JP5541926B2 - 眼薬物送達用の新規生体材料ならびにその製造および使用方法 - Google Patents
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Description
有効な組織接着剤の探索は多くの製品をもたらしたが、それらは全て欠点を持っている。
局所薬物送達技術は機能によって分類することができる。徐放技術は活性医薬を長時間にわたって送達しようとするものである。薬物を物理的に捕捉するポリマー材料は、ある期間にわたって受動的送達をもたらすための手段になりうる。また、ポリマー材料は、安定性または溶解度の改善など、改善された特徴を与えることができる。多くの植え込み型装置の場合、薬物送達サイクルの終了時点において、ポリマーマトリックスは分解されるか、回収されるか、またはその場に残されうる。
皮膚充填剤は通例、ウシコラーゲン、ヒアルロン酸、ポリ乳酸、またはカルシウムヒドロキシルアパタイトから生産される。皮膚充填剤は、しわを減少させもしくは排除し、瘢痕陥凹を盛り上がらせ、唇を増大させ、または軟組織体積減少を補うために使用される。充填剤の注入は、通常、小さな針を使って遂行され、皮膚充填剤は処置を必要とする各しわまたは瘢痕中に注入される。多少の初期不快感および挫傷が体験されるが、そのような副作用は一般に極めて迅速に治まる。副作用は稀であるが、アレルギー反応、潰瘍形成、ヘルペス感染症の再活性化、細菌感染、限局性挫傷、および肉芽腫形成などを挙げることができる。時には材料の移動または「ビーズ化(beading)」が見られて、美容上満足できない結果をもたらす。体積の増加がもたらす利益は一般に、生物学的起源を持つ充填剤の場合で3〜6ヶ月間持続し、合成材料ではそれよりも多少長く持続する。産業界では、現在、充填剤材料の寿命および性能の改善ならびに有害副作用の減少が求められている。
キトサンは、エビ、ロブスター、およびカニを含む甲殻類の外骨格に由来するキチンの部分的脱アセチル化によって誘導されるカチオン性多糖である。その化学的性質は脱アシル化-(1,4)-N-アセチル-D-グルコサミンポリマーと記載するのが最も適切である。キトサンの接着性はかなり前から知られている。しかし、今までのところ、キトサンに基づく接着剤製品は生産されていない。これは、キトサンの取扱いが困難であり、高い酸濃度に起因する問題を伴うことなく組織に迅速に結合する形でそれを送達することは困難であることが、大きな理由である。USPTOデータベースでの検索によれば、「キトサン(chitosan)」および「接着剤(adhesive)」を含む要約または請求項を持つ特許は14件しかファイルされていなかった。これらの特許の大半は製紙業向けである。米国特許第5,773,033号にはフィブリノゲン/キトサン止血剤が開示されたが、これは組織結合用ではない。「生物学的組織用接着剤(Adhesive for Biological Tissue)」と題する米国特許第6,329,337号には、組換えヒト血漿タンパク質と二官能性または多官能性アルデヒドとから生産されるグルー剤が開示された。その薬剤では、溶液の粘度を高めるために、または二官能性もしくは多官能性アルデヒドと共に架橋試薬として、キトサンが使用された。米国特許第5,496,872号には、かなり網羅的な潜在的試薬の一覧中にキトサンが開示されたが、この特許は、結合をチオール、カルボン酸およびラジカルに頼っている。米国特許第6,200,595号には、潜在的医用接着剤として使用される、キトサンを含むポリカチオン性基体とポリアニオン性基体との組合せが開示された。この特許で報告された接着強さは70g-f/cm2を越えなかった。さらにこの発明では使用直前に2つの構成要素を混合する必要がある。米国特許第6,991,652号には、細胞成長用のマトリックスとして使用される数多くの潜在的材料の一覧中の一つとして、キトサンの使用が開示された。
「約」という用語は、そのパラメータが望ましい値の±10%以内であることを意味する。
本発明は、処理キトサン、修飾キトサン、修飾処理キトサン、またはその混合物もしくは組合せを含む生体材料を提供する。処理キトサンは、キトサンを水ならびにさまざまな塩類および/またはアニオン溶液に対して透析することによって調製される。これらの実施形態では、処理キトサンが、無処理キトサンから同定可能かつ再現可能に変化した構造コンフォメーションを持つ。結果として生じる処理キトサンは、無処理キトサンと比較して、化学的、物理的および/または性能的特性または特徴に変化を示す。修飾キトサンには、キトサン分子に一つ以上の官能基を共有結合で付着させることによる化学修飾を受けたキトサンが包含される。修飾キトサンには、一つ以上の別個の化学修飾因子(原子構造物または分子構造物)と非共有結合的に会合しているキトサンも包含される。修飾キトサンは、いくつかの別個の化学修飾因子(原子構造物または分子構造物)が同時添加されたキトサンも包含しうる。修飾キトサンは、上記3クラスの修飾キトサンの組合せまたは混合物も包含しうる。化学修飾因子は一般に、与えられた適用にとって望ましい挙動、特性または特徴をキトサンに付与するように選択される。本発明の組成物は、液体、ヒドロゲル、固体、薄膜、粒子、造形構造物、およびナノ粒子を含む(ただしこれらに限るわけではない)いくつかの物理的形態に製剤化することができる。
本発明は新規充填または増量材も提供する。
本発明は、概して、処理キトサン、修飾キトサン、修飾処理キトサンまたはその混合物を含むキトサン組成物を含む新規生体材料に関係する。処理には、少なくとも、キトサンのコンフォメーションおよび/または機能変化を引き起こすように設計された透析が含まれる。修飾には、少なくとも、(i)単一または複数の化学修飾因子または化学物質によるキトサンの共有結合的修飾、(ii)キトサンと単一または複数の化学物質との非共有結合的会合、(iii)単一または複数の化学物質のキトサンへの同時添加、あるいは(iv)その混合物または組合せが含まれる。化学物質または化学修飾因子は、原子構造物、例えば原子クラスター、量子ドット、もしくは他のナノ原子構造であるか、分子、分子構造物、または分子の集合体であることができる。
本発明者らが行った修飾キトサンの最初の試みは、ナフタルイミドで修飾されたキトサンを調製して、キトサン単独よりも大きな接着強さを示す光活性化材料をもたらすことだった。参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第10/982,197号を参照されたい。
本発明における使用に適したアミノ酸としては、α位に配置されたカルボキシル基とアミノ基とを含む任意の天然もしくは合成化合物、またはカルボキシル基とアミノ基とを含みポリペプチド鎖中に組み込まれうる任意の化合物、またはカルボン酸類似体もしくはアミノ基類似体を含む化合物であってポリペプチド鎖中に組み込まれうるものが挙げられるが、これらに限定されない。
キトサン溶解のための一般手法
キトサンを10%有機酸または非酸化性鉱酸溶液で可溶化した。使用した有機酸または非酸化性鉱酸は、本発明を製造するために使用したそれ以降のステップと、本発明の最終的適用とに依存した。限定するわけではないが、鉱酸には、HCl、硫酸、リン酸または他の任意の非酸化性鉱酸が含まれる。表1に、このプロセスに適した有機酸の選択肢の非限定的なリストを記載する。
処理済であるが無修飾のキトサンが望まれる場合には、合成プロトコールにおけるこのステップを省いた。修飾キトサンまたは修飾処理キトサンが望まれる場合は、表2の非限定的リストに示すいくつかの広範なカテゴリーに含まれるさまざまな化学物質を使って、処理キトサンを修飾することができる。これらの修飾は合成法中のさまざまな時点で行うことができる。これらの部分は、例えば限定するわけではないが、表2または実施例1〜4および6に記載の連結ケミストリーを使って、キトサン基質に共有結合付着させることができる。得られる修飾度は修飾ステップで添加される修飾因子の量によって決定された。修飾因子が液体でない場合は、それを適当な溶媒に溶解した。次に、撹拌したキトサンに修飾因子を滴下によってゆっくり加えた。選択した修飾因子に応じて、適当な期間にわたって、修飾因子をキトサンと混合させた。
塩基をキトサンサンプルにpHが9〜10になるまでゆっくり加えた(9と10の間で識別可能な変色を起こすpH試験紙を使用した)。キトサン溶液は極めて粘稠になったので、このステップ中の混合プロセスを助けるために、機械的混合に加えて、テフロン撹拌子も使用した。
10%(v/v)有機酸溶液の添加により、キトサンを酸に再可溶化した。再可溶化は一晩進行させた。全てのキトサンが溶解状態に戻ってから、塩基をゆっくり加えることにより、キトサンを再沈殿させた。完全な沈殿が、塩基性pH(9〜10)の達成とサンプル上清における顕著な粘性の欠如の両方によって示された。共有結合で修飾されたキトサンを含むキトサンをこのステップで沈殿させて、未反応の修飾試薬類を含む小分子を溶液中に残した。混合機をサンプルから取り除き、サンプルを遠心分離し(例えば385O×Gまたはキトサンを沈降させるのに十分なG力)、上清を捨てた。
遠心分離ステップで得た固形キトサンを透析チューブ(フラット径10mm、MWカットオフ12,000〜14,000)に移した。キトサンを10%(v/v)有機酸溶液に対して、固形物が再溶解するまで透析した。このステップでは最初のキトサン希釈に選択したものと同じ酸を使用した。しかし、最終生成物が使用される用途に応じて、酸は最初の溶解ステップで使用した酸とは異なる酸であってもよく、その選択は、以降の合成ステップに左右されるだろう。表1に考えうる酸選択肢の非限定的リストを示す。次に酸透析液を取り除き、水で置き換え、3時間以上透析する。次に、水をさらに2回取り替えて、水での洗浄を合計3回行った。少量のキトサンを透析チューブから取り出し、pH計を使ってpHを測定した。次に、透析液を緩衝塩溶液に変え、キトサンのpHが一般にpH5.7〜6.0の範囲になるまで、透析を監視した。透析に使用する緩衝塩溶液は、最終生成物の適用に基づいて選択した。考えうる緩衝塩溶液の非限定的リストを表4に記載する。所望のpH範囲が3時間で達成されない場合は、新たな緩衝塩溶液を使用した。次にキトサンを水に対して3回透析した(各洗浄を3時間以上続けた)。キトサンを透析チューブから取り出し、凍結乾燥フラスコ中で合わせた。上述の洗浄ステップはいずれも、1回の洗浄ステップまたは追加洗浄ステップを含むことができ、洗浄ステップあたりの洗浄回数は、必要性の問題というよりも、任意である。
透析したキトサンを含有するフラスコを-80℃のフリーザーに一晩入れた。次に試料を凍結乾燥し、使用するまで貯蔵した。
ある量の本発明の凍結乾燥キトサンを、所望の製剤濃度(PBSまたは他の適当な希釈剤1ミリリットルあたりのキトサンのミリグラム数で表す)を与えるであろう体積の滅菌リン酸緩衝食塩水(PBS;pH=7.4)または他の適当な希釈剤と混和することによって、最終製剤を調製した。サンプルを、滅菌前に、少なくとも4時間、またはその具体的最終製剤にとって適当な時間、可溶化させた。
キトサン製剤をオートクレーブ中で蒸気滅菌した。これは、サンプルバイアルをアルミニウム箔で覆い、オートクレーブ内部の水槽に入れることによって行った。滅菌後にサンプルを室温まで冷却させ、最終pHを測定した。望ましい製剤pHは約5〜約7である。ある実施形態では、pH範囲が約6〜約7である。別の実施形態では、pH範囲が約6.2〜約6.4である。
本発明の組成物の全てにおいて、単一修飾試薬または複数修飾試薬の添加によってキトサン特性のさらなる操作を達成することができ、その場合、それらの試薬は、意図する目的に合わせて調整された組成物が製造されるような性質を組成物に付与するように設計される。これらの添加は、合成法の全体にわたって、さまざまな時点で行うことができる。例えば組織接着剤の場合、添加剤は、抗微生物剤、抗ウイルス剤、成長促進剤、治癒を強化するための薬剤、または組織接着目的に合わせて組成物を調整することができる他の任意の薬剤であることができる。他のタイプの接着剤の場合、添加剤としては、その適用に応じて他の添加剤を挙げることができる。薬物送達適用の場合、添加剤は、活性医薬剤(該医薬剤がキトサンマトリックスに共有結合されない場合)、または賦形剤、アジュバント、促進剤、放出促進剤、または意図する薬物送達適用に合わせて組成物を調整することができる他の任意の薬剤であることができる。これらの非共有結合的修飾は、鎖内および鎖間相互作用を調節または修飾することにより、キトサンの挙動に影響を及ぼすことができる。これは、適当な体積の滅菌再構成キトサンと滅菌修飾剤とを混ぜ合わせて所望の製剤を得ることによって行われる。適切な非共有結合的修飾因子としては、架橋剤、医薬組成物、疎水性分子、親水性分子、色素、ステロイド類、脂質、タンパク質、核酸、生体適合性ポリマー、または本発明のキトサンに加えることができる他の任意の材料が挙げられるが、これらに限定されない。
処理キトサンまたは修飾処理キトサンを調製するための本発明の方法のある実施形態を、図2Aおよび図2Bにブロック図の形式で示す。
実施例
この実施例では、スルホン酸クロリドを使ったアルキルスルホン酸によるクラスAタイプの共有結合修飾キトサンの調製を例示する。この合成は、約1%のキトサン修飾比(100グルコースサブユニットあたり1オクタンスルホンアミド連結)を目標とするように設計された。
ビーカーで、2グラムのキトサンを40mLの10%(v/v)乳酸と混ぜ合わせた。キトサンを一晩可溶化させた。キトサンが完全に溶解したら、サンプルを機械式撹拌機に乗せ、80〜12rpmの速度で撹拌し、30分間混合させた。混合を継続しながら、100μLのオクタンスルホニルクロリドをキトサンに滴下した。サンプルを1時間混合させてから、6M NaOHをサンプルのpHが9〜10になるまでゆっくり加えた。混合を続けながらこのpHを2時間維持した。次に、100mLの10%(v/v)乳酸を加えることによって、キトサンを再溶解した。修飾キトサンの全てが溶解したら、6M NaOHをゆっくり加えることによって、サンプルを再沈殿させた。混合を停止し、サンプルを4本の遠心管(50mL)に等分し、キトサンを沈降させるのに十分な時間および速度で遠心分離した。一般に沈降は約3850×Gで行われる。上清を捨て、修飾キトサンを透析チューブに入れた。次に、キトサンの全てが溶解するまで、キトサンを10%(v/v)乳酸で透析した。次に、酸透析液を取り除き、超純水(USP滅菌注射用水)で置き換え、3時間以上透析した。次に超純水をさらに2回交換し、合計3回の水洗浄を行った。少量のキトサンを透析チューブから取り出し、pH測定をおこなった。次に、透析液をPBS(pH7.4)に変え、キトサンのpHが5.7〜6.0の範囲になるまで、透析を監視した。次にキトサンを超純水に対して3回透析した(各洗浄は3時間以上継続した)。次にキトサンを、上に概説した凍結乾燥ステップ、再構成ステップおよび滅菌ステップに供した。製剤の望ましい最終pHは6.2〜6.4である。
この実施例では、ジイミドカップリングを使ったN-(2-ジエチルアミノ-エチル)-スクシンアミド酸によるクラスCタイプの共有結合修飾キトサンの調製を例示する。
ビーカーで、1.00g(5.7ミリモルのキトサンモノマー単位)のキトサンを0.1N HClに溶解した。次に、そのキトサン溶液に、0.40g(1.8ミリモル)のN-(2-ジエチルアミノ-エチル)-スクシンアミド酸を加えた。次に、0.52g(2.7ミリモル)の1-エチレン-3-(3-ジメチルアミノ-プロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)またはN-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩および0.78g(0.68ミリモル)のN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)または1-ヒドロキシ-2,5-ピロリジンジオンを加えた。得られた溶液のpHを1N NaOHで5に調整し、その混合物を室温で24時間撹拌した。得られた修飾キトサンを、1N NaOHでpHを約9に調整して沈殿させ、その沈殿物を遠心分離で集めることによって精製した。このタイプの修飾反応のさらなる詳細は、Park, J.H.;Cho, Y.W.;Chung, H.;Kwon, I.C.;Jeong, S.Y.「Synthesis and Characterization of Sugar-Bearing Chitosan Derivatives: Aqueous Solubility and Biodegradability」Biomacromolecules 2003, 4, 1087-1091に見出すことができる。
この実施例では、酸クロリドカップリングを使ったN-(2-ジエチルアミノ-エチル)-スクシンアミド酸によるクラスCタイプの共有結合修飾キトサンの調製を例示する。
ビーカーで、0.40g(1.8ミリモル)のN-(2-ジエチルアミノエチル)スクシンアミド酸を約10mLの乾燥THFに溶解した。次に、その溶液に0.26g(2.2ミリモル)の塩化チオニルを加え、乾燥カラムを取付けて、1時間還流した。還流後に、その溶液を室温まで冷却した。1.00g(5.7ミリモルのキトサンモノマー単位)のキトサンを10%(w/w)酢酸溶液に溶解した。次にN-(2-ジエチルアミノエチル)スクシンアミド酸クロリド溶液をキトサン溶液に撹拌しながら滴下した。キトサンをスクシンアミド酸クロリドと反応させた後、pHを1N NaOHで7〜8の値に調整し、反応を2〜4時間継続させた。1N NaOHを添加してpHを9まで上昇させることにより、修飾キトサンを精製した。次に沈殿物を遠心分離によって集めた。
この実施例では、酸クロリドカップリングを使ったコール酸によるクラスDタイプの共有結合修飾キトサンの調製を例示する。
1グラムのキトサンを20mLの10%乳酸に溶解した。0.581グラムのコール酸(ナトリウム塩)を10mLのDMSOまたは酢酸エチルに溶解した。そのコール酸溶液に120μLの塩化チオニルを注意深く加えた。そのコール酸-塩化チオニル反応混合物を乾燥管下で1時間還流した後、その混合物を室温まで冷却した。そのコール酸-塩化チオニル反応混合物を、溶解したキトサンに、オーバーヘッド混合機を使って一定に撹拌しながら加えた。反応溶液のpHを6M NaOHを使って9〜10に調整した。この反応混合物を2時間撹拌した。その混合物を3850×Gで10分間遠心分離することにより、沈殿した修飾キトサンを集めた。修飾キトサンを50mLの10%乳酸に再溶解した後、6M NaOHを使ってpH9〜10に調整することにより、それを再沈殿させた。その混合物を3850×Gで10分間遠心分離することによって、再沈殿した修飾キトサンを集めた。集めた修飾キトサンを透析チューブに移し、10%乳酸に対して、キトサンが溶解するまで透析した。修飾キトサンを溶解した後、透析液を脱イオン(DI)水で置き換え、透析をさらに3時間続けた。DI水を合計3回取り替えて使用した。3回の水洗浄後に、キトサンのpHがpH5.7〜6.0に達するまで、修飾キトサンをPBS(pH7.4)に対して透析した。あるいは、PBS透析を他の塩類、例えばトリス緩衝液中の硫酸マグネシウムに対する透析で置き換えてもよい。所望のpH範囲が得られたら、2回の3時間透析ステップを終了した。修飾キトサンを凍結乾燥器フラスコに入れ、-80℃で少なくとも1時間は凍結させた。フラスコを凍結乾燥器に入れ、完全に乾燥するまで乾燥させた。乾燥した修飾キトサンをデシケーター中、-20℃で必要になるまで保存した。上記の手法における修飾ステップを繰り返して、より高度に修飾された生体材料を得ることができる。
この実施例では、処理キトサンとパーフルオロンとの混合物から構成されるクラスFタイプの非共有結合修飾体の調製を例示する。
1グラムのキトサンを40mLの10%酢酸に溶解して、25mg/mLキトサン溶液を作製した。1mLのパーフルオロンを1mLの25mg/mLキトサン溶液に加えて最終キトサン濃度を12.5mg/mLとし、一晩撹拌した。最初の添加時に溶液は二相性だったが、長時間の撹拌後は、パーフルオロン相が明白でなくなった。得られた溶液は乳光性を示した。そのキトサン/パーフルオロン混合物を透析チューブに入れ、水に対して3回透析した後、PBSに対して一晩透析した。
この実施例では、ジイミドカップリングを使ったポリエーテルによるクラスCタイプの共有結合修飾キトサンの調製を例示する。この実施例では、ポリエーテルアミンを無水コハク酸で修飾して、キトサンへのジイミドカップリングを容易にするスクシンアミド酸リンカーを作製した。
ポリエーテルアミン酸リンカーの調製
250mL丸底フラスコで、2.49g(4.2ミリモル)のJeffamine 600、150mLの乾燥テトラヒドロフラン、0.42g(4.2ミリモル)の無水コハク酸および1.2mL(8.4ミリモル)のトリエチルアミンを混ぜ合わせる。この混合物を合計4時間にわたって撹拌、還流する。その溶液の冷却後に、約10mLの溶液が残るまで、ロータリーエバポレーターにかける。次に、サンプルを窒素パージ下でTHFの蒸発が完了して混合物がシロップ状の粘稠度になるまでさらに乾燥する。このプロセスにより、約1.8mLのリンカーが得られるはずである。
ビーカーで、2.00g(11.4ミリモルのキトサンモノマー単位)のキトサンを0.1N HClに溶解した。次に1.00g(1.4ミリモル)のJ600-スクシンアミド酸をキトサン溶液に加えた。次に、0.287g(2.5ミリモル)の1-エチレン-3-(3-ジメチルアミノ-プロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)またはN-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩および0.478g(2.5ミリモル)のN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)または1-ヒドロキシ-2,5-ピロリジンジオンを加えた。得られた溶液のpHを6M NaOHでpH5〜6に維持し、その混合物を室温で72時間撹拌(ガラス撹拌子またはテフロン撹拌子)した。得られた修飾キトサンを、6M NaOHでpHを約9に調整することによって沈殿させ、その沈殿物を遠心分離で集めることによって精製した。次に修飾キトサンを透析チューブに移し、PBS中の10%(v/v)乳酸に対して、溶解するまで36時間透析した。次にその酸透析液を取り除き、超純水(USP滅菌注射用水)で置き換え、3時間以上透析した。次に透析液をPBS(pH6.0)に変え、キトサンを約36時間透析した。次にPBS透析液を取り除き、超純水(USP滅菌注射用水)で置き換え、3時間以上透析した。本明細書で先に概説した通常の方法に従って、最終生成物を凍結乾燥し、再構成させた。
処理および修飾の効果を特徴づけるために、代表的な組成物を、円偏光二色性(CD)、元素分析、核磁気共鳴(NMR)、光散乱検出を用いたゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)、および粘度測定を含むさまざまな解析手法によって解析した。これらの解析手法を、処理キトサン、および修飾キトサンまたは修飾処理キトサンに対して行った。次にこのデータを天然のキトサンサンプルに関するデータと比較して、本発明の組成物と天然のキトサンとの間の物理的および/または化学的相違を記録した。これらの初期研究を本明細書では研究1という。その後、キトサン分子量(MW)ならびに脱アセチル化のタイプ(ランダム(R)かブロック(B)か)および脱アセチル化度(DDA)の影響を調べるために、本明細書において研究2と呼ぶ追加研究を、同じ解析技法(NMRを除く)を使って行った。全ての特徴づけは実施例1に記載の実施形態に対して行った。
Domard(Int. J. Biol. Macromol. 1987, VoI 9, 98-104)はキトサンのCDスペクトルを報告した。この著者は、185nmに、脱プロトン化(-NH2)型のキトサン(より結晶性の高い材料として存在する形態)に対応する負の二色性バンドを報告している。プロトン化型のキトサン(-NH3 +)はこの負のバンドを示さない。プロトン化されたアミンの静電反発は、この材料が結晶性コンフォメーションを取ることを妨げる。本発明の生成物で得られたCDスペクトルを図3に示す。本発明のキトサン(修飾体または非修飾体)処理が、無処理キトサンよりも事実上結晶性の低い、ユニークなキトサンをもたらすことは明白である。これらの結果は、複数のサンプルを使って複数の装置で立証された。
元素分析(燃焼)を使って、オクタンスルホネートによる修飾度を測定した。3つの修飾処理材料バッチと、1つの無修飾処理材料バッチに対して、硫黄および窒素分析を行った。各キトサンサブユニットは、酸クロリドカップリングを使ってオクタンスルホネートに連結することができる窒素を一つ有する。窒素の総モル数を、キトサンに対するオクタンスルホネート修飾因子のスルホンアミド連結に起因する硫黄のモル数と比較することにより、3つの修飾処理試料のそれぞれについて、修飾比を測定することができた。無修飾処理試料には硫黄が存在しないことから、修飾因子の非存在下では硫黄は存在しないことが確認された。3つの修飾処理バッチについて測定された修飾比は、グルコースサブユニットの1.5±0.3%の修飾だった。この初期研究での硫黄レベルは、定量に使用した燃焼分析機の検出限界に近かったので、研究2での硫黄分析は、感度の改善をもたらす誘導結合プラズマ(ICP)法を使って行った。各実験セットで測定された修飾比を表5に示す。
プロトンNMRで、キトサンの炭化水素修飾に起因する共鳴を検出することができた。この共鳴ピークは、解析した3つの修飾処理バッチには存在したが、無修飾処理バッチには存在しなかったことから、そのピークの起源は修飾因子であることが立証された。この特定の共鳴に関するピーク積分値をキトサン骨格(C2)に帰属することができる明確に定義された共鳴と比較したところ、約0.5%という修飾比が得られた。この値は、ICP元素硫黄分析によって測定された表5に示す修飾比と、良好な一致を示す。
13個のキトサンサンプルを、光散乱検出を用いたGPCを使って下記の標準化された条件下で解析した。0.3M酢酸/0.3M酢酸ナトリウムを移動相として30℃、流速1.0mL/分で使用するUltrahydrogels(Two Linear)カラム。150μLの注入体積を使用し、Viscotek Y-501検出器およびDAWN光散乱検出器を使って溶出プロファイルを測定した。データを表7にまとめて示し、クロマトグラムを図4に示す。重量平均分子量(Mw)データの比較は、実施例1の処理を受けた全てのキトサンサンプル間の明確な相違を示す。無処理材料は、本発明の処理を受けた材料よりも低い保持容量(高いMw)を示した。Mwの同様の変化が、実施例1に従って調製され調べられた全てのキトサンサンプルに見られた。これらの実験において、修飾は実施例1の修飾である。これらの結果を確認するためにサンプルは2つの異なる試験室で解析された。Mwのこの変化は、分子量(MW)、脱アセチル化度(DDA)および脱アセチル化のタイプ(ブロックかランダムか)などのキトサン特性に依存しない。処理すると、サンプルGPC-2、3、4および5は、Mwに、263,000から219,000への観察可能で再現性のあるシフト(84%まで減少)を示す。観察される分子量のこの変化は単純な鎖切断とは合致しない。というのも、そのような鎖切断は、これらの実験条件下では予想されないからである。もう一つの説明として分子コンフォメーションの変化が挙げられる。多価リン酸イオンはキトサン骨格の全く異なる部分を引きつけて、よりコンパクトな構造を形成しうる。細長い(楕円体)粒子は通例、GPCカラムではより迅速に溶出するので、高い保持容量は見掛けの分子収縮を示すだろう。これは、本発明の材料が、より大きな被内包体積(included volume)へのアクセスを持つことと合致する。
表7に示す全ての材料の代表的サンプルについてブルックフィールド粘度計を使って相対粘度測定を行った。サンプルは全て同一濃度(10mg/mL)とした。データを表8にまとめて示す。本発明の処理を受けたキトサンは、修飾体であれ無修飾体であれ、無加工製剤と比較して、やはりユニークで再現性のある物理的特性を示した。同じ出発材料(同じMW)、サンプルpHおよび濃度を使ってこのタイプの測定を行うと、類似する比率の相対粘度測定値が得られると予想されるだろう。しかしむしろ、粘度は本発明の処理により、一貫して再現性よく、約50%減少した。これは、リン酸イオンとキトサンの間の引力が、より堅固な分子コンフォメーションをもたらすことに合致する。これらの例で調べた修飾は実施例1の修飾である。
この実施例は、さまざまな本発明の製剤の、エクスビボで組織を結合する能力を評価するために設計した。
いくつかの組織をいくつかの供給源から入手した。次にターゲット組織を約4×8mmの細片に切断した。試験材料を一つの組織細片の端に適用した。次にもう一つの組織細片を処理細片に、重なり部分に約4×4平方ミリメートルの重なり(その両端には一枚分の厚さの部分が延びている)を形成するように配置した。次にその組織調製物を薄いプラスチックシートで包み、顕微鏡スライドグラスの間に挟み、軽い圧力(約125g)で圧迫した。結合後は、部分的な脱水に起因する余計な「粘着性」が、測定される引張強さに影響を及ぼさないことを保証するために、組織を注意深くPBS中に少なくとも1時間、ただし24時間を越えないように入れてから、引張強さ試験を行った。引張接着強さの試験はテンシオメーターを使って行い、力を接着破壊点まで徐々に増加させた。ピーク負荷を記録し、接着強さをg-f/cm2として算出した。
いくつかの競合技術および対照に関する比較データを表9に示す。修飾キトサン材料のいくつかの一般クラスのそれぞれについて、代表的接着強さを表10に示す。次に、最も有望な製剤を追加の安全性および効力試験に供した。そのデータは以降の実施例に示す。
このモデルは、潜在的製剤をスクリーニングし、異なる組織における異なる製剤の相対的接着特性を比較するための、有用なツールになる。このモデルを使って、本発明の製剤は並外れた接着特性を与えることが確認され、それは競合技術または天然のキトサンのみよりも優れていることが判明した。
2PhotoBioMedデータ
Veritas(商標)はSynovis Life Sicencesが製造する調製済心膜製品である。
この実施例は、本発明の組成物の、インビボで組織を結合する能力、具体的にはウサギモデルで角膜切開を封鎖する能力を評価するために設計されたものであり、実施例1の材料を利用した。
体重7〜8ポンドのニュージーランドホワイトウサギを使用した。ウサギを筋肉内キシラジン(5mg/kg)およびケタミン(35mg/kg)で麻酔した。プロパラカイン塩酸塩溶液0.5%(アルカイン、Alcon)の局所麻酔をウサギ眼に適用した。Transpore Tape(3M)を使って、眼をテープで開いておき、Steri-Drape(3M)で覆って、滅菌手術野を設けた。3.2mm Clear Cutスリットナイフ(Alcon)で角膜切開を施した。切開が明確に定められるように、スリットナイフには、滅菌外科用マーカー(Viscot)で印を付けた。角膜縁に対して約1mm前方、虹彩面から45°の角度で、角膜の全層を貫通する、非自閉性の3.2mm切開を各角膜に作製した。切開が漏出性であることを保証するために、滅菌平衡塩類溶液(BSS)(Alcon)を23ゲージ針(Techcon)で前房に注入した。実験群では、約10〜20μLの実施例1の材料を角膜切開中に30ゲージ鈍針(Techcon)で適用し、組織を確実に相対させかつ切開面を乾燥させるために、外科用眼スピア(spear)(Murocel)で軽く加圧した。約5〜10μLの実施例1の材料を局所適用し、5分間の結合時間、硬化させた。対照群では、10-0非吸収性ナイロンブラックモノフィラメント外科用縫合糸(Alcon)を強膜から角膜へと配置することにより切開を封鎖した。処置後に全ての眼をBSSで洗浄し、抗生物質モキシフロキサシン塩酸塩0.5%(ベガモックス、Alcon)で処理し、眼の乾燥を防ぐためにテープで閉じておいた。術後、ウサギには、トブラマイシンおよびデキサメタゾンのステロイド抗生物質(トブラデックス、Alcon)ならびにケトロラクトロメタミン0.5%(アキュラー、Allergan)を、死亡させるまで1日4回投与した。動物を監視して、潜在的漏出および刺激の何らかの徴候について評価した。動物を1〜2時間、1日、および7日の3時点(1時点あたりn=6)で死亡させた。安楽死の直後に、BSSを23ゲージ針(Techcon)を使って前房に注入して、眼房を加圧した。フィジオグラフ(physiograph)を使って、各眼の漏出/破裂圧を評価した。前房圧は典型的には12〜20mmHgである。漏出/破裂圧が50mmHgを越えた場合に、眼はうまく封鎖されたとみなした。
1〜2時間時点で、6匹のウサギを観察し、死亡させた。対照(縫合)眼または実験(実施例1の材料で処置)眼のいずれにも、刺激は見られなかった。全ての眼は50mmHgを越える圧力を保った。1日目に、6匹のウサギを観察し、死亡させた。実験眼に刺激は見られなかった。縫合眼にはわずかな刺激が認められた。全ての眼は50mmHgを越える圧力を保った。7日目に、6匹のウサギを観察し、死亡させた。対照眼または実験眼のいずれにも、刺激は見られなかった。全て眼は50mmHgを超える圧力を保った。
実施例1の材料は、ウサギ眼における角膜切開をうまく封鎖できる封鎖剤であることがわかった。この材料は優れた生体適合性を示し、標準的な縫合糸処置は炎症応答を誘発したが、本発明の組成物は炎症応答を誘発しなかった。
この実施例は、培養角膜内皮細胞に対する本発明の製剤の細胞毒性を評価するために設計されたものであり、実施例1の材料を利用した。
10%ウシ胎仔血清(FCS)を含有する標準的組織培養培地(ダルベッコ改変イーグル培地-DMEM)で、ウサギ角膜内皮細胞を、それらがコンフルエントになるまで(約7〜10日間)成長させた。細胞は12ウェル組織培養プレートで成長させた。コンフルエント培養物を使って、これらの細胞に対する本発明の接着剤製剤の毒性を試験した。使用直前に、0.2%FCSを含有するDMEMにストック化合物(10mg/mL)を希釈して、最終濃度を1、2、または3mg/mLにした。細胞を、総液量0.5mLのDMEM+0.2%FCS/ウェル中、異なる濃度の接着剤(上述のとおり)の存在下、37℃で24時間インキュベートした。実験の終了時に、細胞をPBSで洗浄し、哺乳動物細胞用のMolecular Probes(商標)Live/Dead(登録商標)生存性/細胞毒性キットを製造者の仕様書に従って使用することにより、各実験条件下での生細胞および死細胞の存在について解析した。細胞培養実験は三重に行った。これらの手法は初代細胞を使って行い、二次細胞株を使って繰り返した。
どの試験条件下でもこれらの培養細胞では細胞毒性が観察されなかった。
この実施例の接着剤化合物は角膜内皮に対して毒性でない。本質的に培地の3分の1が本発明の接着剤からなる3mg/mLでさえ、細胞毒性作用は観察されなかった。
この実施例では、ウサギ眼の角膜実質内に置いた場合の本発明の製剤の生体適合性を、実施例1の材料を利用して例示する。
体重7〜8kgのニュージーランドホワイトウサギを使用した。ウサギを筋肉内キシラジン(5mg/kg)およびケタミン(35mg/kg)で麻酔した。プロパラカイン塩酸塩溶液(0.5%)(アルカイン、Alcon)の局所麻酔をウサギ眼に適用した。睫毛からの汚染を防ぐために、Transpore Tape(3M)を使って、眼をテープで開いておいた。最初の角膜切開を、300ミクロン精密深さナイフ(Sharpoint)で作製した。角膜縁に対して約1.5mm前方で約2.5mmの切開を各角膜に施した。直径3.5mmのラメラ実質ポケットを、Bevel Up Angled Cresent Knife(Sharpoint)を使って、角膜中、300ミクロンの深さに作製した。実験群では、約20μLの接着剤製剤(10mg/mL)を23ゲージ鈍針(Techcon)で角膜ポケットに入れ、ポケット内に残った空気が確実になくなるように、外科用眼スピア(Murocel)を使って、ポケットを軽い圧力でさすった。接着剤を、5分間の結合時間、硬化させた。対照群では、実験群と同じ手法に従って約20μLのBSSを角膜ポケットに入れた。処置後に全ての眼をBSSで洗浄し、抗生物質モキシフロキサシン塩酸塩0.5%(ベガモックス、Alcon)で処理し、麻酔から回復する間の眼の乾燥を防ぐためにテープで閉じておいた。術後、ウサギには、トブラマイシンおよびデキサメタゾンのステロイド抗生物質(トブラデックス、Alcon)を、7日間にわたって1日4回投与した。
1日目、14日目、30日目、60日目、および90日目のそれぞれに、3匹のウサギを観察し、死亡させた。120日の時点で、2匹のウサギを観察し、死亡させた。巨視的観察では、試験標本のいずれにも、刺激は見つからなかった。組織学的観察により、数多くの試験において材料が実質的に良性のままであることが確認された。残留キトサンは120日まで実質ポケット内で明白なままだった。
この化合物は、ウサギ眼の角膜実質において炎症応答または免疫応答を誘発しなかった。炎症性薬剤を使った以前の結果は、著しい刺激、羞明、炎症、角膜浮腫、および新血管形成を誘発した。
この実施例は、皮内注射した場合の本発明の製剤の生体適合性を評価するために設計されたものであり、実施例1の材料を利用した。
スプレイグ・ドーリーラットをキシラジン(7mg/kg)、ケタミン(70mg/kg)、およびブプレノルフィン(0.05mg/kg)の筋肉内注射で麻酔した。ラットの背皮膚表面を剃毛し、アルコールで清拭した。実施例1の材料0.2mLを識別された格子区画に皮下注射した。さらに、0.2mLの陽性対照材料と陰性対照材料の両方を皮下注射した。7日時点または28日時点で行われる安楽死の時点で、適当な領域の回収が保証されるように、注射部位には小さな刺青の点で印を付けた。適当な時点で動物を安楽死させ、付随する筋を伴う皮膚サンプルを回収し、標本をOCTに包埋し、凍結してから、凍結切片作製および組織学的評価を行った。
陰性対照標本は7日目までに完全に再吸収され、どの時点でも注射部位に免疫応答は事実上なかった。陽性対照は7日目までに再吸収または生分解により著しい減少を示し、28日目までに事実上存在しなくなった。しかし、陽性対照の注射部位には、材料がもはや明白でなくなった28日目でさえ、著しい炎症応答が観察された。実施例1の材料は、28日目まで存在したままであり、7日時点でも28日時点でも、陽性対照よりも少ない炎症応答を示した。極めてわずかで限局的な免疫応答が観察されたが、下部隣接組織は典型的形態を示した。
本発明の実施例1の材料は、試験した組織において、良好な生体適合性と優れた寿命を示す。これらの材料は、皮膚充填剤として、または持続的薬物送達用のデポー剤として、潜在的に有用でありうる。
この実施例は、本発明の材料(具体的には充填剤または増量剤として機能するように設計されたもの)の生体適合性および保持を評価するために設計されたものであり、実施例6の材料を利用した。
この研究にはニュージーランドホワイトウサギを使用した(n=3)。眼の処置はランダム化した。各動物において、一眼を10mg/mLの実施例6の材料60〜80μLで処置し、他眼を20mg/mLの実施例6の材料60〜80μLで処置した。40%/60%酸素/空気混合物中、2.0〜3.5%のイソフルランで、ウサギを麻酔した。2滴の局所麻酔薬(テトラカイン-0.5%滴剤またはアルカイン)をウサギ眼に適用した。鉗子を使って、結膜を眼球の表面から静かに持ち上げて、結膜の「テンティング」を起こした。眼球の表面から十分に離して注射を行った。(この手技により眼球穿孔のリスクが著しく低減する)。針を眼球に対して接線方向に置いて、針先をテント中に挿入し、適当な製剤を送達した。23ゲージ針を使って注射を行った。10mg/mLの実施例6の材料100μLを一眼の結膜中に注射した。20mg/mLの実施例6の材料100μLを対側眼の結膜中に注射した。注射後に、抗生物質滴剤(ベガモックス(登録商標))を点眼した。1週間、毎日観察を行った後、研究が終了するまで週に1回観察した。24時間時点で結膜の写真を撮影した。29日目に、ウサギを安楽死させ、結膜を回収し、組織学的検査用に加工した。
眼瞼を下げる前にウサギを見ると、全てのウサギ眼は全ての観察点で明るく湿った外観を保っていた。最初の24〜48時間以内に見かけの体積にわずかな減少が起こったが、全ての注射部位は結膜組織の少なからぬ膨張を維持した。これらの製剤は、充填剤または増量剤として役立つように、それらが体積占有性を保つべく、保水性が最適化されるように設計される。最初の2、3日間はわずかな発赤が結膜に認められた。これは、おそらく、組織の過膨張に原因があったと考えることができるだろう。29日目に、全ての眼は良好に見えた。結膜組織の残留膨張(48時間後に観察されたものと同等なもの)が続いていた。カルコフロール染色を使った組織学的評価により、注射29日後の処置眼の結膜における実施例6の材料の存在が確認された。
実施例6の材料は充填剤または増量剤として有望である。眼周囲注射後に、実施例6の材料は結膜空間内に、優れた適合性で少なくとも29日間は存在し続けた。この研究では定量しなかったが、これらの材料は、その初期体積のかなりの部分を保ったので、望ましい品質を示した。
この実施例は、インビトロウサギ眼モデルの角膜表面における製剤保持の動態を評価するために設計されたものであり、実施例1の材料を利用した。この実施例は、最終的に、調製されたキトサン材料内への遊離薬物の混合と、その後の、拡散による組織への薬物の溶出を伴うターゲット組織基体への接着とによって、薬物送達マトリックスとして作用する、修飾処理キトサン材料の能力を評価するために設計された。
残留蛍光の定量的解析により、適用4時間後に85%が残り、8時間および16時間のどちらでも20%以上が残っていたが、24時間までに事実上全ての残留蛍光が消失した(表11参照)。残留蛍光を示す代表的角膜横断面を見るには図9を参照し、発光定量については図10を参照されたい。
本発明の製剤は適用が容易であり、16時間までは接着性を保つ。24時間までに残留蛍光がなくなる。このデータは、これらの製剤が、そこからの持続的薬物送達を施すための、またはドライアイに対処するための、1日1回の適用しか必要としない、有用なマトリックスになりうることを示唆している。24時間時点で残留がないことは、翌日に再適用するための新鮮な表面を示唆する。
この実施例は、実施例1の材料を利用した処置後の、擦過創傷における角膜再上皮化の速度およびパターンを評価するために設計された。
体重7〜8kgのニュージーランドホワイトウサギを使用した(n=4)。動物をキシラジン(5mg/kg)およびケタミン(35mg/kg)の筋肉内(i.m.)注射で麻酔した。プロパラカイン塩酸塩溶液0.5%(アルカイン、Alcon)の局所麻酔をウサギ眼に適用した。睫毛からの汚染を防ぐために、Transpore Tape(3M)を使って、眼をテープで開いておいた。メスの背(鈍端)を使って下眼瞼の底を軽く押して、眼球を眼窩から持ち上げた。眼球を親指と人差し指の間に傷つけないように保持し、滅菌6mmトレフィンでそのトレフィンを軽く押すことによって角膜の中心に印を付けた。印を付けた角膜上の6mm円内の上皮全体を、メスに取付けた15番バードパーカー刃を使って、静かに掻爬した。印を付けた領域内の上皮全体を掻爬するように注意した。掻爬後に、付着している固定されていない上皮を取り除くために、眼を滅菌BSSですすいだ。一眼をランダムに選択して、化合物(濃度10mg/mL)で処置した。100μLを局所適用し、1分間硬化させた。対側眼は対照として役立つように100μLのBSSで処置した。各眼をフルオレセインで処理し、UV曝露下で画像を捕らえ、0時間での創傷サイズを記録した。画像解析時の較正用に角膜の隣に定規を置いた。眼を写真撮影した後、フルオレセインをBSSで洗い流した。処置後に全ての眼をBSSで洗浄し、抗生物質モキシフロキサシン塩酸塩0.5%(ベガモックス、Alcon)で処置し、麻酔から回復する間の眼の乾燥を防ぐためにテープで閉じておいた。動物がその眼に触れるのを防ぐために、動物にはエリザベスカラーを付けた。手術後1、2、4、および8日目に、上述のように写真を撮影することにより、全ての眼で創傷サイズを評価した。全体的健康状態および眼の状態を、1日に1回監視し、観察結果を記録した。8日目の写真を撮影した後に、角膜を回収した。角膜を切開し、瞬間凍結し、組織学的観察用に調製した。
写真を撮影し、定量的画像解析を行った。創傷治癒プロセスの目視観察と予備解析により、接着性フィルムの存在は、図11に示すように再上皮化の減速を引き起こすが、最終的には再上皮化が起こることが示唆された。キトサンと結合する染料を使った組織学的観察により、上皮細胞は、図12に示すように、本発明の接着性フィルム上に前進することがわかった。剥がれたフィルムの残片による涙点閉鎖は見られなかった。
局所フィルムは毒性作用または炎症作用を何も持たないようであるが、再上皮化プロセスを減速させるようである。この保護被覆が再上皮化プロセス中に鎮痛効果をもたらすのであれば、再上皮化が遅延したとしても、臨床的利益が得られるだろう。あるいは、これは、鎮痛剤および/または上皮/実質成長プロモーターを送達する手段にもなりうる。残留フィルムが8日まで実質に接着することを示す証拠があり、これらは持続的薬物送達の新規手段になるだろう。
この実施例は、キトサン分子そのものへの医薬剤の共有結合付着と、その後のターゲット組織基体への接着とによって、薬物送達マトリックスとして作用する、修飾処理キトサン材料の能力を評価するために設計された。医薬剤は付着されたままであるか、加水分解または酵素活性によって切断されうる。
酵素的に切断可能なリンクによって骨格に付着されたダンシル基を使って、偽薬の酵素的切断を証明した。下記の図式では、単純アミドがエラスターゼによる切断の適当なターゲットである。骨格としてコラーゲンを使用してこの実施例を完成させた。連結は、ナフタルイミド光化学を利用してコラーゲンに共有結合で付着させた。
これらの実験の結果を図13に示す。酵素の非存在下で蛍光は373±225、酵素の存在下で蛍光は1767±305であったことから、偽薬の酵素的放出が示された。
この実施例は、生物学的高分子からの医薬剤の持続的放出を達成するために切断可能なリンカーを使用するという思想を明確に証明している。この証明はコラーゲンモデルからの偽薬の酵素依存的放出を例示するものであるが、同様の化学を使って、本発明の材料から医薬剤を送達することができる。
この実施例は修飾処理キトサン製剤の抗微生物特性を評価するために設計されたものであり、実施例1の材料を利用した。
微生物の0.5マックファーランド標準接種物を使って、Remelヒツジ血寒天プレートまたはRemelチョコレート寒天プレート(微生物依存)での成長叢を調製した。1滴(50μL)の化合物をプレートの中心に置いた。そのプレートを36.5℃、6.5%CO2でインキュベートし、24時間および48時間時点で成長の阻害について観察した。1滴(50μL)をRemelヒツジ血液寒天プレートおよびRemelチョコレート寒天プレートに接種することにより、化合物を無菌性について調べた。各プレート上に1滴の食塩水を置くことで、この試験手法の陰性対照とした。
以下の微生物の場合、化合物の液滴のすぐ下には明白な阻害があったが、隣接する領域では明白な阻害はなかった:
表皮ブドウ球菌
黄色ブドウ球菌
インフルエンザ菌
緑膿菌
大腸菌。
大便レンサ球菌
肺炎レンサ球菌。
文献には、天然のキトサンがさまざまな微生物に対して抗微生物特性を示すと報告されている。これらの実験により、本発明の修飾処理キトサンは、少なくともある微生物に対して、抗微生物特性を保っていることが確認される。
この実施例は、修飾処理キトサン製剤の抗真菌特性を評価するために設計されたものであり、実施例1の材料を利用した。
Sab Dex寒天上に0.5マックファーランド標準濁度の微生物叢を作製することによって、10mg/mLでの実施例1の材料の抗真菌特性を試験した。1滴の化合物をこの微生物叢の中心に置き、潜在的抗真菌活性について観察した。カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・クルセイ、およびアスペルギルス属を含む5種類の酵母および真菌生物を試験した。
処置に先だって、酵母および真菌生物の全てをSab Dex寒天培地上で密生させた。以下の微生物の場合、化合物の液滴のすぐ下には明白な阻害があったが、隣接する領域では明白な阻害はなかった:
カンジダ・クルセイ
カンジダ・パラプシローシス。
カンジダ・アルビカンス
カンジダ・グラブラタ
アスペルギルス属
で観察された。
実施例1の材料は、試験した全ての真菌生物で、ある程度の接触依存性抗真菌特性を示す。真菌成長の促進がいずれの場合も観察されなかったことは、おそらく最も重要だろう。この知見は、真菌増殖を助長するのではなく抑制することが重要になるであろう医学用途に照らして望ましい。
本発明は、キトサンマトリックスおよび医薬有効量の眼薬を含む、眼薬物送達組成物にも関係する。眼薬は、プロスタグランジン、プロスタミドまたはその混合物、または非ステロイド抗炎症薬(NSAID)もしくはNSAIDの混合物またはコルチコステロイドもしくはコルチコステロイドの混合物からなる群より選択され、治療有効量の眼薬がある期間にわたって放出されるように、組成物を適合させる。キトサンマトリックスは、処理キトサン、処理修飾キトサン、またはその混合物を含み、それらの処理キトサンは、無処理キトサンよりも低い見掛けの分子量および高い組織接着強さを持つ。プロスタグランジン、プロスタミドまたはその混合物を含む組成物に関して、期間は1日〜約1年である。ある実施形態では、プロスタグランジン、プロスタミドまたはその混合物を含む組成物に関して、期間が約1ヶ月〜約6ヶ月である。別の実施形態では、プロスタグランジン、プロスタミドまたはその混合物を含む組成物に関して、期間が約1ヶ月〜約4ヶ月である。別の実施形態では、プロスタグランジン、プロスタミドまたはその混合物を含む組成物に関して、期間が少なくとも3ヶ月である。別の実施形態では、プロスタグランジン、プロスタミドまたはその混合物を含む組成物に関して、期間が少なくとも1ヶ月である。別の実施形態では、プロスタグランジン、プロスタミドまたはその混合物を含む組成物に関して、期間が少なくとも2ヶ月である。
この実施例は、インビボウサギ眼モデルの角膜表面での保持の動態を評価するために設計されたものであり、実施例1の材料を利用した。さらにまた、この実施例は、最終的に、調製されたキトサン材料内への遊離薬物の混合と、その後の、拡散による組織への薬物の溶出を伴うターゲット組織基体への接着とによって、薬物送達マトリックスとして作用する、修飾処理キトサン材料の能力を評価するために設計された。
この研究には体重5〜6ポンドのニュージーランドホワイトウサギを4匹使用した。ウサギの眼をランダム化した。1滴の滅菌BSSを対照眼に入れ、5〜50μLピペッターを使って20μLの実施例1の材料を実験眼に適用した。2時間時点で角膜を回収した。回収時には、40%/60%酸素/空気混合物中の2.0〜3.5%のイソフルオラン(isofluorane)で、ウサギを麻酔してから、安楽死させた。回収後直ちに解析する時間を見込んで、実験には1時間間隔の時間差を設けた。修飾キトサン材料の保持を評価するために、角膜をカルコフロールで染色し、蛍光顕微鏡法を使ってトポグラフ的に評価した。各角膜について、代表的画像を捕らえ、保存した。
蛍光顕微鏡法を使った角膜表面のトポグラフ的評価により、実施例1の材料は、適用2時間後に、引き続き存在することが確認された。図14を参照して、実験眼には陽性カルコフロール染色が観察されるのに対して、対照眼では非特異的染色が観察されることに注目されたい。
実施例1の材料は適用が容易であり、インビボ条件下で2時間までは依然として接着性である。このデータは、これらの製剤が、そこから持続的なまたは改善された薬物送達を与えるための、またはドライアイに対処するための、有用なマトリックスになりうることを示唆する。約10分〜約30日の期間にわたって角膜に接着するキトサン製剤を調製することができる。
この実施例では、ケトロラクトロメタミン(KT)送達系として使用するための、本発明のキトサン組成物へのKTの組み込みを例示する。
この実施例は、現在市販されているKT製剤(AllerganのAcular LS(登録商標))の眼送達性能を、本発明の送達マトリックスと、インビボウサギモデルで比較するために設計された。この研究では実施例19の材料を使用した。
この研究には体重5〜7ポンドのニュージーランドホワイトウサギを9匹使用した。ウサギとその眼をさまざまな処置群にランダムに割り当てた(下記参照)。適当な化合物を実験眼に滴下し、他眼は無処置のままにしておいた。液剤の滴下後に、ウサギを最初の15〜20分間は絶えず監視し、その後は収集時まで15分ごとに監視した。眼房水の収集に先だって、40%/60%酸素/空気混合物中の2.0〜3.5%のイソフルオランで、ウサギを麻酔した。このタイプの薬物送達適用に関して文献調査すれば、眼に局所適用し、次に適用後さまざまな時点で角膜眼房水中の薬物レベルを定量することによって製剤を評価するのが、一般的慣行であることがわかるだろう。したがって、100μLの眼房水を適当な時点でそれぞれの眼から収集し、解析するまで-80℃で保存しておいた。
この研究で得られたデータを図15に示す。現在市販されているAcular-LS(登録商標)は、活性薬を0.4%の濃度で含有し、本発明の製剤では0.2%である。活性薬が50%少ないにもかかわらず、本発明の製剤からの送達は、適用後1時間および4時間の時点で、現在市販されている製品より多い。本発明の製剤によって送達されるKT濃度は、1時間時点および4時間時点で、それぞれAcular-LS(登録商標)の136%および157%だった。
実施例19の材料は、眼へのKTの送達を改善するための手段として極めて有望であり、活性医薬成分(API)をかなり減らしても、上回らないまでも同等な送達を得ることができる。
この実施例では、PA送達系として使用するための、本発明の修飾キトサン組成物への酢酸プレドニシロン(PA)の組み込みを例示する。
この特定の適用の場合、薬物は上述の再構成ステップ中に製剤に組み込まれる。これにより、本発明の製剤と並行して薬物製品の滅菌が行い易い。実施例4の凍結乾燥材料を量り取り、滅菌食塩水で希釈して、3mg/mLという所望の最終修飾キトサン濃度を得る。PAを添加する前に修飾キトサンを一晩可溶化させた。薬物をオートクレーブ処理する前に、薬物を量り取って、修飾キトサン/食塩水混合物に加えた時に所望の最終薬物濃度(0.05%)が得られるようにした。活性薬物の溶解を促進するために、オートクレーブ処理に先だって、その混合物を加熱してもよい。次に、その製剤をオートクレーブ処理した後、終夜撹拌した。滅菌された材料は、温かい間に、または冷却後に、適当な希釈剤で希釈することができる。そのような希釈剤としては、薬物送達に使用される任意の担体が挙げられる。
この実施例では、PA送達系として使用するために、DMSOを補助溶媒として使用して、酢酸プレドニシロン(PA)を本発明の修飾キトサン組成物に組み込むための代替的手法を例示する。
10mg/mLの実施例4の材料の修飾キトサン溶液2.7mLを20mLバイアルに入れた。2%PA/DMSO溶液225μLをそのバイアルに滴下した。次に1mLのDI水をバイアルに加えた。次に500μLのメタノールをバイアルに滴下した。得られた溶液を丸底フラスコに移し、ロータリーエバポレーターにかけて、ヒドロゲルを生成させた。次にそのヒドロゲルをフラスコから掻きだして、メスシリンダーに入れ、所望の体積(この実施例では9mL)に再構成させた。再構成した材料をオートクレーブで滅菌した。
この実施例では、PA送達系として使用するために、酢酸エチルを補助溶媒として使用して、酢酸プレドニシロン(PA)を本発明の修飾キトサン組成物に組み込むための代替的手法を例示する。
この実施例は、現在市販されている酢酸プレドニゾロン(PA)製剤(AllerganのPred Forte(登録商標))の眼送達性能を、本発明の送達マトリックスと、インビボウサギモデルで比較するために設計された。この研究では実施例21の材料を使用した。
体重5〜8ポンドのニュージーランドホワイトウサギ12匹をさまざまな処置群にランダムに割り当てた(下記参照)。適当な化合物を左眼に滴下し、右眼は無処置のままにしておいた。液剤の滴下後に、ウサギを最初の15〜20分間は絶えず監視し、その後は収集時まで15分ごとに監視した。眼房水の収集に先だって、40%/60%酸素/空気混合物中の2.0〜3.5%のイソフルランで、ウサギを麻酔した。このタイプの薬物送達適用に関して文献調査すれば、眼に局所適用し、次に適用後さまざまな時点で角膜眼房水中の薬物レベルを定量することによって製剤を評価するのが、一般的慣行であることがわかるだろう。したがって、100μLの眼房水を適当な時点でそれぞれの眼から収集し、解析するまで-80℃で保存しておいた。
図16には、この研究で得られたデータを要約した棒グラフが含まれる。現在市販されているPred Forte(登録商標)は活性薬物を1.0%の濃度で含有し、本発明の製剤は0.05%である。活性薬物が20分の1であるにもかかわらず、本発明の製剤からの送達は、1時間時点で現在市販されている製品を越え(Pred Forte(登録商標)の138%)、適用後4時間でもわずかに少ないだけだった(Pred Forte(登録商標)の71%)。
実施例21の材料は、眼へのPAの送達を改善するための手段として極めて有望であり、活性医薬成分(API)をかなり減らしても、上回らないまでも同等な送達を得ることができる。
この実施例では、酵素放出型ビマトプロスト送達系として使用するための、本発明の修飾キトサン組成物へのビマトプロストの共有結合による付着を例示する。
ビマトプロストの共有結合による付着は2段階で行った。第1ステップ(図17参照)では、ビマトプロスト分子にテザーを付加して、キトサン骨格への付着に適した適切な分子構造にした。テザーへのビマトプロストの付着により、酵素的加水分解時に無修飾ビマトプロストの限局的放出をもたらすであろう酵素的に切断可能なリンクが形成された。第2ステップ(図17参照)では、リンカー修飾ビマトプロストを実施例1の修飾キトサン材料のキトサン骨格に付着させた。共有結合的に修飾され薬剤が負荷されたキトサン材料は、続いて、持続的送達相におけるビマトプロストの限局的送達に使用することができる。
200mgのビマトプロスト、48mgの無水コハク酸、147mgの4-ジメチルアミノピリジン、74μLのトリエチルアミンおよび4mLのジクロロメタンを混合し、室温で20分間、振とう機に乗せる。その溶液に4mLのヘキサンを加えて、リンカー修飾ビマトプロストを沈殿させた。沈殿後に、濃厚な油状の層だけが残るまで、溶媒を減圧下で蒸発させた。10mLの0.1M塩化カルシウム(pH=8)を加え、溶液の体積を、ほぼ乾固するまで減圧下で減少させた。10mLの脱イオン(DI)水を加えて全ての材料を再溶解した。次に、再溶解したサンプルを50mLの遠心分離バイアルに入れ、1M HClでpH4に酸性化した。生成物が沈殿するにつれて、溶液は乳白色に変化した。3850×Gで10分間の遠心分離によって生成物を集めた。
実施例1の材料を滅菌食塩水に再構成して、総体積10mLの10mg/mL溶液にした。その溶液に0.11gのEDCおよび0.165gのNHSを、磁気撹拌子で撹拌しながら加えた。ステップ1で得たリンカー修飾ビマトプロストを、10mg/mL修飾キトサン溶液に加えた。溶液のpHを6M NaOHおよび/またはHClを使って6.5〜7に調整し、そのpH調整溶液を72時間撹拌した。次に、得られた溶液を、6M NaOHの添加によってpH9にし、反応をクエンチして修飾キトサン/ビマトプロスト生成物を沈殿させた。沈殿した修飾キトサン/ビマトプロスト生成物と上清とを50mLビーカーに移し、30mLの10%乳酸を加え、沈殿物を再溶解させた。6M NaOHの添加によって修飾キトサン/ビマトプロスト生成物を再沈殿させた。このステップは、上清の一部として捨てられる溶解した残留物を除去するために設計された。材料を遠心管に移し、3850×Gで10分間遠心分離した。沈殿物を収集し、固形の修飾キトサン/ビマトプロスト生成物を透析チューブに移し、10%酸に対して、修飾キトサンが溶解するまで透析した。溶解した修飾キトサン/ビマトプロスト生成物を水に対して最低3時間は透析した。修飾キトサン/ビマトプロスト生成物を水に対してさらに2回透析した。この透析ステップは過剰な酸および未付着のビマトプロスト/リンカーを修飾キトサン/プロトプラスト生成物から除去する。透析液のpHをpH試験紙で測定し、pHを記録した。次に、修飾キトサン/ビマトプロスト生成物を、滅菌PBSに対して、透析液が5.7〜6.0のpHを持つようになるまで透析した。次に、修飾キトサン/ビマトプロスト生成物を水に対して3時間透析し、それを合計2回繰り返した。次に、修飾キトサン/ビマトプロスト生成物を凍結乾燥フラスコに移し、-80℃で終夜冷蔵した。その修飾キトサン/ビマトプロスト生成物を凍結乾燥した。凍結乾燥材料は貯蔵に有利であり、所望の濃度での再構成を簡単にする。次に、凍結乾燥製品を滅菌PBSを使って所望の濃度で再構成し、オートクレーブにかけて、滅菌製品を得ることができる。
実施例1の修飾キトサン材料へのビマトプロストの共有結合的付着を、以下の手法に従って、FTIRで調べた。
この実施例では、酵素放出型ビマトプロスト送達系として使用するための実施例1の修飾キトサン材料にビマトプロストを付着させるもう一つの手法を例示する。この代替的手法では、実施例25に記載の手法よりも純粋なリンカー-ビマトプロストコンジュゲートが生成する。
200mgのビマトプロスト(0.48mmol)、48mgの無水コハク酸(0.48mmol)、147mgの4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)(1.2mmol)、74μLのトリエチルアミン(TEA)(0.53mmol)、1gのDEAEセファデックス(粒径40〜125μm)を量り取った。次に、4mLのジクロロメタンをバイアルに入れた。そのバイアルに無水コハク酸を加え、ボルテックスにかけてジクロロメタンに溶解させた。次にDMAPを加え、ボルテックスにかけて溶解させた。次にビマトプロストを加え、ボルテックスにかけて溶解させた。次にTEAを加え、ボルテックスにかけて溶解させた。最後にDEAEを加え、ボルテックスにかけて混合し、そのバイアルにしっかりと蓋をした。次に、蓋をしたバイアルをリストアクション振とう器にのせ、室温で1時間振とうした。反応が進行している間に、10mLシリンジからプランジャを取り除いた。濾紙を小さな円形に切り取り、湿らせた。その円形の湿った濾紙を使って、シリンジの開口部に栓をした。濾紙はDEAEゲルの流れを遅らせるように設計された。シリンジに乾燥DEAEビーズを1mLラインまで充填した。ビーズを水で湿らせ、次にメタノールで湿らせた。反応混合物をピペットでシリンジに入れた。ゲルを40mLの75%メタノールと40mLの水で洗浄して、あらゆる不純物または未反応材料を除去した。次に、ゲルを40mLの1M NaClで洗浄して、生成物を溶出させた。
修飾キトサンの可溶化
適当な量の実施例1の修飾キトサン材料を量り取り、1M NaClで洗浄したステップ1の生成物に加えた。その混合物を24時間撹拌した。修飾キトサンが溶解しない場合は、その混合物を穏やかに加熱して、60℃を越えないように注意しながら、修飾キトサンを溶解させた。
0.11gのEDC(修飾キトサン100mgあたり)および0.165gのNHS(修飾キトサン100mgあたり)を量り取り、先のステップで得た溶液に、磁気撹拌子を使って撹拌しながら加えた。溶液のpHを調べて、pH5〜6に維持した。反応溶液を室温で72時間撹拌した。
72時間後に、溶液のpHを6M NaOHでpH9に調整して、修飾キトサン/ビマトプロスト生成物を沈殿させた。沈殿した修飾キトサン/ビマトプロスト生成物を150mLビーカーに入れ、50mLの10%乳酸を加えた。沈殿した修飾キトサン/ビマトプロストを、全ての修飾キトサン/ビマトプロスト生成物が溶解するまで撹拌した。6M NaOHを使ってpHをpH9に調整することにより、修飾キトサン/ビマトプロスト生成物を沈殿させた。次にその混合物を50mL遠心管に移し、3850×Gで15分間遠心分離した。次に上清を取り出して、捨てた。修飾キトサン/ビマトプロスト生成物を透析チューブに移し、修飾キトサン/ビマトプロスト生成物が溶解するまで、10%乳酸に対して透析した。修飾キトサン/ビマトプロスト生成物が溶解した後、透析液をDI水に変え、生成物を最低3時間、最低3回の独立したDI水透析ステップで透析した。修飾キトサン/ビマトプロスト生成物のpHを調べた後、修飾キトサン/ビマトプロスト生成物をPBS(pH7.4)に対して、修飾キトサン/ビマトプロスト生成物が約6のpHに達するまで透析した。このPBS透析では、生成物が約6のpHに達するのに、通例、30分を要した。次に生成物をDI水に対して最低3時間、最低2回の独立したDI水透析ステップで透析した。修飾キトサン/ビマトプロスト生成物を透析チューブから取り出し、凍結乾燥器フラスコに入れた。そのフラスコを少なくとも1時間または一晩、-80℃のフリーザーに入れておいた。フラスコを-80℃のフリーザーから取り出し、生成物が完全に乾燥するまで凍結乾燥器に置いた。
この実施例は、ウサギ眼を取り囲む結膜組織内に配置した場合の本発明の材料の生体適合性を評価するために設計されたものであり、実施例1の材料を使用した。
この研究には2匹のニュージーランドホワイトウサギを使用した。ウサギおよび処置はランダム化した。実験眼は10mg/mLの実施例1の材料100μLで処置し、対照眼はBSS 100μLで処置した。40%/60%酸素/空気混合物中、2.0〜3.5%のイソフルランで、ウサギを麻酔した。2滴の局所麻酔薬(テトラカイン-0.5%滴剤またはアルカイン)をウサギ眼に適用した。鉗子を使って、結膜を眼球の表面から静かに持ち上げて、結膜の「テンティング」を起こした。眼球の表面から十分に離して注射を行った。(この手技により眼球穿孔のリスクが著しく低減する)。針を眼球に対して接線方向に置いて、針先をテント中に挿入し、適当な製剤を送達した。23ゲージ針を使って注射を行った。実験眼の結膜には実施例1の材料100μLを注射した。対照眼の結膜にはBSS 100μLを注射した。注射後に、抗生物質滴剤(べガモックス(登録商標))を点眼した。1週間、毎日観察を行った後、研究が終了するまで週に1回観察した。24時間時点で結膜の写真を撮影した。29日目に、ウサギを安楽死させ、結膜を回収し、組織学的検査用に加工した。
眼瞼を下げる前にウサギを見ると、研究全体にわたって、対照眼と処置眼とを弁別することはできなかった。全てのウサギ眼は全ての観察点で明るく湿った外観を保っていた。24時間時点で、全ての結膜が(実験結膜も対照結膜も)正常に見えたことから、BSSも実施例1の材料の流動体構成要素も組織に吸収されたことが示された。どの結膜にも発赤は認めなかった。29日時点で、全ての眼が正常なようだった。どの眼にも隆起(bump)は存在しなかった。カルコフロール染色を使った組織学的評価により、注射29日後の実験眼の結膜における実施例1の材料の存在が確認された。ここで図19を参照して説明すると、顕微鏡像が、29日時点における材料の継続的存在を裏付けている。
実施例1の材料は、眼に持続的薬物送達を提供するための手段として有望である。眼周囲注射後に、本発明の材料は結膜空間内に、優れた生体適合性で少なくとも29日間は存在し続けた。
この実施例は、ウサギ眼を取り囲む結膜組織内に配置した場合の、ビマトプロストの付加によって共有結合的に修飾されている本発明の材料の生体適合性を評価するために設計されたものであり、実施例25の材料を利用した。
この研究には4匹のニュージーランドホワイトウサギを使用した。この研究ではウサギおよび処置をランダム化した。実験眼は10mg/mLの実施例25の材料100μLで処置し、対照眼はBSS 100μLで処置した。40%/60%酸素/空気混合物中、2.0〜3.5%のイソフルランで、ウサギを麻酔した。2滴の局所麻酔薬(テトラカイン-0.5%滴剤またはアルカイン)をウサギ眼に適用した。鉗子を使って、結膜を眼球の表面から静かに持ち上げて、結膜の「テンティング」を起こした。眼球の表面から十分に離して注射を行った。(この手技により眼球穿孔のリスクが著しく低減する)。針を眼球に対して接線方向に置いて、針先をテント中に挿入し、適当な製剤を送達した。23ゲージ針を使って注射を行った。実験眼の結膜には実施例25の材料100μLを注射した。対照眼の結膜にはBSS 100μLを注射した。注射後に、抗生物質滴剤(ベガモックス(登録商標))を点眼した。1週間、毎日観察を行った後、研究が終了するまで週に1回観察した。注射時、1日目および7日目に、結膜の写真を撮影した。研究の終了時に、ウサギを安楽死させ、結膜を回収し、組織学的検査用に加工した。
眼瞼を下げる前にウサギを見ると、研究全体にわたって、対照眼と処置眼とを弁別することはできなかった。全てのウサギ眼は全ての観察点で明るく湿った外観を保っていた。24時間時点で、全ての対照結膜が正常に見えたことから、BSSは組織に吸収されたことが示された。全ての実験結膜には、わずかないし顕著なピロー(pillow)または隆起が、結膜組織のわずかな発赤と共に存在した。発赤は研究の進行と共にゆっくり減少した。(眼そのものおよび周囲組織は、研究全体にわたって、完全に正常なままだった)。最初の24時間以内に、相対的隆起サイズが減少し、その後は極めて小さくなった。29日時点で、全ての眼が正常なようだった。全ての実験眼に依然として隆起が存在した。切開時点で、どの結膜が実施例25の材料を含むかは、極めて明白だった。カルコフロール染色を使った組織学的評価により、注射29日後の実験眼の結膜における本発明のキトサン化合物の存在が確認された。ここで図20を参照して説明すると、この図には、29日時点におけるこの材料の継続的存在を裏付ける肉眼的および顕微鏡的証拠が示されている。
ビマトプロストにより共有結合的に修飾されている本発明の修飾キトサン材料は、眼に持続的薬物送達を提供するための手段として有望である。眼周囲注射後に、これらの材料は結膜空間内に、優れた生体適合性で少なくとも29日間は存在し続ける。実施例27での結果が基材のみからの刺激の徴候を示さなかったことを考えると、注射後にこれらの実験眼の結膜で観察されたわずかな発赤は、おそらくビマトプロスト修飾に起因するのだろう。
この実施例は、結合されたビマトプロストを酵素的に放出する能力を評価するために設計されたものである。これは、ブタエステラーゼおよびリゾチームを使用するインビトロ加水分解アッセイにより、以下の手法に従って証明された。
0.309gのホウ酸を50mLのDI水に加え、1M NaOHでpHを6.5に調整することにより、0.1Mホウ酸緩衝剤の溶液を調製した。実施例25の材料の5mg/mL溶液を滅菌食塩水中に無菌的に調製した。1ミリリットルあたり1000単位のブタエステラーゼおよび20単位の卵白リゾチームを0.1Mホウ酸緩衝液に溶解した。標準を以下のように調製した:1mLのホウ酸緩衝液(pH6.5)および1mLの5mg/mL実施例25の修飾キトサン材料を各バイアルに入れ、10秒間ボルテックスして、完全な混合を保証する。サンプルをリストアクション振とう器にのせて、72時間振とうする。エステラーゼサンプルを以下のように調製した:1mLのブタエステラーゼおよび卵白リゾチーム溶液(1mLあたり1000単位のブタエステラーゼおよび20単位の卵白リゾチーム)ならびに1mLの5mg/mL実施例25の修飾キトサン材料を各バイアルに入れ、10秒間ボルテックスして、完全な混合を保証する。サンプルをリストアクション振とう器にのせて、72時間振とうする。
図21は、酵素の存在下および非存在下でのビマトプロストの放出プロファイルを示す。酵素が存在しない場合、検出可能なビマトプロストは観察されなかった。酵素が存在する場合は、かなりの量のビマトプロストが放出された。
この実施例は、共有結合されたビマトプロストを切断するエステラーゼおよびリゾチームの作用下で、ビマトプロストが本発明の修飾キトサン材料から効率よく放出されることを明確に示している。
Claims (7)
- 眼疾患または眼異常を処置するための医薬組成物であって、
処理・修飾キトサン、またはその混合物を含むキトサン組成物と、
プロスタグランジン、プロスタミドおよびその混合物からなる群より選択される治療剤
とを含み、
処理・修飾キトサンは、対応する無処理キトサンと比較して、化学的、物理的および/または性能的特性または特徴に変化を示し、キトサンを、アルキルスルホン酸基の共有結合付着により修飾し、酢酸、乳酸、酒石酸、クエン酸、ギ酸、酪酸、ピルビン酸、安息香酸、コハク酸およびトリクロロ酢酸からなる群から選択される有機酸の10%(v/v)溶液に対する透析により処理することによって得られ、
治療剤は、少なくとも一つの処理・修飾キトサンに、直接的に、またはリンカーを介して、共有結合され、
処置有効量の治療剤がある期間にわたって放出されるようにキトサン組成物を適合させた、医薬組成物。 - さらに保存剤を含む、請求項1に記載の組成物。
- 保存剤が、組成物の0.00001%〜0.1%(w/v)の量の、塩化ベンザルコニウム、クロルヘキシジン、PHMB(ポリヘキサメチレンビグアニド)、メチルパラベン、エチルパラベン、ヘキセチジン、亜塩素酸塩成分およびその混合物からなる群より選択される、請求項2に記載の組成物。
- さらに眼科適合性賦形剤を含む、請求項1に記載の組成物。
- さらに緩衝剤を含む、請求項1に記載の組成物。
- 緩衝剤が、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤およびその混合物からなる群より選択される、請求項5に記載の組成物。
- さらに眼科適合性ビヒクルを含む、請求項1に記載の組成物。
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