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CN103933575B - 一种三齿型连接子及其应用 - Google Patents

一种三齿型连接子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种三齿型连接子及其应用，所述三齿型连接子可用于获得抗体药物偶联物。所述抗体药物偶联物如式Ⅰ所示：L–(T–A–D)n Ⅰ其中L是抗体，抗体片段或蛋白；T是三齿型连接子部分；A是可断裂连接子组合或不可断裂连接子部分；D是药物部分；n是一个范围在1‑8的整数；所述三齿型连接子部分的结构如式Ⅱ所示：

Description

一种三齿型连接子及其应用
技术领域
本发明涉及应用抗体药物偶联物治疗肿瘤或其它疾病，尤其涉及应用一种特殊的三齿型连接子来制备抗体药物偶联物以控制药物/抗体比值(DAR)。
背景技术
作为新型的靶向治疗药物，抗体药物偶联物(ADC)开创了肿瘤治疗方法的新纪元(Carter等，2008，Cancer J.14：154-169；Chari等，2008，Acc.Chem.Res.41：98-107；Senter等，2009，Curr.Opin.Chem.Biol.13：235–244；Teicher等，2009，Curr.Cancer DrugTargets 9：982-1004；Ducry等，2010，Bioconjugate Chem.21：5-13；Lash等，2010，Invivo:The Business&Medicine Report 32-38；Casi等，2012，J.Control.Rel.161：422-428)。在美国的西雅图基因公司(Seattle Genetics,Inc.)和免疫原公司(ImmunoGen,Inc.)引领下，很多跨国制药企业和初创公司都开展了这一领域的研发。据美国华尔街报告披露，截止2011年5月，总计有36个ADC项目进入临床前和临床阶段。2011年8月美国食品药品监督管理局(FDA)批准西雅图基因公司研制的用于治疗霍奇金淋巴瘤以及复发性间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)的新药AdcetrisTM上市(Katz等，2011，Clin.Cancer Res.17：6428-6436)。健泰科生物技术公司(Genentech)研制的用于治疗乳腺癌的新药T-DM1正在进行三期临床试验并取得了满意的效果，有可能于2013年初获得FDA批准上市(Mathew等，2011，Curr.Opin.Oncol.23：594-600)。
抗体药物偶联物一般由三部分组成：抗体或抗体类配体，小分子药物，和将配体与药物偶联起来的连接子。抗体药物偶联物的作用机制如下：抗体或抗体类配体特异性地识别细胞表面抗原并与之结合；形成的结合物以内吞的方式进入细胞内，同时将小分子药物带入细胞；抗体被酶解或连接子自身断裂，小分子药物以适当的活性成分形式释放出来，杀死目标细胞。抗体药物偶联物采用的小分子细胞毒性药物活性非常高，通常比目前在一线应用的化疗药物活性高10-1000倍以上。用于抗体药物偶联物的细胞毒性药物主要包括美登素类(Maytansinoids,EP 0425235；US 5208020,5416064；7276497,7473796,7851432；US2007/0269447,2011/0158991；WO 2004/103272,2012/061590)，耳抑素肽类(Auristatins,US 6884869,7498298)，卡奇霉素类(Calicheamicins,US 5606040,5770710)，阿霉素类(Doxorubicins,Dubowchik等，2002，Bioconjugate Chem.13：855-869)，苯并二吡咯类抗生素类(duocarmycins和CC-1065类,US 7129261),以及吡咯并苯二氮卓二聚体类(PBDdimers,WO 2005/040170)等。抗体药物偶联物采用的连接子需满足以下要求：在细胞外具有足够的稳定性，保证小分子药物不与配体脱离；进入细胞后，可断裂的连接子在适当条件下断裂，释放出活性小分子药物；对于不可断裂的连接子，活性成分则由小分子，连接子，以及由配体酶解产生的氨基酸残基构成。
目前进入临床试验的抗体药物偶联物结构中，高活性的细胞毒性药物通常是通过连接子连接在配体表面的赖氨酸残基，或者抗体铰链区域的半胱氨酸残基(由链间二硫键部分还原得到)上,最佳的药物/配体比值(DAR)为2-4。抗体表面大量的赖氨酸残基(超过80个)以及偶联反应的非选择性，导致偶联数目和位点的不确定性，进而导致生成的抗体药物偶联物的不均一性。例如，T-DM1(平均DAR值为3.5)的DAR值分布为0-8(Lazar等，2005，Rapid Commun.Mass Spectrom.19：1806-1814)。同样，尽管抗体铰链区的链间二硫键只有四对，但为达到最佳平均DAR值(2-4)的要求，需要部分还原链间二硫键(Sun等，2005，Bioconjugate Chem.16：1282-1290)。由于现有的还原剂(DTT,TCEP等)无法选择性地还原链间二硫键，因此生成的偶联物也不是均一的产物，由多种组分组成，其主要组分的DAR值为0,2,4,6,8，而且对应每一种特定DAR值的组分都存在由于连接位点不同而形成的异构体。抗体药物偶联物产品的不均一性可以导致各成员组分间药物动力学性质，效价以及毒性的不均一性。例如，具有较高DAR值的组分在体内被清除得更快，并导致更高的毒性(Boswell等，2011，Bioconjugate Chem.22：1994-2004)。
为了解决抗体药物偶联物均一性问题，定点偶联技术近来得到了更多的青睐，这一技术从位点和数量两方面来控制抗体药物之间的偶联。西雅图基因公司选择性地用丝氨酸部分置换组成链间二硫键的半胱氨酸，从而将可用于偶联的位点从8个降低到4个或2个(WO 2006/065533；Mcdonagh等，2006，Protein Eng.Des.Sel.19：299-307)。这样得到的具有确定位点和DAR值的抗体药物偶联物，与从不均一偶联物中分离出来的具有同样DAR值的组分，表现出同样的体外和体内特性，包括抗肿瘤活性，药物动力学，和最大耐受量。应用噬菌体展示技术预测合宜的偶联位点，健泰科公司通过重组的方式在抗体的轻链和重链上引入半胱氨酸，在不影响抗体蛋白折叠组装和改变与抗原结合力的前提下，提供可用于偶联的巯基基团(US 7855275；US 2011/0301334；WO 2008/141044,2009/052249；Junutula等，2008，Nat.Biotechnol.26：925-933；Junutula等，2010,Clin.Cancer Res.16：4769-4778)。应用此项技术生产的抗体药物偶联物表现出令人满意的近均一组分具有的体内特性。与上述技术不同的是，Ambrx(WO 2006/069246,2007/059312)，Allozyne(US 2008/0096819；WO2007/130453,2009/026393)，Sutro(WO 2010/081110)，以及Redwood(US 2010/0210543)等公司都采用非天然氨基酸抗体/蛋白改造技术，在抗体/蛋白的合宜位点引入带有可偶联基团的非天然氨基酸，从而实现抗体/蛋白的定点修饰，包括聚乙二醇修饰，糖基化修饰，以及抗体药物偶联物。尽管以上技术都能够实现偶联药物位点和数量的可控，所应用的抗体/蛋白都是通过基因重组的方式得到的。基因重组技术需要大量的工作和精巧的设计，以寻找合宜的位点供药物偶联或聚乙二醇修饰，因此非常耗时而且研发费用较高。
针对以上偶联技术存在的问题，通过简单的化学方法实现定点偶联目的会节省大量的人力物力财力，因此更加富有吸引力。一种平衡转移烷基化交叉偶联试剂(ETAC)被开发用于定点偶联技术，该试剂可与铰链区二硫键完全还原/部分还原成巯基的抗体反应，生成链间交叉偶联的结构(Liberatore等，Bioconjugate Chem.1：36-50；del Rosario等，1990，Bioconjugate Chem.1：51-59)。交叉偶联的产品不仅收率较低(30％左右)，而且均一性较差，含有0到4组链间交叉偶联的组分。韩国的LegoChem Biosciences(LCB)公司报道了一种定点偶联技术，包括定点功能化步骤和正交药物偶联步骤，但是技术的细节并没有披露(BioSpectrum,2012,39)。
因此，本领域迫切需要提供高效、简单、实用的化学偶联方法。
发明内容
本发明旨在提供一种可用于化学偶联方法制备抗体药物偶联物的新型三齿型连接子。
在本发明的第一方面，提供了一种如式Ⅰ所示的抗体药物偶联物，
L–(T–A–D)n Ⅰ
其中L是抗体，抗体片段或蛋白；T是三齿型连接子部分；A是连接子部分；D是药物部分；n是一个范围在1-8的整数；
所述三齿型连接子部分的结构如式Ⅱ所示：
其中W是取代的芳基，杂芳基，链烷基，环烷基，杂环烷基，或其中任意组合。
在另一优选例中，所述A是可断裂连接子组合或不可断裂连接子；更佳地，所述A的结构如式Ⅲ或Ⅳ所示：
C–Ee–Ff Ⅲ
Gg Ⅳ
其中C是可断裂连接子；E,F是自杀式连接子；e,f是在0-5范围内的整数；G是不可断裂连接子；g是0-5范围内的整数。
在另一优选例中，所述抗体药物偶联物的结构如式Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ或Ⅷ所示：
其中，L是抗体、抗体片段或蛋白，L′是抗体、抗体片段、蛋白或其它基团(如半胱氨酸等含巯基基团)；当L′是抗体或抗体片段时，与L是同一抗体或抗体片段；Z是O，S，NR2，C(＝O)O，C(＝O)NR3，C(＝S)O，C(＝S)NR4，C(＝S)S，NR5(C＝O)NR6，NR7(C＝S)NR8，O(C＝O)NR9；m是0或1；R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8,和R9独立地选自H,链烷基，环烷基，杂环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基；R1是链烷基，环烷基，杂环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，聚乙二醇,或其中任意组合；n是范围在0-8的整数；X是-NR10-，-O-，-S-，-C(＝O)-，-C(＝S)-，-NR11(C＝O)-，-NR12(C＝S)-，-O(C＝O)-，-O(C＝S)-；R10，R11，和R12独立地选自H,链烷基，环烷基，杂环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基；J是取代基团,包括，但不限于氢,卤素，硝基，氰基，羟基，烷氧基，氨基，酰胺基，酯基，磺酰胺基，脲，链烷基，环烷基，杂环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基；o是0，1，2或3；R13,R14,R15和R16独立地选自链烷基，环烷基，杂环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，或其中任意组合；Q是N或CR17；R17独立地选自H，链烷基，环烷基，杂环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基；p,q是范围在0-8的整数；x,y是范围在0-8的整数，并且x+y≥1。
在另一优选例中，所述抗体为针对细胞表面受体和肿瘤相关抗原的抗体。
在另一优选例中，所述药物为细胞毒性药物，治疗自身免疫疾病的药物和抗炎症的药物。
在本发明的第二方面，提供了一种结构如式1所示的三齿型连接子：
在本发明的第三方面，提供了一种结构如式3所示的三齿型连接子：
在本发明的第四方面，提供了一种结构如式4所示的三齿型连接子：
在本发明的第五方面，提供了一种结构如式5所示的三齿型连接子：
在本发明的第六方面，提供了一种结构如式6所示的三齿型连接子：
在本发明的第七方面，提供了一种结构如式IX所示的三齿型连接子在制备抗体药物偶联物中的应用：
其中W是取代的芳基，杂芳基，链烷基，环烷基，杂环烷基，或其中任意组合。
在另一优选例中，所述的三齿型连接子的结构如式1、式2、式3、式4、式5或式6所示：
据此，本发明提供了一种高效、简单、实用的化学偶联方法。
附图说明
图1显示了本发明中涉及的六个典型的三齿型连接子结构以及三个简化的双齿型连接子结构。
图2a和图2b显示了抗体-三(或二)齿型连接子偶联物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定结果。
图3显示了抗体药物偶联物的疏水作用色谱(HIC)测定结果，其中a是H-mc-vcMMAE，b是H-1-vcMMAE，c是H-3-vcMMAE，d是H-4-vcMMAE。
图4显示了抗体药物偶联物的尺寸排除色谱(SEC)测定结果，其中a是H-1-vcMMAE，b是H-1-MMAF，c是H-3-vcMMAE，d是H-3-MMAF，e是H-4-vcMMAE，f是H-4-MMAF。
图5显示了抗体药物偶联物的酶联免疫吸附(ELISA)测定结果，其中a是H-1-MMAF和H-1-vcMMAE，b是H-3-MMAF和H-3-vcMMAE，c是H-4-MMAF和H-4-vcMMAE。
图6显示了抗体药物偶联物的细胞增殖抑制实验结果，其中a是H-1-MMAF、H-3-MMAF和H-4-MMAF，b是H-1-vcMMAE、H-3-vcMMAE和H-4-vcMMAE。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现“三齿连接子”可以全部/部分交叉偶联抗体的轻链-重链及重链-重链，进而发现应用此种偶联方法得到的抗体药物偶联物，与传统抗体药物偶联物相比，具有更窄的药物/抗体比值(DAR)分布。
具体地，本发明提供的“三齿型连接子”，包含两个马来酰胺单元和第三个偶联基团。两个马来酰胺单元用于交联抗体链间的巯基基团(还原后)，而第三个偶联基团用于与小分子药物或药物-连接子单元偶联：
所产生的抗体药物偶联物可用于靶向输送药物到达目标细胞群体，例如肿瘤细胞。抗体药物偶联物可以特异性的与细胞表面蛋白结合，所产生的结合物随即被细胞内吞。在细胞内，药物以活性药物的方式释放出来产生功效。抗体包括嵌合抗体，人源化抗体，人抗体；可与抗原结合的抗体片段；或者抗体Fc融合蛋白；或者蛋白。药物是高活性药物，包括，但不局限于，美登素类(Maytansinoids)，耳抑素肽类(Auristatins)，卡奇霉素类(Calicheamicins)，阿霉素类(doxorubicins)，苯并二吡咯类抗生素类(Duocarmycins andCC-1065)，吡咯并苯二氮卓二聚体类(PBD dimers)等。在某种情况下，药物可以是聚乙二醇。药物或药物-连接子单元通过三齿型连接子与抗体偶联，生成部分链间交联的偶联物。与传统的抗体药物偶联物相比，应用本发明方法制备的抗体药物偶联物的药物/抗体比值(DAR)分布更窄，从而大幅提升了产品均一性及药理学特性均一性。
定义
如本文所用，“抗体”或“抗体单元”在其所属的范围内，包括抗体结构的任何部分。这一单元可以结合，反应性关联，或者络合一个受体，抗原，或者靶向细胞群体具有的其他受体单元。抗体可以是任何蛋白或蛋白类分子，它可以结合，络合，或者与待治疗或生物改造的细胞群体的一部分发生反应。
本发明中组成抗体药物偶联物的抗体最好保持其原有野生状态时的抗原结合能力。因此，本发明中的抗体能够，最好专一性地，与抗原结合。涉及的抗原包括，例如，肿瘤相关抗原(TAA)，细胞表面受体蛋白和其他细胞表面分子，细胞存活调节因子，细胞增殖调节因子，与组织生长与分化相关的分子(如已知或预知的具有功能性的)，淋巴因子，细胞因子，参与细胞循环调节的分子，参与血管生成的分子，以及与血管生成有关的分子(如已知或预知的具有功能性的)。肿瘤相关因子可以是簇分化因子(如CD蛋白)。与本发明中所述抗体结合的抗原可以是上述分类中一个或一个子集，而其它的子集则包含其它的具有特殊性质的分子/抗原(与目标抗原相比)。
应用在抗体药物偶联物中的抗体包括，但不局限于，针对细胞表面受体和肿瘤相关抗原的抗体。这样的肿瘤相关抗原是业内所熟知的，可以通过业内熟知的抗体制备方法和信息来制备。为了开发可用于癌症诊断与治疗的有效的细胞水平目标物，研究人员力图找寻跨膜或其他肿瘤相关多肽。这些目标物能够特异性地表达在一种或多种癌症细胞表面，而在一种或多种非癌细胞表面表达很少或不表达。通常，相对于非癌细胞表面而言,这样的肿瘤相关多肽在癌细胞表面更加过度表达。确认这样的肿瘤相关因子，可大大提高基于抗体治疗癌症的专一靶向特性。
肿瘤相关抗原包括，但不局限于，以下列出的肿瘤相关抗原(1)-(36)。为方便起见，为业内所熟知的抗原相关信息标示如下，包括名称，其它名称，基因库登录号。与肿瘤相关抗原对应的核酸和蛋白序列可参见公开数据库，例如Genbank。抗体靶向对应的肿瘤相关抗原包括所有的氨基酸序列变种和同种，与参考文献中确认的序列具有至少70％，80％，85％，90％，或95％的同源性，或者具备与引用文献中的肿瘤相关抗原序列具有完全一致的生物性质和特征。
肿瘤相关抗原(1)-(36)：
(1)BMPR1B(骨形态发生蛋白受体-IB型，Genbank登录号NM_001203)；
(2)E16(LAT1，SLC7A5，Genbank登录号NM_003486)；
(3)STEAP1(六次跨膜的前列腺上皮抗原，Genbank登录号NM_012449)；
(4)0772P(CA125，MUC16，Genbank登录号AF361486)；
(5)MPF(MPF，MSLN，SMR、巨核细胞强化因子，间皮素，Genbank登录号NM_005823)；
(6)Napi3b(NAPI-3B，NPTIIb，SLC34A2，溶质载运体家族34(磷酸钠)成员2，II型钠依赖型磷酸转运子3b，Genbank登录号NM_006424)；
(7)Sema 5b(FLJ10372，KIAA1445，Mm.42015，SEMA5B，SEMAG，脑信号蛋白5b Hlog，sema结构域，七个血小板反应蛋白重复序列(1型和类1型)，跨膜结构域(TM)和短胞质结构域，(脑信号蛋白)5B，Genbank登录号AB040878)；
(8)PSCA hlg(2700050C12Rik,C530008016Rik,RIKEN cDNA 2700050C12,RIKENcDNA 2700050C12基因，Genbank登录号AY358628)；
(9)ETBR(内皮缩血管肽B型受体，Genbank登录号AY275463)；
(10)MSG783(RNF124,假拟蛋白FLJ20315,Genbank登录号NM_017763)；
(11)STEAP2(HGNC_8639,IPCA-1,PCANAP1,STAMP1,STEAP2,STMP,前列腺癌相关基因1，前列腺癌相关蛋白1，六次跨膜的前列腺上皮抗原2，六次跨膜的前列腺蛋白，Genbank登录号AF455138)；
(12)TrpM4(BR22450,FLJ20041,TRPM4,TRPM4B,瞬时受体电势阳离子通道，亚家族M，成员4，Genbank登录号NM_017636)；
(13)CRIPTO(CR,CR1,CRGF,CRIPTO,TDGF1,畸胎瘤衍生生长因子，Genbank登录号NP_003203或NM_003212)；
(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/EB病毒受体)或Hs.73792,Genbank登录号M26004)；
(15)CD79b(CD79B,CD79β,IGb(免疫球蛋白相关β),B29,Genbank登录号NM_000626)；
(16)FcRH2(IFGP4,IRTA4,SPAP1A(含有磷酸酶锚定蛋白1a的SH2结构域),SPAP1B,SPAP1C,Genbank登录号NM_030764)；
(17)HER2(ErbB2,Genbank登录号M11730)；
(18)NCA(CEACAM6,Genbank登录号M18728)；
(19)MDP(DPEP1,Genbank登录号BC017023)；
(20)IL20Rα(IL20Ra,ZCYTOR7,Genbank登录号AF184971)；
(21)Brevican(BCAN,BEHAB,Genbank登录号AF229053)；
(22)EphB2R(DRT,ERK,Hek5,EPHT3,Tyro5,Genbank登录号NM_004442)；
(23)ASLG659(B7h,Genbank登录号AX092328)；
(24)PSCA(前列腺干细胞抗原前体，Genbank登录号AJ297436)；
(25)GEDA(Genbank登录号AY260763)；
(26)BAFF-R(B细胞活化因子受体，BLyS受体3，BR3,Genbank登录号AF116456)；
(27)CD22(B细胞受体CD22-B同种型,Genbank登录号AK026467)；
(28)CD79a(CD79A,CD79α,免疫球蛋白相关α，能够与Igβ(CD79B)发生共价作用并在表面与Ig M分子形成复合物，转导参与B细胞分化信号的B细胞特异性蛋白，Genbank登录号NP_001774.1)；
(29)CXCR5(伯基特氏(Burkitt’s)淋巴瘤受体1，被CXCL13趋化因子活化的G蛋白偶联受体，在淋巴细胞迁移和体液防御中发挥作用，在HIV-2感染以及可能在艾滋病，淋巴瘤，骨髓瘤，和白血病中发挥作用，Genbank登录号NP_001701.1)；
(30)HLA-DOB(MHCII类分子的Beta亚基(Ia抗原)，其结合肽并将其呈递到CD4+T淋巴小细胞，Genbank登录号NP_002111.1)；
(31)P2X5(嘌呤受体P2X配体门控离子通道5，由胞外ATP门控的离子通道，可能涉及突触传递和神经新生，其缺陷可能导致特发性逼尿肌不稳定的病理生理状况，Genbank登录号NP_002552.2)；
(32)CD72(B细胞分化抗原CD72,Lyb-2,Genbank登录号NP_001773.1)；
(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105),富含亮氨酸重复的I型膜蛋白(LRR)家族，调节B细胞活化和凋亡，功能的丧失与系统性红斑狼疮患者疾病活动增加有关，Genbank登录号NP_005573.1)；
(34)FcRH1(Fc受体样蛋白1，推定的免疫球蛋白Fc结构域受体，包含C2型类Ig样和ITAM结构域，可能在B淋巴细胞分化中起作用，Genbank登录号NP_443170.1)；
(35)IRTA2(易位相关免疫球蛋白超家族受体2，推定的免疫受体，可能在B细胞发育和淋巴瘤产生中起作用；由易位导致的基因失调发生在一些B细胞恶性病上，Genbank登录号NP_112571.1)；
(36)TENB2(推定的跨膜蛋白聚糖，与生长因子的EGF/调蛋白(heregulin)家族和卵泡抑素(follistatin)相关，Genbank登录号AF179274)。
如本文所用，“药物”或者代号“D”泛指任何具有期望的生物活性，并具有反应性官能团以便制备本发明所述偶联物的化合物。期望的生物活性包括，诊断，治愈，缓解，治疗，预防人或其它动物的疾病。因此，只要具有必需的反应性官能团，术语“药物”涉及的化合物包括正式国家药典，以及例如美国正式同种疗法药典，正式全国处方集，或者其任何增补本等确认的药物。典型的药物列于医师案头用药参考(PDR)和美国食品药品监督管理局(FDA)的橙皮书。随着新型药物不断被发现和发展，本专利规定这些药物也应纳入本发明所述偶联药物的前药。
较佳地，药物是指：一种用于癌症治疗的细胞毒性药物；一种具有期望生物活性的蛋白或多肽，例如一种毒素，如相思子毒素，蓖麻毒素A,假单胞菌外毒素，和白喉毒素；其他合适的蛋白包括肿瘤坏死因子，α-干扰素，β-干扰素，神经原生长因子，血小板衍生生长因子，组织型纤酶溶原生长因子，以及生物反应调节制剂，例如淋巴因子，白细胞介素-1(IL-1),白细胞介素-2(IL-2),白细胞介素-6(IL-6),粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),粒细胞集落刺激因子，或其它生长因子。
一方面，药物是美登素或类美登素。美登素化合物通过抑制微管蛋白的微管形成来抑制细胞增殖(Temillard et al(1975)Science 189:1002-1005；U.S.Pat.No.5,208,020)。类美登素是美登素的衍生物。美登素和类美登素都具有高效的细胞毒性，但是它们在癌症治疗的临床应用上具有很大的局限性，这主要是源于此类分子对肿瘤的低选择性。但是，这种高细胞毒性促使它们成为抗体药物偶联物的首选药物部分。以下列出了美登素，类美登素，以及在抗体药物偶联物应用中经常利用的三个类美登素分子结构。
合成类美登素的主要原料是美登醇，主要由安丝菌素水解得到。安丝菌素可以通过发酵的方式制备。安丝菌素衍生物(WO 2012/061590)和丙氨酰基美登醇(US 2012/0121615)据报道也可作为抗体药物偶联物的药物“弹头”(这两类分子结构见下式所示)。
一方面，药物是耳抑素肽类药物。耳抑素肽类药物是海兔毒素10(Dolastatin 10)的类似物，而后者是从海洋软体动物海兔体内分离出来的具有生物活性的多肽(US7498298)。海兔毒素10通过结合微管蛋白(与长春新碱同样的结合区域)而抑制微管蛋白聚合。海兔毒素10，耳抑素肽PE，耳抑素肽E都是线性多肽，含有四个氨基酸(其中三个氨基酸是海兔毒素类化合物所独有的)和C-端酰胺基团。两个代表性的耳抑素肽类化合物，单甲基耳抑素肽E(MMAE)和单甲基耳抑素肽F(MMAF)，都是抗体药物偶联物的首选药物部分。
一方面，药物是卡奇霉素类药物。卡奇霉素类药物是抗肿瘤抗生素，通过结合DNA小沟并促使特定位点双螺旋DNA断裂，而导致细胞凋亡。卡奇霉素类药物具有体外亚皮克摩尔级别的高活性，但是它们的低治疗指数排除了临床应用前景。然而这种高活性却是它们成为抗体药物偶联物的理想候选药物(如吉妥单抗和Inotuzumab Ozogamicin)。
一方面，药物是阿霉素类。阿霉素能够嵌入DNA双螺旋结构从而阻断DNA复制，因此被用作化疗药物。但是由于阿霉素类较低的细胞毒性(针对人源癌细胞系，半数抑制浓度为0.1-0.2微摩尔，而用于抗体药物偶联物的细胞毒性药物活性通常为亚纳摩尔级)，导致其在抗体药物偶联物中的应用并不普遍。
一方面，药物是苯并二吡咯类抗生素(duocarmycins,CC-1065等)和其它的环丙基吡咯吲哚-4-酮(cyclopropapyrroloind-4-one,CPI)衍生物。这类化合物是有效的DNA小沟结合-烷基化试剂。环丙苯并吲哚-4-酮(cyclopropabenzindol-4-one，CBI)类似物的化学结构更稳定，生物活性更高，而且与它们含有天然CPI烷基化亚基的父系化合物相比更容易合成。一个代表性的CBI衍生物是酚羟基保护衍生物CBI(见下式)，具有弱化的前药毒性和增强的水溶性。
一方面，药物是吡咯并苯二氮卓类(pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodi-azepines，PBDs)或者PBD二聚体类(PBD dimers)。PBD是一类由链霉菌产生的天然产物，其独特特性在于能够在DNA小沟，确切是在嘌呤-鸟嘌呤-嘌呤序列处，形成非扭曲的共价加和物。应用PBD作为部分小分子策略靶向锁定DNA序列以及作为新型的抗癌和抗菌药物引起了越来越多的兴趣(Antonow等，2008,Biochemistry 47:11818-11829)。应用一个柔性碳链连接两个PBD单元的C8/C8’的羟基基团，所得的二聚体具有增强的生物活性(WO 2011/130616)。PBD二聚体被认为是可以产成序列选择性的DNA损伤，例如倒序的5′-Pu-GATC-Py-3′链间交联，从而导致其生物活性。这些化合物已被证明是高效的细胞毒性药物，可作为抗体药物偶联物的备选药物。
另一方面，药物并不仅仅局限于上述提到的类别，还包括所有可用于抗体药物偶联物的药物。
按照在细胞内药物释放的机制，如本文所用，“连接子”或“抗体药物偶联物的连接子”可被分为两类：不可断裂连接子和可断裂连接子。
对于含有不可断裂连接子的抗体药物偶联物，其药物释放机制为：偶联物与抗原结合并被细胞内吞后，抗体在溶酶体中被酶解，释放出由小分子药物，连接子，和抗体氨基酸残基共同组成的活性分子。由此带来的药物分子结构改变并不减弱其细胞毒性，但由于活性分子是带电荷的(氨基酸残基)，从而导致其不能渗入邻近细胞。因此，此类活性药物不能杀死邻近不表达靶向抗原(抗原阴性细胞)的肿瘤细胞(旁观者效应,bystander effect)(Ducry等，2010，Bioconjugate Chem.21:5-13)。
可断裂连接子，顾名思义，可以在目标细胞内断裂并释放出活性药物(小分子药物本身)。可断裂连接子可分为两个主要的类别：化学不稳定连接子和酶不稳定连接子。
化学不稳定连接子可以由于血浆和细胞质性质的不同而选择性的断裂。这样的性质包括pH值，谷胱甘肽浓度等。
对pH值敏感的连接子，通常又称为酸断裂连接子。这样的连接子在血液的中性环境下相对稳定(pH 7.3-7.5)，但是在弱酸性的内涵体(pH 5.0-6.5)和溶酶体(pH 4.5-5.0)内将会被水解。第一代的抗体药物偶联物大多应用这类连接子，例如腙，碳酸酯，缩醛，缩酮类。由于酸断裂连接子有限的血浆稳定性，基于此类连接子的抗体药物偶联物通常具有较短的半衰期(2-3天)。这种较短的半衰期在一定程度上限制了pH敏感连接子在新一代抗体药物偶联物中的应用。
对于谷胱甘肽敏感的连接子，又称二硫键连接子。药物释放是基于细胞内谷胱甘肽的高浓度(毫摩尔范围)与血液中相对较低的谷胱甘肽浓度(微摩尔范围)差异引起的。对于肿瘤细胞而言尤其如此，其低含氧量导致还原酶的活性增强，因而导致更高的谷胱甘肽浓度。二硫键具有热力学稳定性，因此在血浆中具有较好的稳定性。
酶不稳定连接子，如肽连接子，能够更好地控制药物释放。肽连接子能够被溶酶体内蛋白酶，如组织蛋白酶(Cathepsin B)或纤溶酶(在一些肿瘤组织中此类酶含量增加)，有效地切断。这种肽连接被认为在血浆循环中非常稳定，这是因为细胞外不合宜的pH值及血清蛋白酶抑制剂导致蛋白酶通常在不具备活性。鉴于较高的血浆稳定性和良好的细胞内断裂选择性和有效性，酶不稳定连接子被广泛用做抗体药物偶联物的可断裂连接子。典型的酶不稳定连接子包括Val-Cit(vc),Phe-Lys等。
自杀式连接子一般嵌合在可断裂连接子与活性药物之间，或者本身就是可断裂连接子的一部分。自杀式连接子的作用机制是：当可断裂连接子在合宜的条件下断裂后，自杀式连接子能够自发地进行结构重排，进而释放与之连接的活性药物。常见的自杀式连接子包括对氨基苄醇类(PAB)和β-葡萄糖醛酸苷类(β-Glucuronide)等。
抗体药物偶联物
本发明提供的抗体药物偶联物由抗体、三齿型连接子、连接子和药物组成，所述连接子是可断裂连接子组合或不可断裂连接子。
抗体是球状蛋白，含有一系列氨基酸位点可用于偶联药物-连接子。由于其三级和四级结构，只有溶剂可及的氨基酸可供偶联。事实上，高收率的偶联通常发生在赖氨酸残基的ε-氨基基团或半胱氨酸残基的巯基基团上。
抗体蛋白表面的大量赖氨酸侧链导致大量的位点可供药物偶联，从而导致生成的抗体药物偶联物是混合物，含有不同的药物偶联数量(药物/抗体比值，DAR)和偶联位点。
本发明提供的偶联产品，尽管仍然是混合物，但与传统方式偶联得到的抗体药物偶联物相比，其DAR分布范围很窄。其平均DAR值接近4，接近最佳抗体药物偶联物平均DAR值(2-4)范围。此外，偶联产品不含有裸抗(DAR＝0)，这一组分对细胞毒杀不起作用。同时，偶联产品也不含有重度偶联产品(DAR＝8),这一组分在体内的清除速度很快，相对于低DAR的组分而言。因此，本发明提供的抗体药物偶联物产品非均一性得到很大的改善。
对于三齿型连接子而言，两个马来酰胺基团之间的距离(简称连接子尺寸)可能会直接影响三齿型连接子对抗体链间交联的效率。发明人合成了一系列具有不同尺寸的三齿型连接子，以及三齿型连接子的简化模式(双齿型连接子，不包含与药物偶联的基团)。将这些连接子与还原后的抗体反应，所得的偶联物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和疏水作用色谱(HIC)分析，以考察连接子尺寸对抗体链间交联的影响。
三齿连接子及二齿连接子
抗体药物偶联物
制备方法
偶联步骤如下所示。在A步骤，一个连接子与三齿型连接子偶联得到三齿型连接子-连接子(T-L)。在B步骤，T-L与药物分子(D)偶联得到三齿型连接子-连接子-药物(T-LD)。在C步骤，抗体链间二硫键被还原产生共8个巯基基团。在D步骤，T-LD与还原后的抗体巯基交联，生成部分/全部交联的抗体药物偶联物。
用途
本发明提供的抗体药物偶联物，靶向瞄准特殊的细胞群体，与细胞表面特异蛋白(抗原)结合，结合物内吞进入细胞内，药物以活性形式释放到细胞内。
本发明提供抗体药物偶联物，靶向瞄准特殊的细胞群体，与细胞表面特异蛋白(抗原)结合，发生功效；或者在细胞外释放药物，药物渗入细胞内产生功效。
本发明提供一种复合物，包括有效剂量的药物偶联物和药学可接受的载体或媒介。
本发明提供治疗动物体内癌症或其他肿瘤的治疗方法，所述方法是给患有癌症或其他肿瘤的动物使用治疗有效量的本发明提供的抗体药物偶联物。
本发明提供治疗自免疫疾病或炎症疾病的治疗方法，所述方法是给患有自免疫疾病或炎症疾病的患者使用治疗有效量的本发明提供的抗体药物偶联物。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、本发明提供的偶联方法适用于大部分抗体,从而可以避免对每一种抗体进行繁琐的重组改造以引入定点偶联位点,因此具有广泛的应用前景。
2、本发明提供的新型三齿型连接子，可通过简单的化学方法与抗体偶联。尽管通过这种方法产生的抗体药物偶联物仍然不具有完全的均一性，但与传统的偶联方式相比，应用这种连接子得到的偶联物DAR值分布非常窄，因此生成的产品均一性得到了很大程度的提高。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明下列实施例中采用的通用步骤是：
通用步骤A
三齿型连接子的合成
三齿型连接子的合成，可参照双马来酰胺类化合物的合成(Girouard等，2005，J.Am.Chem.Soc.127:559-566)。
通用步骤B
抗体连接子偶联或抗体药物偶联物制备
向贺赛汀溶液(2-10mg/mL，25mM硼酸-硼酸钠缓冲液，25mM氯化钠，1mM二乙烯三胺五乙酸，pH值8.0)中加入三(2-羧乙基)膦盐酸盐(10当量，储备液浓度10mM)。反应液于37℃恒温摇床内孵育1小时。将反应液冷却至～10℃。
向冷却至10℃的还原贺赛汀溶液中加入二甲亚砜和5-100当量的二(三)齿型连接子或三齿型连接子-(连接子)-药物化合物(二甲亚砜储备液)，并保证反应液中二甲亚砜体积占比达15％。偶联反应在10℃进行1小时。
向反应液加入过量的半胱氨酸溶液，以淬灭未反应的二(三)齿型连接子或三齿型连接子-(连接子)-药物化合物。淬灭反应在10℃进行30分钟。反应液先经超滤除去二(三)齿型连接子-半胱氨酸加合物或三齿型连接子-(连接子)-药物-半胱氨酸加合物以及过量的半胱氨酸，然后经由0.2微米孔径的过滤装置除菌，并在4℃条件下保存。
通用步骤C
聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
SDS-PAGE是在Bio-Rad 165-8001电泳仪上测定的：将不低于10微克的样品与相应的上样缓冲液混合，沸水浴上加热1分钟；按顺序将样品和标准蛋白(5微升/孔)加入到浓缩胶梳孔中，在220伏条件下泳胶45分钟；将泳好的胶取出，用去离子水冲洗一遍，然后加入考马斯亮蓝G250染色液并在摇床上染色16小时；染色后的胶用去离子水冲洗三遍，在摇床上脱色2小时；脱色后的胶取出后转移到成像仪上记录凝胶图像。
通用步骤D
疏水作用色谱(HIC)分析
疏水作用色谱是在安捷伦1100(Agilent 1100)色谱仪上测定的。固定相采用TSKgel丁基-NPR柱(4.6×35mm，2.5μm，东曹(上海)生物科技有限公司)。洗脱梯度为线性梯度，25分钟内从100％缓冲液A[50mM磷酸钾(pH 7.0)+1.5M硫酸铵]置换到100％缓冲液B[80％v/v 50mM磷酸钾(pH 7.0),20％v/v异丙醇]。流速为0.8毫升/分钟，柱温设在30℃,检测波长设在230纳米和280纳米。
通用步骤E
酶联免疫吸附测定(ELISA)
采用间接ELISA方法考察待测抗体或抗体药物偶联物与对应抗原的结合能力：将Her2抗原与固相载体(96孔酶标板)连接，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原；加梯度稀释的抗体或受检抗体药物偶联物，其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原-抗体复合物，未结合固相抗原的抗体或抗体药物偶联物经洗涤除去；加酶标抗抗体，使其与结合在固相抗原上的抗体或ADC抗体结合，未结合的抗抗体经洗涤除去；加入底物溶液，用酶标仪读取450nm/630nm处的光密度值，绘制曲线，计算EC50。
通用步骤F
细胞增殖实验(Cell Proliferation Assay)
通常，抗体或抗体药物偶联物的细胞抑制活性是通过以下方法测定的：将表达肿瘤相关抗原或受体蛋白的哺乳动物细胞与抗体或抗体药物偶联物在细胞培养基中相接触；细胞孵育2到5天时间；测定细胞数量。基于细胞的体外实验用来测定细胞生存力，即增殖(IC50),细胞毒性(EC50),以及抗体药物偶联物的诱导凋亡(切冬酶激活)。
除非另外说明，所有的无水试剂都是直接从供应商购买的，并保存在氮气下。购买的所有其它试剂和溶剂都是高纯度的，并且使用前不经过进一步纯化。
核磁共振波谱是在Bruker Avance III 500兆核磁共振波谱仪上采集的。化学位移(δ)单位是ppm,以四甲基硅烷为参照系(化学位移为0)，偶合常数(J)单位是Hz。
低分辨质谱数据是在一台与惠普Agilent 1200高效液相色谱仪接口的Agilent6110(酸法)或6120B(碱法)质谱仪上采集的。酸法高效液相色谱方法采用沃特世SunfireC18反相色谱柱(4.60×50mm，3.5μm)进行分离，洗脱液梯度为1.4分钟内5％-95％B相(乙腈，含0.01％三氟乙酸)在A相(水相，含0.01％TFA)，流速为2.3mL/min，柱温为50℃；碱法高效液相色谱方法采用沃特世Xbridge C18反相色谱柱(4.60×50mm，3.5μm)进行分离，洗脱液梯度为1.5分钟内5％-95％B相(乙腈)在A相(水相，含10mM碳酸氢铵)，流速为2.0mL/min，柱温为40℃。
制备高效液相色谱纯化是在吉尔森仪器上完成的，使用的分离柱为沃特世Sunfire C18反相色谱柱(250×19mm，10μm)。流动相为含0.1％TFA的水相-乙腈梯度淋洗液。
使用的细胞系是SK-BR-3人乳腺癌细胞。该细胞系是从ATCC得到的。Her2抗原购自义翘神州公司(北京)。酶标抗抗体购自西格玛公司(上海)。底物溶液购自Decent生物技术公司(上海)。Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞增殖-毒性检测试剂盒购自Dojindo公司(上海)。
实施例1
化合物1的制备
3,4-二氨基苯甲酸(1.5g，9.87mmol)和马来酸酐(2.9g，29.6mmol)在氯仿(90mL)中回流20小时。反应得到的黄色沉淀过滤收集。固体重新悬浮在乙酸酐(75mL)中，加入乙酸钠(324mg，3.95mmol)。反应混合物在100℃搅拌2小时。得到的澄清溶液倾倒在碎冰上，加入150mL冷水。混合物剧烈搅拌30分钟，易挥发组分在旋蒸上除去。剩余物用乙酸乙酯萃取。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，和浓缩。残余物在乙腈里重结晶得到白色固体(280mg)。LC-MS m/z(ES+),313.1(M+H)+；1H NMR(DMSO-d6)δ8.11(dd,1H),8.02(d,1H),7.59(d,1H),7.19(s,2H),7.16(s,2H)。
实施例2
化合物2,7,8和9的制备
化合物2,7,8和9的制备参照文献报道的方法(通用步骤A)。
实施例3
化合物10的制备
将化合物1(62mg，0.20mmol)悬浮于0℃，干燥的四氢呋喃(10mL)中，随后加入N-羟基丁二酰亚胺(24mg，0.21mmol)和含有N,N’-二环己基碳二亚胺(50mg，0.24mmol)的四氢呋喃溶液(2mL)。反应混合物在0℃搅拌2小时，然后在25℃搅拌12小时。混合物在0℃过滤，然后将滤液浓缩得到白色固体(60mg)。粗产物不经纯化直接用于下一步反应。LC-MS m/z(ES+),427.2(M+NH4)+。
实施例4
化合物11的制备
向含有化合物10(50mg，0.12mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(2mL)溶液中加入Val-Cit-PABOH(三氟乙酸盐，80mg，0.16mmol；制备见Bioconjugate Chem.2002,13,855-869)和二异丙基乙基胺(28μL,0.16mmol)。反应混合物在室温下搅拌3小时。溶剂在旋蒸上除去，残余物用制备高效液相色谱纯化得到白色固体(37mg)。LC-MS m/z(ES+),674.3(M+H)+。
实施例5
化合物12的制备
向含有化合物11(37mg，55μmol)的N,N-二甲基甲酰胺(2mL)溶液中加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(33mg，110μmol)和二异丙基乙基胺(14μL，82μmol)。反应混合物在室温下搅拌5小时。溶剂在旋蒸上除去，残余的油状物用乙酸乙酯(2mL)析出沉淀，再加入乙醚(10mL)进一步析出沉淀。沉淀经过滤收集，干燥得到淡黄色固体(43mg)。LC-MS m/z(ES+),839.3(M+H)+。
实施例6
化合物13的制备
将化合物12(35mg，42μmol)，MMAE(30mg，42μmol；制备见US6,884,869)，和1-羟基苯并三唑(HOBt，1.2mg，8.0μmol)依次加入干燥的N,N-二甲基甲酰胺(2mL)和吡啶(0.4mL)溶液中。反应混合物在室温下搅拌30小时。将溶剂蒸干，残余物用制备高效液相色谱仪纯化得到白色粉末(12mg)。LC-MS m/z(ES+),1417.7(M+H)+。
实施例7
化合物14的制备
向溶有化合物1(28mg，90μmol)，MMAF-O-t-Bu(45mg，57μmol，US7,964,567)和二异丙基乙基胺(31μL，0.18mmol)的二氯甲烷(3mL)溶液中加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，34mg，90μmol)。反应混合物在室温氮气保护下搅拌3小时。将溶剂蒸发出去，残余物用硅胶柱层析色谱(洗脱液为二氯甲烷/甲醇：40/1)分离得到无色油状物(50mg)。LC-MS m/z(ES+),1083.7(M+H)+。
实施例8
化合物15的制备
将溶有化合物14(50mg，46μmol)的二氯甲烷(3mL)溶液冷却至0℃并加入三氟乙酸(1mL)。反应混合物在室温条件下搅拌8小时。将溶剂蒸干，残余物用制备高效液相色谱仪纯化得到白色固体(13mg)。LC-MS m/z(ES+),1026.5(M+H)+。
实施例9
化合物16的制备
将(S)-4,5-二氨基戊酸二盐酸盐(205mg，1mmol)溶于乙酸叔丁酯(16mL)，随后加入高氯酸(0.22mL)。反应混合物在室温条件下搅拌22小时。加入碳酸氢钠(0.84g，10mmol)淬灭反应，并将溶剂在高真空条件下蒸干(避免体系温度升高)。半油状固体加入氯仿和乙醚析出固体。固体经过滤收集，高真空干燥得到易吸潮的灰白色固体(75mg)。
实施例10
化合物17的制备
将化合物16(75mg，0.4mmol)，马来酸酐(86mg，0.88mmol)依次加入N,N-二甲基甲酰胺(5mL)，混合物室温搅拌16小时。加入乙酸酐(5mL)，三乙胺(167μL，1.2mmol)和醋酸镍四水合物(催化量)，反应混合物在90℃搅拌2小时。将反应液浓缩除去易挥发物，然后用乙酸乙酯萃取。有机相先后用饱和碳酸钠溶液，食盐水洗涤后，用硫酸钠干燥，然后浓缩。残余物用硅胶柱色谱(洗脱液：石油醚/乙酸乙酯4/1)纯化得到无色油状物(33mg)。LC-MS m/z(ES+),366.3(M+NH4)+；1H NMR(CDCl3)δ6.65(s,2H),6.64(s,2H),4.21-4.18(m,1H),4.05(dd,1H),3.67(dd,1H),2.41-2.37(m,1H),2.24-2.13(m,2H),2.11-2.05(m,1H),1.43(s,9H)。
实施例11
化合物3的制备
将化合物17(80mg，0.43mmol)溶于二氯甲烷(6mL)，然后加入三氟乙酸(3mL)。反应液在室温下搅拌3小时。混合物浓缩后，用制备高效液相色谱方法纯化得到白色固体(41mg)。LC-MS m/z(ES+),291.0(M-H)+；1H NMR(CDCl3)δ6.67(s,4H),4.23-4.18(m,1H),4.04(dd,1H),3.69(dd,1H),2.49-2.42(m,1H),2.34(t,2H),2.15-2.09(m,1H)。
实施例12
化合物18的制备
化合物18是由化合物3合成得到的，采用的合成方法与实施例3类似。LC-MS m/z(ES+),389.8(M+H)+。
实施例13
化合物19的制备
化合物19是由化合物18合成得到的，采用的合成方法与实施例4类似。LC-MS m/z(ES+),654.8(M+H)+。
实施例14
化合物20的制备
化合物20是由化合物19合成得到的，采用的合成方法与实施例5类似。LC-MS m/z(ES+),819.3(M+H)+。
实施例15
化合物21的制备
化合物21是由化合物20合成得到的，采用的合成方法与实施例6类似。LC-MS m/z(ES+),1397.7(M+H)+。
实施例16
化合物22的制备
化合物22是由化合物3合成得到的，采用的合成方法与实施例7类似。LC-MS m/z(ES+),1063.7(M+H)+。
实施例17
化合物23的制备
化合物23是由化合物22合成得到的，采用的合成方法与实施例8类似。LC-MS m/z(ES+),1006.4(M+H)+。
实施例18
化合物24的制备
化合物24的合成参照文献方法(Chem.Eur.J.2004,10,1215-1226)。
实施例19
化合物25的制备
在室温条件下，将溴乙酸叔丁酯(5.4mL,33.5mmol)加入溶有化合物24(3.9g,13.4mmol)的干燥四氢呋喃(4mL)溶液中。在1小时内，向混合物中缓慢加入氢化钠(60％wt矿物油混合物，2.42g,60.5mmol)。反应5小时后，将混合物用硅藻土过滤，滤液蒸干，残余物用硅胶柱色谱纯化(洗脱液：石油醚/乙酸乙酯10/1到5/1)得到白色固体(3.9g)。LC-MS m/z(ES+),315.1(M+H)+。
实施例20
化合物26的制备
向溶有化合物25(1.0g,2.5mmol)的1,4-二氧六环(10mL)溶液中加入浓盐酸(5mL)。混合物在室温下反应16小时，将溶剂蒸干得到白色固体(570mg)。粗产品不经纯化直接用于下步反应。LC-MS m/z(ES+),149.2(M+H)+。
实施例21
化合物4的制备
将溶有化合物26(250mg,1.1mmol)的饱和碳酸氢钠/四氢呋喃(1:1v/v,20mL)混合溶液中冷却至0℃。向上述溶液中分批加入N-甲氧基羰基琥珀酰亚胺(526mg,3.4mmol)。混合物在0℃反应10分钟，然后在室温反应3小时。反应液用浓盐酸酸化至pH 2-3，然后用乙酸乙酯萃取(50mL x 2)。合并的有机相用饱和食盐水(20mL)洗涤，干燥，并浓缩。粗产品用用制备高效液相色谱纯化得到产品(91mg)。LC-MS m/z(ES+),149.2(M+H)+。1H NMR(DMSO-d6)δ7.04(s,4H),3.97(s,2H),3.76-3.73(m,1H),3.49-3.47(m,4H)。
实施例22
化合物27的制备
化合物27是由化合物4合成得到的，采用的合成方法与实施例3类似。
实施例23
化合物28的制备
化合物28是由化合物27合成得到的，采用的合成方法与实施例4类似。LC-MS m/z(ES+),670.3(M+H)+。
实施例24
化合物29的制备
化合物29是由化合物28合成得到的，采用的合成方法与实施例5类似。LC-MS m/z(ES+),835.2(M+H)+。
实施例25
化合物30的制备
化合物30是由化合物29合成得到的，采用的合成方法与实施例6类似。LC-MS m/z(ES+),707.5 1/2(M+H)+。
实施例26
化合物31的制备
化合物31是由化合物4合成得到的，采用的合成方法与实施例7类似。LC-MS m/z(ES+),1078.3(M+H)+。
实施例27
化合物32的制备
化合物32是由化合物31合成得到的，采用的合成方法与实施例8类似。LC-MS m/z(ES+),1022.3(M+H)+。
实施例28
化合物33的制备
化合物33的制备参考文献Bioorg.Med.Chem.Lett.2003,13,3267–3271。
实施例29
化合物34的制备
将化和物33(1.0g,6.4mmol)和三苯基膦(4.0g,15.4mmol)溶解于四氢呋喃(20mL)和水(0.4mL)中。混合物在室温搅拌过夜。反应液过滤除去固体，滤液用乙醚萃取。水相冻干得到580mg无色胶状物。
实施例30
化合物35的制备
化合物35是由化合物34合成得到的，采用的合成方法与实施例18类似。LC-MS m/z(ES+),327.2(M+Na)+。
实施例31
化合物36的制备
化合物36是由化合物35合成得到的，采用的合成方法与实施例19类似。
实施例32
化合物37的制备
化合物37是由化合物36合成得到的，采用的合成方法与实施例20类似。
实施例33
化合物5的制备
化合物5是由化合物37合成得到的，采用的合成方法与实施例21类似。LC-MS m/z(ES+),323.1(M+H)+。1H NMR(CDCl3)δ6.75(s,2H),6.71(s,2H),4.23(s,2H),3.72-3.68(m,4H),3.64-3.60(m,1H),1.81-1.76(m,2H)。
实施例34
化合物38的制备
化合物38的制备参考文献Org.Lett.2000,2,14。
实施例35
化合物39的制备
向溶有化合物38(2.0g，6.6mmol)的二氯甲烷(30mL)溶液中加入丁二酸酐(0.66g,6.6mmol)。反应液在室温下搅拌16小时。将反应液浓缩除去溶剂，残余物用硅胶柱色谱纯化(洗脱液：二氯甲烷/甲醇20/1)得到白色固体(1.9g)。LC-MS m/z(ES+),426.2(M+Na)+。
实施例36
化合物40的制备
化合物40是由化合物39合成得到的，采用的合成方法与实施例20类似。
实施例37
化合物6的制备
化合物6是由化合物40合成得到的，采用的合成方法与实施例21类似。1H NMR(DMSO-d6)δ7.04(s,2H),6.96(s,2H),3.59(t,2H),3.53(t,2H),3.42-3.39(m,4H),2.33(s,4H)。
实施例38
抗体与连接子1,7,8和9的偶联是按照通用步骤B的方法制备的。连接子的尺寸变化及柔性变化对抗体-连接子的偶联的影响，结果如图2所示。
实施例39
抗体药物偶联物H-1-vcMMAE的制备
抗体药物偶联物H-1-vcMMAE是按照通用步骤B的方法制备的。经疏水作用色谱测定，其平均药物/抗体比值(DAR)值为4.5，各组分含量为：DAR 4.0(59％)，DAR 5.0(36％)，DAR 6.0(5％)。
实施例40
抗体药物偶联物H-1-MMAF的制备
抗体药物偶联物H-1-MMAF是按照通用步骤B的方法制备的。由于疏水作用色谱测定显示两个主要组分无法完全分开，因此所得抗体药物偶联物的平均DAR值无法准确计算。
实施例41
抗体药物偶联物H-3-vcMMAE的制备
抗体药物偶联物H-3-vcMMAE是按照通用步骤B的方法制备的。经疏水作用色谱测定，其平均药物/抗体比值(DAR)值为4.2，各组分含量为：DAR 4.0(81％)，DAR 5.0(19％)。
实施例42
抗体药物偶联物H-3-MMAF的制备
抗体药物偶联物H-3-MMAF是按照通用步骤B的方法制备的。由于疏水作用色谱测定显示两个主要组分无法完全分开，因此所得抗体药物偶联物的平均DAR值无法准确计算。
实施例43
抗体药物偶联物H-4-vcMMAE的制备
抗体药物偶联物H-4-vcMMAE是按照通用步骤B的方法制备的。经疏水作用色谱测定，其平均药物/抗体比值(DAR)值为4.2，各组分含量为：DAR 4.0(80％)，DAR 5.0(20％)。
实施例44
抗体药物偶联物H-4-MMAF的制备
抗体药物偶联物H-4-MMAF是按照通用步骤B的方法制备的。由于疏水作用色谱测定显示两个主要组分无法完全分开，因此所得抗体药物偶联物的平均DAR值无法准确计算。
实施例45
酶联免疫吸收测定(ELISA)
Herceptin及其抗体药物偶联物对特异抗原Her2的结合能力通过酶联免疫吸附测定法测定，具体步骤参见通用步骤E，测试结果如表1所示。与Herceptin相比,抗体药物偶联物仍具有特异性抗原结合性。
表1
n/a：不能准确测出。下同。
实施例46
细胞增殖实验(Cell Proliferation Assay)
Herceptin及其抗体药物偶联物对人乳腺癌细胞株(SK-BR-3)增殖抑制作用是按照通用步骤F进行的，测试结果如表2所示。
表2
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (22)

1.一种结构如式Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ或Ⅷ所示的抗体药物偶联物，
其中，L是抗体或抗体片段，L′与L是同一抗体或抗体片段；Z是O，S，NR2，C(＝O)O，C(＝O)NR3，C(＝S)O，C(＝S)NR4，C(＝S)S，NR5C(＝O)NR6，NR7C(＝S)NR8，OC(＝O)NR9；m是0或1；R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8,和R9独立地选自H,链烷基，环烷基，杂环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基；R1是链烷基，环烷基，杂环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，聚乙二醇,或其中任意组合；n是范围在0-8的整数；X是-NR10-，-O-，-S-，-C(＝O)-，-C(＝S)-，-NR11C(＝O)-，-NR12C(＝S)-，-OC(＝O)-，-OC(＝S)-；R10，R11，和R12独立地选自H,链烷基，环烷基，杂环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基；J是取代基团,包括卤素，硝基，氰基，羟基，烷氧基，氨基，酰胺基，酯基，磺酰胺基，脲，链烷基，环烷基，杂环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基；o是0，1，2或3；R13,R14,R15和R16独立地选自链烷基，环烷基，杂环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，或其中任意组合；Q是N或CR17；R17独立地选自H，链烷基，环烷基，杂环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基；p,q是范围在0-8的整数；x,y是范围在0-8的整数，并且x+y≥1；
其中C是可断裂连接子；E,F是自杀式连接子；e,f是在0-5范围内的整数；G是不可断裂连接子；g是0-5范围内的整数。
2.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，Z是O；m是0或1；。
3.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，R1是链烷基，聚乙二醇,或其组合；n是范围在0-8的整数。
4.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，X是-C(＝O)-。
5.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，o是0。
6.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，R13,R14,R15和R16独立地选自链烷基。
7.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，Q是N或CR17；R17选自H，链烷基。
8.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述抗体为针对细胞表面受体和肿瘤相关抗原的抗体。
9.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述药物为细胞毒性药物，治疗自身免疫疾病的药物和抗炎症的药物。
10.一种结构如式1所示的三齿型连接子：
11.一种结构如式3所示的三齿型连接子：
12.一种结构如式4所示的三齿型连接子：
13.一种结构如式5所示的三齿型连接子：
14.一种结构如式6所示的三齿型连接子：
15.一种结构如式IX所示的三齿型连接子在制备抗体药物偶联物中的应用：
所述抗体药物偶联物结构如式Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ或Ⅷ所示；
其中，L是抗体或抗体片段，L′与L是同一抗体或抗体片段；Z是O，S，NR2，C(＝O)O，C(＝O)NR3，C(＝S)O，C(＝S)NR4，C(＝S)S，NR5(C＝O)NR6，NR7(C＝S)NR8，O(C＝O)NR9；m是0或1；R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8,和R9独立地选自H,链烷基，环烷基，杂环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基；R1是链烷基，环烷基，杂环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，聚乙二醇,或其中任意组合；n是范围在0-8的整数；X是-NR10-，-O-，-S-，-C(＝O)-，-C(＝S)-，-NR11C(＝O)-，-NR12C(＝S)-，-OC(＝O)-，-OC(＝S)-；R10，R11，和R12独立地选自H,链烷基，环烷基，杂环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基；J是取代基团,包括，但不限于氢,卤素，硝基，氰基，羟基，烷氧基，氨基，酰胺基，酯基，磺酰胺基，脲，链烷基，环烷基，杂环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基；o是0，1，2或3；R13,R14,R15和R16独立地选自链烷基，环烷基，杂环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，或其中任意组合；Q是N或CR17；R17独立地选自H，链烷基，环烷基，杂环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基；p,q是范围在0-8的整数；x,y是范围在0-8的整数，并且x+y≥1；
其中C是可断裂连接子；E,F是自杀式连接子；e,f是在0-5范围内的整数；G是不可断裂连接子；g是0-5范围内的整数。
16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，Z是O；m是0或1。
17.如权利要求15所述的应用，其特征在于，R1是链烷基，聚乙二醇,或其组合；n是范围在0-8的整数。
18.如权利要求15所述的应用，其特征在于，X是-C(＝O)-。
19.如权利要求15所述的应用，其特征在于，o是0。
20.如权利要求15所述的应用，其特征在于，R13,R14,R15和R16独立地选自链烷基。
21.如权利要求15所述的应用，其特征在于，Q是N或CR17；R17选自H，链烷基。
22.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述的三齿型连接子的结构如式1、式2、式3、式4、式5或式6所示：
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