JP5708878B2 - バイオセンサおよびその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、作用極および対極を含む電極系が設けられた電極層と、キャビティを形成するためのスリットが形成されて電極層に積層されるスペーサ層と、キャビティに連通する空気穴が形成されてスペーサ層に積層されるカバー層と、作用極および対極に設けられた反応層とを備える、バイオセンサおよびその製造方法に関する。

図１０の従来のバイオセンサに示すように、作用極５０１および対極（図示省略）と参照極５０２とを含む電極系と、測定対象物質と特異的に反応する酵素を含む酵素層５０３ａおよびメディエータを含むメディエータ層５０３ｂから成る反応層とを有するバイオセンサ５００を用いて、試料に含まれる測定対象物質と反応層とが反応することで生成される還元物質を作用極５０１と対極との間に電圧を印加して酸化することにより得られる酸化電流を計測することで測定対象物質の定量を行う物質の測定方法が知られている（例えば特許文献１参照）。

図１０に示すバイオセンサ５００は、ポリエチレンテレフタレートやポリイミドなどの絶縁性基板に電極が設けられて形成された電極層５０４と、電極層に設けられた各電極間の短絡を防止するための絶縁体層５０５と、カバー層５０６とが積層されて形成される。また、電極層５０４にメディエータ層５０３ｂが設けられ、カバー層５０６に酵素層５０３ａが設けられており、電極層５０４とカバー層５０６とが、それぞれに設置された両面テープから成る接着層５０８により互いに貼りあわされることで、酵素層５０３ａおよびメディエータ層５０３ｂが分離して互いに離隔した状態で配置されている。

また、電極層５０４には、作用極５０１および対極と参照極５０２とが設けられ、これらの電極５０１，５０２にそれぞれ電気接続される電極パターンが設けられることにより電極層５０４に電極系が形成されている。

そして、酵素層５０３ａおよびメディエータ層５０３ｂが対向する空間内に液体から成る試料が供給されると、供給された試料が各電極５０１，５０２および反応層に接触すると共に、反応層が試料に溶解する。

また、カバー層５０６に設けられた酵素層５０３ａには、試料に含まれるグルコースに特異的に反応するグルコースオキシダーゼおよび親水性高分子が含まれている。また、作用極５０１および対極上に設けられたメディエータ層５０３ｂには、メディエータ（電子受容体）としてのフェリシアン化カリウムおよび親水性高分子が含まれている。そして、酵素層５０３ａおよびメディエータ層５０３ｂそれぞれに含まれる親水性高分子により、各層５０３ａ，５０３ｂの剥離が防止されている。

また、フェリシアン化カリウムが試料に溶解することによるフェリシアン化イオンは、グルコースオキシダーゼと反応してグルコースがグルコノラクトンに酸化される際に放出される電子により還元体であるフェロシアン化イオンに還元される。したがって、バイオセンサ５００にグルコースを含む試料が供給されると、フェリシアン化イオンはグルコースが酸化されることにより放出される電子により還元されるため、試料に含まれて酵素反応により酸化されるグルコースの濃度に応じた量だけフェリシアン化イオンの還元体であるフェロシアン化イオンが生成される。

このよう構成されたバイオセンサ５００では、酵素反応の結果生じたメディエータの還元体を作用極５０１上で酸化することにより得られる酸化電流が試料中のグルコース濃度に依存した大きさとなるため、この酸化電流を計測することにより試料に含まれるグルコースの定量を行うことができる。

特開２００９−２４４０１２号公報（段落００１６〜００９２、図１，２、要約書など）

ところで、酵素層５０３ａに含まれる酵素とメディエータ層５０３ｂに含まれるメディエータとがバイオセンサ５００の保管状態において反応することにより、メディエータが経時的に還元されるため、バイオセンサ５００を用いた測定対象物質の測定精度が劣化するおそれがある。そこで、上記したバイオセンサ５００では、反応層を形成する酵素層５０３ａおよびメディエータ層５０３ｂが分離して互いに離隔された状態で配置されることにより、酵素によるメディエータの還元が防止されている。しかしながら、このように構成すると、バイオセンサ５００が長期間保管されることにより酵素およびメディエータが反応して反応層が劣化するのを防止できる一方で、電極層５０４およびカバー層５０６それぞれに個別にメディエータ層５０３ｂおよび酵素層５０３ａを形成しなければならず手間がかかり、製造コストの増大を招いていた。

また、酵素層５０３ａおよびメディエータ層５０３ｂそれぞれに含まれる親水性高分子は、各層５０３ａ，５０３ｂの剥離を防止したり、例えば血液試料がバイオセンサ５００に供給された場合に、血液試料を濾過して血球の移動を阻止することで、血液試料のヘマトクリット値が測定に与える影響を抑制する機能を有している。その一方で、親水性高分子はメディエータ層５０３ｂに含まれるメディエータを還元することが知られている。例えばバイオセンサ５００が長期間保管されることにより、親水性高分子によるメディエータの還元が徐々に進み、上記した酸化電流を測定する際に、親水性高分子により還元されたメディエータの還元体が酸化することによる酸化電流もバックグランド電流として、測定対象である酸化電流と一緒に測定されるので、測定精度が劣化する。

したがって、従来では、バイオセンサ５００に使用期限を設け、使用期限を過ぎて長期間保管されたバイオセンサ５００は測定精度が劣化するため廃棄されており、試料に含まれる測定対象物質の測定において、ランニングコストの増大を招いていた。以上のように、従来では、親水性高分子がメディエータに与える影響について十分な検討が為されていなかった。

本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、酵素層およびメディエータ層それぞれが酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含むことにより、長期間保管可能なバイオセンサ、ならびに当該バイオセンサを簡単に製造することができる技術を提供することを目的とする。

上記した目的を達成するために、本発明の第１態様は、絶縁性基板の一方面に作用極および対極を含む電極系が設けられた電極層と、スリットが形成されて、前記スリットが前記作用極および前記対極の先端側に配置されて前記電極層の前記一方面に積層されるスペーサ層と、前記電極層および前記スリットにより形成されて試料が供給されるキャビティと、前記キャビティに連通する空気穴が形成されて前記キャビティを被覆して前記スペーサ層に積層されるカバー層と、前記キャビティに露出する前記作用極および前記対極の先端側に設けられた反応層とを備えるバイオセンサの製造方法であって、測定対象物質と反応する酵素および酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む酵素層を形成する酵素層形成工程と、メディエータおよび酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含むメディエータ層を形成するメディエータ層形成工程とを有する反応層形成工程を備え、前 記反応層形成工程は、前記酵素層形成工程の前に実行される、酸素原子の二重結合を有す る親水性高分子を含む親水層を形成する親水層形成工程をさらに有することを特徴としている（請求項１）。

このように構成された発明では、スペーサ層のスリットにより形成されたキャビティに露出する作用極および対極の先端側に設けられる反応層は、測定対象物質と反応する酵素および酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む酵素層を形成する酵素層形成工程と、メディエータおよび酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含むメディエータ層を形成するメディエータ層形成工程とを有する反応層形成工程により形成される。したがって、酵素層およびメディエータ層が、電極層に設けられた作用極および対極の先端側に反応層として一緒に形成されるので、従来のように、カバー層および電極層それぞれに酵素層およびメディエータ層をそれぞれ個別に形成する必要がなく、簡単に反応層を形成することができる。

また、酵素および酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む酵素層と、メディエータおよび酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含むメディエータ層とが形成されることにより、酵素層に含まれる酵素およびメディエータ層に含まれるメディエータの周囲が酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子により囲まれると共に、酸素およびメディエータが分離された状態で反応層が形成される。本願発明者による鋭意検討の結果、親水性高分子が酸素原子の二重結合を有する場合に、酸素結合の二重結合を有する官能基がメディエータに対して求核攻撃することによりメディエータが還元されると考えられるため、このように構成すると、酵素およびメディエータの周囲が酸素原子の２重結合を有さない親水性高分子により囲まれた状態となるので、バイオセンサの保管状態において反応層に含まれるメディエータおよび酵素が接触するのを防止できると共に、メディエータが親水性高分子により還元されるのを抑制することができる。

したがって、本試薬構造を採用することにより長期期間保管可能なバイオセンサを簡単に製造することができる。

また、酵素層が形成された後にメディエータ層が形成されており、電極層により近い位置に酵素層が配置されている。酵素はメディエータより拡散速度が小さいので、電極近傍での酵素・メディエータ量が、メディエータの上に酵素が積層された場合より多くなり、センサの応答性と測定精度が向上する。

さらに、前記反応層形成工程は、前記酵素層形成工程の前に実行される、酸素原子の二 重結合を有する親水性高分子を含む親水層を形成する親水層形成工程をさらに有している 。このため、酵素層が形成される前に、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含む 親水層が親水層形成工程により形成されるが、一般的に、酸素原子の二重結合を有する親 水性高分子は、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子よりも血球等の移動を阻止す る効果が高い。したがって、電極層に設けられた親水層には、酸素原子の二重結合を有す る親水性高分子が含まれているため、バイオセンサのキャビティに例えば血液試料が供給 された場合に、親水層の親水性高分子により血液試料が効率よく濾過されて血液試料に含 まれる血球の移動が阻止されるので、血液試料のヘマトクリット値の差異に伴う測定精度 への影響を低減することができる。したがって、正確で信頼性の高いバイオセンサを提供 することができる。
また、前記反応層形成工程は、前記酵素層形成工程の後であって前記メディエータ層形成工程の前に実行される、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む第１中間層を形成する第１中間層形成工程をさらに有しているとよい（請求項２）。

このように構成すると、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む第１中間層が、酵素層とメディエータ層との間に第１中間層形成工程により形成されるため、酵素層に含まれる酵素がメディエータ層に含まれるメディエータに接触するのが第１中間層により防止されるので、酵素層に含まれる酵素とメディエータ層に含まれるメディエータとが反応するのをさらに抑制することができる。

また、前記反応層形成工程は、前記親水層形成工程の後であって前記酵素層形成工程の前に実行される、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む第２中間層を形成する第２中間層形成工程をさらに有しているとよい（請求項３）。

このように構成すると、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む第２中間層が、親水層と酵素層との間に第２中間層形成工程により形成されるため、親水層に含まれる酸素原子の二重結合を有する親水性高分子がメディエータ層に含まれるメディエータに接触するのが第２中間層により防止されるので、メディエータ層に含まれるメディエータが親水層の親水性高分子により還元されるのをさらに抑制することができる。
また、上記した目的を達成するために、本発明の第２態様は、絶縁性基板の一方面に作用極および対極を含む電極系が設けられた電極層と、スリットが形成されて、前記スリットが前記作用極および前記対極の先端側に配置されて前記電極層の前記一方面に積層されるスペーサ層と、前記電極層および前記スリットにより形成されて試料が供給されるキャビティと、前記キャビティに連通する空気穴が形成されて前記キャビティを被覆して前記スペーサ層に積層されるカバー層と、前記キャビティに露出する前記作用極および前記対極の先端側に設けられた反応層とを備えるバイオセンサの製造方法であって、測定対象物質と反応する酵素および酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む酵素層を形成する酵素層形成工程と、メディエータおよび酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含むメディエータ層を形成するメディエータ層形成工程とを有する反応層形成工程を備え、前記反応層形成工程は、前記酵素層形成工程の前に実行される、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含み前記メディエータの還元を抑制する還元抑制層を形成する還元抑制層形成工程をさらに有している（請求項４）。

また、前記酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールのうちの少なくとも１つを含むとよい（請求項５）。

このように構成すると、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールのうちの少なくとも１つが酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子として試薬層に含まれることにより、試薬層に含まれるメディエータが還元されるのを防止することができると共に、試薬層が親水層から剥離するのを防止することができるので、実用的な構成のバイオセンサを提供することができる。

また、前記酸素原子の二重結合を有する親水性高分子は、少なくともカルボキシメチルセルロース含むとよい（請求項６）。

このように構成すると、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子として少なくともカルボキシメチルセルロースを含む親水層を電極層上に設けることにより、親水層に積層される試薬層が剥離するのを防止することができる。また、バイオセンサのキャビティに例えば血液試料が供給された場合に、親水層の親水性高分子により血液試料が濾過されて血液試料に含まれる血球の移動が阻止されるので、血液試料のヘマトクリット値の差異に伴う測定精度への影響を低減することができる。
さらに、上記した目的を達成するために、本発明の第３態様は、絶縁性基板の一方面に作用極および対極を含む電極系が設けられた電極層と、スリットが形成されて、前記スリットが前記作用極および前記対極の先端側に配置されて前記電極層の前記一方面に積層されるスペーサ層と、前記電極層および前記スリットにより形成されて試料が供給されるキャビティと、前記キャビティに連通する空気穴が形成されて前記キャビティを被覆して前記スペーサ層に積層されるカバー層と、前記キャビティに露出する前記作用極および前記対極の先端側に設けられた反応層とを備えるバイオセンサであって、前記反応層では、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含み前記メディエータの還元を抑制する還元抑制層上に、測定対象物質と反応する酵素およびメディエータと、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む試薬層が設けられ、前記試薬層は、前記酵素および前記酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む酵素層と、前記メディエータおよび前記酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含むメディエータ層とを備えている（請求項７）。

本発明によれば、酵素層およびメディエータ層が、電極層に設けられた作用極および対極の先端側に反応層として一緒に形成されるので、従来のように、カバー層および電極層それぞれに酵素層およびメディエータ層をそれぞれ個別に形成する必要がなく、簡単に反応層を形成することができ、酵素層およびメディエータ層それぞれが酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含むことにより、保管状態において、酵素層に含まれる酵素と、メディエータ層に含まれるメディエータとの接触が抑制され、メディエータ層のメディエータが還元されるのが抑制されるため、長期期間保管可能なバイオセンサを簡単に製造することができる。

本発明の第１実施形態にかかるバイオセンサを示す図であって、（ａ）は分解斜視図、（ｂ）は斜視図である。 図１のバイオセンサのキャビティ部分の横断面図である。 本発明の第１実施形態にかかるバイオセンサの製造方法を示す図であって、（ａ），（b）はそれぞれ異なる工程を示す。 バイオセンサの保管期間とバックグランド電流との関係を示す図である。 本発明の第２実施形態にかかるバイオセンサのキャビティ部分の横断面図である。 本発明の第３実施形態にかかるバイオセンサのキャビティ部分の横断面図である。 バイオセンサの変形例のキャビティ部分の横断面図である。 本発明の第４実施形態にかかるバイオセンサのキャビティ部分の横断面図である。 バイオセンサの変形例のキャビティ部分の横断面図である。 従来のバイオセンサを示す図である。

＜第１実施形態＞
本発明の第１実施形態にかかるバイオセンサおよびこのバイオセンサの製造方法について図１〜図４を参照して説明する。

（バイオセンサの構成および製造方法）
図１は本発明の第１実施形態にかかるバイオセンサを示す図であって、（ａ）は分解斜視図、（ｂ）は斜視図である。図２は図１のバイオセンサのキャビティ部分の横断面図である。図３は本発明の第１実施形態にかかるバイオセンサの製造方法を示す図であって、（ａ），（ｂ）はそれぞれ異なる工程を示す。

この発明のバイオセンサ１００は、作用極１０１および対極１０２を含む電極系と、メディエータおよび測定対象物質と反応する酵素を含む反応層１０６とを有し、測定器（図示省略）に装着されて使用されるものである。すなわち、測定器に装着されたバイオセンサ１００の先端側に設けられたキャビティ１０３に供給された血液などの試料に含まれるグルコースなどの測定対象物質と、バイオセンサ１００に設けられた反応層１０６とが反応することで生成される還元物質を、作用極１０１と対極１０２との間に電圧を印加して酸化することにより得られる酸化電流を計測することで、試料に含まれる測定対象物質の定量が行われる。

すなわち、バイオセンサ１００は、図１および図２に示すように、それぞれ、セラミック、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料、ポリエチレンテレフタレートなどの絶縁性材料により形成された、作用極１０１および対極１０２を含む電極系が設けられた電極層１１０と、キャビティ１０３に連通する空気穴１０５が形成されたカバー層１３０と、キャビティ１０３を形成するためのスリット１０４が形成され、電極層１１０およびカバー層１３０に挟まれて配置されるスペーサ層１２０とが、試料導入口１０３ａが設けられる先端側が揃った状態で積層されて接着されることにより形成される。また、作用極１０１および対極１０２上には、試料に含まれるグルコースなどの測定対象物質と反応する酵素を含む反応層１０６が設けられている。そして、後端側から測定器の所定の挿入口に挿入されて装着されることで、バイオセンサ１００は測定器に装着される。

この実施形態では、電極層１１０は、ポリエチレンテレフタレートなどの絶縁性材料から成る絶縁性基板により形成される。また、電極層１１０を形成する絶縁性基板の一方面に、白金、金、パラジウムなどの貴金属やカーボン、銅、アルミニウム、チタン、ＩＴＯ、ＺｎＯなどの導電性物質から成る導電層が、スクリーン印刷やスパッタリング蒸着法により形成されている。そして、絶縁性基板の一方面に形成された導電層に、レーザ加工やフォトリソグラフィによるパターン形成が施されることにより、作用極１０１および対極１０２と、バイオセンサセンサチップ１００が測定器に装着されたときに、作用極１０１および対極１０２のそれぞれと測定器とを電気的に接続する電極パターン１０１ａ，１０２ａとを含む電極系が形成される。

また、作用極１０１および対極１０２は、それぞれの先端側が、キャビティ１０３に露出するように配置される。また、作用極１０１および対極１０２のそれぞれの後端側の電極パターン１０１ａ，１０２ａは、試料導入口１０３ａと反対側の電極層１１０の端縁であって、スペーサ層１２０が積層されない電極層１１０の端縁まで延伸されて形成される。

次に、上記したようにして形成された電極層１１０にスペーサ層１２０が積層される。スペーサ層１２０は、ポリエチレンテレフタレートなどの絶縁性材料から成る基板により形成され、基板の先端縁部のほぼ中央にキャビティ１０３を形成するためのスリット１０４が形成されている。そして、スリット１０４が、作用極１０１および対極１０２の先端側に配置されて、スペーサ層１２０が電極層１１０の一方面を部分的に被覆して積層されることにより、電極層１１０およびスリット１０４により試料が供給されるキャビティ１０３が形成される。

続いて、電極層１１０にスペーサ層１２０が積層されて形成されるキャビティ１０３部分が、プラズマにより洗浄処理された後に、反応層１０６が形成される。なお、プラズマ洗浄工程において使用されるプラズマは、酸素プラズマ、窒素プラズマ、アルゴンプラズマなど、プラズマによる金属活性化処理において使用される種々のプラズマを使用することができ、減圧プラズマであっても大気圧プラズマであってもよい。

図３（ａ），（ｂ）に示すように、反応層１０６は、カバー層１３０がスペーサ層１２０に積層される前に、キャビティ１０３に露出する作用極１０１および対極１０２の先端側に、酵素および酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含有する試薬２０２と、メディエータおよび酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含有する２０３とを順番に滴下することにより形成される。また、キャビティ１０４への血液などの試料の供給を円滑にするために、界面活性剤やリン脂質などの親水化剤がキャビティ１０４内壁に塗布される。

具体的には、反応層１０６は、電極層１１０上に酵素および酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む酵素層１０６ｂと、酵素層１０６ｂに積層され、メディエータおよび酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含むメディエータ層１０６ｃとを備え、反応層形成工程により次のようにして形成される。

すなわち、図３（ａ）に示すように、酵素および酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子としてメチルセルロースを含有する試薬２０２が滴下装置２００からキャビティ１０３に所定量滴下されて乾燥することにより酵素層１０６ｂが形成される（酵素層形成工程）。次に、図３（ｂ）に示すように、メディエータおよび酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子としてヒドロキシプロピルメチルセルロースを含有する試薬２０３が滴下装置２００からキャビティ１０３に所定量滴下されて乾燥することによりメディエータ層１０６ｃが形成されることにより（メディエータ層形成工程）、反応層１０６が形成される。

以上のように、この実施形態では、酵素層形成工程およびメディエータ層形成工程により本発明の「反応層形成工程」が構成されている。

また、酵素としては、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールエステラーゼ、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼなどを用いることができ、これらの酵素を検出したい測定対象物質（グルコース、乳酸、コレステロール、アルコール、ザルコシン、フルクトシルアミン、ピルビン酸、ヒドロキシ酪酸など）に応じて選択することで種々のセンサを形成することができる。

例えば、グルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼを用いれば血液試料中のグルコースを検出するグルコースセンサを形成でき、アルコールオキシダーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼを用いれば血液試料中のエタノールを検出するアルコールセンサを形成でき、乳酸オキシダーゼを用いれば血液試料中の乳酸を検出する乳酸センサを形成でき、コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとの混合物を用いれば総コレステロールセンサを形成できる。

また、メディエータとしては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、フェロセン誘導体、ベンゾキノン、キノン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体などを用いることができる。

また、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子として、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールなどを用いることができる。なお、試薬２０２，２０３それぞれに、酵素およびメディエータと一緒に混合される酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子は増粘剤として機能する。また、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子は、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。

また、親水化剤としては、ＴｒｉｔｏｎＸ１００（シグマアルドリッチ社製）、Ｔｗｅｅｎ２０（東京化成工業社製）、ビス（２−エチルヘキシル）スルホコハク酸ナトリウムなどの界面活性剤、レシチンなどのリン脂質を用いることができる。また、親水化剤は、上記したようにキャビティ１０４に塗布する以外に、試薬２０２，２０３それぞれに混合してキャビティ１０４に滴下したり、試薬層が形成された後にキャビティ１０４に滴下してもよい。また、試料に含まれるイオン濃度のばらつきを低減するために、リン酸などの緩衝剤を設けてもよい。

次に、反応層１０６がキャビティ１０３に形成された後に、ポリエチレンテレフタレートなどの絶縁性材料から成る基板により形成されたカバー層１３０が、スペーサ層１２０に積層されることにより、バイオセンサ１００が形成される。図１（ａ），（ｂ）に示すように、カバー層１３０には、スペーサ層１２０に積層されたときにキャビティ１０３と連通する空気穴１０５が形成されており、カバー層１３０は、キャビティ１０３を被覆してスペーサ層１２０に積層される。

なお、この実施形態では、バイオセンサ１００は、血液中のグルコースの定量を行うことを目的に形成されており、測定対象物質としてのグルコースと特異的に反応する酵素としてＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）を補酵素とするＧＤＨ（グルコースデヒドロゲナーゼ）（以下、ＦＡＤ−ＧＤＨと表記する）を含み、測定対象物であるグルコースとＦＡＤ−ＧＤＨとの反応により生成される電子により還元されて還元物質と成るメディエータとしてフェリシアン化カリウムを含む反応層１０６がキャビティ１０３に露出する作用極１０１および対極１０２の先端側に設けられている。

このように構成されたバイオセンサ１００では、先端の試料導入口１０３ａに血液から成る試料を接触させることにより、毛細管現象により試料が空気穴１０５に向かって吸引されてキャビティ１０３に試料が供給される。そして、キャビティ１０３に供給された試料に反応層１０６が溶解することにより、試料中の測定対象物質であるグルコースとＦＡＤ−ＧＤＨとの酵素反応により電子が放出され、放出された電子によりフェリシアン化イオンが還元されて還元物質であるフェロシアン化イオンが生成される。そして、反応層１０６が試料に溶解することによる酸化還元反応により生成された還元物質を、バイオセンサ１００の作用極１０１と対極１０２との間に電圧（例えば０．３Ｖ）を印加して電気化学的に酸化することにより、作用極１０１と対極１０２との間に流れる酸化電流を計測することで試料中のグルコースの定量が測定器において行われる。なお、バイオセンサ１００の作用極１０１と対極１０２との間に電圧が印加された後、３〜５秒後の電流値が酸化電流として計測される。

（バックグランド電流の比較例）
図４はバイオセンサの保管期間とバックグランド電流との関係を示す図であり、横軸が保管期間（ｈ）を示し、縦軸がバックグランド電流の大きさ（μＡ）を示す。また、同図中の◆は、酵素層１０６ｂおよびメディエータ層１０６ｃが酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含まない従来のバイオセンサのバックグランド電流を示し、同図中の■は、本実施形態のバイオセンサ１００のバックグランド電流を示す。なお、バックグランド電流の測定は、バックグランド電流測定用の試料をキャビティ１０３に供給した後、通常の手順と同様に酸化電流を計測することにより行った。

図４に示すように、バイオセンサの保管期間が長くなるのに伴い、従来のバイオセンサでは経時的にバックグランド電流が増大するのに対して、本実施形態のバイオセンサ１００ではバックグランド電流が増大するのが抑制されている。

以上のように、この実施形態によれば、スペーサ層１２０のスリット１０４により形成されたキャビティ１０３に露出する作用極１０１および対極１０２の先端側に設けられる反応層１０６は、測定対象物質であるグルコースと反応する酵素および酸素原子の二重結合を有さないメチルセルロースを含む酵素層１０６ｂを形成する酵素層形成工程と、メディエータおよび酸素原子の二重結合を有さないヒドロキシプロピルメチルセルロースを含むメディエータ層を形成するメディエータ層形成工程とを有する反応層形成工程により形成される。したがって酵素層１０６ｂおよびメディエータ層１０６ｃが、電極層１１０に設けられた作用極１０１および対極１０２の先端側に反応層１０６として一緒に形成されるので、従来のように、カバー層１３０および電極層１１０それぞれに酵素層１０６ｂおよびメディエータ層１０６ｃをそれぞれ形成する必要がなく、簡単に反応層１０６を形成することができる。

また、酵素および酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む酵素層１０６ｂと、メディエータおよび酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含むメディエータ層１０６ｃとが形成されることにより、酵素層１０６ｂに含まれる酵素およびメディエータ層１０６ｃに含まれるメディエータの周囲が酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子により囲まれると共に、酸素およびメディエータが分離された状態で反応層１０６が形成される。本願発明者による鋭意検討の結果、親水性高分子が酸素原子の二重結合を有する場合に、酸素結合の二重結合を有する官能基がメディエータに対して求核攻撃することによりメディエータが還元されると考えられるため、このように構成すると、酵素およびメディエータの周囲が酸素原子の２重結合を有さない親水性高分子により囲まれた状態となるので、バイオセンサ１００の保管状態において反応層１０６に含まれるメディエータおよび酵素が接触するのを防止できると共に、メディエータが親水性高分子により還元されるのを抑制することができる。

したがって、酵素層１０６ｂおよびメディエータ層１０６ｃそれぞれが酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含むことにより、保管状態において、酵素層１０６ｂが含む酵素とメディエータ層１０６ｃが含むメディエータとの反応が抑制されると共に、メディエータ層１０６ｃのメディエータが還元されるのが抑制されるため、長期期間保管可能なバイオセンサを簡単に製造することができる。

また、酵素層１０６ｂが形成された後にメディエータ層１０６ｃが形成されており、電極層１１１０により近い位置に酵素層１０６ｂが配置されているので、キャビティ１０３に供給された試料に溶解したメディエータが電極層１１０に向かって拡散する際に、酵素反応の結果、試料中のグルコースなどの測定対象物質が酸化されることにより放出された電子が豊富な酵素層１０６ｂを通過することになるため、電極層１１０に向かって拡散するメディエータが効率よく還元されるので実用的である。

また、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールのうちの少なくとも１つが酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子として試薬層に含まれることにより、試薬層に含まれるメディエータが還元されるのを防止することができると共に、試薬層が電極層１１０または親水層１０６ａから剥離するのを防止することができるので、実用的な構成のバイオセンサ１１０を提供することができる。

＜第２実施形態＞
本発明の第２実施形態にかかるバイオセンサの製造方法について図５を参照して説明する。図５は本発明の第２実施形態にかかるバイオセンサのキャビティ部分の横断面図である。この実施形態が上記した第１実施形態と異なるのは、図５に示すように、酵素層形成工程の後であってメディエータ層形成工程の前に実行される第１中間層形成工程において酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む試薬がキャビティ１０３に所定量滴下されて乾燥することにより、酵素層１０６ｂとメディエータ層１０６ｃとの間に、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む中間層１０６ｄ（第１中間層）がさらに形成される点である。その他の構成は上記した第１実施形態と同一であるため、その構成および動作の説明は同一符号を付すことにより省略する。

このように構成すると、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む中間層１０６ｄが、酵素層１０６ｂとメディエータ層１０６ｃとの間に第１中間層形成工程により形成されるため、酵素層１０６ｂに含まれる酵素がメディエータ層１０６ｃに含まれるメディエータに接触するのが中間層１０６ｄにより防止されるので、酵素層１０６ｂに含まれる酵素とメディエータ層１０６ｃに含まれるメディエータとが反応するのをさらに抑制することができる。

＜第３実施形態＞
本発明の第３実施形態にかかるバイオセンサの製造方法について図６を参照して説明する。図６は本発明の第３実施形態にかかるバイオセンサのキャビティ部分の横断面図である。この実施形態が上記した第１実施形態と異なるのは、図６に示すように、酵素層形成工程の前に実行される親水層形成工程において酸素原子の二重結合を有する親水性高分子としてカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む試薬がキャビティ１０３に所定量滴下されて乾燥することにより、酵素層１０６ｂが形成される前に電極層１１０上に親水層１０６ａが形成される点である。その他の構成は上記した第１実施形態と同一であるため、その構成および動作の説明は同一符号を付すことにより省略する。

このように構成すると、酵素層１０６ｂが形成される前に、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子（ＣＭＣ）を含む親水層１０６ａが親水層形成工程により形成されるが、一般的に、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子は、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子よりも血球等の移動を阻止する効果が高い。したがって、電極層１１０に設けられた親水層１０６ａには、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子が含まれているため、バイオセンサ１００のキャビティ１０３に例えば血液試料が供給された場合に、親水層１０６ａの親水性高分子により血液試料が効率よく濾過されて血液試料に含まれる血球の移動が阻止されるので、血液試料のヘマトクリット値の差異に伴う測定精度への影響を低減することができる。

したがって、正確で信頼性の高いバイオセンサ１００を提供することができる。また、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含む親水層１０６ａを電極層１１０上に設けることにより、親水層１０６ａに積層される酵素層１０６ｂが剥離するのを防止することができる。

なお、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子として、カルボニル基、アシル基、カルボキシル基、アルデヒド基、スルホ基、スルホニル基、スルホキシド基、トシル基、ニトロ基、ニトロソ基、エステル基、ケト基、ケテン基などを有するポリマーを用いることができる。また、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子は、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。

また、図７のバイオセンサの変形例のキャビティ部分の横断面図に示すように、図５のバイオセンサ１００において、酵素層１０６ｂが形成される前に親水層形成工程により親水層１０６ａを電極層１１０上に形成してもよい。このように構成しても同様の効果を奏することができる。

＜第４実施形態＞
本発明の第４実施形態にかかるバイオセンサの製造方法について図８を参照して説明する。図８は本発明の第４実施形態にかかるバイオセンサのキャビティ部分の横断面図である。この実施形態が上記した第３実施形態と異なるのは、図８に示すように、親水層形成工程の後であって酵素層形成工程の前に実行される第２中間層形成工程において酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む試薬がキャビティ１０３に所定量滴下されて乾燥することにより、親水層１０６ａと酵素層１０６ｂとの間に、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む中間層１０６ｄ（第２中間層）がさらに形成される点である。その他の構成は上記した第１実施形態と同一であるため、その構成および動作の説明は同一符号を付すことにより省略する。

このように構成すると、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む中間層１０６ｄが、親水層１０６ａと酵素層１０６ｂとの間に第２中間層形成工程により形成されるため、親水層１０６ａに含まれる酸素原子の二重結合を有する親水性高分子がメディエータ層１０６ｃに含まれるメディエータに接触するのが中間層１０６ｄにより防止されるので、メディエータ層１０６ｃに含まれるメディエータが親水層１０６ａの親水性高分子により還元されるのを抑制することができる。

また、図９のバイオセンサの変形例のキャビティ部分の横断面図に示すように、図７のバイオセンサ１００において、酵素層１０６ｂが形成される前に第２中間層形成工程により、親水層１０６ａ上に中間層１０６ｄを形成してもよい。このように構成しても同様の効果を奏することができる。

なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて、上記したもの以外に種々の変更を行なうことが可能であり、例えば、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を、複数種類組み合わせて適切に混合することにより、血液試料中の血球の移動を効果的に阻止したり、酵素層およびメディエータ層の拡散、混合が低減されてメディエータの還元を抑制する抑制効果を奏することができる。

また、上記したバイオセンサ１００の反応層１０６に含まれる酵素およびメディエータの組合せを変更することによりエタノールセンサや乳酸センサなどを形成してもよい。

また、上記した実施形態では、バイオセンサ１００は、作用極１０１および対極１０２を有する二極電極構造に形成されているが、参照極をさらに設けることによりバイオセンサ１００を三極電極構造に形成してもよい。この場合、対極１０２を接地して電圧出力部により参照極に参照電位を印加した状態で、作用極１０１に対極１０２を基準とする所定電位を印加すればよい。

また、上記した実施形態では、作用極１０１と対極１０２との間に所定電圧を印加することにより、作用極１０１と対極１０２との間に流れる電流を監視することで、キャビティ１０３に血液試料が供給されたことが検出されるが、キャビティ１０３に試料が供給されたことを検知するための検知用電極をさらに設けてもよい。この場合、対極１０２と検知用電極との間に所定電圧を印加することにより、対極１０２と検知用電極との間に流れる電流を監視することで、キャビティ１０３に試料が供給されたことを検出すればよい。

また、バイオセンサ１００を形成する電極層１１０、スペーサ層１２０およびカバー層１３０のうち、少なくともカバー層１３０は、キャビティ１０３に血液試料が供給されたことを視認できるように透明な部材で形成するのが望ましい。

作用極および対極を含む電極系が設けられた電極層と、キャビティを形成するためのスリットが形成されて電極層に積層されるスペーサ層と、キャビティに連通する空気穴が形成されてスペーサ層に積層されるカバー層と、作用極および対極に設けられた反応層とを備えるバイオセンサに本発明を広く適用することができる。

１００ バイオセンサ
１０１ 作用極
１０２ 対極
１０３ キャビティ
１０４ スリット
１０５ 空気穴
１０６ 反応層
１０６ａ 親水層
１０６ｂ 酵素層
１０６ｃ メディエータ層
１０６ｄ 中間層（第１中間層、第２中間層）
１１０ 電極層
１２０ スペーサ層
１３０ カバー層

Claims (7)

1. 絶縁性基板の一方面に作用極および対極を含む電極系が設けられた電極層と、
   スリットが形成されて、前記スリットが前記作用極および前記対極の先端側に配置されて前記電極層の前記一方面に積層されるスペーサ層と、
   前記電極層および前記スリットにより形成されて試料が供給されるキャビティと、
   前記キャビティに連通する空気穴が形成されて前記キャビティを被覆して前記スペーサ層に積層されるカバー層と、
   前記キャビティに露出する前記作用極および前記対極の先端側に設けられた反応層とを備えるバイオセンサの製造方法において、
   測定対象物質と反応する酵素および酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む酵素層を形成する酵素層形成工程と、
   メディエータおよび酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含むメディエータ層を形成するメディエータ層形成工程と
   を有する反応層形成工程を備え、
   前記反応層形成工程は、前記酵素層形成工程の前に実行される、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含む親水層を形成する親水層形成工程をさらに有することを特徴とする、バイオセンサの製造方法。
2. 前記反応層形成工程は、前記酵素層形成工程の後であって前記メディエータ層形成工程の前に実行される、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む第１中間層を形成する第１中間層形成工程をさらに有することを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサの製造方法。
3. 前記反応層形成工程は、前記親水層形成工程の後であって前記酵素層形成工程の前に実行される、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む第２中間層を形成する第２中間層形成工程をさらに有することを特徴とする請求項１または２に記載のバイオセンサの製造方法。
4. 絶縁性基板の一方面に作用極および対極を含む電極系が設けられた電極層と、
   スリットが形成されて、前記スリットが前記作用極および前記対極の先端側に配置されて前記電極層の前記一方面に積層されるスペーサ層と、
   前記電極層および前記スリットにより形成されて試料が供給されるキャビティと、
   前記キャビティに連通する空気穴が形成されて前記キャビティを被覆して前記スペーサ層に積層されるカバー層と、
   前記キャビティに露出する前記作用極および前記対極の先端側に設けられた反応層とを備えるバイオセンサの製造方法において、
   測定対象物質と反応する酵素および酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む酵素層を形成する酵素層形成工程と、
   メディエータおよび酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含むメディエータ層を形成するメディエータ層形成工程と
   を有する反応層形成工程を備え、
   前記反応層形成工程は、前記酵素層形成工程の前に実行される、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含み前記メディエータの還元を抑制する還元抑制層を形成する還元抑制層形成工程をさらに有する、バイオセンサの製造方法。
5. 前記酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールのうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載のバイオセンサの製造方法。
6. 前記酸素原子の二重結合を有する親水性高分子は、少なくともカルボキシメチルセルロース含むことを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載のバイオセンサの製造方法。
7. 絶縁性基板の一方面に作用極および対極を含む電極系が設けられた電極層と、
   スリットが形成されて、前記スリットが前記作用極および前記対極の先端側に配置されて前記電極層の前記一方面に積層されるスペーサ層と、
   前記電極層および前記スリットにより形成されて試料が供給されるキャビティと、
   前記キャビティに連通する空気穴が形成されて前記キャビティを被覆して前記スペーサ層に積層されるカバー層と、
   前記キャビティに露出する前記作用極および前記対極の先端側に設けられた反応層とを備えるバイオセンサにおいて、
   前記反応層では、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含み前記メディエータの還元を抑制する還元抑制層上に、測定対象物質と反応する酵素およびメディエータと、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む試薬層が設けられ、
   前記試薬層は、
   前記酵素および前記酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む酵素層と、
   前記メディエータおよび前記酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含むメディエータ層と
   を備える、バイオセンサ。

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