JP5586285B2

JP5586285B2 - 受容体相互作用検出方法およびサイクリックａｍｐセンサータンパク質

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Publication number: JP5586285B2
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Inventors: 崇杉山
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Description

本発明は、細胞内の互いに異なる受容体同士の相互作用（例えばＤ１受容体と５ＨＴ２Ａ受容体の相互作用）を、一方の受容体（例えばＤ１受容体）の活性（例えばサイクリックＡＭＰの濃度）を一細胞ごとに非侵襲的に解析して検出する受容体相互作用検出方法、および互いに異なる受容体同士の相互作用を検出するためのサイクリックＡＭＰセンサータンパク質に関するものである。

多くのホルモンや神経伝達物質は、Ｇタンパク質共役型受容体に働き、細胞内セカンドメッセンジャーを介して様々な細胞活動を引き起こしている。Ｇタンパク質共役型受容体に働く神経伝達物質は、ヒトの情動や気分、依存、認知、学習、記憶などの広範囲に亘る脳機能の調節に関わっており、なかでも、モノアミンおよびその受容体は、躁うつ病や統合失調症、気分障害、自閉症、注意欠陥／多動性障害などの精神疾患に対する治療の標的とされている。このような脳の高次機能は、脳内の伝達物質およびその受容体の時間的および空間的な濃度分布によって制御されている。したがって、特定の情動活動に関する情報伝達機構を解析するにあたって、脳内のＧタンパク質共役型受容体の時間的および空間的な変化および相互作用をリアルタイムに捉えることが必要である。

これまでに、脳内の受容体の時間的および空間的な変化および相互作用に関する研究において、情動活動に対する効果を示す薬物の存在が明らかにされ、その作用点がモノアミンのＧタンパク質共役型受容体であることが解明されてきた経緯がある。モノアミンのＧタンパク質共役型受容体が関与する従来のシグナル伝達の研究では、主にモデル動物を用いた行動薬理学的な手法で解析されてきた。

例えば、Ｂｏｄｙらは、５ＨＴ２Ａ受容体やＤ１受容体、Ｄ２受容体のサブタイプに対する選択的阻害剤を用いて、ラットの代表的なオペラント条件付けであるタイミング行動を制御する方法を開示している（非特許文献１参照）。タイミング行動に対するｄ−アンフェタミンの効果が、５ＨＴ２Ａ受容体およびＤ１受容体に対する選択的阻害剤で阻害されることから、タイミング行動に対するｄ−アンフェタミンの作用には５ＨＴ２Ａ受容体およびＤ１受容体が関わっていることを明らかにしている。

また、例えば、Ａｕｃｌａｉｒらは、５ＨＴ２Ａ受容体に対する選択的阻害剤を用いて、ラットにおけるｄ−アンフェタミン誘導性の自発運動活性を制御する方法を開示している（非特許文献２参照）。ｄ−アンフェタミンは、脳内においてドーパミン遊離を起こさせ、ドーパミン誘導性の自発運動活性の上昇を引き起こす。５ＨＴ２Ａ受容体に対する選択的阻害剤が、ドーパミン遊離を抑制せずにドーパミン誘導性の自発運動活性の上昇を抑制することを示しており、ドーパミン受容体と５ＨＴ２Ａ受容体との相互作用を明らかにしている。

ＢｏｄｙＳ．，ＣｈｅｕｎｇＴ．Ｈ．Ｃ．，ＢｅｚｚｉｎａＧ．，ＡｓｇａｒｉＫ．，ＦｏｎｅＫ．Ｃ．Ｆ．，ＧｌｅｎｎｏｎＪ．Ｃ．，ＢｒａｄｓｈａｗＣ．Ｍ．，ＳｚａｂａｂｉＥ．， "Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄ−ａｍｐｈａｔａｍｉｎｅａｎｄＤＯＩ（２，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｉｏｄｏａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ）ｏｎｔｉｍｉｎｇｂｅｈａｖｉｏｒ：ｉｎｔａｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＤ１ａｎｄ５−ＨＴ２Ａｒｅｃｅｐｔｏｒｓ"，Ｐｓｙｃｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８９，ｐｐ３３１−３４３，２００６ＡｕｃｌａｉｒＡ．，ＢｌａｎｃＧ．，ＧｌｏｗｉｎｓｋｉＪ．，ＴａｓｓｉｎＪ．−Ｐ．， "Ｒｏｌｅｏｆｓｅｒｏｔｏｎｉｎ２Ａｒｅｃｅｐｔｏｒｓｉｎｄ−ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄｒｅｌｅａｓｅｏｆｄｏｐａｍｉｎｅ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｗｉｔｈｐｒｅｖｉｏｕｓｄａｔａｏｎａｌｐｈａ１ｂ−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃｒｅｃｅｐｔｏｒｓ"，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．９１，ｐｐ３１８−３２６，２００４

しかしながら、モデル動物を用いた行動薬理学的な手法を用いて異なるＧタンパク質共役型受容体の時間的および空間的な相互作用を解析する従来の方法では、受容体の空間的な配置が不明のまま相互作用の解析を行っているため、受容体同士の相互作用を正確には示していない、という問題点があった。

本発明は、上記問題点に鑑みてなされたもので、受容体の空間的な配置を明らかにして受容体の相互作用に関する各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞において特定の受容体の相互作用を再現性良く観察することができる受容体相互作用検出方法および受容体の相互作用を検出するためのサイクリックＡＭＰセンサータンパク質を提供することを目的とする。

上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる受容体相互作用検出方法は、細胞において第１の受容体と第２の受容体との相互作用を検出する受容体相互作用検出方法であって、前記第２の受容体の活性を示す指標となるレポータを含む前記細胞を作製する作製工程と、前記作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から、発光させるための所定の処置を行うと共に前記第１の受容体に結合する所定の受容体結合物質を添加する処置および添加工程と、前記処置および添加工程が行われた後の前記細胞の発光量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定した前記発光量に基づいて前記細胞内における前記第２の受容体の活性を解析する解析工程と、前記解析工程で解析した前記第２の受容体の活性に基づいて、前記第１の受容体と前記第２の受容体との前記相互作用を検出する検出工程と、を含むことを特徴とする。ここで、レポータとは、遺伝子の発現に応じて光を発生し得る蛍光タンパク質や発光タンパク質を包含するものであり、具体的にはサイクリックＡＭＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）センサータンパク質などである。また、発光タンパク質とは、具体的には生物発光タンパク質などである。また、発光させるための所定の処置とは、例えば発光基質を添加する（または予め細胞等の試料中に供給しておく）ことや励起光を照射することなどである。生物発光共鳴エネルギー転移（いわゆるBRET）による蛍光（例えばGFP、YFP等）を測定する場合には、生物発光用の基質を添加等することによって励起光の照射は不要である。

また、本発明にかかる受容体相互作用検出方法は、前記に記載の受容体相互作用検出方法において、前記作製工程において、前記レポータは、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質であり、前記解析工程において、前記第２の受容体の活性はサイクリックＡＭＰの濃度で解析すること、を特徴とする。

また、本発明にかかる受容体相互作用検出方法は、前記に記載の受容体相互作用検出方法において、前記サイクリックＡＭＰセンサータンパク質は、前記細胞内のサイクリックＡＭＰと相互作用して発光するものであること、を特徴とする。

また、本発明にかかる受容体相互作用検出方法は、前記に記載の受容体相互作用検出方法において、前記サイクリックＡＭＰセンサータンパク質は、ホタルのルシフェラーゼおよびＰＫＡ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＡ）のサイクリックＡＭＰ結合領域とからなる融合タンパク質であること、を特徴とする。

また、本発明にかかる受容体相互作用検出方法は、前記に記載の受容体相互作用検出方法において、前記サイクリックＡＭＰ結合領域が、マウスのＰＫＡ−ＲＩα由来であることを特徴とする。

また、本発明にかかる受容体相互作用検出方法は、前記に記載の受容体相互作用検出方法において、前記サイクリックＡＭＰ結合領域が、２２０から２５０のアミノ酸残基の長さを有することを特徴とする。

また、本発明にかかる受容体相互作用検出方法は、前記に記載の受容体相互作用検出方法において、前記サイクリックＡＭＰ結合領域が、少なくとも２つのサイクリックＡＭＰ結合部位を含むことを特徴とする。

また、本発明にかかる受容体相互作用検出方法は、前記に記載の受容体相互作用検出方法において、前記サイクリックＡＭＰセンサータンパク質は、前記ルシフェラーゼのＮ末端側断片、前記ルシフェラーゼのＣ末端側断片および前記サイクリックＡＭＰ結合領域を含み、前記Ｎ末端側断片と前記Ｃ末端側断片とが前記サイクリックＡＭＰセンサータンパク質分子内で結合すると、前記ルシフェラーゼの発光酵素活性が回復することを特徴とする。

また、本発明にかかる受容体相互作用検出方法は、前記に記載の受容体相互作用検出方法において、前記サイクリックＡＭＰ結合領域が、配列番号３７または３９に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。

また、本発明にかかる受容体相互作用検出方法は、前記に記載の受容体相互作用検出方法において、前記作製工程において、前記細胞は前記第１の受容体と前記第２の受容体とを含有するものであること、を特徴とする。

また、本発明にかかる受容体相互作用検出方法は、前記に記載の受容体相互作用検出方法において、前記作製工程において、前記細胞は前記第１の受容体の遺伝子と前記第２の受容体の遺伝子とが導入されたものであること、を特徴とする。

また、本発明にかかる受容体相互作用検出方法は、前記に記載の受容体相互作用検出方法において、前記測定工程は、前記第２の受容体の活性に依存する発光標識の光子量を測定する光子量測定工程をさらに含むこと、を特徴とする。

また、本発明にかかる受容体相互作用検出方法は、前記に記載の受容体相互作用検出方法において、前記測定工程は、前記第２の受容体の活性に依存する発光標識を撮像する撮像工程をさらに含むこと、を特徴とする。

また、本発明にかかる受容体相互作用検出方法は、前記に記載の受容体相互作用検出方法において、前記撮像工程は、複数の異なる前記細胞に対して同時に実行され、前記解析工程は、前記撮像工程で撮像した複数の発光画像を前記細胞ごとに照合する照合工程をさらに含むこと、を特徴とする。

また、本発明にかかる受容体相互作用検出方法は、前記に記載の受容体相互作用検出方法において、前記測定工程は繰り返し実行されること、を特徴とする。

また、本発明にかかる受容体相互作用検出方法は、前記に記載の受容体相互作用検出方法において、前記第１の受容体は５ＨＴ２Ａ受容体であり、前記第２の受容体はＤ１受容体であること、を特徴とする。

また、本発明にかかる受容体相互作用検出方法は、前記に記載の受容体相互作用検出方法において、前記処置および添加工程において、前記受容体結合物質はセロトニンであること、を特徴とする。

また、本発明はサイクリックＡＭＰセンサータンパク質に関するものであり、本発明にかかるサイクリックＡＭＰセンサータンパク質は、第１の受容体と第２の受容体との相互作用を検出するためのものであること、を特徴とする。

また、本発明にかかるサイクリックＡＭＰセンサータンパク質は、前記に記載のサイクリックＡＭＰセンサータンパク質において、サイクリックＡＭＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と相互作用して発光するものであること、を特徴とする。

また、本発明にかかるサイクリックＡＭＰセンサータンパク質は、前記に記載のサイクリックＡＭＰセンサータンパク質において、前記第１の受容体は５ＨＴ２Ａ受容体であり、前記第２の受容体はＤ１受容体であること、を特徴とする。

この発明によれば、第２の受容体の活性を示す指標となるレポータを含む細胞を作製し、作製した細胞に当該細胞外から、発光させるための所定の処置を行うと共に第１の受容体に結合する所定の受容体結合物質を添加し、当該処置および添加が行われた後の細胞の発光量を測定し、測定した発光量に基づいて細胞内における第２の受容体の活性を解析し、解析した第２の受容体の活性に基づいて、第１の受容体と第２の受容体との相互作用を検出するので、受容体の空間的な配置を明らかにして受容体の相互作用に関する各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞において特定の受容体の相互作用を再現性良く観察することができるという効果を奏する。

この発明によれば、レポータはサイクリックＡＭＰセンサータンパク質であり、第２の受容体の活性はサイクリックＡＭＰの濃度で解析するので、生物発光によるサイクリックＡＭＰ検出原理を利用して受容体の空間的な配置を明らかにして受容体の相互作用に関する各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞において特定の受容体の相互作用を再現性良く観察することができるという効果を奏する。

この発明によれば、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質は、細胞内のサイクリックＡＭＰと相互作用して発光するものであるので、サイクリックＡＭＰの存在下で相互作用が強化された発光によりサイクリックＡＭＰの濃度を検出することができるという効果を奏する。

この発明によれば、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質は、ホタルのルシフェラーゼおよびＰＫＡ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＡ）のサイクリックＡＭＰ結合領域とからなる融合タンパク質であるので、発光量を測ればサイクリックＡＭＰ濃度を算出することができるという効果を奏する。

この発明によれば、サイクリックＡＭＰ結合領域が、マウスのＰＫＡ−ＲＩα由来であるので、哺乳類由来の細胞において使用することができるという効果を奏する。

この発明によれば、サイクリックＡＭＰ結合領域が、２２０から２５０のアミノ酸残基の長さを有するので、ルシフェラーゼの活性をなるべく維持したまま融合タンパク質を作製できるという効果を奏する。

この発明によれば、サイクリックＡＭＰ結合領域が、少なくとも２つのサイクリックＡＭＰ結合部位を含むので、サイクリックＡＭＰ濃度の変化によって、ルシフェラーゼ活性を変化させることができるという効果を奏する。

この発明によれば、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質は、ルシフェラーゼのＮ末端側断片、ルシフェラーゼのＣ末端側断片およびサイクリックＡＭＰ結合領域を含み、Ｎ末端側断片とＣ末端側断片とが前記サイクリックＡＭＰセンサータンパク質分子内で結合すると、ルシフェラーゼの発光酵素活性が回復するので、サイクリックＡＭＰ結合領域の構造変化により発光強度を変化させることができるという効果を奏する。

この発明によれば、サイクリックＡＭＰ結合領域が、配列番号３７または３９に記載のアミノ酸配列を含むので、条件に応じてサイクリックＡＭＰセンサータンパク質として最適なものを選択できるという効果を奏する。

この発明によれば、細胞は第１の受容体と第２の受容体とを含有するものであるので、解析対象となる受容体を人工的に含めた扱い易い細胞を用いて実験をやり易くすることができるという効果を奏する。

この発明によれば、細胞は第１の受容体の遺伝子と第２の受容体の遺伝子とが導入されたものであるので、解析対象となる受容体を人工的に含めた扱い易い細胞を用いて実験をやり易くすることができる他、自然に近い応答を得ることができるという効果を奏する。

この発明によれば、第２の受容体の活性に依存する発光標識の光子量を測定するので、フォトンカウンティングの技術を利用して細胞全体または細胞集団全体からの発光量を得ることができるという効果を奏する。

この発明によれば、第２の受容体の活性に依存する発光標識を撮像するので、発光顕微鏡を利用して個々の細胞からの発光量を得ることができるという効果を奏する。

この発明によれば、撮像を複数の異なる細胞に対して同時に実行し、撮像した複数の発光画像を細胞ごとに照合するので、細胞一つ一つからの発光量を個別に且つ同時に得ることができるという効果を奏する。

この発明によれば、発光量の測定を繰り返し実行するので、発光量の経時変化を観察することができるという効果を奏する。

この発明によれば、第１の受容体は５ＨＴ２Ａ受容体であり、第２の受容体はＤ１受容体であるので、Ｄ１受容体および５ＨＴ２Ａ受容体の空間的な配置を明らかにしてＤ１受容体と５ＨＴ２Ａ受容体の相互作用に関する各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞においてＤ１受容体と５ＨＴ２Ａ受容体の相互作用を再現性良く観察することができるという効果を奏する。

この発明によれば、受容体結合物質はセロトニンであるので、５ＨＴ２Ａ受容体の活性を観察することができるという効果を奏する。

この発明によれば、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質は、第１の受容体と第２の受容体との相互作用を検出するためのものであるので、当該サイクリックＡＭＰセンサータンパク質を用いれば、受容体の空間的な配置を明らかにして受容体の相互作用に関する各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞において特定の受容体の相互作用を再現性良く観察することができるという効果を奏する。

この発明によれば、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質はサイクリックＡＭＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と相互作用して発光するものであるので、当該サイクリックＡＭＰセンサータンパク質を用いれば、サイクリックＡＭＰの存在下で相互作用が強化された発光によりサイクリックＡＭＰ濃度を検出することができるという効果を奏する。

この発明によれば、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質はＤ１受容体と５ＨＴ２Ａ受容体との相互作用を検出するためのものであるので、当該サイクリックＡＭＰセンサータンパク質を用いれば、Ｄ１受容体および５ＨＴ２Ａ受容体の空間的な配置を明らかにしてＤ１受容体と５ＨＴ２Ａ受容体の相互作用に関する各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞においてＤ１受容体と５ＨＴ２Ａ受容体の相互作用を再現性良く観察することができるという効果を奏する。

図１は、発光観察システム１００の全体構成の一例を示す図である。図２は、発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示す図である。図３は、発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示す図である。図４は、発光観察システム１００の画像解析装置１１０の構成の一例を示すブロック図である。図５は、スプリットルシフェラーゼを用いたサイクリックＡＭＰの検出原理を示す図である。図６は、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質、５ＨＴ２Ａ受容体およびＤ１受容体が導入されたＨＥＫ２９３細胞を含むセロトニン刺激前の発光画像を示す図である。図７は、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質、５ＨＴ２Ａ受容体およびＤ１受容体が導入されたＨＥＫ２９３細胞を含むセロトニン刺激５分後の発光画像を示す図である。図８は、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質、５ＨＴ２Ａ受容体およびＤ１受容体が導入されたＨＥＫ２９３細胞を含むドーパミン刺激５分後の発光画像を示す図である。図９は、５ＨＴ２Ａ受容体およびＤ１受容体が導入された、選択されたＨＥＫ２９３細胞におけるセロトニン刺激およびドーパミン刺激によるサイクリックＡＭＰセンサータンパク質の発光強度の経時変化を示した図である。図１０は、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質、５ＨＴ２Ａ受容体およびＤ２受容体が導入されたＨＥＫ２９３細胞を含むセロトニン刺激前の発光画像を示す図である。図１１は、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質、５ＨＴ２Ａ受容体およびＤ２受容体が導入されたＨＥＫ２９３細胞を含むセロトニン刺激５分後の発光画像を示す図である。図１２は、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質、５ＨＴ２Ａ受容体およびＤ２受容体が導入されたＨＥＫ２９３細胞を含むドーパミン刺激５分後の発光画像を示す図である。図１３は、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質、５ＨＴ２Ａ受容体およびＤ２受容体が導入されたＨＥＫ２９３細胞を含むフォルスコリン刺激５分後の発光画像を示す図である。図１４は、５ＨＴ２Ａ受容体およびＤ２受容体が導入された、選択されたＨＥＫ２９３細胞におけるセロトニン刺激、ドーパミン刺激およびフォルスコリン刺激によるサイクリックＡＭＰセンサータンパク質の発光強度の経時変化を示した図である。図１５は、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質および５ＨＴ２Ａ受容体が導入されたＨＥＫ２９３細胞を含むセロトニン刺激前の発光画像を示す図である。図１６は、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質および５ＨＴ２Ａ受容体が導入されたＨＥＫ２９３細胞を含むセロトニン刺激５分後の発光画像を示す図である。図１７は、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質および５ＨＴ２Ａ受容体が導入されたＨＥＫ２９３細胞を含むフォルスコリン刺激５分後の発光画像を示す図である。図１８は、５ＨＴ２Ａ受容体が導入された、選択されたＨＥＫ２９３細胞におけるセロトニン刺激およびドーパミン刺激によるサイクリックＡＭＰセンサータンパク質の発光強度の経時変化を示した図である。図１９は、変異型のスプリットルシフェラーゼを用いたサイクリックＡＭＰの検出原理を示す図である。図２０は、ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＲＩα＿αＡＢ＿Ｎおよび、５ＨＴ２Ａ受容体、Ｄ１受容体を導入したＨＥＫ２９３細胞において、セロトニン刺激前の発光画像を示す図である。図２１は、ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＲＩα＿αＡＢ＿Ｎおよび、５ＨＴ２Ａ受容体、Ｄ１受容体を導入したＨＥＫ２９３細胞において、セロトニン刺激５分後の発光画像を示す図である。図２２は、ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＲＩα＿αＡＢ＿Ｎおよび、５ＨＴ２Ａ受容体、Ｄ１受容体を導入したＨＥＫ２９３細胞において、ドーパミン刺激５分後の発光画像を示す図である。図２３は、５ＨＴ２Ａ受容体、Ｄ１受容体を導入したＨＥＫ２９３細胞において、選択した細胞でのセロトニンおよびドーパミン刺激によるｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＲＩα＿αＡＢ＿Ｎの発光強度の経時変化を示した図である。図２４は、ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＲＩα＿αＡＢ＿Ｎおよび、５ＨＴ２Ａ受容体を導入したＨＥＫ２９３細胞において、セロトニン刺激前の発光画像を示す図である。図２５は、ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＲＩα＿αＡＢ＿Ｎおよび、５ＨＴ２Ａ受容体を導入したＨＥＫ２９３細胞において、セロトニン刺激５分後の発光画像を示す図である。図２６は、ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＲＩα＿αＡＢ＿Ｎおよび、５ＨＴ２Ａ受容体を導入したＨＥＫ２９３細胞において、ドーパミン刺激５分後の発光画像を示す図である。図２７は、５ＨＴ２Ａ受容体を導入したＨＥＫ２９３細胞において、選択した細胞でのセロトニンおよびドーパミン刺激によるｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＲＩα＿αＡＢ＿Ｎの発光強度の経時変化を示した図である。図２８は、作製した種々のサイクリックＡＭＰセンサータンパク質の詳細を示す表である。図２９は、種々のサイクリックＡＭＰセンサータンパク質の活性を比較した図である。

以下に、本発明にかかる受容体相互作用検出方法および受容体の相互作用を検出するためのサイクリックＡＭＰセンサータンパク質の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、本実施の形態により本発明が限定されるものではない。ここで、本実施の形態では、発光タンパク質（具体的には生物発光タンパク質）を用いてＤ１受容体と５ＨＴ２Ａ受容体との相互作用を発光画像で検出する場合を一例として説明するが、蛍光タンパク質や他の受容体同士やフォトンカウンティングに対しても同様に実施することができる。

［構成］
まず、本発明にかかる受容体相互作用検出方法で用いる発光観察システム１００の構成について、図１、図２および図３を参照して説明する。図１は、発光観察システム１００の全体構成の一例を示す図である。

図１に示すように、発光観察システム１００は、細胞１０２を収納した容器１０３（具体的にはシャーレ、スライドガラス、マイクロプレート、ゲル支持体、微粒子担体など）と、容器１０３を配置するステージ１０４と、微弱な発光を測定するための発光画像撮像ユニット１０６と、画像解析装置１１０と、で構成されている。発光画像撮像ユニット１０６をステージ１０４の下側に配置してもよい。これにより、カバー（図示せず）の開閉によるサンプル上方からの外乱光を完全に遮断でき、その結果、発光画像のＳ／Ｎ比を増すことができる。発光画像撮像ユニット１０６は、レーザー走査式の光学系であってもよい。

細胞１０２は、例えば、サイクリックＡＭＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）濃度に依存して発光するよう発光標識された生きた細胞である。ここで、サイクリックＡＭＰ濃度に依存して発光するタンパク質（発光タンパク質）として、Ｎ末側発光酵素とＣ末側発光酵素、およびサイクリックＡＭＰ結合タンパク質との融合タンパク質の他に、例えば国際公開第２００７／１２０５２２号または特表２００７−５０８０１４号公報に開示されている融合タンパク質を用いてもよい。また、ここで、細胞１０２に、当該融合タンパク質が発現されるよう構成した、当該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを細胞１０２に導入することにより、当該融合タンパク質が細胞１０２内で発現されるよう構成してもよい。なお、細胞１０２には、当該細胞１０２外から所定の発光基質（例えばルシフェリンなど）および所定の刺激（例えば薬物刺激など）が与えられる。

発光画像撮像ユニット１０６は、具体的には正立型の発光顕微鏡であり、細胞１０２の発光画像を撮像する。発光画像撮像ユニット１０６は、図示の如く、対物レンズ１０６ａと、ダイクロイックミラー１０６ｂと、ＣＣＤ（ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅｄｄｅｖｉｃｅ）カメラ１０６ｃと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されている。対物レンズ１０６ａは、具体的には（開口数／倍率）^２の値が０．０１以上のものが好ましい。ダイクロイックミラー１０６ｂは、細胞１０２から発せられた発光を色別に分離し、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。ＣＣＤカメラ１０６ｃは、対物レンズ１０６ａ、ダイクロイックミラー１０６ｂおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された細胞１０２の発光画像および明視野画像を撮る。また、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、画像解析装置１１０と有線または無線で通信可能に接続される。ここで、細胞１０２が撮像範囲中に複数存在する場合、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、当該撮像範囲中に含まれる複数の細胞１０２の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。結像レンズ１０６ｆは、対物レンズ１０６ａおよびダイクロイックミラー１０６ｂを介して当該結像レンズ１０６ｆに入射した像（具体的には細胞１０２を含む像）を結像する。なお、図１では、ダイクロイックミラー１０６ｂで分離した２つの発光に対応する発光画像を２台のＣＣＤカメラ１０６ｃで別々に撮像する場合の一例を示しており、１つの発光を用いる場合には、発光画像撮像ユニット１０６は、対物レンズ１０６ａ、１台のＣＣＤカメラ１０６ｃおよび結像レンズ１０６ｆで構成されてもよい。

ここで、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合、発光画像撮像ユニット１０６は、図２に示すように、対物レンズ１０６ａと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、スプリットイメージユニット１０６ｄと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されてもよい。そして、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、スプリットイメージユニット１０６ｄおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された細胞１０２の発光画像（スプリットイメージ）および明視野像を撮像してもよい。スプリットイメージユニット１０６ｄは、細胞１０２から発せられた発光を色別に分離し、ダイクロイックミラー１０６ｂと同様、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。

また、複数色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合（つまり、多色の発光を用いる場合）、発光画像撮像ユニット１０６は、図３に示すように、対物レンズ１０６ａと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、フィルターホイール１０６ｅと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されてもよい。そして、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、フィルターホイール１０６ｅおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された細胞１０２の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。フィルターホイール１０６ｅは、細胞１０２から発せられた発光をフィルタ交換によって色別に分離し、複数色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。

図１に戻り、画像解析装置１１０は、具体的にはパーソナルコンピュータである。そして、画像解析装置１１０は、図４に示すように、大別して、制御部１１２と、システムの時刻を計時するクロック発生部１１４と、記憶部１１６と、通信インターフェース部１１８と、入出力インターフェース部１２０と、入力装置１２２と、出力装置１２４と、で構成されており、これら各部はバスを介して接続されている。

記憶部１１６は、ストレージ手段であり、具体的には、ＲＡＭ（ｒａｎｄｏｍａｃｃｅｓｓｍｅｍｏｒｙ）やＲＯＭ（ｒｅａｄ−ｏｎｌｙｍｅｍｏｒｙ）等のメモリ装置、ハードディスクのような固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等を用いることができる。そして、記憶部１１６は制御部１１２の各部の処理により得られたデータなどを記憶する。通信インターフェース部１１８は、画像解析装置１１０と、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、の間における通信を媒介する。すなわち、通信インターフェース部１１８は他の端末と有線または無線の通信回線を介してデータを通信する機能を有する。入出力インターフェース部１２０は、入力装置１２２や出力装置１２４に接続する。ここで、出力装置１２４には、モニタ（家庭用テレビを含む）の他、スピーカやプリンタを用いることができる（なお、以下で、出力装置１２４をモニターとして記載する場合がある。）。また、入力装置１２２には、キーボードやマウスやマイクの他、マウスと協働してポインティングデバイス機能を実現するモニターを用いることができる。

制御部１１２は、ＯＳ（ＯｐｅｒａｔｉｎｇＳｙｓｔｅｍ）等の制御プログラムや各種の処理手順等を規定したプログラムや所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラムに基づいて種々の処理を実行する。そして、制御部１１２は、大別して、発光画像撮像指示部１１２ａと、発光画像取得部１１２ｂと、画像解析部１１２ｃと、解析結果出力部１１２ｄと、で構成されている。

発光画像撮像指示部１１２ａは、通信インターフェース部１１８を介して、ＣＣＤカメラ１０６ｃへ発光画像および明視野画像の撮像を指示する。発光画像取得部１１２ｂは、ＣＣＤカメラ１０６ｃで撮像した発光画像および明視野画像を、通信インターフェース部１１８を介して取得する。制御部１１２は、発光画像撮像指示部１１２ａを制御して、ＣＣＤカメラ１０６ｃに細胞１０２の発光画像および明視野画像を繰り返し撮像させ、発光画像取得部１１２ｂを制御して、撮像した発光画像および明視野画像を、撮像される度に又は全撮像が終了後纏めて取得する。

画像解析部１１２ｃは、発光画像取得部１１２ｂで取得した複数の発光画像に基づいて、細胞１０２から発せられる発光の発光強度を経時的に測定する。解析結果出力部１１２ｄは、画像解析部１１２ｃでの解析結果を出力装置１２４に出力する。具体的には、解析結果出力部１１２ｄは、画像解析部１１２ｃで得られた、細胞１０２から発せられる発光の発光強度に関する時系列データを、グラフ化して出力装置１２４に表示する。

［受容体相互作用検出方法］
本発明は、細胞において第１の受容体と第２の受容体との相互作用を検出する受容体相互作用検出方法であって、前記第２の受容体の活性を示す指標となるレポータを含む前記細胞を作製する作製工程と、前記作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から、発光させるための所定の処置を行うと共に前記第１の受容体に結合する所定の受容体結合物質を添加する処置および添加工程と、前記処置および添加工程が行われた後の前記細胞の発光量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定した前記発光量に基づいて前記細胞内における前記第２の受容体の活性を解析する解析工程と、前記解析工程で解析した前記第２の受容体の活性に基づいて、前記第１の受容体と前記第２の受容体との前記相互作用を検出する検出工程とを含むことを特徴とする受容体相互作用検出方法に関する。

作製工程では、レポータを含む細胞が作製される。このレポータとは、後述するようなサイクリックＡＭＰセンサータンパク質であってよい。対象となる細胞の種類に限定はなく、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞等を使用できる。動物細胞が使用される場合、特に哺乳細胞が使用され、例えばマウスの細胞、サルの細胞およびヒトの細胞が使用される。細胞に対してレポータを導入する方法に特別な限定はなく、既知の導入方法が使用できる。細胞は、生体組織の一部として培養された細胞集合体であってもよいし、生体組織が属している臓器等や生命個体の形態でもよい。レポータがタンパク質である場合、１つの方法は、当該タンパク質をコードする塩基配列を含む又は当該配列から成る核酸を細胞に導入し、その後細胞内で当該タンパク質を発現させる方法である。例えば、当該核酸を含む発現ベクターを、リン酸カルシウム法、リポフェクション法またはエレクトロポレーション法等によって細胞内に導入し、発現ベクターから当該タンパク質を発現させることができる。ベクターから発現させるのではなく、当該核酸がゲノムに組み込まれた細胞を作製した後、ゲノムから当該タンパク質を発現させることもできる。別の方法は、細胞外で精製した当該タンパク質を細胞内に直接導入する方法である。例えば、マイクロインジェクション法によって当該タンパク質を細胞内に直接注入することができる。または、当該タンパク質を含む培養液にて細胞をインキュベートさせて、エンドサイトーシスによって当該タンパク質を細胞に取り込ませることができる。

処置および添加工程では、発光させるための所定の処置および第１の受容体に結合する所定の受容体結合物質の添加が行われる。発光させるための所定の処置とは、例えば発光基質を添加することや励起光を照射することなどである。発光基質を添加する方法に特別な限定はなく、適宜選択できる。好ましくは、発光基質は測定の直前に添加される。発光基質の添加量に特別な限定はないが、好ましくは、発光酵素が発光反応を生じるために十分な量で添加される。第１の受容体に結合する所定の受容体結合物質の添加によって、当該受容体は活性化される。第１の受容体は例えば５ＨＴ２Ａ受容体であってよく、受容体結合物質はセロトニン、例えば５ＨＴとすることができる。

測定工程では、処置および添加工程によって細胞から生じる発光が測定される。測定はイメージングまたはフォトカウンティングによって行うことができる。イメージングを行う場合、発光反応が生じている細胞の画像が取得されるので、細胞ごとの発光を測定するのに都合が良い。撮像は任意のタイミングで行うことができるが、好ましくは、基質添加から一定時間後に行われる。特に複数の測定を繰り返す場合、測定結果のばらつきを抑えるために、複数の測定を通じて同一のタイミングで撮像することが好ましい。撮像時間は条件に応じて最良の時間が適宜選択される。発光強度が小さい場合、撮像時間（顕微鏡を使用する場合、露光時間）は長くされ、逆に発光強度が大きすぎる場合、撮像時間は短くされる。撮像は、発光反応に係る波長の光のみを取得して行うこともできるが、それと同時に明視野画像または別の波長の光による画像を取得してもよい。例えば、細胞にサイクリックＡＭＰセンサータンパク質と同時にプローブ（例えば蛍光または発光タンパク質）を融合した特定のタンパク質を導入し、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質に由来する光と同時に、当該特定のタンパク質からの光を検出してもよい。

解析工程では、第２の受容体の活性が解析される。測定工程において得られた測定結果に基づき、発光が生じたかどうかが判定される。発光が生じた場合、第２の受容体が活性化したと判定される。好ましくは、第２の受容体として、Ｄ１受容体またはＤ２受容体を選択することができる。Ｄ１受容体は、リガンドが結合するとアデニル酸シクラーゼを活性化し、細胞内のサイクリックＡＭＰ濃度を上昇させる作用を有する。一方、Ｄ２受容体は、リガンドが結合するとホスホジエステラーゼを活性化し、細胞内のサイクリックＡＭＰ濃度を低下させる作用を有する。第２の受容体は、アデニル酸シクラーゼを活性化する作用を有するか否かが判明している受容体であることが好ましい。

検出工程では、第２の受容体の活性の解析結果に基づいて、第１の受容体と第２の受容体との前記相互作用が検出される。処置および添加工程において第１の受容体に受容体結合物質を与えた結果、解析工程において第２の受容体の活性が認められた場合、第１の受容体と第２の受容体との相互作用に対して肯定的な結論が得られる。一方、解析工程において第２の受容体の活性が認められなかった場合、第１の受容体と第２の受容体との相互作用に対して否定的な結論が得られる。

［サイクリックＡＭＰセンサータンパク質］
次に、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質について補足的に説明する。

本発明において、第２の受容体の活性を示す指標となるレポータとして、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質を使用することができる。当該サイクリックＡＭＰセンサータンパク質として、ホタルのルシフェラーゼおよびＰＫＡのサイクリックＡＭＰ結合領域とからなる融合タンパク質を使用することができる。

サイクリックＡＭＰ結合領域としては、マウスのＰＫＡ−ＲＩα由来のものを使用することができる。ここで、ＰＫＡ−ＲＩαとは、ＰＫＡの制御サブユニットαのことを意味する。ＰＫＡ−ＲＩαは、サイクリックＡＭＰ結合ドメインを有しており、サイクリックＡＭＰに結合する能力を有する。

サイクリックＡＭＰ結合領域の長さに関して、そのアミノ酸残基の数を１２０から２５０としてもよい。また、アミノ酸残基の数を２００から２５０、２２０から２５０、２３０から２５０、２３０から２４５、または２３０から２４０としてもよい。例えば、アミノ酸残基数を２３０または２４１としてもよい。

サイクリックＡＭＰ結合領域としては、少なくとも２つのサイクリックＡＭＰ結合部位を含むものを使用することができる。「サイクリックＡＭＰ結合部位」とは、サイクリックＡＭＰ１分子が結合することができるサイクリックＡＭＰ結合領域中の部位として定義される。サイクリックＡＭＰ結合部位には、前述のＰＫＡ−ＲＩαのサイクリックＡＭＰ結合ドメインが含まれる。また、上記定義を満たせば、サイクリックＡＭＰ結合ドメインとして特定または認識されていない部位であってもサイクリックＡＭＰ結合部位に含まれる。

本発明に係る方法において、ルシフェラーゼのＮ末端側断片、ルシフェラーゼのＣ末端側断片およびサイクリックＡＭＰ結合領域を含むサイクリックＡＭＰセンサータンパク質であって、Ｎ末端側断片とＣ末端側断片とがサイクリックＡＭＰセンサータンパク質分子内で結合すると、ルシフェラーゼの発光酵素活性が回復するサイクリックＡＭＰセンサータンパク質を使用することができる。「ルシフェラーゼのＮ末端側断片」とは、Ｃ末端から複数のアミノ酸が欠失したルシフェラーゼ断片であって、発光酵素活性を失ったルシフェラーゼ断片を意味する。「ルシフェラーゼのＣ末端側断片」とは、Ｎ末端から複数のアミノ酸が欠失したルシフェラーゼ断片であって、発光酵素活性を失ったルシフェラーゼ断片を意味する。サイクリックＡＭＰセンサータンパク質がそれらの断片およびサイクリックＡＭＰ結合領域を「含む」とは、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質が、ルシフェラーゼのＮ末端側断片、ルシフェラーゼのＣ末端側断片、サイクリックＡＭＰ結合領域および任意にその他のポリペプチドから成る融合タンパク質であることを意味する。したがって、これらの構成要素が側鎖または修飾基として含まれるわけではない。このようなサイクリックＡＭＰセンサータンパク質の例は、図５に示されるような、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質のＮ末端側にルシフェラーゼのＮ末端側断片が存在し、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質のＣ末端側にルシフェラーゼのＣ末端側断片が存在し、これらの断片の間にＰＫＡ−ＲＩα由来のサイクリックＡＭＰ結合領域が存在するサイクリックＡＭＰセンサータンパク質である。また、別の例は、図１９に示されるような、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質のＮ末端側にルシフェラーゼのＣ末端側断片が存在し、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質のＣ末端側にルシフェラーゼのＮ末端側断片が存在し、これらの断片の間にＰＫＡ−ＲＩα由来のサイクリックＡＭＰ結合領域が存在するサイクリックＡＭＰセンサータンパク質である。

Ｎ末端側断片は、例えばルシフェラーゼの１番目から４００番目のアミノ酸を含む断片であってよく、Ｃ末端側断片は、例えばルシフェラーゼの４０１番目から５５０番目のアミノ酸を含むものであってよい。特に、Ｎ末端側断片がルシフェラーゼの１番目から４１６番目のアミノ酸を含み、Ｃ末端側断片がルシフェラーゼの３９９番目から５５０番目のアミノ酸を含むことが好ましい。このように、Ｎ末端側断片およびＣ末端側断片は、それらの配列の一部が重複していてもよい。また、Ｎ末端側断片にもＣ末端側断片にも含まれないルシフェラーゼ配列部分が存在してもよい。

サイクリックＡＭＰセンサータンパク質内において、ルシフェラーゼがＮ末端側断片とＣ末端側断片とに分かれたことにより、通常の環境下（例えばサイクリックＡＭＰが存在していない環境下）では、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質はルシフェラーゼの活性を有さない。しかし、特定の環境下（例えばサイクリックＡＭＰが存在する環境下）では、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質はルシフェラーゼの活性を回復する。この回復は、サイクリックＡＭＰ結合領域の機能に起因する。例えば、マウスのＰＫＡ−ＲＩα由来のサイクリックＡＭＰ結合領域を選択した場合、図５および１９に示されるように、サイクリックＡＭＰ結合領域にサイクリックＡＭＰが結合すると、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質全体の立体構造が変化し、結果としてＮ末端側断片とＣ末端側断片とが接近する。これらの２つの断片が協同してルシフェラーゼ活性を奏する。

「Ｎ末端側断片とＣ末端側断片とが前記サイクリックＡＭＰセンサータンパク質分子内で結合すると発光酵素活性が回復する」という表現において、Ｎ末端側断片とＣ末端側断片とが「結合」する態様に限定はなく、共有結合または非共有結合等の化学的結合であってもよいが、Ｎ末端側断片とＣ末端側断片とがルシフェラーゼの本来の機能を果たしうる程度に「接近」または「接触」している状態であることが好ましい。あるいは、Ｎ末端側断片とＣ末端側断片とが「会合」する状態であってもよい。すなわち、当該表現において使用される「結合」という用語は、「接近」、「接触」または「会合」という意味を含む。

また、上記表現において、Ｎ末端側断片とＣ末端側断片との結合は、サイクリックＡＭＰに応答して生じる結合であってよい。より具体的には、サイクリックＡＭＰ結合領域にサイクリックＡＭＰ分子が結合することで、サイクリックＡＭＰ結合領域の構造の変化が生じ、その結果生じるＮ末端側断片とＣ末端側断片との結合または接近であってよい。

なお、サイクリックＡＭＰ結合領域としては、好ましくは配列番号３７または３９に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。

［実施例１］
本実施の形態における実施例について、以下に図５〜図９を用いて説明する。ここで、図５はスプリットルシフェラーゼアッセイ法を用いたサイクリックＡＭＰの検出原理を示す図である。

スプリットルシフェラーゼアッセイとは、ホタルルシフェラーゼやウミシイタケルシフェラーゼ等のルシフェラーゼを特定の位置で分割して発光酵素活性（生物発光能）を失活させた後、そのフラグメント（断片）であるＮ末側発光酵素とＣ末側発光酵素を再構成して発光酵素活性を回復させる手法であり、タンパク質間相互作用の検出やタンパク質の細胞内小器官移行検出等に用いられる。

図５には、Ｎ末側発光酵素（ＮＬｕｃ）とＣ末側発光酵素（ＣＬｕｃ）との非共有結合的相互作用を起こさせるタンパク質として、サイクリックＡＭＰ結合タンパク質を用いた例を示している。すなわち、細胞内で発現させた、Ｎ末側発光酵素とＣ末側発光酵素およびサイクリックＡＭＰ結合タンパク質との融合タンパク質における当該サイクリックＡＭＰ結合タンパク質にサイクリックＡＭＰが結合すると、当該サイクリックＡＭＰ結合タンパク質の立体構造が変化してＮ末側発光酵素とＣ末側発光酵素とが結合し、発光酵素活性が回復して検出可能なシグナルが発せられる。本実施例では、当該スプリットルシフェラーゼアッセイ系において、サイクリックＡＭＰ結合タンパク質にＰＫＡ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＡ）の制御サブユニットＩα（ＰＫＡ−ＲＩα）のサイクリックＡＭＰ結合ドメインを用いた例について説明する。ここで、本実施例における実験の流れ（手順）は、以下の通りである。

［前準備その１：Ｎ末側発光酵素遺伝子とＣ末側発光酵素遺伝子およびＰＫＡ−ＲＩαのサイクリックＡＭＰ結合ドメイン遺伝子のクローニングと、融合タンパク質発現プラスミドの作製］
［手順１］
Ｎ末側発光酵素（ＮＬｕｃ）遺伝子とＣ末側発光酵素（ＣＬｕｃ）遺伝子の作製のために、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）に用いる合成オリゴＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）を以下に示す配列で調製した。
［ＮＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ＮＬｕｃ＿Ｆｗ（配列番号１）：５’−ＴＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡ−３’
ＮＬｕｃ＿Ｒｖ（配列番号２）：５’−ＣＡＧＣＴＣＧＡＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＧＴＴ−３’
［ＣＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ＣＬｕｃ＿Ｆｗ（配列番号３）：５’−ＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣＴＡＣＧＴＴＡＡＣＡＡＣＣＣＣＧＡＧ−３’
ＣＬｕｃ＿Ｒｖ（配列番号４）：５’−ＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＣＧＧＣＧＡＴＣＴＴＧＣＣＧＣＣ−３’

また、ＰＫＡ−ＲＩαのｃＡＭＰ結合ドメイン遺伝子のクローニングのために、ＰＣＲに用いる合成オリゴＤＮＡを以下に示す配列で調製した。
ＰＫＡ＿ＲＩＡ＿β１＿Ｆｗ（配列番号５）：５’−ＡＴＴＣＴＣＧＡＧＧＣＴＡＴＧＴＴＴＣＣＡＧＴＣＴＣＣＴＴＴ−３’
ＰＫＡ＿ＲＩＡ＿Ｂ＿Ｒｖ（配列番号６）：５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＡＡＧＣＴ−３’

［手順２］
ｐＧＬ４．１０（プロメガ（株）製）を鋳型として、Ｎ末側ルシフェラーゼ遺伝子（ＮＬｕｃ：ＧＬ４．１０遺伝子の１番目から４１６番目のアミノ酸を含む。）およびＣ末側ルシフェラーゼ遺伝子（ＣＬｕｃ：ＧＬ４．１０遺伝子の３９９番目から５５０番目のアミノ酸を含む。）を、上記合成オリゴＤＮＡ（配列番号１のＤＮＡ配列と配列番号２のＤＮＡ配列のペア、および配列番号３のＤＮＡ配列と配列番号４のＤＮＡ配列のペア）をプライマーとしてＰＣＲにより増幅した。

［手順３］
ＰＫＡの制御サブユニットＩα（ＰＫＡ−ＲＩα）に２ヶ所あるサイクリックＡＭＰ結合ドメインのＡとＢの両方を含む領域を、マウスのＰＫＡ制御サブユニットＩα（ＰＫＡ−ＲＩα）のｃＤＮＡを鋳型とし、上記合成オリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲにより増幅した。配列番号５のＤＮＡ配列と配列番号６のＤＮＡ配列のプライマーを用いて、ＲＩα＿β１ＡＢ遺伝子（マウスのＰＫＡ−ＲＩα遺伝子の１５２番目から３８１番目のアミノ酸配列に対応する領域を含む。配列番号３９）をＰＣＲにより増幅した。

［手順４：融合タンパク質遺伝子発現プラスミドの作製］
ＰＣＲで増幅させたＮＬｕｃ遺伝子、ＣＬｕｃ遺伝子およびＲＩα＿β１ＡＢ遺伝子を、動物細胞発現用プラスミドであるｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）のＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間に挿入し、動物細胞発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＲＩα＿β１ＡＢ＿Ｃを作製した。

［前準備その２：ヒトＤ１受容体遺伝子とＤ２受容体遺伝子および５ＨＴ２Ａ受容体遺伝子のクローニング］
［手順１］
ヒトＤ１受容体遺伝子とＤ２受容体遺伝子および５ＨＴ２Ａ受容体遺伝子の作製のために、ＰＣＲに用いる合成オリゴＤＮＡを以下に示す配列で調製した。
［ヒトＤ１受容体遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ＨＵ＿Ｄ１Ｒ＿Ｆｗ（配列番号７）：５’−ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＡＡＣＡＣＣＴＣＴＧＣＣ−３’
ＨＵ＿Ｄ１Ｒ＿Ｒｖ（配列番号８）：５’−ＴＣＡＧＧＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＴＴＧＴＧＴＧＡＴ−３’
［ヒトＤ２受容体遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ＨＵ＿Ｄ２Ｒ＿Ｆｗ（配列番号９）：５’−ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＡＡＴＣＴＧＴＣＣＴＧＧ−３’
ＨＵ＿Ｄ２Ｒ＿Ｒｖ（配列番号１０）：５’−ＴＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＴ−３’
［ヒト５ＨＴ２Ａ受容体遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ＨＵ＿５ＨＴ２ＡＲ＿Ｆｗ（配列番号１１）：５’−ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＴＣＴＴＴＧＴＧＡＡＧＡＡＡＡＴ−３’
ＨＵ＿５ＨＴ２ＡＲ＿Ｒｖ（配列番号１２）：５’−ＴＣＡＣＡＣＡＣＡＧＣＴＣＡＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＣＡＣＴＣＣ−３’

［手順２］
ヒト脳ｃＤＮＡライブラリ（タカラバイオ（株）製）を鋳型として、Ｄ１受容体遺伝子（ヒトのＤ１受容体遺伝子の全長に対応する領域を含む。）Ｄ２受容体遺伝子（ヒトのＤ２受容体遺伝子の全長に対応する領域を含む。）および５ＨＴ２Ａ受容体遺伝子（ヒトの５ＨＴ２Ａ受容体遺伝子の全長に対応する領域を含む。）を、上記合成オリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲにより増幅した。

［手順３］
ＰＣＲで増幅させたＤ１受容体遺伝子、Ｄ２受容体遺伝子および５ＨＴ２Ａ受容体遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターにサブクローニングした後、作製したＤＮＡの配列をＤＮＡシーケンシングにより確認した。

［手順４］
それぞれの遺伝子を哺乳類細胞の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン（株）製）へ組み込み、ヒトＤ１受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／Ｄ１ＲおよびヒトＤ２受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／Ｄ２Ｒおよびヒト５ＨＴ２Ａ受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／５ＨＴ２ＡＲを作製した。

［実験：ヒトＤ１受容体、Ｄ２受容体および５ＨＴ２Ａ受容体を含有するＨＥＫ２９３細胞でのｃＡＭＰ濃度変動の発光イメージング］
［手順１：ＨＥＫ２９３細胞の培養］
ＡＴＣＣ（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）社より入手したＨＥＫ２９３細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内で、１０％ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍおよび１× Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌａｍｉｎｏａｃｉｄｓを添加したＥａｒｌｅ'ｓＭＥＭ／培地（ＧＩＢＣＯ社製）で培養した。

［手順２：タンパク質発現プラスミドの導入］
ＨＥＫ２９３細胞を、直径３５ｍｍガラスボトムディッシュに２×１０^５／ｄｉｓｈの細胞密度で播種し、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養し、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＲＩα＿β１ＡＢ＿Ｃ、ヒトＤ１受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／Ｄ１Ｒ（またはヒトＤ２受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／Ｄ２Ｒ）およびヒト５ＨＴ２Ａ受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／５ＨＴ２ＡＲを混合し、ＦｕＧＥＮＥＨＤ（ロシュ社製）を用いてトランスフェクションを行い、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。なお、ヒトＤ１受容体のアミノ酸配列は具体的には配列番号２９のアミノ酸配列であり、ヒト５ＨＴ２Ａ受容体のアミノ酸配列は具体的には配列番号３０のアミノ酸配列である。

［手順３：発光画像の撮像］
培地中にルシフェリン２ｍＭ（プロメガ社製）を加えて１時間静置してから、培養ディッシュを発光顕微鏡“ＬＶ（ＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷ）−２００”（オリンパス社製）にセットし、２０秒間隔で発光画像のタイムラプス撮影を行った。発光観察条件として、対物レンズの倍率は４０倍、露出時間は１０秒、ビニングは２×２とした。ＣＣＤカメラ１０６ｃとしてＥＭ−ＣＣＤカメラｉＸｏｎ（アンドール社製）を用い、画像解析装置１１０として構成したパーソナルコンピュータに発光画像を取り込んだ。

［手順４：ドーパミン刺激による発光画像の撮像］
タイムラプス撮影開始から１分後以降に、セロトニン（５ＨＴ：最終濃度１０μＭ）、ドーパミン（ＤＡ：最終濃度１０μＭ）およびフォルスコリン（ＦＳＫ：最終濃度５μＭ）で順次刺激を行い、引き続き発光画像のタイムラプス撮影を行った。

［手順５：発光量の経時変化のグラフ表示］
刺激前に撮影した各々の発光画像（図６、図１０および図１５参照）に対して図示の如く複数のＲＯＩ（ＲｅｇｉｏｎｏｆＩｎｔｅｒｅｓｔ：関心領域）を指定し、また刺激後に撮影した各々の発光画像（図７、図８、図１１〜図１３および図１６〜図１７参照）に対して図示の如く複数のＲＯＩを指定した。指定した各ＲＯＩの発光強度を各々の発光画像に基づいて測定し、当該測定した発光強度の経時変化をグラフ（図９、図１４および図１８参照）で表示した。発光画像の解析は、画像解析部１１２ｃとして機能するＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（ユニバーサルイメージング社製）を用いて行った。なお、図９、図１４および図１８において、Ｃｅｌｌ１〜Ｃｅｌｌ４のそれぞれに対応する各グラフは、図６〜図８、図１０〜図１３および図１５〜図１７における番号１〜番号４のそれぞれに対応する各ＲＯＩの発光強度の経時変化を示している。

［実験の結果］
以上の実験の結果、図６〜図９に示すように、５ＨＴ２Ａ受容体またはＤ１受容体、Ｄ２受容体への刺激に対する細胞内のサイクリックＡＭＰ応答の変化をシングルセルレベル（一細胞レベル）で検出することができた。また、図９に示されている個々の細胞における発光強度の変化を見ると、５ＨＴ２Ａ受容体とＤ１受容体との組合せにおいて、５ＨＴ２Ａ受容体への刺激に対する細胞内サイクリックＡＭＰ濃度の上昇が観察された。しかし、図１１〜図１４および図１６〜図１８に示すように、５ＨＴ２Ａ受容体とＤ２受容体との組合せにおいておよび５ＨＴ２Ａ受容体のみにおいては、５ＨＴ２Ａ受容体への刺激に対する細胞内サイクリックＡＭＰ濃度の上昇が観察されなかった。セロトニン受容体とドーパミン受容体との相互作用のこれまでの研究から、個体において、Ｄ１受容体を介すると考えられている行動が５ＨＴ２Ａ受容体を介して引き起こされる、ということが知られている。本実験により得られた結果は、個体において観察した反応を細胞レベルで説明することが出来ることを示している。

［本実施例のまとめ］
以上、本実施例によれば、細胞内の情報伝達に影響を及ぼすことなく、各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞においての５ＨＴ２Ａ受容体とＤ１受容体との相互作用を再現性良く経時的に観察することができる。

［他の実施の形態］
上述した実施の形態においては、主に、互いに結合することにより発光酵素活性が回復するよう分割させたＮ末側発光酵素とＣ末側発光酵素およびＰＫＡ−ＲＩαのサイクリックＡＭＰ結合ドメインからなる融合タンパク質を、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質として説明を行ったが、本発明はこれに限られず、Ｎ末側発光酵素とＣ末側発光酵素およびＰＫＡ−ＲＩαのサイクリックＡＭＰ結合ドメインからなる融合タンパク質に替えて、国際公開第２００７／１２０５２２号および特表２００７−５０８０１４号公報に開示されているサイクリックＡＭＰセンサータンパク質を用いてもよい。

［実施例２］
実施例１とは異なる実施形態に係るサイクリックＡＭＰセンサータンパク質を作製し、その有用性を検討した。具体的には、図１９に示されるように、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質のＮ末端側にＣ末端側断片が配置され、Ｃ末端側にＮ末端側断片が配置され、それらの間にサイクリックＡＭＰ結合領域が配置されたサイクリックＡＭＰセンサータンパク質を作製した。すなわち、端的に表現すると、実施例１に係るサイクリックＡＭＰセンサータンパク質に対して、Ｃ末端側断片とＮ末端側断片とを置き換えたサイクリックＡＭＰセンサータンパク質を作製した。なお、本実施例に係るサイクリックＡＭＰセンサータンパク質並びにその作製のために使用される遺伝子およびプライマー等について、それらの名称に「変異型」または「ｃｐ（ｃｉｒｃｕｌａｒｐｅｒｍｕｔａｉｏｎ）」等を付して区別した。

［前準備：変異型ルシフェラーゼ作成用のＮ末側発光酵素遺伝子とＣ末側発光酵素遺伝子、およびＰＫＡ−ＲＩαのサイクリックＡＭＰ結合ドメイン遺伝子のクローニングと、変異型ルシフェラーゼ融合タンパク質発現プラスミドの作製］
［手順１］
変異型ルシフェラーゼ作成用のＮ末側発光酵素（ｃｐＮＬｕｃ）遺伝子とＣ末側発光酵素（ｃｐＣＬｕｃ）遺伝子の作製のために、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）に用いる合成オリゴＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）を以下に示す配列で調製した。
［ｃｐＮＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ｃｐＮＬｕｃ＿Ｆｗ（配列番号１３）：５’−ＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＡＡＧ−３’
ｃｐＮＬｕｃ＿Ｒｖ（配列番号１４）：５’−ＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＣＴＴＧＴＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣ−３’
［ｃｐＣＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ｃｐＣＬｕｃ＿Ｆｗ（配列番号１５）：５’−ＴＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＧＧＣＴＡＣＧＴＴＡＡＣＡＡＣＣＣＣ−３’
ｃｐＣＬｕｃ＿Ｒｖ（配列番号１６）：５’−ＣＡＧＣＴＣＧＡＧＣＡＣＧＧＣＧＡＴＣＴＴＧＣＣＧＣＣＣＴＴ−３’

また、ＰＫＡ−ＲＩαのｃＡＭＰ結合ドメイン遺伝子のクローニングのために、ＰＣＲに用いる合成オリゴＤＮＡを以下に示す配列で調製した。
ＰＫＡ＿ＲＩＡ＿α＿Ｆｗ（配列番号１７）：５’−ＴＴＴＣＴＣＧＡＧＣＴＴＧＡＴＧＡＴＡＡＣＧＡＧＡＧＡＡＧＴ−３’
ＰＫＡ＿ＲＩＡ＿Ｂ＿Ｒｖ（配列番号１８）：５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＡＡＧＣＴ−３’

［手順２］
市販のルシフェラーゼ遺伝子であるｐＧＬ４．１０（プロメガ（株）製）を鋳型として、変異型のＮ末側ルシフェラーゼ遺伝子（ｃｐＮＬｕｃ：ＧＬ４．１０遺伝子の１番目から４１６番目のアミノ酸を含む。）および変異型のＣ末側ルシフェラーゼ遺伝子（ｃｐＣＬｕｃ：ＧＬ４．１０遺伝子の３９９番目から５５０番目のアミノ酸を含む。）を、上記合成オリゴＤＮＡ（配列番号１３のＤＮＡ配列と配列番号１４のＤＮＡ配列のペア、および配列番号１５のＤＮＡ配列と配列番号１６のＤＮＡ配列のペア）をプライマーとしてＰＣＲにより増幅した。

［手順３］
ＰＫＡの制御サブユニットＩα（ＰＫＡ−ＲＩα）に２ヶ所あるサイクリックＡＭＰ結合ドメインのＡとＢの両方を含む領域を、マウスのＰＫＡ制御サブユニットＩα（ＰＫＡ−ＲＩα）のｃＤＮＡを鋳型とし、上記合成オリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲにより増幅した。配列番号１７のＤＮＡ配列と配列番号１８のＤＮＡ配列のプライマーを用いて、ＲＩα＿αＡＢ遺伝子（マウスのＰＫＡ−ＲＩα遺伝子の１４１番目から３８１番目のアミノ酸配列に対応する領域を含む。）（塩基配列は配列番号３７に示される）をＰＣＲにより増幅した。

［手順４：融合タンパク質遺伝子発現プラスミドの作製］
ＰＣＲで増幅させた、ｃｐＮＬｕｃ遺伝子、ｃｐＣＬｕｃ遺伝子およびＲＩα＿αＡＢ遺伝子をそれぞれ含む核酸を、制限酵素にて適宜処理した後、動物細胞発現用プラスミドであるｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）のＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間に挿入し、動物細胞発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＲＩα＿αＡＢ＿Ｎを作製した。

［手順２：タンパク質発現プラスミドの導入］
ＨＥＫ２９３細胞を、直径３５ｍｍガラスボトムディッシュに２×１０^５／ｄｉｓｈの細胞密度で播種し、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養し、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＲＩα＿αＡＢ＿Ｎ、ヒトＤ１受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／Ｄ１Ｒ（またはヒトＤ２受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／Ｄ２Ｒ）およびヒト５ＨＴ２Ａ受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／５ＨＴ２ＡＲを混合し、ＦｕＧＥＮＥＨＤ（ロシュ社製）を用いてトランスフェクションを行い、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。なお、ｐｃＤＮＡ／Ｄ１Ｒ、ｐｃＤＮＡ／Ｄ２ＲおよびｐｃＤＮＡ／５ＨＴ２ＡＲは、実施例１と同様に作製したものを使用した。

［手順４：セロトニン、ドーパミン刺激による発光画像の撮像］
タイムラプス撮影開始から１分後以降に、セロトニン（５ＨＴ：最終濃度１０μＭ）、ドーパミン（ＤＡ：最終濃度１０μＭ）で順次刺激を行い、引き続き発光画像のタイムラプス撮影を行った。

［手順５：発光量の経時変化のグラフ表示］
刺激前に撮影した各々の発光画像（図２０および図２４参照）に対して図示の如く複数のＲＯＩ（ＲｅｇｉｏｎｏｆＩｎｔｅｒｅｓｔ：関心領域）を指定し、また刺激後に撮影した各々の発光画像（図２１、図２２、図２５および図２６参照）に対して図示の如く複数のＲＯＩを指定した。指定した各ＲＯＩの発光強度を各々の発光画像に基づいて測定し、当該測定した発光強度の経時変化をグラフ（図２３、および図２７参照）で表示した。発光画像の解析は、画像解析部１１２ｃとして機能するＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（ユニバーサルイメージング社製）を用いて行った。なお、図２３および図２７において、Ｃｅｌｌ１〜Ｃｅｌｌ４のそれぞれに対応する各グラフは、図２０〜図２２および図２４〜図２６における番号１〜番号４のそれぞれに対応する各ＲＯＩの発光強度の経時変化を示している。

［実験の結果］
以上の実験の結果、図６〜図９および図２０〜図２３に示すように、５ＨＴ２Ａ受容体またはＤ１受容体、Ｄ２受容体への刺激に対する細胞内のサイクリックＡＭＰ応答の変化をシングルセルレベル（一細胞レベル）で検出することができた。また、図９および図２３に示されている個々の細胞における発光強度の変化を見ると、５ＨＴ２Ａ受容体とＤ１受容体との組合せにおいて、５ＨＴ２Ａ受容体への刺激に対する細胞内サイクリックＡＭＰ濃度の上昇が観察された。しかし、図１１〜図１４および図１６〜図１８、図２４〜図２７に示すように、５ＨＴ２Ａ受容体とＤ２受容体との組合せにおいておよび５ＨＴ２Ａ受容体のみにおいては、５ＨＴ２Ａ受容体への刺激に対する細胞内サイクリックＡＭＰ濃度の上昇が観察されなかった。セロトニン受容体とドーパミン受容体との相互作用のこれまでの研究から、個体において、Ｄ１受容体を介すると考えられている行動が５ＨＴ２Ａ受容体を介して引き起こされる、ということが知られている。本実験により得られた結果は、個体において観察した反応を細胞レベルで説明することが出来ることを示している。

［本実施例のまとめ］
以上、本実施例によれば、細胞内の情報伝達に影響を及ぼすことなく、各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞においての５ＨＴ２Ａ受容体とＤ１受容体との相互作用を再現性良く経時的に観察することができる。この実施例において使用するルシフェラーゼ遺伝子やルシフェリン等は、他の市販試薬であってもよいし、生物発光等を発生する生物から抽出等されたものであってもよい。

［他の実施の形態］
上述した実施の形態においては、主に、互いに結合することにより発光酵素活性が回復するよう分割させたＮ末側発光酵素とＣ末側発光酵素、および、ＰＫＡ−ＲＩαのサイクリックＡＭＰ結合ドメインからなる融合タンパク質をサイクリックＡＭＰセンサータンパク質として説明を行ったが、本発明はこれに限られず、Ｎ末側発光酵素とＣ末側発光酵素、および、ＰＫＡ−ＲＩαのサイクリックＡＭＰ結合ドメインからなる融合タンパク質に替えて特許文献１および特許文献２に開示されているサイクリックＡＭＰセンサータンパク質を用いてもよい。

［実施例３］
種々のサイクリックＡＭＰセンサータンパク質を作製し、それらの有用性を検討した。具体的には、長さおよび範囲をかえた１６通りのサイクリックＡＭＰ結合領域を作製し、それぞれについて、Ｎ末端側断片、サイクリックＡＭＰ結合領域およびＣ末端側断片の順に配置したもの、ならびに、Ｃ末端側断片、サイクリックＡＭＰ結合領域およびＮ末端側断片の順に配置したものの計３２種のサイクリックＡＭＰセンサータンパク質を作製した。それら全てについて、サイクリックＡＭＰの存在下および非存在下における酵素活性を測定した。

［手順１］
スプリットルシフェラーゼ作成用のＮ末側発光酵素（ＮＬｕｃ）遺伝子とＣ末側発光酵素（ＣＬｕｃ）遺伝子、および、変異型スプリットルシフェラーゼ作成用のＮ末側発光酵素（ｃｐＮＬｕｃ）遺伝子とＣ末側発光酵素（ｃｐＣＬｕｃ）遺伝子の作製のために、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）に用いる合成オリゴＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）を以下に示す配列で調製した。
［ＮＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ＮＬｕｃ＿Ｆｗ（配列番号１）：５’ − ＴＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡ − ３’
ＮＬｕｃ＿Ｒｖ（配列番号２）：５’ − ＣＡＧＣＴＣＧＡＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＧＴＴ − ３’
［ＣＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ＣＬｕｃ＿Ｆｗ（配列番号３）：５’ − ＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣＴＡＣＧＴＴＡＡＣＡＡＣＣＣＣＧＡＧ − ３’
ＣＬｕｃ＿Ｒｖ（配列番号４）：５’ − ＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＣＧＧＣＧＡＴＣＴＴＧＣＣＧＣＣ − ３’
［ｃｐＮＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ｃｐＮＬｕｃ＿Ｆｗ（配列番号１３）：５’−ＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＡＡＧ−３’
ｃｐＮＬｕｃ＿Ｒｖ（配列番号１４）：５’−ＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＣＴＴＧＴＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣ−３’
［ｃｐＣＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ｃｐＣＬｕｃ＿Ｆｗ（配列番号１５）：５’−ＴＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＧＧＣＴＡＣＧＴＴＡＡＣＡＡＣＣＣＣ−３’
ｃｐＣＬｕｃ＿Ｒｖ（配列番号１６）：５’−ＣＡＧＣＴＣＧＡＧＣＡＣＧＧＣＧＡＴＣＴＴＧＣＣＧＣＣＣＴＴ−３’

また、ＰＫＡ−ＲＩαのｃＡＭＰ結合ドメイン遺伝子のクローニングのために、ＰＣＲに用いる合成オリゴＤＮＡを以下に示す配列で調製した。
ＰＫＡ＿ＲＩＡ＿Ｘｎ１＿Ｆｗ（配列番号１９）：５’− ＡＴＴＣＴＣＧＡＧＧＡＴＴＡＴＡＡＧＡＣＡＡＴＧＧＣＴＧＣＴ −３’
ＰＫＡ＿ＲＩＡ＿Ｘｎ２＿Ｆｗ（配列番号２０）：５’− ＧＣＣＣＴＣＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧＴＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＣＡＣ −３’
ＰＫＡ＿ＲＩＡ＿α＿Ｆｗ（配列番号２１）：５’− ＴＴＴＣＴＣＧＡＧＣＴＴＧＡＴＧＡＴＡＡＣＧＡＧＡＧＡＡＧＴ −３’
ＰＫＡ＿ＲＩＡ＿β１＿Ｆｗ（配列番号２２）：５’− ＡＴＴＣＴＣＧＡＧＧＣＴＡＴＧＴＴＴＣＣＡＧＴＣＴＣＣＴＴＴ −３’
ＰＫＡ＿ＲＩＡ＿β２＿Ｆｗ（配列番号２３）：５’− ＴＴＴＣＴＣＧＡＧＧＧＡＧＡＧＡＣＧＧＴＴＡＴＴＣＡＧＣＡＡ −３’
ＰＫＡ＿ＲＩＡ＿β３＿Ｆｗ（配列番号２４）：５’− ＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＧＧＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＧＴＧＡＴＴ −３’
ＰＫＡ＿ＲＩＡ＿β４＿Ｆｗ（配列番号２５）：５’− ＡＴＴＣＴＣＧＡＧＧＧＡＧＡＡＡＴＧＧＡＴＧＴＣＴＡＴＧＴＣ −３’
ＰＫＡ＿ＲＩＡ＿β５＿Ｆｗ（配列番号２６）：５’− ＡＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＴＧＴＴＧＧＧＧＡＡ −３’
ＰＫＡ＿ＲＩＡ＿Ａ＿Ｒｖ（配列番号２７）：５’− ＣＴＣＡＧＡＴＣＴＧＴＣＣＡＧＡＧＡＣＴＣＴＡＡＡＡＴＡＧＡ −３’
ＰＫＡ＿ＲＩＡ＿Ｂ＿Ｒｖ（配列番号２８）：５’− ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＡＡＧＣＴ −３’

［手順２］
そして、ｐＧＬ４．１０（プロメガ（株）製）を鋳型として、以下の表１のプライマーセットを使用し、ルシフェラーゼ遺伝子の断片を含む核酸をＰＣＲによって増幅した。

［手順３］
ＰＫＡの制御サブユニットＩα（ＰＫＡ−ＲＩα）にはｃＡＭＰ結合ドメインがＡとＢの２ヶ所あり、Ａのみを含む領域、または、ＡおよびＢの両方を含む領域を、マウスのＰＫＡ制御サブユニットＩα（ＰＫＡ−ＲＩα）のｃＤＮＡを鋳型とし、上記合成オリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲにより増幅した。使用したプライマーと増幅された遺伝子との関係を図２８に示す（図中、「遺伝子名」「使用したプライマー」「ＰＫＡ−ＲＩα中の対するアミノ酸の位置」「アミノ酸残基の数」が参照される）。

なお、配列番号３１には、ＰＫＡの制御サブユニットＩα（ＰＫＡ−ＲＩα）全体のアミノ酸配列が示される。配列番号３２には、ＲＩα−Ｘｎ１Ａ遺伝子に対応するアミノ酸配列が記載される。配列番号３３には、ＲＩα−Ｘｎ１ＡＢ遺伝子に対応するアミノ酸配列が記載される。配列番号３４には、ＲＩα−Ｘｎ２Ａ遺伝子に対応するアミノ酸配列が記載される。配列番号３５には、ＲＩα−Ｘｎ２ＡＢ遺伝子に対応するアミノ酸配列が記載される。配列番号３６には、ＲＩα−αＡ遺伝子に対応するアミノ酸配列が記載される。配列番号３７には、ＲＩα−αＡＢ遺伝子に対応するアミノ酸配列が記載される。配列番号３８には、ＲＩα−β１Ａ遺伝子に対応するアミノ酸配列が記載される。配列番号３９には、ＲＩα−β１ＡＢ遺伝子に対応するアミノ酸配列が記載される。配列番号４０には、ＲＩα−β２Ａ遺伝子に対応するアミノ酸配列が記載される。配列番号４１には、ＲＩα−β２ＡＢ遺伝子に対応するアミノ酸配列が記載される。配列番号４２には、ＲＩα−β３Ａ遺伝子に対応するアミノ酸配列が記載される。配列番号４３には、ＲＩα−β３ＡＢ遺伝子に対応するアミノ酸配列が記載される。配列番号４４には、ＲＩα−β４Ａ遺伝子に対応するアミノ酸配列が記載される。配列番号４５には、ＲＩα−β４ＡＢ遺伝子に対応するアミノ酸配列が記載される。配列番号４６には、ＲＩα−β５Ａ遺伝子に対応するアミノ酸配列が記載される。配列番号４７には、ＲＩα−β５ＡＢ遺伝子に対応するアミノ酸配列が記載される。

［手順４］（原核生物発現用プラスミドｐＲＳＥＴ／ＧＬ４＿Ｎ＿Ｃ、および、ｐＲＳＥＴ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿Ｎの作製）
ＰＣＲによって増幅したＮＬｕｃ遺伝子を含む断片を、原核生物発現用プラスミドであるｐＲＳＥＴ２Ｂ（インビトロジェン社製）内のＢａｍＨＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に挿入した後、ＣＬｕｃ遺伝子を含む断片を、ＢｇｌＩＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間に挿入することで、原核生物発現用プラスミド（ｐＲＳＥＴ／ＧＬ４＿Ｎ＿Ｃ）を作製した。

また、ＰＣＲによって増幅したｃｐＣＬｕｃ遺伝子を含む断片を、原核生物発現用プラスミドであるｐＲＳＥＴ２Ｂ（インビトロジェン社製）内のＢａｍＨＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に挿入した後、ｃｐＮＬｕｃ遺伝子を含む断片を、ＢｇｌＩＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間に挿入し、原核生物発現用プラスミド（ｐＲＳＥＴ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿Ｎ）を作製した。

［手順５］（融合タンパク質遺伝子発現プラスミドの作製）
手順３によって作製したＰＫＡ−ＲＩα由来の種々の遺伝子を含む核酸を、手順４で作製したｐＲＳＥＴ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＣベクターまたはｐＲＳＥＴ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿Ｎベクター内のＸｈｏＩ部位とＢｇｌＩＩ部位の間に挿入した。このようにして得られたプラスミドを図２８に示す（図中、「得られるプラスミドの名称」が参照される）。

［手順６］（融合タンパク質遺伝子の大腸菌での発現および精製）
以上のように作製した融合タンパク質発現プラスミドを、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株にトランスフォームし、ＴｈｅＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（キアゲン社製）を用いて、キットのマニュアルに従って融合タンパク質を精製した。精製手順を簡略に説明すると、上記原核生物発現用プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株にトランスフォームして、５ｍＬのＬＢ培地中に植菌した。一晩培養した後、遠心分離によって集菌し、集菌した大腸菌を溶解バッファー（５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４，３００ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭイミダゾール，ｐＨ８．０）５００μＬで再懸濁してリゾチームを添加し（１ｍｇ／ｍＬ）、４℃で６０分間インキュベートした。細胞を静かにボルテックスして溶解し、１５，０００ｘｇで１０分間遠心分離して上清を新しいチューブに移した。５０％Ｎｉ−ＮＴＡレジン懸濁液５０μＬを添加し、４℃で６０分間静かに混合した。１５，０００ｘｇで１０秒間遠心してレジンを沈殿させ、レジンを洗浄バッファー（５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４，３００ｍＭＮａＣｌ，２０ｍＭイミダゾール，ｐＨ８．０）５００μＬで２回洗浄した。溶出バッファー（５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４，３００ｍＭＮａＣｌ，２５０ｍＭイミダゾール，ｐＨ８．０）５０μＬで融合タンパク質を２回溶出し、融合タンパク質を得た。得られた融合タンパク質を図２８に示す（図中、「得られるサイクリックＡＭＰセンサータンパク質の名称」が参照される）。

［手順７］（融合タンパク質遺伝子の特性測定）
上記融合タンパク質の発光活性をｃＡＭＰの存在下および非存在下でそれぞれ測定した。測定方法を簡単に説明すると、上述の融合タンパク質溶液２０μＬに、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）２０μＬを加えた。さらに、４ｍＭｃＡＭＰ溶液を１μＬ加え（終濃度１００μＭ）、ネガティブコントロールにはＰＢＳを同量加えた。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（プロメガ社製）を４０μＬ加えて、ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒＪＮＲ−ＩＩ（アトー社製）で発光量（１０秒間の積算）を測定した。

［結果］
上記の通り、精製した融合タンパク質をＰＢＳに希釈し、ｃＡＭＰ（終濃度１００μＭ）の有無での発光量を測定した（図２９）。その結果、ｃＡＭＰが存在することで発光活性が上昇する融合タンパク質が存在することがわかった。ｃＡＭＰの有無による活性の差が特に大きかったのは、ＧＬ４＿Ｎ＿ＲＩα＿β１ＡＢ＿Ｃ（図２９ａ中「β１ＡＢ」）およびｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＲＩα＿αＡＢ＿Ｎであった（（図２９ｂ中「αＡＢ」）。

以上のように、本発明にかかる受容体相互作用検出方法およびサイクリックＡＭＰセンサータンパク質は、バイオ、製薬、医療など様々な分野で好適に用いることができる。

また、以上のように、本発明にかかる５ＨＴ２Ａ受容体とＤ１受容体の相互作用を検出するための発光タンパク質および解析方法は、バイオ、製薬、医療など様々な分野で好適に用いることができる。

１００発光観察システム
１０３容器（シャーレ）
１０４ステージ
１０６発光画像撮像ユニット
１０６ａ対物レンズ（発光観察用）
１０６ｂダイクロイックミラー
１０６ｃＣＣＤカメラ
１０６ｄスプリットイメージユニット
１０６ｅフィルターホイール
１０６ｆ結像レンズ
１１０画像解析装置
１１２制御部
１１２ａ発光画像撮像指示部
１１２ｂ発光画像取得部
１１２ｃ画像解析部
１１２ｄ解析結果出力部
１１４クロック発生部
１１６記憶部
１１８通信インターフェース部
１２０入出力インターフェース部
１２２入力装置
１２４出力装置

Claims

細胞において第１の受容体と第２の受容体との相互作用を検出する受容体相互作用検出方法であって、
前記第２の受容体の活性を示す指標となるレポータを含む前記細胞を作製する作製工程と、
前記作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から、発光させるための所定の処置を行うと共に前記第１の受容体に結合する所定の受容体結合物質を添加する処置および添加工程と、
前記処置および添加工程が行われた後の前記細胞の発光量を測定する測定工程と、
前記測定工程で測定した前記発光量に基づいて前記細胞内における前記第２の受容体の活性を解析する解析工程と、
前記解析工程で解析した前記第２の受容体の活性に基づいて、前記第１の受容体と前記第２の受容体との前記相互作用を検出する検出工程と、
を含むことを特徴とする受容体相互作用検出方法。
前記作製工程において、前記レポータは、サイクリックＡＭＰセンサータンパク質であり、
前記解析工程において、前記第２の受容体の活性はサイクリックＡＭＰの濃度であること、
を特徴とする請求項１に記載の受容体相互作用検出方法。
前記サイクリックＡＭＰセンサータンパク質は、前記細胞内のサイクリックＡＭＰと相互作用して発光するものであること、
を特徴とする請求項２に記載の受容体相互作用検出方法。
前記サイクリックＡＭＰセンサータンパク質は、ホタルのルシフェラーゼおよびＰＫＡ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＡ）のサイクリックＡＭＰ結合領域とからなる融合タンパク質であること、
を特徴とする請求項２または３に記載の受容体相互作用検出方法。
前記サイクリックＡＭＰ結合領域が、マウスのＰＫＡ−ＲＩα由来であることを特徴とする請求項４に記載の受容体相互作用検出方法。
前記サイクリックＡＭＰ結合領域が、２２０から２５０のアミノ酸残基の長さを有することを特徴とする請求項４または５に記載の受容体相互作用検出方法。
前記サイクリックＡＭＰ結合領域が、少なくとも２つのサイクリックＡＭＰ結合部位を含むことを特徴とする請求項４から６の何れか１項に記載の受容体相互作用検出方法。
前記サイクリックＡＭＰセンサータンパク質は、前記ルシフェラーゼのＮ末端側断片、前記ルシフェラーゼのＣ末端側断片および前記サイクリックＡＭＰ結合領域を含み、前記Ｎ末端側断片と前記Ｃ末端側断片とが前記サイクリックＡＭＰセンサータンパク質分子内で結合すると、前記ルシフェラーゼの発光酵素活性が回復することを特徴とする請求項４から７の何れか１項に記載の受容体相互作用検出方法。
前記サイクリックＡＭＰ結合領域が、配列番号３７または３９に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項４から８の何れか１項に記載の受容体相互作用検出方法。
前記作製工程において、前記細胞は前記第１の受容体と前記第２の受容体とを含有するものであること、
を特徴とする請求項１から９のいずれか１つに記載の受容体相互作用検出方法。
前記作製工程において、前記細胞は前記第１の受容体の遺伝子と前記第２の受容体の遺伝子とが導入されたものであること、
を特徴とする請求項１から９のいずれか１つに記載の受容体相互作用検出方法。
前記測定工程は、前記第２の受容体の活性に依存する発光標識の光子量を測定する光子量測定工程をさらに含むこと、
を特徴とする請求項１から１１のいずれか１つに記載の受容体相互作用検出方法。
前記測定工程は、前記第２の受容体の活性に依存する発光標識を撮像する撮像工程をさらに含むこと、
を特徴とする請求項１から１１のいずれか１つに記載の受容体相互作用検出方法。
前記撮像工程は、複数の異なる前記細胞に対して同時に実行され、
前記解析工程は、前記撮像工程で撮像した複数の発光画像を前記細胞ごとに照合する照合工程をさらに含むこと、
を特徴とする請求項１３に記載の受容体相互作用検出方法。
前記測定工程は繰り返し実行されること、
を特徴とする請求項１から１４のいずれか１つに記載の受容体相互作用検出方法。
前記第１の受容体は５ＨＴ２Ａ受容体であり、前記第２の受容体はＤ１受容体であること、
を特徴とする請求項１から１５のいずれか１つに記載の受容体相互作用検出方法。
前記処置および添加工程において、前記受容体結合物質はセロトニンであること、
を特徴とする請求項１６に記載の受容体相互作用検出方法。