請求の範囲の「第１抽出ステップ」に相当）。第１パラメータは、細胞１０１が置かれている基板と、細胞１０１との間の接着状態に基づく情報である。細胞１０１の基板への接着状態に基づく情報としては、例えば、細胞１０１の基板への接着面積、撮像範囲全体に対した接着面積の割合、細胞の基板への接着模様（パターン・２次元分布）等の情報が挙げられる。

第２抽出部２０５は、画像受信部２０１が受信した定量位相画像より、第２パラメータを抽出するものである（特許請求の範囲の「第２抽出ステップ」に相当）。第２パラメータは、細胞１０１の光学的厚さ、面積、体積、または細胞１０１内での屈折率の変化に基づく（または表す）情報である。

第３抽出部２０６は、輪郭適用後の反射干渉画像より、第３パラメータを抽出するものである（特許請求の範囲の「第３抽出ステップ」に相当）。第３パラメータは、細胞１０１の輪郭の中での、基板への接着状態に基づく情報である。細胞１０１が占める空間の範囲内での基板への接着状態に基づく情報としては、例えば、細胞１０１の全体面積に対した接着面積の割合等の情報が挙げられる。

リファレンス記憶部２０８は、予め既知の種類または状態の細胞に対して抽出したパラメータ（上記の第１、第２、第３パラメータ）をリファレンスデータとして記憶するものである。解析部２０７は、第１抽出部２０４、第２抽出部２０５、第３抽出部２０６で抽出された第１、第２、第３パラメータを基にして、未知の被検体の細胞の種類または状態を判別するものである。具体的には、第１、第２、第３パラメータのうち、所定のパラメータを選択し、選択された所定のパラメータを用いて、未知の被検体の細胞の種類または状態を判別する。所定のパラメータは、解析部２０７により（または図示しない別途の処理手段により）自動的に選択された特異な値を示すパラメータであってもよいし、ユーザーが選択したパラメータであってもよい。解析部２０７は、このように選択された所定のパラメータを用いて、未知の被検体の細胞の種類または状態を判別する。また、解析部２０７が、リファレンス記憶部２０８に記憶されたリファレンスデータに基づき、所定のパラメータを選択し、未知の被検体の細胞の種類または状態を判別しても良い。更に、第１抽出部２０４、第２抽出部２０５、および第３抽出部２０６のそれぞれ、または組み合わせにより、３つ以上のパラメータが抽出された場合には、解析部２０７が当該３つ以上のパラメータに対して主成分分析を行うことにより、未知の細胞の種類または状態を判別しても良い。なお、以下の記載においては、解析部２０７がリファレンスデータに基づき所定のパラメータを選択し、未知の被検体の細胞の種類または状態を判別する態様を［第１実施例］の欄で記載する。一方で、解析部２０７が、リファレンスデータに基づかないで、特異な値またはユーザ指示により所定のパラメータを選択し、未知の被検体の細胞の種類または状態を判別する態様を［第１０実施例］の欄で記載する。更に、解析部２０７が主成分分析により未知の細胞の種類または状態を判別する態様を［第１２実施例］の欄で記載する。

図２は、以上のような機能的構成要素を備える処理部２０のハードウェア構成図である。図２に示すように、処理部２０は、物理的には、ＣＰＵ２１、ＲＯＭ２２及びＲＡＭ２３等の主記憶装置、キーボード及びマウス等の入力デバイス２４、ディスプレイ等の出力デバイス２５、画像取得部１０との間でデータの送受信を行うためのネットワークカード等の通信モジュール２６、ハードディスク等の補助記憶装置２７などを含む通常のコンピュータシステムとして構成される。処理部２０の各機能は、ＣＰＵ２１、ＲＯＭ２２、ＲＡＭ２３等のハードウェア上に所定のコンピュータソフトウェアを読み込ませることにより、ＣＰＵ２１の制御の元で入力デバイス２４、出力デバイス２５、通信モジュール２６を動作させると共に、主記憶装置２２，２３や補助記憶装置２７におけるデータの読み出し及び書き込みを行うことで実現される。

［第１実施例］
引き続き、本発明の第１実施例について図１を再び参照しながら詳細に説明する。図１は、第１実施例にかかる細胞観察装置１の構成概要図である。

（画像取得部１０の説明）
図１に示されるように、測定対象となる細胞１０１の入った容器１０２を細胞１０１の培養環境が維持された培養空間１０３に静置する。培養環境は、細胞１０１の生育、状態維持に適した温度、湿度、炭酸ガス濃度などが整った環境である。

定量位相計測について述べる。細胞１０１の入った容器１０２の上部に設置した定量位相計測用光源１０５から放射された照明光は、細胞１０１の入った容器１０２を透過し、対物レンズ１０４にて集光される。そして、ハーフミラー１０７を介し、更に全反射ミラー１０９を介して、位相計測のための回折型干渉光学系１１１にて物体光と参照光の干渉像を形成し、カメラ１１０にて干渉縞画像が撮像される。

反射干渉計測について述べる。反射干渉計測用光源１０６から放射された照明光は、ハーフミラー１０７にて反射して、対物レンズ１０４を通って、測定対象となる細胞１０１を入れた容器１０２の底面側から入射する。反射干渉照明用光学系としては、ハーフミラーに限らず、照明光強度が十分ある場合には５：９５（反射：透過）や２０：８０（反射：透過）にするなど、反射比率を低減させたビームスプリッタを用いてもよい。また、波長によって反射率・透過率が異なるダイクロイックミラーを用いてもよい。容器１０２の底面の細胞１０１の接着面から得られる反射光は細胞１０１の接着距離に応じて干渉を生じ、得られた反射干渉光は再び対物レンズ１０４にて集光され、ハーフミラー１０７を介し、更に全反射ミラー１０９を介して、カメラ１１０にて撮像される。容器１０２の底面の細胞１０１の接着面から反射した光は、細胞１０１の接着距離に応じて干渉した光の振幅が異なり、明暗のコントラストとして撮影される。なお、定量位相像および反射干渉像は、共通の対物レンズ１０４を介して取得されるので、細胞１０１の撮像範囲は、定量位相計測および反射干渉計測においてほぼ同一範囲となる。

第１実施例は、定量位相画像および反射干渉画像を一つのカメラ１１０を用いて、交互に時間差を置いて取得することを特徴の一つとする。このためには、定量位相計測用光源１０５および反射干渉計測用光源１０６がそれぞれの照明光を照射するタイミングにおいて互いに排他的に照明を行う必要がある。そこで、定量位相計測用光源１０５および反射干渉計測用光源１０６のそれぞれの照射口に光の照射・遮断を行うための機械シャッタ１０５Ａ，１０６Ａを備える。あわせて定量位相画像を作成するための回折型干渉光学系１１１の内部に、参照光カット装置１０８を備える。

回折型干渉光学系１１１は定量位相画像を作成するための光学系であり、定量位相計測用光源１０５にて照明された透過照明像から回折素子１１１Ａを通して物体光と参照光を分離してそれぞれ取り出し、干渉させる役目を果たす。また、定量位相像と反射干渉像はいずれも同じ回折型干渉光学系１１１を通るため、反射干渉像を取り出すためには、回折素子１１１Ａを通ることにより分離された参照光をカットするための装置が必要となり、本実施例では参照光カット装置１０８を備えている。

参照光カット装置１０８は、例えば参照光側の光路１１１Ｂ上に設けた機械シャッタとして構成することができる。図３は、参照光カット装置１０８として機能する参照光シャッタ１０８Ａを示す図である。図３（Ａ）は、定量位相画像撮像時の参照光シャッタ１０８Ａの動きを示す。定量位相画像撮像時には、回折素子１１１Ａにより分離された後に、ピンホール１０８Ｂを通る物体光およびピンホール１０８Ｃを通る参照光の両方が必要であるため、参照光シャッタ１０８Ａはピンホール１０８Ｃを遮ることなく、物体光および参照光はピンホール１０８Ｂおよび１０８Ｃを通ってカメラ１１０に到達する。一方、図３（Ｂ）は、反射干渉画像撮像時の参照光シャッタ１０８Ａの動きを示す。反射干渉画像撮像時には、回折素子１１１Ａにより分離された後にピンホール１０８Ｂを通る物体光は必要であるが、ピンホール１０８Ｃを通る参照光は不要である。このため、参照光シャッタ１０８Ａはピンホール１０８Ｃを遮ることにより参照光を遮光し、物体光のみがピンホール１０８Ｂを通ってカメラ１１０に到達する。

図４は、定量位相シャッタ１０５Ａ、参照光カット装置１０８、カメラ１１０による定量位相撮像、反射干渉シャッタ１０６Ａ、およびカメラ１１０による反射干渉撮像のそれぞれの動作にかかるタイミングチャートに示す。定量位相画像と反射干渉画像は時系列にお互い排他的に照明と画像取得を行う。具体的には、定量位相画像を取得する時は、定量位相シャッタ１０５Ａが開口し、反射干渉シャッタ１０６Ａが閉じる。逆に反射干渉画像を取得する時には、反射干渉シャッタ１０６Ａが開口し、定量位相シャッタ１０５Ａが閉じるという具合である。同時に、定量位相画像を取得するタイミングにおいては、回折型干渉光学系１１１の回折素子１１１Ａによって得られる物体光と参照光のうち、参照光側に設けた参照光カット装置１０８が開口し、カメラ１１０にて物体光と参照光の干渉像が結像することによって定量位相画像を得る。一方、反射干渉画像を取得するタイミングにおいては、回折素子１１１Ａによって得られた参照光は不要であるので、参照光側に設けた参照光カット装置１０８が閉じて、物体光のみが反射干渉画像としてそのままカメラ１１０に結像する。このように定量位相画像と反射干渉画像とを時間的に交互に取得して２つの画像をペアとして同時刻の画像として扱う。

できるだけ多くの細胞１０１を見るために、観察する位置を移動させる機構を有しても良い。細胞１０１への影響を少なくするため、および定量位相計測において液面の揺れを抑えるために、細胞１０１を入れた容器は静止したままで、照明光学系と観察光学系を一体とした画像取得部１０の本体をＸＹ平面上で移動させることによって観察位置を変える方法が望ましい。これとあわせて、観察しているＸＹの空間平面座標を画像に記録することが望ましい。

（処理部２０の説明）
図５のフローチャートを更に参照しながら、処理部２０の機能および動作について説明する。

最初に、カメラ１１０にて参照光と細胞１０１を透過した物体光の干渉縞画像が得られる（ステップＳ１０１、特許請求の範囲の「撮像ステップ」に相当）。干渉縞画像から公知の演算方法を用いて定量的な位相画像を形成する。定量位相画像を得るためには、細胞１０１のない背景領域のオフセット補正および背景領域の視野におけるシェーディング補正を施し、背景部分は空間的に均一で、背景部の位相の値を０に補正し、細胞１０１の位相（光路長）の２次元マップを得る。

一方で、ステップＳ１０１とともに、カメラ１１０にて細胞１０１の接着面の反射干渉画像が得られる（ステップＳ１０２、特許請求の範囲の「撮像ステップ」に相当）。容器１０２の底面に接着している細胞１０１の容器１０２の底面からの距離に応じて干渉光の振幅が異なり、反射干渉画像は明暗のコントラストとして撮影される。反射干渉画像の視野内の反射光のシェーディングを補正する。あわせて細胞１０１のない背景の値が時間的に変動しないように、時間ごとに背景部のオフセット補正を行う。これらの画像演算補正によって、空間的、時間的に変動の少ない定量位相画像および反射干渉画像を得ることができる。

次に、ステップＳ１０１およびステップＳ１０２にて撮像および補正された両画像（定量位相画像および反射干渉画像）が処理部２０に入力される（ステップＳ１０３）。

次に、ステップＳ１０３にて入力された両画像に対して、細胞１０１の輪郭領域を抽出する処理（以下、「セグメンテーション」ともいう。）が行われる（ステップＳ１０４およびＳ１０５、特許請求の範囲の「輪郭抽出ステップ」および「輪郭適用手段」に相当）。

まず、図６に示すように、同一観察位置および同時刻に撮像された定量位相画像および反射干渉画像のうち、定量位相画像から個々の細胞１０１の輪郭となる領域を画像処理により検出する（ステップＳ１０４、図６の画像Ａ、特許請求の範囲の「輪郭抽出ステップ」に相当）。つまり、定量位相画像では、細胞１０１のない背景となる溶液を通る光に対して細胞１０１を通る光は、細胞１０１の屈折率が溶液の屈折率よりも大きいために、光路長が長くなる。そのため、細胞１０１の存在する領域の画素の位相の値は背景よりも大きな値となる。そこで、適正な閾値または空間フィルタ処理を用いることにより、人の手に寄らず自動的に、背景と細胞１０１を分離することができる。そして、一つ一つの細胞１０１に対応した輪郭を決定し、それぞれの細胞１０１の占める領域に対応する画素座標の領域を決定することができる。

次に、ステップＳ１０４で得られた個々の細胞１０１の輪郭領域の画素座標を空間座標の一致する反射干渉画像に適応させ、つまりステップＳ１０４で得られたセグメンテーション領域を反射干渉画像にコピーすることにより、定量位相画像で決定された個々の細胞１０１の輪郭領域を反射干渉画像に当てはめる（ステップＳ１０５、図６の画像Ｂ、特許請求の範囲の「輪郭適用ステップ」に相当）。このようにすることで、図６に示すように、定量位相画像と反射干渉画像の両方の画像Ａ，Ｂに対して同じ輪郭領域を決定することができる。

次に、ステップＳ１０４およびＳ１０５のセグメンテーションの後に、パラメータを抽出する処理が行われる（ステップＳ１０６、特許請求の範囲の「第１抽出ステップ」、「第２抽出ステップ」および「第３抽出ステップ」に相当）。

すなわち、ステップＳ１０４で得られた一つ一つの細胞１０１の領域において、第２抽出部２０５が、定量位相画像から（１）細胞１０１の光学的厚さ（光路長）の平均値、（２）光学的厚さの標準偏差、（３）細胞１０１の面積、（４）細胞１０１の光学的体積（光学的厚さの合計値）を求める（ステップＳ１０６、特許請求の範囲の「第２抽出ステップ」に相当）。更に、ステップＳ１０３で入力した反射干渉画像、およびステップＳ１０５でセグメンテーション領域をコピーした反射干渉画像から、第１抽出部２０４および第３抽出部２０６が、それぞれ、（５）明暗の平均輝度、（６）強い接着を示す暗領域の面積、（７）弱い接着を示す明領域の面積、（８）撮像範囲全体および細胞１０１の面積に占める暗領域の割合、（９）撮像範囲全体および細胞１０１の面積に占める明領域の割合を求める（ステップＳ１０６、特許請求の範囲の「第１抽出ステップ」および「第３抽出ステップ」に相当）。

また、接着部位の２次元分布パターンを求める方法として、反射干渉画像の明暗の２次元濃淡分布パターンから求めたテクスチャ解析の定量解析を行う。テクスチャ解析には、画像における濃度ｉの画素がθ方向に距離ｄ画素離れた画素の濃度がｊである確率Ｐ（ｉ，ｊ）（ｉ，ｊ＝０，１，２，３，．．．ｎ−１）を要素とする同時生起行列から求めたテクスチャの特徴を得る同時生起行列法、画像における濃度ヒストグラムＰ（ｉ）からテクスチャの特徴を求める濃度ヒストグラム法等を適用する。この解析処理は解析部２０７により行われても良い。

同時生起行列法から得られるテクスチャの特徴パラメータとしては、（１０）エネルギー、（１１）エントロピー、（１２）相関、（１３）局所一様性、（１４）慣性等が挙げられる。この中で、エネルギーは同時生起行列の確率分布が特定の値に集中しているかを示す指標となり、エントロピーは同時生起行列の確率分布が広い範囲の値に分布しているかを示す指標となる。一方、濃度ヒストグラム法から得られるテクスチャの特徴パラメータとしては、（１５）平均、（１６）分散、（１７）歪度、（１８）尖度等が挙げられる。この中で、歪度は濃度ヒストグラムの形状が対称な形からどれだけずれているかを示す指標となり、尖度は濃度ヒストグラムの分布がどれだけ平均値の周りに集中しているのかを示す指標となる。

このうち、同時生起行列法の（１１）相関や濃度ヒストグラム法の（１４）平均、（１５）分散のパラメータは画像取得時の輝度の明るさの影響を受けやすいので、評価する場合には同じ露光時間や同じ照明輝度で取得したものに限るなどの条件を把握していた方が良い。この場合、分散のかわりに（１９）「√（分散）／平均輝度」を用いることにより、画像取得時の明るさの条件に影響を受けないパラメータとして利用することができる。また、同時生起行列法では、θ方向、距離ｄについて複数の値を得ることができるが、あらかじめどの方向、どの距離のパラメータが細胞間で差が出るかを予備実験で検討および決定しておくと、膨大なパラメータの数を最適化することができる。今回はθ方向＝０度、距離ｄ＝８画素に固定して結果を得ることにする。このようにして一つ一つの細胞１０１について（１）から（１９）を計測結果として数値として記憶する。

図７に個々の細胞から得られたパラメータの一例を示す。またこれらのパラメータのうちの２つの成分を用いて散布図を描くことができる。図８は骨髄幹細胞（stem cells）と分化誘導した破骨細胞（osteoclasts）の２種類の細胞について、識別を行うために特徴的なパラメータを用いてプロットしたものである。図８（Ａ）は、横軸に反射干渉の明暗の平均輝度（５）をとり、縦軸に定量位相の細胞の光学的厚さの平均値（１）をとって、それぞれの細胞をプロットした２成分散布図である。一方、図８（Ｂ）は横軸に反射干渉のテクスチャ解析の濃度ヒストグラム法の尖度（１８）をとり、縦軸に反射干渉のテクスチャ解析の同時生生起行列法の慣性（１４）をとってプロットしたものである。何れの２成分散布図においても、骨髄幹細胞と破骨細胞はそれぞれ集団を形成しており、種類の異なる細胞を識別する有効なパラメータとなっている。

図５に戻り、ステップＳ１０６にて個々の細胞１０１から求めた計測情報（パラメータ）をもとに、未知の被検体の細胞がどの種類の細胞集団に類似しているのか、またはどんな状態の細胞集団に類似しているのかを判別する（ステップＳ１０７）。そのためには、あらかじめ既知の状態の細胞集団の計測情報をリファレンスデータとして格納しておき、被検体細胞とリファレンスデータとを比較することにより被検体細胞の種類や状態を判別する。細胞観察装置１には、図１に示すように、リファレンスデータを格納するためのリファレンス記憶部２０８が設けられている。リファレンス記憶部２０８には、複数種類の細胞または複数種類の状態の細胞について記憶することができ、初期値として代表的な細胞群についてリファレンスを持つこともできるし、作業者にとって必要な細胞群について新たに計測を行い追加することもできる。

リファレンスデータを取得する手順としては、最初に、あらかじめ既知の種類の細胞集団または既知の状態の細胞集団について複数個の細胞を用意する。これらは細胞間のばらつきが少なく、できるだけ均質なものを用意する。次に、これらの細胞に対して上述したステップＳ１０１〜Ｓ１０６の処理を画像取得部１０および処理部２０の協同により行い、求めた計測結果をリファレンスデータとしてリファレンス記憶部２０８に記憶する。

リファレンスデータを用いた細胞判別の一例として、被検体となる未知の細胞が二つの細胞集団のうちどちらに属するかを判別する場合を考える。なお、以下の判別処理は、解析部２０７によって行われる。最初に、リファレンスとして格納した２種類の細胞集団について、個々の細胞の（１）から（１９）の計測結果のうち、任意の２成分を選んでそれぞれを縦軸、横軸にとった２成分散布図を作成する。作成した２成分散布図の中で二つの細胞集団を単純な区画線で簡便に識別できるような２成分散布図を、被検体の細胞を識別する際の判断基準として利用する。例えば図９（Ａ）に示す一例のリファレンスデータでは、細胞Ａと細胞Ｂを識別する手段として、横軸に反射干渉のテクスチャ解析の濃度ヒストグラム法の尖度（１６）をとり、縦軸に反射干渉のテクスチャ解析の同時生生起行列法の慣性（１３）をとってプロットした。この２成分の散布図を用いると、細胞Ａと細胞Ｂを単純な区画線Ｌにて識別することができる。この区画線Ｌを用いた細胞Ａの識別の性能としては、感度１００％、特異度１００％で識別が可能である。

次に、被検体となる未知の細胞について計測を行い、未知の細胞一つ一つについて上述の（１）から（１９）の計測結果のパラメータを得る。被検体の細胞が細胞Ａか細胞Ｂであるかを識別したい場合、細胞Ａと細胞Ｂを識別するためのリファレンスデータの２成分散布図を呼び出し、これを参照する。図９（Ｂ）および（Ｃ）のように、リファレンスデータの２成分散布図に被検体の細胞をプロットし、区画線Ｌを用いて細胞Ａおよび細胞Ｂに相当する領域を明示する。すると、被検体の細胞は区画線Ｌにて区切られた細胞Ａの領域または細胞Ｂの領域に存在し、どちらの細胞集団に属しているかを判別することができる。図９（Ｃ）においては、１３個の被検体の細胞のうち、７個の細胞は細胞Ａに分類され、残る６個の細胞は細胞Ｂに分類されるという結果が得られる。もちろん、図９（Ｄ）および（Ｅ）に示すように、２成分散布図にプロットされた一つ一つのデータが、定量位相画像および反射干渉画像においてどの細胞であるかを関連付けて明示することもできる。

なお、区画線は２成分散布図において目視により縦軸横軸に水平な矩形領域を設けてもよいし、統計解析の判別分析の手法を用いて２集団を弁別する線形判別式を用いてもよい。線形判別式にて細胞を識別する場合には、個々の細胞について、得られた線形判別式をもとに判別得点を求めると、２群における判別得点の一方は正の値、他方は負の値をとるので、簡単に細胞を識別することができる。

（第１実施例の作用及び効果）
続いて、以上まで説明した第１実施例にかかる細胞観察装置１の作用及び効果について説明する。本実施例の細胞観察装置１によれば、反射干渉計測用光源１０６、定量位相シャッタ１０５Ａ、カメラ１１０、および第１抽出部２０４の反射干渉計測ユニットを備えることにより、細胞からの反射光をもとに、第１パラメータを得る。また、定量位相計測用光源１０５、反射干渉シャッタ１０６Ａ、カメラ１１０、および第２抽出部２０５の定量位相計測ユニットを備えることにより、細胞からの透過光をもとに、第２パラメータを得る。このように、本実施例の細胞観察装置１では、反射干渉計測ユニットおよび定量位相計測ユニットの両方を備えることにより、第１パラメータおよび第２パラメータの両方を得ることができ、これにより使用者は細胞の状態を適切に判別・評価するためのより多くの情報を得ることとなる。

また、本実施例の細胞観察装置１では、反射干渉計測および定量位相計測の両計測に対して、共通の一つのカメラ１１０によって撮像を行っている。カメラ１１０を一つ備えるだけで済むことから、コストの面で有効である。また、カメラ１１０が共通であることから、両計測の結果として得られる画像（反射干渉画像および定量位相画像）間の空間的な位置ずれが起きない。したがって、両画像間の空間座標の位置合わせ処理をしなくて済むこととなり、処理負荷の面で有効である。

また、反射干渉画像を生成する際には定量位相シャッタ１０５Ａが定量位相計測用光源１０５からの光を遮光し、定量位相画像を生成する際には反射干渉シャッタ１０６Ａが反射干渉計測用光源１０６からの光を遮光することにより、時間的に互いに排他的に計測を行うこととなる。このような計測方法により、時間的に完全に同時の画像を取得する必要のない場合に、本実施例は有用である。例えば、定量位相計測と反射干渉計測のそれぞれの画像取得に生じる時間差に対して、細胞が十分ゆっくり変化しているような場合に、特に有用である。また、反射干渉計測および定量位相計測を同時に行わないことから、光源を用いる際に計測方式別に波長を分けて用いる必要がなく、各々の計測に最も有効な波長を利用することができる。反射干渉計測用光源１０６および定量位相計測用光源１０５間で、波長範囲にオーバーラップがあっても良く、同一でも構わない。

また、本実施例によれば、第１パラメータおよび第２パラメータに加え、第３パラメータが更に得られる。この第３パラメータは、定量位相画像と反射干渉画像との間で細胞の輪郭を合わせた上で得られるパラメータであるため、第１パラメータおよび第２パラメータとは異なる性質のパラメータであり、使用者はこの第３パラメータを更に得ることにより、細胞の状態を適切に判別・評価するためのより多くの情報を得ることとなる。

また、定量位相画像から細胞の輪郭を抽出し、当該輪郭を反射干渉画像に適用することにより、輪郭適用後の反射干渉画像を生成する処理の中で使用者の介入はない。一方、従来の反射干渉顕微鏡を用いる方法（反射干渉法）では、個々の細胞の輪郭を予め認識しておく必要があるため、反射干渉法は輪郭認識のための他の方法との組み合わせで用いられることが多い。上述したように、上記の非特許文献１は、蛍光法と反射干渉法の組み合わせについて開示しているが、細胞の輪郭を自動的に抽出することが困難であったため、操作者が手描きにより細胞の輪郭を定めている。また、非特許文献２は、透過照明法と反射干渉法の組み合わせについて開示しているが、細胞の輪郭を人の手に寄らず自動的に定めることについての言及はない。更に、非特許文献３は、明視野法と反射干渉法の組み合わせについて開示しており、細胞輪郭抽出の自動化について一応の言及はしているものの、例えば、使用者が明視野画像を見ながら輪郭抽出のための最適な閾値を手動で設定する必要があることが記載されているなど、使用者のある程度の介入の必要性を認め、細胞の輪郭を人の手に寄らず自動的に定めるには至っていない。これに対して、本実施例では、定量位相画像からの細胞輪郭抽出、当該輪郭の反射干渉画像への適用、輪郭適用後の反射干渉画像の生成までの処理が、輪郭抽出部２０２および輪郭適用部２０３により人の手に寄らず行われる。これらの処理が人の手に寄らず行われることにより作業効率は著しく向上し、それに伴う作業時間の顕著な短縮が達成される。

輪郭抽出部２０２および輪郭適用部２０３によるセグメンテーションの自動化により、どれぐらい作業時間が短縮できるかについて、非特許文献３の場合と比べる実験を実施した。視野中に１００個ほど存在する細胞を明視野（非特許文献３の場合）と定量位相（本実施例の場合）にてそれぞれ撮影し、セグメンテーションの処理にかかる時間を計測した。明視野の場合、明るさの閾値を用いたセグメンテーションが困難であったため、マウスにて細胞一つ一つの輪郭を通常の作業能力を有する作業者の手によりトレースしてセグメンテーションを行った。この場合、１００個の細胞をセグメンテーションするのに１５０秒を要した。一方、定量位相にて得られた細胞の位相画像においては、輪郭抽出部２０２および輪郭適用部２０３における自動閾値と画像処理によってセグメンテーションを行った。この場合には、３秒の演算処理時間で１０８個の細胞をセグメンテーションすることができ、１５０秒から３秒へと大幅な時間短縮が可能であった。以上の実験結果から分かるように、本実施例の輪郭抽出部２０２および輪郭適用部２０３を備え、人の手に寄らずセグメンテーションを行うことにより、作業効率は著しく向上し、それに伴う作業時間の顕著な短縮が達成される。

また、本実施例によれば、回折型干渉光学系１１１を備えることにより定量位相画像を生成するために必要な参照光が得られ、参照光カット装置１０８を備えることにより反射干渉画像生成には不要な参照光を遮光することができる。

また、本実施例によれば、細胞の基板への接着状態に基づく情報として、細胞の基板への接着面積、撮像範囲全体に対した接着面積の割合、細胞の基板への接着パターン(２次元分布)等の情報が得られ、使用者はこれらの情報を用いて細胞の状態を適切に判別・評価することができる。

また、本実施例によれば、細胞の光学的厚さ、面積、体積、または細胞内での屈折率の変化に基づく情報が得られ、使用者はこれらの情報を用いて細胞の状態を適切に判別・評価することができる。

また、本実施例によれば、細胞の輪郭の中での、つまり細胞が占める空間の範囲内での基板への接着状態に基づく情報として、細胞の全体面積に対した接着面積の割合等の情報が得られ、使用者はこのような情報を用いて細胞の状態を適切に判別・評価することができる。

また、本実施例によれば、リファレンスデータに基づき、未知の被検体の細胞の種類または状態を判別することができる。

［第２実施例］
引き続き、本発明の第２実施例について説明する。第２実施例では、図１に示した第１実施例の構成要素のうち、画像取得部１０に相違点がある。つまり、定量位相計測および反射干渉計測を順次行うための光学系の構成に特徴がある。

図１０は、第２実施例における画像取得部１０Ａを示す。第１実施例の画像取得部１０と比べると、全反射ミラー１０９を用いずに構成されている。従って、簡素な構成が実現でき、装置化しやすいというメリットがある。

定量位相計測において、細胞１０１の入った容器１０２の上部に設置した定量位相計測用光源１０５から放射された照明光は、細胞１０１の入った容器１０２を透過し、対物レンズ１０４にて集光される。そして、ハーフミラー１０７を介し、位相計測のための回折型干渉光学系１１１にて物体光と参照光の干渉像を形成し、カメラ１１０にて干渉縞画像が撮像される。

反射干渉計測において、反射干渉計測用光源１０６から放射された照明光は、ハーフミラー１０７にて反射して、対物レンズ１０４を通って、測定対象となる細胞１０１を入れた容器１０２の底面側から入射する。容器１０２の底面の細胞１０１の接着面から得られる反射光は細胞１０１の接着距離に応じて干渉を生じ、得られた反射干渉光は再び対物レンズ１０４にて集光され、ハーフミラー１０７を介し、カメラ１１０にて撮像される。

［第３実施例］
引き続き、本発明の第３実施例について説明する。第３実施例では、図１に示した第１実施例の構成要素のうち、画像取得部１０に相違点がある。つまり、定量位相計測および反射干渉計測を順次行うための光学系の構成に特徴があり、具体的には、定量位相の計測方法を２光束方式に変えたものである。

図１１は、第３実施例における画像取得部１０Ｂを示す。第２実施例の画像取得部１０Ａと比べると、回折型干渉光学系１１１を用いずに、定量位相計測用光源１０５からの照明光および参照光を光路１１８Ｇおよび光路１１９Ｇを用いてカメラ１１０に到達させている点が相違する。回折型干渉光学系１１１を備えなくても装置構成ができるというメリットがある。定量位相の計測方法を回折型干渉光学系１１１を用いる代わりに、２光束方式を採用し、参照光を別の光路で作成し、最終的に物体光と参照光を干渉させる構成である。定量位相計測用光源１０５に供えられた定量位相シャッタ１０５Ａは参照光カット装置１０８（図１参照）の役割を兼用するため、参照光カット装置は別に存在しない。

定量位相計測において、定量位相計測用光源１０５からの照明光は、照明光のための光路１１８Ｇを通って、容器１０２の上部に設置したレンズ１２０Ｇを介して、容器１０２内の細胞１０１を透過し、対物レンズ１０４にて集光される。そして、ハーフミラー１０７を介し、ハーフミラー１２１Ｇおよびレンズ１２２Ｇを更に介し、カメラ１１０に到達する。一方、定量位相計測用光源１０５からの参照光は、参照光のための光路１１９Ｇを通って、レンズ１２３Ｇ、ハーフミラー１２１Ｇ、およびレンズ１２２Ｇを順に介し、カメラ１１０に到達する。

反射干渉計測において、反射干渉計測用光源１０６から放射された照明光は、ハーフミラー１０７にて反射して、対物レンズ１０４を通って、測定対象となる細胞１０１を入れた容器１０２の底面側から入射する。容器１０２の底面の細胞１０１の接着面から得られる反射光は細胞１０１の接着距離に応じて干渉を生じ、得られた反射干渉光は再び対物レンズ１０４にて集光され、ハーフミラー１０７を介し、ハーフミラー１２１Ｇおよびレンズ１２２Ｇを更に介し、カメラ１１０にて撮像される。

タイミングチャートは実施例１の図４と基本的には同様であるため省略するが、定量位相シャッタ１０５Ａと参照光カット装置１０８が常に同じタイミングで動作する。具体的には、定量位相画像を取得する時は、定量位相シャッタ１０５Ａおよび参照光カット装置１０８が開口し、反射干渉シャッタ１０６Ａが閉じる。逆に反射干渉画像を取得する時には、反射干渉シャッタ１０６Ａが開口し、定量位相シャッタ１０５Ａおよび参照光カット装置１０８が閉じるという具合である。このように定量位相画像と反射干渉画像とを時間的に交互に取得して２つの画像をペアとして同時刻の画像として扱う。

［第４実施例］
引き続き、本発明の第４実施例について説明する。第４実施例では、図１に示した第１実施例の構成要素を全て含み、定量位相計測用光源１０５に更なる特徴がある。

従来、位相変化を求めるために干渉性の高いレーザ光が光源としてよく使用されていた。しかしながら、レーザ光を使用する場合には、対物レンズなどの光学系に由来する過干渉による背景ノイズや、細胞内の高屈折率の顆粒などからの散乱光ノイズが、計測に影響を与えることがしばしばある。本実施例の細胞観察装置１の定量位相計測においては、照明用光源として、波長幅が広く干渉性の低い低コヒーレント光を使用することに特徴がある。この特徴により、過干渉によるノイズを低減でき、より安定した計測をすることができる。一例では、中心波長８３０ｎｍ、波長幅２０ｎｍ程度のＳＬＤ（スーパールミネセンスダイオード）を使用することにより、過干渉によるノイズを低減でき、より安定した計測に成功した。

［第５実施例］
引き続き、本発明の第５実施例について説明する。第５実施例では、図１に示した第１実施例の構成要素を全て含み、反射干渉計測用光源１０６に更なる特徴がある。

従来、コントラストを得るためにある程度波長幅を制限したバンドパスフィルタを用いた照明光が利用されていた。しかしながら、バンドパスされた照明光では、干渉性が高く、細胞の接着面とは関係のない細胞の上部の細胞膜と培養液との界面からの反射による干渉縞が映り込むことがしばしばある。本実施例の細胞観察装置１の反射干渉計測においては、波長幅の広く干渉性の低い低コヒーレント光を使用している。広い波長幅の照明光を用いることにより、干渉が起きる距離を狭くすることができ、細胞の基板への接着面に限定した反射干渉画像を取り出すことが可能となる。

図１２に４２０ｎｍ〜７５０ｎｍの波長幅の広い照明光を用いた場合と４８０ｎｍ、５３０ｎｍを中心波長として波長幅３０ｎｍ程度に狭い波長範囲でバンドパスされた照明光を用いた場合の反射干渉画像の違いを示す。図１２（Ａ）と図１２（Ｂ）のように狭い波長範囲でバンドパスされた照明光では、細胞の接着面ではない細胞の上部の細胞膜と培養液との界面からの反射が干渉縞のように重なって観察されるが、図１２（Ｃ）のように波長幅の広い照明光を用いることにより、細胞の上部からの反射光による干渉は観察されず、細胞の接着面により限定した情報のみを取り出すことが可能である。

本実施例では、広い放射波長を有するハロゲンランプを光源として用い、出力光に４２０ｎｍから８００ｎｍ程度の可視から近赤外の波長域において任意の広い波長幅のバンドパスフィルタを用いている。中心波長が５００ｎｍから１０００ｎｍで、半値全幅が１００ｎｍ以上のバンドパスされた光を用いると、細胞の接着面に限定した反射干渉画像を取り出すことができる。このような照明法の工夫は細胞からの定量的なパラメータを取得する上で非常に有効である。

［第６実施例］
引き続き、本発明の第６実施例について説明する。第６実施例では、図１に示した第１実施例の構成要素を全て含み、反射干渉画像取得のための照明方法に更なる特徴がある。図１３は、第６実施例にかかる細胞観察装置１Ａの構成概要図である。図１３に示すように、細胞観察装置１Ａには、リングスリット１１３が更に備えられている。

一般に、統計的に有意なデータを取得したり、多くの細胞の中にまれに混在する異種細胞を発見するためには、できるだけ多くの細胞について計測を行う必要がある。そのため、できるだけ低倍率の対物レンズを用いて一度に広い視野を計測することが望まれる。しかしながら、低倍率の対物レンズはＮＡが低く、ＮＡの低い照明光は標本に垂直に照射される成分が多く、細胞上部に存在する溶液と空気の界面で反射し、反射光によって細胞が照明されるという現象を引き起こす。これによって接着面とは無関係な細胞の形態像が観察側に含まれるようになる。また、対物レンズの中心部分を通過した照明光は、対物レンズ内部で反射され、反射光が観察側に多く含まれて高い背景光となり、接着面の反射干渉画像のコントラストを低下させる原因となる。

本実施例にかかる細胞観察装置１Ａの反射干渉計測において、図１３に示すように、低いＮＡの対物レンズ１０４Ａを使う場合は、対物レンズ１０４Ａの反射干渉計測用光源１０６側の開口絞りと共役な位置にリング状のスリット１１３を設ける。リング状に開口したスリット１１３を反射干渉計測用光源１０６からの照明光が通り、照明光は対物レンズ１０４Ａの中心は通らず周辺を通って照明され、角度のついた高いＮＡの光のみを使って細胞１０１が照明されるため、細胞１０１上部の溶液からの反射光の影響を低減することができる。また、リング状のスリット１１３を用いた照明は、低ＮＡの対物レンズ１０４Ａのみならず、広く対物レンズ１０４Ａ内部の反射による背景光を低減することができる。リング状に開口したスリット１１３は使用する対物レンズ１０４Ａの瞳径に適合して対物レンズ１０４Ａごとに変えられるように、使用する対物レンズ１０４Ａに適合したリングスリット１１３が円盤上に複数個取り付けられて、必要に応じて、円盤を回転させることによって、使用者がリングスリット１１３を選択できるように構成されている。

図１４にリングスリット１１３を用いてない場合と、用いた場合の反射干渉画像を示す。図１４（Ａ）はリングスリット１１３を用いてない場合の反射干渉画像を示す。細胞の上部の溶液と空気との界面からの反射光によって細胞が照明され、矢印で示すように、細胞の輪郭像が細胞の接着画像に重なって観察されてしまう。一方、図１４（Ｂ）のように照明光学系にリングスリット１１３を設けた場合には、細胞の上部の溶液と空気との界面に直進する照明成分がカットされるために、細胞が上部からの反射光によって照明されることがなくなり、細胞の接着面の情報をコントラスト良く観察することができる。このような照明法の工夫は細胞からの定量的なパラメータを取得する上で非常に有効である。

［第７実施例］
引き続き、本発明の第７実施例について説明する。第７実施例では、図１に示した第１実施例の構成要素を全て含み、細胞１０１の入った容器に更なる特徴がある。

図１５は、第７実施例における容器１０２Ａを示す図である。容器１０２Ａの有する特徴の一つは、細胞１０１が入れられた容器１０２Ａの細胞１０１の接着面の反対側（容器１０２Ａの観察領域の対物レンズ側）に反射防止コート１１４が施されたことである（以下、「特徴１」ともいう。）。容器１０２Ａの有する他の特徴の一つは、容器１０２Ａの上部に、培養液１１５の高さを一定にできるように、培養液１１５に接触するような高さに平行にガラスなどの観察窓１１６を備えたことである（以下、「特徴２」ともいう。）。容器１０２Ａの有する更に他の特徴の一つは、観察窓１１６において、容器１０２Ａの外側（培養液１１５に接する面の反対側の空気側）に反射防止コート１１７が施されたことである（以下、「特徴３」ともいう。）。

特徴１は、反射干渉画像を取得する上で著しい効果を発揮する。できるだけ多くの細胞１０１を計測する目的では、低倍率対物レンズを利用することが良い。しかし、低倍率の対物レンズはＮＡが低く、通常油浸や水浸ではなく、ドライ系の対物レンズが一般的である。しかしながら、反射干渉画像において、ドライ系の対物レンズを用いると、対物レンズから出射した照明光は細胞１０１の入っている容器の底面で大きく反射する。これは空気と容器の底面のガラスなどの屈折率差が大きいためである。そのため、大幅に背景光が増加して細胞１０１の接着面の反射干渉画像を見ることはほとんど困難となる。従来、反射干渉観察に、油浸や水浸の対物レンズが用いられてきた理由はここにある。

そこで、第７実施例では、細胞１０１が入れられた容器１０２Ａの細胞１０１の接着面の反対側（容器１０２Ａの観察領域の対物レンズ側）に反射防止コート１１４を施すことによって、ドライ系の対物レンズでの反射干渉画像の取得を可能にした。図１６に示すように、反射防止コート１１４をしていない状態で対物レンズから照射された照明光は空気とガラスとの界面で４％程度の反射があるが、ガラス底面に照明光の波長範囲（４２０ｎｍ〜７２０ｎｍ）において反射率Ｒを０．５％程度に抑えた反射防止コート処理を行うことによって、背景光を１／８以下に低減することができる。このため、第７実施例によれば、ドライ系の対物レンズを用いる場合であっても、高いコントラストで細胞接着面の反射干渉画像を得ることができる。

図１７に容器１０２Ａの底面に反射防止コート１１４を施した場合のドライ対物レンズを用いた反射干渉画像を示す。図１７（Ａ）のように反射防止コート１１４を施さないと、容器１０２Ａの底面からの反射が大きいために、反射干渉画像のコントラストは極めて低下してしまう。これに対して、図１７（Ｂ）のように底面に反射防止コート１１４を施した容器１０２Ａを用いることによって、ドライ系の対物レンズでも良好なコントラストを得ることができる。

特徴２は、定量位相画像を取得する上で極めて有効である。定量位相画像を取得する上で、溶液の揺れによって生じる液面の高さの変化は光路長の変化となり、計測上のノイズを生じる。そのため、液面の高さが変わらないようにして計測を行うことが望まれる。しかしながら、継続的に観察を行う場合、途中で薬液を投与してその後の変化を計測する場合があり、薬液投与によって液面の揺れが生じることは避けられない。そこで、第７実施例では、細胞１０１の入った容器１０２Ａの上部（または蓋）に特徴がある。

すなわち、容器１０２Ａの上部（または蓋）には、培養液１１５の高さを一定にできるように、培養液１１５に接触するような高さに平行にガラスなどの観察窓１１６が設けられている。観察窓１１６の存在により、細胞１０１の入った容器１０２Ａの観察領域における溶液の高さは、細胞１０１の接着した観察面である容器１０２Ａの底面と容器１０２Ａの上部の観察窓１１６との間で一定となる。観察窓１１６は容器１０２Ａの底面の観察領域に対応した範囲に設けられ、周囲は開口部を設けて薬液の投与を可能にしている。なお、定量位相画像を取得するにあたり、観察窓１１６は標本の底面に対して並行であることが望ましい。容器１０２Ａの上部に培養液１１５と接して培養液１１５の高さを一定に保つ観察窓１１６を設けた場合には、定量位相画像は時間的に安定であり、細胞１０１の光路長の測定結果を常に安定な条件下で得ることが可能となる。なお、容器１０２Ａ上部の観察窓１１６は容器１０２Ａの蓋を兼ねており、蓋を閉じた状態で無菌状態を維持することが可能である。また、薬液を投与する場合を考慮して蓋部分には薬液投与用の開口部を設けてもよい。

特徴３は、反射干渉画像を取得するにあたり、観察窓１１６の容器１０２Ａの外側（培養液１１５に接する面の反対側の空気側）に、反射防止コート１１７が施されたことである。反射防止コート１１７を施さなかった場合には、細胞１０１上部の溶液に接する観察窓１１６のガラスと外側の空気との屈折率の差が大きいために、反射干渉画像を得る目的で対物レンズから照射された照明光が観察窓１１６において４％程度反射される。その反射光により細胞１０１が照明されて反射干渉画像に細胞１０１の輪郭像が重ねて投影される。このことは反射干渉画像から接着面に限定した情報を取り出す上で邪魔な情報となり、クリアな反射干渉画像を得ることの妨げとなる。そこで、第７実施例では、観察窓１１６の容器１０２Ａの外側に照明光の波長範囲において反射率を０.５％程度に抑えるような反射防止コート処理を施すことによって、反射率を１/８程度に低減することができる。このため、上面からの反射光の影響を抑えて、高いコントラストで細胞接着面の反射干渉画像を得ることができる。

図１８に容器１０２Ａ上部の観察窓１１６に反射防止コート１１７を施した場合の反射干渉画像の改善を示す。図１８（Ａ）のように無処理の場合では、容器１０２Ａ上部の観察窓１１６と空気との界面からの反射光によって細胞１０１が上部から照明されて細胞１０１の輪郭像が映り込んでしまう。一方で、図１８（Ｂ）のように上部の観察窓１１６の空気側に反射防止コート１１７を施すことによって、上部からの反射は低減され、細胞１０１の接着面の反射干渉画像をコントラスト良く観察することができる。

なお、細胞１０１の入った容器１０２Ａに培養液１１５の乱れが起きないように、例えば測定中に試薬などを投与しない状態で静置観察を行うのであれば、上述の観察窓１１６を設けることは必須ではなく、図１９に示すように、容器の底面に反射防止コート１１４を施した特徴１のみを有する容器１０２Ｂとしても良い。

［第８実施例］
引き続き、本発明の第８実施例について説明する。第８実施例では、図１に示した第１実施例の構成要素のうち、ハーフミラー１０７に相違点がある。つまり、第８実施例は、第１実施例の構成要素を全て含み、ハーフミラー１０７の特性をより向上させたものである。

通常のハーフミラーは全波長域において同等の分離比率を有するものが一般的である。このようなハーフミラーを本実施形態におけるハーフミラー１０７として用いた場合では、反射干渉の目的で光路中に設置したハーフミラー１０７を定量位相の像が通過する際に、定量位相画像の透過率はハーフミラー１０７によって制限されてしまう。そこで、第８実施例では、図２０の画像取得部１０Ｃに示すように、反射干渉計測用光源１０６とカメラ１１０との間および定量位相計測用光源１０５とカメラ１１０との間に位置し、波長により反射対透過の比率を異ならせることが可能なハーフミラー１０７Ａを用いる。ここで、第８実施例においては、反射干渉と定量位相の照明光の波長が重ならないように、定量位相計測用光源１０５および反射干渉計測用光源１０６はそれぞれ別の波長の照明光を用いることが前提である。ハーフミラー１０７Ａの波長特性とは、つまり、反射干渉の観察波長域においてはハーフミラー（図２０では透過：反射＝８０：２０）として働き、一方、定量位相の観察波長域においては最大限光を透過する波長特性である。こうすることにより、定量位相の観察光の光量のロスが少なくて済む。

例えば、反射干渉では可視光（４２０ｎｍから７５０ｎｍ）を用い、定量位相では中心波長８３０ｎｍで半値全幅２０ｎｍの光を用いる場合には、ハーフミラー１０７Ａの波長特性を可視光（４２０ｎｍから７５０ｎｍ）では反射：透過の比率を２０：８０に設定する一方で、８００ｎｍ以上では反射：透過の比率を５：９５に設定する。こうすることで、反射干渉では観察光の８０％を得ることができるとともに、定量位相については、ハーフミラー１０７Ａの反射干渉時の透過率に左右されず、９５％の透過率で信号を得ることが可能となる。

［第９実施例］
引き続き、本発明の第９実施例について説明する。第９実施例では、図１に示した第１実施例の構成要素のうち、画像取得部１０に相違点がある。つまり、定量位相画像を取得するための光学系の構成に特徴がある。

定量位相の取得方法としては、第１実施例のような回折型干渉光学系１１１や第３実施例のような２光束干渉計など、干渉を利用した方法が一般的であるが、最近では干渉を用いない光学的手法が知られている。具体的には、細胞の透過照明画像を取得する工程において、焦点位置を移動させて焦点位置のわずかに異なる最低２枚の透過照明画像から演算によって位相画像を作成するというものである（例えば、下記の参考文献を参照）。
＜参考文献＞
IATIA社のホームページ：http://www.iatia.com.au/technology/

上記の定量位相画像の取得方法を本実施形態の細胞観察装置１に取り組むことができる。図２１は、この場合の画像取得部１０Ｄを示す。第１実施例の図１の構成と比べて、回折型干渉光学系１１１、参照光カット装置１０８、全反射ミラー１０９は不要である。対物レンズ１０４には電動フォーカス装置１２４を取り付け、フォーカス位置を変えて撮像するよう制御される。なお、図２１の電動フォーカス装置１２４における矢印は、電動フォーカス装置１２４がフォーカス位置を変えることを示す。

手順としては定量位相画像を取得するタイミングでは定量位相計測用光源１０５に備え付けられた定量位相シャッタ１０５Ａが開口して透過照明を細胞１０１に照射する。反射干渉計測用光源１０６に備え付けられた反射干渉シャッタ１０６Ａは閉じる。このとき電動フォーカス装置１２４を制御して、焦点位置のわずかに異なる２画像を取得する。例えば、５μｍ焦点位置の異なる画像を取得する。得られた２画像から演算によって位相画像を作成する。一方、反射干渉画像を取得するタイミングでは反射干渉計測用光源１０６に備え付けられた反射干渉シャッタ１０６Ａが開口して照明光を標本の底面から照射する。定量位相計測用光源１０５に備え付けられた定量位相シャッタ１０５Ａは閉じる。このとき、電動フォーカス装置１２４を制御して、細胞１０１の反射干渉画像に焦点をあわせて画像を取得する。以上の手順にて一組の定量位相画像および反射干渉画像を得ることができる。

［第１０実施例］
引き続き、本発明の第１０実施例について説明する。第１０実施例では、図１に示した第１実施例の構成と同様の構成を有するが、解析部２０７がリファレンス記憶部２０８によらずに処理を行うため、図示まではしないが、図１におけるリファレンス記憶部２０８を除いた構成としても良い。

第１０実施例において、解析部２０７は、リファレンスデータに基づかないで、未知の被検体の細胞の種類または状態を判別する。つまり、解析部２０７は、未知の細胞に対して抽出したパラメータの中から所定のパラメータを選択し、当該選択された所定のパラメータを用いて、未知の細胞の種類または状態を判別する。ここで、解析部２０７は、特異な値を示すパラメータを所定のパラメータとして自動的に選択するように構成されていても良い。また、当該パラメータ選択処理を行うために、別途の処理手段が設けられていても良い。一方で、解析部２０７が、ユーザからの入力に基づき、所定のパラメータを選択するように構成されていても良い。

図２２は、第１０実施例において、解析部２０７がユーザからの入力に基づき所定のパラメータを選択するように構成された場合に、ユーザに表示される画面４０を示す。画面４０Ａは、ユーザにパラメータの種類を示し、ユーザの選択を受けるための画面である。画面４０Ａの例において、ユーザは、慣性と尖度を所定のパラメータとして選択している。なお、選択ツール４０Ａ１等を用いて、ユーザが画面４０Ａに表示されていない他のパラメータを選択できるようにしても良い。画面４０Ｂは、ユーザが選択したパラメータを反映してグラフに表示された例を示す。ユーザは画面４０Ｂを確認してから、画面４０Ａに戻りパラメータを選択し直しても良く、そのまま画面４０Ｃに進んでも良い。画面４０Ｃは、細胞の画像を表示する画面である。

このような第１０実施例によれば、解析部２０７は、リファレンスデータによらずに、処理を行うことができる。したがって、リファレンス記憶部２０７を設けなくて済むので、装置構成が簡潔になる。このような実施態様は、例えば、試料中の細胞が骨髄幹細胞と破骨細胞とに分かれていることが事前に分かっているときに、細胞それぞれを分別する場合に好適である。

［第１１実施例］
引き続き、本発明の第１１実施例について説明する。図２３は、第１１実施例における細胞観察装置１Ｅを示す。第１１実施例では、図１に示した第１実施例の構成と比べ、処理部２０Ｅに光源制御部２０９（特許請求の範囲の「反射干渉光量調整手段」および「定量位相光量調整手段」に相当））が更に備えられている。その代わりに、図１に示されている定量位相シャッタ１０５Ａ、反射干渉シャッタ１０６Ａ、照明光絞り部１０５Ｂは存在しない。光源制御部２０９は、反射干渉計測用光源１０６のＯＮ/ＯＦＦによる切り替えにより、反射干渉計測用光源１０６から放射される光の光量を調整し、且つ定量位相計測用光源１０５のＯＮ/ＯＦＦによる切り替えにより、定量位相計測用光源１０５から放射される光の光量を調整するものである。図２３では、光源制御部２０９一つで両方の光源をＯＮ/ＯＦＦしているが、光源ごとに別々の制御部を設けても良い。第１１実施例は、光源がＬＥＤやＬＤ、ＳＬＤなどの半導体型光源である場合に好適である。

［第１２実施例］
引き続き、本発明の第１２実施例について説明する。第１２実施例では、図１に示した第１実施例の構成要素のうち、主に、解析部２０７の動作に相違点がある。第１２実施例では、第１抽出部２０４、第２抽出部２０５、および第３抽出部２０６のそれぞれ、または組み合わせにより、３つ以上のパラメータが抽出された場合を前提としており、この場合に解析部２０７は、当該３つ以上のパラメータに対して主成分分析を行って、未知の細胞の種類または状態を判別する。

第１２実施例における動作を簡単にまとめると、次のようである。最初に、第１抽出部２０４、第２抽出部２０５、および第３抽出部２０６のそれぞれ、または組み合わせが、３つ以上のパラメータを抽出して、解析部２０７に出力する（以下「手順１」）。次に、解析部２０７が、当該３つ以上のパラメータに対して、標準化を行う（以下「手順２」）。次に、解析部２０７が、当該標準化データに基づき、第１主成分および第２主成分を求める（以下「手順３」）。次に、解析部２０７が、第１主成分および第２主成分の２成分散布図に細胞をプロットし、細胞判別を行う（以下「手順４」）。以下、実際の実験例に基づき、各手順の詳細について説明する。

（手順１：パラメータ抽出）
本実験においては、それぞれ１０個ずつの４種類の細胞をリファレンスとして用い、３つの未知の細胞に対して識別を実施した。なお、３つの未知の細胞は４種の細胞の何れかに含まれるものとして実験を行い、実験の目的は３つの未知の細胞が４種の細胞の何れに含まれるものかを識別することである。以下、リファレンスとして用いた各細胞の名称と、表記名と、個数（ｎ）とを順に示す。
ラット膵β細胞株 ＩＮＳ−１ （ｎ＝１０）
マウス膵β細胞株 ＭＩＮ−６ （ｎ＝１０）
ヒト膵癌細胞株 ＭＩＡ ＰａＣａ−２ （ｎ＝１０）
ヒト子宮頸癌細胞株 ＨｅＬａ （ｎ＝１０）

図２４は、リファレンスとして用いた各細胞の反射干渉画像および定量位相画像を示す。図２４（Ａ）および（Ｂ）はラット膵β細胞株（ＩＮＳ−１）の反射干渉画像および定量位相画像を順に示す。図２４（Ｃ）および（Ｄ）はマウス膵β細胞株（ＭＩＮ−６）の反射干渉画像および定量位相画像を順に示す。図２４（Ｅ）および（Ｆ）はヒト膵癌細胞株（ＭＩＡＰａＣａ−２）の反射干渉画像および定量位相画像を順に示す。図２４（Ｇ）および（Ｈ）はヒト子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ）の反射干渉画像および定量位相画像を順に示す。

本実験では、第１抽出部２０４、第２抽出部２０５、および第３抽出部２０６のそれぞれ、または組み合わせが、図２４に示した反射干渉画像および定量位相画像から以下に示す７つのパラメータを抽出した。下記の（１）と（２）が定量位相画像より得られたパラメータであり、（３）〜（７）が反射干渉画像より得られたパラメータである。図２５は、７つのパラメータの実際の計測値を示す。
（１）細胞の面積
（２）細胞の厚さ
（３）接着面のテクスチャ：同時生起行列／局所一様性
（４）接着面のテクスチャ：同時生起行列／慣性
（５）接着面のコントラスト：濃度ヒストグラム／歪度
（６）接着面のコントラスト：濃度ヒストグラム／尖度
（７）接着面のコントラスト：濃度ヒストグラム／√（分散）／平均

（手順２：標準化）
上記手順１で抽出した複数のパラメータから、要約した特徴を示す成分（主成分）を求めるには、各パラメータを含む１次元の式を作成する必要がある。しかし、図２５に示す計測値では、パラメータによって単位が異なるために、取りうる値の大きさがまちまちである。これらの値をそのまま取り扱うと、値の大きいパラメータに情報が偏り、各パラメータから均等に情報を取り出すことが難しい。そこで、各パラメータから均等に情報を取り出すために、各パラメータの情報量を求めた。情報量として、母集団に対した偏差平方和を図２５に示す計測値から求めてみたところ、図２６に示すような計算結果が出た。しかし、図２６に示されるように、各パラメータ間の情報量に大きな差があった。各パラメータの情報量を等しくすることが望ましいので、本実験では、各パラメータにつき、以下の数式（１）に基づき、データの標準化を行った。
Ｘ’＝（Ｘｉ―Ｘ）／Ｘｓｄ…（１）
なお、数式（１）において、Ｘ’は標準化後のデータであり、Ｘｉは図２５で示した各計測値であり、ＸはＸｉにおける平均値であり、ＸｓｄはＸｉにおける標準偏差である。

図２７は標準化後の各パラメータの値を示す。図２７に示されるように、標準化の結果、各パラメータの情報量はパラメータの種類によらず等しくなっている。このような標準化後のデータを用いることにより、平等にデータを扱うことができるようになる。

（手順３：主成分の計算）
次に、解析部２０７が、図２７の標準化後のデータに基づき、第１主成分ｆおよび第２主成分ｇを求める。まず、標準化したデータをそれぞれ、面積＝Ｘ１、光学厚さ＝Ｘ２、…、√（分散）／平均＝Ｘ７とし、それらから統合した特徴を表す２つの主成分であるｆとｇを以下の数式（２）および（３）に基づき計算する。なお、数式（２）および（３）において、ａ１からａ７、ｂ１からｂ７は係数である。
ｆ＝ａ１＊Ｘ１＋ａ２＊Ｘ２＋ … ＋ａ７＊Ｘ７…（２）
ｇ＝ｂ１＊Ｘ１＋ｂ２＊Ｘ２＋ … ＋ｂ７＊Ｘ７…（３）

このとき、係数には以下の条件を設定する。
ａ１^２＋ａ２^２＋ … ＋ａ７^２＝１…（４）
ｂ１^２＋ｂ２^２＋ … ＋ｂ７^２＝１…（５）
数式（４）および（５）で示す条件を設定する理由は、後の手順で主成分ｆ、ｇの分散を最大にするような係数ａ１からａ７、ｂ１からｂ７を求めるので、数式（４）および（５）の条件にて係数を制限しておかないと、係数が制限なく大きくなってしまうからである。「ａ１^２＋ａ２^２＋・・・ ＋ａ７^２」および「ｂ１^２＋ｂ２^２＋… ＋ｂ７^２」は係数のベクトルの大きさに相当するものであり、ベクトルの大きさを１とすることで、元データの情報量を変えずに、新しい判断軸としての第１主成分ｆおよび第２主成分ｇを得ることができる。

また、ｆとｇを相関のない互いに直交する直線とするために、以下の条件を更に設定する。
ａ１＊ｂ１＋ａ２＊ｂ２＋ … ＋ａ７＊ｂ７＝０…（６）

ここで、ｆについて元になるデータの情報量をできるだけ多く反映した１次式となるようにするには、ｆで与えられる成分の値のばらつきが最も大きくなるようにすることが考えられる。ばらつきは分散と考えることができるので、ｆの分散が最大になるようにする。標本数４３の細胞それぞれのｆの値をｆ１、ｆ２、ｆ３、…、ｆ４３とすると、ｆの分散Ｖｆは以下の数式（７）で与えられ、分散Ｖｆが最大になる条件を満たすｆを計算する。
なお、上記の数式（７）において、
はｆの平均値である。

以上の方法により、第１主成分ｆについて、上記数式（４）の条件を満たし、且つ上記数式（７）の条件を満たす係数ａ１、ａ２、…、ａ７を計算する。図２８は、以上で説明した計算方法に基づき計算された主成分ｆの係数を示す。

次に、第２主成分ｇについて、上記数式（５）の条件を満たし、且つ上記数式（７）と同趣旨の条件（つまり分散が最大になる条件）を満たし、更に、上記数式（６）の条件を満たすような係数ｂ１、ｂ２、…、ｂ７を計算する。図２９は、以上で説明した計算方法に基づき計算された第２主成分ｇの係数を示す。

次に、各細胞についてｆおよびｇの値を求め、それぞれ第１主成分および第２主成分とする。図３０は、各細胞について第１主成分ｆおよび第２主成分ｇを求めた結果を示す。図３０（Ａ）はラット膵β細胞株（ＩＮＳ−１）およびマウス膵β細胞株（ＭＩＮ−６）の第１主成分ｆおよび第２主成分ｇを示しており、図３０（Ｂ）はヒト膵癌細胞株（ＭＩＡＰａＣａ−２）およびヒト子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ）の第１主成分ｆおよび第２主成分ｇを示している。

（手順４：プロットおよび細胞判別）
解析部２０７が、図３１に示した第１主成分ｆおよび第２主成分ｇの値を用いて、２成分散布図に各細胞をプロットし、細胞判別を行う。図３１はプロットした結果を示しており、第１主成分ｆを横軸に、第２主成分ｇを縦軸にして、各細胞をプロットした例である。図３１のプロット結果で示されるように、第１主成分ｆと第２主成分ｇの散布図（主成分散布図）により、４種類の細胞集団はその特徴量に応じて容易に識別することのできる集団を形成した。これは主成分の分散が最も大きくなるように求めることにより（上記数式（７））、各細胞の特徴が明示できたことを示すものである。その結果、主成分散布図において未知の細胞（○で表示したｕｎｋｎｏｗｎ）が△で表示したＭＩＡ−ＰａＣａ細胞の集団に属すると判別することができた。実際に未知の細胞はＭＩＡ−ＰａＣａであったため、本実験による細胞判別は正しかったことが確認できた。

以上で説明した実施例１６は、抽出した多数のパラメータの全部また３つ以上であって抽出パラメータの一部を細胞判別に有効活用したい場合に特に好適である。例えば、判別したい細胞の種類が多くて多数のパラメータを用いて高い精度で判別すべき場合や、抽出した多数のパラメータから２つのパラメータを選択することが容易ではない場合等に、特に好適である。実施例１６では、抽出した多数のパラメータに対して主成分分析を行うことにより、当該多数のパラメータが細胞判別に適切に影響を及ぼうようにすることができる。主成分分析によれば、抽出した多数のパラメータのうち２つを選択する代わりに、当該多数のパラメータの全部または３つ以上の一部が適切に反映された２つの主成分により細胞判別を行うからである。

なお、以上の説明では、パラメータの数が７つである場合を例に挙げて説明したが、これに限らず、３つ以上のパラメータであれば本実施例を適用することができる。重複するため説明を省略するが、実際１０個のパラメータを用いて上記実験と同様の実験を行った結果、７つのパラメータを用いた場合と同様の結果が得られた。

１，１Ａ…細胞観察装置、１０，１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃ，１０Ｄ…画像取得部、２０…処理部、４０，４０Ａ，４０Ｂ，４０Ｃ…画面、１０１…細胞、１０２，１０２Ａ，１０２Ｂ…容器、１０３…培養空間、１０４，１０４Ａ…対物レンズ、１０５…定量位相計測用光源、１０５Ａ…定量位相シャッタ、１０５Ｂ…照明光絞り部、１０６…反射干渉計測用光源、１０６Ａ…反射干渉シャッタ、１０７，１０７Ａ…ハーフミラー、１０８…参照光カット装置、１０８Ａ…参照光シャッタ、１０８Ｂ…ピンホール、１０８Ｃ…ピンホール、１０９…全反射ミラー、１１０…カメラ、１１１…回折型干渉光学系、１１１Ａ…回折素子、１１１Ｂ…光路、１１３…リングスリット、１１４…反射防止コート、１１５…培養液、１１６…観察窓、１１７…反射防止コート、１１８Ｇ…定量位相計測における照明光のための光路、１１９Ｇ…定量位相計測における参照光のための光路、１２０Ｇ，１２２Ｇ，１２３Ｇ…レンズ、１２１Ｇ…ハーフミラー、１２４Ｈ…電動フォーカス装置、２０１…画像受信部、２０２…輪郭抽出部、２０３…輪郭適用部、２０４…第１抽出部、２０５…第２抽出部、２０６…第３抽出部、２０７…解析部、２０８…リファレンス記憶部、２０９…光源制御部。

本発明は、細胞の状態を適切に判別・評価するためのより多くの情報を得ることを可能とする細胞観察装置および細胞観察方法を提供する。

Claims (13)

1. 反射干渉計測用光源と、
   前記反射干渉計測用光源から放射される光の光量を調整する反射干渉光量調整手段と、
   定量位相計測用光源と、
   前記定量位相計測用光源から放射される光の光量を調整する定量位相光量調整手段と、
   前記反射干渉計測用光源から放射され、細胞から反射される反射光を撮像することにより、反射干渉画像を生成するとともに、前記定量位相計測用光源から放射され、前記細胞を透過する透過光を撮像することにより、定量位相画像を生成する撮像手段と、
   前記撮像手段が生成した前記反射干渉画像より第１パラメータを抽出する第１抽出手段と、
   前記撮像手段が生成した前記定量位相画像より第２パラメータを抽出する第２抽出手段と、
   前記定量位相画像に基づき、前記細胞の輪郭を抽出する輪郭抽出手段と、
   前記輪郭抽出手段が抽出した前記輪郭を前記反射干渉画像に適用することにより、輪郭適用後の反射干渉画像を生成する輪郭適用手段と、
   前記輪郭適用後の反射干渉画像より、前記細胞の前記輪郭の中での、前記細胞が置かれている基板と前記細胞との間の接着状態に基づく情報である第３パラメータを抽出する第３抽出手段と、
   を備え、
   前記反射干渉画像を生成する際に、前記定量位相光量調整手段が前記定量位相計測用光源からの光を遮光し、前記撮像手段が前記反射光を撮像し、
   前記定量位相画像を生成する際に、前記反射干渉光量調整手段が前記反射干渉計測用光源からの光を遮光し、前記撮像手段が前記透過光を撮像する、
   ことを特徴とする細胞観察装置。
2. 前記反射干渉光量調整手段は、前記反射干渉計測用光源から放射される光の光量を調整するシャッタであり、
   前記定量位相光量調整手段は、前記定量位相計測用光源から放射される光の光量を調整するシャッタである、
   ことを特徴とする請求項１に記載の細胞観察装置。
3. 前記反射干渉光量調整手段は、前記反射干渉計測用光源のＯＮ/ＯＦＦによる切り替えにより、前記反射干渉計測用光源から放射される光の光量を調整し、
   前記定量位相光量調整手段は、前記定量位相計測用光源のＯＮ/ＯＦＦによる切り替えにより、前記定量位相計測用光源から放射される光の光量を調整する、
   ことを特徴とする請求項１に記載の細胞観察装置。
4. 前記定量位相画像を生成するために、前記透過光を物体光および参照光に分離して干渉させる干渉光学系と、
   前記反射干渉画像を生成する際に、前記参照光を遮光する参照光遮光手段と、
   を更に備えることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の細胞観察装置。
5. 前記反射干渉計測用光源と前記撮像手段との間および前記定量位相計測用光源と前記撮像手段との間に位置し、波長により反射対透過の比率を異ならせることが可能なミラーを更に備える、
   ことを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の細胞観察装置。
6. 前記第１パラメータは、前記基板と前記細胞との間の接着状態に基づく情報である、
   ことを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の細胞観察装置。
7. 前記第２パラメータは、前記細胞の光学的厚さ、面積、体積、または前記細胞内での屈折率の変化に基づく情報である、
   ことを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の細胞観察装置。
8. 予め既知の種類または状態の前記細胞に対して抽出したパラメータをリファレンスデータとして記憶するリファレンス記憶手段と、
   前記リファレンスデータに基づき、未知の細胞の種類または状態を判別する解析手段と、
   を更に備えることを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載の細胞観察装置。
9. 未知の細胞に対して抽出したパラメータの中から所定のパラメータを選択し、当該選択された所定のパラメータを用いて、前記未知の細胞の種類または状態を判別する解析手段を更に備える、
   ことを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載の細胞観察装置。
10. 前記第１抽出手段または前記第２抽出手段が３つ以上のパラメータを抽出した場合に、前記３つ以上のパラメータに対して主成分分析を行うことにより、未知の細胞の種類または状態を判別する解析手段を更に備える、
    ことを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載の細胞観察装置。
11. 前記反射干渉計測用光源から放射され前記細胞から反射される光が集光される対物レンズと、
    前記対物レンズの前記反射干渉計測用光源側の開口絞りと共役な位置に、リング状のスリットと、
    を更に備えることを特徴とする請求項１〜１０の何れか１項に記載の細胞観察装置。
12. 前記細胞を収容する容器を更に備え、
    前記容器の前記細胞の接着面の反対側に反射防止コートが施されている、
    ことを特徴とする請求項１〜１１の何れか１項に記載の細胞観察装置。
13. 撮像手段が、反射干渉計測用光源から放射され、細胞から反射される反射光を撮像することにより、反射干渉画像を生成するとともに、定量位相計測用光源から放射され、前記細胞を透過する透過光を撮像することにより、定量位相画像を生成する撮像ステップと、
    第１抽出手段が、前記撮像手段が生成した前記反射干渉画像より第１パラメータを抽出する第１抽出ステップと、
    第２抽出手段が、前記撮像手段が生成した前記定量位相画像より第２パラメータを抽出する第２抽出ステップと、
    輪郭抽出手段が、前記定量位相画像に基づき、前記細胞の輪郭を抽出する輪郭抽出ステップと、
    輪郭適用手段が、前記輪郭抽出手段が抽出した前記輪郭を前記反射干渉画像に適用することにより、輪郭適用後の反射干渉画像を生成する輪郭適用ステップと、
    第３抽出手段が、前記輪郭適用後の反射干渉画像より、前記細胞の前記輪郭の中での、前記細胞が置かれている基板と前記細胞との間の接着状態に基づく情報である第３パラメータを抽出する第３抽出ステップと、
    を備え、
    前記撮像ステップでは、前記反射干渉画像を生成する際に、定量位相光量調整手段が前記定量位相計測用光源からの光を遮光し、前記撮像手段が前記反射光を撮像し、
    前記撮像ステップでは、前記定量位相画像を生成する際に、反射干渉光量調整手段が前記反射干渉計測用光源からの光を遮光し、前記撮像手段が前記透過光を撮像する、
    ことを特徴とする細胞観察方法。