JP5622569B2 - 加水分解性ポリマーｆｍｏｃ−リンカー - Google Patents

Description

（関連出願への相互参照）
本願は、２００７年６月２６日に出願された米国仮特許出願第６０／９３７，１６９号、および２００８年４月７日に出願された米国仮特許出願第６１／１２３，２６３号への優先権の利益を主張し、これらの米国仮特許出願の双方の全体は、本明細書中に参考として援用される。

（発明の分野）
本発明は、少なくとも１つの半合成ポリマーと結合している加水分解性リンカーの作製に関する。これらの加水分解性リンカーは、タンパク質およびペプチド系の薬物のインビボでの循環を延長するのに有用である。

（発明の背景）
ほとんどのタンパク質またはペプチド薬物は寿命が短く、しばしば、インビボで短い循環半減期を有する。タンパク質またはペプチド薬物が経口で吸収されないことを考慮すると、循環系において治療活性のある薬物を長く保持することは、臨床的重要性の点で明らかに望ましい特徴である。

タンパク質またはペプチド薬物の臨床的特性を改善するための好ましい方策は、その薬物を、ポリマー、例えばポリアルキレンオキシド（非特許文献１）、またはポリシアル酸（非特許文献２）、デキストランもしくはヒドロキシルアルキルスターチなどの多糖で修飾することである。（本明細書で引用したすべての文献を参照により本明細書に組み込む。）
しばらくの間、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を用いた修飾が知られていた。しかし、ＰＥＧを用いたタンパク質の修飾はしばしば、タンパク質の活性の低下をもたらす。

コロミン酸（ＣＡ）として知られているポリシアル酸（ＰＳＡ）は、天然由来の環状多糖である。これは、α（２→８）ケトシド結合でのＮ−アセチルノイラミン酸のホモポリマーであり、その非還元末端に隣接ジオール基を含む。ＰＳＡは負の電荷を有しており、人体の天然成分である。これは、所定の物理的特性でバクテリアから簡単に大量生産することができる（特許文献１）。ポリシアル酸と化学的にも免疫学的にも同じなので、人体内で、バクテリアのポリシアル酸は、タンパク質と結合していても非免疫原性である。他のポリマー（例えば、ＰＥＧ）とは異なり、ポリシアル酸は生分解性である。

しかし、ＰＳＡなどの酸性単糖とコンジュゲートしたポリペプチドを含む治療用化合物はこれまで市販されていない。

１〜４個のシアル酸単位しかもたない短いＰＳＡポリマー鎖も合成されている（非特許文献３；非特許文献４）。

ＰＥＧ部分を含むいくつかの加水分解性または分解性リンカーが提案されている。

特許文献２は、弱い、加水分解的に不安定な結合を有するＰＥＧおよび関連ポリマー誘導体を記載している。

特許文献３は、ビス−Ｎ−２−ヒドロキシエチルグリシン基（ビシン）をベースとした放出可能なＰＥＧ−リンカーを記載している。

特許文献４および特許文献５は、加水分解性フルオレンをベースとしたＰＥＧ構造体を記載している。

これらのリンカーをタンパク質系薬物とコンジュゲートした後は、タンパク質−ポリマー複合体をプロドラッグとみなすことができ、制御放出機序により、タンパク質の活性をコンジュゲートから放出することができる。この考え方を用いて、薬物動態特性が改善された薬物を得ることができる（非特許文献５）。

米国特許第５，８４６，９５１号明細書 米国特許第６，５１５，１００号明細書 米国特許第７，１２２，１８９号明細書 国際公開第０４／０８９２８０号パンフレット 国際公開第０６／１３８５７２号パンフレット

Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ａｄｖａｎ Ｄｒｕｇ Ｒｅｖ．第５４巻、４５９〜４７６頁（２００２年） Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、第１３４１巻、２６〜３４頁（１９９７年） Ｋａｎｇら、Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ．、２２７〜２２８頁（２０００年） Ｒｅｓｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第１巻、３１〜４６頁（２００４年） Ｚｈａｏら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．第１７巻、３４１〜３５１頁（２００６年）

本発明は、インビボでの循環などのインビボでの特性を改善するために、加水分解性リンカーがタンパク質またはペプチド薬物とコンジュゲートされている、少なくとも１つの半合成バイオポリマーと結合した加水分解性リンカーを提供する。

本発明は、一般式１の化合物を提供する。

ただし、
Ｚは脱離基であり、１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つはＹ基と結合している。

Ｙは、Ｎ−スクシンイミジル部分と結合した半合成バイオポリマーを含む基である。

Ｙ基と結合していることに加えて、式Ｉの化合物は任意選択で、利用可能な１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つでＸ基と結合していてもよい。

Ｘは−ＳＯ_３−Ｒ^３である。

Ｒ^３は、水素、（Ｃ_１〜Ｃ_８）−アルキルおよび（Ｃ_１〜Ｃ_８）−アルキル−Ｒ^４からなる群から選択される。

Ｒ^４はポリマーである。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
式Ｉの化合物

（式中、
Ｚは脱離基であり、１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つはＹ基と結合しており、
Ｙは、Ｎ−スクシンイミジル部分と結合した半合成バイオポリマーを含む基であり、
利用可能な１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つは任意選択でＸ基と結合しており、
Ｘは−ＳＯ _３ −Ｒ ^３ であり、
Ｒ ^３ は、水素、（Ｃ _１ 〜Ｃ _８ ）−アルキルおよび（Ｃ _１ 〜Ｃ _８ ）−アルキル−Ｒ ^４ からなる群から独立に選択され、
Ｒ ^４ はポリマーである）。
（項目２）
ＺがＮ−スクシンイミジルエステルであり、
Ｙが、

であり、
ＰＯＬＹＭＥＲは半合成バイオポリマーであり、
Ｒ ^１ はその出現ごとに独立に（Ｃ _１ 〜Ｃ _８ ）−アルキルであり、
Ｒ ^２ は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−（Ｃ _１ 〜Ｃ _８ ）−アルキル−ＮＲ−、−ＮＲＣ（Ｏ）−および−ＮＲＣ（Ｏ）−（Ｃ _１ 〜Ｃ _８ ）−アルキル−ＮＲからなる群から独立に選択され、
Ｒは、独立に、水素または（Ｃ _１ 〜Ｃ _８ ）−アルキルである、
項目１に記載の化合物。
（項目３）
Ｒ ^２ が−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−またはＮＲＣ（Ｏ）−であり、ここで、Ｒは、独立に、水素または（Ｃ _１ 〜Ｃ _８ ）−アルキルである、項目２に記載の化合物。
（項目４）
前記ＰＯＬＹＭＥＲがチオエーテル結合を介して結合している、項目３に記載の化合物。
（項目５）
前記半合成バイオポリマーが炭水化物である、項目１から４のいずれか一項に記載の化合物。
（項目６）
前記半合成バイオポリマーが多糖である、項目５に記載の化合物。
（項目７）
前記多糖がポリシアル酸（ＰＳＡ）である、項目６に記載の化合物。
（項目８）
前記多糖が少なくとも３単位の単糖を含む、項目６に記載の化合物。
（項目９）
以下のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ

からなる群から選択される、項目１に記載の化合物。
（項目１０）
項目１に記載の化合物の調製方法であって、中間化合物をカップリング反応にかけるステップを含み、ここで
ＰＯＬＹＭＥＲは半合成バイオポリマーであり、
Ｒ ^１ はその出現ごとに独立に（Ｃ _１ 〜Ｃ _８ ）−アルキルであり、
Ｒ ^２ は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−（Ｃ _１ 〜Ｃ _８ ）−アルキル−ＮＲ−、−ＮＲＣ（Ｏ）−および−ＮＲＣ（Ｏ）−（Ｃ _１ 〜Ｃ _８ ）−アルキル−ＮＲからなる群から独立に選択され、
Ｒは、独立に、水素または（Ｃ _１ 〜Ｃ _８ ）−アルキルであり、
Ｘは−ＳＯ _３ −Ｒ ^３ であり、
Ｒ ^３ は、水素、（Ｃ _１ 〜Ｃ _８ ）−アルキルおよび（Ｃ _１ 〜Ｃ _８ ）−アルキル−Ｒ ^４ からなる群から独立に選択され、
Ｒ ^４ はポリマーであり、
ｎは、０、１、２、３または４から選択される整数であり、
ｍは、１、２、３または４から選択される整数である、
方法。
（項目１１）
ＨＳ−ＰＯＬＹＭＥＲが

である、項目８に記載の方法。
（項目１２）
Ｒ ^２ が、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−または−ＮＲＣ（Ｏ）−のいずれかであり、ここで、Ｒは、独立に、水素またはＣ _１ 〜Ｃ _８ −アルキルである、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記化合物が、置換のための１つまたは複数の基を含むタンパク質またはペプチド薬物とコンジュゲートしている、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
項目１から７のいずれか一項に記載の化合物およびタンパク質またはペプチド薬物を含むコンジュゲート。

ｐＨ８．３におけるインビトロでのＦＶＩＩａ−ＰＳＡコンジュゲートの加水分解を示す図である。ＦＶＩＩａ活性の放出はＳｔａｃｌｏｔアッセイ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、Ａｓｎｉｅｒｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）により測定した。 ｐＨ８．３におけるインビトロでのＦＶＩＩａ−トリマーＰＳＡコンジュゲートの加水分解を示す図である。ＦＶＩＩａ活性の放出はＳｔａｃｌｏｔアッセイ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、Ａｓｎｉｅｒｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）により測定した。 凝固アッセイ（Ｓｔａｃｌｏｔ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、Ａｓｎｉｅｒｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）で測定した血漿中でのＦＶ１１ａ活性を示す図である。ＦＶＩＩａ凝固活性について、用量調節した曲線下面積（ＡＵＣ）は、非修飾ｒＦＶｉｌａでは０．０１４であり、ｒＦＶＩＩａ−コンジュゲート（０〜無限大）では０．０１５に増大した。終末相半減期は２．３時間から４．４時間へ延長され、平均滞留時間（ＭＲＴ）は１．４時間から２．４時間へ延長された。 ポリクローナル抗ヒトＦＶＩＩ抗体を用いたＥＬＩＳＡによるＦＶＩＩａ抗原の測定結果を示す図である。抗原について、用量調節したＡＵＣ（０〜無限大）は０．０１０（非修飾ｒＦＶＩＩａ）から０．０１４（ｒＦＶＩＩａ−コンジュゲート）へ増大し、終末相半減期は１．４時間から２．３時間へ延長され、ＭＲＴ１．５時間から２．２時間へ延長された。 凝固アッセイ（Ｓｔａｃｌｏｔ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、Ａｓｎｉｅｒｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）で測定した血漿中でのＦＶＩＩａ活性を示す図である。ｒＦＶＩＩａ−トリマー−ＰＳＡコンジュゲートの薬物動態は、未変性（ｎａｔｉｖｅ）ｒＦＶＩＩａ（−△−）と比較して改善されている（−○−）。

本発明は、少なくとも１つの半合成バイオポリマーと結合した加水分解性リンカーであって、インビボでの循環などのインビボでの特性を改善するために、タンパク質またはペプチド薬物とさらにコンジュゲートさせることができる加水分解性リンカーを提供する。タンパク質またはペプチド薬物の活性を、制御放出機序により、コンジュゲートから放出することができる。

以下の段落は、一般的定義、および本発明による化合物を作り上げる様々な化学的部分の定義を提供するものであり、別に明確に示された定義により、より広い定義が提供されていない限り、本明細書および特許請求の範囲を通して一様に当てはまるものとする。

「Ｃ_１〜Ｃ_８−アルキル」は、１〜８個の炭素原子を有する一価アルキル基を指す。この用語の例は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシルなどの基である。直鎖状および分岐状アルキルが含まれる。

「脱離基」は、コンジュゲートを形成するタンパク質またはペプチド薬物上の求核部（ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ）と反応することができる基を指す。この用語の例には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾリル、ハロゲン、Ｎ−ヒドロキシフタリミジル、ｐ−ニトロフェノキシ、イミダゾリル、チアゾリジニルチオン、Ｏ−アシル尿素などの基であり、また当業者には他の適切な脱離基も明らかであろう。したがって、本発明のためには、タンパク質またはペプチド薬物は、アミンなどの置換のための１つまたは複数の基を含む。タンパク質またはペプチド薬物は、血漿タンパク質、すなわちＦＶＩＩＩ、ＶＷＦ、ＦＶＩＩａおよびＦＩＸなどの血液凝固因子である。

「半合成バイオポリマー」は、天然由来のポリマーをベースとした人造有機ポリマーを指す。半合成バイオポリマーを反応基で官能化して、これらの官能化された半合成バイオポリマーを他の化合物にコンジュゲートさせることもできる。この「半合成バイオポリマー」という用語の例は、炭水化物などの直鎖状または分岐状ポリマー、具体的には例えば多糖類である。多糖類の例は、ＰＳＡ（ポリシアル酸）およびＨＡＳ（ヒドロキシアルキルスターチ）である。

「加水分解性」リンカーは、その中でタンパク質が、未変性の形態で放出されるリンカー系を指す。タンパク質は放出され、リンカーは完全に切断される。加水分解性のリンカーの同義語は「分解性」または「放出性」のリンカーである。

本発明は、一般式１の化合物を提供する。

ただし、Ｚは脱離基であり、１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つはＹ基と結合している。

Ｙは、Ｎ−スクシンイミジル部分と結合した半合成バイオポリマーを含む基である。

Ｙ基と結合していることに加えて、式Ｉの化合物は、利用可能な１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つでＸ基と任意選択で結合することができる。

Ｘは−ＳＯ_３−Ｒ^３である。

Ｒ^３は、水素、（Ｃ_１〜Ｃ_８）−アルキルおよび（Ｃ_１〜Ｃ_８）−アルキル−Ｒ^４からなる群から選択される。

Ｒ^４はポリマーである。その例は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などの親水性ポリマーである。

一実施形態では、ＺがＮ−スクシンイミジルエステルであり、１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つがＹ基と結合しており、Ｙが、

（式中、ＰＯＬＹＭＥＲは、好ましくは１，０００Ｄａ〜３００，０００Ｄａの分子量を有する半合成バイオポリマーである）
である式１の化合物に関する。

一実施形態では、分子量は５，０００〜２５，０００、好ましくは５，０００〜１０，０００である。

他の実施形態では、前記半合成バイオポリマーは炭水化物である。好ましくは少なくとも３単位の単糖を含む多糖が好ましい。

一実施形態では、前記多糖は２〜２００単位、好ましくは１０〜１００単位の単糖を含む。

一実施形態では、半合成バイオポリマーはＰＳＡ誘導体である。

他の実施形態では、半合成バイオポリマーは、チオエーテル結合を介してスクシンイミジル部分と結合している。

Ｒ^１はその出現ごとに独立に（Ｃ_１〜Ｃ_８）−アルキルである。

一実施形態では、Ｒ^１はその出現ごとに独立に、メチル、エチル、プロピル、ブチルおよびヘキシルからなる群から選択される。

Ｒ^２は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−（Ｃ_１〜Ｃ_８）−アルキル−ＮＲ−、−ＮＲＣ（Ｏ）−および−ＮＲＣ（Ｏ）−（Ｃ_１〜Ｃ_８）−アルキル−ＮＲからなる群から独立に選択され、ただし、Ｒは水素または（Ｃ_１〜Ｃ_８）−アルキルである。

一実施形態では、Ｒ^２は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。

他の実施形態では、Ｒ^２は−ＮＨＣ（Ｏ）−である。

一実施形態では、式１の化合物は、１、２、３または４の位置の少なくとも１つでＹ基と結合している。

他の実施形態では、式１の化合物は、１、２、３または４の位置の少なくとも１つでＹ基と結合しており、５、６、７または８の位置の少なくとも１つでＸ基とさらに結合している。

他の実施形態では、式１の化合物は、２または３の位置の少なくとも１つで少なくとも１つのＹ基と結合しており、７または８の位置の少なくとも１つでＸ基とさらに結合している。

他の実施形態では、式１の化合物は、２および７の位置でＹ基と結合している。

他の実施形態では、式Ｉの化合物は、２および７の位置でＹ基およびＸ基とそれぞれ結合している。

他の実施形態では、式１の化合物は、

である。

他の実施形態では、本発明は式１の化合物の調製に関する。

Ｔｓｕｂｅｒｙら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．第２７９巻、３８１１８〜３８１２４頁（２００４年）は、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニル−メトキシカルボニル）部分をベースとしたタンパク質の誘導体化のための加水分解性ＰＥＧ−リンカーの合成を記載している。ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳＵ（９−ヒドロキシメチル−２−（アミノ−３−マレイミド−プロピオネート）−７−スルホフルオレンＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート）の合成が記載されている。以下の合成スキームは、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳＵ誘導体から出発した、式１の化合物を調製するための例としての合成ステップを示す。

ただし、
ＰＯＬＹＭＥＲは半合成バイオポリマーであり、
Ｒ^１はその出現ごとに独立に（Ｃ_１〜Ｃ_８）−アルキルであり、
Ｒ^２は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−（Ｃ_１〜Ｃ_８）−アルキル−ＮＲ−、−ＮＲＣ（Ｏ）−および−ＮＲＣ（Ｏ）−（Ｃ_１〜Ｃ_８）−アルキル−ＮＲからなる群から独立に選択され、ただし、Ｒは、独立に、水素またはＣ_１〜Ｃ_８−アルキルである。

Ｒは、独立に、水素または（Ｃ_１〜Ｃ_８）−アルキルであり、
Ｘは−ＳＯ_３−Ｒ^３であり、
Ｒ^３は、水素、（Ｃ_１〜Ｃ_８）−アルキルおよび（Ｃ_１〜Ｃ_８）−アルキル−Ｒ^４からなる群から独立に選択され、
Ｒ^４はポリマーであり、
ｎは０、１、２、３または４から選択される整数であり、
ｍは、１、２、３または４から選択される整数である。

ＨＳ−ＰＯＬＹＭＥＲは、

などのチオール誘導体化された半合成バイオポリマーである。

式２の化合物は、アミンなどの置換のための１つまたは複数の基を含むタンパク質またはペプチド薬物と容易に反応させることができる。好ましいタンパク質またはペプチド薬物は、ＦＶＩＩＩ、ＶＷＦ、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸなどの血液凝固因子である。

上記手順によって修飾されたタンパク質およびペプチド薬物は、著しく高いインビボでの循環性を有する。リンカーの加水分解性は、その未変性の形態でのタンパク質の放出によって、加水分解後に活性を再度得ることができるようにする。図１および図２に例を示す。タンパク質コンジュゲートの生物活性の回復を図３および図４に示す。

本発明を、以下の実施例によって説明するが、これらに限定されるものではない。

（実施例１）
末端ＳＨ基を含むＰＳＡの調製
ポリシアル酸（Ｓｉｇｍａ）をＮａＩＯ_４で酸化し（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、第１３４１巻、２６〜３４頁（１９９７年））、末端アルデヒド基を生成させた。次いで、ＷＯ０５／０１６９７３に記載されているようにして、ＮＨ_４Ｃｌで還元的アミノ化ステップを実施し、シッフ塩基をＮａＣＮＢＨ_３で還元して末端アミノ基を含むＰＳＡ−ＮＨ_２を得た。続いて、メーカーの使用説明書に従って、２−イミノチオラン（Ｐｉｅｒｃｅ ２６１０１）と反応させて、末端ＳＨ基を含む改変されたＰＳＡを調製した。生成したＳＨ基のモル濃度はＥｌｌｍａｎｓ試薬を用いて判定した。さらに、同じ手順を、ＴｉｍＴｅｃ、ＬＬＣ、Ｎｅｗａｒｋ、ＵＳＡから得たＮ−アセチルノイラミン酸トリマーにＳＨ基を導入するために用いた。

（実施例２）
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳＵリンカーを用いたｒＦＶＩＩａのＰＳＡとのコンジュゲート
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中のｒＦＶＩＩａ（０．７ｍｇ／ｍｌ）の１５ｍｌ溶液に、二官能性リンカーＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳＵ（Ｔｓｕｂｅｒｙら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、第２７９巻、３８１１８〜３８１２４頁（２００４年）によって概要が示されているようにして調製した）を加え（濃度：０．５ｍｇ／ｍｇタンパク質）、室温で３０分間インキュベートした。次いで、実施例１に従って末端ＳＨ基を含む誘導体化ＰＳＡを調製した。ＰＳＡ誘導体をその混合物（濃度：１０ｍｇ ＰＳＡ−ＳＨ／ｍｇタンパク質）に加え、さらに２時間インキュベートした。次いで、０．１Ｍグリシン（最終濃度１０ｍＭ）および５ｍＭシステイン（終末濃度０．５ｍＭ）の水溶液を加えて反応を停止させた。ＱＨｙｐｅｒＤ Ｆ ５０μｍ樹脂（ＢｉｏＳｅｐｒａ）およびＰｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ１０；ｈ＝１０ｃｍ）を用いてイオン交換クロマトグラフィーにより、遊離試薬を、ｒＦＶＩＩａ−ＰＳＡコンジュゲートから分離した。ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩａを含む溶液をそのカラムにかけ、続いてこれを１０ＣＶ平衡緩衝液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で洗浄した。次いでポリシアル化されたｒＦＶＩＩａを、溶出緩衝液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．１）で溶出させた。溶出液は０．０６ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含んでおり、レゾルシノールアッセイ（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ；Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、第２４巻：６０４〜１１頁（１９５７年））によって、コンジュゲートと結合したＰＳＡの証拠が示された。コンジュゲート中のｒＦＶＩＩａの活性を放出させるために、４５０μｌの溶出液を５０μｌの１Ｍ ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．３）に加え、ＦＶＩＩａ活性の放出を測定した（Ｓｔａｃｌｏｔ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、Ａｓｎｉｅｒｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）。結果を図２に示す。

（実施例３）
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳＵリンカーを用いたトリマーＰＳＡのｒＦＶＩＩａとのコンジュゲート
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中のｒＦＶＩＩａ（０．７ｍｇ／ｍｌ）の１５ｍｌ溶液に、二官能性リンカーＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳＵ（Ｔｓｕｂｅｒｙら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、第２７９巻、３８１１８〜３８１２４頁（２００４年）によって概要が示されているようにして調製した）を加え（濃度：０．０７ｍｇ／ｍｇタンパク質）、室温で３０分間インキュベートした。次いで、実施例１に記載のようにしてトリマーＰＳＡ（ＴｉｍＴｅｃ、ＬＬＣ、Ｎｅｗａｒｋ、ＵＳＡ）を誘導体化して遊離ＳＨ基を導入した。トリマーＰＳＡ−ＳＨ誘導体を混合物（濃度：０．４３ｍｇトリマーＰＳＡ−ＳＨ／ｍｇタンパク質）に加え、さらに２時間インキュベートした。次いで、０．１Ｍグリシン（最終濃度１０ｍＭ）および５ｍＭシステイン（終末濃度０．５ｍＭ）の水溶液を加えて反応を停止させた。ＱＨｙｐｅｒＤ Ｆ ５０μｍ樹脂（ＢｉｏＳｅｐｒａ）およびＰｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ１０；ｈ＝１０ｃｍ）を用いてイオン交換クロマトグラフィーにより、遊離試薬をｒＦＶＩＩａ−ＰＳＡコンジュゲートから分離した。ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩａを含む溶液をそのカラムにかけ、続いてこれを１０ＣＶ平衡緩衝液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で洗浄した。次いでポリシアル化されたｒＦＶＩＩａを溶出緩衝液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．１）で溶出させた。溶出液は０．０６ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含んでおり、レゾルシノールアッセイ（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、第２４巻、６０４〜１１頁（１９５７年））によって、コンジュゲート中での結合したＰＳＡの証拠が示された。コンジュゲート中のｒＦＶＩＩａの活性を放出させるために、４５０μｌの溶出液を５０μｌの１Ｍ ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．３）に加え、ＦＶＩＩａ活性の放出を測定した（Ｓｔａｃｌｏｔ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、Ａｓｎｉｅｒｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）。結果を図１に示す。

（実施例４）
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳＵリンカーを用いたヒト血清アルブミンのＰＳＡとのコンジュゲート
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を、２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．２）中で二官能性リンカーＭａｌ−ＦＭＳＯＳＵリンカー（Ｔｓｕｂｅｒｙら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、第２７９巻、３８１１８〜３８１２４頁（２００４年）によって概要が示されているようにして調製した）で１時間インキュベートする。次いで、過剰のリンカーを、同じ緩衝剤系を用いてＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるゲルろ過によって分離する。タンパク質を含む画分を収集し、ＰＳＡ−ＳＨ（実施例１に従って調製）を加える。混合物を室温で２時間インキュベートする。次いでコンジュゲートを、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製する。タンパク質−ＰＳＡコンジュゲートを、２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５で溶出させる。コンジュゲートを含む画分を集め、１０Ｋ膜を用いた限外ろ過により濃縮する。次いでその溶液を、２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．２）に対してダイアフィルトレーションにかける（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｅｄ）。

（実施例５）
正常ラットにおけるｒＦＶＩＩａ−ＰＳＡ−コンジュゲートの薬物動態
ｒＦＶＩＩａ−ＰＳＡコンジュゲートを、０．０５ｍｇ／ｍｇの濃度のタンパク質のＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳＵを用いて、実施例２に従って調製した。８匹の正常ラット（４匹のオス、４匹のメス）に麻酔をかけ、緩衝液（１．３ｇ／Ｌグリシルグリシン、３ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、３０ｇ／Ｌマンニトール、１．５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ_２×２Ｈ_２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ５．５）中のｒＦＶＩＩａ−ＰＳＡ−コンジュゲートを、１０ｍｌ／ｋｇ（１２００μｇタンパク質／ｋｇ）の体積用量で尾静脈に静脈注射を施した。１２００μｇタンパク質／ｋｇの用量の非修飾ｒＦＶＩＩａを、８匹の正常ラット（４匹のオス、４匹のメス）での対照として用いた。上記コンジュゲート（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）を注射した後、５分、１時間、２時間、４時間、７時間、１０時間および２４時間後に、尾動脈から血液試料を採取し、クエン酸血漿を調製し、さらなる分析用に冷凍した。

血漿でのＦＶＩＩａ活性を凝固アッセイ（Ｓｔａｃｌｏｔ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、Ａｓｎｉｅｒｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）により測定し、ＦＶＩＩ抗原をＥＬＩＳＡ（ポリクローナル抗ヒトＦＶＩＩ抗体）で判定した。結果を統計的に評価した。ＦＶＩＩａ凝固活性について、用量調節した曲線下面積（ＡＵＣ）は、非修飾ｒＦＶＩＩａでは０．０１４であり、ｒＦＶＩＩａ−コンジュゲート（０〜無限大）では０．０１５に増大した。終末相半減期は２．３時間から４．４時間へ延長され、平均滞留時間（ＭＲＴ）は１．４時間から２．４時間へ延長された。抗原について、用量調節したＡＵＣ（０〜無限大）は０．０１０（非修飾ｒＦＶＩＩａ）から０．０１４（ｒＦＶＩＩａ−コンジュゲート）へ増大し、終末相半減期は１．４時間から２．３時間へ延長され、ＭＲＴは１．５時間から２．２時間へ延長された。すべての計算を、統計プログラムを用いて実施した（プログラムＲ：Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ． Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ、ＩＳＢＮ ３−９０００５１−０７−０、ＵＲＬ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）。薬物動態を図３および図４に示す。

（実施例６）
正常ラットにおけるｒＦＶＩＩａ−トリマー−ＰＳＡ−コンジュゲートの薬物動態
ｒＦＶＩＩａ−トリマー−ＰＳＡコンジュゲートを、０．０５ｍｇ／ｍｇの濃度のタンパク質のＭＡＬＦＭＳ−ＯＳＵを用いて、実施例３に従って調製した。６匹の正常ラット（３匹のオス、３匹のメス）に麻酔をかけ、緩衝液（１．３ｇ／Ｌグリシルグリシン、３ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、３０ｇ／Ｌマンニトール、１．５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ_２×２Ｈ_２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ５．５）中のｒＦＶＩＩａ−トリマー−ＰＳＡ−コンジュゲートを、１０ｍｌ／ｋｇ（１２００μｇタンパク質／ｋｇ）の体積用量で尾静脈に静脈注射を施した。１２００μｇタンパク質／ｋｇの用量の非修飾ｒＦＶＩＩａを、６匹の正常ラット（３匹のオス、３匹のメス）での対照として用いた。上記コンジュゲートを注射した後、５分、１時間、２時間、４時間、７時間、１０時間および２４時間後に、尾動脈から血液試料を採取し、クエン酸血漿を調製し、さらなる分析用に冷凍した。

血漿でのＦＶＩＩａ活性を凝固アッセイ（Ｓｔａｃｌｏｔ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、Ａｓｎｉｅｒｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）により測定し、排出曲線を作成した。ｒＦＶＩＩａ−トリマー−ＰＳＡコンジュゲートの改善された薬物動態を図５に示す。

（実施例７）
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳＵリンカーを用いたｒＦＩＸのＰＳＡとのコンジュゲート
２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）中の組換えＦＩＸ（８ｍｇ／ｍｌ）の０．６ｍｌ溶液に、二官能性リンカーＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳＵ（Ｔｓｕｂｅｒｙら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、第２７９巻、３８１１８〜３８１２４頁（２００４年）によって概要が示されているようにして調製した）を加え（濃度：０．０７ｍｇ／ｍｇタンパク質）、室温で３０分間インキュベートした。末端ＳＨ基を含む誘導体化ＰＳＡを実施例１に従って調製した。ＰＳＡ誘導体を混合物（濃度：３２ｍｇＰＳＡ−ＳＨ／ｍｇタンパク質−１００倍モル過剰）に加え、さらに室温で２時間インキュベートした。次いで、０．１Ｍグリシン（最終濃度１０ｍＭ）および５ｍＭシステイン（終末濃度０．５ｍＭ）の水溶液を加えて反応を停止させた。事前充填型ブチルセファロースカラム（ＨｉＴｒａｐブチルＦＦ ５ｍｌ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーにより遊離試薬をｒＦＩＸ−ＰＳＡコンジュゲートから分離した。５Ｍ ＮａＣｌ（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液、５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、６．７ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ６．９）を含む緩衝液を、ＰＳＡ−ｒＦＩＸを含む溶液に加えて３Ｍ ＮａＣｌの最終濃度を得た。この混合物をそのカラムにかけ、続いてこれを１０ＣＶ平衡緩衝液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液、３Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、６．７ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ６．９）で洗浄し、６．７ｍＭ ＣａＣｌ_２を含む５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）でｒＦＩＸ−ＰＳＡコンジュゲートを溶出させた。コンジュゲートを溶出させた後、ｐＨをｐＨ６．９に調節した。ＢＣＡアッセイで測定すると、溶出液は０．２４ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含んでおり、レゾルシノールアッセイ（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、第２４巻、６０４〜６１１頁（１９５７年））によって、コンジュゲート中での結合したＰＳＡの証拠が示された。最終ステップにおいて、溶出液を、３０ｋＤ膜（再生セルロース／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた限外ろ過／膜分離法（ＵＦ／ＤＦ）により、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ７．４に対して１０倍に濃縮した。

（実施例８）
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳＵリンカーを用いたｒＦＶＩＩＩのＰＳＡとのコンジュゲート
ｒＦＶＩＩＩ−ＰＳＡコンジュゲートを調製するために、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）中のＡｄｖａｔｅの製造プロセスにより得られた組換えＦＶＩＩＩ（４．５ｍｇ／ｍｌ）の６ｍｌの溶液に、二官能性リンカーＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳＵ（Ｔｓｕｂｅｒｙら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、第２７９巻、３８１１８〜３８１２４頁（２００４年）によって概要が示されているようにして調製した）を加え（濃度：０．３１５ｍｇ／ｍｇタンパク質）、室温で３０分間インキュベートした。末端ＳＨ基を含む誘導体化ＰＳＡを実施例１に従って調製した。ＰＳＡ誘導体を混合物（濃度：２７．８ｍｇＰＳＡ−ＳＨ／ｍｇタンパク質−４５０倍モル過剰）に加え、さらに室温で２時間インキュベートした。０．１Ｍグリシン（最終濃度１０ｍＭ）および５ｍＭシステイン（終末濃度０．５ｍＭ）の水溶液を加えて反応を停止させた。事前充填型ブチルセファロースカラム（ＨｉＴｒａｐブチルＦＦ ５ｍｌ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーにより遊離試薬をｒＦＶＩＩＩ−ＰＳＡコンジュゲートから分離した。５Ｍ ＮａＣｌ（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液、５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、６．７ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ６．９）を含む緩衝液を、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩを含む溶液に加えて３Ｍ ＮａＣｌの最終濃度を得た。この混合物をそのカラムにかけ、続いてこれを１０ＣＶ平衡緩衝液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液、３Ｍ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ６．９）で洗浄し、ｒＦＶＩＩＩ−ＰＳＡコンジュゲートを、クエン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（１３．６ｍＭ Ｎａ_３クエン酸、２０ｍＭ ＣａＣｌ_２、２０ｍＭヒスチジン、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０）で溶出させた。コンジュゲートを溶出させた後、ｐＨをｐＨ６．９に調節した。溶出液は２．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含んでいた（ＢＣＡアッセイ）。

Claims (12)

1. 式Ｉの化合物
   

   

   （式中、
   Ｚは脱離基であり、１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つはＹ基と結合しており、
   Ｙは、以下の構造を有する基であり、
   

   

   Ｒ ^１ は、その出現ごとに独立に（Ｃ _１ 〜Ｃ _８ ）−アルキルであり、
   Ｒ ^２ は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−または−ＮＲＣ（Ｏ）−のいずれかであり、
   Ｒは、独立に、水素または（Ｃ _１ 〜Ｃ _８ ）−アルキルのいずれかであり、
   炭水化物は、チオエーテル結合を介して結合しており、
   利用可能な１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つは任意選択でＸ基と結合していてもよく、
   Ｘは−ＳＯ_３−Ｒ^３であり、
   Ｒ^３は、水素、（Ｃ_１〜Ｃ_８）−アルキルおよび（Ｃ_１〜Ｃ_８）−アルキル−Ｒ^４からなる群から独立に選択され、そして、
   Ｒ^４はポリマーである）。
2. ＺがＮ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾリル、ハロゲン、Ｎ−ヒドロキシフタリミジル、ｐ−ニトロフェノキシ、イミダゾリル、チアゾリジニルチオン、または、Ｏ−アシル尿素である、請求項１に記載の化合物。
3. 前記炭水化物が多糖である、請求項１または２に記載の化合物。
4. 前記多糖がポリシアル酸（ＰＳＡ）である、請求項３に記載の化合物。
5. 前記多糖が少なくとも３単位の単糖を含む、請求項３に記載の化合物。
6. 以下のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ
   

   

   
   

   

   

   

   からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
7. 式（２）の化合物
   

   

   
   の調製方法であって、チオール基を有する炭水化物（ＨＳ−ＰＯＬＹＭＥＲ）と、以下の式を有する中間化合物
   

   

   
   をカップリング反応にかけて、式（２）の化合物を形成するステップを含み、ここで
   ＰＯＬＹＭＥＲは炭水化物であり、
   Ｒ^１はその出現ごとに独立に（Ｃ_１〜Ｃ_８）−アルキルであり、
   Ｒ^２は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−（Ｃ_１〜Ｃ_８）−アルキル−ＮＲ−、−ＮＲＣ（Ｏ）−および−ＮＲＣ（Ｏ）−（Ｃ_１〜Ｃ_８）−アルキル−ＮＲからなる群から独立に選択され、
   Ｒは、独立に、水素または（Ｃ_１〜Ｃ_８）−アルキルであり、
   Ｘは−ＳＯ_３−Ｒ^３であり、
   Ｒ^３は、水素、（Ｃ_１〜Ｃ_８）−アルキルおよび（Ｃ_１〜Ｃ_８）−アルキル−Ｒ^４からなる群から独立に選択され、
   Ｒ^４はポリマーであり、
   ｎは、０、１、２、３または４から選択される整数であり、
   ｍは、１、２、３または４から選択される整数である、
   方法。
8. ＨＳ−ＰＯＬＹＭＥＲが
   

   

   である、請求項７に記載の方法。
9. Ｒ^２が、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−または−ＮＲＣ（Ｏ）−のいずれかであり、ここで、Ｒは、独立に、水素またはＣ_１〜Ｃ_８−アルキルである、請求項７に記載の方法。
10. 前記式（２）の化合物と、タンパク質またはペプチド薬物とを反応させるステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
11. 請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物およびタンパク質またはペプチド薬物を含むコンジュゲート。
12. 前記タンパク質またはペプチド薬物が血漿タンパク質または血液凝固因子である、請求項１１に記載のコンジュゲート。

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