JP5638793B2

JP5638793B2 - 顕微鏡装置

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Publication number: JP5638793B2
Application number: JP2009275584A
Authority: JP
Inventors: 昭典顕谷; 中田　竜男; 竜男中田
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2009-12-03
Filing date: 2009-12-03
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2029-12-03
Also published as: JP2011118162A; US8730574B2; US20110134516A1

Description

本発明は、顕微鏡装置に関するものである。

従来、光源から射出された照明光を固定し、標本を搭載したステージを駆動することにより、標本上において照明光を走査させ、標本を透過した光を検出する透過式のステージ走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。

特開２００８−３９８８２号公報

しかしながら、特許文献１の顕微鏡において、細胞等の標本を培養しながら観察する場合に、標本部分における温度と、その外部に配置されている光学系の温度との間に温度勾配が発生し、光学系に歪みが発生して長時間観察中に観察位置がずれてしまうという不都合がある。また、外来光によるノイズの増加を防止する必要もある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、光学系に発生する歪みを抑制するとともに、外来光によるノイズの増加を防止して、精度の高い観察を行うことができる顕微鏡装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、標本を収容して恒温恒湿を維持しつつ培養する培養部と、該培養部を保持するステージと、光源からの照明光を前記標本に集光する第１の集光光学系と、該第１の集光光学系により前記標本に照射され前記標本を透過した透過光を集光する第２の集光光学系と、前記標本における照明光の集光位置と光学的に共役な位置に配置され、前記第２の集光光学系により集光された透過光の一部を遮断する透過用ピンホールと、該透過用ピンホールを通過した透過光を検出する透過用光検出器と、これら第１および第２の集光光学系、前記透過用ピンホールおよび前記透過用光検出器と前記ステージとを相対的に移動させる移動機構と、前記培養部、前記ステージ、前記第１の集光光学系、前記第２の集光光学系、前記透過用ピンホール、前記透過用光検出器および前記移動機構を取り囲み外光を遮断する筐体と、該筐体内の温度を制御する温度制御部とを備え、前記培養部が培養液を貯留し、前記第２の集光光学系が前記培養液の液面から離れた位置に配置され、前記培養液の液面を検出する液面検出部と、該液面検出部により検出された前記培養液の液面位置に基づいて前記透過用ピンホールまたは前記第２の集光光学系の光軸に沿う方向の位置を調節する位置調節機構とを備える顕微鏡装置を提供する。

本発明によれば、光源からの照明光が第１の集光光学系により集光されて、ステージ上に保持された培養部において培養されている標本に照射され、標本を透過した透過光が第２の集光光学系によって集光される。そして、集光された透過光の内、透過用ピンホールを通過した透過光のみが透過用光検出器により検出される。透過用光検出器により透過光が検出されたときのステージの位置とその透過光の強度を記憶しておくことにより画像を構築することができる。

この場合において、本発明によれば、培養部、ステージ、第１の集光光学系、第２の集光光学系、透過用ピンホール、透過用光検出器および移動機構を取り囲む筐体によって外光が遮断されることにより、透過用光検出器に入射する外光が低減され、構築される画像に含まれるノイズを低減することができる。さらに、筐体内が温度制御部によって温度制御されることにより、恒温恒湿に維持された培養部とその外側に配置されている光学系との温度差が過大とならないように管理することができ、温度差による歪みの発生を抑えて、長時間観察における観察位置ズレの発生を抑制することができる。これにより、精度の高い観察を行うことができる。
また、培養部に貯留された培養液の液面が変動しても、液面検出部により検出された培養液の液面位置に基づいて位置調節機構が、落射用ピンホールまたは第２の集光光学系の光軸方向沿う位置を調節し、標本に対する落射用ピンホールの光学的に共役な位置関係を維持することができる。これにより、培養液の液面が変動しても、標本の鮮明な透過光観察を行うことができる。

上記発明においては、前記光源と前記第１の集光光学系との間に配置され、光源からの照明光を走査する走査部と、該走査部により照明光が前記標本上で走査されることにより、該標本において発生して前記第１の集光光学系により集光され、前記走査部を介して戻る蛍光を分岐する蛍光分岐部と、前記標本と光学的に共役な位置に配置され、前記蛍光分岐部により分岐された蛍光の一部を遮断する落射用ピンホールと、該落射用ピンホールを通過した蛍光を検出する落射用光検出器とを備え、前記筐体が、前記走査部、前記蛍光分岐部、前記落射用ピンホールおよび前記落射用光検出器をも取り囲んでいてもよい。

このようにすることで、ステージを停止させた状態で、光源から発せられた照明光が走査部によって走査されて第１の集光光学系により標本上に集光され、標本において発生し第１の集光光学系によって集光された蛍光が、走査部を介して戻る途中で蛍光分岐部により分岐される。そして、落射用ピンホールを通過した蛍光のみが落射用光検出器により検出される。したがって、落射用光検出器により検出された際における走査部の走査位置情報と蛍光の強度とを対応づけて記憶しておくことにより、共焦点蛍光画像を取得することができ、標本の落射蛍光観察を行うことができる。一方、標本の透過光観察は走査部を停止することにより行うことができる。

この場合において、走査部、蛍光分岐部、落射用ピンホールおよび落射用光検出器も筐体に取り囲まれているので、外光によるノイズを低減した落射蛍光観察を行うことができる。また、長時間にわたる蛍光観察においても、温度差による観察位置ズレの発生を抑制することができ、精度の高い観察を行うことができる。

上記発明においては、前記光源がレーザ光を射出するレーザ光源であり、該レーザ光源から射出されたレーザ光を、前記標本への入射前に、互いに直交する偏光面を有する偏光成分に分割する第１の微分干渉素子と、前記標本を通過した互いに直交する偏光面を有する偏光成分を単一偏光面を有する偏光に統合する第２の微分干渉素子と、該第２の微分干渉素子により統合された偏光以外の光を遮断する偏光素子とを備え、前記筐体が、前記第１、第２の微分干渉素子および前記偏光素子をも取り囲んでいてもよい。

このようにすることで、第１、第２の微分干渉素子および偏光素子によって標本の微分干渉観察を行うことができ、その場合においても、外光によるノイズを低減し、長時間にわたる微分干渉観察においても、温度差による観察位置ズレの発生を抑制することができ、精度の高い観察を行うことができる。

また、上記発明においては、前記第１および第２の集光光学系が、位相差観察用の集光光学系であってもよい。
このようにすることで、外光によるノイズを低減し、長時間にわたる観察においても、温度差による観察位置ズレの発生を抑制しつつ標本の位相差観察を行うことができる。

また、前記光源からの照明光を複数の光束に分割する光束分割部を備え、前記透過用ピンホールが、前記光束分割部により分割された複数の光束の前記標本上における集光位置とそれぞれ共役な位置に複数配置され、前記透過用光検出器が、複数の前記透過用ピンホールを通過した複数の透過光をそれぞれ検出するように複数設けられていてもよい。
このようにすることで、光束分割部により分割された複数の光束を同時に標本上に集光し、各光束の標本における透過光の内、透過用ピンホールを通過した透過光のみを別個に透過用光検出器によって検出することにより、多点で透過観察を行うことができ、１画面を迅速に構築することが可能となる。

また、上記発明においては、前記第１および第２の集光光学系が、それぞれ倍率を異ならせて複数組切替可能に設けられるとともに、倍率が切り替えられる際には、前記第１および第２の集光光学系の倍率が同一となるように切り替えられてもよい。
このようにすることで、倍率を変更した観察を行っても透過用ピンホールの標本に対する光学的に共役な位置関係を保持することができ、透過共焦点観察を継続することができる。

また、上記発明においては、前記第１の集光光学系が、倍率を異ならせて複数組切替可能に設けられ、前記透過用ピンホールが、反射または透過パターンを変更可能な空間変調器により構成され、前記第１の集光光学系の倍率が切り替えられたときには、前記透過用ピンホールの反射または透過パターンを切り替えてもよい。

このようにすることで、第１の集光光学系の倍率が切り替えられたときに、透過用ピンホールを構成する空間変調器によって反射または透過パターンを切り替えることにより、第２の集光光学系を切り替えることなく、透過用ピンホールの標本に対する光学的に共役な位置関係を保持することができ、透過共焦点観察を継続することができる。

また、上記発明においては、前記光源からの照明光をラインビームに変換する変換光学系と、該変換光学系により変換されたラインビームの一部を選択的に反射または透過させるように反射または透過パターンを変更可能に構成され、複数の光束を生成する第１の空間変調器と、前記透過用ピンホールが、反射または透過パターンを変更可能に構成され、反射または透過位置が前記第１の空間変調器と光学的に共役な位置関係を保つように駆動される第２の空間変調器により構成され、前記透過用光検出器が、複数の前記透過用ピンホールを通過した複数の透過光をそれぞれ検出するように複数設けられていてもよい。

このようにすることで、変換光学系によりラインビームに変換された照明光の内の一部が、第１の空間変調器の反射または透過パターンによって選択的に反射または透過されることにより複数の光束が生成されて、第１の集光光学系により標本上に集光され、標本を透過した透過光が第２の集光光学系により集光されて、透過用ピンホールに入射される。透過用ピンホールは、第２の空間変調器によって構成されて、第１の空間変調器と光学的に共役な位置関係を保つように反射または透過パターンが設定されるので、透過用ピンホールを通過した透過光のみを透過用光検出器により検出することで、多点の透過共焦点観察を行うことができる。

本発明によれば、光学系に発生する歪みを抑制するとともに、外来光によるノイズの増加を防止して、精度の高い観察を行うことができるという効果を奏する。

本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡装置を模式的に説明する全体構成図である。図１の顕微鏡装置の培養部近傍の詳細を示す拡大立て断面図である。本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡装置を模式的に説明する全体構成図である。図３の顕微鏡装置における標本上のレーザ光の集光点とその移動経路を示す図である。本発明の第３の実施形態に係る顕微鏡装置を模式的に説明する全体構成図である。図５の顕微鏡装置の光学系を図５とは直交する方向から見た部分的な図である。図３の顕微鏡装置における標本上のレーザ光の集光点とその移動経路を示す図である。本発明の第４の実施形態に係る顕微鏡装置を模式的に説明する全体構成図である。

本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡装置１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１は、図１に示されるように、レーザ光源２と、標本Ａを収容して培養する培養部３と、該培養部３を搭載して移動させるステージ４と、レーザ光源２からの光を集光して標本Ａに照射する第１の集光光学系５と、標本Ａを透過した透過光を集光する第２の集光光学系６と、第２の集光光学系６により集光された透過光の一部を遮断するピンホール部材７と、ピンホール部材７を通過した透過光を検出する光検出器８と、これらを取り囲む筐体９と、筐体９に配置された温度センサ１０およびヒータ１１と、これらを制御する制御部１２と、制御部１２に接続されたモニタ１３とを備えている。

培養部３は、図２に示されるように、培養液Ｂを貯留し該培養液Ｂ内に標本Ａを浸漬した状態で収容する培養容器１４と、該培養容器１４を取り囲む外側容器１５とを備えている。培養容器１４は外側容器１５内において上方に開口されている。外側容器１５は、上方に開口する容器本体１５ａと、該容器本体１５ａの開口に接触状態に配置されて、容器本体１５ａに対して水平方向に移動可能に配されつつ開口を閉鎖する蓋体１５ｂとを備えている。蓋体１５ｂは、後述するＺステージ４ｃに固定され，Ｚステージ４ｃの作動によって鉛直方向に移動させられるようになっている。

Ｚステージ４ｃには、支柱１６が固定され、蓋体１５ｂが支柱１６に蝶番１７によって揺動可能に固定されている。
蓋体１５ｂの中央部には、第２の集光光学系５の一部を構成する後述する第２対物レンズを貫通させる貫通孔１８が設けられている。貫通孔１８と第２対物レンズ６ａとの間はシール部材１９によって鉛直方向に相対移動可能に密封され、容器本体１５ａと蓋体１５ｂとの間は、シール部材２０によって、水平方向に相対移動可能に密封されている。

培養部３の培養容器１４内には、培養液Ｂを循環するためのチューブ２１が接続されている。
また、培養部３の外側容器１５と培養容器１４との間の空間には、蒸気や、ＣＯ_２を供給するためのチューブ２２が接続されている。また、この空間には、該空間内の温度を検出する温度センサ１０が設けられている。

ステージ４は、図２に示されるように、外側容器１５を搭載して、水平方向（Ｘ方向）に移動させるＸステージ４ａと、該Ｘステージ４ａをＸ方向に直交する水平方向（Ｙ方向）に移動させるＹステージ４ｂと、Ｘステージ４ａおよびＹステージ４ｂを鉛直方向（Ｚ方向）に移動させるＺステージ４ｃとを備えている。各Ｘ，Ｙ，Ｚステージ４ａ，４ｂ，４ｃには、外側容器の下方に配される位置に開口部２３が設けられており、鉛直下方から入射される照明光が開口部２３を介して容器本体１５ａの底面から培養部３の標本Ａに照射されるようになっている。

第１の集光光学系５は、レーザ光を集光する集光レンズ５ａと、該集光レンズ５ａにより集光されたレーザ光を互いに直交する偏光面を有する偏光成分に分割する第１の微分干渉素子５ｂと、該第１の微分干渉素子５ｂを透過したレーザ光をその上方に配置されている標本Ａ上に集光する第１対物レンズ５ｃとを備えている。

第２の集光光学系６は、標本Ａを透過したレーザ光を集光する第２対物レンズ６ａと、該第２対物レンズ６ａにより集光された互いに直交する偏光面を有する偏光成分を単一偏光面を有するレーザ光に統合する第２の微分干渉素子６ｂと、該第２の微分干渉素子６ｂを透過した統合された偏光以外のレーザ光を遮断する偏光素子６ｃと、該偏光素子６ｃを透過したレーザ光を集光する集光レンズ６ｄとを備えている。
本実施形態において、第２対物レンズ６ａは、図２に示されるように、液浸レンズにより構成され、培養容器１４内の培養液Ｂに浸漬された状態で使用されるようになっている。

ピンホール部材７は、標本Ａにおけるレーザ光の集光位置と光学的に共役な位置に配置され、集光点を通ったレーザ光のみが通過でき、集光点以外からのレーザ光は遮断されるようになっている。
光検出器８は、例えば、光電子増倍管である。

筐体９は、図１に示されるように、ステージ４を挟んで上下に配置されたレンズ等の光学素子をそれぞれ取り囲んで外部に対して閉塞している。これにより、ステージ４を挟んだ上下の空間２４，２５が、該空間２４．２５内に外来光が入射しないように遮断され、特に、光検出器８やピンホール部材７の周囲に外来光が入射しないようになっている。

温度センサ１０は、上述したように培養容器１４と外部容器１５との間の空間、および筐体９内のステージ４の上部空間２４および下部空間２５の温度をそれぞれ検出するようにそれぞれ配置されている。
ヒータ１１も、筐体９内の上部空間２４、下部空間２５および培養部３の近傍にそれぞれ配置され、それぞれの部位を独立して加温することができるようになっている。

制御部１２は、温度センサ１０により検出された温度情報を受け取って、筐体９内の上部空間２４、下部空間２５および培養部３内がそれぞれ所望の温度になるようにヒータ１１を制御するようになっている。
また、制御部１２は、ステージ４を駆動して培養部３を移動させるとともに、各位置において光検出器８において検出された透過光の強度をステージ４の位置情報と対応づけて記憶するようになっている。そして、制御部１２は、記憶している透過光の強度をステージ４の位置情報に基づいて並べることにより、標本Ａの２次元的な微分干渉画像を生成するようになっている。
モニタ１３は、制御部１２により生成された透過光の微分干渉画像を表示するようになっている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡装置１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１を用いて標本Ａの観察を行うには、チューブ２１を介して培養部３の培養容器１４内に貯留した培養液Ｂを循環させながら、チューブ２２を介して供給した蒸気やＣＯ_２により、培養容器１４内の湿度およびＣＯ_２濃度等の培養条件を一定に維持しつつ、温度センサ１０により検出した培養部３内の温度に基づいて、該温度が所定の温度、例えば、３７℃となるように、制御部１２がヒータ１１を制御する。
また、制御部１２は、筐体９内の上部空間２４および下部空間２５内部の温度センサ１０により検出した筐体９内の温度に基づいて、該温度が所定の温度になるように、ヒータ１１を制御する。

そして、筐体９内および培養部３内の温度が恒温化された状態で、制御部１２が、ステージ４を駆動して標本Ａを所望の位置に配置する。この状態で、レーザ光源２から発せられたレーザ光を第１の集光光学系５によって標本Ａ上に集光し、標本Ａを透過した透過光を第２の集光光学系６によって集光し、ピンホール部材７を通過した透過光のみを光検出器８によって検出する。制御部１２は、検出された透過光の強度をステージ４の位置情報と対応づけて記憶し、ステージ４を次の位置まで移動させ、上記動作を繰り返す。

これにより、標本Ａ上の所望の領域にレーザ光が通過させられて、標本Ａの透過光画像を取得することができる。第１の集光光学系５および第２の集光光学系６には第１，第２の微分干渉素子５ｂ，６ｂおよび偏光素子６ｃが設けられているので、透過光画像としては、微分干渉画像が取得される。取得された微分干渉画像はモニタ１３に表示される。

この場合において、本実施形態に係る顕微鏡装置１によれば、各光学素子が筐体９によって取り囲まれているので、外来光が遮断され、取得される透過レーザ光画像に発生するノイズを低減して鮮明な観察を行うことができるという利点がある。
さらに、筐体９内の各部の温度は温度センサ１０により検出された温度に基づいてヒータ１１を制御することにより恒温化されているので、各光学素子に温度差による歪みが発生するのを防止することができ、長時間観察中に観察位置がずれてしまう不都合の発生を未然に防止することができるという利点もある。

また、本実施形態においては、第２の集光光学系６を構成する第２対物レンズ６ａが液浸レンズによって構成され、培養液Ｂ内に浸漬された状態で使用されるので、培養液Ｂの液面位置が変動しても標本Ａ上におけるレーザ光の集光点とピンホール部材７との光学的に共役な位置関係が崩れることがなく、常に鮮明な透過光画像を取得することができる。
また、本実施形態においては、透過光画像として微分干渉画像を取得するので、透明な標本Ａであっても、その形態を鮮明に観察することができる。

この場合において、第２対物レンズ６ａの焦点位置を合わせるために、Ｚステージ４ｃを移動させると、Ｚステージ４ｃとともに、容器本体１５ａおよび蓋体１５ｂが同時に上下に移動する。蓋体１５の貫通孔１８と第２対物レンズ６ａとの間はシール部材１９によって鉛直方向に摺動可能に設けられているので、Ｚステージ４ｃを移動させて蓋体１５が第２対物レンズ６ａに対して鉛直方向に移動しても、両者間の密封状態が維持される。

また、標本Ａに対するレーザ光の集光点を変更するために、Ｘステージ４ａおよびＹステージ４ｂを移動させると、Ｘステージ４ａに搭載されている容器本体１５ａも水平方向に移動させられる。容器本体１５ａの上端と蓋体１５ｂの下面との間もシール部材２０によって水平方向に摺動可能に設けられているので、Ｘ，Ｙステージ４ａ，４ｂを移動させて容器本体１５ａが第２対物レンズ６ａに対して水平方向に移動しても、蓋体１５ｂと容器本体１５ａとの間の密封状態が維持される。
これにより、外側容器１５ａ内が密封された状態に維持され、培養環境が一定に保持されて、生細胞等の標本Ａの長時間にわたる観察においても、標本Ａを健全な状態に維持することができる。

なお、本実施形態においては、第２対物レンズ６ａを液浸レンズとして、培養液Ｂ内に常に浸漬した状態を維持することとした。しかし、液浸レンズであっても培養液Ｂの液面から離れて上方に配された状態で観察する場合や、液浸レンズではない場合には、培養液Ｂの液面が変動すると、ピンホール部材７への集光位置がずれてしまい、レーザ光の標本Ａにおける集光点を通過する透過光を検出することができない。そのような場合には、液面の位置を検出する液面センサ（図示略）を設け、液面センサにより検出された液面の位置に基づいて、制御部１２がピンホール部材７あるいは第２対物レンズ６ａを鉛直方向に移動させる位置調節機構（図示略）を有することにすればよい。

次に、本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡装置３０について、図面を参照して説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る顕微鏡装置１と構成を共通とする箇所については、同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る顕微鏡装置３０は、図３に示されるように、第１の集光光学系３１に、レーザ光源２からのレーザ光を集光する集光レンズ３１ａと、該集光レンズ３１ａによって集光されたレーザ光を複数の光束に分割するマイクロレンズアレイ３１ｂとを備えている。また、ピンホール部材３２としては、複数の光束が標本Ａ上においてそれぞれの集光点に集光することにより、各集光点を通過したレーザ光を通過させるために、各集光点と光学的に共役な位置関係に配置される複数のピンホール３２ａを備えたものが採用されている。また、光検出器３３としては、各ピンホール３２ａを通過した透過光をそれぞれ独立に検出する複数の受光部３３ａを有するマルチアノード光電子増倍管あるいはＣＣＤが採用されている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡装置３０によれば、レーザ光源２から射出されたレーザ光は、マイクロレンズアレイ３１ｂを通過することにより複数の光束に分割され、第１の集光光学系３１によって、図４に示されるように、標本Ａ上の複数箇所に集光される。図中、斜線部が集光点を示している。

そして、Ｘ，Ｙステージ４ａ，４ｂを駆動して標本Ａを水平方向に移動させることにより、図４に矢印で示されるように、集光点によって視野内の所定範囲を埋めるように標本Ａ上における集光点を移動させ、各位置を透過した透過光を検出して透過光画像を得ることができる。

すなわち、本実施形態に係る顕微鏡装置３０によれば、第１の実施形態に係る顕微鏡装置１と比較して、複数の集光点を透過した複数の透過光を同時に検出するので、より迅速に画像を取得することができる。特に、生細胞のように動く標本Ａを観察する場合に、ブレを低減しつつ観察することができ、効果的である。
また、本実施形態においても、全ての光学素子が筐体９によって囲まれているので、外来光を遮断して鮮明な画像を得ることができるとともに、筐体９内の温度を管理することによって温度差による光学素子の変形を防止して長時間観察においても位置ズレが生じないようにすることができる。

なお、本実施形態においては、各ピンホール３２ａを通過したレーザ光を別個の受光部３３ａによって独立に検出することとしたが、これに代えて、隣接する複数の受光部３３ａ（あるいは画素）によって各ピンホール３２ａを通過したレーザ光を検出することにしてもよい。この場合には、各受光部３２ａにより検出されたレーザ光の強度を加算して１つの集光点からの情報として処理すればよい。

また、標本Ａを異なる倍率で観察するために、第１対物レンズ５ｃおよび第２対物レンズ６ａが、レボルバ等（図示略）によって複数の倍率のものを切替可能に用意されていてもよい。この場合には、制御部１２が、第１対物レンズ５ｃおよび第２対物レンズ６ａの両方の倍率が同一倍率となるように切り替えることにすればよい。あるいは、手動で同一倍率に切り替えることにしてもよい。

あるいは、第１対物レンズ５ｃのみ切替可能にして、ピンホール部材３２として、ディジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）や液晶シャッタ等の反射または透過パターンを変更可能な空間変調器を採用してもよい。このようにすることで、第１対物レンズ５ｃの倍率を切り替えることによりレーザ光の集光点が変動しても、それに合わせるように空間変調器の反射または透過パターンを変更することで、ピンホール部材３２と標本Ａ上の集光点との光学的に共役な位置関係を維持することができる。

次に、本発明の第３の実施形態に係る顕微鏡装置４０について、図面を参照して説明する。
本実施形態の説明において、上述した第２の実施形態に係る顕微鏡装置３０と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る顕微鏡装置４０は、図５および図６に示されるように、第２の実施形態に係る顕微鏡装置３０におけるマイクロレンズアレイ３１ｂに代えて、シリンドリカルレンズ４１ａおよびＤＭＤや液晶シャッタ等の第１の空間変調器４１ｂを使用し、ピンホール部材３２に代えて、第２の空間変調器４２ａおよびシリンドリカルレンズ４２ｂを採用している。
また、光検出器４３としては、一列に並んだ複数の受光部４３ａを有するラインＣＣＤあるいはマルチアノード光電子増倍管を採用している。

第１の集光光学系３１におけるシリンドリカルレンズ４１ａは、レーザ光源２から発せられたレーザ光をライン状に集光して第１の空間変調器４１ｂに入射させるようになっている。また、第１の空間変調器４１ｂは、その透過または反射パターンによって、ライン状に集光されたレーザ光を部分的に透過または反射することにより複数本の光束を生成するようになっている。

一方、第２の集光光学系６における第２の空間変調器４２ａは、標本Ａ上における光束の集光点と光学的に共役な位置に入射する光のみを反射または透過するように反射または透過パターンが設定されている。また、シリンドリカルレンズ４２ｂは、第２の空間変調器４２ａにより反射または透過された透過光を集光して、一列に並ぶ光検出器３３の複数の受光部３３ａにそれぞれ入射させるようになっている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡装置４０によれば、レーザ光源２から射出されたレーザ光は、シリンドリカルレンズ４１ａおよび第１の空間変調器４１ｂを通過することにより複数の光束に分割され、第１の集光光学系３１によって、図７に示されるように、標本Ａ上の複数箇所を通過させられる。図中、斜線部がレーザ光の通過位置を示している。

そして、Ｘ，Ｙステージ４ａ，４ｂを駆動して標本Ａを水平方向に移動させることにより、図７に矢印で示されるように、集光点によって視野内の所定範囲を埋めるように標本Ａ上におけるレーザ光の通過位置を移動させ、各位置を透過した透過光を検出して透過レーザ光画像を得ることができる。

このようにすることで、第２の実施形態に係る顕微鏡装置３０と同様に、複数箇所の透過光を同時に検出するので、より迅速に画像を取得することができる。特に、生細胞のように動く標本を観察する場合に、ブレを低減しつつ観察することができ、効果的である。

また、本実施形態においても、全ての光学素子が筐体９によって囲まれているので、外来光を遮断して鮮明な画像を得ることができるとともに、筐体９内の温度を管理することによって温度差による光学素子の変形を防止して長時間観察においても位置ズレが生じないようにすることができる。

次に、本発明の第４の実施形態に係る顕微鏡装置５０について、図面を参照して説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る顕微鏡装置１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る顕微鏡装置５０は、図８に示されるように、集光レンズ５ａによって集光されたレーザ光を２次元的に走査するスキャナ５１と、該スキャナ５１により走査されたレーザ光を集光する瞳投影レンズ５２および結像レンズ５３と、標本Ａにおいて発生し、レーザ光源２側に戻る蛍光をスキャナ５１と集光レンズ５ａとの間でレーザ光の光路から分岐するダイクロイックミラー５４と、蛍光検出光学系５５とをさらに備えている。

スキャナ５１は、例えば、異なる軸線回りに揺動させられる２枚のガルバノミラー（図示略）を対向配置してなる近接ガルバノミラーである。２枚のガルバノミラーを同期させつつ揺動させることにより、レーザ光を標本Ａ上において２次元的に走査させることができるようになっている。一方、ガルバノミラーの揺動を停止させることにより、レーザ光を静止させ、ステージ４を移動させることによっても、レーザ光を標本Ａ上において２次元的に走査させることができるようになっている。

蛍光検出光学系５５は、ダイクロイックミラーによって分岐された蛍光を集光する共焦点レンズ５５ａと、該共焦点レンズ５５ａの焦点位置に配置され、焦点位置を通過する蛍光のみを通過させる共焦点ピンホール５５ｂと、該共焦点ピンホール５５ｂを通過した蛍光を集光する集光レンズ５５ｃと、蛍光に含まれるレーザ光を遮断するバリアフィルタ５５ｄと、該バリアフィルタ５５ｄを透過した蛍光を検出する光電子増倍管からなる光検出器５５ｅとを備えている。
本実施形態においては、これらの光学素子も全て筐体９内に配置されて、温度管理されている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡装置５０によれば、スキャナ５１を停止した状態でステージ４を移動させて透過光の透過共焦点観察を行い、ステージ４を停止した状態でスキャナ５１を駆動して、標本Ａにおいて発生した蛍光の落射共焦点観察を行うことができる。
本実施形態においても、全ての光学素子が筐体９によって囲まれているので、外来光を遮断して鮮明な透過光画像および蛍光画像を得ることができるとともに、筐体９内の温度を管理することによって温度差による光学素子の変形を防止して長時間観察においても位置ズレが生じないようにすることができる。

蛍光画像はスキャナ５１を使用しているのでフレームレートが高い。スキャナ５１を停止した状態でステージ４を移動させて透過光の透過共焦点観察と、標本Ａにおいて発生した蛍光を同時に取得することにしてもよい。この場合には、透過画像と蛍光画像とが同時刻に取得されているので、細胞の形態変化を透過画像と蛍光画像で比較するような観察方法に適している。

なお、上記各実施形態においては、レーザ光源２も筐体９内に収容することとして説明したが、レーザ光源２は筐体９外に配置することにしてもよい。
また、ステージを光学系に対してその光軸に直交する方向に移動させることとしたが、これに代えて、ステージを固定し、光学系全体を移動させることにしてもよい。

また、上記各実施形態においては、微分干渉画像を取得するために第１の微分干渉素子５ｂ、第２の微分干渉素子６ｂ、偏光素子６ｃを備えることとしたが、これに代えて、第２の集光光学系６としては、位相リング（図示略）を、第１の集光光学系５としては、位相膜（図示略）を有する位相差観察用の集光光学系を採用してもよい。

Ａ標本
Ｂ培養液
１，３０，４０，５０顕微鏡装置
２光源
３培養部
４ステージ（移動機構）
５，３１第１の集光光学系
５ｂ第１の微分干渉素子
６第２の集光光学系
６ｂ第２の微分干渉素子
６ｃ偏光素子
７，３２ピンホール部材（透過用ピンホール）
８光検出器（透過用光検出器）
９筐体
１０温度センサ（温度制御部）
１１ヒータ（温度制御部）
３１ｂマイクロレンズアレイ（光束分割部）
３２ａピンホール（透過用ピンホール）
３３ａ受光部（透過用光検出器）
４１ａシリンドリカルレンズ（変換光学系）
４１ｂ第１の空間変調器
４２ａ第２の空間変調器（透過用ピンホール）
５１スキャナ（走査部）
５４ダイクロイックミラー（蛍光分岐部）
５５ｂ共焦点ピンホール（落射用ピンホール）
５５ｅ光検出器（落射用光検出器）

Claims

標本を収容して恒温恒湿を維持しつつ培養する培養部と、
該培養部を保持するステージと、
光源からの照明光を前記標本に集光する第１の集光光学系と、
該第１の集光光学系により前記標本に照射され前記標本を透過した透過光を集光する第２の集光光学系と、
前記標本における照明光の集光位置と光学的に共役な位置に配置され、前記第２の集光光学系により集光された透過光の一部を遮断する透過用ピンホールと、
該透過用ピンホールを通過した透過光を検出する透過用光検出器と、
これら第１および第２の集光光学系、前記透過用ピンホールおよび前記透過用光検出器と前記ステージとを相対的に移動させる移動機構と、
前記培養部、前記ステージ、前記第１の集光光学系、前記第２の集光光学系、前記透過用ピンホール、前記透過用光検出器および前記移動機構を取り囲み外光を遮断する筐体と、
該筐体内の温度を制御する温度制御部とを備え、
前記培養部が培養液を貯留し、
前記第２の集光光学系が前記培養液の液面から離れた位置に配置され、
前記培養液の液面を検出する液面検出部と、該液面検出部により検出された前記培養液の液面位置に基づいて前記透過用ピンホールまたは前記第２の集光光学系の光軸に沿う方向の位置を調節する位置調節機構とを備える顕微鏡装置。
前記光源と前記第１の集光光学系との間に配置され、光源からの照明光を走査する走査部と、
該走査部により照明光が前記標本上で走査されることにより、該標本において発生して前記第１の集光光学系により集光され、前記走査部を介して戻る蛍光を分岐する蛍光分岐部と、
前記標本と光学的に共役な位置に配置され、前記蛍光分岐部により分岐された蛍光の一部を遮断する落射用ピンホールと、
該落射用ピンホールを通過した蛍光を検出する落射用光検出器とを備え、
前記筐体が、前記走査部、前記蛍光分岐部、前記落射用ピンホールおよび前記落射用光検出器をも取り囲んでいる請求項１に記載の顕微鏡装置。
前記光源がレーザ光を射出するレーザ光源であり、
該レーザ光源から射出されたレーザ光を、前記標本への入射前に、互いに直交する偏光面を有する偏光成分に分割する第１の微分干渉素子と、
前記標本を通過した互いに直交する偏光面を有する偏光成分を単一偏光面を有する偏光に統合する第２の微分干渉素子と、
該第２の微分干渉素子により統合された偏光以外の光を遮断する偏光素子とを備え、
前記筐体が、前記第１、第２の微分干渉素子および前記偏光素子をも取り囲んでいる請求項１又は請求項２に記載の顕微鏡装置。
前記第１および第２の集光光学系が、位相差観察用の集光光学系である請求項１又は請求項２いずれかに記載の顕微鏡装置。
前記光源からの照明光を複数の光束に分割する光束分割部を備え、
前記透過用ピンホールが、前記光束分割部により分割された複数の光束の前記標本上における集光位置とそれぞれ共役な位置に複数配置され、
前記透過用光検出器が、複数の前記透過用ピンホールを通過した複数の照明光をそれぞれ検出するように複数設けられている請求項１から請求項４のいずれかに記載の顕微鏡装置。
前記第１および第２の集光光学系が、それぞれ倍率を異ならせて複数組切替可能に設けられるとともに、倍率が切り替えられる際には、前記第１および第２の集光光学系の倍率が同一となるように切り替えられる請求項５に記載の顕微鏡装置。
前記第１の集光光学系が、倍率を異ならせて複数組切替可能に設けられ、
前記透過用ピンホールが、反射または透過パターンを変更可能な空間変調器により構成され、
前記第１の集光光学系の倍率が切り替えられたときには、前記透過用ピンホールの反射または透過パターンを切り替える請求項５に記載の顕微鏡装置。
前記光源からの照明光をラインビームに変換する変換光学系と、
該変換光学系により変換されたラインビームの一部を選択的に反射または透過させるように反射または透過パターンを変更可能に構成され、複数の光束を生成する第１の空間変調器と、
前記透過用ピンホールが、反射または透過パターンを変更可能に構成され、反射または透過位置が前記第１の空間変調器と光学的に共役な位置関係を保つように駆動される第２の空間変調器により構成され、
前記透過用光検出器が、複数の前記透過用ピンホールを通過した複数の照明光をそれぞれ検出するように複数設けられている請求項１に記載の顕微鏡装置。