JP5558106B2 - 凝固第ｖｉｉ因子関連ポリペプチドの皮下投与 - Google Patents

Description

本発明は、第ＶＩＩａ因子又は第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドにより冒されうる病状を予防又は処置する医薬を製造するための、第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドの使用に関し、ここで、該医薬は皮下又は筋肉内投与用のものである。

血液凝固は、最終的にフィブリン血餅を生じる種々の血液成分又は因子の複合的相互作用からなるプロセスである。一般に、凝固「カスケード」と称されるものに関与する血液成分は、それ自体が活性化凝固因子である、アクチベーターの作用によりタンパク質分解酵素に転換される酵素的に不活性なタンパク質である酵素前駆体又はチモーゲンである。このような転換を受けた凝固因子は、一般に「活性因子」と称され、末尾に小文字の「ａ」を加えて標記される(例えば第ＶＩＩａ因子)。

活性化第Ｘ因子(「Ｘａ」)は、プロトロンビンをトロンビンに転換させるのに必要とされ、トロンビンはついでフィブリン血餅形成の最終段階としてフィブリノーゲンをフィブリンに転換する。第Ｘ因子の活性化を促進する２つの系又は経路が存在する。「内因的経路」は、血漿中にのみ存在する因子の利用を通してトロンビン形成に至る反応を意味する。一連のプロテアーゼ媒介活性化により、最終的に第ＩＸａ因子が生じ、これが、第ＶＩＩＩａ因子と共に、第Ｘ因子をＸａに切断する。同一のタンパク質分解が、血液凝固の「外因的経路」において、第ＶＩＩａ因子とその補助因子の組織因子によりもたらされる。組織因子は膜結合タンパク質であり、通常は血漿中は循環しない。しかしながら、血管破裂の際には、それは第ＶＩＩａ因子と複合体化し、Ｃａ^＋＋及びリン脂質の存在下で第Ｘ因子活性化又は第ＩＸ因子活性化を触媒しうる。ホメオスタシスにおける２つの凝固経路の相対的な重要性は明らかではないが、近年、第ＶＩＩ因子と組織因子が、血液凝固の調節において中枢的役割を担っていることが見出された。

第ＶＩＩ因子は、単鎖チモーゲンとして血液中を循環する微量の血漿糖タンパク質である。チモーゲンは触媒的に不活性である。単鎖第ＶＩＩ因子は、インビトロで、第Ｘａ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＩＸａ因子又はトロンビンにより、２本鎖第ＶＩＩａ因子に転換され得る。第Ｘａ因子は、第ＶＩＩ因子の主たる生理学的アクチベーターであると考えられている。ホメオスタシスに関与する幾つかの他の血漿タンパク質と同様、第ＶＩＩ因子はその活性についてビタミンＫに依存しており、これは、タンパク質のアミノ末端でクラスター化する多くのグルタミン酸残基のγ-カルボキシル化に必要とされる。これらのγ-カルボキシル化グルタミン酸は、第ＶＩＩ因子とリン脂質との金属結合相互作用に必要である。

チモーゲン第ＶＩＩ因子の活性化２本鎖分子への転換は、分子のほぼ中間に位置する内部ペプチド結合が切断されることにより生じる。ヒト第ＶＩＩ因子において、活性化切断部位はＡｒｇ_１５２-Ｉｌｅ_１５３である。組織因子、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下で、２本鎖第ＶＩＩａ因子は、タンパク質限定加水分解により、第Ｘ因子又は第ＩＸ因子を素早く活性化させる。

組換えヒト第ＶＩＩａ因子(ｒＦＶＩＩａ)は、第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子に対する中和抗体を生じる血友病患者の処置に有用である活性化凝固因子である。第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子の投与により、重篤な血友病患者の約３０％に重篤な抗体形成が生じる。ｒＦＶＩＩａの作用(第Ｘ因子を介した凝固系の活性化)により、体の血管区画に影響が及ぶ。現在まで、ｒＦＶＩＩａの投与経路は静脈内である。相対的に半減期が短い結果、投与は、通常は２．５〜３時間毎に繰り返されなければならない。投与間隔を長くすることができる、長時間持続する吸収相を有する適切なバイオアベイラビリティに至る投与の代替形態により、自己投与が可能となり、よって患者にとっての利便性が増加する。

第ＶＩＩａ因子は、約５０ｋＤａの分子量を持つ糖タンパク質である。第ＶＩＩａ因子は、常套的には、血友病Ａ又はＢ患者に、予防的(例えば、計画されている手術を予想して)又は出血症状(bleeding episodes)に応じて、静脈内送達されている。このような静脈注射の繰り返し使用は、病気を制御するためには必要なことではあるが、副作用を起こすおそれがある。注射の繰り返しにより、注射部位の静脈が線維状になり又は閉塞され、高齢者を処置する場合は、特に緊急の問題に至るおそれがある。また、乳児／幼児／小児等、静脈が小さい場合、必要な治療的用量を注射するために、静脈に針を挿入することが医師／親にとって困難である場合がある。静脈内投与に対する更なる障害は、注入に必要な時間が長く、患者が子供の場合は問題となりかねない。

凝固第ＶＩＩＩ因子(１７０-３００ｋＤａ)及び第ＩＸ因子(６０ｋＤａ)は、単鎖チモーゲンの形態で皮下投与されてよく、すなわちポリペプチドは、未だ活性化されていない。これらの非活性化形態は、非常に素早く分解される活性化(切断)形態よりも、さらに安定している。

第ＶＩＩａ因子は、出血性疾患、特に凝固因子欠乏症に起因する出血性疾患(血友病Ａ及びＢ)、又は凝固因子インヒビター、又は血友病Ａ又はＢを被っていない患者、例えばフォンウィルブランド病を被っている患者における出血性疾患を制御するための、哺乳動物、特にヒトへの投与に有用である。フォンウィルブランド病を患っている患者は、フォンウィルブランド因子タンパク質を欠いているか、又は異常なフォンウィルブランド因子タンパク質を有しているため、不完全な一次止血となる。また、出血性疾患は、血液凝固カスケードが正常に機能している患者にも見られ、血小板機能の欠失、血小板減少症、又は知られていない理由に起因する場合もある。さらにＦＶＩＩａは、他の患者における過度の出血、例えば組織損傷、特に手術又は外傷に関連し、中でも組織因子(ＴＦ)に富む組織での出血を予防又は処置するのに使用されてもよい。ＦＶＩＩａは、出血が拡散している、また現在の止血技術及び治療に対する応答性が低い(例えば、出血性胃炎及び大量の子宮出血)の場合も使用されてよい。さらにＦＶＩＩａは、脳、内耳領域、眼等の機械的止血の可能性が制限されており、種々の器官からバイオプシーを取り出すプロセスに関連する器官、及び腹腔鏡手術において生じた出血の処置にも適している。

国際出願第９３／０７８９０号は、皮下注射によるＦＩＸを用いた血友病の処置に関する。
国際出願第９５／２６７５０号は、血友病Ａ又はＢを処置するための、皮下注射に適したＦＶＩＩＩ又はＦＩＸの処方に関する。
国際出願第９５／２８９５４号は、保存及び皮下注射に適したＦＩＸの濃縮製剤に関する。

図１は、ミニブタに皮下投与した後の研究化合物についての、時間(ｈ)の関数としての血漿濃度ＥＬＩＳＡ(ｎｇ／ｍｌ)を示す(平均±ＳＤ、ｎ＝２)(１：２)。 図２は、ミニブタに皮下投与した後の研究化合物についての、時間(ｈ)の関数としての血漿ＦＶＩＩａ等価物血餅濃度(ｎｇ／ｍｌ)を示す(平均±ＳＤ、ｎ＝２)(１：２)。 図３は、マウスに皮下投与した後の研究化合物についての、時間(ｈ)の関数としての、ＥＬＩＳＡを介して測定した場合の血漿ＦＶＩＩａ濃度(ｎｇ／ｍｌ)を示す(平均±ＳＤ)。 図４は、マウスに皮下投与した後の研究化合物についての、時間(ｈ)の関数としての、血漿凝固活性(ｎｇ／ｍｌ)を示す(平均±ＳＤ)。

本発明は、出血症状を予防又は処置する方法を提供するものであり、該方法は、投与の皮下又は筋肉内経路を介して、第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドを、このような処置に有効な量、このような処置を必要とする患者に投与することにより実施される。
本発明の第２の態様は、出血症状を予防又は処置する医薬を調製するための、第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドの使用に関し、該調製は皮下又は筋肉内径路を介しての投与に適している。
本発明の第３の態様は、(ｉ)製薬用製剤中の第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチド、及び(ｉｉ)出血症状を予防又は処置するために、皮下又は筋肉内経路を介して投与するための説明書を含む、キットのパーツに関する。

幾つかの実施態様では、第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドは、第ＶＩＩａ因子のアミノ酸配列変異体である。幾つかの実施態様では、第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドは、野生型第ＶＩＩａ因子、又は分子のポリペプチド部分に共有結合又は非共有結合して付加的な化学的部分が導入されることで修飾された第ＶＩＩａ因子の配列変異体である。結合は、ポリペプチド部分に直接なされても、あるいは例えばオリゴ糖部分を介して間接的になされてもよい。幾つかの実施態様では、第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドは、ペグ化により修飾されており、ここで、一又は複数のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)基はポリペプチド鎖に直接(例えば、システイン残基に結合することにより)に、又はタンパク質結合オリゴ糖を介してコンジュゲートしている。幾つかの実施態様では、第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドは、野生型(無修飾)第ＶＩＩａ因子のバイオアベイラビリティの少なくとも約１２５％のバイオアベイラビリティを示す。

(発明の詳細な記載)
本発明は、第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチド、すなわち治療的用途を高めるために野生型第ＶＩＩａ因子に対して修飾されたポリペプチドを、皮下又は筋肉内投与することを含む。このような第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドは、皮下経路を介して効果的に投与され、例えば出血等の第ＶＩＩａ因子応答性症候群を予防及び／又は処置するための治療的に有益な方法を提供可能であることが見出された。

第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチド
野生型ヒト第ＶＩＩ因子は、米国特許第４７８４９５０号に開示されているアミノ酸配列を有するポリペプチド(配列番号：１)である。「第ＶＩＩａ因子」及び「第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチド」なる用語は、それらのそれぞれの生物活性形態が生じるように、タンパク質分解的にプロセシングされたポリペプチドを含むことを意図している。典型的には、第ＶＩＩ因子は、残基１５２と１５３の間が切断されて、第ＶＩＩａ因子が生じる。

血液凝固における第ＶＩＩａ因子の生物活性は、(ｉ)組織因子(ＴＦ)へ結合し、(ｉｉ)第ＩＸ因子又は第Ｘ因子のタンパク質分解的切断を触媒して、活性化第ＩＸ因子又はＸ(それぞれ第ＩＸａ因子又は第Ｘａ因子)を生成する能力に由来する。本発明の目的において、第ＶＩＩａ因子の生物活性は、例えば米国特許第５９９７８６４号に記載されているように、第ＶＩＩ因子欠損血漿及びトロンボプラスチン(又は組換えＴＦ)を使用し、血液凝固を促進させる調製物の能力を測定することにより定量されうる。このアッセイでは、生物活性はコントロールサンプルに対する凝固時間の減少度として表され、１単位／ｍｌの第ＶＩＩ因子活性を有するプール化ヒト血清標準体と比較することにより、「第ＶＩＩ因子単位」に転換される。またＦＶＩＩａ活性は、既知のタンパク質濃度及び既知の比活性を有する参照物質に対して測定された場合、ｍｇ／ｍｌで表してもよい。また、第ＶＩＩａ因子の生物活性は、(ｉ)第Ｘ因子、及び脂質膜に包埋したＴＦを含む系において、第Ｘａ因子を生成する第ＶＩＩａ因子の能力を測定し(Perssonら, J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997)；(ｉｉ)水系中における第Ｘ因子の加水分解度を測定し；(ｉｉｉ)表面プラズモン共鳴ベースの装置を使用し、ＴＦに対するその物理的結合を測定し(Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997)；(ｉｖ)合成基質の加水分解度を測定することにより定量されうる。何れの方法も、その方法が上述した方法のいずれかと相関し、よってアッセイユニットを調節可能な場合は、第ＶＩＩａ因子活性の定量に使用されうることが理解されるであろう。

本発明で使用される第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドは、次の点の一又は複数において野生型第ＶＩＩａ因子とは異なるポリペプチドを含む：(ｉ)アミノ酸配列に変異を含む(修飾されたアミノ酸の導入を含む)；及び／又は(ｉｉ)ポリペプチド部分に共有結合又は非共有結合した付加的な化学的部分が導入されて修飾されている。第ＶＩＩ因子のこのような変異は、安定性、リン脂質結合性、改変された比活性等を含む、ヒト第ＶＩＩ因子とは異なる性質を示し得る。

第ＶＩＩ因子変異体の非限定的な例には、Ｓ５２Ａ-ＦＶＩＩａ、Ｓ６０Ａ-ＦＶＩＩａ(Linoら, Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998)；米国特許第５５８０５６０号に開示されたような増加したタンパク質分解安定性を示すＦＶＩＩａ変異体；残基２９０と２９１の間、又は残基３１５と３１６の間が、タンパク質分解的に切断された第ＶＩＩａ因子(Mollerupら, Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995)；第ＶＩＩａ因子の酸化形態(Kornfeltら, Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999)；ＰＣＴ／ＤＫ０２／００１８９(国際公開第02/077218に相当)に開示されているＦＶＩＩ変異体；及び国際公開第０２／３８１６２号に開示されたような増加したタンパク質分解安定性を示すＦＶＩＩ変異体(Scripps Research Institute)；国際公開第９９／２０７６７号、米国特許第６０１７８８２号及び米国特許第６７４７００３号、米国特許出願第２００３０１００５０６号(ミネソタ大学)及び国際公開第００／６６７５３号、米国特許出願第２００１００１８４１４号、米国特許第２００４２２０１０６号、及び米国特許第２００１３１００５号、米国特許第６７６２２８６号及び米国特許第６６９３０７５号(ミネソタ大学)に開示されたような高められた膜結合性を示し、修飾されたＧｌａ-ドメインを有するＦＶＩＩ変異体；及び国際公開第０１／５８９３５号、米国特許第６８０６０６３号、米国特許出願第２００３００９６３３８号(Maxygen ApS)、国際公開第０３／９３４６５号(Maxygen ApS)、国際公開第０４／０２９０９１号(Maxygen ApS)、国際公開第０４／０８３３６１号(Maxygen ApS)、及び国際公開第０４／１１１２４２号(Maxygen ApS)、並びに国際公開第０４／１０８７６３号(Canadian Blood Services)に開示されたようなＦＶＩＩ変異体が含まれる。

ＦＶＩＩ変異体の非限定的例には、国際公開第０１／８３７２５号、国際公開第０２／２２７７６号、国際公開第０２／０７７２１８、ＰＣＴ／ＤＫ０２／００６３５(国際公開第０３／０２７１４７号に相当)、デンマーク特許出願第ＰＡ２００２ ０１４２３号(国際公開第０４／０２９０９０号に相当)、デンマーク特許出願第ＰＡ２００１ ０１６２７号(国際公開第０３／０２７１４７号に相当)に開示されたＦＶＩＩ変異体；国際公開第０２／３８１６２号(スクリップス研究所)；日本国特許第２００１０６１４７９号に開示されているような高められた活性を有するＦＶＩＩａ変異体(財団法人化学及血清療法研究所)が更に含まれる。

第ＶＩＩａ因子配列変異体の非限定的例には：Ｌ３０５Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ、Ｌ３０５Ｉ、Ｌ３０５Ｔ、Ｆ３７４Ｐ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３３７Ａ、Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ１５７Ａ、Ｅ２９６Ｖ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ、及びＳ３３６Ｇ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｈ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ、Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｈ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｑ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｔ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ、Ｆ３７４Ｙ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｔ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｄ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｓ５２Ａ-第ＶＩＩ因子、Ｓ６０Ａ-第ＶＩＩ因子；Ｒ１５２Ｅ-第ＶＩＩ因子、Ｓ３４４Ａ-第ＶＩＩ因子、及びＰ１１Ｑ／Ｋ３３Ｅ、Ｔ１０６Ｎ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ、Ｖ２５３Ｎ、Ｒ２９０Ｎ／Ａ２９２Ｔ、Ｇ２９１Ｎ、Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ／Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ；及び２３３Ｔｈｒから２４０Ａｓｎのアミノ酸
配列に置換、付加又は欠失を有するＦＶＩＩ、３０４Ａｒｇから３２９Ｃｙｓのアミノ酸配列に置換、付加又は欠失を有するＦＶＩＩがさらに含まれる。

本発明で使用される野生型第ＶＩＩａ因子又は第ＶＩＩａ因子配列変異体の修飾には、限定されるものではないが、例えば一又は複数のアルキル化、グリコシル化、ペグ化、アシル化、ホスホリル化、硫酸化、又は他のエステル形成又はアミド形成等、化学的及び／又は酵素的修飾が含まれる。具体例には、限定されるものではないが、ペグ化した野生型ヒト第ＶＩＩａ因子、システイン-ペグ化されたヒト第ＶＩＩａ因子、及びそれらの変異体が含まれる。第ＶＩＩ因子誘導体の非限定的例には、国際公開第２００５／０１４０３５号(Novo Nordisk A/S)；国際公開第０３／３１４６４号及び米国特許第２００４００４３４４６号、米国特許第２００４００６３９１１号、米国特許第２００４０１４２８５６号、米国特許第２００４０１３７５５７号、及び米国特許第２００４０１３２６４０号(Neose Technologies, Inc.)に開示されたグリコペグ化ＦＶＩＩ誘導体；国際公開第０１／０４２８７号及び米国特許出願第２００３０１６５９９６号、国際公開第０１／５８９３５号、国際公開第０３／９３４６５号(Maxygen ApS)、国際公開第０２／０２７６４号、米国特許出願第２００３０２１１０９４号(ミネソタ大学)に開示されている他のＦＶＩＩコンジュゲートが含まれる。

ペグ化されたヒト第ＶＩＩａ因子には、一又は複数のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分が結合された任意の第ＶＩＩａ因子が含まれる。ＰＥＧ部分は、第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの任意のアミノ酸残基又は炭水化物部分を含む、第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの任意の部分に結合しうる。「システイン-ペグ化ヒト第ＶＩＩａ因子」なる用語は、ヒト第ＶＩＩａ因子に導入されたシステインのスルフヒドリル基に結合したＰＥＧ分子を有する第ＶＩＩａ因子を称し、第ＶＩＩａ因子配列変異体を形成する。

一実施態様では、本発明で使用される第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドは、ポリペプチド部分に共有結合又は非共有結合される付加的な化学的部分を導入することで修飾されている。一実施態様では、このような付加的な化学的部分は、デンドリマー、ポリアルキレングリコール(ＰＡＧ)を含むポリアルキレンオキシド(ＰＡＯ)、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)及びポリプロピレングリコール(ＰＰＧ)、分枝状ＰＥＧ、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリカルボキシラート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン・無水マレイン酸共重合体、ポリスチレン・無水マレイン酸共重合体、デキストラン、カルボキシメチル-デキストランからなる列挙から選択される。

一実施態様では、本発明で使用される第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドは、分枝状であってもよい、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を導入されることで修飾されている。一実施態様では、ポリエチレングリコールは、２−１００ＫＤａ、例えば４−４０ＫＤａ、例えば５ＫＤａ、１０ＫＤａ、２０ＫＤａ、又は４０ＫＤａの平均分子量を有する。

本発明で使用される第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドには、上述したような一又は複数の凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、又はＴＦ結合アッセイで試験した場合に、同じ細胞型において生産される第ＶＩＩａ因子の比活性の少なくとも約５％、例えば少なくとも約２５％、例えば少なくとも約５０％、７５％及び９０％を示すものが含まれる。野生型第ＶＩＩ因子に対して実質的に改変された生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異体には、限定されるものではないが、ＴＦ非依存性第Ｘ因子タンパク質分解活性を示す第ＶＩＩ因子変異体が含まれる。

薬物動態学的変異体
一連の実施態様では、本発明で使用される第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドには、一又は複数の薬物動態特性が、野生型第ＶＩＩａ因子に対して変化しているものが含まれる。
本発明の実施の際に、薬物動態特性は、例えばWinNonlin Professional Version 3.1 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA)を使用して算出することができる。一つを越える値が存在するならば、各時点での平均濃度値を使用して計算が実施される。

以下の式を使用して、次の薬物動態学的パラメータが算出される：ＡＵＣ、ＡＵＣ_{％Ｅｘｔｒａｐ}、Ｃ_ｍａｘ、ｔ_ｍａｘ、λ_ｚ、ｔ_１／２、ＣＬ、及びＶ_ｚ：
ＡＵＣ 時間０から無限大までの、血漿濃度-時間曲線下の面積。無限大まで、
外挿法を用いた線形／ｌｏｇ台形公式を使用して算出。
線形台形公式は時間０からｔ_ｍａｘまで使用する：

ｌｏｇ台形公式は時間ｔ_ｍａｘから最終時点ｔまで使用する：

無限大までの外挿は次式を使用して実施する：

ＡＵＣ_{％Ｅｘｔｒａｐ}
最終濃度から無限大までの外挿法のためのＡＵＣの百分率：

Ｃ_ｍａｘ 時間０まで逆外挿した最大血漿濃度
ＣＬ 全身クリアランス

ｔ_ｍａｘ 最大血漿濃度が観察される時間
ｔ_１／２ 半減期：

λ_ｚ 消失速度定数。(平均)濃度対時間のｌｏｇ-線形回帰により算出
Ｖ_ｚ 消失期に基づく分布容積：

有用な第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドの非限定的例には、吸収とクリアランスとの間の比率が改変されて、増加したＡＵＣ及び／又はｔ_１／２をもたらすものが含まれる。
幾つかの実施態様では、第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドは、修飾により、吸収とクリアランスとの間の比率が変化し、野生型第ＶＩＩ因子のバイオアベイラビリティの少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、又は５００％のバイオアベイラビリティの増加を示すものである。

化合物の調製
本発明での使用に適した精製されたヒト第ＶＩＩａ因子は、好ましくは、例えばHagenら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83: 2412-2416, 1986に記載されたように、又は欧州特許第２００４２１号(ZymoGenetics)に記載されたように、ＤＮＡ組換え技術により作製される。
ここに記載された第ＶＩＩ因子変異体は、組換え核酸技術により生産されてもよい。一般に、クローン化された野生型第ＶＩＩ因子核酸配列が、所望のタンパク質をコードするように改変される。ついで、この改変された配列は発現ベクターに挿入され、これが宿主細胞中で形質転換されるか又は形質移入される。高等真核細胞、特に培養された哺乳動物細胞が、宿主細胞として好ましい。ヒト第ＶＩＩ因子に対する完全長ヌクレオチド及びアミノ酸配列は公知である(組換えヒト第ＶＩＩ因子のクローニング及び発現が記載されている米国特許第４７８４９５０号を参照)。ウシ第ＶＩＩ因子配列は、Takeyaら, J. Biol. Chem. 263:14868-14872 (1988))に記載されている。第ＶＩＩａ因子配列変異体を生産するために任意の一般的な技術を使用することができることは理解されるであろう。

また第ＶＩＩ因子は、Broze及びMajerus, J. Biol.Chem. 255 (4): 1242-1247, 1980、Hedner及びKisiel, J. Clin.Invest. 71: 1836-1841, 1983により記載されている方法により製造することができる。これらの方法は、検出可能な量の他の血液凝固因子を伴わずに第ＶＩＩ因子を生じせしめる。更に精製された第ＶＩＩ因子調製物は、最終精製工程として更なるゲル濾過を含ませることにより得ることができる。

野生型第ＶＩＩａ因子又は第ＶＩＩａ因子配列変異体の化学的及び／又は酵素的修飾は、当該分野で知られている任意の手段により達成され得る。適切な修飾には、限定されるものではないが、欧州特許出願第０６１２００００号(Novo Nordisk A/S)に記載の化学的グリカン修飾、国際公開第２００６０１３２０２号に記載のＣ末端修飾、国際公開第２００６０３５０５７号に記載のグリコシルトランスフェラーゼ媒介性修飾、国際公開第２００５０１４０４９号に記載のデンドリマー修飾、カルボキシペプチダーゼ媒介性末端修飾(例えば、国際公開第２００５０３５５５３Ａ２号、国際公開第９５２００３９Ａ号、及び国際公開第９８３８２８５Ａ号に記載)、トランスグルタミナーゼ媒介性修飾(例えば、国際公開第２００５０７０４６８号に記載)、自己触媒／エンドペプチダーゼ媒介性ペプチド転移(例えば、国際公開第２００６０１３２０２Ａ２号に記載)；チオール媒介性修飾(例えば、国際公開第２００２０７７２１８号及びＰＣＴ／ＥＰ／２００６０６３３１０に記載)、及びアミン媒介性修飾(例えば、国際公開第０２／０２７６４号に記載)が含まれる。

第ＶＩＩ因子及び第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、第ＸＩＩａ因子又はトリプシン様特異性を有する他のペプチダーゼ、例えば、第ＩＸａ因子、カリクレイン、第Ｘａ因子、及びトロンビンを使用し、タンパク質分解的切断により活性化されうる。例えば、Osterudら, Biochem. 11:2853 (1972); Thomas, 米国特許第４４５６５９１号；及びHednerら, J. Clin. Invest. 71:1836 (1983)を参照。また第ＶＩＩ因子は、イオン交換クロマトグラフィー用カラム、例えばMono Q(登録商標)(Pharmacia)等に通過させることにより、活性化されてもよい。ついで、得られた活性化第ＶＩＩ因子は、以下に記載するようにして、製剤化され、投与されうる。

医薬投与
ここに記載したようなＦＶＩＩａで処置するための任意の患者用のレジメンは、当業者により決定されるべきである。治療において投与される用量は、多くの要因、例えば患者の体重及び状態に依存し、治療マトリックス中の異なった点を調べ、臨床成績に相関させることにより、決定されうる。

一連の実施態様では、第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドは、皮下的に、ｋｇ体重当たり約１００−１０００００単位の量、例えば体重ｋｇ当たり約２５０−２５０００単位の量で、約５−５００μｇ／ｋｇに相当する量が投与される。

本発明の実施の際には、第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドは、出血の予防又は処置のための単一用量有効量を含む単一用量として、又は出血の予防又は処置のための有効量を含む一連の段階的用量で、患者に投与されうる。第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドの有効量とは、単一用量で又は複数回用量の総計で、もしくは任意の他の種類の定められた処置レジメンの一部として投与される場合に、出血に関連した少なくとも一の臨床的パラメータにおいて測定可能な程度の改善性を生じせしめる第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの量を意味する。異なる活性度を有する第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドが投与される場合、有効量は、既知の第ＶＩＩａ因子ポリペプチドと、第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドの一又は複数の生物学的特性(例えば凝固活性及び／又は一又は複数の薬物動態特性)を比較し、既知の第ＶＩＩａ因子ポリペプチドについての予め決められた有効量に対して比例的に、投与される量を調節することにより決定しうる。

単一用量の投与とは、約５分未満の期間で、ボーラスとして、第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドの全用量を投与することを意味する。幾つかの実施態様では、投与は、約２．５分未満、中でも約１分未満の期間でなされる。典型的には、単一用量有効量は、野生型第ＶＩＩａ因子と比較して、少なくとも約４０μｇ／ｋｇのヒト第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチド、例えば少なくとも約５０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、又は９０μｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１５０μｇ／ｋｇの第ＶＩＩａ因子を含む。

幾つかの実施態様では、単一用量の第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドの投与に続き、被験者は、少なくとも約３０分の間は、さらなる第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドを投与されない。幾つかの実施態様では、投与後の間隔は、少なくとも約４５分、例えば少なくとも約１時間、少なくとも約１．５時間、又は少なくとも約２時間である。

他の実施態様では、被験者は次のレジメンに従い、第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドを受容する：(ｉ)被験者は、少なくとも約４０μｇ／ｋｇを含む第１の量の第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドを受容し；(ｉｉ)少なくとも約３０分の期間後、第２の量の第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドが投与され、該量は少なくとも約４０μｇ／ｋｇを含み；(ｉｉｉ)第２の量の投与の少なくとも約３０分の期間後、第３の量の第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドが投与され、該量は少なくとも約４０μｇ／ｋｇを含む。ついで、 第３の量の投与の後、少なくとも約３０分の期間後、被験者は、少なくとも約４０μｇ／ｋｇを含む更なる(第４)の量の第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドを受容しうる。

他の実施態様では、第１の量の第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドは、少なくとも約４０μｇ／ｋｇ、例えば少なくとも約８０μｇ／ｋｇ、例えば少なくとも約１００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１５０μｇ／ｋｇ、又は少なくとも２００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも３００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも５００μｇ／ｋｇを含み；他の実施態様では、第２の量の第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドは、少なくとも約７５μｇ／ｋｇ、例えば少なくとも約９０μｇ／ｋｇを含み；他の実施態様では、第３(及び場合によっては第４)の量の第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドは、少なくとも約７５μｇ／ｋｇ、例えば少なくとも約９０μｇ／ｋｇを含む。
一実施態様では、第１の用量は約２００μｇ／ｋｇ、第２の用量は約１００μｇ／ｋｇ、及び第３の用量(及び場合によっては第４)の用量は約１００μｇ／ｋｇを含む。

他の実施態様では、被験者は、第１の投与から少なくとも約４５分、例えば少なくとも約１時間、少なくとも約１．５時間、少なくとも約２時間、少なくとも約２．５時間、又は少なくとも約３時間の期間後、第２の量の第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドを受容する。
一実施態様では、被験者は、約２００μｇ／ｋｇを含む第１の用量を受容し；被験者は、約１時間の期間後、１００μｇ／ｋｇを含む第２の用量を受容し、第１の用量から約３時間の期間後、被験者は、約１００μｇ／ｋｇを含む第３の用量を受容する。

併用療法：
本発明は、第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドと併せた付加的な薬剤の併用投与を含む。幾つかの実施態様では、付加的な薬剤には、限定されるものではないが、凝固因子、例えば第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｖ因子、第ＸＩ因子，又は第ＸＩＩＩ因子を含む血液凝固剤；又はＰＡＩ-１、アプロチニン、ε-アミノカプロン酸又はトラネキサム酸等、線維素溶解系のインヒビターが含まれる。

他の薬剤と第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドとの組合せの投与を含む実施態様では、第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドの用量はそれ自体で有効量を含み、付加的な薬剤により、患者に対する治療的有益性がさらに増すと理解されるであろう。あるいは、第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドと第２の薬剤との組合せは、併せて有効量を含みうる。また、有効量は、例えば投与のタイミング及び回数、投与方式、製剤等を含む、特定の処置レジメンで定められうると理解されるであろう。

医薬の製剤
静脈注射は、通常は５−２０ｍｌである。皮下に付与される注射は、０．０５から１ｍｌであることが、通常は好ましい。よって、ＦＶＩＩａ関連の濃度は、このような医薬においては、比較的高くしなければならない。
投与される容量は、０．０１ｍｌ以上、例えば０．１−２ｍｌ、０．２５−１．５ｍｌ、及び０．５−１ｍｌとすることができる。

ＦＶＩＩａ関連ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させる添加剤は、それ自体が適切な有機化合物、その塩、それ自体が有機化合物又はその塩を含有するエマルション又は分散液、例えば極性脂質の分散液、又はそれらの任意の組合せ又は一連の付加物である。本発明で有用な有機化合物は、例えばアミノ酸、ペプチド、タンパク質、及び多糖類である。ペプチドには、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、例えばコラーゲン及びゼラチンが含まれる。コラーゲン及びゼラチンは好ましくは加水分解されている。多糖類には、例えばキトサン、シクロデキストリン、デンプン、ヒアルロン酸、デキストラン、セルロース、及びそれらの任意の誘導体、それらの組合せ、及び／又は一連の付加物が含まれる。デンプンは好ましくは加水分解されている。エマルションには、分散相として油を含有する水中油型エマルション、及び連続相として油を含有する油中水型分散液が含まれる。油は、植物又は動物由来、もしくは合成的に生成させることができる。適切には、エマルションの植物性油は、大豆油又はベニバナ油、又はそれらの任意の組合せである。ＦＶＩＩａのバイオアベイラビリティを増加させる添加剤は、乾燥又は再構築の前に製剤に添加可能であり、又はＦＶＩＩａを含有する安定した溶液又は分散液に添加可能である。
投与前、一又は複数の水溶液又は分散液を、任意の混合物又はシーケンスで、安定した水溶液、分散液、又は乾燥した形態である本発明の医薬に添加することができる。

医薬は、乾燥した形態、好ましくは凍結乾燥とすることができる。投与前、乾燥した製品又は組成物は、水溶液又は分散液、例えば懸濁液、リポソーム製剤又はエマルションを用いて再構築することができる。また医薬は、投与用に準備が整った安定した水溶液とすることができる。さらにそれは、分散液、例えば懸濁液、リポソーム製剤又はエマルションとすることができる。
医薬は好ましくは皮下的に投与される。製剤におけるＦＶＩＩａ活性は、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．３ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、又は約６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌである。
また医薬は、等張液を得るために、一又は複数の塩、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌをさらに含有していてもよく、一又は複数の他の等張性を確立させる化合物を、好ましくは１．０ｍｇ／ｍｌ以上の量で含有していてもよい。
カルシウム、又は亜鉛等の他の二価の金属イオンは、ＦＶＩＩａ活性を維持するために必要なものとして使用されてよい。例えば、塩化カルシウムを添加してもよいが、他の塩、例えばグルコン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム(calcium glubionate)又はグルセプタン酸カルシウム(calcium gluceptate)も使用されてよい。医薬は、好ましくは０．１５ｍｇ／ｍｌ以上の量で、塩化カルシウムを含有する。

アミノ酸は、好ましくはバッファーに使用され、製剤が凍結乾燥されているならば、系及びそれは、タンパク質を保護する。適切なバッファーは、グリシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、又はグリシルグリシンとすることができ、好ましくはヒスチジンである。

また、非イオン性界面活性剤が医薬中に存在していてもよい。界面活性剤は、好ましくはブロック共重合体、例えばポロキサマー(poloxamer)、特にポリキサマー１８８、又はポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えばポリオキシエチレン-(２０)-ソルビタンモノラウラート又はポリオキシエチレン-(８０)-ソルビタンモノオレアートから選択される。好ましくは、ポリオキシエチレン-(８０)-ソルビタンモノオレアート(トゥイーン８０)である。トゥイーン８０は少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌの濃度で使用されることが好ましい。使用される場合、非イオン性界面活性剤は、上述した臨界ミセル濃度(ＣＭＣ)の量で好ましく存在すべきである。Wan及びLee, Journal of Pharm Sci, 63, p. 136, 1974を参照。

単糖類又は二糖類(例えばスクロース)、多糖類、例えば低分子量のデキストリン類、又は糖アルコール(例えば、ソルビトール、グリセロール、又はマンニトール)を添加してもよい。また医薬は、酸化防止剤、例えば亜硫酸水素塩、アスコルビン酸グルタチオン、アセチルシステイン、トコフェロール、メチオニン、ＥＤＴＡ、クエン酸、ブチルヒドロキシトルエン、及び／又はブチルヒドロキシアニソールをさらに含有していてもよい。さらに錯化剤、例えばＥＤＴＡ及びクエン酸は、それらがカルシウム又は他の二価の金属イオン、例えばｚｎ２＋よりも不安定な金属イオンに対して、より強い親和性を示す場合、ＦＶＩＩａ分子を安定化させるために低濃度で存在しうる。またさらに医薬は、シクロデキストリン、特にスルホアルキルエーテルシクロデキストリン(国際公開第2005023308号)を含有していてもよい。さらに、保存料、例えばベンジルアルコール、フェノール、ソルビン酸、パラベン類、ｍ-クレゾール及びクロロクレゾールを添加してもよい。

アジュバントは、一般的に０．００１〜４％ｗ／ｖの濃度で存在している。また医薬製剤は、プロテアーゼインヒビター、例えばアプロチニン又はトラネキサム酸を更に含みうる。

製剤のｐＨは、好ましくは２−９の間の値に調節される。約５．０〜約７．５のｐＨを有する調製物が好ましく、より好ましくは、約５．０〜約６．５のｐＨを有する調製物であり、最も好ましくは、約５．５〜約６．０のｐＨを有する調製物である。
好ましくは、ＦＶＩＩａ関連ポリペプチドは高度に精製され、すなわち４０ＩＵ／ｍｇ以上の比活性を有する。

一実施態様では、医薬は次のものからなる。
ｒＦＶＩＩａ-関連ポリペプチド ４ｍｇ／ｍｌ(３００００ＩＵ／ｍｌ)
塩化ナトリウム ５．８４ｍｇ／ｍｌ
ポリソルベート８０ ０．１ｍｇ／ｍｌ
塩化カルシウム,２Ｈ２Ｏ １．４７ｍｇ／ｍｌ
ヒスチジン １．３７ｍｇ／ｍｌ
ｐＨ６．０

本発明で使用可能な医薬組成物を調製するための一般的な技術は、例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 第19編, 1995に記載されている。
医薬は、例えば、細菌保持フィルターを通して濾過することにより、医薬に滅菌剤を導入することにより、医薬に照射することにより、又は医薬を加熱することにより、滅菌されうる。またそれらは、滅菌水、又は使用前又は使用直前に幾つかの他の滅菌された注射用媒体に溶解可能な、滅菌された固体状医薬の形態で製造することができる。
本発明は、以下の実施例により、さらに例証される。与えられる実施例は、本発明を例証するものであり、限定するものではないことを意味する。

実施例１：ミニブタへの皮下投与後の止血タンパク質の薬物動態
動物：
Ellegaard Gottingen Minipigs, Soro Landevej 302, DK4261, Dalmose, Denmarkからの、２０匹のオスのゲッティンゲンミニブタで実験を実施した。体重は６．９−１４．５ｋｇの範囲であった。毎日２回、動物に水と食物(２００ｇのアトロミン(Atromin)９０２３を毎日)を与えた。２１−２３℃に温度制御された室内で、１２時間サイクルの明時と暗時にて、研究を実施した。明時は６時から１８時とした。

薬剤及び化学：
ｒＦＶＩＩａ、ｒＦＶＩＩａ-５Ｋ ＰＥＧ、ｒＦＶＩＩａ-１０Ｋ ＰＥＧ、ｒＦＶＩＩａ-２０Ｋ ＰＥＧ、及びｒＦＶＩＩａ-４０Ｋ ＰＥＧを、投与に使用した(表１)。種々の試験用物質を、１０ｍＭのヒスチジン、１００ｍＭのＮａＣｌ、及び１０ｍＭのＣａＣｌ_２に希釈した。

実験設定：
試験用物質(ｎ＝２)(表１)を静脈内又は皮下に単一投与するために、動物を割り当てた。用量は、静脈内で０．２ｍｇ／ｋｇ体重、皮下で０．５ｍｇ／ｋｇ体重であり、これは静脈内で０．１ｍｌ／ｋｇ、皮下で０．２５ｍｌ／ｋｇに対応する。静脈内用量は、耳の静脈へ針又は短いカテーテルを介して投与され、２ｍｌの滅菌生理食塩水が続く。皮下注射を、頸部右側、耳から約５−７ｃｍ、及び頸部中央部から７−９ｃｍに与えた。針上のストッパーを用いて注射をし、針の０．４ｃｍを挿入させた。

血液及び組織サンプルの採取：
血液サンプルを、投与前、投与０．２５、０．５、１、２、３、４、６、８、１２、２４、３０、４８、５４、７２、８０、９６、１２０、１４４及び１６８時間後に取り出した。ｒＦＶＩＩａが投与されたミニブタからのサンプル採取を４８時間後に終了した。０．１２９Ｍのクエン酸ナトリウムが予め充填されたバキュテイナ(２ｍｌ)を使用して血液サンプルを収集し、最大１０分、室温で保持し、室温にて、４０００Ｇで５分間遠心分離した。遠心分離の直後、０．５ｍｌの血漿を２ｍｌのＳＰＡバッファーに希釈し、ゆっくりではあるが、完全に混合した。５００μｌに希釈された血漿をマイクロニック(Micronic)チューブに移し、ラックに配した。３×５００μｌに希釈された血漿を３つのエッペンドルフ管に移し、箱に配した。識別のために、全てのチューブに完全にラベルを付け、−８０℃で保存した。最後の血液サンプルの後、Zoletil 50 Vetを使用し、動物を沈静化させ、ペントバルビタール注射により屠殺し、処分した。

分析方法：
ｒＦＶＩＩａ及び類似体の濃度をＥＬＩＳＡにより、及び凝固アッセイにより活性を測定した。
ＥＬＩＳＡ：
アッセイは、高度な選択性を有し、ブタ血漿におけるｒｈＦＶＩＩａを測定するように修正されたこと以外は、DakoCytomationからの第ＦＶＩＩ因子ＥＩＡキットと基本的に同じである。簡単に述べると、希釈された血漿サンプル中のｒｈＦＶＩＩａ濃度を、サンプル中の同じ割合に対し、ブタ血漿が補填されたＳＰＡバッファーにおいて調製されたｒｈＦＶＩＩａの標準物質の列から測定した。ＥＬＩＳＡセットアップを、一方がｒｈＦＶＩＩａを捕捉するために供給され、他方が結合したｒｈＦＶＩＩａを検出する２つの抗ｒｈＦＶＩＩａモノクローナル抗体をベースにした直接２部位サンドイッチとした。ビオチン化された検出抗体を、捕捉抗体でコーティングされた９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、希釈された血漿サンプル又は標準物質と共にインキュベートした。次に、ウェルを洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンと共にインキュベートし、再度洗浄し、使用準備が整ったＴＭＢ／過酸化ペルオキシダーゼの有色基質と共にインキュベートした。最後に、Ｈ_３ＰＯ_４を添加することにより発色を停止させ、参照として６２０ｎｍと４５０ｎｍで光学密度を測定した。

凝固アッセイ：
ｒＦＶＩＩコンジュゲートのＦＶＩＩａ活性レベルを、Morriseyらに従い、修正ＦＶＩＩａ凝固アッセイを使用して分析した。
要するに、ｒＦＶＩＩａ変異体を、ＦＸａ又はＦＩＸａ^ｉによるＦＶＩＩの活性化を支持するのに失敗したが、ＦＶＩＩａに対する補因子活性を有する組織因子(可溶性ＴＦ、ｓＴＦ)の細胞外ドメインを使用する一段階凝固アッセイにおいて測定した。ｓＴＦ(ＴＦ１-２０９、ＬＯｄ１１３３８-１２５)、試験用サンプル、及び標準物質を、５０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、１％のＢＳＡ、ｐＨ７．４(ＴＢＳ／ＢＳＡ)バッファーに希釈した。標準物質(ｒＦＶＩＩａ、バルクＬＡＳＡ１３２００-００８−１．３１ｍｇ／ｍｌ、３２Ｕ／μｇ)を２-２００ｐＭの範囲に希釈し、サンプル中と同じ割合になるまで、標準物質をマウス血漿で補った。同量(２５μｌ)の希釈サンプル(又は標準物質)と先天的なＦＶＩＩ欠損血漿(Helena Biosciences)とを混合した。ウサギの脳のセファリン(ＲＢＣ、Heptest Laboratories Inc、１バイアルを１０ｍｌの０．９％ＮａＣｌにおいて再構成した)(５０μｌ)をｒＦＶＩＩａサンプル／欠損血漿に添加し、３７℃で２分、インキュベートした。５０μｌのｓＴＦ／ＣａＣｌ_２(ｓＴＦ、２９ｎＭ；ＣａＣｌ_２、４．２ｍＭ)を添加することにより、凝固を開始させた。凝固時間を記録し、ｌｏｇ-ｌｏｇスケールにおいてｒＦＶＩＩａの濃度に対してプロットし、線形回帰曲線を、回帰分析による対数変換データに適合させた。長時間作用する変異体についての凝固時間を、この較正曲線に基づき、ｒＦＶＩＩａ様濃度に(ｎＭ)に転換した。

結果の分析：
ＥＬＩＳＡ並びに凝固アッセイ分析からの結果を、ＰＣベースのソフトウェアＷｉｎＮｏｎｌｉｎ(Pharsight Corporation)を使用する、非コンパートメント薬物動態学的分析にかけた。

結果及び検討：
ＥＬＩＳＡ及び凝固アッセイの結果を添付Ａに付与する。図１及び図２は、研究化合物の時間プロファイルに対する、ＥＬＩＳＡを介して測定されたＦＶＩＩａ及び類似体の血漿濃度、及び凝固等価物活性の平均(±ＳＤ)をそれぞれ例証する。
血漿濃度及び活性プロファイル(図１及び図２)には、８時間(ＥＬＩＳＡ)及び５時間(凝固活性)の平均Ｔ_１／２(表３及び表４)に至る、ｒＦＶＩＩａの皮下投与と比較した、２０、６２、３３、１５８時間(ＥＬＩＳＡ)、及び１０、１２、１４及び２１時間(凝固活性)のＴ_１／２に至るＦＶＩＩａ-５Ｋ ＰＥＧ、ＦＶＩＩａ-１０Ｋ ＰＥＧ、ＦＶＩＩａ-２０Ｋ ＰＥｇ、ＦＶＩＩａ-４０Ｋ ＰＥＧの皮下投与後の、拡張吸収が示されている。

実施例２：マウスへの皮下投与後の止血タンパク質の薬物動態
動物：
tornbjergvej 40, Ejby, 4623 Ll. Skensvedからの、８２匹のオスのＮＭＲＩマウスにおいて、研究を実施した。動物は約３０ｇと計量され、実験期間中、食物及び水(アルトロミン(Altromin)１３２０)に自由に接近できるようにした。温度制御された室内で実験を実施した。

薬剤及び化学薬品：
ｒＦＶＩＩａ、ＦＶＩＩａ-５Ｋ ＰＥＧ、ＦＶＩＩａ-１０Ｋ ＰＥＧ、ＦＶＩＩａ-４０Ｋ ＰＥＧ、ＦＶＩＩａ-ＨＳＡ、及びｄｅｓ-ｇｌａ ＦＶＩＩａを、実験に含めた(表２)。ＦＶＩＩａ-ＨＳＡを１０ｍＭのグリシルグリシン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、０，０１％のトゥイーン８０、ｐＨ６．６に処方し、ＦＶＩＩａ-５Ｋ ＰＥＧ及びＦＶＩＩａ-４０Ｋ ＰＥＧを１０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ ６．０に処方し、ＦＶＩＩａ-１０Ｋ ＰＥＧを１０ｍＭのグリシルグリシン、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ６．０に処方した。
試験用品を使用するまで−８０℃で保存した。投与日、試験用品を解凍し、氷上で保存した。試験用品を、投与直前に室温にした。

実験設計：
動物に、表１に列挙された化合物を静脈内又は皮下への単一投与を受けさせた。少量の血液しかマウスから引き出すことはできず、よってマウスからの全てのプロファイル得ることはできなかった。以下に記載の研究において、血液サンプリングは、２−３のサンプルｐｒ．時点、及び２−３のサンプルｐｒ．マウスに基づき引き出される平均プロファイルを可能にする、少量サンプリングレジメンを含む。用量は、静脈内には尾部静脈に１−２ｍｇ／ｋｇ体重、皮下には頸部に７．８−１０ｍｇ／ｋｇとした。

分析方法：
ｒＦＶＩＩａの濃度をＥＬＩＳＡにより、及び凝固アッセイによりｃｐ-ＦＶＩＩａの活性度を測定した。
ＥＬＩＳＡ：
アッセイは、高度な選択性を有し、マウス血漿におけるｒｈＦＶＩＩａを測定するように修正されたこと以外は、DakoCytomationからの第ＦＶＩＩ因子ＥＩＡキットと基本的に同様である。簡単には、希釈された血漿サンプル中のｒｈＦＶＩＩａ濃度を、サンプル中の同様のパーセンテージに対し、マウス血漿が補足されたＳＰＡ-バッファーにおいて調製されたｒｈＦＶＩＩａの標準物質の列から測定した。ＥＬＩＳＡセットアップを、一方がｒｈＦＶＩＩａを捕捉するために供給され、他方が結合したｒｈＦＶＩＩａを検出する２つの抗ｒｈＦＶＩＩａモノクローナル抗体をベースにした直接２部位サンドイッチとした。ビオチン化された検出抗体を、捕捉抗体でコーティングされた９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、希釈された血漿サンプル又は標準物質と共にインキュベートした。次に、ウェルを洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンと共にインキュベートし、再度洗浄し、使用準備が整ったＴＭＢ／過酸化ペルオキシダーゼの有色基質と共にインキュベートした。最後に、Ｈ_３ＰＯ_４を添加することにより発色を停止させ、参照として６２０ｎｍと４５０ｎｍで光学密度を測定した。

凝固アッセイ：
ｒＦＶＩＩａコンジュゲートのｒＦＶＩＩａ活性レベルを、Morriseyらに従い、修正ＦＶＩＩａ-凝固アッセイを使用して分析した。
要するに、ｒＦＶＩＩａ変異体を、ＦＸａ又はＦＩＸａ^ｉｉによるＦＶＩＩの活性化を支持するのに失敗したが、ＦＶＩＩａに対する補因子活性を有する組織因子(可溶性ＴＦ、ｓＴＦ)の細胞外ドメインを使用する一段階凝固アッセイにおいて測定した。ｓＴＦ(ＴＦ１-２０９、ＬＯｄ１１３３８-１２５)、試験用サンプル、及び標準物質を、５０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、１％のＢＳＡ、ｐＨ７．４(ＴＢＳ／ＢＳＡ)バッファーに希釈した。標準物質(ｒＦＶＩＩａ−１．３１ｍｇ／ｍｌ、３２Ｕ／μｇ)を２-２００ｐＭの範囲に希釈し、サンプル中と同じ割合になるまで、標準物質をマウス血漿で補った。同量(２５μｌ)の希釈サンプル(又は標準物質)と先天的なＦＶＩＩ欠損血漿(Helena Biosciences)とを混合した。ウサギの脳のセファリン(ＲＢＣ、Heptest Laboratories Inc、１バイアルを１０ｍｌの０．９％ＮａＣｌにおいて再構成した)(５０μｌ)をｒＦＶＩＩａサンプル／欠損血漿に添加し、３７℃で２分、インキュベートした。５０μｌのｓＴＦ／ＣａＣｌ_２(ｓＴＦ、２９ｎＭ；ＣａＣｌ_２、４．２ｍＭ)を添加することにより、凝固を開始させた。凝固時間を記録し、ｌｏｇ-ｌｏｇスケールにおけるｒＦＶＩＩａの濃度に対してプロットし、線形回帰曲線を、回帰分析による対数変換データに適合させた。長時間作用する変異体についての凝固時間を、この較正曲線に基づき、ｒＦＶＩＩａ様濃度に(ｎＭ)に転換した。

結果の分析：
ＥＬＩＳＡ並びに凝固アッセイ分析からの結果を、ＰＣベースのソフトウェアＷｉｎＮｏｎｌｉｎ(Pharsight Corporation)を使用する、非コンパートメント薬物動態学的分析にかけた。

結果及び論議：
血漿濃度及び活性プロファイル(図３及び図４)には、ＥＬＩＳＡ及び凝固アッセイのそれぞれにおいて、８、１６、２４及び８時間、及び５、８、８及び８時間の平均Ｔ_ｍａｘに至る、Ｃ４０７を介して結合したＦＶＩＩａ-５Ｋ ＰＥＧ、ＦＶＩＩａ-１０Ｋ ＰＥＧ、ＦＶＩＩａ-４０Ｋ ＰＥＧ及びＦＶＩＩａ-ＨＳＡ ＰＥＧの皮下投与後の、拡張吸収相が示されている。皮下投与後のＦＶＩＩａの平均Ｔ_ｍａｘ値は、ＥＬＩＳＡ及び凝固活性の双方において３時間であった(表３及び表４)。静脈内投与後のものと比較して、皮下投与後は、Ｃ_ｍａｘ値及びＡＵＣがゆっくりと低下した(表３及び表４)。マウスにおける皮下投与後、Ｃ４０７を介して結合したＦＶＩＩａ-５Ｋ ＰＥＧ、ＦＶＩＩａ-１０Ｋ ＰＥＧ、ＦＶＩＩａ-４０Ｋ ＰＥＧ及びＦＶＩＩａ-ＨＳＡ ＰＥＧのＴ_１／２は、８．４、１４、５１、８．２時間(ＥＬＩＳＡ)、及び３．５、８．６、８．４、４．２時間(凝固活性)であり、ｃｐＦＶＩＩａについての３．４時間(ＥＬＩＳＡ)及び１．５時間(凝固活性)より大きかった。バイオアベイラビリティは、ＥＬＩＳＡ及び凝固活性のそれぞれについて、２３、７８、４５及び１７％、及び１２、１６、２６及び１３％と推定された(表３及び表４)。
表３及び表４には、それぞれＥＬＩＳＡ及び凝固アッセイのデータの非コンパートメント分析(ＮＣＡ)後の薬物動態学的パラメータを列挙する。

ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、その全内容がここに記載されているかの如く、特定の文献が別個にここの他の箇所で援用されているとしても、その全体が出典明示によりここに援用される(法律により許容される最大範囲)。
特に示さない限り、ここで提供される全ての正確な値は、対応する近似値の代表例である(例えば、特定の要因又は測定値に関して提供される全ての正確な例示的値は、適切な場合は、「約」により修飾される対応の近似測定値をまた提供するとみなすことができる)。

本発明の実施態様
１．出血症状を予防又は処置する方法であって、第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドを、このような処置に有効な量、このような処置を必要とする患者に投与することを含み、該投与が皮下又は筋肉内経路を介してなされる方法。
２．第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドが、第ＶＩＩａ因子のアミノ酸配列変異体である実施態様１に記載の方法。
３．第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドが、ポリペプチドに共有結合又は非共有結合した非ポリペプチド部分を含む実施態様１-２の何れかに記載の方法。
４．非ポリペプチド部分がＰＥＧである実施態様３に記載の方法。
５．第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドが、野生型第ＶＩＩａ因子のバイオアベイラビリティに対して、少なくとも約１２５％のバイオアベイラビリティを示す実施態様１-４の何れかに記載の方法。
６．第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドが皮下経路を介して投与される実施態様１-５の何れかに記載の方法。
７．出血症状を予防又は処置する医薬を調製するための、第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドの使用であって、該調製が皮下又は筋肉内径路を介しての投与に適している使用。
８．(ｉ)製薬用製剤中の第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチド、及び(ｉｉ)出血症状を予防又は処置するために、皮下又は筋肉内経路を介して投与するための説明書を含むパーツのキット。

Claims (4)

1. 出血症状の予防又は治療における使用のためのペグ化ヒト第ＶＩＩａ因子ポリペプチドであって、皮下又は筋肉内経路を介した投与のためのものであり、ポリエチレングリコール部分の平均分子量が４０ＫＤａであるペグ化ヒト第ＶＩＩａ因子ポリペプチド。
2. 皮下経路を介しての投与のためのものである請求項１に記載のペグ化ヒト第ＶＩＩａ因子ポリペプチド。
3. （ｉ）製薬用製剤中の請求項１に記載のペグ化ヒト第ＶＩＩａ因子ポリペプチドと、（ｉｉ）出血症状を予防又は治療するために皮下又は筋肉内経路を介して投与するための説明書を含むパーツのキット。
4. ポリエチレングリコール部分の平均分子量が４０ＫＤａであるペグ化ヒト第ＶＩＩａ因子ポリペプチドを含有してなり、皮下又は筋肉内経路を介して投与される、出血症状を予防又は治療するための医薬。

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