JP5639665B2 - Ｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼのクロモン阻害剤 - Google Patents

Description

[0001] 本発明は、Ｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼの新規クロモン阻害剤、かかる阻害剤を含んでなる医薬組成物、それらを作製して使用する方法に関する。

[0002] 一酸化窒素という化合物は、化学式がＮＯの気体である。ＮＯは、生体系において知られている数少ない気体シグナル伝達分子の１つであり、様々な生体事象を制御するのに重要な役割を担っている。例えば、内皮は、ＮＯを使用して、細動脈壁の周囲にある平滑筋へ弛緩するシグナルを伝達して、血管拡張と低酸素組織への血流増加をもたらす。ＮＯは、平滑筋増殖、血小板機能、神経伝達を調節することにも関与して、宿主防御においてある役割を担っている。一酸化窒素はきわめて反応性で、数秒の存続時間を有するが、膜を通って自由に拡散することも、多くの分子標的へ結合することもできる。これらの特性により、ＮＯは、隣接細胞間と細胞内部の生体事象を制御することが可能な理想のシグナル伝達分子となっている。

[0003] ＮＯは、フリーラジカルの気体であり、それにより反応性で不安定となるので、ＮＯは、in vivo で短命で、生理学的条件下では３〜５秒の半減期を有する。酸素の存在時に、ＮＯは、チオールと結合して、Ｓ−ニトロソチオール（ＳＮＯ）と呼ばれる安定なＮＯ付加物の生物学的に重要な群を産生することができる。この安定したＮＯのプールは、生理活性ＮＯの供給源として作用すると仮定されて、細胞のホメオスタシスにおけるＮＯの中心性があるとすれば、それ自体として、健康や病気において決定的に重要であるらしい（Stamler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 7674-7677 (1992)）。タンパク質−ＳＮＯは、心臓血管、呼吸、代謝、胃腸、免疫、及び中枢神経系の機能において広汎な役割を担う（Foster et al., 2003, Trends in Molecular Medicine 第9巻、第4号、2003年4月、160-168 頁）。生体系において最も研究されているＳＮＯの１つは、Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ）であり（Gaston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10957-10961 (1993)）、効率的なトランスニトロソ化剤であって、細胞内の他のＳ−ニトロソ化タンパク質と平衡状態を維持しているらしい（Liu et al., 2001）ので、ＮＯシグナル伝達において新興の主要な調節因子である。ＮＯ−ＳＮＯ連続性におけるこのきわめて重要な位置があるとすれば、ＧＳＮＯは、ＮＯ調節が薬理学的に正当化されるときに考慮すべき療法上有望な標的を提供する。

[0004] ＮＯホメオスタシスと細胞ＳＮＯレベルの主要な調節因子としてのＧＳＮＯのこの理解の観点から、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）酵素によるＮＯラジカルの産生より下流で生じる、ＧＳＮＯ及びＳＮＯタンパク質の内因性の産生を検証することに諸研究が集中してきた。より最近になって、利用可能なＧＳＮＯの濃度と、必然的に利用可能なＮＯとＳＮＯを制御するのに重要な役割を有する、ＧＳＮＯの酵素的異化についての理解が増してきた。

[0005] このＧＳＮＯ異化反応の理解にとって重要なことに、研究者は、最近、高度に保存されたＳ−ニトロソグルタチオンレダクターゼ（ＧＳＮＯＲ）を同定した（Jensen et al., Biochem J., 331: 659-668 (1998); Liu et al., Nature, 410: 490-494 (2001)）。ＧＳＮＯＲは、グルタチオン依存型ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＧＳ−ＦＤＨ）、アルコールデヒドロゲナーゼ３（ＡＤＨクラス３）（Uotila and Koivusalo,「補酵素と補因子（Coenzymes and Cofactors）」D. Dolphin 監修、517-551 頁（ニューヨーク、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、1989)）、及びアルコールデヒドロゲナーゼ５（ＡＤＨ５）としても知られている。重要にも、ＧＳＮＯＲは、他の基質よりもＧＳＮＯに対してより大きな活性を示し（Jensen et al., 1998; Liu et al., 2001）、細菌、植物、及び動物において重要なタンパク質及びペプチド脱ニトロソ化活性に媒介するようである。ＧＳＮＯＲは、真核生物において主要なＧＳＮＯ代謝酵素であるらしい（Liu et al., 2001）。従って、ＧＳＮＯＲ活性が低いか又は非存在である生体コンパートメント（例、気道被覆液）では、ＧＳＮＯが蓄積する可能性がある（Gaston et al., 1993）。

[0006] ＧＳＮＯＲが欠乏している酵母では、この酵素の基質ではないＳ−ニトロシル化タンパク質が蓄積するが、このことは、ＧＳＮＯがＳＮＯ−タンパク質と平衡して存在することを強く示唆する（Liu et al., 2001）。ＧＳＮＯと、従ってＳＮＯ−タンパク質の周囲レベルに対する正確な酵素的制御があることは、生理学的要求を超過してＮＯが産生されるニトロソ化ストレスに抗する保護を含めて、一群の生理学的及び病理学的機能にわたって、ＧＳＮＯ／ＧＳＮＯＲが種々の役割を担い得るとする可能性を提起する。実際、ＧＳＮＯは、呼吸の促進（Lipton et al., Nature, 413:171-174 (2001)）から、嚢胞性線維症の膜貫通調節因子の調節（Zaman et al., Biochem Biophys Res Commun, 284:65-70 (2001)）、血管緊張、血栓症、及び血小板機能の調節（de Belder et al., Cardiovasc Res. 1994 May; 28(5):691-4. (1994)；Z. Kaposzta, A et al., Circulation; 106 (24): 3057-3062, 2002）、並びに宿主防御（de Jesus-Berrios et al., Curr. Biol., 13: 1963-1968 (2003)）に及ぶ生理学的プロセスへの関与が特に示唆されている。他の研究は、ＧＳＮＯＲが in vitro（Liu et al., 2001）と in vivo（de Jesus-Berrios et al., 2003）の両方で酵母細胞をニトロソ化ストレスに対して保護することを見出した。

[0007] まとめると、これまでのデータは、ＧＳＮＯＲが、ＧＳＮＯを異化して、必然的に、生体系において利用可能なＳＮＯ及びＮＯを低下させる、酵素：ニトロソグルタチオンレダクターゼ（ＧＳＮＯＲ）の主要な生理学的リガンドであることを示唆している（Liu et al., 2001）、（Liu et al., Cell, (2004), 116(4), 617-628）、及び（Que et al., Science, 2005, 308, (5728): 1618-1621）。それ自体として、この酵素は、局所及び全身の生理活性ＮＯを調節することに中心的な役割を担っている。ＮＯバイオアベイラビリティの混乱は、高血圧症、アテローム性動脈硬化症、血栓症、喘息、胃腸障害、炎症、及び癌が含まれる数多くの疾患状態の病理発生に関連付けられてきたので、ＧＳＮＯＲ活性を調節する薬剤は、一酸化窒素の不均衡に関連した疾患を治療するための候補療法剤となる。

[0008] 現在、当該技術分野では、増加したＮＯ合成及び／又は増加したＮＯ生理活性に関連する医学的状態への診断薬、予防法、改善手段、及び治療法への大きなニーズがある。さらに、他のＮＯ関連障害を予防する、改善する、又は逆転させるための新規な化合物、組成物、及び方法への有意なニーズがある。本発明は、上記のニーズを満足させる。

Stamler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 7674-7677 (1992) Foster et al., 2003, Trends in Molecular Medicine 第9巻、第4号、2003年4月、160-168 頁 Gaston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10957-10961 (1993) Liu et al., Nature, 410: 490-494 (2001) Jensen et al., Biochem J., 331: 659-668 (1998) Uotila and Koivusalo,「補酵素と補因子（Coenzymes and Cofactors）」D. Dolphin 監修、517-551 頁（ニューヨーク、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、1989) Lipton et al., Nature, 413:171-174 (2001) Zaman et al., Biochem Biophys Res Commun, 284:65-70 (2001) de Belder et al., Cardiovasc Res. 1994 May; 28(5):691-4. (1994) Z. Kaposzta, A et al., Circulation; 106 (24): 3057-3062, 2002 de Jesus-Berrios et al., Curr. Biol., 13: 1963-1968 (2003) Liu et al., Cell, (2004), 116(4), 617-628 Que et al., Science, 2005, 308, (5728): 1618-1621

[0009] 本発明は、Ｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼ（「ＧＳＮＯＲ」）阻害剤として有用な新規クロモン化合物を提供する。本発明には、記載のＧＳＮＯＲ阻害剤の医薬的に許容される塩、プロドラッグ、及び代謝産物が含まれる。また本発明に含まれるのは、少なくとも１つのＧＳＮＯＲ阻害剤と少なくとも１つの医薬的に許容される担体を含んでなる医薬組成物である。

[0010] 本発明の組成物は、どの好適な医薬的に許容される剤形でも製造することができる。
[0011] 本発明は、Ｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼを阻害することを必要とする被検者においてそれをするための方法を提供する。そのような方法は、少なくとも１つのＧＳＮＯＲ阻害剤又はその医薬的に許容される塩、そのプロドラッグ又は代謝産物を少なくとも１つの医薬的に許容される担体と組み合わせて含んでなる医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。ＧＳＮＯＲ阻害剤は、本発明による新規化合物であっても、ＧＳＮＯＲの阻害剤であることがこれまで知られていなかった既知の化合物であってもよい。

[0012] 本発明はまた、ＮＯドナー療法によって改善される障害を治療することを必要とする被検者においてそれをする方法を提供する。そのような方法は、少なくとも１つのＧＳＮＯＲ阻害剤、又はその医薬的に許容される塩、プロドラッグ、又はその代謝産物を少なくとも１つの医薬的に許容される担体と組み合わせて含んでなる医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。ＧＳＮＯＲ阻害剤は、本発明による新規化合物であっても、ＧＳＮＯＲの阻害剤であることがこれまで知られていなかった既知の化合物であってもよい。

[0013] 本発明はまた、細胞増殖性障害を治療することを必要とする被検者においてそれをする方法を提供する。そのような方法は、少なくとも１つのＧＳＮＯＲ阻害剤、又はその医薬的に許容される塩、プロドラッグ、又はその代謝産物を少なくとも１つの医薬的に許容される担体と組み合わせて含んでなる医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。ＧＳＮＯＲ阻害剤は、本発明による新規化合物であっても、ＧＳＮＯＲの阻害剤であることがこれまで知られていなかった既知の化合物であってもよい。

[0014] 本発明の方法には、１以上の第二の活性薬剤での投与が含まれる。そのような投与は、連続的であるか又は組合せ組成物中であり得る。
[0015] 本発明の実施又は検証には、本明細書での記載に類似しているか又は同等である方法及び材料を使用することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書に言及するすべての公的に利用可能な出版物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。抵触がある場合は、種々の定義を含めて、本明細書が基準となる。

[0016] 以上の要約と以下の詳細な記載はともに例示的で説明的なものであり、特許請求されるような組成物及び方法のさらなる詳細を提供することを企図している。当業者には、以下の詳細な記載から、他の目的、利点、及び新規の特徴が容易に明らかになろう。

Ａ．発明の概説
[0017] 最近まで、Ｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼ（ＧＳＮＯＲ）は、ホルムアルデヒドグルタチオン付加物、Ｓ−ヒドロキシメチルグルタチオンを酸化することが知られていた。これまでＧＳＮＯＲは、様々な細菌、酵母、植物、及び動物において確認されて、十分に保存されている。大腸菌（E. oli）、パン酵母（S. cerevisiae）、及びマウスマクロファージからのこのタンパク質は、６０％以上のアミノ酸配列同一性を共有する。ＧＳＮＯＲの活性（即ち、ＮＡＤＨが必須補因子として存在するときのＳ−ニトロソグルタチオンの分解）は、大腸菌、マウスマクロファージ、マウス内皮細胞、マウス平滑筋細胞、酵母、及びヒトのヒーラ細胞、上皮細胞、及び単球細胞において検出されてきた。ヒトＧＳＮＯＲのヌクレオチド及びアミノ酸配列の情報は、米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）データベースより、登録番号Ｍ２９８７２，ＮＭ＿０００６７１の項目で入手することができる。マウスＧＳＮＯＲのヌクレオチド及びアミノ酸配列の情報は、ＮＣＢＩデータベースより、登録番号ＮＭ＿００７４１０の項目で入手することができる。ヌクレオチド配列では、開始部位と終結部位に下線が施されている。ＣＤＳは、コーディング配列を明示する。ＳＮＰは、一塩基多型を明示する。他の関連したＧＳＮＯＲのヌクレオチド及びアミノ酸の配列は、他の種のそれを含めて、米国特許出願：２００５／００１４６９７に見出すことができる。

[0018] 本発明により、ＧＳＮＯＲは、in vitro と in vivo で、Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ）及びタンパク質Ｓ−ニトロソチオール（ＳＮＯ）を代謝して、少量のＮＯドナー化合物の細胞内レベルを制御してタンパク質のニトロシル化が中毒レベルに達することを防ぐことによって、ＮＯ生理活性を調節するように機能することが示された。

[0019] このことに基づけば、この酵素の阻害により、ＮＯドナー療法が適用されるすべての疾患において生理活性が増強され、病理学的に増殖している細胞の増殖が阻害され、そしてそのことが有益である疾患においてＮＯ生理活性が高められることになる。

Ｂ．Ｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼ阻害剤
１．本発明の化合物
[0020] 本発明は、ＧＳＮＯＲの強力な阻害剤である医薬品を提供する。特に提供されるのは、以下に図示される構造（式Ｉ）を有する、ＧＳＮＯＲの阻害剤である置換クロモン類似体、又はその医薬的に許容される塩、立体異性体、又はプロドラッグである。

［式中、
Ｒ_１は、ＣＦ_３、ＣＦ_２Ｈ、ＣＦ_２ＣＨ_３、ＣＦ_２ＣＨ_２ＣＨ_３、メチル、イソプロピル、イソブチル、シクロペンチル、ＣＨ_２ＯＣＨ_３、ＳＣＨ_３、ベンジル、チオフェン−２−イル、及びチオフェン−３−イルからなる群より選択され；
Ｒ_２は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、メトキシ、及びシアノより選択され；そして
Ｒ_３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、及びメトキシより選択される］。

[0021] 本発明のさらなる側面では、Ｒ_１が、ＣＦ_３、ＣＦ_２Ｈ、及びＣＦ_２ＣＨ_３より選択され；そしてＲ_２が水素である。
[0022] 本発明のさらなる側面では、Ｒ_１が、ＣＦ_３、メチル、イソプロピル、及びイソブチルからなる群より選択され；そしてＲ_２とＲ_３がともに水素である。

[0023] 本発明のなお別の側面では、Ｒ_１が、ＣＦ_３、メチル、イソプロピル、イソブチル、ＣＦ_２Ｈ、ＣＦ_２ＣＨ_３、及びＣＦ_２ＣＨ_２ＣＨ_３からなる群より選択され；そしてＲ_２とＲ_３がともに水素である。

[0024] 本発明のさらなる側面では、式Ｉの好適な化合物に、限定されないが：
４−（２−（ジフルオロメチル）−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
４−（７−ヒドロキシ−２−（メトキシメチル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
４−（７−ヒドロキシ−２−イソプロピル−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
４−（２−シクロペンチル−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
４−（７−ヒドロキシ−２−メチル−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
４−（２−ベンジル−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（チオフェン−２−イル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（チオフェン−３−イル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
４−（７−ヒドロキシ−２−イソブチル−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
４−（７−ヒドロキシ−２−（メチルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
４−（６−クロロ−７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
４−（６−フルオロ−７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
２−フルオロ−４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
３−クロロ−４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
４−（２−（１，１−ジフルオロエチル）−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
４−（７−ヒドロキシ−６−メトキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
２−クロロ−４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
４−（２−（１，１−ジフルオロプロピル）−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）−３−メトキシ安息香酸；及び
４−（６−シアノ−７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸が含まれる。

[0025] さらに、本明細書に記載の組成物のいずれにおいても、１以上の化合物又は化合物の亜属が特別に除外される可能性がある。本発明の１つの態様では、４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸が特別に除外される。

[0026] 置換クロモン類似体は、ＧＳＮＯＲの強力な阻害剤である。本文脈で使用するように、「類似体」という用語は、クロモン核を保持する式Ｉの化合物と同様の化学構造及び機能を有する化合物を意味する。

[0027] ある置換基への結合が環中の２つの原子を連結する結合に交差するように示されるとき、このときそのような置換基は、環中のどの原子へも結合してよい。置換基が、所与の式の化合物の残り部分へそのような置換基が結合する原子を示さずに収載されるとき、このときそのような置換基は、そのような置換基中のどの原子を介しても結合してよい。置換基及び／又は可変基（variables）の組合せは、そのような組合せが安定な化合物をもたらしさえすれば、許容される。

[0028] 本発明のいくつかのクロモン類似体は、配置異性体、幾何異性体、及び配座異性体が含まれる、様々な異性型でも存在し得て、並びに、様々な互変異性型、特に水素原子の付加点が異なるものでも存在し得る。本明細書に使用するように、「異性体」という用語には、化合物の互変異性型を含めて、化合物のすべての異性型が含まれると企図される。示されるか又は記載される化合物のすべての互変異性体も、本発明の一部であるとみなされる。本発明の化合物のシス及びトランス幾何異性体が記載されて、異性体の混合物として、又は分離した異性型として単離され得る。本明細書に記載の化合物には、オレフィン、Ｃ＝Ｎ二重結合、等の多くの幾何異性体も存在し得て、本発明では、そのようなすべての安定な異性体が考慮される。特定の立体化学又は異性型が具体的に示されなければ、ある構造のすべてのキラル、ジアステレオマー、ラセミ、及び幾何異性型が企図される。

[0029] 本明細書に記載の化合物は、不斉中心を有する場合がある。不斉的に置換された原子を含有する本発明の化合物は、光学活性型又はラセミ型で単離することができる。当該技術分野では、ラセミ型の分割によるか又は光学活性の出発材料からの合成によるといった、光学活性型を製造する方法がよく知られている。

[0030] 他に示さなければ、そのような非対称性より生じる異性体（例、すべてのエナンチオマー及びジアステレオマー）が本発明の範囲内に含まれると理解されたい。そのような異性体は、模範的な分離技術によるか又は立体化学的に制御された合成によって、実質的に純粋な形態で入手することができる。さらに、本出願において考察される構造と他の化合物及び部分には、それらのすべての互変異性体も含まれる。アルケンには、Ｅ又はＺのいずれかのジオメトリーを適宜含めることができる。

[0031] 図示した構造とその構造へ付与される名称との間に矛盾があるならば、図示した構造が基準となることを銘記されたい。さらに、ある構造又は構造の一部の立体化学が、例えば、実線、楔形線、又は破線で示されていなければ、その構造又は構造の一部には、記載の化合物のすべての立体異性体が含まれると解釈されるべきである。

２．代表的なＧＳＮＯＲ阻害剤
[0032] 実施例１〜２１は、式Ｉの代表的な新規クロモン類似体を収載する。各化合物を製造するために使用し得る合成法については、実施例１の前に図示した合成スキームを参照にして、そして実施例２３に記載される中間体を参照にして、実施例１〜２１に詳しく記載する。実施例１〜２１には、各化合物の裏付けとなる質量分析法データとプロトンＮＭＲデータも含まれる。実施例２４に記載のアッセイによってＧＳＮＯＲ阻害剤の活性を定量して、ＩＣ_５０値を入手した。ＧＳＮＯＲ阻害化合物、実施例１〜２１は、約５μＭ未満のＩＣ_５０を有した。ＧＳＮＯＲ阻害化合物、実施例１、２、３、５、６、１０、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０は、約０．５μＭ未満のＩＣ_５０を有した。ＧＳＮＯＲ阻害化合物、実施例１、１０、１４、１５、１６、１８、及び２０は、約０．１μＭ未満のＩＣ_５０を有した。

Ｃ．定義
[0033] 本明細書に使用するように、「約」は、当業者によって理解されて、それが使用される文脈に依ってある程度変化する可能性がある。それが使用される文脈があっても、当業者に明らかでないこの用語の使用があるならば、「約」は、その特定用語のプラス又はマイナス１０％までを意味するものである。

[0034] 本明細書に使用するように、「生理活性」という用語は、生理学的又は病態生理学的プロセスに影響を及ぼし得る１以上の細胞又は細胞外プロセス（例えば、結合、シグナル伝達、等による）に対する効果を示す。

[0035] 本明細書に使用するように、そして他に示さなければ、「立体異性体」という用語は、化合物の他の立体異性体を実質的に含まない、該化合物の１つの立体異性体を意味する。例えば、１つのキラル中心を有する立体異性体的に純粋な化合物は、該化合物の対掌エナンチオマーを実質的に含まない。２つのキラル中心を有する立体異性体的に純粋な化合物は、該化合物の他のジアステレオマーを実質的に含まない。いくつかの態様において、立体異性体的に純粋な化合物は、約８０重量％以上の該化合物の１つの立体異性体と約２０重量％未満の該化合物の他の立体異性体、例えば、約９０重量％以上の該化合物の１つの立体異性体と約１０重量％未満の該化合物の他の立体異性体、又は約９５重量％以上の該化合物の１つの立体異性体と約５重量％未満の該化合物の他の立体異性体、又は約９７重量％以上の該化合物の１つの立体異性体と約３重量％未満の該化合物の他の立体異性体を含む。

[0036] 本明細書に使用するように、「タンパク質」は、「ペプチド」、「ポリペプチド」、又は「ペプチド断片」と同義で使用される。「精製された」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、又はペプチド断片は、そのアミノ酸配列が得られる細胞、組織、又は無細胞供給源からの細胞材料も他の混在タンパク質も実質的に含まないか、又は化学的に合成されるときは、化学前駆体も他の化学品も実質的に含まない。

[0037] 本明細書に使用するように、「調節する」は、ペプチド又はポリペプチドのレベルを増加又は減少させること、あるいはペプチド又はポリペプチドの安定性又は活性を増加又は減少させることに言及するものである。「阻害する」という用語は、ペプチド又はポリペプチドのレベルの減少、あるいはペプチド又はポリペプチドの安定性又は活性の減少に言及するものである。好ましい態様において、調節されるか又は阻害されるペプチドは、Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ）又はタンパク質Ｓ−ニトロソチオール（ＳＮＯ）である。

[0038] 本明細書に使用するように、「一酸化窒素」及び「ＮＯ」という用語には、無電荷の一酸化窒素と有電荷の一酸化窒素の種が含まれ、特に、ニトロソニウムイオン（ＮＯ^＋）とニトロキシルイオン（ＮＯ⁻）が含まれる。一酸化窒素の反応型は、気体の一酸化窒素によって提供され得る。構造：Ｘ−ＮＯ_ｙ（ここでＸは、一酸化窒素を放出、送達、又は移送する部分であり、ｙは１又は２である）を有する化合物には、一酸化窒素をその企図される作用部位へその企図される目的のために活性な形態で提供するありとあらゆるそのような化合物が含まれる。

[0039] 本明細書に利用するように、「医薬的に許容される」という用語は、動物、より特別にはヒトでの使用のために、連邦又は州政府の規制当局によって承認されているか又は米国薬局方又は他の一般的に認知されている薬局方に収載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬剤とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又は媒体を意味して、限定されないが、水及び油剤のような無菌の液剤が含まれる。

[0040] ＧＳＮＯＲ阻害剤の「医薬的に許容される塩」又は「塩」は、イオン結合を含有して、典型的には、酸又は塩基のいずれかと開示化合物を反応させることによって生成される、被検者への投与に適した、開示化合物の生成物である。医薬的に許容される塩には、限定されないが、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、アリールアルキルスルホン酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、及び酒石酸塩が含まれる酸付加塩；Ｌｉ、Ｎａ、Ｋのようなアルカリ金属カチオン、Ｍｇ又はＣａのようなアルカリ土類金属の塩、又は有機アミン塩を含めることができる。

[0041] 「医薬組成物」は、被検者への投与に適した形態で開示化合物を含んでなる製剤である。本発明の医薬組成物は、好ましくは、その企図される投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例には、限定されないが、経口及び非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、吸入、局所、経皮、経粘膜、及び直腸の投与が含まれる。

[0042] 「安定な化合物」と「安定な構造」は、反応混合物からの有用な純度までの単離と、有効な治療薬剤への製剤化に耐えるほどに十分に頑丈である化合物を示すものである。

[0043] 本明細書に使用するように、「治療有効量」という用語は、一般に、本明細書に記載のように予防、抑制、又は治療されるべき障害の少なくとも１つの症状を改善するのに必要な量を意味する。「治療有効量」という句は、本発明のＧＳＮＯＲ阻害剤に関する場合、そのような治療を必要とする有意数の被検者においてＧＳＮＯＲ阻害剤が投与されるための特定の薬理学的応答をもたらすＧＳＮＯＲ阻害剤の投与量を意味する。特別な例において特別な被検者へ投与されるＧＳＮＯＲ阻害剤の治療有効量は、たとえそのような投与量が当業者によって治療有効量であるとみなされるとしても、本明細書に記載の状態／疾患を治療するのにいつでも有効であるわけではないことが重要である。

[0044] 「生体試料」という用語には、限定されないが、血液（例、血清、血漿、又は全血）、尿、唾液、汗、母乳、膣分泌物、精液、毛包、皮膚、歯、骨、爪、又は他の分泌物、体液、組織、又は細胞の試料が含まれる。本発明によれば、生体試料中のＳ−ニトロソグルタチオンレダクターゼのレベルは、米国特許出願公開公報番号２００５／００１４６９７に記載の方法によって定量することができる。

Ｄ．ＧＳＮＯＲ阻害剤を含んでなる医薬組成物
[0045] 本発明には、本明細書に記載の少なくとも１つのＧＳＮＯＲ阻害剤と少なくとも１つの医薬的に許容される担体を含んでなる医薬組成物が含まれる。好適な担体については、参照により本明細書に組み込まれる「レミントン：科学と実践（Remington: The Science and Practice）」第２０版（出版元：リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス）に記載されている。本発明による医薬組成物は、１以上の非ＧＳＮＯＲ阻害活性薬剤も含んでよい。

[0046] 本発明の医薬組成物は、本明細書に記載の新規ＧＳＮＯＲ阻害剤を含むことができて、この医薬組成物は、ＧＳＮＯＲ阻害剤の活性を有することがこれまで知られていなかった既知の化合物、又はその組合せを含むことができる。

[0047] ＧＳＮＯＲ阻害剤は、限定されないが、注射可能な剤形、分散液剤、ゲル剤、エアゾール剤、軟膏剤、クリーム剤、凍結乾燥製剤、乾燥散剤、錠剤、カプセル剤、制御放出製剤、迅速融解製剤、遅延放出製剤、延長放出製剤、パルス放出製剤、即時放出及び制御放出混合製剤、等が含まれる、どの医薬的に許容される剤形でも利用することができる。具体的には、本明細書に記載のＧＳＮＯＲ阻害剤は：（ａ）経口、肺、静脈内、動脈内、鞘内、関節内、直腸、眼、結腸、非経口、槽内、膣内、腹腔内、局所、頬内、経鼻、及び局部投与からなる群より選択される投与用に；（ｂ）分散液剤、ゲル剤、エアゾール剤、軟膏剤、クリーム剤、錠剤、サシェ剤、及びカプセル剤からなる群より選択される剤形へ；（ｃ）凍結乾燥製剤、乾燥散剤、迅速融解製剤、制御放出製剤、遅延放出製剤、延長放出製剤、パルス放出製剤、並びに即時放出及び制御放出混合製剤より選択される剤形へ；又は（ｄ）これらのあらゆる組合せへ製剤化することができる。

[0048] 呼吸器感染症では、吸入製剤を使用して、高い局所濃度を達成することができる。吸入に適した製剤には、上気道及び下気道の細菌感染症を治療するために吸入器又はネブライザーによって被感染患者の気管支内腔又は鼻腔へ分散させることが可能である、乾燥散剤又はエアゾール化又は気化させた溶液剤、分散液剤、又は懸濁液剤が含まれる。

[0049] 非経口、皮内、又は皮下の適用に使用される溶液剤又は懸濁液剤は、以下の成分の１以上を含むことができる：（１）注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒のような無菌希釈剤；（２）ベンジルアルコール又はメチルパラベンのような抗菌剤；（３）アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；（４）エチレンジアミン四酢酸のようなキレート形成剤；（５）酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩のような緩衝剤；及び（６）塩化ナトリウム又はデキストロースのような浸透圧の調整用の薬剤。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムのような酸又は塩基で調整することができる。非経口調製品は、ガラス又はプラスチックから作られる、アンプル、使い捨てシリンジ、又は多用量バイアルに密封することができる。

[0050] 注射可能な使用に適した医薬組成物は、無菌水溶液剤（水溶性である場合）、又は無菌の注射可能な溶液剤又は分散液剤の用時調製用の分散剤及び無菌散剤を含み得る。静脈内投与に好適な担体には、生理食塩水溶液、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州パルシッパニー）、又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。すべての事例において、組成物は、無菌でなければならず、容易な注入可能性（syringability）が存在する程度まで流動的であるべきである。医薬組成物は、製造及び保存の条件下で安定であるべきで、細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に抗して保存されるべきである。

[0051] 担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール、等）、及びこれらの好適な混合物を含んでなる、溶媒又は分散媒体であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用によって、（分散液の場合は）必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、等によって達成することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、マンニトール又はソルビトールのようなポリアルコール、及び塩化ナトリウムのような無機塩類を組成物に含めることが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期化吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。

[0052] 無菌の注射可能な溶液剤は、必要とされる量の活性試薬（例、ＧＳＮＯＲ阻害剤）を、必要に応じて、上記に列挙した成分の１つ又は組合せとともに適正な溶媒に取り込むこと、それに続く濾過滅菌によって調製することができる。一般に、分散液剤は、基本の分散媒体と他の必要とされるあらゆる成分を含有する無菌担体へ少なくとも１つのＧＳＮＯＲ阻害剤を取り込むことによって調製する。無菌の注射可能な溶液剤の調製用の無菌散剤の場合、例示の調製法には、真空乾燥と凍結乾燥が含まれ、そのいずれも、先に無菌濾過したその溶液より、ＧＳＮＯＲ阻害剤＋所望されるあらゆる追加成分の散剤を産生する。

[0053] 一般に、経口組成物には、不活性希釈剤又は食用担体が含まれる。それらは、例えば、ゼラチンカプセルに被包するか又は錠剤へ圧縮することができる。経口療法上の投与の目的では、ＧＳＮＯＲ阻害剤を賦形剤とともに取り込んで、錠剤、トローチ剤、又はカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物はまた、洗口液としての使用のための液状担体を使用して調製し得て、ここでは液状担体中の化合物が経口的に適用されて口中で転がされて喀痰されるか、又は嚥下される。この組成物の一部として、医薬的に適合可能な結合剤、及び／又はアジュバント材料を含めることができる。

[0054] 吸入による投与では、化合物は、好適なデバイス由来の好適な推進剤（例、二酸化炭素のような気体、噴霧化液剤、又は乾燥散剤）を含有する加圧容器又はディスペンサーからのエアゾールスプレー剤の形態で送達される。経粘膜又は経皮投与では、浸透すべきバリアに適正な浸透剤を製剤中に使用する。当該技術分野では、そのような浸透剤が一般的に知られていて、例えば、経粘膜投与には、洗浄剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔スプレー剤又は坐剤の使用により達成することができる。経皮投与では、活性試薬を、当該技術分野で一般的に知られているような軟膏剤、軟膏、ゲル剤、又はクリーム剤へ製剤化する。この試薬はまた、坐剤（例えば、ココア脂や他のグリセリドのような慣用の坐剤基剤とともに）又は直腸送達用の停留浣腸剤の形態で調製することができる。

[0055] １つの態様において、ＧＳＮＯＲ阻害剤は、身体からの速やかな消失に抗して保護する担体とともに調製される。例えば、インプラントやマイクロカプセル化送達システムが含まれる、制御放出製剤を使用することができる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸のような生分解性、生体適合性のポリマーを使用することができる。このような製剤の製造の方法は、当業者に明らかであろう。この材料も、市販品より入手することができる。

[0056] リポソーム懸濁液剤（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体が付いた、被感染細胞へ標的指向されるリポソーム剤が含まれる）も医薬的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に知られた方法に従って製造することができる。

[0057] さらに、ＧＳＮＯＲ阻害剤の懸濁液剤は、適正な油性の注射懸濁液剤として調製してよい。好適な脂溶性の溶媒又は媒体には、ゴマ油のような脂肪オイル、又はオレイン酸エチル、トリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。非脂質ポリカチオン性アミノポリマーも送達用に使用してよい。この懸濁液剤には、化合物の溶解性を高めて高濃度溶液剤の調製を可能にするのに適した安定化剤又は薬剤を含めてもよい。

[0058] 経口又は非経口の組成物を単位剤形で製剤化することは、投与の容易さと投与量の均一性のために特に有利である。本明細書に使用する単位剤形は、治療される被検者への単位投与量として適した、物理的に別個の単位を意味して、各単位は、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量のＧＳＮＯＲ阻害剤を必要とされる医薬担体とともに含有する。本発明の単位剤形への仕様は、ＧＳＮＯＲ阻害剤の独自の特徴と達成すべき特別な治療効果、並びに、そのような活性薬剤を個体の治療のために調合することの当該技術分野に固有の限界によって支配されて、直接的に依存する。

[0059] 少なくとも１つのＧＳＮＯＲ阻害剤を含んでなる、本発明による医薬組成物は、１以上の医薬賦形剤を含むことができる。そのような賦形剤の例には、限定されないが、結合剤、充填剤、滑沢剤、懸濁剤、甘味剤、香味剤、保存剤、緩衝剤、湿潤剤、崩壊剤、発泡剤、及び他の賦形剤が含まれる。そのような賦形剤は、当該技術分野で知られている。例示の賦形剤には：（１）様々なセルロース及び架橋ポリビニルピロリドン、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０１及びＡｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０２のような微結晶性セルロース、珪化微結晶性セルロース（ＰｒｏＳｏｌｖ ＳＭＣＣ^ＴＭ）、トラガカントゴム、及びゼラチンが含まれる、結合剤；（２）様々なデンプン、乳糖、乳糖一水和物、及び無水乳糖のような充填剤；（３）アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、コーンスターチ、軽度架橋ポリビニルピロリドン、ジャガイモデンプン、とうもろこしデンプン、及び加工デンプン、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、デンプングリコール酸ナトリウム、及びこれらの混合物のような崩壊剤；（４）圧縮される散剤の流動可能性に作用する薬剤が含まれる滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、Ａｅｒｏｓｉｌ（登録商標）２００のようなコロイド状二酸化シリコン、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、及びシリカゲルが含まれる）；（５）コロイド状二酸化シリコンのような滑り剤；（６）ソルビン酸カリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸とその塩、ブチルパラベンのような他のパラヒドロキシ安息香酸エステル、エチル又はベンジルアルコールのようなアルコール類、フェノールのようなフェノール性化合物、又は塩化ベンザルコニウムのような四級化合物といった、保存剤；（７）微結晶性セルロース、乳糖、二塩基性リン酸カルシウム、サッカライド、及び／又は上記のいずれもの混合物といった医薬的に許容される不活性充填剤のような希釈剤；希釈剤の例には、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０１及びＡｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０２のような微結晶性セルロース；乳糖一水和物、無水乳糖、及びＰｈａｒｍａｔｏｓｅ（登録商標）ＤＣＬ２１のような乳糖；Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ（登録商標）のような二塩基性リン酸カルシウム；マンニトール；デンプン；ソルビトール；ショ糖；及びブドウ糖が含まれる；（８）ショ糖、サッカリンショ糖、キシリトール、サッカリンナトリウム、シクラメート、アスパルテーム、及びアセスルフェームのような、あらゆる天然又は人工甘味料が含まれる、甘味剤；（９）ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジフレーバリング、Ｍａｇｎａｓｗｅｅｔ（登録商標）（ＭＡＦＣＯの商標）、バブルガムフレーバー、フルーツフレーバー、等のような香味剤；並びに（１０）有機酸と炭酸塩又は重炭酸塩のような発泡性のカップルが含まれる、発泡剤。好適な有機酸には、例えば、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、フマル酸、アジピン酸、コハク酸、及びアルギン酸と無水物、及び酸塩が含まれる。好適な炭酸塩及び重炭酸塩には、例えば、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、グリシン炭酸ナトリウム、炭酸Ｌ−リジン、及び炭酸アルギニンが含まれる。あるいは、発泡性カップルの重炭酸ナトリウム成分だけが存在してよい。

Ｅ．本発明の組成物を含んでなるキット
[0060] 本発明には、本発明の組成物を含んでなるキットも含まれる。そのようなキットは、例えば、（１）少なくとも１つのＧＳＮＯＲ阻害剤；及び（２）溶媒又は溶液のような、少なくとも１つの医薬的に許容される担体を含むことができる。追加のキット成分には、例えば：（１）安定化剤、緩衝剤、等のような、本明細書において明確化した医薬的に許容される賦形剤のあらゆるもの、（２）キット成分を保持及び／又は混合するための少なくとも１つの容器、バイアル、又は同様の器具；及び（３）吸入器、ネブライザー、シリンジ、等のような送達器具が含まれてもよい。

Ｆ．ＧＳＮＯＲ阻害剤を製造する方法
[0061] 本発明のＧＳＮＯＲ阻害剤は、既知の合成の方法論を使用して、又は既知の合成の方法論の変更により、容易に合成することができる。当業者に容易に認められるように、以下に記載の方法論は、多様な置換基を有するクロモンの合成を可能にする。以下の実施例において、例示の合成法を記載する。

[0062] 必要とされるならば、当該技術分野で知られた定型的な手段によって、エナンチオマー及びジアステレオマーのさらなる精製及び分離を達成することができる。このように、例えば、化合物のエナンチオマーの分離は、キラルＨＰＬＣと関連のクロマトグラフィー技術の使用によって達成することができる。ジアステレオマーも同様に分離することができる。しかしながら、いくつかの事例では、例えば、制御された沈殿化又は結晶化によるように、ジアステレオマーを単に物理的に分離させることができる。

[0063] 本発明の方法は、本明細書に記載のように行なわれるとき、簡便にも、当該技術分野で定型的に利用できる温度で実施することができる。１つの態様において、この方法は、約２５℃〜約１１０℃の範囲の温度で実施する。別の態様において、温度は、約４０℃〜約１００℃の範囲にある。なお別の態様において、温度は、約５０℃〜約９５℃の範囲にある。

[0064] 塩基を必要とする合成工程は、簡便な有機又は無機塩基を使用して行う。典型的には、この塩基は、求核性ではない。このように、１つの態様において、塩基は、炭酸塩、リン酸塩、水酸化物、アルコキシド、ジシラザンの塩、及び三級アミンより選択される。

[0065] 本発明の方法は、本明細書に記載のように実施されるとき、反応体の性質及び量と反応温度に依存して、数分後〜数時間後に実質的には完了している可能性がある。反応が実質的に完了しているときの決定は、簡便には、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣＭＳ、ＴＬＣ、及び^１Ｈ ＮＭＲのような、当該技術分野で知られた通常の技術によって評価することができる。

Ｇ．治療の方法
[0066] 本発明には、開示される化合物の１以上の使用を通して医学的状態を予防するか又は治療する（例えば、その１以上の症状を軽減する）方法が含まれる。この方法は、治療有効量のＧＳＮＯＲ阻害剤を必要とする患者へそれを投与することを含む。本発明の組成物は、予防療法へも使用することができる。

[0067] 本発明による治療の方法に使用されるＧＳＮＯＲ阻害剤は、（１）本明細書に記載の新規ＧＳＮＯＲ阻害剤、又はその医薬的に許容される塩、そのプロドラッグ、又はその代謝産物；（２）本発明に先立って知られていたが、ＧＳＮＯＲ阻害剤であることは知られていなかった化合物、又はその医薬的に許容される塩、そのプロドラッグ、又はその代謝産物；又は（３）本発明に先立って知られていて、ＧＳＮＯＲ阻害剤であることが知られていたが、本明細書に記載の治療の方法に有用であることは知られていなかった化合物、又はその医薬的に許容される塩、そのプロドラッグ、又はその代謝産物であり得る。

[0068] 患者は、どの動物、家畜動物、酪農動物、野生動物でもよく、限定されないが、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ、及びウシと、好ましくはヒト患者が含まれる。本明細書に使用されるように、「患者」及び「被検者」という用語は、交換可能的に使用してよい。

[0069] 有害なほどに高いレベルのＧＳＮＯＲ又はＧＳＮＯＲ活性がある被検者において、調節は、例えば、ＧＳＮＯＲ機能を壊すか又はダウンレギュレートする、又はＧＳＮＯＲレベルを減少させる開示化合物の１以上を投与することによって達成され得る。これらの化合物は、抗ＧＳＮＯＲ抗体又は抗体断片、ＧＳＮＯＲアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、又は低分子のような他のＧＳＮＯＲ阻害剤、又は他の阻害剤とともに、単独で、又は本明細書に詳しく記載されるような他の薬剤と組み合わせて投与してよい。

[0070] 本発明は、ＮＯドナー療法によって改善される障害に罹患した被検者を治療する方法を提供する。このような方法は、治療有効量のＧＳＮＯＲ阻害剤を被検者へ投与することを含む。

[0071] 本明細書に使用されるように、「治療すること」は、疾患、状態、又は障害を克服する目的のための患者の管理及び看護について記載して、症状又は合併症の発現を防ぐための本発明の化合物の投与、症状又は合併症を軽減すること、又は疾患、状態、又は障害を消失させることが含まれる。より具体的には、「治療すること」には、疾患（障害）状態の少なくとも１つの有害な症状又は影響、疾患の進行、疾患の原因体（例、細菌又はウイルス）、又は他の異常な状態を逆転させること、弱めること、軽減すること、最小化すること、抑制すること、又は休止させることが含まれる。治療は、症状及び／又は病態が改善する間は続けられる。

[0072] 障害には、肺中の低酸素血症及び／又は平滑筋狭窄及び／又は肺感染及び／又は肺損傷に関連した肺の障害（例、肺性高血圧、ＡＲＤＳ、喘息、肺炎、肺線維症／間質性肺疾患、嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ）、高血圧、虚血性冠症候群、アテローム性動脈硬化症、心不全、緑内障といった状態が含まれる心臓血管系疾患及び心疾患、血管新生を特徴とする疾患（例、冠動脈疾患）、血栓症発生のリスクがある障害、再狭窄発生のリスクがある障害、慢性炎症性疾患（例、ＡＩＤ認知症及び乾癬）、アポトーシス発生のリスクがある疾患（例、心不全、アテローム性動脈硬化症、神経変性障害、関節炎、及び肝損傷（虚血性又はアルコール性））、インポテンツ、食物への渇望に応じた摂食に起因する肥満、卒中、再灌流損傷（例、心臓又は肺における外傷性筋肉損傷、又は圧挫損傷）、並びに後続の虚血性イベントに抗するＮＯ保護への心臓又は脳のプレコンディショニングが有益である障害を含めることができる。

[0073] １つの態様において、本発明の化合物又はその医薬的に許容される塩、又はそのプロドラッグ又は代謝産物は、ＮＯドナーと組み合わせて投与することができる。ＮＯドナーは、一酸化窒素又は関連レドックス種を供与して、より一般的には、一酸化窒素の生理活性、即ち、一酸化窒素で確認される活性、例えば、血管弛緩、又は受容体タンパク質（例、ｒａｓタンパク質、アドレナリン作用性受容体、ＮＦκＢ）の刺激又は阻害を提供する。Ｓ−ニトロソ、Ｏ−ニトロソ、Ｃ−ニトロソ、及びＮ−ニトロソ化合物とそのニトロ誘導体、及び金属ＮＯ錯体が含まれるが、他のＮＯ生理活性産生化合物も除外されない、本発明に有用なＮＯドナーについては、参照により本明細書に組み込まれる「一酸化窒素研究の方法（Methods in Nitric Oxide Research）」Feelisch et al．監修、71〜115 頁（Ｊ．Ｓ．，ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク、1996）に記載されている。ニトロソが三級炭素へ付いているＣ−ニトロソ化合物である、本発明に有用であるＮＯドナーには、米国特許第６，３５９，１８２号とＷＯ０２／３４７０５に記載されるものが含まれる。Ｓ−ニトロソ化合物の例には、本発明に有用なＳ−ニトロソチオールを含めて、例えば、Ｓ−ニトロソグルタチオン、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン、Ｓ−ニトロソ−システインとそのエチルエステル、Ｓ−ニトロソシステイニルグリシン、Ｓ−ニトロソ−γ−メチル−Ｌ−ホモシステイン、Ｓ−ニトロソ−Ｌ−ホモシステイン、Ｓ−ニトロソ−γ−チオ−Ｌ−ロイシン、Ｓ−ニトロソ−δ−チオ−Ｌ−ロイシン、及びＳ−ニトロソアルブミンが含まれる。本発明に有用な他のＮＯドナーの例は、ナトリウムニトロプルシド（ニプリド）、亜硝酸エチル、イソソルビド、ニトログリセリン、モルシドミンであるＳＩＮ １、フロキサミン、Ｎ−ヒドロキシ（Ｎ−ニトロサミン）、及びＮＯ又は疎水性ＮＯドナーで飽和されたペルフルオロカーボンである。

[0074] 既知のＮＯ放出剤、アムロジピンのＲ（＋）エナンチオマー（Zhang X. P et al. 2002 J. Cardiovascular Pharmacology 39, 208-214）とＧＳＮＯＲ阻害剤の組合せも、本発明の態様である。

[0075] 本発明はまた、病理学的に増殖する細胞に罹患した被検者を治療する方法を提供し、ここで該方法は、ＧＳＮＯＲの阻害剤の治療有効量を前記被検者へ投与することを含む。ＧＳＮＯＲの阻害剤は、医薬的に許容される担体と組み合わせた、上記に定義されるような化合物、又はその医薬的に許容される塩、又はそのプロドラッグ又は代謝産物である。治療は、症状及び／又は病態が改善する間は続けられる。

[0076] 別の態様において、病理学的に増殖する細胞は、病理学的に増殖する微生物であり得る。関与する微生物は、ニトロソ化ストレスから保護されるようにＧＳＮＯＲを発現するもの、又は該微生物に感染された宿主細胞がこの酵素を発現することによってニトロソ化ストレスから保護されるものであり得る。「病理学的に増殖する微生物」という用語は、本明細書において、病理学的微生物を意味するために使用されて、限定されないが、病理学的細菌、病理学的ウイルス、病理学的クラミジア、病理学的原生動物、病理学的リケッチア、病理学的真菌、及び病理学的マイコプラズマが含まれる。適用可能な微生物に関するさらなる詳細は、米国特許第６，０５７，３６７号のカラム１１及び１２に説明されている。「病理学的微生物に感染された宿主細胞」という用語には、病理学的ウイルスに感染された哺乳動物細胞だけでなく、細胞内の細菌又は原生動物を含有する哺乳動物細胞（例、結核菌、ライ菌（ライ病）、又は腸チフス菌（腸チフス）を含有するマクロファージ）も含まれる。

[0077] 別の態様において、病理学的に増殖する細胞は、病理学的蠕虫であり得る。「病理学的蠕虫」という用語は、本明細書において、病理学的線虫、病理学的吸虫、及び病理学的条虫を意味するために使用される。適用可能な蠕虫に関するさらなる詳細は、米国特許第６，０５７，３６７号のカラム１２に説明されている。

[0078] 別の態様において、病理学的に増殖する細胞は、病理学的に増殖する哺乳動物細胞であり得る。本明細書に使用される「病理学的に増殖する哺乳動物細胞」という用語は、前記哺乳動物において、その哺乳動物又はその臓器に有害な効果を引き起こすほどに大きさ又は数が増大する、哺乳動物の細胞を意味する。この用語には、例えば、病理学的に増殖するか又は拡大して再狭窄を引き起こす細胞、病理学的に増殖するか又は拡大して良性前立腺肥大を引き起こす細胞、病理学的に増殖して心筋肥大を引き起こす細胞、及び関節炎の滑膜細胞のように炎症部位で増殖する細胞、又は細胞増殖性障害に関連した細胞が含まれる。

[0079] 本明細書に使用されるように、「細胞増殖性障害」という用語は、細胞の非調節及び／又は異常な増殖が癌性又は非癌性であり得る望まれない状態又は疾患（例えば、乾癬状態）の発症をもたらし得る状態を意味する。本明細書に使用されるように、「乾癬状態」という用語は、角化細胞の過剰増殖、炎症性の細胞浸潤、及びサイトカインの変化が関与する障害を意味する。細胞増殖性障害は、前癌状態又は癌であり得る。癌は、原発性癌又は転移性癌、又はその両方であり得る。

[0080] 本明細書に使用されるように、「癌」という用語には、肺癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腺癌、扁平上皮癌、肉腫、悪性膠腫、横紋筋肉腫、肝細胞癌、頭頚部癌、悪性メラノーマ、非メラノーマ皮膚癌のような固形腫瘍、並びに、白血病、小児白血病及びリンパ腫、多発性骨髄腫、ホジキン病、リンパ球及び皮膚起源のリンパ腫、急性及び慢性白血病（急性リンパ芽球性、急性骨髄芽球性、又は慢性骨髄芽球性白血病のような）、形質細胞性新生物、リンパ性新生物、及びＡＩＤＳに関連した癌のような、造血系腫瘍及び／又は悪性腫瘍が含まれる。

[0081] 乾癬状態に加えて、本発明の組成物を使用して治療され得る増殖性疾患の種類は、表皮及び類皮嚢胞、脂肪腫、腺腫、毛細及び皮膚血管腫、リンパ管腫、母斑病変、奇形腫、腎腫、筋線維腫症、骨形成性腫瘍、及び他の形成異常塊、等である。１つの態様において、増殖性疾患には、形成異常と類似の障害が含まれる。

[0082] １つの態様において、癌を治療することは、腫瘍サイズの低下、腫瘍数の減少、腫瘍増殖の遅延、原発腫瘍部位から離れた他の組織又は臓器における転移性病巣の減少、患者生存率の改善、又は患者の生命の質の改善、又は上記の少なくとも２つを含む。

[0083] 別の態様において、細胞増殖性障害を治療することは、細胞増殖の速度の低下、増殖性細胞の比率の低下、細胞増殖の領域又は範囲の大きさの減少、又は異常な外観又は形態を有する細胞の数又は比率の減少、又は上記の少なくとも２つを含む。

[0084] なお別の態様において、本発明の化合物又はその医薬的に許容される塩、そのプロドラッグ、又はその代謝産物は、第二の化学療法剤と組み合わせて投与することができる。さらなる態様において、第二の化学療法剤は、タモキシフェン、ラロキシフェン、アナストロゾール、エクセメスタン、レトロゾール、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、シクロホスファミド、ロバスタチン、ミノシン、ゲンシタビン、ａｒａＣ、５−フルオロウラシル、メトトレキセート、ドセタキセル、ゴセレリン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、テニポシド、エトポシド、エポチロン、ナベルビン、カンプトテシン、ダウノニビシン、ダクチノマイシン、ミトキサントロン、アムサクリン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ソラフェニブ、マレイン酸スニチニブ、トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、及びベバシズマブからなる群より選択される。

[0085] １つの態様において、本発明の化合物又はその医薬的に許容される塩、そのプロドラッグ、又はその代謝産物は、ニトロソ化又は酸化ストレスをかける薬剤と組み合わせて投与することができる。本発明のＧＳＮＯＲ阻害剤との組合せ療法においてニトロソ化ストレスを選択的にかけて病理学的に増殖する細胞の増殖を阻害する薬剤とその投与量及び投与経路には、本明細書に組み込まれる米国特許第６，０５７，３６７号に開示されるものが含まれる。本発明のＧＳ−ＦＤＨ阻害剤との組合せ療法において酸化ストレスをかける補助薬剤（即ち、ＧＳＨ（グルタチオン）に対するＧＳＳＧ（酸化グルタチオン）の比、又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈに対するＮＡＤ（Ｐ）の比を高める薬剤、又はチオバルビツール酸誘導体を増加させる薬剤）には、例えば、Ｌ−ブチオニン−Ｓ−スルホキシミン（ＢＳＯ）、グルタチオンレダクターゼ阻害剤（例、ＢＣＮＵ）、ミトコンドリア呼吸の阻害剤又は脱共役剤、及び反応性酸素種（ＲＯＳ）を高める薬物（例、アドリアマイシン）が標準の投与経路での標準投与量で含まれる。

[0086] ＧＳＮＯＲ阻害剤は、ホスホジエステラーゼ阻害剤（例、ロリプラム、シロミラスト、ロフルミラスト、Ｖｉａｇｒａ（登録商標）（クエン酸シルデニフィル）、Ｃｉａｌｉｓ（登録商標）（タダラフィル）、Ｌｅｖｉｔｒａ（登録商標）（バルデニフィル）、等）、β−アゴニスト、ステロイド、又はロイコトリエンアンタゴニスト（ＬＴＤ４）とも同時投与してよい。当業者は、改善すべき障害に依って、適正な治療有効量を容易に決定することができる。

[0087] ＧＳＮＯＲ阻害剤は、β−アドレナリン作用性のシグナル伝達を改善するための手段として使用してよい。特に、ＧＳＮＯＲの阻害剤は、単独で、又はβ−アゴニストと組み合わせて、心不全、又は高血圧症及び喘息のような他の血管系障害を治療するか又はそれらに対して保護するために使用し得る。ＧＳＮＯＲ阻害剤はまた、平滑筋（例、気道及び血管）弛緩をもたらすＧｓ Ｇ−タンパク質を増強することによって、並びに、Ｇｑ Ｇ−タンパク質を減弱させることによって、それにより平滑筋収縮を（例えば、気道及び血管において）妨げる、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を調節するために使用することができる。

[0088] ＮＯドナー療法によって改善される障害に罹患した被検者の治療用の治療有効量とは、治療される障害の改善を引き起こすか又はその障害に関連したリスクに対して保護する、in vivo でのＧＳＮＯＲ阻害量である。例えば、喘息では、治療有効量は、気管支拡張に有効な量であり；嚢胞性線維症では、治療有効量は、気道閉塞改善に有効な量であり；ＡＲＤＳでは、治療有効量は、低酸素血症改善に有効な量であり；心疾患では、治療有効量は、アンギナ緩和又は血管新生誘導に有効な量であり；高血圧症では、治療有効量は、血圧低下に有効な量であり；虚血性冠動脈障害では、治療有効量は、血流増加に有効な量であり；アテローム性動脈硬化症では、治療有効量は、内皮機能不全の逆転に有効な量であり；緑内障では、治療有効量は、眼内圧低下に有効な量であり；血管新生を特徴とする疾患では、治療有効量は、血管新生阻害に有効な量であり；血栓症発生のリスクがある障害では、治療有効量は、血栓症予防に有効な量であり；再狭窄発生のリスクがある障害では、治療有効量は、再狭窄阻害に有効な量であり；慢性炎症性疾患では、治療有効量は、炎症抑制に有効な量であり；アポトーシス発生のリスクがある障害では、治療有効量は、アポトーシス予防に有効な量であり；インポテンスでは、治療有効量は、勃起の達成又は持続に有効な量であり；肥満では、治療有効量は、満腹感を引き起こすのに有効な量であり；卒中では、治療有効量は、血流増加又はＴＩＡ保護に有効な量であり；再灌流損傷では、治療有効量は、機能向上に有効な量であり；そして心臓及び脳のプレコンディショニングでは、治療有効量は、細胞保護に有効な量（例えば、トリポニン又はＣＰＫによって測定されるような）である。

[0089] 病理学的に増殖する細胞に罹患した被検者の治療用の治療有効量は、抗増殖に有効な量である、in vivo でのＧＳＮＯＲ阻害量を意味する。本明細書に使用される、このような抗増殖に有効な量は、少なくとも約２０％、少なくとも約１０％、少なくとも約５％、又は少なくとも約１％の増殖速度の抑制を引き起こす量を意味する。

[0090] 一般に、投与量、即ち治療有効量は、治療される被検者の体重１ｋｇにつき、１日あたり、１μｇ〜１０ｇの範囲に及び、そしてしばしば、１０μｇ〜１ｇ又は１０μｇ〜１００ｍｇの範囲に及ぶ。

Ｈ．他の使用
[0091] 本発明の化合物又はその医薬的に許容される塩、又はそのプロドラッグ又は代謝産物は、そのような化合物の存在が有益であり得る状況において、様々な器具へ適用することができる。そのような器具は、どのデバイス又は容器であってもよい（例えば、患者への埋め込みに先立って外科用メッシュ又は心臓血管ステントをコートするのにＧＳＮＯＲ阻害剤を使用し得る埋め込みデバイス）。本発明のＧＳＮＯＲ阻害剤はまた、in vitro アッセイ目的又は細胞を培養するための様々な器具へ適用することができる。

[0092] 本発明の化合物又はその医薬的に許容される塩、又はそのプロドラッグ又は代謝産物はまた、抗体、天然リガンド、等のような、ＧＳＮＯＲ阻害化合物への結合パートナーの開発、単離、又は精製のための薬剤として使用することができる。当業者は、本発明の化合物に関連した使用を容易に決定することができる。
本発明は、以下の態様を包含する。
（１） 式（Ｉ）の化合物：

［式中、Ｒ_１は、ＣＦ_３、ＣＦ_２Ｈ、ＣＦ_２ＣＨ_３、ＣＦ_２ＣＨ_２ＣＨ_３、メチル、イソプロピル、イソブチル、シクロペンチル、ＣＨ_２ＯＣＨ_３、ＳＣＨ_３、ベンジル、チオフェン−２−イル、及びチオフェン−３−イルからなる群より選択され；Ｒ_２は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、メトキシ、及びシアノより選択され；Ｒ_３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、及びメトキシより選択される］。
（２） Ｒ_１が、ＣＦ_３、ＣＦ_２Ｈ、及びＣＦ_２ＣＨ_３からなる群より選択され、Ｒ_２が水素である、（１）の化合物。
（３） Ｒ_１が、ＣＦ_３、メチル、イソプロピル、及びイソブチルからなる群より選択され、Ｒ_２とＲ_３がともに水素である、（１）の化合物。
（４） Ｒ_１が、ＣＦ_３、メチル、イソプロピル、イソブチル、ＣＦ_２Ｈ、ＣＦ_２ＣＨ_３、及びＣＦ_２ＣＨ_２ＣＨ_３からなる群より選択され、Ｒ_２とＲ_３がともに水素である、（１）の化合物。
（５） ４−（２−（ジフルオロメチル）−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸； ４−（７−ヒドロキシ−２−（メトキシメチル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸； ４−（７−ヒドロキシ−２−イソプロピル−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸； ４−（２−シクロペンチル−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸； ４−（７−ヒドロキシ−２−メチル−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸； ４−（２−ベンジル−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸； ４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（チオフェン−２−イル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸； ４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（チオフェン−３−イル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸； ４−（７−ヒドロキシ−２−イソブチル−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸； ４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸； ４−（７−ヒドロキシ−２−（メチルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸； ４−（６−クロロ−７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸； ４−（６−フルオロ−７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸； ２−フルオロ−４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸； ３−クロロ−４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸； ４−（２−（１，１−ジフルオロエチル）−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸； ４−（７−ヒドロキシ−６−メトキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸； ２−クロロ−４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸； ４−（２−（１，１−ジフルオロプロピル）−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸； ４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）−３−メトキシ安息香酸；及び ４−（６−シアノ−７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；からなる群より選択される、（１）の化合物。
（６） （１）〜（５）のいずれかに記載の化合物の治療有効量を医薬的に許容される担体又は賦形剤と一緒に含んでなる医薬組成物。
（７） 疾患又は状態の治療を必要とする患者へ（１）〜（５）のいずれかに定義される式Ｉの化合物の治療有効量を投与することを含む、疾患または状態の治療方法。
（８） （１）〜（５）のいずれかに定義される式Ｉの化合物を作製する方法。

[0093] 以下のスキーム及び実施例は、本発明を例解するために示す。しかしながら、本発明は、これらの実施例に記載される特定の条件又は詳細に限定されないことを理解されたい。本出願を通して、米国特許が含まれる公的に利用可能な文書へのありとあらゆる参考文献が参照により具体的に組み込まれる。

[0094] 本発明のＧＳＮＯＲ阻害剤は、既知の合成の方法論を使用して、又は既知の合成の方法論の変更により、容易に合成することができる。当業者に容易に認められるように、以下に記載の方法論は、多様な置換基を有するクロモンの合成を可能にする。以下の一般スキーム１は、本発明のクロモン化合物を作製するための代表的な手順である。追加の合成の詳細については、実施例１〜２１に、そして中間体のセクションである実施例２３に見出すことができる。

実施例１：４−（２−（ジフルオロメチル）−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸

[0095] （合成） 一般スキーム１に従って、中間体Ａ−１ａより出発し、条件ａ）（変更）及びｃ）を使用して製造した。
[0096] （工程１） ４−（２−（ジフルオロメチル）−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸エチルの合成
中間体Ａ−１ａ（４５０ｍｇ，１．５ミリモル）及びＴＥＡ（７５８ｍｇ，７．５ミリモル）の溶液へ２，２−ジフルオロ酢酸無水物（５２２ｍｇ，３．０ミリモル）を加えた。この混合物を１２０℃で４時間撹拌した。この反応混合物を室温へ冷やして真空で濃縮して茶褐色の固形物を得て、これをさらに精製せずに次の工程に使用した（４００ｍｇ，７４％）。

[0097] （工程２） ４−（２−（ジフルオロメチル）−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸（実施例１）の合成、ｃ）条件の実例
４−（２−（ジフルオロメチル）−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸エチル（４００ｍｇ，１．１６ミリモル）の１，４−ジオキサン（１ｍＬ）中の混合物へ濃ＨＣｌ（１ｍＬ）を加えた。この反応混合物を一晩加熱して還流させた。この混合物を室温へ冷やして、濾過した。濾過した塊を水（５ｍＬ）で２回、そしてエタノール（２ｍＬ）で洗浄し、分取用ＨＰＬＣによって精製して、白色の固形物（５０ｍｇ，１３％）を得た。

[0098] （データ） ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d_6, TMS): δ 13.11 (s, 1H), 11.09 (s, 1H), 8.02 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.95 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.01 (dd, J = 2.5, 9.0 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 2.5 Hz 1H), 6.68 (t, J = 51.0 Hz, 1H); MS (ESI): m/z 333.0 [M+1]⁺。

実施例２：４−（７−ヒドロキシ−２−（メトキシメチル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸

[0099] （合成） 一般スキーム１に従って、中間体Ａ−１ａより出発し、条件ｂ）（変更）及びｃ）を使用して製造した。
[00100] （工程１） ４−（７−ヒドロキシ−２−（メトキシメチル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸エチルの合成、ｂ）条件の実例
中間体Ａ−１ａ（４５０ｍｇ，１．５ミリモル）及びＥｔ_３Ｎ（８２５ｍｇ，７．５ミリモル）のＤＣＭ（５ｍＬ）中の撹拌混合物へ塩化２−メトキシアセチル（４８６ｍｇ，４．５ミリモル）を加えた。次いで、この混合物を室温で５時間撹拌した。この溶液を減圧下に除去して、残渣を水（５０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（５０ｍＬｘ３）で抽出した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮してシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ＝１：１）によって精製して、４−（７−ヒドロキシ−２−（メトキシメチル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸エチル（８４ｍｇ，１６％）を黄色のオイルとして得た。MS (ESI): m/z 355.0 [M+1]⁺。

[00101] （工程２） ４−（７−ヒドロキシ−２−（メトキシメチル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸（実施例２）の合成
一般スキーム１、ｃ）条件（分取用ＨＰＬＣによって精製）、詳しい例については実施例１の工程２を参照のこと。

[00102] （データ） ¹H NMR (MeOH-d₄, 500 MHz, TMS): δ 8.08 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.99 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 6.94 (t, J = 10.0 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 4.24 (s, 2H), 3.34 (s, 2H); MS (ESI): m/z 327.1 [M+1]⁺。

実施例３：４−（７−ヒドロキシ−２−イソプロピル−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸

[00103] （合成） 一般スキーム１に従って、中間体Ａ−１ａより出発し、条件ｂ）及びｄ）を使用して製造した。ここでは、合成の詳細がｂ）及びｄ）の実例として含まれる。

[00104] （工程１） ４−（７−（イソブチリルオキシ）−２−イソプロピル−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸エチルの合成、スキーム１、ｂ）条件の実例。

[00105] 中間体Ａ−１ａ（４５０ｍｇ，粗製、１．５ミリモル）及びＴＥＡ（８３４μＬ，６ミリモル）の乾燥ＤＣＭ（５ｍＬ）溶液へ塩化イソブチリル（４８０μＬ，４．５ミリモル）を室温で滴下した。この混合物を３時間撹拌した。揮発物質を減圧下に除去した。残渣へＴＥＡ（５ｍＬ）を加えて、９５℃で一晩加熱した。室温へ冷やして濾過し；濾過ケークをＥＡ（１０ｍＬ）で洗浄した。濾液を濃縮してＣｏｍｂｉ−Ｆｌａｓｈ（４０ｇシリカゲル、ＰＥ：ＥＡ＝１０：０で開始して３：１への勾配、４０ｍＬ／分、４０分、総溶媒量：１．６Ｌ）によって精製して、４−（７−（イソブチリルオキシ）−２−イソプロピル−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸エチル（８０ｍｇ，１３％）を白色の固形物として得た。

[00106] （工程２） ４−（７−ヒドロキシ−２−イソプロピル−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸（実施例３）の合成、スキーム１、ｄ）条件の実例。
[00107] ４−（７−（イソブチリルオキシ）−２−イソプロピル−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸エチル（８０ｍｇ，０．１４２ミリモル）のＴＨＦ（２ｍＬ）溶液へ水酸化リチウム（６０ｍｇ，１．４２ミリモル）の水（１ｍＬ）溶液を加えた。この混合物を室温で３時間撹拌した。ＴＬＣ（ＰＥ：ＥＡ＝３：１）は、この反応が完了していることを示した。有機溶媒を減圧下に除去し、塩基性の水層をＤＣＭ（１０ｍＬｘ２）で抽出して１Ｎ ＨＣｌ溶液でｐＨ４〜５へ調整し、沈殿を濾過によって採取し、真空で乾燥させて、実施例３（５８ｍｇ，９４％）を黄色の固形物として得た。

[00108] （データ） ¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz, TMS): δ 12.99 (s, 1H), 10.80 (s, 1H), 7.99 (d, J = 8 Hz, 2H), 7.87(d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.38(d, J = 7.5 Hz, 2H), 6.92 (dd, J = 8.5Hz 2 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 2 Hz, 1H), 2.75(m, 1H), 1.21 (s, 3H), 1.19 (s, 3H); MS (ESI): m/z 325.1 [M+1]⁺。

実施例４：４−（２−シクロペンチル−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸

[00109] （合成） 一般スキーム１に従って、工程１において中間体Ａ−１ａと塩化シクロペンタンカルボニルより出発し、条件ｂ）を使用して製造して、４−（７−（シクロペンタンカルボニルオキシ）−２−シクロペンチル−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸エチルを得た。工程２は、ｄ）条件に従った。詳しい実例については、実施例３を参照のこと。

[00110] （データ） ¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz, TMS): δ 12.98 (brs, 1H), 10.79 (brs, 1H), 7.99 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.87 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8 Hz, 2H), 6.91 (dd, J = 9Hz 2 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 2 Hz, 1H), 2.84 (m, 1H), 1.78-1.84 (m, 6H), 1.543 (s, 2H); MS (ESI): m/z 351.1 [M+1]⁺。

実施例５：４−（７−ヒドロキシ−２−メチル−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸

[00111] （合成） 一般スキーム１に従って、工程１において中間体Ａ−１ａと無水酢酸より出発し、条件ａ）（ここでは、反応物を室温で２時間撹拌後に３時間還流させて、分取用ＴＬＣ（ＰＥ：ＥＡ＝３：１）によって精製した）を使用して製造した。工程２は、ｃ）条件に従った。詳しい実例については、実施例１を参照のこと。

[00112] （データ） ¹H NMR (MeOH-d₄, 500 MHz, TMS): δ 8.12 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.99 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.94 (d, J = 9.0 Hz ,1H) ,6.88 (s, 1H), 2.32 (s, 3H); MS (ESI): m/z 297.1 [M+1]⁺。

実施例６：４−（２−ベンジル−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸

[00113] （合成） 一般スキーム１に従って、工程１において中間体Ａ−１ａと塩化２−フェニルアセチルより出発し、条件ｂ）（ここでは、反応を室温で３時間行った）を使用して製造して、４−（２−ベンジル−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸エチルを得た。工程２：ｄ）条件（ここでは、反応物をそのまま室温一晩撹拌して、分取用ＨＰＬＣによって精製した）に従った。詳しい実例については、実施例３を参照のこと。

[00114] （データ） ¹H NMR (MeOH-d₄, 500 MHz):δ 8.12 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.99 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.29 (q, J = 14.5 Hz, 2H), 7.24 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.22 (s, 1H), 7.15 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 6.94 (q, J = 8.5 Hz, 1H), 6.83 (s, 1H), 3.92 (s, 2H); MS (ESI): m/z373.1 [M+1]⁺。

実施例７：４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（チオフェン−２−イル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸

[00115] （合成） 一般スキーム１に従って、工程１において中間体Ａ−１ａと塩化チオフェン−２−カルボニルより出発し、条件ｂ）を使用して製造して、チオフェン−２−カルボン酸３−（４−（エトキシカルボニル）フェニル）−４−オキソ−２−（チオフェン−２−イル）−４Ｈ−クロメン−７−イルを得た。工程２：ｄ）条件に従った。詳しい実例については、実施例３を参照のこと。

[00116] （データ） ¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz, TMS): δ13.08 (brs, 1H), 10.89 (s, 1H), 8.03 (d, J = 8 Hz, 2H), 7.90 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.77 (dd, J = 5, 1Hz, 1H), 7.41 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.31 (dd, J = 3.5, 1Hz, 1H), 7.08 (m, 1H), 6.94-6.98 (m, 2H); MS (ESI): m/z 365.0 [M+1]⁺。

実施例８：４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（チオフェン−３−イル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸

[00117] （合成） 一般スキーム１に従って、工程１において中間体Ａ−１ａと塩化チオフェン−３−カルボニルより出発し、条件ｂ）を使用して製造して、チオフェン−３−カルボン酸３−（４−（エトキシカルボニル）フェニル）−４−オキソ−２−（チオフェン−３−イル）−４Ｈ−クロメン−７−イルを得た。工程２は、ｄ）条件に従った。詳しい実例については、実施例３を参照のこと。

[00118] （データ） ¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz, TMS): δ13.01 (brs, 1H), 10.87 (s, 1H), 7.97 (d, J = 8 Hz, 2H), 7.92 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.78-7.79 (m, 1H), 7.49-7.51 (m, 1H), 7.35 (d, J = 8.5Hz, 2H), 6.98 (d, J = 2 Hz, 1H), 6.95 (dd, J = 9, 2Hz, 1H), 6.70 (dd, J = 5.5, 1.5Hz, 1H); MS (ESI): m/z 365.0 [M+1]⁺。

実施例９：４−（７−ヒドロキシ−２−イソブチル−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸

[00119] （合成） 一般スキーム１に従って、工程１において中間体Ａ−１ａと塩化３−メチルブタノイルより出発し、条件ｂ）を使用して製造して、４−（２−イソブチル−７−（３−メチルブタノイルオキシ）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸エチルを得た。工程２は、ｄ）条件に従って、ＰＥからの再結晶によって精製した。詳しい実例については、実施例３を参照のこと。

[00120] （データ） ¹H NMR (MeOH-d₄, 500 MHz, TMS): δ8.12 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.00 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.95 (dd, J = 2.5, 9.0 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 2.49 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 2.40-2.20 (m, 1H), 0.90 (d, J = 7.0 Hz, 6H); MS (ESI): m/z 339.1 [M+1]⁺。

実施例１０：４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸

[00121] （合成） 一般スキーム１に従って、中間体Ａ−１ａより出発し、条件ａ）及びｃ）を使用して製造した。ここでは、合成の詳細がａ）及びｃ）の別の実例として含まれる。

[00122] （工程１） ４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸エチルの合成、ａ）条件の実例。
中間体Ａ−１ａ（４００ｍｇ，１．３３ミリモル）のＤＣＭ（１０ｍＬ）溶液へＴＦＡＡ（１．３９ｇ，６．６５ミリモル）を５〜１０℃で加えた。添加後、この混合物を室温で１時間撹拌し、濃縮し、分取用ＴＬＣ（ＰＥ：ＥＡ＝２：１）によって精製して、生成物（２８０ｍｇ，５６％）を黄色の固形物として得た。

[00123] （工程２） ４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸（実施例１０）の合成、ｃ）条件の実例。
４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸エチル（２３ｍｇ，０．０６ミリモル）のジオキサン（０．５ｍＬ）溶液へ濃ＨＣｌ（０．５ｍＬ）を加えた。この反応混合物を７０℃で７時間撹拌し、室温へ冷やして、遠心分離させた。沈殿を水（１ｍＬｘ２）で濯ぎ、真空で乾燥させて、実施例１０（１３ｍｇ，６１％）を白色の固形物として得た。

[00124] （データ） ¹H NMR (CD₃OD_,500 MHz): δ 8.09 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.01 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.01 (dd, J = 9.0, 2.0 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 2.0 Hz, 1H) ppm. MS (ESI): m/z 351.0 [M+1]⁺。

実施例１１：４−（７−ヒドロキシ−２−（メチルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸

[00125] （合成） 工程１：４−（７−メトキシ−２−（メチルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸メチルの合成。
中間体Ｂ（１００ｍｇ，０．３３ミリモル）及び二硫化炭素（１２７ｍｇ，１．６７ミリモル）のＤＭＦ（５．０ｍＬ）中の撹拌混合物を０℃へ冷やして、ＮａＨ（２４ｍｇ，１．０ミリモル）を加えた。この反応混合物を０℃で３０分間撹拌した。次いで、ＭｅＩ（９４ｍｇ，０．６７ミリモル）を加えて、この反応混合物を室温で３時間撹拌した。この溶液を水（１０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（５０ｍＬｘ３）で抽出した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮して、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ＝３：１）によって精製して、生成物（３６ｍｇ（純粋ではない），３０％）を得た。MS (ESI): m/z 357.0 [M+1]⁺。

[00126] 工程２：４−（７−ヒドロキシ−２−（メチルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸（実施例１１）の合成。
乾燥ジクロロメタン（５．０ｍＬ）中の４−（７−メトキシ−２−（メチルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸メチル（３６ｍｇ，０．１０１ミリモル）を窒素下に０℃へ冷やして、ＤＣＭ中のＢＢｒ_３（１．０Ｍ，０．２ｍＬ，０．２０２ミリモル）を速やかに加えた。次いで、この混合物を室温で一晩撹拌した。この反応物を水で反応停止させて、減圧下に濃縮した。残渣を分取用ＨＰＬＣによって精製して、実施例１１（８．２ｍｇ，２５％）を灰白色の固形物として得た。

[00127] （データ） ¹H NMR (MeOH-d₄, 500 MHz, TMS): δ 8.10 (d, J = 10.0 Hz, 2H), 8.01 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.97 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 2.64 (s, 3H); MS (ESI): m/z329.0 [M+1]⁺。

実施例１２：４−（６−クロロ−７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸

[00128] （合成） 一般スキーム１に従って、工程１において中間体ＣとＴＦＡＡより出発し、条件ａ）を使用して製造した（ここでは、反応物を室温で２時間撹拌してから、４０℃で４時間加熱して、精製せずに使用した）。工程２は、ｃ）条件（分取用ＨＰＬＣによる精製を伴う）に従った。詳しい実例については、実施例１０を参照のこと。

[00129] （データ） ¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz, TMS): δ13.10 (brs, 1H), 12.25 (brs, 1H), 8.01 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 8.00 (s, 1H), 7.42 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.16 (s, 1H); MS (ESI): m/z384.9 [M+1]⁺。

実施例１３：４−（６−フルオロ−７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸

[00130] 一般スキーム１に従って、工程１において中間体ＤとＴＦＡＡより出発し、条件ａ）を使用して製造した。工程２は、ｃ）条件（分取用ＨＰＬＣによる精製を伴う）に従った。詳しい実例については、実施例１０を参照のこと。

[00131] （データ） ¹H NMR (MeOH-d₄, 500 MHz, TMS): 8.11 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.77 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 7.5 Hz, 2H); MS (ESI): m/z369.0 [M+1]⁺。

実施例１４：２−フルオロ−４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸

[00132] （合成） 一般スキーム１に従って、工程１において中間体ＥとＴＦＡＡより出発し、条件ａ）を使用して製造した（ここでは、粗生成物を精製せずに使用した）。工程２は、ｃ）条件（水系の後処理に、ＰＥ：ＤＣＭ＝１：１からの再結晶による精製を続ける）に従った。詳しい実例については、実施例１０を参照のこと。

[00133] （データ） ¹H NMR (MeOH-d₄, 500 MHz, TMS): 8.05-8.01 (m, 2H), 7.22 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.20 (s, 1H), 7.04 (dd, J = 2.0 Hz, 9.0 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 2.0 Hz, 1H); MS (ESI): m/z 369.0 [M+1]⁺。

実施例１５：３−クロロ−４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸

[00134] （合成） 一般スキーム１に従って、工程１において中間体ＦとＴＦＡＡより出発し、条件ａ）を使用して製造した（ここでは、水系の後処理を実施して、粗生成物を精製せずに使用した）。工程２は、ｃ）条件（分取用ＨＰＬＣによる精製を伴う）に従った。詳しい実例については、実施例１０を参照のこと。

[00135] （データ） ¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz, TMS): δ13.49 (brs, 1H), 11.28 (brs, 1H), 8.04 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 7.95-7.98 (m, 2H), 7.58 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.06 (dd, J = 2.0, 8.5 Hz 1H), 7.02 (d, J = 2.0 Hz, 1H); MS (ESI): m/z 385.0 [M+1]⁺。

実施例１６：４−（２−（１，１−ジフルオロエチル）−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸

[00136] （合成） 工程１：２，２−ジフルオロプロパン酸（３３０ｍｇ，２．９７ミリモル）のＤＣＭ（５ｍＬ）溶液へＰ_２Ｏ_５（３．３ｇ，２９．７ミリモル）を室温で加えて、この混合物を２日間撹拌して、２，２−ジフルオロプロパン酸無水物を得た。中間体Ａ−２ａ（１７０ｍｇ，０．５９ミリモル）のＴＥＡ（５ｍＬ）懸濁液へＤＣＭ中の２，２−ジフルオロプロパン酸無水物を０〜１０℃で滴下した。この混合物を室温で２時間撹拌した。揮発物質を蒸発させて、残渣を分取用ＴＬＣ（ＰＥ：ＥＡ＝１：１）によって精製して、４−（２−（１，１−ジフルオロエチル）−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸メチル（４５ｍｇ，２１％）を茶褐色のオイルとして得た。

[00137] 工程２：ｃ）条件（ＤＣＭからの再結晶による精製を伴う）に従った。詳しい実例については、実施例１０を参照のこと。
[00138] （データ） ¹H NMR (MeOH-d₄, 500 MHz, TMS): δ8.07 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 8.01 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.01 (dd, J = 2.0, 8.5 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 1.95 (t, J_F-H = 18.5 Hz, 3H); MS (ESI): m/z 347.0 [M+1]⁺。

実施例１７：４−（７−ヒドロキシ−６−メトキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸

[00139] （合成） 一般スキーム１に従って、工程１において中間体ＧとＴＦＡＡより出発し、条件ａ）を使用して製造した。工程２は、ｃ）条件（分取用ＨＰＬＣによる精製を伴う）に従った。詳しい実例については、実施例１０を参照のこと。

[00140] （データ） ¹H NMR (MeOH-d₄, 500 MHz, TMS): δ8.12 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.52 (s, 1H), 7.42 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.04 (s, 1H), 3.98 (s, 3H); MS (ESI): m/z 381.0 [M+1]⁺。

実施例１８：２−クロロ−４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸

[00141] （合成） 一般スキーム１に従って、工程１において中間体ＨとＴＦＡＡより出発し、条件ａ）を使用して製造した。工程２は、ｃ）条件（ＤＣＭからの再結晶による精製を伴う）に従った。詳しい実例については、実施例１０を参照のこと。

[00142] （データ） ¹H NMR (MeOH-d₄, 500 MHz, TMS): 8.15 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 8.06-8.04 (m, 2H), 7.47 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.06 (dd, J = 2.5, 9.0 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 2.0 Hz ,1H) ; MS (ESI): m/z 385.0 [M+1]⁺。

実施例１９：４−（２−（１，１−ジフルオロプロピル）−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸

[00143] （合成） 工程１：２，２−ジフルオロブタン酸（５００ｍｇ，４．０３２ミリモル）のＣＨ_２Ｃｌ_２（３０ｍＬ）中の撹拌溶液を室温で、Ｐ_２Ｏ_５（５．７３ｇ，４０．３２ミリモル）で処理した。この反応混合物を５℃で２日間保存した。この澄明な層を中間体Ａ−２（３００ｍｇ，１．０４９ミリモル）のＴＥＡ（０．４ｍＬ，２．７７ミリモル）溶液へ加え；固形物をＣＨ_２Ｃｌ_２（１ｍＬｘ３）で洗浄して、合わせたＤＣＭ溶液も中間体Ａ−２の溶液へ加えた。この反応物を室温で２時間撹拌した。揮発物質を減圧下に除去した。残渣を希ＨＣｌ溶液に取って、ＥＡで抽出した。この抽出液を濃縮して３００ｍｇの橙色の固形物を得て、これをシリカゲルカラム（ＰＥ：ＥＡ＝１０：１〜４：１）によって精製して、４０ｍｇ（収率：１０％）の生成物を得た。

[00144] 工程２：ｃ）条件（ＤＣＭからの再結晶による精製を伴う）に従った。詳しい実例については、実施例１０を参照のこと。
[00145] （データ） ¹H NMR (MeOH-d₄, 500 MHz, TMS): δ7.96 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.90 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.24 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.89 (dd, J = 2.0, 9.0 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 2.17-2.09 (m, 2H), 0.91 (t, J = 7.5 Hz, 3H); MS (ESI): m/z 347.0 [M+1]⁺。

実施例２０：４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）−３−メトキシ安息香酸

[00146] （合成） 一般スキーム１に従って、工程１において中間体ＩとＴＦＡＡより出発し、条件ａ）を使用して製造した。工程２は、ｃ）条件に従った。詳しい実例については、実施例１０を参照のこと。

[00147] （データ） ¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz, TMS): δ 13.17 (brs, 1H), 11.21 (brs, 1H), 7.93 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.61 (dd, J = 1.0, 7.5 Hz, 1H), 7.58 (s, 1H), 7.32 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.04 (dd, J = 2.0, 8.5 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 3.77 (s, 3H); MS (ESI): m/z381.1 [M+1]⁺。

実施例２１：４−（６−シアノ−７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸

[00148] （合成） 工程１：４−（６−ブロモ−７−メトキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸メチルの合成。
一般スキーム１に従って、中間体ＪとＴＦＡＡより出発し、条件ａ）（ここでは、粗生成物をシリカゲルカラム（ＰＥ／ＥＡ＝１０／１〜３／１）によって精製した）を使用して製造した。

[00149] 工程２：４−（６−シアノ−７−メトキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸メチルの合成。
４−（６−ブロモ−７−メトキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸メチル（３５０ｍｇ，０．７６ミリモル）のＮＭＰ（３ｍＬ）溶液へＣｕＣＮ（３４０ｍｇ，３．８ミリモル）を加えた。この混合物を窒素の防護下に１５０℃で８時間撹拌した。この混合物を室温へ冷やして水（１０ｍＬ）で反応停止させて、濾過した。このケークをアセトン（１５ｍＬｘ２）で洗浄した。濾液を真空で濃縮して茶褐色のオイルを得て、これを分取用ＴＬＣ（ＰＥ／ＥＡ＝５／１）によって精製して、生成物（１２５ｍｇ，４０％）を黄色の固形物として得た。MS (ESI): 404.0 [M+1]⁺。

[00150] 工程３：４−（６−シアノ−７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸の合成。
４−（６−シアノ−７−メトキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸メチル（１２０ｍｇ，０．２９ミリモル）のＤＣＭ（３ｍＬ）溶液へＢＢｒ_３（０．３５ｍＬ，４．５ミリモル）を室温で注意深く滴下した。この添加が完了したとき、この混合物を２日間撹拌した。水を注意深く加えて、生じる混合物を酢酸エチル（１０ｍＬｘ２）で抽出した。合わせた有機相を塩水（５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させて濃縮して茶褐色のオイルを得て、これを分取用ＨＰＬＣによって精製して、実施例２１（３０ｍｇ，２７．８％）を黄色の粉末として得た。

[00151] （データ） ¹H NMR (MeOH-d₄, 500 MHz, TMS): δ 8.38 (s, 1H), 8.11 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.41 (s, J = 8.0 Hz, 2H), 7.09 (s, 1H); MS (ESI): m/z 376.0 [M+1]⁺。

実施例２２：４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸

[00152] （合成） 工程１：４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸エチルの合成。
中間体Ａ−１ａ（３００ｍｇ，１．０ミリモル）の乾燥ＤＭＦ（８ｍＬ）溶液へＢＦ_３・Ｅｔ_２Ｏ（１．２ｍＬ）を撹拌しながら１０℃で注意深く加え、この添加が完了した後で、この混合物を室温まで０．５時間温めた。次いで、この反応溶液を６０℃へ加熱して、ＭｓＣｌ（４ｍＬのＤＭＦ中２ｍＬ）を加えた。次いで、この反応溶液を９５℃まで５時間加熱した。この反応混合物を室温へ冷やして、氷水（３０ｍＬ）へ注いで、ＥＡ（２０ｍＬｘ５）で抽出した。有機相を塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させて真空で濃縮して、茶褐色のオイル（１６０ｍｇ，５１．６％）を得た。MS (ESI): m/z 311.0 [M+1]⁺。

[00153] 工程１：４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸（化合物２２）の合成。
化合物：４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸エチル（１６０ｍｇ，０．５２ミリモル）の１，４−ジオキサン（４ｍＬ）中の混合物へ濃ＨＣｌ（２ｍＬ）を加えた。この反応混合物を一晩加熱して還流させた。この混合物を室温へ冷やして、濾過した。濾過した塊を水（５ｍＬ）で２回、そしてエタノール（２ｍＬ）で洗浄して真空で乾燥させて、実施例２２（４７．３ｍｇ，３２．５％）を茶褐色の固形物として得た。¹H NMR (MeOH-d₄, 400 MHz, TMS): δ 8.32 (s, 1H), 8.10 (d, J = 8 Hz, 3H), 7.71 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.99 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 6.91 (s, 1H); MS (ESI): m/z 283.1 [M+1]⁺。

[00154] 本実施例は、比較例として含まれる。実施例２４に記載の方法によって定量した本化合物のＩＣ_５０は、１３５ｎＭであった。
実施例２３：中間体の合成
[00155] 上記の実施例において言及した中間体の合成について本明細書で記載する。例示の詳しい方法について、中間体Ａ−１ａ及び中間体Ａ−２ａの記載において下記に示す方法１〜３に記載する。

中間体の一般構造

[00156] 中間体Ａ−１ａ：４−（２−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸エチルと中間体Ａ−２ａ：４−（２−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸メチルの合成

[00157] 中間体Ａ−１ａは、方法１によって初めに合成してから、後に、方法２に記載するより短い手順によって製造した。方法３は、メチルエステル中間体Ａ−２ａについて、別の手順で記載する。

方法１：４−（２−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸エチルの合成

[00158] 工程１：２−（４−アセチルフェニル）酢酸エチル（Ａ−２）の合成。２−フェニル酢酸エチル（Ａ−１）（５０．９ｇ，３０５ミリモル）のＣＳ_２（２２０ｍＬ）溶液へＡｌＣｌ_３（９３．６ｇ，７０２ミリモル）を０〜１０℃で１０分にわたり加えた。添加後、塩化アセチル（３０．５ｍＬ，４２７ミリモル）を０〜１０℃で１０分にわたり加えた。添加後、この反応混合物を一晩ゆっくり加熱して還流させてから、氷冷した５Ｎ ＨＣｌ溶液（６００ｍＬ）へ注ぎ、ＥＡ（２００ｍＬｘ３）で抽出した。合わせた有機相を水（２００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ_３（２００ｍＬ）、及び塩水（２００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮して、茶褐色のオイルを得た。冷蔵庫においてＰＥ／アセトン（１５０ｍＬ／２０ｍＬ）で再結晶させて、Ａ−２（１３．８ｇ，１９％）を黄色の結晶固形物として得た。

[00159] 工程２：４−（カルボキシメチル）安息香酸（Ａ−３）の合成。Ａ−２（１０．０ｇ，４８．５ミリモル）のＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ（ｖ／ｖ＝１／１，１００ｍＬ）溶液へＮａＯＨ（３．８８ｇ，９７．０ミリモル）を加えた。この反応溶液を室温で一晩撹拌した。ＴＨＦを減圧下に除去してから、ＮａＯＨ（１７．４６ｇ，４３６．５ミリモル）と水（１５０ｍＬ）を加えた。ヨウ素を室温で少量ずつ加えた。添加後、この反応混合物を室温で３０分間、次いで９０℃で２時間撹拌した。室温へ冷やして、濾過した。濾液を濃ＨＣｌでｐＨ＝８〜９へ調整した。ＮａＨＳＯ_３（固体）を少量ずつ加えると、最後には反応混合物の色が茶褐色から黄色へ変化した。濃ＨＣｌを加えて、ｐＨ＝２〜３とした。生じる沈殿を濾過し、水（１０ｍＬｘ２）で洗浄し、真空で乾燥させて、Ａ−３（４．４７ｇ，５０％）を黄色の粉末として得た。

[00160] 工程３：４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）安息香酸エチル（Ａ−４）の合成。Ａ−３（５．０ｇ，２７．７モル）のＤＣＭ（５０ｍＬ）溶液へ塩化オキサリル（１２．６ｇ，９９．２ミリモル）と１滴のＤＭＦを加えた。この混合物を室温で２時間撹拌してから、濃縮乾固させた。ＥｔＯＨ（１００ｍＬ）を加えて、この混合物を室温で２時間撹拌してから濃縮乾固させて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ＝５：１）によって精製して、Ａ−４（４．５８７ｇ，７０％）を茶褐色のオイルとして得た。

[00161] 工程４：２−（４−（エトキシカルボニル）フェニル）酢酸（Ａ−５）の合成。Ａ−４（３．９２４ｇ，１６．６ミリモル）のＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ／ＥｔＯＨ（ｖ／ｖ＝６／６／１，６５ｍＬ）溶液へＬｉＯＨ・Ｈ_２Ｏ（７３１ｍｇ，１７．４ミリモル）を加えた。この反応溶液を室温で一晩撹拌した。ＴＨＦを減圧下に除去して、この水溶液を１Ｎ ＨＣｌでｐＨ＝３へ酸性化した。この固形物を濾過して真空で乾燥させて、Ａ−５（３．０２ｇ，８７％）を黄色の固形物として得た。

[00162] 工程５：４−（２−（２，４−ジメトキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸エチル（Ａ−６）の合成。Ａ−５（３．０２ｇ，１４．５ミリモル）のＤＣＭ（４５ｍＬ）溶液へ塩化オキサリル（７．３６ｇ，５８．０ミリモル）と１滴のＤＭＦを加えた。この混合物を室温で２時間撹拌してから、濃縮乾固させた。残渣をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶かし、ＡｌＣｌ_３（３．４８ｇ，２６．１ミリモル）と１，３−ジメトキシベンゼン（４．０ｇ，２９．０ミリモル）を０℃で加えた。添加後、この混合物を室温で一晩撹拌した。１Ｎ ＨＣｌ溶液（１００ｍＬ）を加えて、ＤＣＭ（５０ｍＬｘ３）で抽出した。合わせた有機相を飽和ＮａＨＣＯ_３（８０ｍＬ）と塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮してシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ＝１０：１）によって精製して、Ａ−６（３．３０１ｇ，６９％）を茶褐色のオイルとして得た。

[00163] 工程６：４−（２−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸エチル（Ａ−７）の合成。Ａ−６（３．３０ｇ，１０．０ミリモル）のＤＣＭ（５０ｍＬ）溶液へＢＢｒ_３（２５．０５ｇ，１００．０ミリモル）を−７８℃で加えた。添加後、この混合物を室温まで温めて、一晩撹拌した。１Ｎ ＨＣｌ溶液（１００ｍＬ）を注意深く加えた。この混合物を濃縮乾固させた。残渣をＥｔＯＨ（２００ｍＬ）に溶かして、再び濃縮乾固させた。この操作を２回繰り返して、残渣をＥｔＯＨ（８０ｍＬ）に溶かした。ＳＯＣｌ_２（３５．６９ｇ，３００．０ミリモル）を１０℃で加えた。この混合物を室温で一晩撹拌し、濃縮してシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ＝５：１）によって精製して、Ａ−７（中間体Ａ−１ａ）（２．４８ｇ，８２％）を黄色の固形物として得た。

方法２：４−（２−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸エチルの合成

[00164] 工程１：２−（４−（メトキシカルボニル）フェニル）酢酸（Ｂ−２）の合成。２−（４−ブロモフェニル）酢酸（Ｂ−１）（９１．３ｇ，０．４２モル、１．０当量）のＭｅＯＨ（１．５Ｌ）溶液へ乾燥ＴＥＡ（８５．８ｇ，０．８５モル、２．０当量）とＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ_２（３．４３ｇ，４．２ミリモル、１％）を加えた。この溶液をＣＯガス（４ＭＰａ）下に１２０℃で１６時間加熱した。次いで、これを濾過して、真空で濃縮した。残渣を５００ｍＬのＥＡと１Ｌの水に溶かした。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３によってｐＨ＝７．５へ中和して、分離させた。無機相をＥＡ（５００ｍＬｘ３）で抽出し、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ＝５へ酸性化した。濾過と真空での乾燥によって、６２．８ｇのＢ−２（白色の固形物、収率７６％）を得た。MS (ESI): m/z 195.1 [M+1]⁺。

[00165] 工程２：４−（２−（２，４−ジメトキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸メチル（Ｂ−３）の合成。Ｂ−２（１５ｇ，７７．３ミリモル）及びＤＭＦ（１滴）の無水ＤＣＭ（１５０ｍＬ）溶液へ塩化オキサリル（３３ｍＬ，３８６．０ミリモル）を０〜５℃で撹拌しながら滴下した。添加が完了した後で、この混合物を室温で２時間撹拌した。ＴＬＣ（ＰＥ／ＥＡ＝３／１，ＭｅＯＨで止める）がこの反応の完了していることを示したので、揮発物質を蒸発させて、残渣をＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、これを次の工程に直接使用した。

[00166] 三塩化アルミニウム（１６．５ｇ，１２３．７ミリモル）の無水ＤＣＭ（８０ｍＬ）懸濁液へ１，３−ジメトキシベンゼン（２１．３ｇ，１５４．６ミリモル）に続けて上記の塩化アシル溶液を５℃で加えた。この混合物を室温で一晩撹拌し、氷状の１Ｎ ＨＣｌ（２００ｍＬ）へ注意深く注いで、ＥＡ（１５０ｍＬｘ３）で抽出した。合わせた有機層を塩水（２００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して濃縮して茶褐色のオイルを得て、これをシリカゲルカラム（ＰＥ／ＥＡ＝５／１）によって精製して、Ｂ−３（１２ｇ，４９．６％）を黄色の固形物として得た。MS (ESI): m/z 315.1 [M+1]⁺。

[00167] 工程３：４−（２−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸エチル（中間体Ａ−１ａ）の合成。Ｂ−３（５５ｇ，１４１．６ミリモル）のＤＣＭ（６００ｍＬ）溶液へＢＢｒ_３（１６４ｍＬ，１．７モル）を−１０℃で滴下した。この添加が完了したとき、この混合物を室温で一晩撹拌して、撹拌しながら、砕氷（７００ｇ）へ注いだ。揮発物質を蒸発させて黄色の固形物を得て、これを高真空で乾燥させて、無水エタノール（５００ｍＬ）に溶かした。この溶液へ塩化チオニル（８０ｍＬ）を０〜１０℃で滴下した。この添加が完了したとき、生じる混合物を３時間加熱して還流させた。揮発物質を蒸発させて、残渣をＥＡ（６００ｍＬ）と飽和炭酸ナトリウム（２００ｍＬ）の間で分配した。有機相を分離させ、塩水（２００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して濃縮して茶褐色のスラリーを得て、これをＳＧＣ（ＰＥ／ＥＡ＝３／１）によって精製して、中間体Ａ−１ａ（２４．５ｇ，５８％）を黄色の固形物として得た。¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz, TMS): δ 12.58 (s, 1H), 8.01 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.69 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.05 (brs, 1H), 6.41 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.37 (s, 1H), 4.38 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 4.26 (s, 2H), 1.38 (t, J = 7 Hz, 3H). MS (ESI): m/z 301.1 [M+1]⁺。

方法３：４−（２−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸メチルの合成：

[00168] ４−（２−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸メチル（中間体Ａ−２ａ）の合成：Ｂ−２（合成については、方法２，工程１を参照のこと）（５０ｇ，２５７．５ミリモル）のＢＦ_３−Ｅｔ_２Ｏ（１５０ｍＬ）溶液へレゾルシノール（２８．４ｇ，２５７．５ミリモル）を室温で加えて、この混合物を９５℃で５．５時間加熱した。この混合物を室温へ冷やして、氷状の１０％ Ｎａ_２ＣＯ_３溶液（６００ｍＬ）へ撹拌しながら注いで、ＥＡ（５００ｍＬｘ４）で抽出した。合わせた有機層を水（５００ｍＬｘ３）と塩水（５００ｍＬｘ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過して濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（ＰＥ：ＥＡ＝７：１〜４：１）によって精製して、中間体Ａ−２ａ（１０．２ｇ，１３．８％）を黄色の固形物として得た。¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz): δ 12.38 (s, OH), 10.72 (s, OH), 7.91-7.95 (m, 3H), 7.43 (d, J = 8 Hz, 1H), 6.41 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.28 (d, J = 1 Hz, 1H), 4.42 (s, 2H), 3.84 (s, 3H); MS (ESI): m/z 287.1 [M+1]⁺。

[00169] 中間体Ｂ：４−（２−（２−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸メチルの合成。４−（２−（２，４−ジメトキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸メチル（Ｂ−３，中間体Ａ−１ａの方法２を参照のこと）（２．５ｇ，８．０ミリモル）のＤＣＭ（２５ｍＬ）溶液へＢＢｒ_３／ＤＣＭ（８ｍＬ，８ミリモル、ＤＣＭ中１モル／Ｌ）を−７８℃で加えた。この添加が完了したとき、この混合物をそのまま室温へ温めて、１時間撹拌した。１Ｎ ＨＣｌ溶液（１０ｍＬ）を注意深く加えた。この混合物を飽和Ｎａ_２ＣＯ_３（２０ｍＬ）と塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮乾固させた。この粗製物を Combi-Flash（ＰＥ：ＥＡ＝１０：１）によって精製して、中間体Ｂ（６００ｍｇ，２５％）を黄色の固形物として得た。¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz, TMS): δ 12.60 (s, 1H) 8.01 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.71 (d, J = 9.0 Hz ,1H), 7.34 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.42 (d, J = 9.0 Hz ,2H) ,4.27 (s, 2H), 3.90 (s, 3H) ,3.83 (s, 3H); MS (ESI): m/z 301.1 [M+1]⁺。

[00170] 中間体Ｃ：４−（２−（５−クロロ−２，４−ジヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸メチルの合成。Ｂ−２と４−クロロベンゼン−１，３−ジオールより出発して、方法３，中間体Ａ−２ａに記載の手順に従った。粗生成物を精製せずに使用した。MS (ESI): m/z321.0 [M+1]⁺。

[00171] 中間体Ｄ：４−（２−（５−フルオロ−２，４−ジヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸メチルの合成。Ｂ−２と４−フルオロベンゼン−１，３−ジオールより出発して、方法３，中間体Ａ−２に記載の手順に従った。MS (ESI): m/z 305.0 [M+1]⁺。

[00172] 中間体Ｅ：４−（２−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル）−２−フルオロ安息香酸メチルの合成
[00173] 工程１：１−ブロモ−４−（ブロモメチル）−２−フルオロベンゼンの合成。１−ブロモ−２−フルオロ−４−メチルベンゼン（２．５ｇ，１３．３ミリモル）のトリフルオロメチルベンゼン（２５ｍＬ）溶液へＮＢＳ（２．３５ｇ，１３．３ミリモル）及びＡＩＢＮ（９４５ｍｇ，６．７ミリモル）の混合物を、８５℃で３０分間、５分量で加えた。この混合物を８５℃で３時間撹拌した。不溶物を濾過して除いて、濾液を蒸発させて、１−ブロモ−４−（ブロモメチル）−２−フルオロベンゼン（２．７ｇ，７７％）を淡黄色のオイルとして得て、これを次の工程に直接使用した。

[00174] 工程２：２−フルオロ−４−（２−メトキシ−２−オキソエチル）安息香酸メチルの合成。１−ブロモ−４−（ブロモメチル）−２−フルオロベンゼン（５．４ｇ，２０．４ミリモル）のＭｅＯＨ（１５０ｍＬ）溶液へＴＥＡ（２．８ｍＬ，２０．４ミリモル）とＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ_２（１．３ｇ，２ミリモル）を加えた。この混合物をＣＯ（０．５ＭＰａ）下に６０℃で２時間撹拌した。追加のＴＥＡ（４．３ｍＬ，３０．６ミリモル）を加えて、この混合物をＣＯ（４ＭＰａ）下に１２０℃まで２０時間加熱した。溶媒を真空で除去して、残渣を Combi-Flash（８０ｇのシリカゲル、ＰＥ／ＥＡ＝１０：０で開始して１：３への勾配、６０ｍＬ／分、６０分、総溶媒量：３．６Ｌ）によって精製して、生成物（１．５ｇ，３３％）を無色のオイルとして得た。MS (ESI): m/z 227.1 [M+1]⁺。

[00175] 工程３：２−（３−フルオロ−４−（メトキシカルボニル）フェニル）酢酸の合成。中間体Ａ−１ａの合成の方法１における、化合物Ａ−４の化合物Ａ−５への変換に記載の手順に従った。MS (ESI): m/z 213.0 [M+1]⁺。

[00176] 工程４：４−（２−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル）−２−フルオロ安息香酸メチル（中間体Ｅ）の合成。２−（３−フルオロ−４−（メトキシカルボニル）フェニル）酢酸を使用して、方法３（中間体Ａ−２ａを参照のこと）に記載の手順に従ったが、ここでは反応物を６０℃で一晩、そして９５℃で２時間撹拌した。¹H NMR (CDCl3-d₆, 500 MHz, TMS): δ 12.47 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.94 (t, J = 8.0 Hz ,1H), 7.69 (d,J = 8.5 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.08 (d, J = 11.5 Hz, 1H) , 6.43 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.41 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 4.26 (s, 2H), 3.94 (d, J = 2.5 Hz, 3H); MS (ESI): m/z 305.1 [M+1]⁺。

[00177] 中間体Ｆ：３−クロロ−４−（２−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸メチルの合成
[00178] 工程１：３−クロロ−４−メチル安息香酸メチルの合成。３−クロロ−４−メチル安息香酸（２０ｇ，１１７ミリモル）のＭｅＯＨ（２００ｍＬ）溶液へ塩化チオニル（２５．６ｍＬ，３５２ミリモル）を０℃で撹拌しながら滴下した。この混合物を室温で５日間撹拌した。この反応物を濃縮した。残渣をＥＡ（５００ｍＬ）に溶かし、１０％ Ｎａ_２ＣＯ_３（２５０ｍＬｘ２）、水（２５０ｍＬ）、及び塩水（２５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過して濃縮して、生成物（２０．８ｇ，９６％）を黄色の固形物として得た。

[00179] 工程２：４−（ブロモメチル）−３−クロロ安息香酸メチルの合成。３−クロロ−４−メチル安息香酸メチルを使用して中間体Ｅの合成中の工程１に従って、生成物（１０ｇ，７８％）を得た。MS (ESI): m/z263.0 [M+1]⁺。

[00180] 工程３：３−クロロ−４−（２−メトキシ−２−オキソエチル）安息香酸メチルの合成。４−（ブロモメチル）−３−クロロ安息香酸メチル（１０ｇ，３７．９５ミリモル）のＭｅＯＨ（３００ｍＬ）溶液へＴＥＡ（４．２ｍＬ，３０．３６ミリモル）とＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ_２（２．８ｇ，３．８ミリモル）を加えた。この反応物を０．４ＭＰａ ＣＯ気圧下に６０℃で３時間加熱し、濾過して濃縮した。残渣を Combi-Flash（１２０ｇのシリカゲル、ＰＥ／ＥＡ＝１０：０で開始して５：１への勾配による、６０ｍＬ／分、６０分、総溶媒量：３．６Ｌ）によって精製して、生成物（２．７ｇ，２９％）を白色の固形物として得た。MS (ESI): m/z 243.0 [M+1]⁺。

[00181] 工程４：２−（２−クロロ−４−（メトキシカルボニル）フェニル）酢酸の合成。中間体Ａ−１ａの合成の方法１における、化合物Ａ−４の化合物Ａ−５への変換に記載の手順に従った。

[00182] 工程５：３−クロロ−４−（２−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸メチル（中間体Ｆ）の合成。２−（２−クロロ−４−（メトキシカルボニル）フェニル）酢酸を使用して、方法３（中間体Ａ−２ａを参照のこと）に記載の手順に従った。¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz, TMS): δ 12.09 (s, 1H), 10.72 (brs, 1H), 7.97-7.88 (m, 3H), 7.57 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.44 (dd, J = 2.5, 8.5 Hz, 1H), 6.30 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 4.62 (s, 2H), 3.87 (s, 3H); MS (ESI): m/z 321.1 [M+1]⁺。

[00183] 中間体Ｇ：４−（２−（２，４−ジヒドロキシ−５−メトキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸メチルの合成
[00184] 工程１：酢酸４−ホルミル−２−メトキシフェニルの合成。４−ヒドロキシ−３−メトキシベンズアルデヒド（１０ｇ，６６ミリモル）の３０ｍＬのＴＨＦ溶液へＡｃ_２Ｏ（８ｇ，８０ミリモル）とＴＥＡ（２０ｇ，１９８ミリモル）を加えた。この反応物を室温で一晩撹拌した。揮発物質を蒸発させて１５ｇの生成物をオイルとして得て、これをさらに精製せずに次の工程に使用した。

[00185] 工程２：酢酸４−（ホルミルオキシ）−２−メトキシフェニルの合成。酢酸４−ホルミル−２−メトキシフェニル（１５ｇ，７７ミリモル）のＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ）溶液へｍ−ＣＰＢＡ（３１ｇ，１５４ミリモル）を加えた。この溶液を５０℃で２．５時間還流させた。この溶液を飽和Ｎａ_２ＳＯ_３溶液（５０ｍＬ）、飽和Ｎａ_２ＣＯ_３溶液（５０ｍＬ）、及び塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過して真空で濃縮して、１６ｇの粗生成物を白色の固形物として得て、これをさらに精製せずに次の工程に使用した。

[00186] 工程３：４−メトキシベンゼン−１，３−ジオールの合成。酢酸４−（ホルミルオキシ）−２−メトキシフェニル（１６ｇ，７６ミリモル）のＴＨＦ（５０ｍＬ）／Ｈ_２Ｏ（５０ｍＬ）溶液へＬｉＯＨ（７．７ｇ，１８４．２ミリモル）を加えた。この反応物を室温で一晩撹拌した。揮発物質を減圧下に除去した。残渣をＥＡ（５０ｍＬｘ３）で抽出した。有機相を塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過して、真空で濃縮して黒色のオイルを得て、これをシリカゲルカラム（ＰＥ：ＥＡ＝３：１）によって精製して、４．８ｇ（４０％）の生成物を茶褐色の固形物として得た。

[00187] 工程４：４−（２−（２，４−ジヒドロキシ−５−メトキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸メチル（中間体Ｇ）の合成。４−メトキシベンゼン−１，３−ジオールを使用して、方法３（中間体Ａを参照のこと）に記載の手順に従った（ここでは、反応物を６０℃で一晩加熱した）。MS (ESI): m/z317.0 [M+1]⁺。

[00188] 中間体Ｈ：２−クロロ−４−（２−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸メチルの合成。
[00189] 工程１：１−ブロモ−４−（ブロモメチル）−２−クロロベンゼンの合成。１−ブロモ−２−クロロ−４−メチルベンゼンを使用して、中間体Ｅの工程１に従った。

[00190] 工程２：２−クロロ−４−（２−メトキシ−２−オキソエチル）安息香酸メチルの合成。中間体Ｅの工程２に従った。MS (ESI): m/z 243.0 [M+1]⁺。
[00191] 工程３：２−（３−クロロ−４−（メトキシカルボニル）フェニル）酢酸の合成。中間体Ｆの工程４に従った。MS (ESI): m/z 229.0 [M+1]⁺。

[00192] 工程４：２−クロロ−４−（２−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸メチル（中間体Ｈ）の合成。中間体Ｆの工程５に従った。MS (ESI): m/z 321.7 [M+1]⁺。

[00193] 中間体Ｉ：４−（２−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル）−３−メトキシ安息香酸メチルの合成。
[00194] 工程１：３−メトキシ−４−メチル安息香酸メチルの合成。３−メトキシ−４−メチル安息香酸より出発した（中間体Ｆの工程１を参照のこと）。MS (ESI): m/z 181.1 [M+1]⁺。

[00195] 工程２：４−（ブロモメチル）−３−メトキシ安息香酸メチルの合成（中間体Ｆの工程２を参照のこと）。MS (ESI): m/z 259.1 [M+1]⁺。
[00196] 工程３：３−メトキシ−４−（２−メトキシ−２−オキソエチル）安息香酸メチルの合成（中間体Ｆの工程３を参照のこと）。MS (ESI): m/z 239.1 [M+1]⁺。

[00197] 工程４：２−（２−メトキシ−４−（メトキシカルボニル）フェニル）酢酸の合成（中間体Ｆの工程４を参照のこと）。MS (ESI): m/z 225.1 [M+1]⁺。
[00198] 工程５：４−（２−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル）−３−メトキシ安息香酸メチルの合成（中間体Ｆの工程５を参照のこと）。¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz, TMS): δ 12.33 (s, 1H), 10.68 (s, 1H), 7.93 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.55 (dd, J = 1.0, 7.0 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.41 (dd, J = 2.0, 9.0 Hz, 1H), 6.27 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 4.36 (s, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.79 (s, 3H); MS (ESI): m/z 317.1 [M+1]⁺。

[00199] 中間体Ｊ：４−（２−（５−ブロモ−２−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸メチルの合成。
[00200] 工程１：４−（２−（５−ブロモ−２，４−ジメトキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸メチルの合成。Ｂ−２と１−ブロモ−２，４−ジメトキシベンゼンを使用して、方法２の工程２に従った（中間体Ａを参照のこと）。MS (ESI): m/z 395.0 [M+1]⁺。

[00201] 工程２：４−（２−（５−ブロモ−２−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸メチル（中間体Ｊ）の合成。４−（２−（５−ブロモ−２，４−ジメトキシフェニル）−２−オキソエチル）安息香酸メチル（１．１ｇ，２．８ミリモル）のＤＣＭ（１００ｍＬ）溶液へＡｌＣｌ_３（７．４ｇ，５６ミリモル）を加えて、この混合物を室温で１時間撹拌した。次いで、この混合物を氷水（１００ｍＬ）へ注いで、ＤＣＭ（２０ｍＬｘ４）で抽出した。有機相を塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過して濾液を真空で濃縮して茶褐色のオイルを得て、これを分取用ＴＬＣ（ＰＥ／ＥＡ＝３／１）によって精製して、中間体Ｊ（７５０ｍｇ，７１％）を淡黄色の固形物として得た。MS (ESI): m/z 379.0 [M+1]⁺。

実施例２４：ＧＳＮＯＲアッセイ
[00202] 様々な化合物について、ＧＳＮＯＲ活性を阻害するその能力を in vitro で試験した。ＧＳＮＯＲの発現及び精製については、Biochemistry 2000, 39, 10720-10729 に記載されている。

[00203] ＧＳＮＯＲの発酵処理：１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ＸＹＴ培地中のＧＳＮＯＲグリセロールストックの穿刺物より、３７℃で一晩のインキュベーション後にプレ培養物を増殖させた。次いで、アンピシリンを含有する新鮮な２ＸＹＴ（４Ｌ）へ細胞を加えて、３７℃で０．６〜０．９のＯＤ（Ａ_６００）にまで増殖させた後で誘導した。２０℃で一晩のインキュベーションにおいて、ＧＳＮＯＲ発現を０．１％アラビノースで誘導した。

[00204] ＧＳＮＯＲの精製：大腸菌細胞ペーストを窒素キャビテーションによって溶解させて、澄明化した溶解物をＡＫＴＡ ＦＰＬＣ（アマーシャム・ファルマシア）でのＮｉアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。このカラムを、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）／２５０ｍＭ ＮａＣｌにおいて０〜５００ｍＭのイミダゾール勾配で溶出させた。Ｓｍｔ−ＧＳＮＯＲ融合物を含有する溶出ＧＳＮＯＲ画分をＵｌｐ−１で、４℃で一晩消化させてアフィニティータグを外してから、同じ条件下にＮｉカラムで再操作した。ＧＳＮＯＲをフロースルー画分に回収して、結晶解析のためには、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＤＴＴ、１０μＭ ＺｎＳＯ_４中のＱ−セファロース及びヘパリンフロースルークロマトグラフィーによってさらに精製する。

[00205] ＧＳＮＯＲアッセイ：ＧＳＮＯ溶液と酵素／ＮＡＤＨ溶液は、それぞれの日に用時作製する。これらの溶液は、濾過して、そのまま室温へ温める。ＧＳＮＯ溶液：１００ｍＭ ＮａＰＯ_４（ｐＨ７．４）、０．４８０ｍＭ ＧＳＮＯ。３９６μＬのＧＳＮＯ溶液に続いて、ＤＭＳＯ中の試験化合物（又は、完全な反応対照ではＤＭＳＯのみ）の８μＬをキュベットへ加えて、ピペット先端で混合する。試験すべき化合物は、１００％ ＤＭＳＯ中１０ｍＭのストック濃度で作製する。２倍の連続希釈を１００％ ＤＭＳＯで行う。アッセイ液中のＤＭＳＯの最終濃度が１％となるように、各希釈液の８μＬをアッセイ液へ加える。試験する化合物の濃度は、１００〜０．００３μＭの範囲に及ぶ。酵素／ＮＡＤＨ溶液：１００ｍＭ ＮａＰＯ_４（ｐＨ７．４）、０．６００ｍＭ ＮＡＤＨ、１．０μｇ／ｍＬ ＧＳＮＯレダクターゼ。３９６μＬの酵素／ＮＡＤＨ溶液を先のキュベットへ加えて、この反応を開始させる。キュベットを Cary 3E UV/可視分光光度計に入れて、３４０ｎｍ吸光度／分の変化を２５℃で３分間記録する。アッセイは、各化合物濃度について同一３検体で行う。SigmaPlot の酵素反応速度分析モジュールでの標準曲線解析を使用して、各化合物のＩＣ_５０を計算する。

[00206] 最終アッセイ条件：１００ｍＭ ＮａＰＯ_４（ｐＨ７．４）、０．２４０ｍＭ ＧＳＮＯ、０．３００ｍＭ ＮＡＤＨ、０．５μｇ／ｍＬ ＧＳＮＯレダクターゼ、及び１％ ＤＭＳＯ。最終容量：８００μＬ／キュベット。

[00207] ＧＳＮＯＲ阻害剤の活性：実施例１〜２１に記載の化合物について、ＧＳＮＯＲ阻害活性を定量して、ＩＣ_５０値を入手した。ＧＳＮＯＲ阻害剤の化合物、実施例１〜２１は、約５μＭ未満のＩＣ_５０を有した。ＧＳＮＯＲ阻害剤の化合物、実施例１、２、３、５、６、１０、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０は、約０．５μＭ未満のＩＣ_５０を有した。ＧＳＮＯＲ阻害剤の化合物、実施例１、１０、１４、１５、１６、１８、及び２０は、約０．１μＭ未満のＩＣ_５０を有した。

実施例２５：マウス薬物動態（ＰＫ）試験
実験モデル
[00208] マウスを使用して、ＧＳＮＯＲ阻害剤の薬物動態を決定する。この種は、経口（ＰＯ）と静脈内（ＩＶ）の両方で試験品を投与することによって化合物のバイオアベイラビリティを評価するのに広く使用されている。ＩＶ又はＰＯ投与のいずれかによる雄性ＢＡＬＢ／ｃにおいてピーク活性の時点で血漿曝露を評価することによって、ＧＳＮＯＲ阻害剤の効力を比較することができる。

材料と方法
ＧＳＮＯＲ阻害剤のＩＶ投与
[00209] ＧＳＮＯＲ阻害剤の化合物１０をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）／１０％ Ｓｏｌｕｔｏｌ（ＨＳ１５）の澄明な溶液に戻し、０．２ｍｇ／ｍＬの濃度を得て、マウスへ単回ＩＶ用量（２ｍｇ／ｋｇ）として投与した。動物に外側尾静脈より投薬した。イソフルラン麻酔下での心臓穿刺によって指定の時点（０．０８３、０．２５、０．５、１、２、４、８、１６、２４時間）で血液試料（各動物で１ｍＬまでの血液）を採取した。血液は、Ｌｉ−ヘパリンを含有する試験管へ採取した。この血液試料を氷上に保存して、採取からほぼ３０分以内に遠心分離させた。ラベルを付けたポリプロピレン管へ血漿を移して、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析するまで、−７０℃で冷凍した。

ＧＳＮＯＲ阻害剤のＰＯ投与
[00210] ＧＳＮＯＲ阻害剤、化合物１０を４０％プロピレングリコール／４０％炭酸プロピレン／２０％の５％ショ糖の澄明な溶液へ戻し、２ｍｇ／ｍＬの濃度を得て、マウスへ単回経口用量（１０ｍｇ／ｋｇ）としてガバージュにより投与した。イソフルラン麻酔下での心臓穿刺によって投薬後０．２５、０．５、１、２、４、８、１２、１６、２０、及び２４時間で血液試料を採取した。血液は、Ｌｉ−ヘパリンを含有する試験管へ採取した。この血液試料を氷上に保存して、採取からほぼ３０分以内に遠心分離させた。ラベルを付けたポリプロピレン管へ血漿を移して、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析するまで、−７０℃で冷凍した。

ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析
[00211] 各時点での血漿試料について、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して、１ｎｇ／ｍＬの定量下限（ＬＬＯＱ）で分析した。血漿を分析して各試料中のＧＳＮＯＲ阻害剤の量を定量して、それぞれのＧＳＮＯＲ阻害剤について、関連するマトリックスにおいて回帰曲線を作成した。

[00212] ＩＶ投与とＰＯ投与の両方についてＰＫ変数を計算するためにＷｉｎＮｏｎｌｉｎ分析を使用した：
ＩＶ部分のＰＫ変数−ＡＵＣ_ｌａｓｔ；ＡＵＣ_ＩＮＦ；Ｔ１／２；Ｃｌ；Ｖｓｓ；Ｃ_ｍａｘ；ＭＲＴ
ＰＯ部分のＰＫ定数−ＡＵＣ_ｌａｓｔ；ＡＵＣ_ＩＮＦ；Ｔ１／２；Ｃ_ｍａｘ；Ｃｌ，ＭＲＴ。

[00213] 上記のＰＫ変数に加えて、バイオアベイラビリティ（％Ｆ）の計算を実施した。
結果
[00214] ＩＶ投与：ＧＳＮＯＲ阻害剤、化合物１０の血漿レベルを投薬後２４時間まで測定した。

[00215] 経口投与：化合物１０の血漿レベルを投薬後２４時間まで測定し、曲線下面積に基づいて、平均の経口バイオアベイラビリティを定量した。化合物１０は、１７パーセントより高い経口バイオアベイラビリティを有した。

実施例２６．実験喘息におけるＧＳＮＯＲｉの効力
実験喘息モデル：
[00216] 卵白アルブミン（ＯＶＡ）誘発喘息のマウスモデルを使用して、ＧＳＮＯＲ阻害剤について、メタコリン（ＭＣｈ）誘発性気管支収縮／気道過敏反応に対する効力をスクリーニングする。これは、ヒトの喘息に類似した急性アレルギー喘息の表現型を提示する、広く使用されていて、十分に特徴づけられたモデルである。ＭＣｈでのチャレンジに先立ってＧＳＮＯＲ阻害剤を投与する予防プロトコールを使用して、ＧＳＮＯＲ阻害剤の効力について評価する。全身プレチスモグラフィー（Ｐ_ｅｎｈ；Buxco）を使用して、増加用量のＭＣｈでのチャレンジに応じた気管支収縮応答を評価する。肺炎症の尺度として気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）への好酸球浸潤物の量も定量する。ＧＳＮＯＲ阻害剤の効果を担体と陽性対照としてのコンビベント（吸入；ＩＨ）と比較する。

材料と方法
アレルゲン感作及びチャレンジのプロトコール
[00217] ＰＢＳ中のＯＶＡ（５００μｇ／ｍｌ）を等量の蒸留水中１０％（ｗ／ｖ）硫酸アルミニウムカリウムと混合して、１０Ｎ ＮａＯＨを使用してｐＨ６．５へ調整後、室温で６０分間インキュベートする。７５０ｘｇで５分間の遠心分離後、ＯＶＡ／ミョウバンペレットを蒸留水中の元の容量へ再懸濁させる。０日目に、ミョウバンと複合させた１００μｇ ＯＶＡ（生理食塩水中５００μｇ／ｍＬの０．２ｍＬ）の腹腔内（ＩＰ）注射液をマウスに与える。生理食塩水中のケタミン及びキシラジン（それぞれ、０．４４及び６．３ｍｇ／ｍＬ）の０．２ｍＬ混合物のＩＰ注射によってマウスを麻酔して、ボード上に背臥位で置く。各動物の舌の裏側に２５０マイクログラム（２．５ｍｇ／ｍｌの１００μｌ）のＯＶＡ（８日目）と１２５μｇ（２．５ｍｇ／ｍｌの５０μｌ）のＯＶＡ（１５、１８、及び２１日目）を入れる。

肺機能検査（Ｐｅｎｈ）
[00218] 有意識で自由に動き、自発的に呼吸するマウスにおける最後のＯＶＡチャレンジから２４時間後に、Buxco チャンバ（ノースカロライナ州ウィルミントン）を使用する全身プレチスモグラフィーで、メタコリンへの in vivo 気道反応性を測定する。超音波ネブライザーによって産生する、エアゾール化した生理食塩水又は増加用量のメタコリン（５、２０、及び５０ｍｇ／ｍＬ）でマウスを２分間チャレンジする。気管支収縮の度合いは、同一マウスの気道抵抗性、インピーダンス、及び胸腔内圧の測定値と相関する、無次元の計算値である向上休止（Ｐ_ｅｎｈ）として表す。それぞれの噴霧化チャレンジ後４分間のＰ_ｅｎｈ読取り値を取って、平均化する。Ｐ_ｅｎｈは、以下のように計算する：Ｐ_ｅｎｈ＝［（Ｔ_ｅ／Ｔ_ｒ−１）ｘ（ＰＥＦ／ＰＩＦ）］（ここでＴ_ｅは無効化時間であり、Ｔ_ｒは弛緩時間であり、ＰＥＦはピーク呼気流量であり、ＰＩＦはピーク吸気流量ｘ０．６７係数である）。最大値からユーザー定義の最大値百分率へ変化させるボックス圧力の時間が弛緩時間を表す。Ｔ_ｒ測定は、最大ボックス圧力で始めて、４０％で終える。

ＢＡＬＦ中の好酸球浸潤
[00219] 気道過敏反応性の測定の後で、マウスを心臓穿刺によって失血させてから、両肺より、又は左肺を主気管支で結紮後に右肺より、ＢＡＬＦを採取する。０．０５ｍＬアリコートより全ＢＡＬＦ細胞を計数し、残る体液を４℃、２００ｘｇで１０分間遠心分離させる。細胞ペレットを１０％ ＢＳＡ含有生理食塩水に再懸濁させて、スライドガラス上に塗抹標本を作製する。好酸球を０．０５％エオジン水溶液と蒸留水中５％アセトンで５分間染色し、蒸留水で濯いで、０．０７％メチレンブルーで対比染色する。

ＧＳＮＯＲ阻害剤と対照
[00220] ＧＳＮＯＲ阻害剤をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）において０．００００５〜３ｍｇ／ｍＬに及ぶ濃度で戻す。ＧＳＮＯＲ阻害剤をマウスへ単回用量（１０ｍＬ／ｋｇ）として、静脈内（ＩＶ）又は経口ガバージュのいずれかにより投与する。投薬は、ＭＣｈチャレンジの３０分〜２４時間前に実施する。ＧＳＮＯＲ阻害剤の効果を、同じやり方で投薬したＰＢＳ担体と比較する。

[00221] すべての試験において、陽性対照としてコンビベント（Combivent）を使用する。コンビベント（ベーリンガー・インゲルハイム）は、その生成物が供給される吸入器デバイスを使用して肺へ投与されるが、マウスへの投与には、ピペット先端を使用して適用する。コンビベントは、ＭＣｈチャレンジの４８時間、２４時間、及び１時間前に投与する。コンビベントのそれぞれのパフ（又は用量）は、１８μｇの臭化イパトロピウム（ＩｐＢｒ）と１０３μｇの硫酸アルブテロール、又はほぼ０．９ｍｇ／ｋｇのＩｐＢｒと５ｍｇ／ｋｇのアルブテロールの用量を提供する。

統計分析
[00222] ベースライン、生理食塩水、及び増加用量のＭＣｈチャレンジに対するＰ_ｅｎｈの曲線下面積値を、GraphPad Prism 5.0（カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して計算して、それぞれの（ＩＶ又は経口投与）担体対照のパーセントとして表す。片側ＡＮＯＶＡ，Dunnetts（ＪＭＰ ８．０，ＳＡＳ研究所、ノースカロライナ州キャリー）を使用して、各試験内の処置群とそれぞれの担体対照群の間の統計学的な差を計算する。処置群とそれぞれの担体対照群の間のｐ値が０．０５未満であれば、有意差があるとみなす。

実施例２７：実験炎症性腸疾患（ＩＢＤ）におけるＧＳＮＯＲ阻害剤の効力
実験モデル
[00223] マウスのデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発性ＩＢＤの急性モデルを使用して、この疾患に対するＧＳＮＯＲ阻害剤の効力を探究する。急性ＤＳＳ誘発ＩＢＤは、このヒト疾患で観察されるものに似た結腸中の病理学的変化を誘発する、広く使用されてよく特徴付けられたモデルである。このモデルとヒトの疾患では、結腸の陰窩内の上皮細胞が破壊されて、上皮壁の機能不全と続発する組織炎症、浮腫、及び潰瘍形成をもたらす。ＧＳＮＯＲ阻害剤療法は、ｓ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ）レベルを回復させることによってＩＢＤに益して、それにより上皮壁の機能不全を予防するか又は逆転させる可能性がある。

[00224] 飲料水中のＤＳＳの数日にわたる投与によって、実験ＩＢＤを誘発する。ＧＳＮＯＲ阻害剤を静脈内（ＩＶ）投薬により連日投与する。スコア＝０（正常組織）〜スコア＝４（潰瘍性の組織傷害と顕著な病理学的変化）の範囲に及ぶ５点尺度を使用して、内視鏡と組織病理学により処置の効果を評価する。ＧＳＮＯＲ阻害剤の効果を担体処置対照と比較する。本試験ではコルチコステロイドのプレドニンを陽性対照として使用して、経口投薬により連日投与する。無処置マウスも正常組織対照として評価する。

材料と方法
[00225] 飲料水中３％ ＤＳＳの試験０日目〜５日目での投与によって、実験ＩＢＤを誘発する。ＧＳＮＯＲ阻害剤をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中０．２及び２ｍｇ／ｍｌの濃度へ戻す。各マウスに１及び１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で０．１ｍｌ ＧＳＮＯＲ阻害剤溶液を連日ＩＶ投与してマウスを処置する。ＧＳＮＯＲ阻害剤の投薬は、ＤＳＳ投与の２日前に開始して、試験の最終日まで（−２日目〜７日目）継続する。担体対照としてＰＢＳを使用して、ＧＳＮＯＲ阻害剤と同じやり方で投与する。本試験の陽性対照としてコルチコステロイドのプレドニゾロンを使用して、毎日（−２日目〜７日目）３ｍｇ／ｋｇ／日の用量で経口投与する。

[00226] 薬物処置の効果は、７日目に内視鏡と組織病理学により評価する。初めにマウスを吸入イソフルランで麻酔して、獣医学用内視鏡（Karl Storz Veterinary Endoscopy America 社、カリフォルニア州ゴレタ）を使用する内視鏡検査へ処す。各マウスについて、内視鏡スコア基準を使用して、粘膜損傷をスコア化する。内視鏡スコアの０は正常であり、１は血管分布の欠損であり、２は血管分布の欠損と破砕性であり、３は破砕性と糜爛であり、そして４は潰瘍形成と出血である。内視鏡検査に続き、二酸化窒素吸入での窒息によりマウスを安楽死させる。次いで、結腸切片をホルマリン固定し、パラフィン包埋、切片化して、ヘマトキシリン−エオジンで染色する。光学顕微鏡法により結腸切片を検査して、ＧＩ病理学の特別な訓練を受けた認定獣医病理学者によって、盲検形式で評価する。炎症、浮腫、及び壊死に基づいて、上皮、結合組織、及び粘膜下組織への病理学的変化をスコア化する（０のスコアは正常であり、１は微小であり、２は軽度であり、３は中等度であり、そして４は顕著な変化である）。

実施例２８：実験慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）におけるＧＳＮＯＲ阻害剤の効力
実験ＣＯＰＤモデル
[00227] マウスのエラスターゼ誘発性ＣＯＰＤの急性モデルを使用して、この疾患に対するＧＳＮＯＲ阻害剤の効力を探究する。エラスターゼ誘発性ＣＯＰＤは、このヒト疾患で観察されるものに似た肺中の病理学的変化を誘発する、広く使用されてよく特徴付けられたモデルである。このモデルとヒトの疾患では、気道閉塞、肺炎症、及び気胞拡大が明白である。ＧＳＮＯＲ阻害剤療法は、これらの化合物の気管支拡張作用と抗炎症作用を介してＣＯＰＤに益する可能性がある。

[00228] エラスターゼ、パパイン、及びブタ膵臓エラスターゼ（ＰＰＥ）の肺中への数日にわたる投与によって、実験ＣＯＰＤを誘発させる。ＧＳＮＯＲ阻害剤は、経口投薬により連日投与する。メタコリン（ＭＣｈ）エアゾールチャレンジに応答する気管支収縮を弱める、肺炎症を減少させる、そして肺胞における気胞拡大を抑えるＧＳＮＯＲ阻害剤の能力を評価することによって、効力を決定する。ＧＳＮＯＲ阻害剤の効果を担体処置対照と比較する。本試験では、好中球及び単球の動員を妨げる、連日の経口ＳＰ ＣＸＣ受容体２／受容体１（ＳＰ ＣＸＣＲ２／１）アンタゴニストと吸入Ｆｌｏｖｅｎｔ（フルチカゾン；コルチコステロイド）の組合せを陽性対照として使用する。

材料と方法
[00229] ８０μｇパパインと２０Ｕ／ｍｇ ＰＰＥ／マウス／日の気管内（ＩＴ）点滴注入による試験０日目〜７日目の投与によって実験ＣＯＰＤを誘発させる。ＧＳＮＯＲ阻害剤は、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中０．０１、０．１、及び１ｍｇ／ｍｌの濃度へ戻す。０．１、１、及び１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量のために各マウスへ０．１ｍｌ ＧＳＮＯＲｉ溶液を連日経口投与（ガバージュ）して、マウスを処置する。担体対照としてＰＢＳを使用して、連日の経口投薬により投与する。低分子アンタゴニストのＳＰ ＣＸＣＲ２／Ｒ１（シェリングプラウ／メルク）［好中球及び単球の動員のためのサイトカイン走化性物質に対して受容体をブロックする］をコルチコステロイドのＦｌｏｖｅｎｔ（グラクソ）と組み合わせて、本試験の陽性対照として使用する。ＳＰ ＣＸＣＲ２／Ｒ１は、５０ｍｇ／ｋｇ／日で経口投薬する。Ｆｌｏｖｅｎｔは、２２０μｇ／マウス／日で吸入により投薬する。マウスの第一群をＧＳＮＯＲ阻害剤、担体対照、又は陽性対照で７日間（試験８日目〜１４日目）処置し、一方マウスの第二群は、ＧＳＮＯＲ阻害剤、担体対照、又は陽性対照で１４日間（試験８日目〜２１日目）処置する。

[00230] 薬物処置の効果は、処置後７日目と１４日目に、メタコリン誘発性気管支収縮の減弱化（気管支拡張効果）、肺炎症の減弱化、及び肺胞中の気胞拡大の抑制（処置後１４日目のみ）を測定することによって評価する。

気管支拡張効果
[00231] メタコリンに対する in vivo 気道反応性は、有意識で自由に動き、自発的に呼吸するマウスにおいて、Buxco チャンバ（ノースカロライナ州ウィルミントン）を使用する全身プレチスモグラフィーで測定する。超音波ネブライザーによって発生させるエアゾール化生理食塩水又は増加用量（５、２０、及び５０ｍｇ／ｍｌ）のメタコリンでマウスを２分間チャレンジする。気管支収縮の度合いは、同一マウスの気道抵抗性、インピーダンス、及び胸腔内圧の測定値と相関する、無次元の計算値である向上休止（Ｐｅｎｈ）として表す。それぞれの噴霧化チャレンジ後４分間のＰｅｎｈ読取り値を取って、平均化する。Ｐｅｎｈは、以下のように計算する：Ｐｅｎｈ＝［（Ｔ_ｅ／Ｔ_ｒ−１）ｘ（ＰＥＦ／ＰＩＦ）］（ここでＴ_ｅは無効化時間であり、Ｔ_ｒは弛緩時間であり、ＰＥＦはピーク呼気流量であり、ＰＩＦはピーク吸気流量ｘ０．６７係数である）。最大値からユーザー定義の最大値百分率へ変化させるボックス圧力の時間が弛緩時間を表した。Ｔ_ｒ測定は、最大ボックス圧力で始めて、４０％で終えた。

抗炎症効果
[00232] 気道過敏反応性の測定の後で、マウスを心臓穿刺によって失血させてから、左肺を主気管支で結紮後に右肺より、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を採取する。全ＢＡＬＦ細胞を計数し、残る体液を４℃、２００ｘｇで１０分間遠心分離させる。細胞ペレットを１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有生理食塩水に再懸濁させて、サイトスピンを使用してスライドガラス上に塗抹標本を作製する。光学顕微鏡法による白血球（ＷＢＣ）分析血液像算定用に Diff-Quik で細胞を染色する。上皮細胞を計数して、細胞全数より差し引く。標準の形態判定基準を使用して好酸球、マクロファージ、好中球、及びリンパ球の比率を算定し、白血球（ＷＢＣ）全数の百分率として表す。

[00233] 抗炎症効果の追加のパラメータとして、ＢＡＬＦ中の好中球及び単球の走化性物質のレベルを抑える処置の能力も評価する。好中球と単球のそれぞれの動員のケモカインである、ＧＲＯα（増殖関連腫瘍遺伝子α）としても知られるＫＣ（角化細胞走化性物質）とＪＥ（ＭＣＰ−１，単球走化性タンパク質）について、イムノアッセイを使用して測定する。

気胞拡大の抑制
[00234] １０％緩衝化ホルムアルデヒドを含む２５ｃｍ水圧での一定の陽圧下で両肺を膨張させてから、灌流固定する。この固定肺をパラフィンに包埋し、ヘマトキシリン及びエオジンで染色させ、光学顕微鏡法により検査する。平均線形切片（Ｌｍ）と平均等価肺胞径（Ｄ２）を計算することによって、気胞拡大を形態学的に定量する。

[00235] 当業者には、本発明の精神及び範囲より逸脱することなく、本発明の方法及び組成物において様々な変更態様（modifications）及び変形態様（variations）を作製し得ることが明らかであろう。

Claims (10)

1. 式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容される塩：
   

   

   ［式中、
   Ｒ_１は、ＣＦ_３、ＣＦ_２Ｈ、ＣＦ_２ＣＨ_３、ＣＦ_２ＣＨ_２ＣＨ_３、メチル、イソプロピル、イソブチル、シクロペンチル、ＣＨ_２ＯＣＨ_３、ＳＣＨ_３、ベンジル、チオフェン−２−イル、及びチオフェン−３−イルからなる群より選択され；
   Ｒ_２は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、メトキシ、及びシアノより選択され；
   Ｒ_３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、及びメトキシより選択される］。
2. Ｒ_１が、ＣＦ_３、ＣＦ_２Ｈ、及びＣＦ_２ＣＨ_３からなる群より選択され、Ｒ_２が水素である、請求項１の化合物又はその医薬的に許容される塩。
3. Ｒ_１が、ＣＦ_３、メチル、イソプロピル、及びイソブチルからなる群より選択され、Ｒ_２とＲ_３がともに水素である、請求項１の化合物又はその医薬的に許容される塩。
4. Ｒ_１が、ＣＦ_３、メチル、イソプロピル、イソブチル、ＣＦ_２Ｈ、ＣＦ_２ＣＨ_３、及びＣＦ_２ＣＨ_２ＣＨ_３からなる群より選択され、Ｒ_２とＲ_３がともに水素である、請求項１の化合物又はその医薬的に許容される塩。
5. ４−（２−（ジフルオロメチル）−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
   ４−（７−ヒドロキシ−２−（メトキシメチル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
   ４−（７−ヒドロキシ−２−イソプロピル−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
   ４−（２−シクロペンチル−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
   ４−（７−ヒドロキシ−２−メチル−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
   ４−（２−ベンジル−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
   ４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（チオフェン−２−イル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
   ４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（チオフェン−３−イル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
   ４−（７−ヒドロキシ−２−イソブチル−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
   ４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
   ４−（７−ヒドロキシ−２−（メチルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
   ４−（６−クロロ−７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
   ４−（６−フルオロ−７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
   ２−フルオロ−４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
   ３−クロロ−４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
   ４−（２−（１，１−ジフルオロエチル）−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
   ４−（７−ヒドロキシ−６−メトキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
   ２−クロロ−４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
   ４−（２−（１，１−ジフルオロプロピル）−７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
   ４−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）−３−メトキシ安息香酸；及び
   ４−（６−シアノ−７−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−クロメン−３−イル）安息香酸；
   からなる群より選択される、請求項１の化合物又はその医薬的に許容される塩。
6. 請求項１〜５のいずれかに記載の化合物又はその医薬的に許容される塩の治療有効量を医薬的に許容される担体又は賦形剤と一緒に含んでなる医薬組成物。
7. 肺の障害を治療する方法において用いられる、請求項６に記載の医薬組成物。
8. 医薬の製造における、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物またはその医薬的に許容される塩の使用。
9. 前記医薬が肺の障害の治療用である、請求項８に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩の使用。
10. 請求項１〜５のいずれかに記載の化合物又はその医薬的に許容される塩を医薬的に許容される担体又は賦形剤と混合することを含む、請求項６又は７に記載の医薬組成物の製造方法。